JPH11500430A

JPH11500430A - 外来遺伝子の生体内トランスフェクション及び発現に有用な併用医薬

Info

Publication number: JPH11500430A
Application number: JP8524707A
Authority: JP
Inventors: バツク，ジヤン−フランソワ; シヤトヌー，リユシエーヌ; アダダ，エデイ; リー，マーテイン; ペリコデ，ミシエル; ウエブ，ミシエール
Original assignee: ローヌ−プーラン・ロレ・エス・アー; アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル
Priority date: 1995-02-14
Filing date: 1996-02-12
Publication date: 1999-01-12
Also published as: CA2211039C; ES2163612T3; PT809516E; NO973724D0; US20040265276A1; FI973323L; US20030004091A1; DK0809516T3; MX9706017A; HUP9800635A3; FR2730411B1; AU4723896A; FI973323A0; NO320072B1; CZ258197A3; NO973724L; SK282235B6; KR19980702199A; DE69614668T2; BR9607310A

Abstract

(57)【要約】本発明は、少なくとも１種類の免疫抑制剤と、治療用遺伝子を含む第一組換えＤＮＡと免疫防御遺伝子を含む第二組換えＤＮＡとをゲノムに含む少なくとも１種類の組換えアデノウイルスとから成る併用医薬であって、時間的に連続的、断続的及び／または同時的に投与でき、体内及び／または体外での外来遺伝子トランスフェクションに有用な併用医薬に関する。

Description

【発明の詳細な説明】外来遺伝子の生体内トランスフェクション及び発現に有用な併用医薬本発明は遺伝子療法の分野、特に目的とする治療用遺伝子を発現させるためのアデノウイルスの使用に関する。より特定的には本発明は、２種類の治療薬の併用に基づく遺伝性疾患の新規な治療方法に関する。遺伝子療法は、病気に冒された細胞または器官に遺伝情報を導入することによって欠損または異常（突然変異、異常発現、など）を矯正する治療方法である。この遺伝情報を、器官から抽出した細胞にｉｎｖｉｔｒｏ即ち生体外（ex viv o ）で導入し、修飾された細胞を生物体内に再導入してもよく、または、遺伝情報を直接に適当な組織中に生体内（ｉｎｖｉｖｏ）導入してもよい。後者の場合には、種々の物理的なトランスフェクション技術が存在しており、特に、ウイルスをベクターとして用いる技術がある。これに関しては、いくつかの細胞集団に対するウイルスの感染能力が種々のウイルスについて試験されている。試験されたウイルスとしては特に、レトロウイルス（ＲＳＶ，ＨＭＳ，ＭＭＳなど）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルス及びアデノウイルスがある。これらのウイルスのうちで、アデノウイルスは遺伝子療法で有利に使用できるようないくつかの特性を有している。即ち、アデノウイルスは、十分に広い宿主スペクトルを有しており、静止細胞に感染することができ、感染細胞のゲノムに取込まれることがない。アデノウイルスは、約３６ｋｂの大きさの直鎖状二重鎖ＤＮＡをもつウイルスである。アデノウイルスのゲノムは特に、末端の逆方向反復配列（ＩＴＲ）、キャプシド形成配列、初期遺伝子、後期遺伝子（図１参照）を含む。主要な初期遺伝子は、Ｅ１（Ｅ１ａ及びＥ１ｂ）遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ３遺伝子及びＥ４遺伝子である。主要な後期遺伝子はＬ１遺伝子〜Ｌ５遺伝子である。上記のようなアデノウイルスの特性を考慮して、アデノウイルスは既に，生体内（ｉｎｖｉｖｏ）の遺伝子導入に使用されている。このために、種々の遺伝子（β−ｇａｌ、ＯＴＣ、α−１ＡＴ、サイトカイン、など）を組込んだアデノウイルス由来の種々のベクターが調製されている。これらの構築物の各々においては、アデノウイルスが感染細胞中で複製できなくなるように修飾されている。従って、従来技術に記載されている構築物は、領域Ｅ１（Ｅ１ａ及び／またはＥ１ｂ）及び任意に領域Ｅ３が欠失し、その代りに異種のＤＮＡ配列が挿入されているアデノウイルスである（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ１０１（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｇｅｎｅ５０（１９８６）１６１）。しかしながら、すべての公知のウイルスと同様に、野生型アデノウイルスの投与も（Ｒｏｕｔｅｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５（１９９１）１４５０）、または、複製欠陥のある組換えアデノウイルスの投与も（Ｙａｎｇら，ＰＮＡＳ（１９９４）４４０７）、高度の免疫応答を誘発する。免疫系の一義的な目的は、個体の保全、即ち「自己」の保全である。従って免疫系は、その強力な生体防衛メカニズムが自己に向けられることや、自己免疫疾患を引き起こすことなしに、感染因子を除去し、移植組織及び腫瘍を拒絶する。外来抗原を除去するが自己抗原に対しては無応答である状態は生理的トレランス状態と定義されている。外来因子を除去するために、免疫系では２種類のメカニズムが働く。第一のメカニズムでは、Ｂリンパ球によって特異的抗体が産生される。これを体液性免疫と呼ぶ。これらの抗体は抗原に結合し、抗原を不活化したりまたは生物体から排除したりする。第二の防衛メカニズムは、細胞性免疫に関係し、Ｔリンパ球、特に対象となる抗原に特異的な受容体を含む細胞傷害性Ｔリンパ球が関与する。Ｔ細胞受容体が抗原を認識するためには、Ｔ細胞受容体が主要組織適合性複合体即ちＭＨＣのクラスＩ及びクラスIIの遺伝子によってコードされたタンパク質と結合して発現される必要がある。従って、感染細胞に対して作用するこの免疫応答は、遺伝子療法でウイルスベクターを使用する際の重大な障害となる。その理由は、免疫応答は、（Ｉ）感染細胞の破壊を誘発することによって、治療用遺伝子の発現期間を制限し、その結果として治療効果を制限する、（II）かなりの炎症応答を同時に誘発する、及び、（III）反復注入後には感染細胞を迅速に排除するようになる、からである。勿論、感染細胞に対するこの免疫応答の幅は、ウイルスベクターが注入される器官の種類、及び使用される注入方法次第で変化する。例えば、組換えアデノウイルスを免疫担当（immunocompetent）マウスの筋肉に投与したとき、該組換えアデノウイルスによってコードされたβ−ガラクトシダーゼの発現は注入４０日後に最小レベルに減少する（Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，ＰＮＡＳ９０（１９９３）１１４９８）。また、アデノウイルスを用いて肝臓にトランスフェクトされた遺伝子の発現は、注入後１０日間で有意に減少し（ＹａｎｇＹら，１９９４ｉｍｍｕｎｉｔｙ１４３３−４４２）、アデノウイルスを用いて血友病のイヌの肝細胞に導入されたIX因子の発現は注入１００日後に消滅する（Ｋａｙら，ＰＮＡＳ９１（１９９４）２３５３）。従って、アデノウイルス由来のベクターが遺伝子療法で使用できるという展望を得るためには、これらのベクターまたはこれらのベクターに感染した細胞に対して作用する免疫応答をコントロールすることが必要であると考えられる。免疫系が活性化されるためには、アデノウイルス由来のベクターのような、正常時には破壊される筈の生物外来因子（非自己または修飾された自己）が免疫系によって予め認識されている必要があることは上記から理解されよう。近年来の免疫介入戦略の開発の目的は、「許容性（permissive）」免疫環境の創出、即ち、上記のごとき外来抗原に対するトレランス状態を誘発することである。本発明はまさにこのレベルに介入する。本発明の目的は、感染細胞からアデノウイルスが迅速に排除されることを防止し、その結果として、アデノウイルスが保有する治療用遺伝子の生体内（ｉｎｖｉｖｏ）発現の期間を矛盾のない方法によって延長することである。出願人らは、感染細胞中でのある複数の遺伝子の同時発現が免疫防御（immuno protective）作用を誘発し得、従って、ベクター及び／または感染細胞を免疫系から免除することができることを最近になって証明した。出願人らは特に、重要な治療用遺伝子の発現と免疫防御遺伝子の発現とが結合されたアデノウイルスを作製した（ＦＲＮｏ．９４１２３４６）。取り扱った遺伝子は特に、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の活性またはサイトカインの活性に作用して、ベクターまたは感染細胞に対するすべての免疫反応をかなり低下させることができ、抑止することさえ可能な産物を産生する遺伝子である。このような遺伝子は、ＭＨＣタンパク質の発現または抗原提示を少なくとも部分的に阻害し、その有利な結果として、ベクターまたは感染細胞に対する免疫反応を顕著に低下させ、従って治療効果を延長させる。出願人らは意外にも、このようなベクターを免疫抑制剤と組合わせることによってベクターの治療効果を有意に延長させるのが可能であることを証明した。免疫系による当該ベクターの排除及び／または感染細胞の破壊が、このベクター及び免疫抑制剤の夫々の免疫防御効果の単なる相加効果から予測される期間よりも著しく長い期間阻止されることを見出した。本発明の目的となる併用医薬（medicinal combination）は、治療用遺伝子の長期間発現に好適な免疫系の「偽失活(pseudo-inertia)」現象を誘発するという利点を有している。本発明で使用される免疫抑制剤なる用語は、少なくとも１つの免疫シグナル伝達経路の一部または全部を阻害し得る任意の化合物を意味する。一般的に免疫抑制剤は、移植のときに同種移植片の拒絶防止のため、及び、ある種の自己免疫疾患の治療のために常用されている。従来から使用されている製品は、コルチコステロイド、アザチオプリン、サイクロスポリン、ＦＫ５０６のような化学的免疫抑制剤、または、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のような生物学的免疫抑制剤である。第一の部類の免疫抑制剤、そのなかでも特にサイクロスポリン及びＦＫ５０６は、リンパ球性細胞の分化及び増殖に重要な役割を果たすインターロイキン２のようなサイトカインの産生を顕著に阻害する。残念なことに、この部類の免疫抑制剤が効果を発揮するためには持続的投与が必要であり、その結果として毒性の問題が早かれ遅かれ生じることになる。例えば、アザチオプリンは骨髄毒性、サイクロスポリンは腎毒性の可能性を含んでおり、更に、高血圧または神経障害を引き起こすことも予想される。特に問題となる抗体は、免疫系のリンパ系細胞に対する抗体である。免疫抑制剤として使用された最初の抗体は、Ｔリンパ球に対する抗ＣＤ３抗体である。この抗体の標的は、Ｔ細胞の抗原受容体を構成するＣＤ３分子のポリペプチド鎖の１つである。その結果として、抗体によって認識されたＣＤ３＋Ｔ細胞が機能的に失活する。出願人らはこの問題について、この種の免疫抑制剤の投与と治療用遺伝子を含む組換えアデノウイルスの投与とを併用することによって、ウイルスベクター及び／または感染細胞の表面の発現産物に対する宿主の免疫反応を遮断できることに注目した。同じ原理に基づいて、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２８、抗Ｂ７、抗ＩＣＡＭ−１及び抗ＬＦＡ−１などの抗体を使用できる。出願人らはここに、免疫系の反応をかなり遅延させるため、更には阻害するために特に有効であり、しかも毒性の問題を生じない新規な治療方法を開発した。より詳細には本発明は、上述のような有効な治療用遺伝子の発現と免疫防御遺伝子の発現との双方を与える組換えアデノウイルスと少なくとも１種類の免疫抑制剤との併用によって極めて大きい相乗効果が得られるという知見に由来する。従って、本発明の第一の目的は、少なくとも１種類の免疫抑制剤と、治療用遺伝子を含む第一の組換えＤＮＡと免疫防御遺伝子を含む第二の組換えＤＮＡとを含む少なくとも１種類の組換えアデノウイルスとから成る併用医薬であって、双方が時間的に連続的、断続的及び／または同時的に使用され、生体内及び／または生体外の外来遺伝子トランスフェクションに有用な併用医薬に関する。上述のごとく本発明は特に、免疫抑制剤の活性と、治療用遺伝子の発現に対する免疫防御遺伝子の効果との間の相乗効果の知見に基づく。このような併用によって、治療効果を顕著に持続させることができ、また、特に免疫抑制剤の所要薬用量をかなり減らすことができるという利点が得られる。後述するごとく、本発明の併用治療を構成する２つの成分を、時間的に連続的、断続的及び／または同時的に使用し得る。好ましくは、アデノウイルスの注入前及び注入後に免疫抑制剤を注入する。本発明のこの実施態様によれば、免疫抑制剤の投与を時間的間隔を開けて実施することができ、より好ましくはこの投与を定期的に繰り返すことができる。特にこの場合には、２つの成分が別々に包装されている。同時投与の場合には、２つの成分を投与直前に用時混合して一緒に投与してもよく、または逆に、別々の薬剤として同時に投与してもよい。特に、２つの薬剤の投与経路が異なっていてもよい。本発明によれば、免疫抑制剤としては、少なくとも１つの免疫シグナル伝達経路を部分的にまたは完全に阻害し得る任意の化合物を使用し得る。免疫抑制剤は特に、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、アザチオプリン、コルチコステロイド、及び、任意のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体から選択できる。好ましい抗体は、免疫分子を失活させ得る抗体または免疫分子を保有する免疫細胞の破壊を惹起する抗体である。使用できる抗体としては特に、抗ＣＤ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２８、抗Ｂ７、抗ＩＣＡＭ−１、抗ＬＦＡ−１などがある。また、ＣＴＬＡ４Ｉｇのようなハイブリッド分子も使用できる。これはＣＴＬＡ−４分子（ＣＤ２８の相同物(homologue)）と免疫グロブリンとの融合タンパク質である。Ｂ７分子に結合したこの分子のＧ１Ｆｃ部位はＴ細胞の活性化を阻害し得ることが判明した（Ｄ．Ｊ；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，７８９，１９９２）。本発明の範囲が上記に例示した免疫抑制剤に限定されないことは明らかである。これらの免疫抑制剤は単離形態で使用されてもよくまたは組合せ形態で使用されてもよい。本発明によって作製されるアデノウイルスのゲノムに存在する組換えＤＮＡは、該当遺伝子（治療用遺伝子または免疫防御遺伝子）を含み且つその発現を許容するシグナルを任意に含み、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で構築されてアデノウイルスのゲノムに挿入されたＤＮＡフラグメントである。本発明の範囲内で使用される組換えＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）でもよく、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）でもよく、または、例えば１つもしくは複数のイントロンが挿入されたｃＤＮＡから成るハイブリッド構築物でもよい。また、合成配列でもよく、または、半合成配列でもよい。これらのＤＮＡの起原は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどのいずれでもよい。ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡの使用が特に有利である。本発明のベクターの構築に使用できる治療用遺伝子としては、治療効果を有する産物をコードする任意の遺伝子を挙げることができる。このようにしてコードされた産物は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、などである。タンパク質系産物は、標的細胞に対する相同タンパク質（即ち、標的細胞がいかなる病理も示さないときに標的細胞中で正常に発現される産物）でもよい。この場合、タンパク質の発現は例えば、細胞中の不十分な発現を補うか、修飾のために不活性もしくは弱い活性になったタンパク質の発現を補うか、または、タンパク質を超発現させる、などの効果を与え得る。治療用遺伝子はまた、安定性が向上している、活性が修飾されている、などの特性を有している細胞性タンパク質の突然変異体をコードしているものでもよい。タンパク質系産物はまた、標的細胞に対する異種タンパク質でもよい。この場合、発現されたタンパク質は、例えば細胞に欠如している活性を補充または付加し、細胞の耐病性を支援したりまたは細胞の免疫応答を促進したりする。本発明に包含される治療用タンパク質産物としては、特に、酵素、血液誘導体、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなど（ＦＲ９２０３１２０）、成長因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体もしくは合成用酵素、栄養因子：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィンなど、アポリポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡIV、ＡｐｏＥなど（ＦＲ９３０５１２５）、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（ＦＲ９１１１９４７）、線維性嚢胞膵症関連のＣＦＴＲタンパク質、腫瘍抑制遺伝子：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなど（ＦＲ９３０４７４５）、凝血関与因子をコードする遺伝子：VII因子、VIII因子、IX因子、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子、などがある。上述のように、治療用遺伝子はまた、遺伝子であってもよくまたは、標的細胞中で発現することによって遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写をコントロールし得るアンチセンス配列であってもよい。このような配列は、例えば欧州特許ＥＰ１４０３０８に記載の技術によって、標的細胞中で細胞性ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡとして転写され、細胞性ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるのを遮断し得る。アンチセンス配列はまた、標的ＲＮＡを選択的に破壊し得るリボザイムをコードする配列を含む（ＥＰ３２１２０１）。治療用遺伝子の起原は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどでよい。これらの遺伝子は、当業者に公知の任意の技術によって得ることができ、特に、スクリーニングライブラリー、化学合成、または、スクリーニングライブラリーによって得られた配列の化学的または酵素的修飾を含む複合方法によって得られる。本発明の範囲内で使用される免疫防御遺伝子には種々のタイプが存在する。前述のようにこの遺伝子は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の活性またはサイトカインの活性に作用する産物を産生する。好ましい遺伝子は、ＭＨＣのタンパク質の発現または抗原提示を少なくとも部分的に阻害する産物を産生する遺伝子である。好ましい例としては、アデノウイルスの領域Ｅ３に含まれるいくつかの遺伝子、ヘルペスウイルスのＩＣＰ４７遺伝子、サイトメガロウイルスのＵＬ１８遺伝子を挙げることができる。アデノウイルスのゲノムの領域Ｅ３は、種々のリーディングフレームを含み、これらのリーディングフレームは、選択的スプライシングによって種々のタンパク質を産生する。種々のタンパク質のうち、タンパク質Ｇｐ１９ｋ（またはＥ３−１９ｋ）は小胞体（ＥＲ）の膜に局在するグリコシル化トランスメンブランタンパク質である。このタンパク質は、ＭＨＣ −Ｉ分子を結合させるルミナール（luminal）ドメインと微小管（またはチューブリン）を結合させ得るＣ−末端型細胞質末端とを有しており、この末端はタンパク質ｇｐ１９ｋをＥＲの膜に定着させる作用を有している。従って、ｇｐ１９ｋは、ＭＨＣ−Ｉ分子と相互作用しＥＲの処に封鎖することによって、ＭＨＣ− Ｉ分子が細胞表面に発現することを阻止し得る。しかしながら、ウイルス複製が欠如しているとき、アデノウイルスによるタンパク質ｇｐ１９ｋの発現は微弱である。ｇｐ１９ｋの発現は更に、スプライシングの実行に依存する。ｇｐ１９ｋをコードする配列（好ましくはｃＤＮＡ）を含む組換えＤＮＡを本発明のベクターに導入すると、このタンパク質の発現のコントロール及び最適化が可能である。特に、構成的プロモーターを使用し、他のリーディングフレームを削除すると、このタンパク質の発現を強力に促進し、ウイルス複製及び誘導因子の存在に対する依存から解放し得る。これは、ＣＴＬによる感染細胞の溶解をかなり抑制し、治療用遺伝子の生体内（ｉｎｖｉｖｏ）産生を促進及び持続させるために特に有利である。１０．４ｋ及び１４．５ｋのタンパク質のようなアデノウイルスのゲノムの領域Ｅ３によってコードされている他のタンパク質は、本発明のベクターに有利に取込まれるいくつかの特性を有している。単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ４７遺伝子は、本発明で使用される特に重要な別の免疫防御遺伝子を構成する。単純ヘルペスウイルスに感染した細胞は、ＣＴＬによって誘発される溶解に対する耐性を有している。この耐性は、ＭＨＣ−Ｉ分子の細胞表面における発現を抑制し得るＩＣＰ４７遺伝子によって与えられることが判明した。本発明の組換えＤＮＡにＩＣＰ４７遺伝子を組込んだ場合にも、本発明の組換えウイルスが免疫系の作用から免除されることが判明した。サイトメガロウイルスのＵＬ１８遺伝子は、本発明の免疫防御遺伝子の別の好適例である。ＵＬ１８遺伝子の産物は、β２−ミクログロブリンと結合し得る（Ｂｒｏｗｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ３４７（１９９０）７７０）。β２−ミクログロブリンはＭＨＣ−Ｉ分子の鎖の１つである。従って、本発明の組換えＤＮＡにＵＬ１８遺伝子が組込まれると、本発明のウイルスに感染した細胞中の機能性β２−ミクログロブリン分子の数が減少し、その結果として、これらの細胞による完全機能性ＭＨＣ−Ｉ分子産生能力を低下させることができる。その結果として、この種の構築物はＣＴＬによる感染細胞の溶解を防御し得る。上述のように、本発明の範囲内で使用される免疫防御遺伝子は、別の好適な実施態様においては、サイトカインの活性またはシグナル伝達経路を阻害する産物を産生する遺伝子である。サイトカインは、免疫系に対するシグナル伝達分子として作用する分泌タンパク質のファミリーを構成している。サイトカインは、免疫系細胞を吸着し、これらの細胞を活性化し、これらの細胞の増殖を誘発することができる。また、感染細胞を殺すために直接作用し得る。サイトカインの活性またはシグナル伝達経路に不利な影響を及ぼす産物を産生する遺伝子の例としては、サイトカインの合成に介入する遺伝子、または、サイトカインを封鎖するか、サイトカインの活性に拮抗するかもしくは細胞間シグナル伝達経路を妨害する産物を産生する遺伝子がある。好適例としては特に、エプスタイン・バーウイルスのＢＣＲＦ１遺伝子、ウシポックスウイルスのｃｒｍＡ及びｃｒｍＢ遺伝子、ワクシニアウイルスのＢ１５Ｒ及びＢ１８Ｒ遺伝子、サイトメガロウイルスのＵＳ２８遺伝子、アデノウイルスのＥ３−１４．７、Ｅ３−１０．４及びＥ３−１４．５遺伝子を例示し得る。ワクシニアウイルスのＢ１５Ｒ遺伝子は、インターロイキン−１β（インターロイキン−１の分泌形態）と結合し得る可溶性タンパク質をコードしており、従って、このサイトカインがその細胞レセプターと結合することを阻止し得る。より詳細には、インターロイキン−１は、抗原刺激に応答して産生される一次サイトカインの１種であり、感染初期の免疫系のシグナル伝達に極めて重要な役割を果たしている。本発明のベクターにＢ１５Ｒ遺伝子を組込むことができると、特に免疫細胞の活性化に対するＩＬ−１βの活性を減少させ得、その結果として、本発明のウイルスに感染した細胞を重要な免疫応答から局部的に保護するという利点が得られる。ウシポックスウイルスの遺伝子のようなＢ１５Ｒ遺伝子と相同の遺伝子も使用し得る。同様にして、ワクシニアウイルスのＢ１８Ｒ遺伝子はインターロイキン−６のレセプターの相同タンパク質をコードしている。この遺伝子または機能的に相同な任意の遺伝子も、インターロイキン−６が細胞レセプターに結合することを阻害し、その結果として免疫応答を局部的に低下させるために本発明のベクター中で使用し得る。全く同様にして、ウシポックスウイルスのｃｒｍＢ遺伝子も有利に使用できる。即ちこの遺伝子は、ＴＮＦと結合し得且つ細胞の表面でＴＮＦのレセプターと競合し得る分泌タンパク質をコードしている。従ってこの遺伝子は本発明のウイルス中で、感染細胞を破壊することが可能な活性ＴＮＦの濃度を局部的に低下させ得る。ＴＮＦと結合することが可能で、そのレセプターに対するＴＮＦの結合を少なくとも部分的に阻害し得るタンク質をコードする他の遺伝子を使用することも可能である。ウシポックスウイルスのｃｒｍＡ遺伝子は、インターロイキン−１βの合成を阻害することが可能で、且つｓｅｒｐｉｎｅ型のプロテアーゼ阻害活性を有しているタンパク質をコードしている。従ってこの遺伝子は、インターロイキン−１の濃度を局部的に低下させ、その結果として免疫応答及び炎症応答の進行を抑制するために使用できる。エプスタイン・バーウイルスのＢＣＲＦ１遺伝子はインターロイキン１０の類似体をコードしている。この遺伝子の産物は、Ｂリンパ球の増殖を誘導しながら免疫応答を抑制し、その特異性を変化させ得るサイトカインである。サイトメガロウイルスのＵＳ２８遺伝子は、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−α）のレセプターの相同タンパク質をコードしている。従ってこのタンパク質は、ＭＩＰのレセプターのコンペティターとして作用でき、その結果としてＭＩＰのレセプターの活性を局部的に阻害し得る。アデノウイルスのＥ３−１４．７遺伝子、Ｅ３−１０．４遺伝子及びＥ３−１４．５遺伝子の産物は、いくつかのサイトカインによって媒介される細胞間シグナル伝達を遮断し得る。サイトカインが感染細胞の表面でそのレセプターに結合するとき、細胞死を誘発するかまたはタンパク質合成を停止させるためのシグナルが核に伝達される。特に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の場合にはこのような作用が生じる。Ｅ３−１４．７遺伝子、Ｅ３−１０．４遺伝子及び／またはＥ３−１４．５遺伝子が構成的または調節的に発現するように本発明の組換えＤＮＡに組込まれると、ＴＮＦによって誘発される細胞間シグナル伝達を遮断し、その結果として本発明の組換えウイルスに感染させた細胞をこのサイトカインによる障害作用から保護し得る。局部的及び一過性の阻害が特に有利であり得る。このような阻害は特に、後述するような特定の発現シグナル（例えば、サイトカイン依存性プロモーター）の選択によって得られる。本発明のベクターを構築するために、他の相同遺伝子または同様の機能的特性を有している他の遺伝子を使用することも勿論可能である。これらの種々の遺伝子は、当業者に公知の任意の技術によって獲得でき、特に、スクリーニングライブラリー、化学合成または、スクリーニングライブラリーによって得られた配列を化学的または酵素的に修飾する複合方法によって得られる。更に、これらの種々の遺伝子を単独形態で使用してもよく、（１つまたは複数の）組合せ形態で使用してもよい。本発明によれば、遺伝子が組換えＤＮＡの形態で挿入されるので、アデノウイルスの構築を極めて自在に行うことができ、また、挿入された遺伝子の発現をより適切にコントロールし得る。このように、本発明に従ってアデノウイルスベクターに組込まれる組換えＤＮＡ（従って、有益な２つの遺伝子）は種々の形態に配置され得る。第一に、これらの組換えＤＮＡはアデノウイルスのゲノムの同一部位に挿入されてもよく、または、選択された異なる部位に挿入されてもよい。特に、組換えＤＮＡは、アデノウイルスのゲノムの領域Ｅ１、Ｅ３及び／またはＥ４の処の少なくとも一部に、ウイルス配列に置換する配列または補充する配列として挿入され得る。好ましくは、組換えＤＮＡはアデノウイルスのゲノムの領域Ｅ１、Ｅ３またはＥ４領域の処の少なくとも一部に挿入される。組換えＤＮＡが異なる２つの部位に挿入されるとき、本発明の範囲内では、領域Ｅ１及びＥ３の組合せまたは領域Ｅ１及びＥ４の組合せを使用するのが好ましい。この編成が２つの遺伝子間の干渉を伴うことなく２つの遺伝子の高度な発現を可能にすることは実施例で確認された。組換えＤＮＡをウイルスの配列に置換して挿入するのが有利である。第二に、これらの組換えＤＮＡの各々は、同じ転写プロモーターを有していてもよくまたは異なる転写プロモーターを有していてもよい。この配置によれば、高い発現レベルを得ることができ、また遺伝子の発現をより適切にコントロールし得る。この場合、２つの遺伝子は、同方向に挿入されてもよく、または、互いに対向する方向に挿入されてもよい。組換えＤＮＡはまた、単一の転写単位を構成し得る。この配置において、２つの組換えＤＮＡは近接しており、２つの遺伝子が単一のプロモーターのコントロール下に維持され単一のプレメッセンジャーＲＮＡを生じるように配置されている。この配置は単一の転写プロモーターを使用し得るという利点を有している。最後に、本発明の組換えＤＮＡを使用する場合、種々の特性の転写プロモーター、特に強力プロモーターまたは弱プロモーター、調節プロモーターまたは構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは遍在性プロモーター、などを使用することが可能である。治療用遺伝子の高度な発現及び顕著な免疫防御効果を得るためには、組換えＤＮＡの発現シグナル及び夫々の位置の選択が特に重要である。本発明の特に好ましい実施態様では、治療用遺伝子を含む第一の組換えＤＮＡと免疫防御遺伝子を含む第二の組換えＤＮＡとを含み、且つ２つの組換えＤＮＡが領域Ｅ１の処に挿入された欠損アデノウイルスが使用される。本発明の特に好ましい実施態様では、治療用遺伝子を含む第一の組換えＤＮＡと免疫防御遺伝子を含む第二の組換えＤＮＡとを含み、前者のＤＮＡが領域Ｅ１の処に挿入され後者のＤＮＡが領域Ｅ３の処に挿入された欠損アデノウイルスが使用される。上述のように、本発明のアデノウイルスは欠損ウイルスである。即ち、標的細胞中で自律複製できない。従って一般的には、本発明の欠損アデノウイルスのゲノムは感染細胞中でのウイルス複製に必要な配列を少なくとも有していない。これらの領域は（完全にまたは部分的に）除去されていてもよく、非機能性になっていてもよく、または、他の配列、特に治療用遺伝子によって置換されていてもよい。本発明のアデノウイルスが欠損ウイルスであることによって投与後の本発明のベクターの非伝播性が確保されるので、アデノウイルスの欠損特性は本発明の重要な要件である。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスは、ＩＴＲ配列とキャプシド形成を可能にする配列とを含み、Ｅ１遺伝子の全部または一部が欠失している。逆方向反復配列（ＩＴＲ）はアデノウイルスの複製起点を構成している。これらの配列はウイルスゲノムの３’末端及び５’ 末端に局在し（図１参照）、当業者に公知の分子生物学の慣用技術によって該末端から容易に単離できる。ヒトアデノウイルス（特に血清型Ａｄ２及びＡｄ５）のＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は、イヌアデノウイルス（特にＣＡＶ１及びＣＡＶ２）と同様に、文献に記載されている。例えば、アデノウイルスＡｄ５の場合、左側のＩＴＲ配列はゲノムのヌクレオチド１〜１０３を含む領域に対応する。（Ｐｓｉ配列とも命名された）キャプシド形成配列は、ウイルスＤＮＡのキャプシド形成に必要である。従って、本発明の組換え欠損アデノウイルスが調製可能になるためには、この領域が存在していなければならない。キャプシド形成配列は、アデノウイルスのゲノム中で左側（５’）ＩＴＲとＥ１遺伝子との間に局在している（図１参照）。この配列は、分子生物学の慣用技術によって単離されるかまたは人工的に合成され得る。ヒトアデノウイルス（特に血清型Ａｄ２及びＡｄ５）のキャプシド形成配列のヌクレオチド配列は、イヌアデノウイルス（特にＣＡＶ１及びＣＡＶ２）と同様に、文献に記載されている。例えばアデノウイルスＡｄ５の場合、キャプシド形成配列はゲノムのヌクレオチド１９４〜３５８を含む領域に対応する。より好ましくは、本発明のアデノウイルスは、ＩＴＲ配列とキャプシド形成を可能にする配列とを含み、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子の全部または一部が欠失している。好ましい実施態様によれば、本発明のアデノウイルスのゲノムは、Ｅ１遺伝子、Ｅ３遺伝子及びＥ４遺伝子の全部または一部が欠失しており、より好ましくは、Ｅ１遺伝子、Ｅ３遺伝子、Ｌ５遺伝子及びＥ４遺伝子の全部または一部が欠失している。本発明のアデノウイルスは、種々の起原のアデノウイルスから調製され得る。実際、アデノウイルスには種々の血清型が存在し、その構造及び特性は多少違っているが遺伝的編成は似通っている。従って当業者は、任意の種類のアデノウイルスに対して本願に記載の教示を容易に再現し得るであろう。より特定的には、本発明のアデノウイルスの起原は、ヒト、動物またはその双方（ヒトと動物）であり得る。ヒト起原のアデノウイルスに関しては、グループＣに分類されるアデノウイルスの使用が好ましい。ヒトアデノウイルスの種々の血清型のうちでも、本発明ではタイプ２またはタイプ５のアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）を使用するのがより好ましい。上記に指摘したように、本発明のアデノウイルスは、動物起原であってもよく、または、動物起原のアデノウイルスに由来の配列を含んでいてもよい。出願人は実際、動物起原のアデノウイルスが極めて高い効率でヒト細胞に感染でき、試験したヒト細胞中で増殖できないことを証明した（フランス特許出願ＦＲ９３０５９５４参照）。出願人はまた、動物起原のアデノウイルスがヒト起原のアデノウイルスによってトランス補足されないこと、従って、ヒトアデノウイルスの存在下で感染性粒子の形成に導くような生体内（ｉｎｖｉｖｏ）の組換え及び増殖の危険性が全くないことを証明した。従って、動物起原のアデノウイルスまたは動物起原のアデノウイルスの領域の使用は、遺伝子療法におけるベクターとしてのウイルスの使用に固有の危険をいっそう軽減するという理由からも特に有利である。本発明の範囲内で使用可能な動物起原のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、ネズミ（例えば、Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例えばＳＡＶ）などを起原とし得る。より具体的には、トリのアデノウイルスとしては特に、ＡＴＣＣから入手し得る血清型１〜１０、例えばＰｈｅｌｐｓ株（ＡＴＣＣＶＲ−４３２）、Ｆｏｎｔｅｓ株（ＡＴＣＣＶＲ−２８０）、Ｐ７−Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８２７）、ＩＢＨ−２Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８２８）、Ｊ２ −Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８２９）、Ｔ８−Ａ株（ＡＴＣＣＶＲ−８３０）、Ｋ−１１株（ＡＴＣＣＶＲ−９２１）、または、ＡＴＣＣＶＲ−８３１〜８３５という照合番号の株を挙げることができる。ウシのアデノウイルスとしては、種々の公知の血清型、特にＡＴＣＣＶＲ−３１３、３１４、６３９−６４２、７６８及び７６９という照合番号でＡＴＣＣから入手し得る血清型（タイプ１〜８）を使用し得る。また、ネズミのアデノウイルスとしては、ＦＬ（ＡＴＣＣＶＲ−５５０）及びＥ２０３０８（ＡＴＣＣＶＲ−５２８）、ヒツジのアデノウイルスとしてはタイプ５（ＡＴＣＣＶＲ−１３４３）またはタイプ６（ＡＴＣＣＶＲ−１３４０）、ブタのアデノウイルスとしては５３５９、サルのアデノウイルスとしては、ＡＴＣＣＶＲ−５９１〜５９４、９４１〜９４３、１９５〜２０３という照合番号のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物起原の種々のアデノウイルスのうちでも、本発明の範囲内では、イヌ起原のアデノウイルスまたはその領域、特にアデノウイルスＣＡＶ２のすべての株〔例えばｍａｎｈａｔｔａｎ株またはＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ−８００）〕を使用する。イヌのアデノウイルスは多くの構造研究の対象として使用されている。従って、アデノウイルスＣＡＶ１及びＣＡＶ２の完全な制限地図が従来文献（Ｓｐｉｂｅｙら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９８９）１６５）に記載されており、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ３遺伝子とＩＴＲ配列とはクローニングされ配列決定されている（特にＳｐｉｂｅｙら，ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１４（１９８９）２４１；Ｌｉｎｎｅ，ＶｉｒｕｓＲｅｓ．２３（１９９２）１１９，ＷＯ９１／１１５２５参照）。本発明の組換え欠損アデノウイルスは種々の方法で作製できる。第一の方法では、（連結反応（ligation）によってまたはプラスミドの形態で）生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で調製した組換え欠損ウイルスのＤＮＡをコンピテント細胞系、即ち、欠損ウイルスを補足するのに必要なすべての機能をトランス配置（ｉｎｔｒａｎｓ）で保有する細胞系にトランスフェクトする。これらの機能は好ましくは細胞のゲノムに取込まれており、その結果として、組換えが生じる危険を防止し、細胞系にいっそう高度な安定性を与えている。第二の方法では、（連結反応によってまたはプラスミドの形態で）生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で調製した組換え欠損ウイルスのＤＮＡ及びヘルパーウイルスのＤＮＡを適当な細胞系にコトランスフェクトする。この方法によれば、組換えアデノウイルスのすべての欠損機能を補足し得るコンピテント細胞系を準備する必要がない。これらの機能の一部がヘルパーウイルスによって事実上補足されるからである。このヘルパーウイルス自体は欠損ウイルスでなければならない。また、細胞系は補足に必要な機能をトランス配置で保有している。特にこの第二方法の範囲で有用な細胞系としては、ヒト胎児腎臓２９３細胞系、ＫＢ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＭＤＣＫ及びＧＨＫ細胞などがある（実施例参照）。次いで、増殖したベクターを分子生物学の標準的技術に従って回収し、精製し、増幅する。変形実施態様によれば、適正な欠失と２つの組換えＤＮＡとを含む組換え欠損ウイルスのＤＮＡを、連結反応によるかまたはプラスミドの形態で生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で作製することが可能である。前述のように、本発明のベクターは数種類のウイルス遺伝子、特に、Ｅ１遺伝子、Ｅ３遺伝子、Ｅ４遺伝子及び／またはＬ５遺伝子の全部または一部の欠失を有するのが有利である。この欠失は、当該遺伝子に不利な影響を及ぼす任意のタイプの削除に対応してもよい。特に適当な削除は、遺伝子のコーディング領域の全部または一部の削除、及び／または該遺伝子を転写するためのプロモーター領域の全部または一部の削除である。通常は、実施例に示すように、分子生物学の技術に従って、組換え欠損ウイルスのＤＮＡを例えば適当な制限酵素で消化し次いで連結することによって削除を行う。次に、酵素的開裂及び連結反応の順次処理によって組換えＤＮＡを当該ＤＮＡの選択された領域に選択された方向で挿入する。上記の手順で得られたＤＮＡは適正な欠失と２つの組換えＤＮＡとを含んでいる。即ち、これらの欠失と組換えＤＮＡとを含む組換え欠損アデノウイルスが直接作製される。方法のこの第一の実施態様は、その遺伝子が単一転写単位の形態であるかまたはゲノムの同一部位に挿入されているが互いに離間したプロモーターのコントロール下にあるような組換えアデノウイルスの作製に特に好適である。また、２つの組換えＤＮＡを順次に導入する２段階で組換えウイルスを作製することも可能である。即ち、適正な欠失（または欠失の一部）と一方の組換えＤＮＡとを含む第一の組換えウイルスのＤＮＡを、連結反応によるかまたはプラスミドの形態で構築する。次いで、このＤＮＡを利用して、該欠失と１つの組換えＤＮＡとを含む第一の組換えウイルスを作製する。次にこの第一ウイルスのＤＮＡを単離し、第二のプラスミド、即ち第二の組換えＤＮＡと適正な欠失（第一ウイルスに存在しない部分）と相同的組換え可能領域とを含む第二の組換え欠損ウイルスのＤＮＡとコトランスフェクトする。従って、この第二段階では、２つの組換えＤＮＡを含む組換え欠損えウイルスが作製される。方法のこの実施態様は、アデノウイルスのゲノムの異なる２つの領域に挿入された２つの組換えＤＮＡを含む組換えウイルスの作製に特に好適である。本発明による２種類の成分、即ち、免疫抑制剤及び組換えアデノウイルスは、局所、経口、非経口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、などの経路で投与される製剤形態に調製し得る。好ましくは、１種または複数の医薬製剤は夫々、注入（又は注射）可能製剤に許容可能な医薬用賦形剤を含有する。賦形剤としては特に、無菌等張性の塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、または、これらの塩の混合物）、あるいは、乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物を挙げることができ、後者は滅菌水または生理的食塩水を適宜加えることによって注入用溶剤を構成し得る。注入に使用される免疫抑制剤及びアデノウイルスの用量は、種々のパラメータ、特に、使用される投与形態、対象となる疾病、発現させる予定の遺伝子、あるいは所望の治療期間、などに応じて調整され得る。一般的には、本発明の組換えアデノウイルスは、１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの範囲の用量の製剤の形態に調製されて投与される。ｐｆｕ（“ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ”：プラーク形成単位）なる用語は、該当溶液の感染能力に対応し、適当な細胞培養物を感染させ、ほぼ５日後に感染細胞プラークの数を測定することによって決定する。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献にも詳しく記載されている。特に、免疫抑制剤の場合、それらの注入用量及び注入方式は夫々の種類によって異なる。これらの２つのパラメータの調整は当業者の専門知識の範囲内である。本発明の併用医薬（medicinal combination）は、多くの疾病の治療または予防のために使用され得る。アデノウイルスに挿入された治療用遺伝子次第で、併用医薬は特に、遺伝性疾患（ジストロフィー、線維性嚢胞膵症、など）、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、など）、異常増殖性疾患（癌、再発狭窄症、など）、凝血異常関連疾患及びリポタンパク質異常血症、ウイルス感染関連疾患（肝炎、エイズ、など）の治療または予防に使用され得る。本発明はまた、請求の範囲に記載の併用医薬を使用するすべての治療的処置方法に関する。非限定代表例として示す以下の実施例によって本発明をより十分に説明する。図１は、アデノウイルスＡｄ５の遺伝子編制を示す。Ａｄ５の完全配列はデータベースから入手でき、当業者は任意の制限部位を選択または創成し、これによってゲノムの任意の領域を単離し得る。図２は、アデノウイルスＣＡＶ２Ｍａｎｈａｔｔａｎ株（Ｓｐｉｂｅｙら，前出）の制限地図を示す。図３は、ベクターｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌの構築を示す。図４は、アデノウイルスＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌ，ΔＥ１，ΔＥ３の構築を示す。分子生物学の一般技術プラスミドＤＮＡの分離用抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心、アガロースゲルもしくはアクリルアミドゲルにおける電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、フェノールもしくはフェノール−クロロホルムによるタンパク質の抽出、エタノールもしくはイソプロパノールによる塩水（saline ）媒体中のＤＮＡ沈殿、大腸菌（Escherichia coli）の形質転換、などのような分子生物学で使用されている慣用の方法は当業者に公知であり、文献〔ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ら，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ら（編），“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７〕にも十分に記載されている。ｐＢＲ３２２、ｐＵＣタイプのプラスミド及びＭ１３シリーズのファージは市販されている（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。連結反応のためには、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルもしくはアクリルアミドゲルの電気泳動によって寸法に従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノール沈殿させ、次いで、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で製造業者の指示に従ってインキュベートする。５′突出末端の充填は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示通りに使用して行う。３′突出末端の破壊は、ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で製造業者の指示通りに行う。５′突出末端の破壊は、ヌクレアーゼＳ１で注意深く処理することによって行う。合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用する生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）での位置指定突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを使用し、Ｔａｙｌｏｒら〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４〕によって開発された方法をに従って行う。所謂ＰＣＲ技術〔Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｉｏｎ，ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．＆ＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０〕によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、“ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA thermal cycler ）”（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を製造業者の使用説明書通りに用いて行う。ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍによって販売されているキットを使用し、Ｓａｎｇｅｒらによって開発された方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７〕によって行う。使用した細胞系以下の実施例では、以下の細胞系を使用したかまたは使用し得る。 −ヒト胎児腎臓２９３細胞系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）。この細胞系は特に、そのゲノムに取込んだヒトアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）を含む。 −ヒト表皮癌由来のヒトＫＢ細胞系。この細胞系はＡＴＣＣ（照合番号ＣＣＬ１７）から培養可能条件と共に入手できる。 −ヒト上皮癌由来のヒトＨｅｌａ細胞系。この細胞系は、ＡＴＣＣ（照合番号ＣＣＬ２）から培養可能条件と共に入手できる。 −イヌＭＤＣＫ細胞系。ＭＤＣＫ細胞の培養条件は特にＭａｃａｔｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ４４（１９８８）９に記載されている。 −ｇｍＤＢＰ６細胞系（Ｂｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９０（１９９２）６２４）。この細胞系はアデノウイルスのＥ２遺伝子をマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反覆配列（ＬＴＲ）のコントロール下に含むＨｅｌａ細胞から構成されている。実施例実施例１ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲのプロモーターのコントロール下の治療用遺伝子（大腸菌のＬａｃＺ遺伝子）とＲＳＶのＬＴＲのプロモーターのコントロール下のｇｐ１９ｋ遺伝子との双方をＥ１領域の処に挿入された状態で含む組換え欠損アデノウイルスの構築この実施例では、アデノウイルスＡｄ５の左側部分と、２つの組換えＤＮＡと、アデノウイルスＡｄ５の（タンパク質IXに対応する）領域とを含むプラスミドと、種々の欠失を含む欠損アデノウイルスとの相同的組換えによって標記のアデノウイルスを構築した。１．ベクターｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌの構築（図３）１．１．プラスミドｐＧＥＭ−ｇｐ１９ｋの構築プラスミドｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌはアデノウイルスのタンパク質ｇｐ１９ｋをコードするｃＤＮＡ配列を含む。このプラスミドを以下の手順で構築した。領域Ｅ３を含む野生型アデノウイルスＡｄ５のゲノムのＸｂａＩフラグメントを単離し、プラスミドｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の対応する部位にクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−Ｅ３を作製した。次に、プラスミドｇＧＥＭ −Ｅ３から、ｇｐ１９ｋをコードする配列（野生型アデノウイルスＡｄ５のヌクレオチド２８６２８−２９６３４）を含むＨｉｎｆＩフラグメントを単離した。このフラグメントの末端を、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントの作用によって平滑末端とし（分子生物学の一般技術の項参照）、次いで、得られたフラグメントをプラスミドｐＧＥＭｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳｍａＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＥＭ−ｇｐ１９ｋと命名した（図３）。１．２．ベクターｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌの構築この実施例は、夫々の固有プロモーターを含む２つの組換えＤＮＡと、アデノウイルスのゲノムの左側部分と、相同的組換え可能な相補的部分（タンパク質ｐ IX）とを含むプラスミドの構築を記載する。このベクターはプラスミドｐＡＤ．ＲＳＶβＧａｌから以下の手順で構築した。プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌは、５’→３’の方向で、 −ＩＴＲ配列と複製起点とキャプシド形成シグナルとＥ１Ａエンハンサーとを含むアデノウイルスＡｄ５の左側末端に対応するＰｖｕIIフラグメントと、 −ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス由来）のコントロール下のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子と、 −プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌとアデノウイルスｄ１３２４との間の相同的組換えを可能にするアデノウイルスＡｄ５のゲノムの第二フラグメントと、を含む。プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌはＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）によって記載されている。プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌを先ず、酵素ＥａｇＩ及びＣｌａＩによって切断した。この結果、特にアデノウイルスＡｄ５の左側部分とＲＳＶのＬＴＲのプロモーターとを含む第一のフラグメントが作製される。同時に、プラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβＧａｌを酵素ＥａｇＩ及びＸｂａＩによって切断した。この結果、特にＲＳＶのＬＴＲのプロモーターとＬａｃＺ遺伝子とアデノウイルスＡｄ５のゲノムのフラグメントとを含む相同的組換えを可能にする第二の型のフラグメントが作製される。次に、ｇｐ１９ｋのコーディング配列を含むプラスミドｐＧＥＭ−ｇｐ１９ｋ（実施例１．１）のＸｂａＩ−ＣｌａＩフラグメントの存在下でＣｌａＩ−ＥａｇＩフラグメントとＥａｇＩ −ＸｂａＩフラグメントとを連結した（図３）。このようにして作製され、ｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌと命名されたベクターは、 −ＩＴＲ配列と複製起点とキャプシド形成シグナルとＥ１Ａエンハンサーとを含むアデノウイルスＡｄ５の左側末端に対応するＰｖｕIIフラグメントと、 −ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス由来）のコントロール下のｇｐ１９ｋをコードする配列と、 −ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス由来）のコントロール下のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子と、 −相同的組換えを可能にするアデノウイルスＡｄ５のゲノムの第二フラグメントとを含む。２．組換えアデノウイルスの構築２．１．領域Ｅ１の処に同方向で挿入された２つの組換えＤＮＡを含む領域Ｅ１の欠失した組換えアデノウイルスの構築ベクターｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌを直鎖化し、Ｅ１遺伝子の欠失したアデノウイルスベクターと共に、アデノウイルスの領域Ｅ１（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によってコードされた機能をトランス配置で提供するヘルパー細胞（２９３細胞系）にコトランスフェクトした。より詳細には、アデノウイルスＡｄ−ＲＳＶβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ− Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、前出）とベクターｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌとの間の生体内（ｉｎｖｉｖｏ）相同的組換えを以下のプロトコルで行うことによってアデノウイルスＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌ，ΔＥ１が得られる。相同的組換えが可能になるように、ＸｍｎＩによって直鎖化したプラスミドｐＡＤ５ −ｇｐ１９ｋ−βｇａｌと酵素ＣｌａＩによって直鎖化したアデノウイルスＡｄ −ＲＳＶβｇａｌとをリン酸カルシウムの存在下で２９３細胞系にコトランスフェクトした。このようにして作製した組換えアデノウイルスを次にプラーク精製によって選択する。単離後、組換えアデノウイルスのＤＮＡを２９３細胞系で増幅すると、約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する未精製の組換え欠損アデノウイルスを含む培養上清が得られる。ウイルス粒子は通常は、公知技術によって塩化セシウム勾配遠心によって精製される（特にＧｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）。アデノウイルスＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌ，ΔＥ１を２０％グリセロール中に− ８０℃で保存し得る。２．２．領域Ｅ１の処に同方向で挿入された２つの組換えＤＮＡを含み領域Ｅ１及びＥ３が欠失した組換えアデノウイルスの構築（図４）ベクターｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌを直鎖化し、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子の欠失したアデノウイルスベクターと共に、アデノウイルスの領域Ｅ１（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によってコードされた機能をトランス配置で提供するヘルパー細胞（２９３細胞系）にコトランスフェクトした。より詳細には、突然変異アデノウイルスＡｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ３１（１９８２）５４３）とベクターｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌとの間の生体内（ｉｎｖｉｖｏ）相同的組換えを以下のプロトコルで行うことによってアデノウイルスＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌ，ΔＥ１， ΔＥ３が得られた。相同的組換えが可能になるように、プラスミドｐＡＤ５−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌと、酵素ＣｌａＩよって直鎖化したアデノウイルスＡｄ−ｄｌ１３２４とをリン酸カルシウムの存在下で２９３細胞系にコトランスフェクトした。このようにして作製した組換えアデノウイルスを次に、プラーク精製によって選択する。単離後、組換えアデノウイルスのＤＮＡを２９３細胞系で増幅すると、約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する未精製の組換え欠損アデノウイルスを含む培養上清が得られる。ウイルス粒子は通常は、公知技術によって塩化セシウム勾配遠心によって精製される（特にＧｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９７３）４５６参照）。次に、組換えアデノウイルスのゲノムをサザンブロット分析によって確認した。アデノウイルスＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌ，ΔＥ１，ΔＥ３を２０％グリセロール中に−８０℃で保存し得る。実施例２本発明の併用医薬の免疫防御活性の証明６０匹の雌の成熟ＤＢＡ／２マウスを無作為に１０匹ずつの６グループに分け、夫々のグループを以下の注入（又は注射）プロトコルで処理する。グループ１ａ：０日目に４．１０⁹ｐｆｕのウイルスＡｄ−ＲＳＶβｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、前出）を静注し、−２、−１、１、２、３、４及び５日目に１０μｇの抗ＣＤ３モノクローナル抗体を眼内注入する。グループ１ｂ：ウイルスとして４．１０⁹ｐｆｕのウイルスＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌ（図４）を用いる以外は、グループ１ａと同様に処理する。グループ２ａ：０日目に４．１０⁹ｐｆｕのウイルスＡｄ−ＲＳＶβｇａｌを静注し、−２、 −１、１、４及び７日目に２５０μｇの抗ＣＤ４モノクローナル抗体を腹腔内注入する。グループ２ｂ：ウイルスとして４．１０⁹ｐｆｕのウイルスＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌを用いる以外は、グループ２ａと同様に処理する。グループ３ａ：免疫抑制剤を併用投与しないで４．１０⁹ｐｆｕのＡｄ−βｇａｌを静注する。グループ３ｂ：免疫抑制剤を併用投与しないで４．１０⁹ｐｆｕのＡｄ−ｇｐ１９ｋ−βｇａｌを静注する。種々の時期に各グループの２匹のマウスを殺して、肝臓及び脾臓を摘出した。２．１．注入１５日後に採取した脾臓細胞中のリンパ球の主要サブ集団（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の分布の免疫蛍光分析摘出した脾臓から単離細胞の懸濁液を調製した。各リンパ球サブ集団に特異的な抗体を用いて細胞標本を免疫蛍光分析した。サイトフルオローメーター（ＦＡＣＳＳｃｈａｎ−ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光細胞の読取りを行った。結果を以下の表Ｉに示す。抗ＣＤ３抗体で処理した動物ではＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞が顕著に減少しており、処理した動物ではＣＤ４＋細胞が選択的に減少していることが判明する。２．２．注入３２日後に採取しβｇａｌを発現する組織適合性標的に対して生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）刺激した脾臓細胞の細胞障害能力の分析処理した動物の脾臓から単離した脾臓細胞の第二の標本を、表面にβガラクトシダーゼを発現するＰ８１５細胞の存在下で４日間の生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）培養を行った。培養の終了後、Ｃｒ⁵¹で標識した標的細胞Ｐ８１５−βｇａｌに対する脾臓細胞の細胞障害活性を測定した。細胞溶解のパーセントで表す細胞障害活性は、エフェクター細胞と標的細胞とを種々の比で存在させる慣用の方法で測定した。結果を以下の表IIに示す。抗ＣＤ４抗体で処理した動物、即ちグループ２ｂの動物から採取した脾臓細胞では、その細胞障害能力が顕著に減殺されていることが判明する。２．３．１５日及び３２日後の肝臓におけるβガラクトシダーゼ活性の発現肝臓の切片を作製し、βガラクトシダーゼ活性を観察するためにＸ−ｇａｌで染色し、切片の組織化学を観察するためにエオシンで染色する。結果を以下の表 IIIに示す。上記の結果より、抗ＣＤ４抗体の注入とＡｄｇｐ１９ｋ−βｇａｌの注入との併用の結果として、当該遺伝子の発現を顕著に持続させることが判明した。即ち、双方の注入の３０日後に、グループ２ｂでは、かなりのβガラクトシダーゼ活性が観察される。この持続は、本発明によって誘発されたトレランス現象の結果であると解釈でき、抗ＣＤ４免疫抑制剤及び組換えアデノウイルスＡｄｇｐ１９ｋ−βｇａｌの夫々の効果の単なる相加的効果から期待できる結果よりも顕著に優れている。更にグループ２ｂの場合、この３０日の期間中に炎症反応は全く観察されない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年２月２８日【補正内容】サイトフルオローメーター（ＦＡＣＳＳｃｈａｎ−ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光細胞の読取りを行った。結果を以下の表Ｉに示す。抗ＣＤ３抗体で処理した動物ではＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞が顕著に減少しており、抗ＣＤ４抗体で処理した動物ではＣＤ４＋細胞が選択的に減少していることが判明する。２．２．注入３２日後に採取しβｇａｌを発現する組織適合性標的に対して生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）刺激した脾臓細胞の細胞障害能力の分析処理した動物の脾臓から単離した脾臓細胞の第二の標本を、表面にβガラクトシダーゼを発現するＰ８１５細胞の存在下で４日間の生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）培養を行った。培養の終了後、Ｃｒ⁵¹で標識した標的細胞Ｐ８１５−βｇａｌに対する脾臓細胞の細胞障害活性を測定した。細胞溶解のパーセントで表す細胞障害活性は、エフェクター細胞と標的細胞とを種々の比で存在させる慣用の方法で測定した。結果を以下の表IIに示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 45/00 45/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シヤトヌー，リユシエーヌフランス国、エフ−92800・ピユトー、リユ・デ・パビヨン、14 (72)発明者アダダ，エデイフランス国、エフ−94140・アルフオールビル、リユ・ジユール−ゲード、１ (72)発明者リー，マーテインフランス国、エフ−75010・パリ、リユ・サンペ、９ (72)発明者ペリコデ，ミシエルフランス国、エフ−28320・エクローヌ、リユ・ドウ・シヤルトル、31 (72)発明者ウエブ，ミシエールフランス国、エフ−75005・パリ、リユ・トウルヌフオール、24

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１種類の免疫抑制剤と、治療用遺伝子を含む第一組換えＤＮＡと免疫防御遺伝子を含む第二組換えＤＮＡとをゲノムに含む少なくとも１種類の組換えアデノウイルスとから成る併用医薬であって、時間的に連続的、断続的及び／または同時的に投与でき、体内及び／または体外での外来遺伝子トランスフェクションに有用な併用医薬。２．免疫抑制剤が好ましくは、サイクロスポリン、ＦＫ５０６、アザチオプリン、コルチコステロイド及びモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体から選択されることを特徴とする請求項１に記載の併用医薬。３．抗体が、免疫分子を失活させ得るかまたは該分子を含む免疫細胞の破壊を惹起し得る抗体であることを特徴とする請求項２に記載の併用医薬。４．抗体が、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２８、抗Ｂ７、抗ＩＣＡＭ−１、抗ＬＦＡ−１及びＣＴＬＡ４Ｉｇから選択されることを特徴とする請求項３に記載の併用医薬。５．治療用遺伝子が治療用タンパク質をコードしていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の併用医薬。６．治療用遺伝子が治療用ＲＮＡをコードしていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の併用医薬。７．免疫防御遺伝子が、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の活性またはサイトカインの活性に作用する産物を産生する遺伝子であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の併用医薬。８．免疫防御遺伝子が、ＭＨＣのタンパク質の発現または抗原提示を少なくとも部分的に阻害する産物を産生する遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載の併用医薬。９．免疫防御遺伝子がアデノウイルスのｇｐ１９ｋの遺伝子、ヘルペスウイルスのＩＣＰ４７遺伝子またはサイトメガロウイルスのＵＬ１８遺伝子から選択されることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の併用医薬。１０．アデノウイルスのゲノムの２つの組換えＤＮＡが単一の転写単位を構成していることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の併用医薬。１１．２つの組換えＤＮＡの各々が、同じまたは異なる転写プロモーターを含むことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の併用医薬。１２．２つの組換えＤＮＡが同方向に挿入されていることを特徴とする請求項１１に記載の併用医薬。１３．２つの組換えＤＮＡが対向方向に挿入されていることを特徴とする請求項１１に記載の併用医薬。１４．２つの組換えＤＮＡがアデノウイルスのゲノムの同一部位、好ましくは領域Ｅ１、Ｅ３またはＥ４の処に挿入されていることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の併用医薬。１５．２つの組換えＤＮＡが領域Ｅ１の処に挿入されていることを特徴とする請求項１４に記載の併用医薬。１６．２つの組換えＤＮＡがアデノウイルスのゲノムの異なる部位に挿入されていることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の併用医薬。１７．２つの組換えＤＮＡの一方が領域Ｅ１の処に挿入されており他方が領域Ｅ３またはＥ４の処に挿入されていることを特徴とする請求項１６に記載の併用医薬。１８．アデノウイルスが、ＩＴＲ配列と、キャプシド形成を可能にする配列とを含み、Ｅ１遺伝子及びＥ４遺伝子の全部または一部が欠失した組換え欠損アデノウイルスであることを特徴とする請求項１から１７のいずれか一項に記載の併用医薬。１９．アデノウイルスが、ＩＴＲ配列と、キャプシド形成を可能にする配列とを含み、Ｅ１遺伝子、Ｅ３遺伝子及びＥ４遺伝子の全部または一部が欠失したアデノウイルスであることを特徴とする請求項１８に記載の併用医薬。２０．アデノウイルスが、Ｅ１遺伝子、Ｅ３遺伝子、Ｌ５遺伝子及びＥ４遺伝子の全部または一部が欠失したゲノムを有するアデノウイルスであることを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の併用医薬。２１．組換えアデノウイルスの起原が、ヒト、動物または双方にあることを特徴とする請求項１から２０のいずれか一項に記載の併用医薬。２２．ヒト起原の組換えアデノウイルスが、Ｃグループに分類されたアデノウイルス、好ましくは２型または５型の組換えアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の併用医薬。２３．動物起原のアデノウイルスが、イヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、トリ及びサルのアデノウイルスから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の併用医薬。２４．免疫抑制剤がアデノウイルスの注入前または注入後に注入されることを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の併用医薬。２５．免疫抑制剤と組換えアデノウイルスとが同時に注入されることを特徴とする請求項１から２４のいずれか一項に記載の併用医薬。