DE69614668T2

DE69614668T2 - Medizinische zusammensetzung zur verwendung für die transfektion und in vivoexpression von exogenen

Info

Publication number: DE69614668T2
Application number: DE69614668T
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Bach; Lucienne Chatenoud; Hedi Haddada; Martin Lee; Michel Perricaudet; Michelle Webb
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Priority date: 1995-02-14
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2016-02-13
Also published as: CA2211039C; ES2163612T3; PT809516E; NO973724D0; US20040265276A1; FI973323L; US20030004091A1; JPH11500430A; DK0809516T3; MX9706017A; HUP9800635A3; FR2730411B1; AU4723896A; FI973323A0; NO320072B1; CZ258197A3; NO973724L; SK282235B6; KR19980702199A; BR9607310A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentherapie und insbesondere die Verwendung eines Adenovirus zur Expression des Gens von therapeutischem Interesse. Sie betrifft insbesondere eine neue Behandlungsweise von Krankheiten genetischen Ursprungs auf der Basis der kombinierten Verwendung von zwei Typen von therapeutischen Mitteln.
Die Gentherapie besteht darin, dass man einen Defekt oder eine Anomalie (Mutation, aberrante Expression etc.) durch Einschleusen einer genetischen Information in die befallene Zelle oder das befallene Organ korrigiert. Diese genetische Information kann entweder in vitro oder ex vivo in eine Zelle, die aus einem Organ extrahiert wurde, eingeschleust werden, wobei die modifizierte Zelle dann in den Organismus wieder eingeschleust wird, oder direkt in vivo in das geeignete Gewebe eingeschleust werden. Im zweiten Fall existieren verschiedene physikalische Transfektionstechniken, darunter die Verwendung von Viren als Vektoren. In dieser Hinsicht wurden verschiedene Viren auf ihre Fähigkeit, bestimmte Zellpopulationen zu infizieren, getestet. Insbesondere die Retroviren (RSV, HMS, MMS etc.), das HSV-Virus, die Adeno-assoziierten Viren und die Adenoviren.
Unter diesen Viren besitzen die Adenoviren bestimmte interessante Eigenschaften für eine Verwendung in der Gentherapie. Sie besitzen ein ziemlich großes Wirtsspektrum, können ruhende Zellen infizieren und integrieren sich nicht in das Genom der infizierten Zelle. Die Adenoviren sind Viren mit einer linearen doppelsträngigen DNA mit einer Größe von etwa 36 kb. Ihr Genom umfasst insbesondere eine invertiert repetierte Sequenz (ITR) an ihrem Ende, eine Verkapselungssequenz, frühe und späte Gene (vergleiche Fig. 1). Die hauptsächlichen frühen Gene sind die Gene E1 (E1a und E1b), E2, E3 und E4. Die hauptsächlichen späten Gene sind die Gene L1 bis L5.
Angesichts der Eigenschaften der vorstehend genannten Adenoviren wurden diese bereits für den Transfer von Genen in vivo verwendet. In dieser Hinsicht wurden verschiedene von Adenoviren abgeleitete Vektoren hergestellt, die verschiedene Gene beherbergen (β-gal, OTC, α-1AT, Cytokine etc.) In jeder dieser Konstruktionen wurde das Adenovirus so modifiziert, dass es die Replikation in der infizierten Zelle unmöglich macht. Ebenso sind die im Stand der Technik beschriebenen Konstruktionen Adenoviren, bei denen die Regionen E1 (Ela und/oder Elb) und gegebenenfalls E3, in denen eine heterologe DNA-Sequenz insertiert ist, 1 deletiert sind (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh- Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161).
Jedoch induziert wie bei allen bekannten Viren die Verabreichung eines wilden Adenovirus oder eines für die Replikation defekten rekombinanten Adenovirus (Yang et al., PNAS (1994) 4407) eine bedeutende. Immunantwort.
Die Hauptaufgabe des Immunsystems ist die Integrität des Individuums oder die Integrität des "Selbst". Es führt zur Entfernung von infektiösen Erregern, sowie zur Abstoßung von Transplantaten und Tumoren, ohne dass jedoch sich diese starken Verteidigungsmechanismen des Organismus gegen ihn selbst wenden und zu Autoimmunerkrankungen führen. Dieser Zustand der Nicht-Antwort gegenüber den "Selbst"-Antigenen, während die Fremdantigene beseitigt werden, ist als ein Zustand der physiologischen Toleranz definiert. Um die fremden Erreger zu entfernen, entwickelt das Immunsystem zwei Typen von Mechanismen. Der erste ist die Produktion von spezifischen Antikörpern durch die B- Lymphozyten; man spricht von humoraler Immunität. Diese Antikörper werden das Antigen binden und entweder inaktivieren oder aus dem Organismus beseitigen. Der zweite Verteidigungsmechanismus betrifft die celluläre Immunität und setzt T-Lymphozyten ein und darunter cytotoxische T-Lymphozyten, die einen für das in Betracht gezogene Antigen spezifischen Rezeptor tragen. Die Erkennung des Antigens durch den T-Rezeptor bedingt, dass dieser zusammen mit von den Genen des Haupthistokompatibilitätskomplexes oder MHC der Klasse I und der Klasse II codierten Proteinen exprimiert wird.
Folglich stellt diese Immunantwort, die gegen die infizierten Zellen entwickelt wurde, ein Haupthindernis bei der Verwendung von viralen Vektoren in der Gentherapie dar, da (i) durch Induzieren einer Zerstörung der infizierten Zellen sie die Dauer der Expression des therapeutischen Gens und somit den therapeutischen Effekt limitiert, (ii) sie parallel eine bedeutende entzündliche Antwort induziert und (iii) sie die rasche Entfernung der infizierten Zellen nach wiederholten Injektionen herbeiführt. Es versteht sich, dass die Amplitude dieser Immunantwort beim Auftreffen auf infizierte Zellen entsprechend der Natur des Organs, das eine Injektion erhalten hat, und der Verabreichungsart, die eingesetzt wurde, variiert. So wird die Expression der β- Galactosidase, die von einem rekombinanten Adenovirus codiert wird, das in den Muskel von immunkompetenten Mäusen verabreicht wird, auf Zeitspannen von minimal 40 Tagen nach Injektion verringert wird (Kass-Eisler et al., PNAS 90 (1993) 11498). Ebenso wird die Expression von durch Adenoviren transfizierten Genen in der Leber signifikant in den 10 Tagen, die der Infektion folgen, vermindert (Yang Y. et al., 1994, Immunity 1, 433-442) und die Expression des Faktors IX, der durch das Adenovirus in Hepatozyten von hämophilen Hunden transferiert wird, verschwindet 100 Tage nach der Injektion (Kay et al., PNAS 91 (1994) 2353).
Im Hinblick auf eine gentherapeutische Ausnützung der von Adenoviren abgeleiteten Vektoren erscheint es nun notwendig, die Immunantwort, die bei ihrem Auftreten oder gegen die Zellen, die sie infizieren, erzeugt wurde, zu kontrollieren.
Aus den vorstehenden Ausführungen folgt, dass die Einsetzung der Aktivität des Immunsystems eine vorherige Erkennung von für den Organismus fremden Elementen (das Nicht-Selbst oder modifizierte Selbst) wie von Adenoviren abgeleiteten Vektoren, die in normaler Zeit zerstört werden müssen, durch dieses notwendig macht. Im Verlauf der vergangenen Jahre wurden Immuninterventionsstrategien entwickelt, deren Ziel es ist, eine permissive Immunumgebung zu schaffen, d. h. die Einführung eines Toleranzzustands gegenüber den vorstehend definierten Fremd-Antigenen.
Genau hier setzt die vorliegende Erfindung an. Sie betrifft die Entwicklung einer raschen Entfernung von Adenoviren aus den infizierten Zellen und somit die konsequente Verlängerung der Expression der therapeutischen Gene, die sie tragen, in vivo.
Jüngst wiesen die Anmelder nach, dass die Co-Expression bestimmter Gene in den infizierten Zellen einen immunschützenden Effekt induzieren kann und somit Vektoren und/oder infizierte Zellen dem Immunsystem entgehen lassen kann. Sie setzten insbesondere Adenoviren ein, in denen die Expression eines Gens von therapeutischem Interesse an die eines immunschützenden Gens (FR Nr. 94 12 346) gekoppelt ist. Es kann sich insbesondere um ein Gen handeln, dessen Produkt auf die Aktivität des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) oder die Aktivität der Cytokine einwirkt, wodurch jede Immunreaktion gegen den Vektor oder die infizierten Zellen beträchtlich verringert, sogar supprimiert werden kann. Sie hemmen mindestens teilweise die Expression der MMC- Proteine oder die Antigenpräsentation mit der vorteilhaften Folge einer beachtlichen Reduktion der Immunreaktion gegen den Vektor oder die infizierten Zellen und somit eines verlängerten therapeutischen Effekts.
Überraschenderweise wiesen die Anmelder nach, dass es möglich war, die therapeutische Wirkung eines derartigen Vektors signifikant zu verlängern, indem man ihn mit einem Immunsuppressor assoziiert. Die Entfernung des in Betracht gezogenen Vektors und/oder die Zerstörung der infizierten Zellen durch das Immunsystem zeigen sich dem Effekt gegenüber deutlich verzögert, der durch eine einfache Nebenordnung der immunschützenden Effekte des Vektors und des Immunsuppressors erwartet werden kann. Vorteilhafterweise induziert die erfindungsgemäße medikamentöse Assoziation ein "Pseudo-Inertreiz"-Phänomen des Immunsystems, das für die Langzeitexpression eines therapeutischen Gens günstig ist.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Immunsuppressor jede Verbindung, die mindestens einen Weg der Immunsignalkette teilweise oder vollständig hemmen kann. Allgemein werden Immunsuppressoren üblicherweise in der Transplantation mit dem Ziel verwendet, die Abstoßung des Fremdtransplantats zu verhindern, sowie bei der Behandlung bestimmter Autoimmunerkrankungen verwendet. Die klassisch verwendeten Produkte sind entweder die chemischen Immunsuppressoren, wie die Corticosteroide, Azathioprin, Cyclosporin, FK506, oder biologische Immunsuppressoren, wie polyclonale oder monoclonale Antikörper. Die erste Kategorie von Tmmunsuppressoren und unter diesen insbesondere Cyclosporin und FK506 hemmen stark die Produktion von Cytokinen, wie Interleukin 2, deren Rolle in der Differenzierung und der Proliferation von Lymphozytenzellen essentiell ist. Leider macht die Wirksamkeit dieses Typs von Immunsuppressoren ihre permanente Verabreichung notwendig, die über kurz oder lang mit dem Problem ihrer Toxizität konfrontiert wird. So ist Axathioprin potentiell myelotoxisch und Cyclosporin ist nephrotoxisch und kann außerdem eine Hypertension oder neurologische Störungen herbeiführen.
Was insbesondere die Antikörper betrifft, handelt es sich um Antikörper, die gegen die lymphoiden Zellen des Immunsystems gerichtet sind. Der erste als Immunsuppressor verwendete Antikörper ist anti-CD3 gegen die T- Lymphozyten. Sein Ziel ist eine der Polypeptidketten des CD3-Moleküls, das den Rezeptor für das Antigen der T- Zellen darstellt. Daraus folgt eine funktionelle Inaktivierung der CD3+-T-Zellen, die von Antikörpern erkannt werden. Im Falle der Problematik, die hier interessiert, erfolgt die Verabreichung eines Immunsuppressors dieses Typs gleichzeitig mit der eines rekombinanten Adenovirus, das ein therapeutisches Gen enthält, in dem Maße, wie die Immunreaktion des Wirts gegen den viralen Vektor und/oder seine auf der Oberfläche der infizierten Zellen exprimierten Produkte blockiert werden soll. Nach dem gleichen Prinzip kann man anti-CD4, -CD2, -CD8, -CD28, -B7, -ICAM-1 und -LFA-1-Antikörper verwenden.
Die Anmelder haben nun ein neues Behandlungsverfahren entwickelt, das besonders wirksam ist, um stark die Reaktion des Immunsystems zu verzögern oder sogar zu hemmen, ohne Toxizitätsprobleme zu erzeugen.
Genauer betrifft die Erfindung den Nachweis eines synergistischen, besonders großen Effekts, der an die kombinierte Verwendung eines rekombinanten Adenovirus, in dem die Expression eines Gens von therapeutischem Interesse an diejenige eines immunschützenden Gens, wie vorstehend beschrieben, gekoppelt ist, und mindestens eines immunsuppressiven Mittels gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrift somit eine medikamentöse Assoziation mindestens eines immunsuppressiven Mittels und mindestens eines rekombinanten Adenovirus, dessen Genom eine erste rekombinante DNA, die ein therapeutisches Gen enthält, und eine zweite rekombinante DNA, die ein immunschützendes Gen enthält, umfasst, zur aufeinanderfolgenden, zeitlich abgestuften und/oder gleichzeitigen Verwendung, die für exogene Transfektionen in vivo und/oder ex vivo nützlich ist.
Wie vorstehend angegeben, beruht die Erfindung insbesondere auf dem Nachweis eines synergistischen Effekts zwischen der Aktivität des immunsuppressiven Mittels und der Wirkung des immunschützenden Gens, das bei Expression des therapeutischen Gens exprimiert wird.
Diese kombinierte Verwendung erlaubt eine deutlich verlängerte therapeutische Wirkung und benötigt vorteilhafterweise signifikant verminderte Dosen, insbesondere an immunsuppressivem Mittel.
Wie vorstehend ausgeführt, können die zwei Verbindungen der kombinierten Assoziation gemäß der vorliegenden Erfindung aufeinanderfolgend, zeitlich abgestuft und/oder gleichzeitig verwendet werden. Bevorzugt wird das immunsuppressive Mittel vor und nach der Injektion des Adenovirus injiziert. Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Verabreichung des Immunsuppressors zeitlich abgestuft und bevorzugter regelmäßig erneuert erfolgen. In diesem speziellen Fall werden die zwei Verbindungen separat konditioniert. Im Fall einer gleichzeitigen Verabreichung können sie extemporär vor der gemeinsamen Verabreichung vermischt werden oder im Gegensatz dazu gleichzeitig, aber getrennt verabreicht werden. Insbesondere können die Wege der Verabreichung der zwei Mittel verschieden sein.
Erfindungsgemäß kann als immunsuppressives Mittel jede Verbindung verwendet werden, die teilweise oder vollständig mindestens einen Weg der Immunsignalübertragung hemmen kann. Es kann insbesondere aus Cyclosporin, FK506, Azathioprin, Corticosteroiden oder jedem mono- oder polyclonalen Antikörper ausgewählt werden. Es handelt sich bevorzugt um Antikörper, die Immunmoleküle inaktivieren können oder die Zerstörung der Immunzellen, die diese Moleküle tragen, hervorrufen können. Man kann insbesondere als Antikörper anti-CD4, - CD3, -CD2, -CDB, -CD28, -B7, -ICAM-1, -LFA-1 verwenden. Es kann sich auch um Hybridmoleküle, wie CTLA4Ig, ein Fusionsprotein zwischen dem Molekül CTLA-4 (ein Homologes zu CD28) und einem Immunglobulin handeln. Die GlFc-Stelle dieses Moleküls erwies sich durch Binden an das Molekül B7 als fähig, die Aktivierung der T-Zellen zu hemmen (D.J. Lenschow, Science, 257, 789, 1992). Es ist klar, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise auf die vorstehend aufgeführten Immunsuppressoren beschränkt ist. Diese Immunsuppressoren können in isolierter Form oder in Assoziation verwendet werden.
Was die rekombinanten DNAs, die in dem Genom des Adenovirus, das erfindungsgemäß verwendet wird, vorhanden sind, betrifft, handelt es sich um DNA-Fragmente, die das in Betracht gezogene Gen (therapeutische oder immunschützend) und gegebenenfalls Signale, die dessen Expression erlauben, enthalten, die in vitro konstruiert wurden, dann in das Genom des Adenovirus insertiert wurden. Die rekombinanten DNAs, die erfindungsgemäß verwendet werden, können komplementäre DNA (cDNA), genomische DNA (gDNA) oder Hybridkonstruktionen, die beispielsweise aus einer cDNA bestehen, in die ein oder mehrere Introns insertiert sind, sein. Es kann sich auch um synthetische oder semisynthetische Sequenzen handeln. Diese DNAs können menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen etc. Ursprungs sein. Besonders vorteilhafterweise wird cDNA oder gDNA verwendet.
Als therapeutisches Gen, das für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Vektoren verwendbar ist, kann jedes Gen genannt werden, das ein Produkt codiert, das einen therapeutischen Effekt besitzt. Das so codierte Produkt kann ein Protein, ein Peptid, eine RNA etc. sein. Wenn es sich um ein Proteinprodukt handelt, kann es zu der Zielzelle homolog sein (d. h. ein Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, während es keine Pathologie zeigt). In diesem Fall erlaubt die Expression eines Proteins beispielsweise die Abhilfe einer unzureichenden Expression in der Zelle oder die Expression eines inaktiven oder schwach aktiven Proteins aufgrund einer Modifikation oder auch die Überexpression des Proteins, Das therapeutische Gen kann auch eine Mutante eines cellulären Proteins codieren, die eine erhöhte Stabilität, eine modifizierte Aktivität etc. besitzt. Das Proteinprodukt kann auch heterolog zu der Zielzelle sein. In diesem Falle kann ein exprimiertes Protein beispielsweise eine defekte Aktivität in der Zelle ergänzen oder hinzufügen, was dieser erlaubt, gegen eine Pathologie zu kämpfen oder eine Immunantwort zu stimulieren.
Unter den erfindungsgemäßen therapeutische Proteinprodukten können insbesondere Enzyme, Blutderivate, Hormone, Interleukine, Interferone, TNF etc. (FR 9 203 120), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder ihre Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS, HARP/Pleiotrophin etc.; die Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE etc. (FR 9 305 125), Dystrophin oder Minidystrophin (FR 9 111 947), das Protein CFTR, das mit Mukoviszidose assoziiert ist, Tumorsuppressorgene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. (FR 9 304 745), Gene, die Faktoren codieren, die an der Blutgerinnung beteiligt sind, Faktoren VII, VIII, IX, Gene, die an der Reparatur der DNA beteiligt sind, etc. genannt werden.
Wie vorstehend angegeben, kann das therapeutische Gen auch ein Gen oder eine Antisensesequenz sein, deren Expression in der Zielzelle die Kontrolle der Expression der Gene oder die Transkription der cellulären mRNA erlaubt. Derartige Sequenzen können beispielsweise in der Zielzelle in zu der cellulären mRNA komplementäre RNA umgeschrieben werden und so ihre Translation in ein Protein blockieren, gemäß der in dem Patent EP 140 308 beschriebenen Technik. Die Antisensesequenzen umfassen auch Sequenzen, die Ribozyme codieren, die selektiv die Ziel-RNA zerstören können (EP 321 201).
Die therapeutischen Gene können menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen etc.. Ursprungs sein. Sie können durch jede Technik, die einem Fachmann bekannt ist, und insbesondere durch Absuchen von Banken, chemische Synthese oder auch durch gemischte Methoden einschließlich der chemischen oder enzymatischen Modifikation von Sequenzen, die durch Absuchen von Banken erhalten Wurden, erhalten werden.
Das erfindungsgemäß verwendete immunschützende Gen kann verschiedenen Typs sein. Wie vorstehend ausgeführt, handelt es sich um ein Gen, dessen Produkt auf die Aktivität des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) oder die Aktivität der Cytokine einwirkt. Es handelt sich bevorzugt um ein Gen, dessen Produkt mindestens teilweise die Expression der MHC-Proteine oder die Antigenpräsentation hemmt. Als bevorzugte Beispiele können bestimmte Gene, die in der Region E3 des Adenovirus enthalten sind, das Gen ICP47 des Herpesvirus oder das Gen UL18 des Cytomegalievirus genannt werden.
Die Region E3 des Genoms des Adenovirus enthält verschiedene Leseraster, die durch alternatives Spleißen zu verschiedenen Proteinen führen. Unter diesen ist das Protein Gp19k (oder E3-19k) ein glykosiliertes Transmembranprotein, das in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (RE) lokalisiert ist. Dieses Protein umfasst eine luminale Domäne, die die Moleküle des MHC-1 und ein cytoplasmatisches C-terminales Ende, das Mikrotubuli (oder Tubulin) binden kann, das als Anker für das Protein gp19k in der Membran des RE wirkt, verknüpft. Gp19k kann so die Expression der MHC-I-Moleküle auf der Oberfläche der Zellen durch Interaktion und Sequestrierung auf der Ebene des RE verhindern. Jedoch wird in Abwesenheit einer viralen Replikation das Protein gp19k durch die Adenoviren schwach exprimiert. Außerdem wird die Expression von gp19k auch durch die Durchführung eines Spleißens konditioniert. Die Einschleusung in die erfindungsgemäßen Vektoren einer rekombinanten DNA, die eine Sequenz (bevorzugt cDNA) enthält, die gp19k codiert, erlaubt die Kontrolle und die Optimierung der Expression des Proteins. Insbesondere erlaubt die Verwendung von konstitutiven Promotoren und die Suppression anderer Leseraster die starke Erhöhung der Expression dieses Proteins und die Befreiung von der Abhängigkeit der viralen Replikation und der Anwesenheit von Induktorelementen. Dies erlaubt besonders vorteilhafterweise eine beträchtliche Verringerung der Lyse durch CTL der infizierten Zellen und so die Erhöhung und Verlängerung der in-vivo-Produktion des therapeutischen Gens.
Andere Proteine, die durch die Region E3 des Genoms des Adenovirus codiert werden, wie die Proteine 10,4k und 14,5k besitzen bestimmte bedeutende Eigenschaften im Hinblick auf ihren Einbau in die erfindungsgemäßen Vektoren.
Das Gen ICP47 des Herpes-simplex-Virus stellt ein anderes, besonders bedeutendes immunschützendes Gen im Sinne der vorliegenden Erfindung dar. Die durch das Herpes-simplex- Virus infizierten Zellen zeigen eine Resistenz gegenüber der durch CTL induzierten Lyse. Es wurde gezeigt, dass diese Resistenz durch das Gen TCP47 verliehen werden kann, was die Expression der MHC-I-Moleküle auf der Oberfläche der Zellen verringern kann. Der Einbau des Gens ICP47 in rekombinante DNA gemäß der Erfindung erlaubt auch den rekombinanten Viren der Erfindung, dem Immunsystem zu entgehen.
Das Gen UL18 des Cytomegalievirus stellt ein anderes bevorzugtes Beispiel des immunschützenden Gens gemäß der Erfindung dar. Das Produkt des Gens UL18 kann an (32- Mikroglobulin (Browne et al., Nature 347 (1990), 770) binden. Das (32-Mikroglobulin ist eine der Ketten der MHC- I-Moleküle. Der Einbau des Gens UL18 in rekombinante erfindungsgemäße DNA erlaubt so die Verminderung der Anzahl der funktionellen Moleküle von 32-Mikroglobulin in den mit dem Virus infizierten erfindungsgemäßen Zellen und somit eine Verminderung der Fähigkeiten dieser Zellen, vollständige und funktionelle MHC-I-Moleküle zu produzieren. Dieser Konstruktionstyp erlaubt nun den Schutz der infizierten Zellen vor der Lyse durch die CTL.
Wie vorstehend angegeben, ist das erfindungsgemäß verwendete immunschützende Gen in einer anderen bevorzugten Ausführungsform ein Gen, dessen Produkt die Aktivität oder die Signalwege der Cytokine hemmt. Die Cytokine stellen eine Proteinfamilie dar, die sezerniert werden und die als Signalmoleküle auf das Immunsystem einwirken. Sie können Zellen des Immunsystems anziehen, aktivieren, ihre Proliferation induzieren und auch direkt auf die infizierten Zellen einwirken, um sie zu töten.
Unter den Genen, dessen Produkt die Aktivität oder die Signalwege der Cytokine beeinflusst, können Gene genannt werden, die an der Synthese von Cytokinen beteiligt sind, oder deren Produkt Cytokine sequestrieren, in der Aktivität antagonisieren oder mit den intracellulären Signalwegen wechselwirken kann. Als bevorzugte Beispiele können insbesondere das Gen BCRF1 des Epstein-Barr-Virus, die Gene crmA und crmB des Kuhpockenvirus, die Gene BLSR und B18R des Vacciniavirus, das Gen US28 des Cytomegalievirus, die Gene E3-14, T, E3-10,4 und E3-14,5 des Adenovirus genannt werden.
Das Gen B15R des Vacciniavirus codiert ein lösliches Protein, das ein Interleukin-1ß (sekretierte Form von Interleukin-1) binden kann und so die Bindung dieses Cytokins an seine cellulären Rezeptoren verhindern kann. Das Interleukin-1 ist in der Tat eines der ersten Cytokine, die als Antwort auf eine Antigenaggression produziert werden, und es spielt eine sehr bedeutende Rolle in der Signalübertragung des Immunsystems zu Beginn einer Infektion. Die. Möglichkeit, das B15R-Gen in den erfindungsgemäßen Vektor einzubauen, erlaubt vorteilhafterweise die Verringerung der Aktivität von IL-1ß, insbesondere bezüglich der Aktivierung dar Immunzellen und so den lokalen Schutz mit den erfindungsgemäßen mit dem Virus infizierten Zellen gegen eine starke Immunantwort. Gene, die zu dem Gen B15 homolog sind, können auch verwendet werden, wie das Gen des Kuhpockenvirus.
Auf gleiche Weise codiert das Gen B18R des Vacciniavirus ein zu dem Interleukin-6-Rezeptor homologes Protein. Dieses Gen oder jedes funktionelle Homologe davon ist auch in den erfindungsgemäßen Vektoren verwendbar, um die Bindung von Interleukin-6 an seinen cellulären Rezeptor zu hemmen und so lokal die Immunantwort zu verringern.
Immer noch auf gleiche Weise kann das crmB-Gen des Kuhpockenvirus vorteilhafterweise verwendet werden. Dieses Gen codiert in der Tat ein sezerniertes Protein, das an TNF binden kann und in Kompetition mit TNF-Rezeptoren auf der Oberfläche der Zellen treten kann. Dieses Gen erlaubt nun in den erfindungsgemäßen Viren die lokale Verringerung der Konzentration an aktivem TNF, der infizierte Zellen zerstören kann. Andere Gene, die Proteine codieren, die TNF binden können und mindestens teilweise dessen Bindung an seine Rezeptoren hemmen, können ebenfalls verwendet werden.
Das crmA-Gen des Kuhpockenvirus codiert als solches ein Protein mit einer Aktivität, Proteasen vom Serpintyp zu hemmen, was die Synthese von Interleukin-1β hemmen kann. Dieses Gen kann nun zur lokalen Verminderung der Interleukin-1-Konzentration verwendet werden und kann so die Entwicklung der Immunantwort und der entzündlichen Antwort verringern.
Das Gen BCRF1 des Epstein-Barr-Virus codiert ein Analogon von Interleukin 10. Das Produkt dieses Gens ist ein Cytokin, das die Immunantwort vermindern kann und seine Spezifität verändern kann, wobei die Proliferation von B- Lymphozyten induziert wird.
Das Gen US28 des Cytomegalievirus codiert ein Protein, das dem Rezeptor der inflammatorischen Proteins der Makrophagen 1α (MIP-1α) homolog ist. Dieses Protein kann nun als Kompetitor der MIP-Rezeptoren wirken und nun dessen Aktivität lokal hemmen.
Das Produkt der Gene E3-14,7, E3-10,4 und E3-14,5 des Adenovirus kann die Transmission des intracellulären Signals blockieren, das durch bestimmte Cytokine vermittelt wird. Während die Cytokine sich an ihren Rezeptor auf der Oberfläche an einer infizierten Zelle binden, wird ein Signal in den Zellkern übertragen, um den Zelltod zu induzieren oder die Proteinsynthese zu stoppen. Dies ist insbesondere bei dem Tumornekrosefaktor (TNF) der Fall. Der Einbau der Gene E1-14,7, E3-10,4 und/oder E3- 14,5 in eine rekombinante DNA gemäß der Erfindung im Hinblick auf ihre konstitutive oder regulierte Expression erlaubt, dessen intracelluläre Signalbildung, die durch TNF induziert wird, zu blockieren und so die durch erfindungsgemäße rekombinante Viren infizierten Zellen vor toxischen Effekten dieses Cytokins zu schützen.
Eine lokale und vorübergehende Hemmung kann besonders vorteilhaft sein. Dies kann insbesondere durch die Wahl der besonderen Expressionssignale (Cytokine-abhängig Promotoren beispielsweise) wie nachstehend erklärt erhalten werden.
Es versteht sich, dass andere homologe Gene oder Gene mit ähnlichen funktionellen Eigenschaften zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden können. Diese verschiedenen Gene können nach jeder, einem Fachmann bekannten Technik, insbesondere durch Durchmustern von Banken, durch chemische Synthese oder nach gemischten Verfahren einschließlich der chemischen oder enzymatischen Modifikation von Sequenzen, die durch Absuchen von Banken erhalten wurden, erhalten werden. Außerdem können diese verschiedenen Gene allein oder in Kombination(en) verwendet werden.
Die Insertion der in Form von rekombinanter DNA gemäß der Erfindung in Betracht gezogenen Gene bietet eine größere Flexibilität bei der Konstruktion von Adenoviren und erlaubt eine bessere Kontrolle der Expression der Gene.
So können die rekombinanten DNAs (und nun die zwei Gene von Interesse), die in Adenovirusvektoren erfindungsgemäß eingebaut sind, auf verschiedene Weise angeordnet sein.
Sie können zuerst an eine gleiche Stelle des Genoms des Adenovirus oder an verschiedene selektionierte Stellen insertiert sein. Insbesondere können die rekombinanten DNAs mindestens teilweise in den Regionen E1, E3 und/oder E4 des Genoms des Adenovirus insertiert sein, indem sie virale Sequenzen ersetzen oder diese supplementieren.
Bevorzugt werden die rekombinanten DNAs mindestens teilweise in die Regionen E1, E3 oder E4 des Genoms des Adenovirus insertiert. Während sie an zwei verschiedenen Stellen insertiert sind, wird erfindungsgemäß die Verwendung der Regionen E1 und E3 oder E1 und E4 bevorzugt. Die Beispiele zeigen in der Tat, dass diese Organisation eine erhöhte Expression der zwei Gene ohne Interferenz zwischen den beiden Genen erlaubt. Vorteilhafterweise werden die rekombinanten DNAs durch Ersetzen von viralen Sequenzen insertiert.
Diese rekombinanten DNAs können anschließend jeweils einen gleichen oder unterschiedlichen Transkriptionspromotor tragen. Diese Konfiguration erlaubt den Erhalt von höheren Expressionshöhen und bietet eine bessere Kontrolle der Expression der Gene. In diesem Fall können die beiden Gene in gleicher Orientierung oder in entgegengesetzter Orientierung insertiert sein.
Sie können auch eine einzige Transkriptionseinheit darstellen. In dieser Konfiguration sind die beiden rekombinanten DNAs fortlaufend und so positioniert, dass die Gene unter Kontrolle des einzigen Promotors stehen und zu einer einzigen Premessager-RNA führen. Diese Anordnung ist vorteilhaft, da sie die Verwendung eines einzigen Transkriptionspromotors erlaubt.
Schließlich erlaubt die Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNAs die Verwendung von Transkriptionspromotoren unterschiedlicher Natur und insbesondere von starken oder schwachen, regulierten oder konstitutiven, gewebsspezifischen oder ubiquitären etc. Promotoren.
Die Wahl der Expressionssignale und der jeweiligen Position der rekombinanten DNAs ist zum Erhalt eines erhöhten expressionstherapeutischen Gens und eines bedeutenden immunschützenden Effekts besonders wichtig.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet ein defektes Adenovirus, umfassend eine erste rekombinante DNA, die ein therapeutisches Gen enthält, und eine zweite rekombinante DNA, die ein immunschützendes Gen enthält, indem die beiden rekombinanten DNAs in der E1-Region insertiert sind.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet ein defektes Adenovirus, umfassend eine erste rekombinante DNA, die ein therapeutisches Gen enthält, das in der Region E1 insertiert ist, und, eine zweite rekombinante DNA, die ein immunschützendes Gen enthält, das in der E3-Region insertiert ist.
Wie vorstehend ausgeführt, sind die erfindungsgemäßen Adenoviren defekt, d. h. sie können sich nicht autonom in der Zielzelle replizieren. Allgemein fehlen dem Genom der erfindungsgemäßen defekten Adenoviren nun mindestens die Sequenzen, die für die Replikation des Virus in der infizierte Zelle notwendig sind. Diese Regionen können entweder eliminiert sein (ganz oder teilweise) oder nicht- funktionell gemacht worden sein oder durch andere Sequenzen und insbesondere durch die therapeutischen Gene substituiert sein. Der defekte Charakter der erfindungsgemäßen Adenoviren ist ein wichtiges Element, da er die fehlende Verbreitung der erfindungsgemäßen Vektoren nach Verabreichung gewährleistet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Adenoviren ITR-Sequenzen und eine Sequenz, die Verkapselung erlaubt und besitzen eine vollständige oder teilweise Deletion des Gens E1.
Die invertiert repetierten Sequenzen (ITR) bilden den Replikationsorigin der Adenoviren. Sie sind an den 3'- und 5'-Enden des viralen Genoms lokalisiert (vgl. Fig. 1), von wo aus sie leicht nach klassischen Techniken der Molekularbiologie, die einem Fachmann bekannt sind, isoliert werden können. Die Nukleotidsequenz der ITR- Sequenzen der menschlichen Adenoviren (insbesondere die Serotypen Ad2 und Ad5) ist in der Literatur beschrieben, ebenso die Hundeadenoviren (insbesondere CAV1 und CAV2). Bezüglich des Adenovirus Ad5 beispielsweise entspricht die linke ITR-Sequenz der Region, die die Nukleotide 1 bis 103 des Genoms umfasst.
Die Verkapselungssequenz (auch als Sequenz Psi bezeichnet) ist zur Verkapselung der viralen DNA notwendig. Diese Region muss nun vorhanden sein, damit defekte rekombinante erfindungsgemäße Adenoviren hergestellt werden können. Die Verkapselungssequenz ist in dem Genom des Adenovirus zwischen dem linken ITR (5') und dem Gen E1 (vgl. Fig. 1) lokalisiert. Sie kann isoliert oder künstlich durch klassische Techniken der Molekularbiologie synthetisiert werden. Die Nukleotidsequenz der Verkapselungssequenz der menschlichen Adenoviren (insbesondere die Serotypen Ad2 und Ad5) ist in der Literatur beschrieben ebenso Hundeadenoviren (insbesondere CAV1 und CAV2). Bezüglich des Adenovirus Ad5 beispielsweise entspricht die Verkapselungssequenz der Region, die die Nukleotide 194 bis 358 des Genoms umfasst.
Noch bevorzugter umfassen die erfindungsgemäßen Adenoviren die ITR-Sequenz und eine Sequenz, die Verkapselung erlaubt, und besitzen eine vollständige oder teilweise Deletion der Gene E1 und E4.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Genom der erfindungsgemäßen Adenoviren vollständig oder teilweise bezüglich der Gene E1, E3 und E4 und noch bevorzugter vollständig oder teilweise bezüglich der Gene E1, E3, L5 und E4 deletiert.
Die erfindungsgemäßen Adenoviren können aus Adenoviren verschiedener Ursprünge hergestellt werden. Es gibt in der Tat verschiedene Serotypen von Adenoviren, deren Struktur und Eigenschaften ein wenig variieren, aber die eine genetisch vergleichbare Organisation besitzen. Ebenso können die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Anordnungen leicht von einem Fachmann auf dem Gebiet für jeden Typ von Adenovirus reproduziert werden.
Ganz besonders können die erfindungsgemäßen Adenoviren menschlichen, tierischen oder gemischten (menschlich und tierisch) Ursprungs sein.
Bezüglich der Adenoviren menschlichen Ursprungs werden bevorzugt diejenigen, die in die Gruppe C klassifiziert sind, verwendet. Noch bevorzugter werden unter den verschiedenen Serotypen des menschlichen Adenovirus im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad2 oder Ad5) verwendet.
Wie vorstehend angegeben, können die erfindungsgemäßen Adenoviren auch tierischen Ursprungs sein oder Sequenzen, die aus Adenoviren tierischen Ursprungs hervorgegangen sind, umfassen. Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass die Adenoviren tierischen Ursprungs mit großer Wirksamkeit menschliche Zellen infizieren können und dass sie sich in menschlichen Zellen nicht vermehren können, in denen sie getestet wurden (vgl.. französische Patentanmeldung FR 9 305 954). Die Anmelderin hat auch gezeigt, dass die Adenoviren tierischen Ursprungs in keiner Weise durch die Adenoviren menschlichen Ursprungs trans-komplementiert werden, was jedes Risiko einer Rekombination und Fortpflanzung in vivo in Anwesenheit eines menschlichen Adenovirus beseitigt, die zur Bildung eines infektiösen Teilchens führen könnte. Die Verwendung des Adenovirus oder der Regionen des Adenovirus tierischen Ursprungs ist somit besonders vorteilhaft, da die mit der Verwendung von Viren als Vektoren in der Gentherapie inhärenten Risiken noch geringer sind.
Die Adenoviren tierischen Ursprungs, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können aus dem Hund, dem Rind, der Maus (Beispiel: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), dem Schaf, dem Schwein, dem Vogel oder auch dem Affen (beispielsweise SAV) stammen. Insbesondere unter den Adenoviren des Vogels können die Serotypen 1 bis 10, die bei der ATCC zugänglich sind, genannt werden, wie beispielsweise die Stämme Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VRT828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-11 (ATCC VR-921) oder auch die Stämme mit der Bezeichnung ATCC VR-831 bis 835. Unter den Adenoviren des Rinds können die verschiedenen bekannten Serotypen und insbesondere die zwei, die bei der ATCC. (Typen 1 bis 8) unter den Hinterlegungsnrn. ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 und 769 hinterlegt sind, verwendet werden. Es können auch die Maus-Adenoviren FL (ATCC VR-550) und E20308 (ATCC VR-528), das Schaf-Adenovirus Typ 5 (ATCC VR-1343) oder Typ 6 (ATCC VR-1340), Schweine-Adenovirus 5359 oder Affen-Adenoviren, wie insbesondere die bei der ATCC unter den Nummern VR- 591-594, 941-943, 195-203 hinterlegten Adenoviren verwendet werden.
Bevorzugt werden unter den verschiedenen Adenoviren tierischen Ursprungs erfindungsgemäß die Adenoviren oder Regionen von Adenoviren aus dem Hund und insbesondere alle Stämme der Adenoviren CAV2 [Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800) beispielsweise] verwendet. Die Hunde- Adenoviren sind der Gegenstand zahlreicher Strukturstudien. Ebenso wurden vollständige Restriktionskarten der Adenoviren CAV1 und CAV2 im Stand der Technik (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989), 165) beschrieben, und die Gene E1a, E3 sowie die Sequenzen ITR wurden cloniert und sequenziert (vergleiche insbesondere Spibey et al., Virus Res. 14 (1989), 241; Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten defekten Adenoviren können auf verschiedene Weisen hergestellt werden.
Ein erstes Verfahren besteht darin, dass man DNA des rekombinanten defekten Virus, die in vitro hergestellt wurde (entweder durch Ligierung oder in Form eines Plasmids) in eine kompetente Zelllinie, d. h. eine, die in trans alle Funktionen trägt, die zur Komplementierung des defekten Virus notwendig sind, transfiziert. Diese Funktionen sind bevorzugt in das Genom der Zelle integriert, wodurch die Risiken der Rekombination vermieden werden können und was der Zelllinie eine erhöhte Stabilität verleiht.
Eine zweite Variant besteht in der Co-Transfektion einer geeigneten Zelllinie mit der DNA des rekombinanten defekten Virus, der in vitro hergestellt wurde (entweder durch Ligierung oder in Form eines Plasmids) und der DNA eines Helfervirus. Gemäß diesem Verfahren ist es nicht notwendig, eine kompetente Zelllinie mit der Fähigkeit, alle defekten Funktionen des rekombinanten Adenovirus zu komplementieren, zur Verfügung zu haben. Ein Teil dieser Funktionen wird in der Tat durch das Helfervirus komplementiert. Dieses Helfervirus muss selbst defekt sein, und die Zelllinie trägt in trans Funktionen, die zu dessen Komplenientierung notwendig sind. Unter den insbesondere im Rahmen dieser zweiten Variante verwendbaren Zelllinien können insbesondere die Linie der embryonalen menschlichen Niere 293, die KB-Zellen, die Hela-Zellen, MDCK, GHK etc. genannt werden (vgl. die Beispiele).
Anschließend werden die Vektoren, die multipliziert sind, wiedergewonnen, gereinigt und gemäß klassischen Techniken der Molekularbiologie amplifiziert.
Gemäß einer Variante der Ausführungsform ist es möglich, in vitro entweder durch Ligierung oder in Form eines Plasmids DNA des rekombinanten defekten Virus, das geeignete Deletionen und die zwei rekombinanten DNAs trägt, herzustellen. Wie vorstehend angegeben, besitzen die erfindungsgemäßen Vektoren vorteilhafterweise eine Deletion der Gesamtheit oder eines Teils bestimmter viraler Gene, insbesondere der Gene E1, E3, E4 und/oder L5. Diese Deletion kann jedem Typ von Suppression, die das in Betracht gezogene Gen betrifft, entsprechen. Es handelt sich insbesondere um die Suppression der Gesamtheit oder eines Teils der Region, die das Gen codiert und/oder um die Gesamtheit oder einen Teil der Promotorregion der Transkription des Gens. Die Suppression wird im Allgemeinen an DNA des rekombinanten defekten Virus durchgeführt, beispielsweise durch Spaltung mittels geeigneter Restriktionsenzyme, dann Ligierung gemäß Techniken der Molekularbiologie, wie in den Beispielen erläutert ist. Die rekombinanten DNAs können anschließend in dieser DNA durch enzymatische Spaltung, anschließend durch Ligierung in den ausgewählten Regionen und in der gewählten Orientierung insertiert werden.
Die so erhaltene DNA, die nun geeignete Deletionen und die zwei rekombinanten DNAs trägt, erlaubt die direkte Erzeugung eines rekombinanten defekten Adenovirus, das die Deletionen und die rekombinanten DNAs trägt. Diese erste Variante eignet sich besonders zur Herstellung von rekombinanten Adenoviren, in denen die Gene in Form einer einzigen Transkriptionseinheit oder unter der Kontrolle von getrennten Promotoren, aber insertiert an einer gleichen Stelle des Genoms, vorhanden sind.
Es ist auch möglich, das rekombinante Virus in zwei Etappen herzustellen, die die sukkzessive Einschleusung der zwei rekombinanten DNAs erlauben. So wird die DNA eines ersten rekombinanten Virus, das die geeigneten Deletionen (oder einen Teil der Deletionen) und eine der rekombinanten DNAs enthält, durch Ligierung oder in Form des Plasmids konstruiert. Diese DNA wird anschließend zur Erzeugung eines ersten rekombinanten Virus, das die Deletionen und eine rekombinante DNA trägt, verwendet. Die DNA dieses ersten Virus wird anschließend isoliert und mit einem zweiten Plasmid oder der DNA eines zweiten rekombinanten defekten Virus, das die zweite rekombinante DNA, geeignete Deletionen (ein Teil, der auf dem ersten Virus nicht vorhanden ist) und eine Region, die die homologe Rekombination erlaubt, trägt, co-transfiziert. Diese zweite Stufe erzeugt so das rekombinante defekte Virus, das die zwei rekombinanten DNAs trägt. Diese Variante der Herstellung eignet sich besonders zur Herstellung von rekombinanten Viren, die zwei rekombinante DNAs tragen, die in zwei verschiedenen Regionen des Genoms des Adenovirus insertiert sind.
Die zwei erfindungsgemäßen Mittel, d. h. Immunsuppressor und rekombinantes Adenovirus, können im Hinblick auf eine Verabreichung auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokulärem, transdermalem etc. Weg formuliert werden.
Bevorzugt enthält/enthalten die jeweiligen) pharmazeutischen) Formulierung(en) pharmazeutisch verträgliche Träger für eine injizierbare Formulierung. Es kann sich insbesondere um Salzlösungen (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid etc. oder die Gemische dieser Salze), sterile, isotonische Lösung oder trockene Zusammensetzungen, insbesondere in lyophilisierter Form, handeln, die durch Zugabe je nach Fall von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Konstitution von injizierbaren Soluten erlauben.
Die Dosen an Immunsuppressor und an verwendetem Adenovirus zur Injektion können als Funktion verschiedener Parameter und insbesondere als Funktion des verwendeten Verabreichungswegs, der betroffenen Pathologie, des zu exprimierenden Gens oder auch der Dauer der gewünschten Behandlung angepasst werden.
Allgemein werden die erfindungsgemäßen rekombinanten Adenoviren formuliert und in Form von Dosen zwischen 104 und 10¹&sup4; pfu/ml und bevorzugt 10&sup6; bis 10¹&sup0; pfu/ml verabreicht. Der Ausdruck pfu ("plaque forming xnit") entspricht einer Infektionskraft einer in Betracht gezogenen Lösung und wird durch Infektion einer geeigneten Zellkultur bestimmt und misst im Allgemeinen nach 5 Tagen die Anzahl der infizierten Zellplaques. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Titers einer viralen Lösung sind in der Literatur gut dokumentiert. Was insbesondere die Immunsuppressoren betrifft, variieren ihre Dosen und Injektionsarten entsprechend ihrer Natur. Die Einstellung dieser zwei Parameter entspricht den Kompetenzen des Fachmanns.
Die medikamentöse Assoziation gemäß den Ansprüchen 1 bis 25 kann zur Behandlung oder zur Verhütung zahlreicher Pathologien verwendet werden. Entsprechend dem in sein Adenovirus insertierten therapeutischen Gen kann sie insbesondere zur Behandlung oder Verhütung von genetischen Erkrankungen (Dystrophie, Muskoviszidose etc.), neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson, ALS etc.) hyperproliferativen Pathologien (Krebs, Restenose etc.), Pathologien im Zusammenhang mit Störungen der Blutgerinnung oder Dyslipoproteinämien, Pathologien im Zusammenhang mit viralen Infektionen (Hepatitis-Fälle, AIDS etc.) etc. verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird vollständiger anhand der folgenden Beispiele erklärt, die jedoch nur als Erläuterung, nicht als Beschränkung gelten.
Fig. 1: genetische Organisation des Adenovirus Ad5. Die vollständige Sequenz von Ad5 ist auf der Basis der Angaben verfügbar und erlaubt dem Fachmann, jede Restriktionsspaltstelle zu selektionieren oder zu erzeugen und auch die ganze Region das Genoms zu isolieren.
Fig. 2: Restriktionskarte dse Adenovirus CAV2 Stamm Manhattan (gemäß Spibey et al., wie vorstehend zitiert).
Fig. 3: Konstruktion des Vektors pAD5-gp191k-ßgal.
Fig. 4: Konstruktion des Adenovirus Ad-gp19k-ßgal, ΔE1, ΔE3.

Allgemeine Techniken der Molekularbiologie

Die klassisch verwendeten Methoden der Molekularbiologie, wie die präparativen Extraktionen von Plasmid-DNA, Zentrifugation der Plasmid-DNA über einem Caesiumchloridgradienten, Elektrophorese über Agarosegele oder Acrylamidgele, Reinigung der DNA-Fragmente durch Elektroelution, Extraktion von Proteinen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, Fällung der DNA in Salzlösung durch Ethanol oder Isopropanol, Transformation in Escherichia coli etc. sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt und sind ausführlich in der Literatur beschrieben [Maniatis et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 11982; Ausubel F.M. et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC und die Phagen der Reihe M13 sind im Handel erhältlich (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligierungen können die DNA-Fragmente gemäß ihrer Größe elektrophoretisch in Agarosegelen oder Acrylamidgelen getrennt werden, mit Phenol oder einem Gemisch Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt werden, dann in Gegenwart von DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) gemäß den Angaben des Herstellers inkubiert werden.
Die Auffüllung der überstehenden 5'-Enden kann durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt werden. Die Zerstörung der überstehenden 3'-Enden wird in Gegenwart von DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet werden, durchgeführt. Die Zerstörung der überstehenden 5'-Enden wird durch schonende Behandlung mittels 51-Nuklease durchgeführt.
Die gesteuerte Mutagenese in vitro durch synthetische Oligodesoxynukleotide kann gemäß dem von Taylor et al. entwickelten Verfahren [Nucleic Acids Res. 13 (1985), 8749-87643 unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt werden.
Die enzymatische Amplifikation der DNA-Fragmente durch die sogenannte PCR-Technik [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K, et al., Science 230 (1985), 1350- 1354; Mullis K.B. und Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] kann unter Verwendung eines "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt werden.
Die Bestätigung der Nukleotidsequenzen kann durch das von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci USA, T4 (1977), 5463- 5467] entwickelte Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits vorgenommen werden.

Verwendete Zelllinien

In den folgenden Beispielen wurden die folgenden Zelllinien verwendet oder können verwendet werden:
- Embryonale menschliche Nierenlinie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977), 59). Diese Linie enthält insbesondere integriert in ihr Genom den linken Teil des Genoms des menschlichen Adenovirus Ad5 (12%).
- Linie der menschlichen Zellen KB: hervorgegangen aus einem menschlichen epidermalen Carcinom ist diese Linie bei der ATCC (siehe CCL17) sowie die Bedingungen zu deren Kultur erhältlich.
- Linie der menschlichen Hela-Zellen: hervorgegangen aus einem menschlichen Epithelearcinom ist diese Linie bei der ATCC (siehe CCL2) sowie die Bedingungen zu ihrer Kultur erhältlich.
- Linie von Hundezellen MDCK: die Bedingungen der Kultur der MDCK-Zellen sind insbesondere in Macatney et al., Science 44 (1988), 9 beschrieben.
- Linie der gm-Zellen DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624). Diese Linie besteht aus Hela-Zellen, die das E2-Gen des Adenovirus unter der Kontrolle von LTR von MMTV tragen.

BEISPIELE

Beispiel 1. Konstruktion rekombinanter defekter Adenoviren, umfassend ein therapeutisches Gen (das LacZ- Gen von E, coli) unter Kontrolle des Promotors des LTR von RSV und das Gen gp19k unter der Kontrolle des Promotors von LTR von RSV, beide insertiert in die E1-Region.
Diese Adenoviren wurden durch homologe Rekombination zwischen einem Plasmid, das den linken Teil des Adenovirus Ad5, die zwei rekombinanten DNAs und eine Region des rekombinanten Adenovirus Ad5 (entsprechend dem Protein IX) trägt, und der DNA eines defekten Adenovirus, das die verschiedenen Deletionen trägt, konstruiert.

1. Konstruktion des Vektors pAD5-gp19k-ßgal (Fig. 3)

1.1. Konstruktion des Plasmids pGEM-gp19k

Das Plasmid pADS-gp19k-ßgal enthält eine cDNA-Sequenz, die das Protein gp19k des Adenovirus codiert. Dieses Plasmid wurde wie folgt konstruiert. Das Fragment XbaI des Genoms des wilden Adenovirus Ad5, das die Region E3 enthält, wurde isoliert und in die entsprechende Stelle des Plasmids pGEM (Promega) cloniert, um das Plasmid pGEM-E3 zu erzeugen. Das Fragment HinfI, das die Sequenz, die gp19k codiert (Nukleotide 28628 bis 29634 des wilden Adenovirus Ad5), enthält, wurde anschließend aus dem Plasmid pGEM-E3 isoliert. Die Enden dieses Fragments wurden durch Einwirkung des Klenow-Fragments der DNA- Polymerase I von E. coli glattendig gemacht (vgl. allgemeine Techniken der Molekularbiologie), dann wurde das so erhaltene Fragment in die SmaI-Spaltstelle des Plasmids pGEMzf+ (Promega) cloniert.
Das so erhaltene Plasmid wurde als pGEM-pg19k bezeichnet (Fig. 3).
1.2 Konstruktion des Vektors pAD5-gp19k-ßgal
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Plasmids, das eine der zwei rekombinanten DNAs enthält, die ihren eigenen Promotor, den linken Teil des Genoms des Adenovirus und einen zusätzlichen Teil (Protein pIX), der die homologe Rekombination erlaubt, enthält. Dieser Vektor wurde aus dem Plasmid pAd.RSVβGal wie folgt konstruiert.
Das Plasmid pAd.RSVβGal enthält in der 5'-> 3'-Orientierung
- das PvuII-Fragment, entsprechend dem linken Ende des Adenovirus Ad5, umfassend die Sequenz ITR, den Replikationsorigin; die Verkapselungssignale und den Amplifikator E1A;
- das Gen, das β-Galactosidase unter der Kontrolle des RSV-Promotors codiert (das Rous-Sarkomvirus);
- ein zweites Fragment des Genoms des Adenovirus Ad5, das die homologe Rekombination zwischen dem Plasmid pAd.RSVßGal und dem Adenovirus d1324 erlaubt. Das Plasmid pAd.RSVßGal wurde von Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992), 626) beschrieben.
Das Plasmid pAd.RSVßGal wurde zuerst durch die Enzyme EagI und C1aI gespalten. Dies erzeugt ein erstes Fragment, das insbesondere den linken Teil des Adenovirus Ad5 und den Promotor des LTR von RSV trägt. Parallel dazu wurde das Plasmid pAd.RSVßGal auch mit den Enzymen EagI und XbaI gespalten. Dies erzeugt einen zweiten Fragmenttyp, der insbesondere den Promotor des LTR von RSV, das tacz-Gen und ein Fragment des Genoms des Adenovirus Ad5 trägt, das die homologe Rekombination erlaubt. Die Fragmente CalI- EagI und EagI-XbaI wurden anschließend in Gegenwart des XbaI-ClaI-Fragments des Plasmids pGEM-gp19k (Beispiel 1.1) ligiert, das die Sequenz trägt, die gp19k codiert (vergleiche Fig. 3). Der so erhaltene Vektor mit der Bezeichnung pAD5-gp19k-j3gal enthält nun
- das PvuII-Fragment, entsprechend dem linken Ende des Adenovirus Ad5, umfassend die ITR-Sequenz, den Relikationsorigin, die Verkapselungssignale und den Amplifikator E1A;
- die Sequenz, die gp19k codiert, unter der Kontrolle des Promotors RSV (des Rous-Sarkomvirus);
- das Gen, das β-Galactosidase codiert, unter der Kontrolle des Promotors RSV (des Rous-Sarkomvirus) und
- ein zweites Fragment des Genoms des Adenovirus Ad5, das die homologe Rekombination erlaubt.

2. Konstruktion der rekombinanten Adenoviren

2.1 Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus, das in der Region E1 deletiert ist, das die zwei rekombinanten DNAs, insertiert in der gleichen Orientierung wie die E1- Region, enthält.
Der Vektor pAD5-gp19k-βgal wurde linearisiert und mit einem in dem Gen E1 defekten Adenovirusvektor in Helferzellen (Linie 293), die in trans die durch die Regionen E1 (E1A und E1B) des Adenovirus codierten Funktionen enthalten, co-transfiziert.
Genauer wurde das Adenovirus. Ad-gp19k-ßgal,ΔE1 durch homologe Rekombination in vivo zwischen dem Adenovirus Ad- RSVßgal (vgl. Stratford-Perricaudet, wie vorstehend zitiert) und dem Vektor pAD5-gp19k-ßgal gemäß dem folgenden Protokoll erhalten: das Plasmid pADS-gp19k-ßgal, das mit XmnI linearisiert wurde, und das Adenovirus Ad- RSVßgal, das mit dem Enzym Ca1I linearisiert wurde, wurden in die Linie 293 in Gegenwart von Calciumphosprit cotransfiziert, um die homologe Rekombination zu erlauben. Die so erzeugten rekombinanten Adenoviren wurden anschließend durch Reinigung über Plaque selektioniert, Nach der Isolierung wurde die DANN des rekombinanten Adenovirus in der Zelllinie amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führte, der das defekte rekombinante nicht-gereinigte Adenovirus mit einem Titer von etwa 10¹&sup0; pfu/ml enthielt.
Die viralen Teilchen werden im Allgemeinen durch Zentrifugation über einem Caesiumchloridgradienten gemäß bekannten Techniken (vergleiche insbesondere Graham et al., Virology 52 (1973), 456) gereinigt. Das Adenovirus Ad-gp19k-ßgal, ΔE1 kann bei -80ºC in 20% Glycerin konserviert werden.
2.2. Konstruktion eines rekombinanten in den E1- und E3- Regionen deletierten Adenovirus, das die zwei rekombinanten DNAs, insertiert in gleicher Orientierung, in der E1-Region enthält (Fig. 4).
Der Vektor pAD5-gp19k-ßgal wurde linearisiert und mit einem in den Genen E1 und E3 defekten adenoviralen Vektor in Helferzellen (Linie 293) co-transfiziert, die in trans die von den Regionen E1 (E1A und E1B) des Adenovirus codierten Funktionen hinzufügen.
Genauer wurde das Adenovirus Ad-gp19k-ßgal,ΔE1,ΔE2 durch homologe Rekombination in vivo zwischen der Adenovirusmutante Ad-d11324 (Thimmapppaya et al., Cell 31 (1982), 543) und dem Vektor pAD5-gp19k-ßgal gemäß dem folgenden Protokoll erhalten: das Plasmid pAD5-gp19k-ßgal und das Adenovirus Ad-d11324, linearisiert durch das Enzym ClaI wurden in die Linie 293 in Gegenwart von Calciumphosphat co-transfiziert, um die homologe Rekombination zu erlauben. Die so erzeugten rekombinanten Adenoviren wurde anschließend durch Reinigung über Plaque selektioniert. Nach der Isolierung wurde die DNA des rekombinanten Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führte, der das defekte rekombinante nicht-gereinigte Adenovirus mit einem Titer von etwa 10¹&sup0; pfu/ml enthält.
Die viralen Teilchen werden im Allgemeinen durch Zentrifugation über einen Caesiumchloridgradienten gemäß bekannten Techniken (vergleiche insbesondere Graham et al., Virology 52 (1973), 456) gereinigt. Das Genom des rekombinanten Adenovirus wurde anschließend durch Southern-Blot-Analyse bestätigt. Das Adenovirus Ad-gp19k- ßgal,ΔE1,ΔE3 kann bei -80ºC in 20% Glycerin konserviert werden.
Beispiel 2: Nachweis der immunschützenden Aktivität der erfindungsgemäßen medikamentösen Assoziation
60 weibliche erwachsene Mäuse DBA/2 werden nach dem Zufallsprinzip in 6 Gruppen zu 10 Mäusen aufgeteilt, die jeweils gemäß den folgenden Injektionsprotokollen behandelt werden:
- GRUPPE 1a:
Diese erhält eine intraokulare Injektion zu 10 ug monoclonaler Anti-CD3-Antikörper an den Tagen -2, -1, 1, 2, 3, 4, und 5, wobei am Tag 0 eine intravenöse Injektion von 4.10&sup9; pfu des Virus Ad-RSVßgal (vgl. Stratford, Perricaudet, wie oben angegeben) vorgenommen wird.
- GRUPPE 1b:
Sie erhält die gleiche Behandlung wie Gruppe 1a, wobei ein Virustiter von 4.10&sup9; pfu des Virus Ad-gp19k-ßgal (Fig. 4) verwendet wird.
- GRUPPE 2a:
Sie erhält eine intraperitoneale Injektion von 250 ug monoclonalen Anti-CD4-Antikörpern an den Tagen -2, -1, 1, 4, 7, wobei am Tag 0 eine intravenöse Injektion von 4.10&sup9; pfu des Virus Ad-RSVßgal vorgenommen wird.
- GRUPPE 2b:
Sie erhält die gleiche Behandlung wie die Gruppe 2a, wobei als Virustiter 4.10&sup9; pfu des Virus Adgp19k-ßgal verwendet werden,
- GRUPPE 3a:
Sie erhält eine intravenöse Injektion von 4.10&sup9; pfu von Ad- ßgal ohne gleichzeitige Verabreichung eines Immunsuppressors.
- GRUPPE 3b:
Sie erhält eine intravenöse Injektion von 4.10&sup9; pfu von Ad- gp19k-ßgal ohne gleichzeitige Verabreichung eines Immunsuppressors.
Zu verschiedenen Zeiten werden zwei Tiere jeder Gruppe mit dem Ziel getötet, die Leber und die Milz zu entnehmen.
2.1. Immunfluoreszenzanalyse der Verteilung der hauptsächlichen Lymphozyten-Subpopulationen (CD3+, CD4+ und CD8+) in den Splenoxyten, die am Tag 15 nach der Injektion entnommen wurden.
Eine Suspension isolierter Zellen wurde aus den entnommenen Milzen hergestellt. Eine Probe dieser Zellen wurde mittels Immunfluoreszenz mit Hilfe von für jede Lymphozytenunterpopulation spezifischen Antikörpern analysiert. Die Ablesung der fluoreszierenden Zellen wurde mit einem Cytofluorometer (FACS Schan-Becton Dickinson) vorgenommen. Die folgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse.

TABELLE I

Es wird eine deutliche Verminderung der CD3+-, CD4+- und CD8+-Zellen bei den mit Anti-CD3-behandelten Tieren und eine selektive Verminderung der CD4+-Zellen bei mit Anti- CD4-behandelten Tieren beobachtet.

2.2. Analyse der cytotoxischen Fähigkeit der am Ta 32 nach der Injektion entnommenen und in vitro gegenüber histokompatiblen Zielen, die ßgal exprimieren, stimulierten Splenozyten

Eine zweite Probe der aus den Milzen der behandelten Tiere entnommenen Splenozyten wurde in vitro 4 Tage in Gegenwart von P815-Zellen, die die β-Galactosidase auf ihrer Oberfläche exprimieren, gezüchtet. Nach der Kultur wurde die cytotoxische Aktivität der Splenozyten gegenüber den mit Cr&sup5;¹ markierten Zielzellen P815-βgal bewertet. Die cytotoxische Aktivität, ausgedrückt durch den Prozentsatz der Cytolyse, wurde auf herkömmliche Weise bestimmt, indem verschiedene Verhältnisse der Effektorzellen und der Zielzellen aufgestellt wurden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben.

TABELLE II

Die bei den Tieren entnommenen Splenozyten, die die Behandlung mit Anti-CD4 erhalten hatten, d. h. die Gruppe 2b, zeigt eine sehr deutliche Neutralisation ihrer cytotoxischen Kapazität.

TABELLE II

2.3 Expression der β-Galactosidaseaktivität in der Leber nach 15 und 32 Tagen

Die Leber werden selektioniert und X-gal gefärbt, um die β-Galactosidaseaktivität zu zeigen, und mit Eosin gefärbt, um die Histologie des Schnitts nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben.

TABELLE III

Aus den vorstehend angegeben Ergebnissen folgt, dass die Injektion mit einem Anti-CD4-Antikörper in Assoziation mit einer Injektion von Adgp19k-ßgal eine deutlich verlängerte Expression des in Betracht gezogenen Gens induziert.
Ebenso wird 30 Tage nach den Injektionen im Fall der Gruppe 2b eine signifikante β-Galactosidaseaktivität beobachtet. Diese Verlängerung, die als Folge eines Toleranzphänomens interpretiert werden kann, das erfindungsgemäß induziert wurde, ist deutlich größer als die, die durch eine einfache Beiordnung der jeweiligen Effekte von Anti-CD4-Immunsuppressor und rekombinantem Adenovirus Adgp19k-βgal erwartet werden konnte.
Keine Entzündungsreaktion wurde außerdem bei dieser Verzögerung von 30 Tagen in Falle der Gruppe 2b beobachtet.

Claims

1. Medikamentöse Assoziation mindestens eines immunsuppressiven Mittels und mindestens eines defekten rekombinanten Adenovirus, dessen Genom eine erste rekombinante DNA, die ein therapeutisches Gen enthält, und eine zweite rekombinante DNA, die ein immunschützendes Gen enthält, umfasst, zur aufeinanderfolgenden, zeitlich abgestuften und/oder gleichzeitigen Verwendung für exogene in vivo- und/oder ex-vivo-Transfektionen.

2. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das immunsuppressive Mittel bevorzugt aus Cyclosporin, FK506, Azathioprin, Corticosteroiden und mono- oder polyclonalen Antikörpern ausgewählt ist.

3. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Antikörper mit der Fähigkeit, Immunmoleküle zu inaktivieren oder Zerstörung von Immunzellen, die diese Moleküle tragen, hervorzurufen, handelt.

4. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper aus anti-CD4, -CD2, -CD3, -CD8, -CD28, -B7, -ICAM-1, -LFA-1 und CTLA4Ig ausgewählt ist.

5. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutische Gen ein therapeutisches Protein codiert.

6. Medikamentöse Assoziation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das therapeutische Gen eine therapeutische RNA codiert.

7. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das immunschützende Gen ein Gen ist, dessen Produkt auf die Aktivität des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes (MHC) oder die Aktivität der Cytokine einwirkt.

8. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, kennzeichnet, dass das immunschützende Gen ein Gen ist, dessen Produkt mindestens teilweise die Expression der MHC-Proteine oder der Antigenpräsentation hemmt.

9. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das immunschützende Gen aus dem Gen von gp19k des Adenovirus, dem Gen ICP47 des Herpesvirus oder dem Gen UL18 des Cytomegalievirus ausgewählt ist.

10. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet dass die zwei rekombinanten DNAs des Genoms des Adenovirus eine einzige Transkriptionseinheit darstellen.

11. Medikamentöse Assoziation nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei rekombinanten DNAs jeweils einen gleichen oder unterschiedlichen Transkriptionspromotor umfassen.

12. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei rekombinanten DNAs in gleicher Orientierung insertiert sind.

13. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei rekombinanten DNAs in entgegengesetzten Orientierungen insertiert sind.

14. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei rekombinanten DNAs an der gleichen Stelle des Genoms des Adenovirus, bevorzugt in den Regionen E1, E3 oder E4, insertiert sind.

15. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei rekombinanten DNAs in der Region E1 insertiert sind.

16. Medikamentöse Assoziation nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei rekombinanten DNAs an verschiedenen Stellen des Genoms des Adenovirus insertiert sind.

17. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die eine der rekombinanten DNAs in der Region E1 und die andere in der Region E3 oder E4 insertiert ist.

18. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Adenovirus ein defektes rekombinantes Adenovirus, umfassend die Sequenzen ITR, eine Sequenz, die die Verkapselung erlaubt, und enthaltend eine teilweise oder vollständige Deletion der Gene E1 und E4, ist.

19. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Adenovirus handelt, das die ITR-Sequenzen, eine Sequenz, die die Verkapselung erlaubt und eine ganze oder teilweise Deletion der Gene E1, E3 und E4 enthält, umfasst.

20. Medikamentöse Assoziation nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Adenovirus handelt, dessen Genom ganz oder teilweise in den Genen E1, E3, L5 und E4 deletiert ist.

21. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Adenovirus menschlichen, tierischen oder gemischten Ursprungs ist.

22. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Adenoviren menschlichen Ursprungs aus denjenigen, die in die Gruppe C klassifiziert sind, bevorzugt aus den rekombinanten Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5), ausgewählt sind.

23. Medikamentöse Assoziation nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenoviren tierischen Ursprungs aus Adenoviren aus Hund, Rind, Maus, Schaf, Schwein, Vogel und Affe ausgewählt sind.

24. Medikamentöse Assoziation nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das immunsuppressive Mittel vor und nach der Injektion des Adenovirus injiziert wird.

25. Medikamentöse Assoziation nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das immunsuppressive Mittel und das rekombinante Adenovirus gleichzeitig injiziert werden.