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Die
Erfindung betrifft adenovirale Vektoren, welche eine Expressionskassette
eines Gens von Interesse, welches unter die Kontrolle der für dessen
Expression erforderlichen Elemente gestellt ist und Spleißsequenzen
umfasst, umfassen. Deren Anwesenheit erlaubt, die Expression des
therapeutischen Gens in einer Wirtszelle oder einem Wirtsorganismus
deutlich zu erhöhen.
Sie hat gleichfalls die Zellen und die infektiösen Viruspartikel, die diese
neuen Vektoren enthalten, wie auch ein Verfahren zur Herstellung
von diesen zum Gegenstand. Die Erfindung ist von ganz besonderem
Interesse in Hinblick auf Gentherapieperspektiven, insbesondere
beim Menschen.
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Die
Gentherapie wird als Transfer von genetischer Information in eine
Wirtszelle oder einen Wirtsorganismus definiert. Das erste Protokoll,
das auf den Menschen angewendet wurde, wurde in den Vereinigten Staaten
im September 1990 an einem aufgrund einer Mutation, welche das Adenindesaminase
(ADA) kodierende Gen betraf, genetisch bedingt immundefizienten
Patienten begonnen. Der relative Erfolg dieses ersten Experiments
hat die Weiterentwicklung dieser Technik in Hinblick auf sowohl
genetisch bedingte (mit dem Ziel, die Dysfunktion eines fehlerhaften
Gens zu korrigieren) als auch erworbene Krankheiten (Infektionskrankheiten,
Krebserkrankungen ...) ermutigt. Gegenwärtig setzen die meisten Protokolle
retrovirale Vektoren ein, um das therapeutische Gen in die zu behandelnden
Zellen zu transportieren und darin zu exprimieren. Indessen weisen
sie außer
ihrer beschränkten
Klonierungskapazität
zwei Hauptnachteile auf, die deren systematische Verwendung begrenzen:
einerseits infizieren sie hauptsächlich
die in Teilung befindlichen Zellen und andererseits ist aufgrund
ihrer zufälligen
Integration in das Genom der Wirtszelle das Risiko einer Insertionsmutagenese
nicht zu vernachlässigen.
Aus diesem Grund bemühen
sich zahlreiche Wissenschaftlergruppen, andere Arten von Vektoren,
unter diesen die Adenoviren, zu entwickeln.
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Nachgewiesen
in zahlreichen Tierspezies, sind die Adenoviren wenig pathogen,
nicht-integrativ und replizieren ebenso gut in den in Teilung befindlichen
wie in ruhenden Zellen. Überdies
weisen sie ein breites Wirtsspektrum auf und sind in der Lage, eine
große
Anzahl von Zellarten zu infizieren, insbesondere die Epithelzellen,
Endothelzellen, Myozyten, Hepatozyten, Nervenzellen und Synoviozyten.
Außerdem
weisen sie einen natürlichen
Tropismus für
die Atemwege auf. Diese besonderen Eigenschaften machen Adenoviren
zu Vektoren der Wahl für
zahlreiche therapeutische Anwendungen und sogar Impfanwendungen.
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Allgemein
wird das adenovirale Genom aus einem linearen und doppelsträngigen DNA-Molekül von ungefähr 36 kb
gebildet, welches mehr als dreißig
Gene, die die viralen Proteine kodieren, und an seinen Enden zwei
umgekehrte Wiederholungssequenzen (als ITR für „Inverted Terminal Repeat" bezeichnet) und
die Verkapselungsregion trägt.
Die frühen
Gene sind in 4 in dem Genom verteilten Regionen verteilt (E1 bis
E4; E für „early" im Englischen),
die 6 Transkriptionseinheiten, die mit ihrem eigenen Promotor ausgestattet
sind, umfassen. Die späten
Gene (L1 bis L5; L für „late", was im Englischen
spät bedeutet),
die die Strukturproteine kodieren, überspannen teilweise die frühen Transkriptionseinheiten
und werden zumeist ausgehend von dem hauptsächlichen späten Promotor MLP (für „Major
Late Promoter" im
Englischen) transkribiert (siehe 1).
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Die
in den Gentherapieprotokollen gegenwärtig eingesetzten adenoviralen
Vektoren sind sogenannte Vektoren der ersten Generation, denen der
Hauptteil der für
die Replikation essentiellen E1-Region fehlt, um deren Ausbreitung
in der Umwelt und dem Wirtsorganismus zu verhindern. Die Deletion
der nicht-essentiellen E3-Region erlaubt, deren Klonierungskapazität zu erhöhen. Die
Gene von Interesse werden in die virale DNA anstelle von der einen
oder der anderen deletierten Region inseriert. Diese replikationsdefekten
Viren können in
einer Zelllinie, welche die E1-Funktion komplementiert, vermehrt
werden. Man setzt üblicherweise
die Linie 293, die ausgehend von humanen embryonalen Nierenzellen
etabliert worden ist (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72),
ein. Die Deletion der nicht-essentiellen Region E3 erfordert keine
besondere Komplementierung. Ist die Machbarkeit des Transfers von
Genen unter Verwendung dieser Vektoren der ersten Generation jetzt
auch gut etabliert, bleibt die Frage von deren Unschädlichkeit
bestehen. Außer
den Sicherheitsaspekten (Risiko, replikationskompetente Partikel
zu erzeugen) stellt sich das Problem von deren Toxizität.
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Tatsächlich haben
die ersten klinischen Untersuchungen die Induktion von Entzündungsreaktionen aufgrund
der Expression der viralen Gene bei dem Wirt, die sich der Persistenz
der transduzierten Zellen und der Expression des Transgens entgegenstellen,
nachgewiesen. Diese mit der Stimulation des Immunsystems des Wirts
durch die adenoviralen Epitope verbundenen Nachteile haben die Konstruktion
von Viren neuer Generationen gerechtfertigt.
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Die
Konzeption eines adenoviralen Vektors beruht einerseits auf dem
Virusgerüst
und andererseits auf der Expressionskassette des therapeutischen
Gens in Kombination mit Regulationselementen, die eine optimale
Expression in der Wirtzelle erlauben. Hinsichtlich des ersten Gesichtspunkts
enthalten die adenoviralen Vektoren der zweiten Generation noch
die cis-wirkenden ITR-Regionen und Verkapselungssequenzen und umfassen
bedeutende interne Deletionen, die darauf abzielen, die Hauptmenge
der viralen Gene, deren Expression in vivo nicht wünschenswert
ist, zu unterdrücken
(siehe die internationale Anmeldung WO 94/28152). Ihre Vermehrung
wird durch das Zwischenglied eines Hilfsvirus oder von Zelllinien,
die die defekten Funktionen komplementieren, sichergestellt. Man
wird beispielsweise eine von 293 abgeleitete Linie, die die adenoviralen, die
essentiellen E4-Proteine kodierenden Sequenzen exprimiert, einsetzen,
um einen Vektor der zweiten Generation, in dessen Genomgerüst die Regionen
E1, E3 und E4 deletiert sind, zu komplementieren.
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Was
die Expressionskassette angeht, umfasst jene im allgemeinen 5' eine Promotorregion,
welche die Transkription des in deren Folge gelegenen Gens dirigiert
und gegebenenfalls 3' eine
Polyadenylierungssequenz (polyA), die insbesondere dazu beiträgt, die
transkribierte mRNA zu stabilisieren. Zusätzliche Elemente können in
bestimmten Kontexten die Expression verbessern. Über die positive Wirkung der
Intronsequenzen auf die Genexpression ist bereits in vitro (Buchman
und Berg, 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 4395-4405; Huang und Gorman,
1990, Nucleic Acid Res. 18, 937-947), in vivo in transgenen Tieren
(Brinster et al., 1988, Proc. Natl. Rcad. Sci. USA 85, 836-840)
und unlängst
im Kontext eines adenoviralen Vektors der ersten Generation (Connelly
et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 183-195) berichtet worden. Dieses
Dokument zeigt, dass die durch ein Adenovirus, bei dem die Regionen
E1 und E3 deletiert sind und welches den humanen Faktor VIII exprimiert,
behandelten Mäuse
3- bis 13-fach höhere
Serum-Faktor VIII-Spiegel produzieren, wenn die FVIII-cDNA Spleißsequenzen
umfasst.
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Man
kann gleichfalls die am 22. Dezember 1994 unter der Nummer WO 94/29471
veröffentlichte
internationale Patentanmeldung aufführen, die einen rekombinanten
adenoviralen Vektor beschreibt, der ein Gen von Interesse, welches
den Gerinnungsfaktor FIX kodiert, unter der Kontrolle eines Promotors
und einer Polyadenylierungssequenz enthält. Die Hinzufügung einer
aus dem FIX-Gen stammenden homologen Spleißsequenz erlaubt, das Produktionsniveau
von FIX substantiell zu erhöhen,
im Wesentlichen in Gegenwart der 5'- und 3'-nicht-kodierenden Sequenzen dieses
Gens.
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Die
Erfindung hat zum Ziel, der Öffentlichkeit
vom Gesichtspunkt der Expression des therapeutischen Gens aus wirksamere
adenovirale Vektoren zur Verfügung
zu stellen, welche so erlauben, die Vektordosen zu verringern und
die therapeutische Wirkung zu verstärken. Es wurde jetzt gezeigt,
dass die Anwesenheit von Spleißsequenzen
innerhalb des Gens von Interesse nützlich, ja sogar unabdingbar
ist, um dessen Expression zu erzielen. Diese Beobachtung ist besonders
zutreffend im Kontext eines adenoviralen Vektors der zweiten Generation,
wo die Expressionsniveaus der therapeutischen Gene Faktor IX (FIX)
aus dem Hund und humanes Interleukin-2 (IL-2) um einen Faktor von
20 bis 150 erhöht
sind, wenn die Expressionskassette diese Spleißsequenzen enthält. Bei
einem Vektor der ersten Generation bleibt der Verstärkungsfaktor
nach wie vor signifikant (2 bis 3). Diese bedeutende Verbesserung
der Genexpression ist unerwartet und konnte aus dem Stand der Technik
nicht abgeleitet werden.
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Aus
diesem Grund hat die Erfindung einen adenoviralen Vektor zum Gegenstand,
welcher sich von dem Genom eines Adenovirus wenigstens durch Deletion
der Gesamtheit oder eines Teils der E1-Region ableitet, wobei der
adenovirale Vektor eine Expressionskassette eines Gens von Interesse,
welches unter die Kontrolle der für dessen Expression in einer
Wirtszelle oder einem Wirtsorganismus erforderlichen Elemente gestellt
ist, umfasst, wobei die für
die Expression erforderlichen Elemente wenigstens eine Spleißsequenz
umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Spleißsequenz eine Spleißdonorstelle
und eine Spleißakzeptorstelle
umfasst und sich von einem β-Globin-Gen
oder einer synthetischen Spleißsequenz,
welche die in der Sequenzbeschreibung IDS 1 angegebene Sequenz aufweist,
ableitet.
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Im
Sinne der Erfindung bezeichnet der Ausdruck adenoviraler Vektor
ein in Abwesenheit von jeglicher Komplementierung replikationsdefektes
(zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle unfähiges) Adenovirus. Der
erfindungsgemäße Vektor
ist bezogen auf das Ausgangs-Adenovirus wenigstens in der Region
E1 durch vollständige
oder teilweise Deletion von dieser Letzteren modifiziert. Gemäß einer
vorteilhaften Ausführungsweise
ist außerdem
wenigstens eine der aus E2, E4, L1, L2, L3, L4 und L5 ausgewählten Regionen
nicht funktional (funktionsfähig).
Die Nicht-Funktionalität
kann durch vollständige
oder teilweise Deletion von einer oder mehreren der betreffenden
Regionen oder durch Einführung
von einer oder mehreren Mutation (en) (Deletion, Hinzufügung und/oder
Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden), die das mutierte
adenovirale Gen fehlerhaft/defekt machen, erhalten werden. Diese
Modifikationen können
die kodierenden Sequenzen des viralen Genoms oder nicht kodierende
Sequenzen, insbesondere die Promotorregionen, betreffen. Um diese Ausführungsweisen
zu veranschaulichen, kann man die wärmeempfindliche Mutation, die
das DBP-Gen (für DNA
Binding Protein im Englischen) der Region E2A betrifft, aufführen (Ensinger
et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339). Eine teilweise Deletion kann
in der Eliminierung der Region E4 mit Ausnahme der die offenen Leseraster
(ORF) 6 und 7 kodierenden Sequenzen, die keine Komplementation der
E4-Funktion erforderlich
machen, bestehen (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048).
Eine vollständige
Deletion von E4 umspannt die vollständige Transkriptionseinheit.
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Es
wird angegeben, dass ein erfindungsgemäßer adenoviraler Vektor nach
wie vor die cis-wirksamen Regionen des adenoviralen Genoms enthält, nämlich die
terminalen invertierten Sequenzwiederholungen (ITR) und die Verkapselungsregion.
Deren Länge
und Nukleotidsequenz kann von einem Serotyp zum anderen variieren.
Indessen können
sie ausgehend von den Angaben in der Literatur leicht isoliert werden.
Zur Unterrichtung tragen die ersten 458 Nukleotide (nt) des Genoms
des Adenovirus vom Typ 5 (Ad5) die 5'-ITR und die Verkapselungsregion und
die letzten 103 nt entsprechen der 3'-ITR. Der erfindungsgemäße adenovirale Vektor
umfasst vorteilhafterweise gleichfalls die das Protein pIX kodierenden
Sequenzen, wenigstens insoweit, als sie durch die Produktionslinie
nicht komplementiert werden. Außerdem
kann bei diesem die Gesamtheit oder ein Teil der E3-Region fehlen.
Eine andere Alternative besteht darin, die E3-Sequenzen zu bewahren,
die die Polypeptide, die es erlauben, dem Immunsystem des Wirts
zu entkommen, kodieren, insbesondere das Glycoprotein gp19k (Gooding
et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71). Im Rahmen
der Erfindung kann man auf die sogenannten Vektoren der zweiten
Generation des Standes der Technik zurückgreifen (siehe beispielsweise
die internationalen Anmeldungen WO 94/28152 und WO 97/04119).
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Ein
erfindungsgemäßer adenoviraler
Vektor kann gleichfalls auf der Ebene der Sequenzen, die die späten Proteine,
wie das Hexon, das Penton oder die Faser, kodieren, modifiziert
sein, um die Infektiosität
des Virions zu modifizieren, um beispielsweise einen speziellen
Zelltyp zielgerichtet anzusteuern (siehe beispielsweise die französische Anmeldudng
FR 97 04747 ).
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Ein
gemäß der Erfindung
bevorzugter adenoviraler Vektor wird ausgewählt unter den Folgenden:
- (1) adenoviraler Vektor, welchem die Gesamtheit
oder ein Teil der Regionen E1 und E2 und gegebenenfalls die Gesamtheit
oder ein Teil von E3 fehlt,
- (2) adenoviraler Vektor, welchem die Gesamtheit oder ein Teil
der Regionen E1 und E4 und gegebenenfalls die Gesamtheit oder ein
Teil von E3 fehlt,
- (3) adenoviraler Vektor, welchem die Gesamtheit oder ein Teil
der Regionen E1 und E4 und gegebenenfalls die Gesamtheit oder ein
Teil von E3 fehlt und welcher eine nicht-funktionale Mutation in
der Region E2 umfasst,
- (4) adenoviraler Vektor, welchem die Gesamtheit oder ein Teil
der Regionen E1, E2 und E4 und gegebenenfalls die Gesamtheit oder
ein Teil von E3 fehlt,
- (5) adenoviraler Vektor, welchem die Gesamtheit oder ein Teil
der Region E1 und gegebenenfalls die Gesamtheit oder ein Teil von
E3 fehlt.
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Die
Herkunft des erfindungsgemäßen adenoviralen
Vektors kann sowohl vom Gesichtspunkt der Spezies als auch dem des
Serotyps variieren. Er kann sich von dem Genom eines Adenovirus
von humanem Ursprung, Hunde-, Vogel-, Rinder-, Maus-, Schaf-, Schweine-
oder Affenursprung oder ferner von einem Hybrid, welches Fragmente
von adenoviralen Genomen unterschiedlicher Ursprünge umfasst, ableiten. Man
kann insbesondere die Adenoviren CAV-1 oder CAV-2 von Hunde-Ursprung,
DAV von Vogel-Ursprung oder ferner Bad vom Typ 3 von Rinder-Ursprung
aufführen
(Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128:171-176; Spibey und
Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70:165-172; Jouvenne et al., Gene,
1987, 60:21-28; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76:93-102).
Man wird indessen einen adenoviralen Vektor humanen Ursprungs, welcher
sich bevorzugt von einem Adenovirus vom Serotyp C ableitet, insbesondere
vom Typ 2 oder 5, bevorzugen. Außerdem kann der adenovirale
Vektor gemäß der Erfindung
in vitro in Escherichia coli (E. coli) durch die Techniken der Molekularbiologie
oder ferner durch homologe Rekombination (siehe beispielsweise die
internationale Anmeldung WO 96/17070) erzeugt werden.
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Wie
zuvor angegeben, ist der erfindungsgemäße adenovirale Vektor rekombinant
und umfasst wenigstens eine Expressionskassette eines Gens von Interesse,
welches unter die Kontrolle der für dessen Expression in einer
Wirtszelle oder einem Wirtsorganismus erforderlichen Elemente gestellt
ist. Sie ist bevorzugt in den erfindungsgemäßen adenoviralen Vektor unter
Ersetzung von einer der deletierten Regionen, insbesondere von E1
inseriert. In dem Falle, wo man mehrere Expressionskassetten einsetzt,
können
diese an der gleichen Stelle oder an unterschiedlichen Stellen des
Virusgenoms inseriert werden, die gleichen Regulationselemente oder
unterschiedliche Elemente verwenden und gegebenenfalls in umgekehrter
Orientierung bezogen auf einander vorliegen, um Interferenzphänomene auf
der Ebene der Genexpression zu minimieren.
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Das
essentielle Merkmal der wenigstens einen der im Rahmen der Erfindung
eingesetzten Expressionskassetten besteht darin, dass diese wenigstens
eine Spleißsequenz
umfasst. Der Ausdruck „Spleißsequenz" bezeichnet eine
Sequenz, die üblicherweise
beim Spleißen
einer dazwischenliegenden Sequenz (ivs), die sich zwischen zwei
Spleißstellen
befindet, wirksam ist, in einem nukleären Gen zwischen zwei Exons
vor handen ist und in der entsprechenden Messenger-RNA (mRNA) fehlt.
Die Exons sind die Sequenzabschnitte, die die mRNA bilden. Sie können kodierend
oder nicht-kodierend sein, insbesondere jene, die sich an den 5'- und 3'-Enden befinden.
Die Spleißstellen
repräsentieren
die Grenzpositionen zwischen Exons und ivs, wobei die Donorposition
am Beginn der ivs und die Akzeptorposition am Ende steht. Die Spleißsequenz
umfasst wenigstens die direkt 3' von
der Spleißdonorposition
und 5' von der Spleißakzeptorposition
befindlichen Sequenzen und gegebenenfalls eine Sequenz von irgendeiner
Größe, die
diese trennt. Sie kann gleichfalls an dem einen oder anderen von
ihren beiden Enden ergänzende
Sequenzen umfassen. Man wird vorzugsweise nicht-kodierende Exonsequenzen
einsetzen, die direkt am Spleißprozess
teilnehmen und die Sequenzen direkt 5' von der Spleißdonorposition und 3' von der Spleißdonorposition
umfassen. Diese Ausführungsweise
ist besonders vorteilhaft bei einem Gen von Interesse vom Typ komplementäre DNA (cDNA).
Die direkt an dem Spleißen
teilnehmenden Sequenzen (die Exon-ivs-Verbindungsstelle überspannende
Spleißstellen)
sind während
der Evolution relativ gut konserviert und die Consensussequenzen
werden in den meisten Grundlagenwerken, die die Expression der eukaryotischen
Gene behandeln (beispielsweise in Watson et al., 1989, in: Molecular
Biology of the Gene, 4. Aufl., S. 683-742, Benjamin/Cummings Publishing
Company Inc., Menlo Park, Kalifornien), offenbart. Insbesondere
sind die GT- und AG-Sequenzen,
die strangaufwärts
bzw. strangabwärts der
5'- (Donor) und
3'- (Akzeptor)-Spleißpositionen
liegen, praktisch unveränderlich.
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Es
ist bekannt, dass zahlreiche eukaryotische Gene durch eine Aufeinanderfolge
von Exon und Introns gebildet werden. Die Spleißsequenzen, die im Rahmen der
Erfindung eingesetzt werden können,
können
deutlich unterschiedliche Längen
und Sequenzen aufweisen. Es kann sich um eine native Spleißsequenz,
wie eine solche, die in der Natur gefunden wird, handeln. Man kann
auch eine Spleißsequenz
einsetzen, die modifiziert ist, insbesondere durch die Suppression
von einer oder mehreren Sequenzen, die in dem Spleißprozess
nicht aktiv sind, mit dem Ziel, deren Größe zu verringern oder wiederholte
Sequenzen, die zu Rekombinationsphänomenen führen können, oder Regulationssequenzen,
die die Expression des Gens von Interesse stören könnten, zu beseitigen. Man kann
ins Auge fassen, eine Chimäre
Spleißsequenz
einzusetzen, die aus Sequenzen unterschiedlicher Herkunft gebildet
wird. Um diesen Aspekt zu veranschaulichen, kann das chimäre Intron
aus 5'- und 3'-Abschnitten von
zwei unterschiedlichen Introns gebildet werden oder mit einer heterologen Spleißdonorstelle
und/oder einer heterologen Spleißakzeptorstelle ausgestattet
werden. Es ist gleichfalls möglich,
auf eine synthetische Spleißsequenz
zurückzugreifen,
die ausgehend von Consensus-Spleißstellen konzipiert worden
ist. Eine gemäß der Erfindung
bevorzugte Spleißsequenz
leitet sich von dem zweiten Intron des β-Globin-Gens des Kaninchens (Green et al., 1988,
Nucleic Acid Res. 16, 369; Karasuyama et al., 1988, Eur. J. Immunol.
18, 97-104; Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med. 169, 13-25) oder
jener, die in dem Plasmid pCI (Promega Corp., pCI mammalian expression
vector E1731) gefunden wird, umfassend die Spleißdonorstelle des Introns 1
des humanen β-Globin-Gens
sowie den Verzweigungspunkt und die Spleißakzeptorstelle des Gens eines
Immunglobulins von der Maus, ab.
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Ein
erfindungsgemäßer adenoviraler
Vektor umfasst vorzugsweise eine Spleißsequenz, welche zu wenigstens
70% identisch oder identisch ist mit der in der Sequenzbeschreibung
IDS 1 oder 2 angegebenen Sequenz. Die Sequenzidentität zwischen
der Sequenz, die im Rahmen der Erfindung verwendet wird, und jener,
die in der einen oder der anderen der IDS angegeben ist, beträgt wenigstens
70%, vorteilhafterweise wenigstens 80%, vorzugsweise wenigstens
90% und ganz und gar bevorzugt wenigstens 95%. Sequenzidentität bedeutet
100% Identität
und „eine
im Wesentlichen derartige" bezeichnet
eine Sequenzidentität
von wenigstens 95%. Ein Abschnitt umfasst wenigstens 17 aufeinanderfolgende
nt. Ein erfindungsgemäßer adenoviraler Vektor,
der eine Spleißsequenz
umfasst, die im Wesentlichen derart ist, wie sie in der Sequenzbeschreibung IDS
1 oder 2 angegeben ist, ist ganz besonders geeignet.
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Gemäß den durch
die Erfindung verfolgten Zielen kann die Expressionskassette eine
oder mehrere Spleißsequenzen
umfassen, die innerhalb eines oder mehrerer Gene von Interesse vom
genomischen Typ, Minigen-Typ (aus genomischer DNA und cDNA gemischter
Typ) oder ferner cDNA-Typ (frei von Introns), die in der Kassette
enthalten sind, inseriert ist bzw. sind. Die bevorzugte Insertionsstelle
der Spleißsequenz
innerhalb des Gens von Interesse liegt zwischen dem ersten Exon
und dem zweiten Exon. Wenn das Gen von Interesse vom cDNA-Typ ist,
wird man vorzugsweise auf eine Spleißsequenz zurückgreifen,
die mit kurzen Exonsequen zen, die 5' oder 3' von der cDNA inseriert werden können, ausgestattet
ist. Das Gen von Interesse kann zu der Wirtszelle homolog oder heterolog
sein und eine Antisinn-RNA, ein Ribozym oder ein Polypeptid von Interesse
von nukleärer,
zytoplasmatischer, membranständiger
oder sekretierter Lokalisation kodieren. Es kann sich um ein natives
Polypeptid, wie es in der Natur gefunden wird, um ein funktionsfähiges Fragment,
um eine Mutante, die verbesserte und/oder modifizierte biologische
Eigenschaften aufweist, oder ferner eine chimäre Struktur, die aus der Fusion
von Sequenzen unterschiedlicher Herkunft hervorgeht, handeln. Das
Gen von Interesse kann durch chemische Synthese oder durch Klonierung
(Screening einer DNA-Bank mit Hilfe von geeigneten Sonden, PCR...)
erhalten werden und kann durch die herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie
modifiziert werden.
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Im
Rahmen der Erfindung kann es vorteilhaft sein, ein Gen von Interesse,
das ein Zytokin (Interferon α, β oder γ, Interleukin
(IL), insbesondere IL-2, IL-6, IL-10 oder ferner IL-12, einen Tumornekrosefaktor
(TNF), einen Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...),
einen zellulären
Rezeptor (der insbesondere durch das HIV-Virus erkannt wird), einen
Liganden eines Rezeptors, einen Gerinnungsfaktor, einen Wachstumsfaktor
(FGF für
Fibroblast Growth Factor, VEGF für
Vascular Endothelial Growth Factor...), ein Enzym (Urease, Renin,
Thrombin, Metalloproteinase, NOS für Nitric Oxide Synthetase,
SOD, Katalase...), einen Enzyminhibitor (α1-Antitrypsin, Antithrombin
III, viraler Proteaseinhibitor, PAI-1 für Plasminogen Activator Inhibitor..),
ein Antigen des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse I oder
II oder ein Polypeptid, welches auf die Expression der entsprechenden
Gene einwirkt, ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine virale,
bakterielle oder durch Parasiten hervorgerufene Infektion oder deren
Entwicklung zu hemmen, ein Polypeptid, das positiv oder negativ
auf die Apoptose einwirkt (Bax, Bcl2, BclX...), ein zytostatisches
Agens (p21, p16, Rb...), ein Apolipoprotein (ApoAI, ApoAIV, ApoE...),
einen Angiogenese-Inhibitor
(Angiostatin, Endostatin...), einen Marker (β-Galactosidase, Luciferase...)
kodiert, oder ein jegliches anderes Gen von Interesse mit einer
therapeutischen Wirkung für
die Zielerkrankung einzusetzen.
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Genauer
wird man mit dem Ziel, eine vererbte Dysfunktion zu behandeln, eine
funktionsfähige
Kopie des defekten Gens einsetzen, beispielsweise ein Gen, welches
den Faktor VIII oder IX kodiert, im Rahmen der Hämophilie A oder B, Dystrophin
im Rahmen der Duchenne- und Becker-Muskeldystrophien, Insulin im Falle von
Diabetes, das Protein CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator) im Rahmen von Mukoviszidose. Handelt es sich darum, die
Entstehung oder das Fortschreiten von Tumoren oder Krebserkrankungen
zu hemmen, wird man vorzugsweise ein Gen von Interesse einsetzen,
welches eine Antisinn-RNA, ein Ribozym, ein zytotoxisches Produkt
(Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus 1 (TK-HSV-1), Ricin, Choleratoxin,
Diphtherietoxin, das Expressionsprodukt der Hefe-Gene FCY1 und FUR1,
welche Uracilphosphoribosyltransferase und Cytosindesaminase kodieren,....),
einen Antikörper,
einen Inhibitor der Zellteilung oder von Translationssignalen, ein
Expressionsprodukt eines Tumorsuppressorgens (p53, Rb, p73...),
ein das Immunsystem stimulierendes Polypeptid, ein mit einem Tumor
assoziiertes Antigen (MUC-1, BRCA-1, frühe oder späte Antigene (E6, E7, L1, L2...)
eines HPV-Papillomavirus...) kodiert, gegebenenfalls in Kombination
mit einem Zytokingen. Schließlich
kann man im Rahmen einer anti-HIV-Therapie auf ein Gen zurückgreifen,
das ein immunschützendes
Polypeptid, ein antigenes Epitop, einen Antikörper (2F5; Buchacher et al.,
1992, Vaccines 92, 191-195), die extrazelluläre Domäne des CD4-Rezeptors (sCD4; Traunecker et al.,
1988, Nature 331, 84-86), ein Immunadhäsin (beispielsweise ein CD4-IgG-Immunglobulin-Hybrid;
Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1990, Nature
344, 667-670), ein
Immuntoxin (beispielsweise eine Fusion des Antikörpers 2F5 oder des Immunadhäsins CD4-2F5
mit Angiogenin; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499),
eine transdominante Variante, ein zytotoxisches Produkt, wie eines
von jenen, die vorstehend erwähnt
worden sind, oder ferner ein IFNα oder β kodiert.
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Außerdem kann
die im Rahmen der Erfindung eingesetzte Expressionskassette gleichfalls
ein der Selektion dienendes Gen, welches erlaubt, die transfizierten
Zellen zu selektieren oder zu identifizieren, umfassen. Man kann
die Gene neo (welches Neomycinphosphotransferase kodiert), welches
eine Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht, dhfr (Dihydrofolatreduktase),
CAT (Chloramphenicoltransferase), pac (Puromycinacetyltransferase)
oder ferner qpt (Xanthinguaninphosphoribosyltransferase) aufführen. Allgemein
sind die der Selektion dienenden Gene den Fachleuten auf diesem
Gebiet bekannt.
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Der
Ausdruck „für die Expression
erforderliche Elemente" bezeichnet
die genetischen Elemente, die die Transkription eines Gens von Interesse
zu RNA und die Translation einer mRNA in ein Polypeptid erlauben. Unter
jenen kommt dem Promotor eine besondere Bedeutung zu. Er kann aus
irgendeinem Gen eukaryotischer oder sogar viraler Herkunft isoliert
werden und kann konstitutiv oder regulierbar sein. Alternativ kann
es sich um den natürlichen
Promotor des fraglichen Gens handeln. Außerdem kann er derart modifiziert
sein, dass die Promotoraktivität
verbessert wird, eine die Transkription inhibierende Region supprimiert
wird, ein konstitutiver Promotor regulierbar gemacht wird oder umgekehrt,
eine Restriktionsstelle eingeführt
wird ... Man kann als Beispiele die viralen CMV- (Zytomegalievirus),
RSV- (Rous-Sarkom-Virus) -Promotoren, den Promotor des TK-Gens des
HSV-1-Virus, den frühen
Promotor des SV40-Virus (Simian-Virus 40), den adenoviralen Promotor
eines frühen
oder späten
Gens (E1A, MLP...) oder ferner die eukaryotischen Promotoren der
Gene PGK (Phosphoglyceratkinase), MT (Metallothionein), α1-Antitrypsin,
CFTR, Surfactant (Lungen-spezifisch), von Immunglobulinen (Lymphozyten-spezifisch),
Aktin (Muskel-spezifisch) oder ferner SRα (Hybrid zwischen dem Startpunkt
von SV40 und der LTR von HTLV-I; Takebe et al., 1988, Mol. Cell.
Biol. 8, 466-472) erwähnen. Es
kann sich gleichfalls um einen Promotor handeln, der die Expression
in einer Tumor- oder Krebszelle stimuliert. Man kann insbesondere
die Promotoren der Gene MUC-1, welches bei den Brust- und Prostatakrebsformen überexprimiert
wird (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (für Carcinoma
Embryonic Antigen), welches bei den Krebsarten des Colons überexprimiert
wird (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), Tyrosinose,
welche bei den Melanomen überexprimiert
wird (Vile et al., 1993, Cancer Res., 53, 3860-3864), ERB-2, welches
bei den Brust- und Pankreaskrebsformen überexprimiert wird (Harris
et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175), und α-Fetoprotein, welches bei den
Leberkrebsformen überexprimiert
wird (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465), aufführen. Der
frühe Promotor
des Zytomegalievirus (CMV) ist ganz besonders bevorzugt.
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Wenn
die im Rahmen der Erfindung eingesetzte Expressionskassette mehrere
Gene von Interesse umfasst, können
jene unter die Kontrolle der gleichen genetischen Elemente (polycistronische
Kassette unter Verwen dung einer internen Translationsstartstelle
vom IRES-Typ, um die Translation des zweiten Cistrons zu reinitiieren)
oder von unabhängigen
Elementen gestellt sein.
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Selbstverständlich kann
die Kassette außerdem
zusätzliche
Elemente umfassen, die die Expression des Gens von Interesse verbessern
(Signalsequenz, Kernlokalisierungssequenz, Polyadenylierungssequenz, IRES,
dreiteilige Leadersequenz...) oder ferner die Aufrechterhaltung
in der Wirtszelle (Replikationsstartpunkt...) verbessern. Solche
Elemente sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Eine bevorzugte
Polyadenylierungssequenz leitet sich von dem SV40-Virus oder ferner
von dem β-Globin-Gen des Kaninchens ab.
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Eine
besonders vorteilhafte Ausführungsweise
besteht in einem adenoviralen Vektor, in dessen Genom die Regionen
E1, E3 und E4 deletiert sind und in welchen anstelle der Region
E1 eine Expressionskassette insertiert ist, die den CMV-Promotor,
die aus dem Plasmid pCI isolierte synthetische Spleißsequenz,
die humanes IL-2 kodierende cDNA und die polyA-Sequenz des SV40-Virus
(wie pTG6215) umfasst. Eine andere interessante Variante wird durch
einen adenoviralen Vektor von ähnlichem
genomischem Gerüst
(Deletion von E1, E3 und E4) gebildet, welcher eine Expressionskassette
umfasst, welche gebildet wird aus dem RSV-Promotor, gefolgt von Spleißsequenzen,
welche das Intron 2 des β-Globin-Gens des Kaninchens
umfassen, der cDNA des Faktors IX aus dem Hund und der polyA-Sequenz
des β-Globin-Gens
des Kaninchens (wie pTG9378). Ein anderes bevorzugtes Beispiel besteht
in einem E1–E3–-Vektor, in welchen
eine Kassette aus dem CMV-Promotor, dem synthetischen pCI-Intron,
der humanes IL-2 kodierenden cDNA, gefolgt von der polyA-Sequenz
von SV40 (wie pTG6624) inseriert ist.
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Die
Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein infektiöses Viruspartikel
wie auch eine eukaryotische Wirtszelle, die einen erfindungsgemäßen adenoviralen
Vektor umfassen. Die Wirtszelle ist vorteilhafterweise eine Säugetierzelle
und vorzugsweise eine humane Zelle und kann den Vektor in einer
Form, die in das Genom integriert ist oder nicht, umfassen. Es kann
sich um eine primäre
Zelle oder Tumorzelle von hämopoetischem Ursprung
(totipotente Stammzelle, Leukozyt, Lymphozyt, Monozyt oder Makrophage...),
muskulärem
Ursprung (Satellitenzelle, Myozyt, Myoblast...), kardialem, hepatischem,
pulmonalem, trachealem, epithelialem oder Fibroblasten-Ursprung
handeln. Ein erfindungsgemäßes infektiöses Viruspartikel
wird gemäß einer
jeglichen Technik, die auf diesem Fachgebiet herkömmlich ist,
hergestellt (Graham und Prevect, 1991, a.a.O.). Genauer wird der
erfindungsgemäße adenovirale
Vektor in einer Komplementationslinie vermehrt, die in der Lage
ist, in trans die defekten Funktionen bereitzustellen, um die Polypeptide
zu produzieren, die für
die Herstellung der infektiösen
Viruspartikel erforderlich sind. Man wird insbesondere auf die in
den internationalen Anmeldungen WO 94/28152 und WO 97/04119 beschriebenen
Linien zurückgreifen.
Man kann gleichfalls eine geeignete Zelllinie einsetzen, wie die
Linie 293, um die Funktion E1 zu komplementieren (Graham et al.,
1977, a.a.O.), oder A549-E1 (WO 94/28152). Für eine mehrfache Komplementation
ist es gleichfalls möglich,
ein Hilfsvirus oder eine Komplementationslinie des Standes der Technik
(beispielsweise Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2033) einzusetzen.
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Die
Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung eines
infektiösen
Viruspartikels, welches einen adenoviralen Vektor gemäß der Erfindung
umfasst, gemäß welchem:
- (i) man den erfindungsgemäßen adenoviralen Vektor in
eine Komplementationszelle, welche in der Lage ist, den Vektor in
trans zu komplementieren, einschleust, um eine transfizierte Komplementationszelle
zu erhalten;
- (ii) man die transfizierte Komplementationszelle unter geeigneten
Bedingungen kultiviert, um die Produktion des infektiösen Viruspartikels
zu ermöglichen;
und
- (iii) man das infektiöse
Viruspartikel in der Zellkultur gewinnt.
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Selbstverständlich kann
das infektiöse
Viruspartikel aus dem Kulturüberstand,
aber gleichfalls aus den Zellen gewonnen werden. Eine der Methoden,
die üblicherweise
eingesetzt wird, besteht darin, die Zellen durch aufeinanderfolgende
Zyklen von Einfrieren/Auftauen zu lysieren, um die Virionen in dem
Lyseüberstand zu
gewinnen. Jene können
gemäß den Techniken
dieses Fachgebiets amplifiziert und gereinigt werden (chromatographisches
Verfahren, Ultrazentrifugation, insbesondere durch einen Cäsiumchloridgradienten
hindurch ...).
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Die
Erfindung hat gleichfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zum
Gegenstand, welche als therapeutisches oder prophylaktisches Agens
einen adenoviralen Vektor, ein infektiöses Viruspartikel oder eine
eukaryotische Wirtszelle gemäß der Erfindung
oder ferner ein infektiöses
Viruspartikel, welches durch ein Verfahren zur Herstellung eines
infektiösen
Viruspartikels gemäß der Erfindung
erhalten werden kann, in Kombination mit einem aus pharmazeutischer
Sicht annehmbaren Träger
umfasst. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung
ist insbesondere für
die präventive
oder kurative Behandlung von genetisch bedingten Erkrankungen (Hämophilie,
Diabetes, Mukoviszidose, Duchenne- oder Becker-Muskeldystrophie,
Autoimmunerkrankungen...), von Krebserkrankungen und Tumoren, von
Viruserkrankungen (Hepatitis B oder C, AIDS, Herpes-Infektionen...),
von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (Restenosen u.s.w.) bestimmt.
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Eine
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung kann auf herkömmliche
Weise in Hinblick auf eine Verabreichung auf lokalem, parenteralem
oder über
den Verdauungstrakt erfolgendem Wege hergestellt werden. Man kombiniert
insbesondere eine therapeutisch wirksame Menge des therapeutischen oder
prophylaktischen Mittels mit einem aus pharmazeutischer Sicht annehmbaren
Träger.
Es gibt eine Mehrzahl von Verabreichungswegen, die in Betracht gezogen
werden können.
Man kann beispielsweise den intragastrischen, subkutanen, intrakardialen,
intramuskulären,
intravenösen,
intraperitonealen, intratumoralen, intranasalen, intrapulmonalen
oder intratrachealen Weg aufführen.
Für diese
drei letztgenannten Ausführungsweisen
ist eine Verabreichung durch Aerosol oder Instillation vorteilhaft.
Die Verabreichung kann in einer einzigen Dosis oder wiederholt,
ein- oder mehrmals nach einem bestimmten Zeitintervall, stattfinden.
Der Verabreichungsweg und die Dosierung, die geeignet sind, variieren
abhängig
von verschiedenen Parametern, beispielsweise von dem Individuum
oder der zu behandelnden Krankheit oder ferner dem oder den Gen
(en) von Interesse, das bzw. die transferiert werden soll (en).
Insbesondere können
die erfindungsgemäßen viralen
Partikel in Form von Dosen zwischen 104 und
1014 pfu (Plaque-bildende Einheiten), vorteilhafterweise
105 und 1013 pfu
und vorzugsweise 106 und 1012 pfu
formuliert werden. Die Formulierung kann gleichfalls ein Verdünnungsmittel,
ein Adjuvans oder einen Träger,
welches bzw. welcher aus pharmazeutischer Sicht annehmbar ist, umfas sen.
Sie kann in flüssiger
oder trockener Form (Lyophilisat) vorliegen.
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Der
Vektor und die viralen Viruspartikel gemäß der Erfindung können gegebenenfalls
mit einer oder mehreren Substanzen, die die Transfektionseffektivität und/oder
die Stabilität
verbessern, kombiniert werden. Diese Substanzen sind in der Literatur,
die für
den Fachmann auf diesem Gebiet zugänglich ist, ausführlich dokumentiert
(siehe beispielsweise Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol.
Soc. 32, 115-121; Hodgson und Solaiman, 1996, Nature Biotechnology
14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654).
Zur Veranschaulichung, aber nicht als Einschränkung kann es sich um Polymere,
um insbesondere kationische Lipide, Liposomen, nukleäre Proteine
oder ferner neutrale Lipide handeln. Diese Substanzen können allein
oder in Kombination verwendet werden.
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Schließlich bezieht
sich die Erfindung auf die Verwendung eines adenoviralen Vektors,
eines infektiösen
Viruspartikels oder einer eukaryotischen Wirtszelle gemäß der Erfindung
oder ferner eines infektiösen
Viruspartikels, welches durch ein Verfahren zur Herstellung eines
infektiösen
Viruspartikels gemäß der Erfindung erhalten
werden kann, für
den Transfer eines Gens von Interesse in eine Wirtszelle oder einen
Wirtsorganismus. Gemäß einer
ersten Möglichkeit
kann das Arzneimittel direkt in vivo (beispielsweise durch intravenöse, intramuskuläre Injektion,
durch Injektion in einen zugänglichen
Tumor, in die Lungen durch ein Aerosol...) verabreicht werden. Man
kann gleichfalls den ex vivo-Ansatz heranziehen, der darin besteht,
dem Patienten Zellen (Knochenmarksstammzellen, Lymphozyten des peripheren
Bluts...) zu entnehmen, diese in vitro gemäß den Techniken dieses Fachgebiets
zu transfizieren oder zu infizieren und diese dem Patienten erneut
zu verabreichen. Es wird gleichfalls die Herstellung eines Arzneimittels
beschrieben, das für
die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch
Gentherapie bestimmt ist.
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Schließlich hat
die Erfindung gleichfalls die Verwendung eines adenoviralen Vektors
gemäß der Erfindung,
um die Expression eines Gens von Interesse in einer Wirtszelle oder
einem Wirtsorganismus um einen Faktor von wenigstens 20, vorteilhafterweise
um wenigstens 50 und bevor zugt um wenigstens 100 zu verstärken, zum
Gegenstand. Die Verstärkungshöhe kann
leicht bestimmt werden, indem die Expression des Gens von Interesse
in Gegenwart und in Abwesenheit der Spleißsequenz in einem gegebenen
adenoviralen Kontext verglichen wird.
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Es
wird gleichfalls ein Behandlungsverfahren beschrieben, gemäß welchem
man einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, eine therapeutisch
wirksame Menge eines adenoviralen Vektors, eines Viruspartikels
oder einer eukaryotischen Wirtszelle gemäß der Erfindung verabreicht.
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Die 1 ist
eine schematische Darstellung des Genoms des humanen Adenovirus
vom Typ 5 (aufgeführt
in arbiträren
Einheiten von 0 bis 100), welche die Lage der verschiedenen Gene
angibt.
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BEISPIELE
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne
deswegen beschränkt
zu werden.
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Die
nachfolgend beschriebenen Konstrukte werden gemäß den allgemeinen Techniken
der Gentechnologie und der molekularen Klonierung, die detailliert
in Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben werden, oder
gemäß den Empfehlungen
des Herstellers, wenn man einen kommerziellen Kit einsetzt, hergestellt.
Die Schritte der homologen Rekombination werden bevorzugt in dem
Stamm E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580)
ausgeführt. Wenn
es sich um die Reparatur von Restriktionsstellen handelt, besteht
die eingesetzte Technik in einem Auffüllen der überhängenden 5'-Enden mit Hilfe des großen Fragments
der DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow). Die Amplifizierungstechniken
durch PCR (Polymerase Chain Reaction) sind den Fachleuten auf diesem Gebiet
bekannt (siehe beispielsweise PCR Protocols – A Guide to Methods and Applications,
1990, herausgegeben von Innis, Gelfand, Sninsky und White, Academic
Press Inc.). Außerdem
sind die bei den verschiedenen nachfolgend beschriebenen Konstruktionen
eingesetzten Fragmente des adenoviralen Genoms präzise gemäß ihrer
Position in der Nukleotidsequenz des Genoms von Ad5, wie sie in
der Datenbank Genebank unter der Referenz M73260 offenbart wird,
angegeben.
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Was
die Zellbiologie angeht, werden die Zellen gemäß den Standardtechniken, die
den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, transfiziert
oder transduziert und kultiviert. In den folgenden Beispielen greift man
auf die Zelllinien 293 (Graham et al., 1977, a.a.o.; verfügbar bei
der ATCC unter der Referenz CRL1573), LCA-1 (entsprechend dem Klon
5606#5-38, beschrieben in Beispiel 3 der Anmeldung WO 94/04119),
A549 von Epithel-Ursprung, welche sich von einem Lungenkarzinom
ableitet, (ATCC CCL-185) und A549-E1 (Beispiel 6 von WO 94/28156)
zurück.
Es versteht sich, dass andere Zelllinien eingesetzt werden können. Es
wird angegeben, dass die Linie A549-E1 eine Komplementationslinie
der adenoviralen Funktion E1 ist, die erhalten wurde durch Transfektion
mit einem Plasmid, welches die E1-Sequenzen von Ad5 (nt 505 bis
4034), welche ausgehend von dem PGK-Promotor exprimiert werden,
enthält.
Die stabilen, mittels Puromycin selektierten Klone werden auf ihre
Komplementationsfähigkeit
getestet und man wählt
den besten Produzentenklon (#73) aus.
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BEISPIEL 1: Konstruktion
des adenoviralen Vektors AdTG6215, welcher das Gen von humanem Interleukin
2 exprimiert.
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Man
isoliert aus dem Plasmid pCI (Promega) das BglII-BamHI-Fragment,
welches den CMV-Promotor, die Spleißsequenz, eine Mehrfachklonierungsstelle
(MCS) und die polyA-Sequenz des SV40-Virus enthält, welches in ein herkömmliches
Plasmid inseriert wird. Die cDNA-Sequenzen, die humanes IL-2 kodieren
(Taniguchi et al., 1983, Nature 302, 305-311) werden in Form eines XhoI-EcoRI-Fragments
(gegebenenfalls durch PCR) isoliert und auf der Höhe der MCS
eingeführt.
Die Kassette wird an die Stelle der adenoviralen E1-Region in einen
adenoviralen Transfervektor kloniert, wodurch pTG6601 erhalten wird.
Der Transfervektor umfasst die nt 1 bis 458 und 3329 bis 6241 von
Ad5 in einem ppolyII-Plasmid.
Man erzeugt pTG6215 durch homologe Rekombination zwischen dem PacI-BstEII-Fragment,
welches aus pTG6601 isoliert wird, und dem durch ClaI linearisierten
Vektor pTG8595 (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810).
Der adenovirale Vektor pTG6215 enthält das Ad5-Genom, welchem die
Regionen E1 (nt 459 bis 3327), E3 (nt 28592 bis 30470) und E4 (nt
32994 bis 34998) fehlen, und die Kassette „CMV-Promotor-pCI- Spleißsequenz-IL-2-cDNA
und SV40-pA", welche
an der Stelle der adenoviralen E1-Sequenzen inseriert ist.
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Als
Referenzsystem erzeugt man den Vektor pTG6692, indem man die Spleißsequenzen
des aus pCI isolierten Expressionsblocks durch PstI-Verdau und Religation
deletiert. Die Klonierung der IL-2-cDNA und die Insertion der Kassette „ohne Intron" mitten in das adenovirale
Genom erfolgen, wie oben angegeben.
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Schließlich ist
es nützlich,
die Wirkung der Spleißsequenzen
im Kontext eines adenoviralen Vektors der ersten Generation zu vergleichen.
Dafür wird
der Vektor pTG6624 durch homologe Rekombination zwischen dem aus
pTG6601 isolierten PacI-BstEII-Fragment und dem durch ClaI linearisierten
Vektor pTG4656 konstruiert. Dieser Letztere ist äquivalent zu pTG8595 mit dem
Unterschied, dass er eine integrierte E4-Region trägt derart, dass das endgültige Konstrukt
pTG6624 dem Ad5-Genom
entspricht, in welchem die Regionen E1 (nt 459 bis 3328) und E3
(nt 28592 bis 30470) deletiert sind, wobei die Kassette „CMV-Promotor-pCI-Spleißsequenz-IL-2-cDNA
und SV40-pA" an
der Stelle von E1 inseriert ist. Der Vektor „ohne Intron" der ersten Generation,
welcher als pTG6229 bezeichnet wird, resultiert aus der Deletion
der Spleißsequenzen durch
PstI-Verdau und der Klonierung der Kassette ohne Intron in das adenovirale
Genom durch homologe Rekombination mit dem Vektor pTG4656.
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Die
Adenoviren AdTG6215 und AdTG6692 werden durch Transfektion von LCA-1-Zellen
mit dem aus den entsprechenden Vektoren isolierten PacI-Fragment durch die
Calciumphosphat-Technik erhalten. Die Virionen der ersten Generation
AdTG6624 und AdTG6229 werden in der Linie 293 produziert. Die Viren
werden unter den üblichen
Bedingungen isoliert, vermehrt und gereinigt.
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Die
humanen A549-Zellen werden in Kultur genommen, dann bei Konfluenz
durch die vorangegangenen Virionen infiziert, indem eine Infektionsmultiplizität von ungefähr 100 berücksichtigt
wird. Die in die Kulturüberstände 48 h
nach der Infektion sekretierten Mengen von IL-2 werden durch ELISA
(Kit Quantikine hIL-2, R&D
System, Minneapolis) bestimmt. Im Kontext eines adenoviralen Vektors
der zweiten Generation (E1–, E3– und
E4–)
wird IL-2 in 100- bis 150-fach höheren
Mengen produziert, wenn die Virionen eine Expressionskassette tragen,
die mit einem Intron ausgestattet ist (AdTG6215), als wenn ihnen
dieses fehlt (AdTG6692). Diese Letzteren synthetisieren sehr geringe
IL-2-Spiegel, die es nicht erlauben, deren therapeutische Verwendung in
Betracht zu ziehen. Im Vergleich dazu beträgt der Amplifizierungsfaktor
im Kontext eines Virus der ersten Generation (E1–,
E3–)
2,5.
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BEISPIEL 2: Konstruktion
des adenoviralen Vektors AdTG9378, welcher das den Faktor IX aus
dem Hund kodierende Gen exprimiert.
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Zunächst stellt
man die rekombinante Kassette, die aus dem RSV-Promotor, der Spleißsequenz des zweiten Introns
des β-Globin-Gens
des Kaninchens, welche 5' von
der cDNA von FIX aus dem Hund platziert ist, gefolgt von der polyA-Sequenz
des β-Globin-Gens
des Kaninchens, besteht, wieder her. Die β-Globin-Spleiß- und polyA-Sequenzen
werden aus dem Vektor pBCMGNeo (Karasuyama et al., 1989, a.a.O.) durch
SalI-BamHI-Verdau
ausgeschnitten und strangabwärts
des RSV-Promotors, der sich auf dem aus dem Vektor pREP4 (Invitrogen
V004-50) isolierten SalI-BamHI-Fragment befindet, kloniert. Dann
inseriert man strangabwärts
der Spleißsequenzen
die cDNA, die den FIX aus dem Hund kodiert, dessen Sequenz in Evans et
al. (1989, Blood 74, 207-212) beschrieben wird. Die Transkriptionseinheit
wird in einen Transfervektor platziert, der die Ad5-Sequenzen 1
bis 458 und 3328 bis 5778 enthält,
wodurch pTG9350 erhalten wird. Der adenovirale Vektor pTG9378 wird
durch homologe Rekombination zwischen dem aus pTG9350 isolierten
PacI-BglI-Fragment
und dem durch ClaI linearisierten Vektor pTG8595 (Chartier et al.,
1996, a.a.O.) erhalten. Er enthält
das Ad5-Genom, welchem die Regionen E1 (nt 459 bis 3327), E3 (nt
28592 bis 30470) und E4 (nt 32994 bis 34998) fehlen, und die oben
angegebene FIX-Kassette, die an Stelle von E1 inseriert ist.
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Wie
zuvor konstruiert man ein Vergleichskonstrukt, welches als pTG5666
bezeichnet wird, bei dem das adenovirale Gerüst einem Vektor der zweiten
Generation entspricht, in welchem aber der FIX-Kassette Spleißsequenzen
aufgrund eines PstI-Verdaus fehlen.
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Ebenso
konstruiert man zwei Vektoren der ersten Generation pTG9370 und
pTG9383, welche sich jeweils durch die Anwesenheit oder fehlende
Anwesenheit des β-Globin-Introns
2 in der FIX-Kassette unterscheiden. Der Erste wird durch homologe
Rekombination zwischen dem aus pTG9350 isolierten PacI-BglI-Fragment
und dem durch ClaI linearisierten Vektor pTG4656, bei dem die Regionen
E1 (nt 459 bis 3327) und E3 (28592 bis 30470) deletiert sind, erhalten.
Der Zweite resultiert aus der Rekombination zwischen dem PacI-BglI-Fragment,
welches kein Intron aufweist, und pTG4656.
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Die
Viruspartikel werden durch Transfektion der Linien 293 (AdTG9370
und AdTG9383) oder LCA1 (AdTG9378 und AdTG5666) mit den PacI-Fragmenten
der vorangegangenen Plasmide erzeugt. Die Viren werden unter den üblichen
Bedingungen isoliert, vermehrt und gereinigt. Die A549-Zielzellen
werden in Kultur genommen, dann werden sie, sobald sie Konfluenz
erreicht haben, durch die vorangegangenen Virionen infiziert, wobei
eine Infektionsmultiplizität
von ungefähr
100 berücksichtigt
wird. Die in die Kulturüberstände, die 48
h nach der Infektion gewonnen werden, sekretierten Mengen von FIX
aus dem Hund werden durch ELISA bestimmt (siehe beispielsweise Axelrod
et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5173-5177; Roman et
al., 1992, Somat. Cell Mol. Genet. 18, 247-258; Miyanohara et al.,
1992, New Biol. 4, 238-246; Lozier et al., 1994, JAMA 271, 47-51).
Ein besonders geeigneter Test setzt als Capture- oder Einfang-Antikörper den
monoklonalen Antikörper
FXCOO8 (Bajaj et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 11574-11580) in
einer Menge von 200 ng pro Vertiefung und als Detektionsantikörper einen
für humanes
FIX spezifischen Kaninchen-Antikörper
(STAGO), der an Peroxidase gekoppelt ist, ein. Die Sekretion von
FIX aus dem Hund in den durch die Viren der zweiten Generation infizierten
A549-Zellen ist 20-fach
höher,
wenn die Kassette Spleißsequenzen
umfasst (AdTG9378), als wenn ihr diese fehlt (AdTG5666). Wenn die
Transduktion Vektoren der ersten Generation einsetzt, ist die günstige Wirkung
des Introns weniger ausgeprägt
(Verstärkungsfaktor
ungefähr
2,5).
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Das
Ersetzen der cDNA von FIX durch jene, welche humanes IL-2 kodiert,
führt zu
dem Vektor pTG6214. Er ist äquivalent
zu AdTG9378 mit dem Unterschied des Gens von Interesse.
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BEISPIEL 3: Wirkung des
Introns auf die Virusproduktion.
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Ungefähr 107 A549-E1 #73-Zellen werden in F25-Behältern in
Kultur genommen und werden mit einer MOI von 1 mit den Viren AdTG6624
(ΔE1ΔE3 + Intron)
oder AdTG6229 (ΔE1ΔE3 -Intron)
infiziert. Die Infektion erfolgt für 30 min bei 37°C in DMEM-Medium
(Dulbecco's modified
Eagle's medium),
welchem 2% Serum hinzugefügt
worden sind. Die Kulturen werden zu den Zeitpunkten 24 h, 48 h,
72 h und 96 h geerntet und die Virionen aus den Zellen durch Thermoschocks
freigesetzt. Der Virustiter wird durch Immunfluoreszenz des Proteins
DBP mit Hilfe eines spezifischen monoklonalen Antikörpers ausgewertet
(Reich et al., 1983, Virology 128, 480-484). Der Verstärkungsfaktor
wird durch das Verhältnis
der Anzahl von am Ende vorliegenden infektiösen Einheiten (i.E.) zu den
am Anfang vorliegenden bestimmt. Man beobachtet mit den beiden Typen
von Konstrukten einen Verstärkungsfaktor
in der Größenordnung
von 1900, 4100 bzw. 3300 zu den Zeitpunkten 98, 72 und 96 h nach
der Infektion. Wenn das gleiche Experiment in Behältern von
175 (MOI = 3 und geerntet 3 Tage nach der Infektion) ausgeführt wird,
ist die Produktionsausbeute (i.E./Zelle) deutlich höher (um
ungefähr
25%) bei den AdTG6624-Viren,
die eine Expressionskassette umfassen, die mit einem Intron ausgestattet
ist. In ihrer Gesamtheit zeigen diese Ergebnisse, dass das Vorhandensein
des synthetischen Introns von pCI keine negative Wirkung auf die
Ausbeuten der Virusproduktion hat
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BEISPIEL 4: Funktionalität der Vektoren
in vitro und in vivo.
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Verschiedene
Zelltypen wie auch -linien, die ausgehend von verschiedenen Herkünften [human,
Affe oder Maus: A549, Vero und W162 (Weinberg und Ketner, 1983,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5384-5386)] etabliert worden sind,
wie auch primäre
Zellen aus der Maus (Fibroblasten), aus dem Hund (Myoblasten) und vor
allem von menschlicher Herkunft [primäre Tumore, die von einem Magenkrebs
(Passage 5) und von einer Lebermetastase eines Colonkrebses (Passage
2) stammen] werden auf Standard-Weise mit einer MOI von 50 bis 100
transduziert. Die eingesetzten Viren sind die Folgenden: AdTG6624
(ΔE1ΔE3 pCMV+Intron), AdTG6229
(ΔE1ΔE3 pCMV-Intron), AdTG6215
(ΔE1ΔE3ΔE4 pCMV+Intron)
oder AdTG6692 (ΔE1ΔE3ΔE4 pCMV-Intron),
AdTG6214 (ΔE1ΔE3ΔE4 pRSV+Intron)
und seine Kontrolle (ΔE1ΔE3ΔE4 pRSV-Intron).
Die Überstände werden
24 und 72 h nach der Infektion geerntet und die sekretierten Mengen
von IL-2 werden durch ELISA bestimmt, wie zuvor.
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Die
quantitativen Bestimmungen zeigen die günstige Wirkung des Introns
in Hinblick auf die Produktion von IL-2, da diese 2- bis 3-fach
höher ist
im Kontext eines Vektors der ersten Generation und mehr als 100-fach höher ist
in einem ΔE1ΔE3ΔE4-Kontext.
Man stellt fest, dass die AdTG6624-Virionen hinsichtlich IL-2 die
produktivsten sind, was den Vorteil zeigt, den CMV-Promotor und
das synthetische Intron in einem Gerüst eines Vektors der ersten
Generation zu kombinieren.
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Die
Antitumor-Aktivität
der IL-2 exprimierenden Virionen wird in vivo in einem Mäuse-Tumor-Modell ausgewertet.
Weibliche immundefiziente B6D2-Mäuse
im Alter von 6 bis 8 Wochen werden durch Verabreichung von 3 × 105 P815-Tumorzellen krebskrank gemacht. Sind
die Tumore einmal tastbar (3 bis 4 mm Durchmesser) inokuliert man
mit 5 × 108 infektiösen
Partikeln von AdTG6624 auf intratumoralem Wege am Tag 0, Tag 1 und
Tag 2 und man verfolgt das Überleben
der Tiere mit der Zeit. Der Prozentsatz des Überlebens der mit den AdTG6624-Viren
behandelten Tiere erreicht 40% mehr als 40 Tage nach der Infektion.
Im Vergleich dazu weisen die mit einem Kontrollvirus, welches eine
Expressionskassette von IL-2 ohne Intron unter der Kontrolle des
MLP-Promotors enthält,
behandelten Tiere einen viel geringeren Überlebensgrad auf.
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