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TECHNISCHES
GEBIET
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Diese
Erfindung betrifft Materialien, Verfahren und deren Anwendungen
in Bezug auf die Multimerisierung von Vermittlerproteinen biologischer
Ereignisse unter Verwendung synthetischer, vorzugsweise nicht aus Peptiden
bestehender, dimerisierender Mittel.
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HINTERGRUND
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Auf
die Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen,
die an der Vermittlung unterschiedlicher biologischer Ereignisse
beteiligt sind, hat sich beträchtlicher
Forschungsaufwand gerichtet. Eine steigende Zahl von Forschungsgruppen
in akademischen und industriellen Laboratorien konzentrierte ihre
Arbeit auf die Hemmung bestimmter Protein-Protein-Interaktionen,
von denen angenommen wird, dass sie Krankheitsprozesse vermitteln.
Andere Forschung konzentrierte sich teilweise auf die Dimerisierung
chimärer Rezeptoren.
Aspekte dieser Arbeit sind in Spencer et al., 12. November 1993,
Science 262: 1019–1024
und in WO 94/18317 und WO 95/02684 offenbart.
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Der
Erfindungsgegenstand weicht in mehreren Beziehung von den vorangehenden
Arbeiten ab. Er umfasst die Förderung
von Interaktionen zwischen endogenen Proteinen, die ein gewünschtes
biologisches Ereignis vermitteln. Mit „endogenen" Proteinen, wie der Begriff hierin verwendet
wird, beziehen wir uns auf Proteine, die auf oder in einer Zelle
oder auf oder in darin eindringenden Organismen vorkommen – im Gegensatz zu „chimären" Proteinen, die aus
der Expression einer rekombinanten DNA-Sequenz resultieren.
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BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffs
bereit, der ein biologisches Ereignis in einer Zelle auslösen kann,
wobei das Ereignis durch die Assoziierung von zwei oder mehreren
Vermittlerproteinen vermittelt wird (oder werden kann), von denen
mindestens eines und in der Regel beide endogen sind. Das Verfahren
beinhaltet die Schritte des Identifizierens einer ersten Verbindung,
die an eines der Vermittlerproteine binden kann, und eine zweite
Verbindung, die an das andere Vermittlerprotein binden kann. Die
beiden Verbindungen werden dann kovalent miteinander verbunden,
um einen chemischer Dimerisierungsauslöser (CID) zu bilden, der, wie
in 1 schematisch dargestellt, an beide Vermittler
binden kann. Es sind Testverfahren bereit gestellt, um die monomeren
Bindungsverbindungen zu identifizieren und die daraus hergestellten
CIDs zu evaluieren und zu optimieren.
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In
Ausführungsformen,
in denen das biologische Ereignis von Interesse durch Assoziierung
von zwei oder mehreren Kopien derselben Vermittlerart vermittelt
wird, z. B. von einem Rezeptor für
ein Cytokin, einen Wachstumsfaktor oder ein anderes Hormon, kann
es sich bei der ersten und zweiten Verbindung um die gleiche Verbindung
handeln. In solchen Fällen
ist der CID typischerweise ein Homodimer dieser Verbindung. Beispiele
solcher Vermittler umfassen Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise
das Protein STAT-91 und Rezeptoren für Polypeptidwachstumsfaktoren
und Hormone wie die in Tabelle I veranschaulichten: Tabelle
I
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Polypeptid-Wachstumsfaktoren,
Cytokine und Hormone wie Insulin, Erythropoietin (EPO), Wachstumshormon
(GH) und Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) aktivieren
intrazelluläre
Prozesse nach Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren (Ullrich, A.
und Schlesinger, J., „Signal
transduction by receptors with tyrosine kinase activity", Cell, 61: 203–212 (1990);
Kishimoto, T., Taga, T. und Akira, S., „Cytokine signal transduction", Cell, 76: 253–262 (1994)).
Diese Rezeptoren sind aus drei Domänen zusammengesetzt: einer
extrazellulären
Ligandenbindungsdomäne,
einer Transmembrandomäne
und einer intrazellulären
Signaltransductionsdomäne.
Bei manchen Rezeptoren, wie die für GH und EPO, befinden sich
die Ligandenbindungsdomäne
und die Signaltransductionsdomäne
auf demselben Polypeptid. Andere, wie die Rezeptoren für IL-3 und
IL-6, haben separate Ligandenbindungs- und Signaltransductionsuntereinheiten.
Man weiß inzwischen,
dass Signaltransduction durch Cytokine und Wachstumsfaktoren durch
ligandenvermittelte Rezeptordimerisierung erreicht wird (Heldin,
C. H., „Dime rization
of cell surface receptors in signal transduction", Cell, 80: 213–223 (1995); Lemmon, M. A.
und Schlessinger, J., „Regulation
of signal transduction and signal diversity by receptor oligomerization", Trends Biol. Sci.,
19: 459–463
(1994)). EGF bindet beispielsweise an zwei Rezeptoruntereinheiten,
was zur Dimerisierung der zytoplasmatischen Tyrosinkinasedomänen führt. Die Assoziierung
intrazellulärer
Domänen
stimuliert die Tyrosinkinaseaktivität und löst eine Kaskade intrazellulärer Prozesse
aus. Kürzlich
durchgeführte
Arbeit über
Cytokinrezeptoren hat gezeigt, dass auch deren Signaltransduction
durch Rezeptordimerisierung vermittelt wird (Murakami, M. et al., „IL-6 induced
homodimerization of gp130 and associated activation of a tyrosine
kinase", Science,
260: 1808–1810
(1993)).
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Im
Gegensatz zu G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, bei denen präzise ligandeninduzierte
Konformationsänderungen
zur Auslösung
von Signaltransductionsereignissen erforderlich sind, erfordern
Rezeptoren, die durch Dimerisierung aktiviert werden, nur eine ungenaue
Aggregation ihrer zytoplasmatischen Domänen. Beispielsweise wurden
Zellen, die eine EPO-Rezeptorvariante
exprimieren, welche ein zusätzliches
extrazelluläres
Cystein enthält,
durch die Bildung von Disulfid-verknüpften Rezeptordomänen in Abwesenheit
von EPO konstitutiv aktiviert (Watowich, et al., „Homodimerization
and constitutive activation of the erythropoietin receptor", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 89: 2140–2144
(1992)). In anderen Studien dimerisierten bivalente Antikörper gegen
den Wachstumshormonrezeptor die Rezeptoruntereinheiten und aktivierten
GH-vermittelte Zellproliferation (Fuh, G., et al., „Rational
design of potent antagonists to the human growth hormone receptor", Science, 256: 1677–1680 (1992)).
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In
Ausführungsformen,
bei denen das biologische Ereignis von Interesse durch Assoziierung
von zwei oder mehreren unterschiedlichen Vermittlerproteinen vermittelt
wird, sind die erste und zweite Bestandteilsverbindung eines CID
in der Regel zwei verschiedene Verbindungen. Beispiele biologischer
Ereignisse, die durch Assoziierung unterschiedlicher Vermittlerproteine
vermittelt werden können,
umfassen transkriptionelle Aktivierung (vermittelt durch Assoziierung
eines Proteins, das eine DNA-bindende Domäne enthält, mit einem Protein, das
eine transkriptionsaktivierende Domäne enthält), der zielgerichtete Transport
(Targeting) eines Proteins an einen bestimmten Ort (vermittelt durch
Assoziierung des zum Ziel zu transportierenden Proteins mit einem
Zielprotein), einschließlich
das Targeting eines Proteins zum Abbau über das Proteosom, etc.
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Wenn
die Vermittler des biologischen Ereignisses von Interesse in einer
Zelle vorhanden sind, bewirkt das In-Berührungbringen solcher Zellen
mit einer Menge des CID, die wirksam ist, um die Assoziierung des Vermittlerproteins
(der Vermittlerproteine) zu bewirken, das Auftreten des biologischen
Ereignisses von Interesse, z. B. Gentranskription, Proteinlokalisierung,
RezeptorSignaltransduction, etc. Das In-Berührung-bringen der Zellen mit
dem dimerisierenden Mittel wird erreicht, indem der CID dem Kulturmedium
hinzugefügt
wird, in dem die Zellen wachsen, oder, falls sich die Zellen in
einem Organismus befinden oder befinden könnten, indem der CID dem Organismus
verabreicht wird. Der Organismus kann eine Pflanze oder ein Tier
sein und im letzteren Fall kann er ein Insekt, ein Säugetier
(einschließlich,
unter anderen, Nagetiere wie Mäuse
und Ratten und Primaten, einschließlich Menschen) oder ein anderes
Tier sein. Wenn der CID einem Tier oder einem Menschen verabreicht
wird, kann er in Form einer veterinärmedizinischen oder pharmazeutischen
Zusammensetzung verabreicht werden, die den CID und einen oder mehr
geeignete Verdünnungsmittel,
Trägerstoffe,
Adjuvantien und dergleichen enthält,
wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind. Solche Zusammensetzungen
können
herkömmliche
Trägerstoffe
für verschiedene
Verabreichungsarten enthalten, einschließlich für die orale und parenterale
Verabreichung. Weitere Richtlinien für solche Zusammensetzungen
und deren Verabreichung können
aus den in WO 94/18317 offenbarten Einzelheiten adaptiert werden
(siehe insbesondere S. 46–48).
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VERMITTLERSTOFFE & BIOLOGISCHE EREIGNISSE
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Zelluläre Prozesse,
die durch Oligomerisierung ausgelöst werden können, enthalten eine Änderung
eines Zustands wie beispielsweise eines physiologischen Zustands,
z. B. eine Konformationsänderung,
eine Änderung
des Bindungspartners, Zelltod, Transkriptionsbeginn, Kanalöffnung,
Ionenfreisetzung, z. B. Ca2+ etc., oder
eines chemischen Zustands wie beispielsweise eine chemische Reaktion,
z. B. Acylierung, Methylierung, Hydrolyse, Phosphorylierung oder
Dephosphorylierung, Veränderung
des Redoxzustands, Umordnung oder dergleichen. Alle solche Prozesse,
die durch Assoziation oder Oligomerisierung endogener zellulärer Bestandteile
ausgelöst
werden können,
sind im Schutzumfang der Erfindung enthalten, einschließlich beispielsweise Signaltransduction,
die ausgelöst
wird durch die Assoziierung von Vermittlerstoffen wie Wachstumsfaktorrezeptoren
und das „Weiterleiten" eines endogenen
Bestandteils zu der zellulären
Umgebung oder in die Hände eines
anderen endogenen Bestandteiles, wobei ein dimerisierendes Mittel
verwendet wird, das an beide Bestandteile bindet.
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VERBINDUNGEN, DIE AN VERMITTLERSTOFFE
BINDEN KÖNNEN:
KENNZEICHEN & VERFAHREN
ZU DEREN GEWINNUNG
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Viele
Verbindungen, die in der Lage sind, an verschiedene Vermittlerproteine
biologischer Ereignisse zu binden, sind bereits bekannt. Beispielsweise
sind viele Benzodiazepine, Prostaglandine, Beta-Turn-Mimetika, Alpha-
und Betablocker, FK506 (und verwandte Verbindungen wie beispielsweise
Rapamycin und deren Analoga), Steroide, Retinoide, Topoisomeraseinhibitoren
und andere Liganden, die an ihre entsprechenden Rezeptoren oder
Bindungspartner binden, bekannt. Andere Verbindungen, die an solche
Rezeptoren oder an andere endogene Bestandteile binden können, können anhand
verschiedener Ansätze
leicht identifiziert werden, einschließlich durch Phagen-Display
und andere biologische Ansätze
zur Identifizierung von Peptidylbindungsverbindungen; synthetische
Diversität
oder kombinatorische Ansätze
(siehe z. B. Gordon et al., 1994, J. Med. Chem 37(9): 1233–1251 und
37(10): 1385–1401,
und DeWitt et al, 1993, PNAS USA 90: 6909–6913) und konventionelle Screeningprogramme
oder synthetische Programme. Im Gegensatz zu Programmen zum Entwurf
oder zur Testung auf biologisch aktive Verbindungen wie beispielsweise
Enzyminhibitoren oder Rezeptoragonisten oder -antagonisten können Bindungsverbindungen
zur Verwendung im Gegenstand der Erfindung an die Vermittlerstoffe
in einer präzisen
Art und Weise binden, die erforderlich ist, um zu hemmen, als Agonist oder
als Antagonist zu wirken, müssen
aber keine solche Wirkung haben – sie müssen nur an den Vermittlerstoff
binden. Verbindungen, die in der Lage sind, an das Protein von Interesse
zu binden, können
durch verschiedene Verfahren der Afffinitätsreinigung oder durch direkte
oder kompetitive Bindungsassays identifiziert werden, einschließlich Assays,
welche die Bindung des Proteins an Verbindungen umfassen, die auf
festen Trägerstoffen
wie Nadeln, Kügelchen,
Chips, etc. immobilisiert sind. Siehe z. B. Gordon et al., supra.
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Ein
bekannter Ligand für
einen Rezeptor kann beispielsweise wie folgt verwendet werden, um
Verbindungen zu identifizieren, welche an den Rezeptor des Liganden
binden, der in den CIDs dieser Erfindung verwendet werden könnte. Allgemein
ausgedrückt,
verwendet das Verfahren dieser Ausführungsform: (1) ein Peptid,
das eine Ligandenbindungsdomäne
eines Rezeptors von Interesse aufweist (welcher ein intakter Rezeptor,
dessen Ligandenbindungsdomäne
oder ein Fusionsprotein sein kann, das die Ligandenbindungsdomäne des mit
einer heterologen Proteinsequenz fusionierten Rezeptor bindet, in
der folgenden Diskussion insgesamt bezeichnet als „Rezeptor"), (2) einen Liganden
für den
Rezeptor, der in der Lage ist, selektiv an den Rezeptor zu binden,
um einen Ligand-Rezeptor-Komplex
zu bilden, und (3) eine Verbindung (die „Testsubstanz"), die hinsichtlich
ihrer Fähigkeit
zur kompetitiven Bindung an den Rezeptor untersucht werden soll.
Das Verfahren wird durchgeführt,
indem die oben genannten drei Bestandteile oder Zusammensetzungen,
die diese umfassen, kombiniert werden, die resultierende Testmischung
unter Bedingungen inkubiert wird, welche die Bildung eines Ligand- Rezeptor-Komplexes
erlauben, und Messen der Fähigkeit
der Testsubstanz, mit dem Liganden um die Bindung an den Rezeptor
zu konkurrieren oder anderweitig die Bildung des Ligand-Rezeptor-Komplexes
zu blockieren oder die beobachtete Menge an Ligand-Rezeptor-Komplex
zu reduzieren. Dieses Verfahren ist ein wirksames und allgemeines
Verfahren und sollte sich auf jedes Rezeptor-Liganden-Paar anwenden
und auf verschiedene Konfigurationen einstellen lassen, einschließlich sowohl
auf Formate in vivo als auch in vitro. Je nach Konfiguration des
spezifischen Assays kann es wichtig sein, bekannte Konzentrationen von
Rezeptor, Ligand und/oder Testsubstanz zu kennen. Für Vergleichszwecke
kann der Assay auch in Abwesenheit der Testsubstanz oder in Gegenwart
verschiedener Konzentrationen der Testsubstanz durchgeführt werden.
Der Messschritt könnte
durchgeführt
werden, indem auf Vorhandensein des Rezeptor-Liganden-Komplexes,
von nicht-komplexiertem
Rezeptor und/oder nicht-/komplexierter Testsubstanz getestet wird
oder indem das Auftreten eines Ereignisses, das durch das Vorhandensein
oder die Bildung des Rezeptor-Liganden-Komplexes oder einen Rezeptor-Testsubstanz-Komplex vermittelt
wird, gemessen wird. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform
ein Ligand für
einen Rezeptor immobilisiert und mit einem markierten Rezeptor oder
einem markierten Peptid, welche die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors
enthalten, in Gegenwart und Abwesenheit einer Testsubstanz oder
von Zusammensetzungen, welche eine Testsubstanz enthalten, unter
Bedingungen inkubiert, welche eine Rezeptor-Liganden-Bindung erlauben.
Das Vorhandensein einer Testsubstanz, die mit einem Liganden um
die Rezeptorbindung konkurriert, korreliert mit einer Abnahme des
markierten Rezeptors (oder der markierten Domäne), der an den immobilisierten
Liganden gebunden ist, oder mit einer Erhöhung des ungebundenen markierten
Rezeptors (oder der markierten Domäne). Aus dem Stand der Technik
sind verschiedene, für
solche Zwecke geeignete Marker bekannt und können ausgehend von Faktoren wie
Kosten, Verfügbarkeit,
Nutzen und Vertrautheit von Seiten des Durchführenden ausgewählt werden.
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Die
Testsubstanz kann in einer Lösung
vorhanden sein, die als eine Testlösung bezeichnet wird. Alternativ
kann die Testsubstanz vor allem bei in-vitro-Assays in einer Testmischung
vorhanden sein, welche eine Emulsion, Suspension oder eine andere
Mischung umfasst, auf der Oberfläche
einer Zelle, eines Virus, eines Phagen, etc. frei liegend sein oder
auf einem festen Trägerstoff
immobilisiert sein.
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In
einem in-vitro-Format wird ein Bindungsassay durchgeführt, um
eine Verbindung zu identifizieren, die an den Rezeptor in Gegenwart
eines Liganden für
diesen Rezeptor binden kann oder ansonsten in der Lage ist, die
Bildung eines Rezeptor-Liganden-Komplexes
zu blockieren oder dessen beobachtete Menge zu reduzieren. In einer
Ausführungsform
ist der Bindungsassay ein kompetitiver Bindungsassay, bei dem drei
Bestandteile kombiniert und unter Bedingungen inkubiert werden,
welche die Bildung eines Rezeptor-Liganden-Komplexes erlauben. Es
wird die Fähigkeit
der Testsubstanz bestimmt, an den ausgewählten Rezeptor zu binden oder
die rezeptorvermittelte Interaktion in Gegenwart des Rezeptorliganden
anderweitig zu blockieren.
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Bindung
an den Rezeptor oder anderweitiges Blockieren der rezeptorvermittelten
Interaktion kann direkt oder indirekt gemessen werden (z. B. BIAcore® und
andere SPR-Technologien (BIAtechnology Handbook, Pharmacia Biosensor
AB, Uppsala, Schweden, 1994), Fluoreszenz-Anisotropie und verwandte
Technologien (Luminescent Spectroscopy of Proteins, S. 164 und folgende,
E. A. Permyakov, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1992), Durchflusszytometrie
und verwandte Technologien (Flow Cytometry and Cell Sorting, S.
223 und folgende, A. Radbruch, Hrsg., Springer-Verlag, New York,
NY, 1992), ELISA, RIA und verwandte Verfahren (An Introduction to
Radioimmunoassays and Related Techniques, S. 290 und folgende, T.
Chard, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande, 1990),
kompetitive und nicht-kompetitive Affinitätsinteraktionen (Immobilized
Affinity Ligand Techniques, S. 454 und folgende, G. T. Hermanson,
A. K. Mallia und P. K. Smith, Hrsg., Academic Press, Inc., Dan Diego,
CA; 1992).
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In
kompetitiven Bindungsassays ist die Testsubstanz ein rezeptorbindendes
Mittel, wenn die Bindung des Rezeptors und seines Liganden in Gegenwart
der Testsubstanz in geringerem Maß stattfindet als in ihrer Abwesenheit,
beispielsweise, wenn das Vorhandensein der Testsubstanz die Konzentration
des Rezeptor-Liganden-Komplexes verringert oder die Konzentration
nicht-komplexierten Rezeptors oder Liganden (d. h. aneinander) erhöht. Wenn
die Struktur des derart identifizierten Bindungsmittels noch nicht
bekannt ist, kann die Verbindung anschließend aus den anderen Assaybestandteilen
isoliert und charakterisiert werden. Falls gewünscht, kann sie unter Verwendung ähnlicher
Bindungsassays mit unterschiedlichen Rezeptor-Liganden-Paaren nochmals überprüft werden,
um die Selektivität
der Interaktion mit dem Rezeptor, mit dem sie identifiziert worden
ist, zu bestätigen.
Falls gewünscht,
kann die Bindung des Bindungsmittels an den Rezeptor, mit dem es
identifiziert worden ist, biochemisch charakterisiert werden, d.
h. durch Anwendung von BIAcore®-Technologie, die unten
ausführlicher
beschrieben ist. Das so identifizierte Bindungsmittel kann wie unten beschrieben
in einem in-vivo-Assay
getestet werden, und kann, falls gewünscht, in Monomer- und/oder CID-Form
in verschiedenen in-vitro- und/oder in-vivo-Assays auf pharmakologische Aktivität untersucht
werden.
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In-vivo-Assays
lassen sich in analoger Art und Weise durchführen, wobei Zellen verwendet
werden, welche die Ligandenbindungsdomäne von Interesse und einen
Liganden dafür
enthalten. Die Zellen werden in einem für Zellwachstum geeigneten Medium
kultiviert oder gehalten. Die Testsubstanz wird zu den Zellen gegeben,
d. h. zu dem Medium, in dem die Zellen kultiviert werden, und die
Kultur wird unter Bedingungen inkubiert, welche die Bildung eines
Komplexes zwischen dem Rezeptor und seinem Liganden erlauben. Wenn eine
Bindung des Rezeptors und seines Liganden in Gegenwart der Testsubstanz
in geringerem Maß stattfindet
als in ihrer Abwesenheit, beispielsweise, wenn das Vorhandensein
der Testsubstanz die Konzentration des Rezeptor-Liganden-Komplexes
verringert oder die Konzentration des nicht-komplexierten Liganden
erhöht, handelt
es sich bei der Testsubstanz um ein Bindungsmittel. Das Vorhandensein
oder die Abwesenheit von Rezeptor-Liganden-Komplex kann direkt oder
indirekt gemessen werden (z. B. indem das Auftreten eines durch
das Vorhandensein oder die Bildung des Rezeptor-Liganden-Komplexes
oder eines Rezeptor-Testsubstanz-Komplexes vermittelten Ereignisses
gemessen wird).
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Ein
veranschaulichendes in-vivo-Format beruht auf gentechnisch veränderten
Zellen, die ein Reportergen unter rezeptorvermittelter Transkriptionskontrolle
exprimieren können.
Diese Zellen enthalten rekombinante DNAs, die ein Fusionsprotein
kodiert, umfassend, neben anderen Bestandteilsregionen, mindestens eine
Ligandenbindungsdomäne
des Rezeptors von Interesse, und können diese rekombinante DNAs
exprimieren. Die Fusionsproteine können an den Liganden des Rezeptors
binden und können
in Gegenwart des Liganden einen Komplex (Dimerisierung) miteinander
bilden, wie in 6 dargestellt ist. In Gegenwart
des Liganden, z. B. bei Haltung in ligandenhaltigem Kulturmedium,
exprimieren die Zellen das Reportergen – es sei denn, es ist eine
Substanz vorhanden, die an die Rezeptordomäne bindet oder die Assoziierung
der Fusionsproteine, die für
die Transkription des Reportergens erforderlich sind, anderweitig
blockiert. In diesem Assay werden die Zellen in einem geeigneten
Kulturmedium kultiviert oder gehalten, zu dem eine ausgewählte Menge
an Ligand gegeben wird, um eine Grundlinie für die Expression des Reportergens
zu etablieren. Anschließend
wird dem Kulturmedium die Testsubstanz zugegeben, und es wird die
Fähigkeit
der Testsubstanz gemessen, die Expression des Reportergens zu hemmen.
Wenn das Maß der
Expression des Reportergens in Gegenwart der Testsubstanz reduziert
ist, handelt es sich bei der Testsubstanz um einen Blocker, was
die chimären
Rezeptormoleküle
angeht, die an der Transkriptionskontrolle beteiligt sind. Wenn
die Struktur des so identifizierten Blockierungsmittels noch nicht
bekannt ist, kann die Verbindung anschließend von den anderen Assaykomponenten
isoliert und charakterisiert werden. Falls gewünscht, kann sie anhand von
technisch veränderten
Zellen, die ein Fusionsprotein auf der Basis eines anderen Rezeptors enthalten,
in einem ligandenhaltigen Medium nochmals geprüft werden, um die Selektivität der Interaktion
mit der Rezeptordomäne,
mit dem sie identifiziert worden ist, zu bestätigen. Falls gewünscht, kann
die Bindungsaffinität
des Blockierungsmittels für
den Rezeptor, mit dem es identifiziert worden ist, bestimmt werden,
z. B. durch Anwendung von BIAcore®-Technologie.
Das so identifizierte Blockierungsmittel kann wie oben beschrieben
in einem in-vitro-Bindungsassay getestet werden, und kann, wie gewünscht, in
Monomer- und/oder CID-Form (d. h. in dimerisierter Form) in verschiedenen
in-vitro- und/oder
in-vivo-Assays auf pharmakologische Aktivität untersucht werden.
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Durch
solche Verfahren identifizierte Bindungsmittel zur Verwendung bei
der Konstruktion von CIDs dieser Erfindung können aus Peptidbibliotheken
sowie aus Testsubstanzen aus vielen verschiedenen Quellen identifiziert
werden, einschließlich
beispielsweise aus mikrobiellen Nährbrühen, zellulären Extrakten, konditionierten
Medien von Zelllinien oder von Wirtszellen, die mit Genbibliotheken
transformiert worden sind, Sammlungen synthetischer Verbindungen,
kombinatorischen Bibliotheken oder Syntheseprogrammen auf der Basis konventioneller
Ansätze
aus der medizinischen Chemie oder durch strukturbasiertes Wirkstoffdesign.
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Diese
Erfindung stellt somit ein Mittel zum Identifizieren selektiver
Bindungs- oder Blockierungsmittel bereit. So identifizierte Verbindungen
können
anhand von Linkereinheiten kovalent verknüpft werden, z. B. durch Adaption
der in WO 94/18317 und WO 95/02864 offenbarten Ansätze, um
die CIDs dieser Erfindung zu bilden. Linkereinheiten brauchen keine
essenziellen Elemente zur Bindung an die Vermittler von Interesse
enthalten und können
aus einer sehr breit gefächerten
Reihe von Strukturtypen ausgewählt
sein. Bevorzugte Einheiten umfassen C2-C20-Alkyl, Aryl oder Dialkylarylstrukturen.
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Alkyl
soll sowohl gesättigte
als auch ungesättigte
geradkettige, verzweigte, zyklische oder polyzyklische aliphatische Kohlenwasserstoffe
enthalten, die Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff anstelle eines
oder mehrerer Kohlenstoffatome enthalten können und die wahlweise mit
einer oder mehr funktionellen Gruppen substituiert sein können, die
aus der Gruppe ausgewählt
sind, die aus Hydroxy, C1-C8-Alkoxy,
Acyloxy, Carbamoyl, Amino, N-Acylamino, Keton, Halogen, Cyano, Carboxyl
und Aryl besteht (sofern nicht anders angegeben, enthalten die Alkyl-,
Alkoxy- und Acylgruppen vorzugsweise 1–6 kontige aliphatische Kohlenstoffatome).
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Aryl
soll stabile zyklische, heterozyklische, polyzyklische und polyheterozyklische
ungesättigte C3-C14-Einheiten enthalten,
beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, Phenyl, Biphenyl, Naphthyl,
Pyridyl, Furyl, Thiophenyl, Imidazol, Pyrimidinyl und Oxazoyl, die
des Weiteren mit einem bis fünf
Elementen substituiert sein können,
die aus der Gruppe ausgewählt
sind, welche aus Hydroxy, C1-C8-Alkoxy,
verzweigtem oder geradkettigem C1-C8-Alkyl, Acyloxy, Carbamoyl, Amino, N-Acylamino, Nitro,
Halogen, Trifluormethyl, Cyano und Carboxyl besteht (siehe z. B.
Katritzky, Handbook of Heterocyclic Chemistry).
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An
die Bindungseinheiten können über funktionelle
Gruppen wie Ether, Amide, Harnstoffe, Carbamate und Ester oder über Alkyl-Alkyl-, Alkyl-Aryl-
oder Aryl-Aryl-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen praktischerweise Linkereinheiten
verknüpft
sein. Darüber
hinaus können
Linkereinheiten optimiert sein (z. B. durch Modifikation der Kettenlänge und/oder
der Substituenten), um die pharmakokinetischen Eigenschaften des
multimerisierenden Mittels zu verstärken. In Fällen, in denen die Verbindungen
identifiziert werden, während
sie immobilisiert sind, können
sie anhand der funktionellen Gruppen, durch die sie immobilisiert
sind, praktischerweise verknüpft
werden. Peptidylverbindungen können
durch Peptidbindungen verknüpft
werden, obgleich die bevorzugten Mittel dieser Erfindung keine Polypeptide
oder Oligopeptide sind. Divalente dimerisierende Mittel dieser Erfindung
behalten die Bindungsfähigkeit
im Hinblick auf beide Proteine von Interesse bei. Die kovalent verknüpften CIDs
werden daher in der Regel getestet (z. B. wie oben), um die Erhaltung
der Bindungsfähigkeit im
Hinblick auf jedes Protein von Interesse und/oder in zellbasierten
Assays wie unten beschrieben zu bestätigen.
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Wir
weisen darauf hin, dass beim Design von CIDs die Auswahl von Verbindungen,
die an die Proteine von Interesse binden, aus kombinatorischen Bibliotheken,
die auf festen Trägerstoffen
immobilisiert sind, einen nützlichen
Vorteil darstellt. Während
dies dennoch eher die Identifizierung eines neuen Liganden für das Protein
von Interesse als die Auswahl einer bereits bekannten Verbindung
umfasst, sagt der bloße
Vorgang der Entdeckung präzise,
wie man die kovalente Bindung anbringen muss, um die beiden Verbindungen
miteinander zu verknüpfen,
um den CID zu erhalten. Dies liegt daran, dass die Elemente einer
immobilisierten kombinatorischen Bibliothek bereits kovalent an
ihren Trägerstoff
gebunden sind. Deshalb kann beim Zusammensetzen des CID dieselbe
Chemie verwendet werden wie bei der Immobilisierung der einzelnen
Elemente der Bibliothek. Da die ausgewählten Elemente der Bibliothek
außerdem
nach ihrer Fähigkeit
zur Bindung an ihren jeweiligen Rezeptor (oder an andere Proteinbindungspartner)
ausgewählt
sind, darf der Linker, der das Element der Bibliothek kovalent an
den Trägerstoff
anbringt, notwendigerweise nicht mit der Bindungsinteraktion zwischen
dem Element der Bibliothek und dem Protein von Interesse interagieren.
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ASSAY FÜR FUNKTIONELLE
BEURTEILUNG VON CIDS
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Wir
stellen auch allgemeine zellbasierte Verfahren für die funktionelle Charakterisierung
von CIDs bereit. Diese Assays beruhen auf Zellen, die in Übereinstimmung
mit dem in WO 94/18317 beschriebenen System gentechnisch verändert wurden.
Die Zellen sind technisch zu konzipiert, dass sie rekombinante DNAs
enthalten und exprimieren können,
die chimäre
Proteine kodieren, welche nach ihrer Assoziierung oder Dimerisierung
direkt oder indirekt die Transkription eines Reportergens unter
der Transkriptionskontrolle eines Promotors, Enhancers oder eines
anderen transkriptionellen regulatorischen Elements, das auf die
Assoziierung der chimären
Proteine anspricht, aktivieren können.
Geeignete Materialien, Verfahren und Design und Konstruktionsprinzipien
für relevante
Konstrukte und deren Verwendung sind in WO 94/18317 offenbart und
müssen
zur Verwendung in der Ausübung
dieser Erfindung angepasst werden, wie durch folgendes Beispiel
veranschaulicht ist. In einer Ausführungsform sind Jurkat-Zellen
gentechnisch verändert,
um ein Reportergen wie beispielsweise sezernierte alkalische Phosphatase
(obgleich jeder in geeigneter Weise festgestellte Reporter verwendet
werden kann, einschließlich
beispielsweise Beta-Galactosidase oder Luziferase) unter der Expressionskontrolle
des NF-AT-Systems zu enthalten, für das Einzelheiten in dem oben
erwähnten
PCT-Dokument bereit gestellt sind. Die in dem PCT-Dokument offenbarten
Zellen wurden weiter technisch modifiziert, um eine rekombinante
DNA-Sequenz zu enthalten
und zu exprimieren, die ein chimäres
Protein kodiert, welches ein Myristoylierungssignal, den zytoplasmatischen
Schweif der Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptors und eine oder mehr Liganden
bindende Domänen
umfasst, die von FKBP12 abgeleitet sind. Die Zellen unseres Assays
werden analog hergestellt, exprimieren aber eines oder mehr chimäre Proteine,
die anstelle der FKBP12-Domäne einen
Teil oder Alles des Vermittlerproteins von Interesse enthalten.
Wenn eine Dimerisierung von zwei verschiedenen Vermittlerproteinen
von Interesse ist, werden die Zellen technisch verändert, um,
wie oben beschrieben, ein chimäres
Protein zu exprimieren, das einem beliebigen Vermittlerprotein von
Interesse entspricht. Das Vorhandensein eines CID, der an zwei Moleküle des chimären Proteins
(der chimären
Proteine) binden kann, induziert eine Assoziierung oder Dimerisierung
der chimären
Proteine. Solche Dimerisierung löst ein
Transkriptionsaktivierungssignal aus, das von den Transkriptionskontrollelementen
für das
Reportergen empfangen wird und sich einfach durch Messen der Expression
des Reportermoleküls
feststellen lässt,
wie schematisch in 2 dargestellt ist. Alle Einzelheiten
und allgemeine Anleitungen für
die Zusammenstellung solcher Konstrukte, die technische Veränderung
der Zellen und das Feststellen des Reportermoleküls sind in dem PCT-Dokument
bereit gestellt. Siehe z. B. 14, 15 und 18–21 und entsprechende Beispiele darin. Auch hier
wird eine Anpassung dieses Systems zur Bereitstellung von Zellen
zum Testen von CIDs dieser Erfindung einfach erreicht, indem eine
DNA-Sequenz (DNA-Sequenzen), welche die FKBP-Domänen kodiert (kodieren), durch
eine DNA-Sequenz, welche das Vermittlerprotein von Interesse kodiert
(beispielsweise die intrazelluläre oder
extrazelluläre
Domäne
des Rezeptors für
Insulin oder Erythropoietin oder eines anderen Wachstumsfaktors),
ersetzt wird, wobei darauf geachtet wird, dass sich der vollständige Kodierungsbereich
jedes resultierenden Konstruktes im Leserahmen befindet.
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Durch
Verwendung solcher technisch veränderten
Zellen kann man CIDs dieser Erfindung funktionell charakterisieren,
indem die technisch veränderten
Zellen in Zellkultur gezüchtet
und dem CID (den CIDs) von Interesse ausgesetzt werden, indem eine
Menge (in der Regel eine vorbestimmte Menge) des CIDs von Interesse
in das Kulturmedium gegeben wird, und die Menge an Reporter festgestellt
wird, die als Antwort auf den CID produziert wird. Kandidaten-CIDs,
die eine oder mehr strukturelle Variationen in ihren komponentenbindenden
Einheiten oder Verknüpfungseinheiten
enthalten, können
vergleichend beurteilt und CIDs für bestimmte Anwendungen so
optimiert werden.
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Als
ein alternativer Ansatz für
gentechnisch veränderte
Zellen für
solche Testzwecke kann man ein modifiziertes Design für die chimären „Rezeptoren" verwenden, die an
die CIDs binden und Transkription des Reportergens auslösen. Bei
diesem Ansatz enthalten die chimären
Rezeptoren eine Signaleinheit wie beispielsweise die Zeta-Kette
wie oben, eine membranumspannende Domäne und, als eine extrazelluläre Domäne, eine
oder mehr Kopien einer Domäne,
die dem Vermittlerprotein von Interesse des chimären Proteins (der chimären Proteine)
entspricht. Der Assay kann wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Bei dieser Modifikation werden die CIDs allerdings extrazellulär und nicht
intrazellulär
festgestellt, wie in 3 schematisch dargestellt ist.
Dieser Ansatz ist zur Beurteilung von Peptidyl- oder anderen CIDs,
welche nicht leicht in die Zelle gelangen, in der Regel bevorzugt.
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Wie
zu Anfang erwähnt,
sind viele verschiedene Rezeptor/Liganden-Paare an einer Reihe pharmakologisch
wesentlicher Ereignisse, darunter Anämie, Neutropenie, Thrombozytopenie,
Krebs, MS, Diabetes, ZNS-Krankheiten, etc. und ihrer Behandlung
beteiligt. CIDs dieser Erfindung sind entsprechend für verschiedene
klinisch wichtige Zwecke sowie für
Forschungszwecke geeignet, um die Biologie rezeptorvermittelter Phänomene zu
untersuchen.
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CIDs
dieser Erfindung können,
allgemein ausgedrückt,
verwendet werden, um das Auftreten biologischer Ereignisse zu fördern, die
das Ergebnis molekularer Interaktionen sind, die von einem Rezeptor
von Interesse vermittelt werden. Diese Erfindung stellt daher ein
Verfahren und Reagenzien zum Fördern
der Interaktion zwischen endogenen Proteinen und damit zum Fördern einer
biologischen Aktivität
bereit, die von einer solchen Interaktion vermittelt wird. In diesem
Verfahren wird ein CID dieser Erfindung mit dem Rezeptor von Interesse
kombiniert oder in Berührung
gebracht, beispielsweise, indem der CID in eine Zell eingeführt wird,
in welcher die rezeptorvermittelte Interaktion gefördert werden
soll. Nach der Einführung
des CIDs wird die gegenseitige Assoziierung oder Dimerisierung des
endogenen Proteins, an welches der CID bindet, gefördert, wie
leicht festgestellt werden kann. Das Fördern solcher Interaktionen
kann in der Forschung, die auf ein besseres Verständnis der
Biologie rezeptorvermittelter Ereignisse abzielt, nützlich sein.
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Solche
CIDs wären
beispielsweise bei der Diagnose, Prävention oder Behandlung von
Konditionen oder Krankheiten nützlich,
die durch Auftreten zellulärer
Prozesse, die durch eine rezeptorvermittelte Interaktion vermittelt
werden, geheilt werden oder deren Symptome durch Auftreten zellulärer Prozesse,
die durch eine rezeptorvermittelte Interaktion vermittelt werden,
ganz oder teilweise gelindert werden können. Beispielsweise kann ein
Patient behandelt werden, um das Auftreten oder das Fortschreiten
von Anämie,
Thrombozytopenie oder Neutropenie durch Verabreichung eines CIDs,
der eine Dimerisierung von Rezeptormolekülen für respektive EPO, TPO oder
G-CSF fördern
kann, zu verhindern oder zu lindern.
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Ein
CID dieser Erfindung kann zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung
formuliert werden, die einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff
und/oder einen anderen Exzipienten (andere Exzipienten) enthält, indem
konventionelle Materialien und Mittel verwendet werden. Eine solche
Zusammensetzung kann einem Tier, entweder menschlich oder nicht-menschlich,
zur Therapie einer Krankheit oder eines Zustands verabreicht werden,
die oder der auf die Förderung
zellulärer
Ereignisse anspricht, welche die gegenseitige Interaktion endogener
Proteinmoleküle
beinhaltet. Die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung kann
auf jedem üblichen
Weg (parenteral, oral, Inhalation und dergleichen) anhand geeigneter
Formulierungen, wie ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt,
erfolgen. Der CID kann in einer Mischung mit konventionellen Exzipienten
angewandt werden, d. h. mit pharmazeutisch annehmbaren organischen
oder anorganischen Trägersubstanzen,
die für
eine parenterale Verabreichung geeignet sind.
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Diese
Erfindung soll in ihrem Schutzumfang nicht durch die hierin beschriebenen
spezifischen veranschaulichenden Ausführungsformen beschränkt sein.
Vielmehr sind einem Fachmann durch die hierin gegebene Beschreibung
verschiedene Modifikationen der Erfindung außer den hierin beschriebenen
bekannt. Solche Modifikationen fallen in den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche. Es
sind hierin verschiedene Veröffentlichungen
zitiert, deren Offenbarungen in Gänze durch Bezugnahme enthalten
sind.
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BEISPIELE
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Beispiel 1.
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Verstärkung der
Aktivität
bekannter Arzneimittel oder neu ausgewählter Verbindungen oder Vermitteln einer
Aktivität
durch Einschluss in einen CID.
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Bei
diesem Ansatz wird ein Protein, das im Wesentlichen in nur einem
zellulären
Kompartiment, z. B. dem Zytoplasma, arbeitet, durch Bindung an einen
geeigneten CID zu einem alternativen zellulären Kompartiment umgeleitet,
in dem es keine Bioaktivität
aufweist.
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Um
einen solchen CID zu konstruieren, wird eine erste Verbindung ausgewählt, die
in der Lage ist, an das Zielprotein zu binden. Beispiele von Zielproteinen,
die beispielsweise nur im Zytoplasma und nicht im Zellkern arbeitet,
umfassen HIV-Protease
und verschiedene Signaltransductionsproteine wie beispielsweise zap70,
syk und dergleichen. Im Fall der HIV-Protease sind von einer Reihe von Gruppen
zellpermeable HIV-Protease-Hemmer
entwickelt worden und aus der Literatur bekannt. Siehe z. B. Lam
et al., 1994, Science 263 (5145): 380–4 und WO 94/08977.
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Weiter
wird eine zweite Verbindung ausgewählt, die an einen Bestandteil
des alternativen zellulären Kompartiments
bindet. Wiederum stimmt die Lokalisierung des Zielproteins in dem
alternativen Kompartiment nicht mit der biologischen Funktion des
Zielproteins überein.
Wenn das alternative Kompartiment der Zellkern ist, umfassen relevante
Bestandteile die Topoisomerasen, an welche Etoposid, Camptothecin
und verwandte Verbindungen binden. Die Synthese von Camptothecin
und Analoga davon ist bekannt, wie auch ihre Evaluierung als Hemmstoffe
von Topoisomerase I. Siehe z. B. Corey et al., 1975, J. Org. Chem.
40: 2140 (gesamte Synthese); Sugimori et al., 1994, J. Med. Chem.
37(19); 3033–9
(veranschaulichende Analoga); Prost et al., 1994, Biochem. Pharmacol.
48(5), 975–84
(Experimente mit Topo I). Alternative Ziele im Zellkern umfassen DNA,
für die
zahlreiche interkalierende Mittel bekannt sind. Alternative Ziele,
um ein Zielprotein zu den Mitochondrien zu leiten, umfassen Zytochrome,
die nur in diesem Kompartiment vorhanden sind.
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Die
ersten und zweiten Verbindungen können aus bekannten Verbindungen
ausgewählt
sein, die an die entsprechenden Proteine binden können, oder
können
aus kombinatorischen Bibliotheken wie oben erläutert ausgewählt sein.
In jedem Fall sind sie durch eine Linkereinheit wie oben erwähnt in einer
Weise kovalent verbunden, die keine der einzelnen Bindungsinteraktionen
(d. h. an die beiden Proteine) aufhebt Der resultierende CID kann
leicht beurteilt werden, um die Beibehaltung geeigneten Bindungsverhaltens
zu bestätigen.
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Zur
Veranschaulichung dieses Ansatzes haben wir einen CID auf der Basis
eines HIV-Proteaseinhibitors und eines Camptothecin-Analogs entworfen,
um an die HIV-Protease zu binden und in den Nukleus zu translokalisieren.
Die inkorrekte Kompartimentierung der Protease, die sich aus der
Translokation ergibt, zielt darauf ab, die HIV-Protease effektiv
zu inaktivieren. Solche CIDs können
wie andere HIV-Proteaseinhibitormoleküle an das
aktive Zentrum der Protease binden und deren enzymatische Aktivität hemmen.
Unabhängig
davon, ob sie dieses tun oder nicht, sind diese CIDs so konzipiert,
dass sie die Proteaseaktivität
durch Translokation zu einem inkorrekten zellulären Kompartiment aufheben.
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In
unserem veranschaulichenden Ansatz werden 5-10-Hydroxycamptothecin
(3) und andere Analoga von Camptothecin durch bekannte Verfahren
erhalten. Siehe z. B. Kingsbury et al., 1991, J. Med. Chem., 34(1), 98–107. Siehe
auch Luzzio et al., europäische
Patentanmeldung
EP 540099 .
Hydroxycamptothecin kann mit einem HIV-Proteaseinhibitor (2) verknüpft sein
(siehe Lam et al und WO 94/08977, beide supra), um den CID (1) zu
bilden,
wie oben
schematisch dargestellt ist (siehe Kingsbury et al.):
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Beispiel 2
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Der
Ansatz von Beispiel 1 lässt
sich auf andere zytoplasmatische Ziele ausdehnen, z. B. zap70, um das
Targeting eines Signaltransductionsvermittlers zu veranschaulichen.
Während
einige Gruppen aktiv nach Verbindungen suchen, die an zap70 binden
und zap70 spezifisch hemmen, würde
ein CID dieser Erfindung, der ein zap70-Bindungsmolekül enthält (sogar
eines, das Interaktionen oder die biologische Aktivität von zap70
alleine nicht hemmt), das mit einer nuklearen Zieleinheit wie beispielsweise
eine Camptothecin-Einheit oder dergleichen oder einer Proteosom-Zieleinheit
(siehe unten) verknüpft
ist, das Ziel in ein inkorrektes Kompartiment translokalisieren,
d. h. zu einem zellulären
Ort, der nicht mit seiner normalen biologischen Funktion übereinstimmt,
oder zu dem Proteosom, wo er durch Abbau aus dem System entfernt
werden kann.
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Beispiel 3
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Ein
weiteres veranschaulichendes Beispiel umfasst das Targeting eines
zellulären
Proteins oder eines Bestandteils von Viren wie beispielsweise HIV
zu proteosomalen Abbauwegen unter Verwendung von CIDs. Diese CIDs
haben als einen Bestandteil bekannte (oder ausgewählte) Moleküle, um an
virale Proteine wie beispielsweise AZT zu binden, und als einen
zweiten Bestandteil ein Molekül,
das an Proteosombestandteile bindet, wie beispielsweise LMP7, LMP2
(Martinez und Monoco, Nature 353: 664, 1991) oder andere Bestandteile, die
mindestens teilweise für
Proteosomenfunktion und Substratspezifität verantwortlich sind (Gaszynska,
M. et al., Nature 365: 264 (1993); A. Skiyama et al., FEBS-Lett.:
343: 85–88
(1994); und Shimbara et al., J. Biochem. 115: 257 (1994)). Wie in
den anderen Ausführungsformen
dieser Erfindung können
die Bindungsbestandteile aus bereits bekannten Verbindungen ausgewählt sein,
von denen bekannt ist oder angenommen wird, dass sie die gewünschten
Bindungseigenschaften besitzen, oder anhand konventioneller oder
anderer Bindungsassays aus Sammlungen von Verbindungen ausgewählt sein,
die gegen das Protein von Interesse getestet sind (beispielsweise
anhand von konventionellen Verfahren und Materialien exprimiert).
Diese CIDs sind so konzipiert, dass sie die physikalische Nähe der viralen
oder zellulären
Zielproteine an das Proteosom induzieren, was zu der schnellen Zerstörung des
zellulären
oder viralen Proteins führt.
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Moleküle, die
an das Proteosom binden, können
also durch Testung von Sammlungen von Verbindungen oder durch verschiedene,
oben beschriebene Verfahren identifiziert werden. Verbindungen können auch aus
kombinatorischen Bibliotheken oder aus der Reihe bereits bekannter
Verbindungen ausgewählt
sein, die an essenzielle HIV-Proteine binden, einschließlich an
AZT und Analoga davon und jedes der zahlreichen bekannten Moleküle, die
an die HIV-Protease binden. Eine Verbindung, die an einen Proteosombestandteil
bindet, wird dann kovalent mit einer der Verbindungen verknüpft, die
an den HIV-Zielbestandteil
binden kann.
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Die
Effizienz der CIDs beim Induzieren einer Dimerisierung kann mit
dem oben beschriebenen zellbasierten Assay getestet werden. Dieses
Verfahren ermöglicht
eine vergleichende Beurteilung von Modifikationen im Design von
CIDs, einschließlich
von Modifikationen an Bindungsmolekülen, einer Linkereinheit und speziellen
Verknüpfungen.
Nach Bestätigung
der gewünschten
Aktivität
bei der Induktion einer Dimerisierung und Aktivierung der Zeta-Ketten-Chimäre können die
CIDs hinsichtlich der beabsichtigten biologischen Aktivität getestet
werden, z. B. die Fähigkeit,
das Zielprotein aus Zellkulturen zu entfernen, indem Assays wie
Western Blotting oder andere etablierte Verfahren oder Bioassays
verwendet werden.
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Beispiel 4
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Eine
weitere veranschaulichende Modifikation umfasst das Auswählen einer
Verbindung, die an eine Proteinklasse namens E3-Enzyme binden kann
(siehe Ciechanover, 1994, Cell 79: 13–21 und darin zitierte Bezugsverweise).
Diese bewirken, dass Proteine, an welche sie binden, ubiquitiert
und damit zu einem Ziel für Proteinabbau
werden. Ein Beispiel eines Proteins, das nach diesem Prinzip funktioniert,
ist das E6-Protein des Papillomvirus. Es bindet an ein E3-Protein
namens E6Ap (E6- assoziiertes
Protein). E6 bindet auch an p53, wobei p53 in enge Nähe zu E6AP
gebracht wird, und E3-Ligase bewirkt, dass es ubiquitiert und daher
abgebaut wird.
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CIDs
dieses Aspektes der Erfindung sind so konzipiert, dass sie eine
Einheit enthalten, die wegen ihrer Fähigkeit zur Bindung an ein
E3-Enzym ausgewählt
ist und mit einer Einheit verknüpft
ist, die ausgewählt
ist, um an ein zu entfernendes zelluläres, virales oder anderes Protein
zu binden (z. B. an HIV-Protease, zap 70, etc.). Bindung des CID
an das Zielprotein soll zu einer Ubiquitierung und daher einem Abbau
des Zielproteins durch die Zelle führen.
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Beispiel 5: Kompetitiver
In-vitro-Bindungsassay für
Bindungsbestandteile zur Verwendung bei der Herstellung von CIDs
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Die
extrazelluläre
Ligandenbindungsdomäne
kann mithilfe der klonierten Rezeptor-cDNA exprimiert und gereinigt
werden. Eine Identifizierung der extrazellulären Rezeptordomäne ist möglich, indem
eine Kyte-Doolittle-Analyse der Kodierungssequenz durchgeführt wird.
Im Falle von Cytokin- und Wachstumsfaktorrezeptoren befindet sich
die extrazelluläre
Domäne
N-terminal zu der transmembran-umspannenden (TM) Domäne. Die
TM-Domäne
markiert das Ende der Ligandenbindungsdomäne und ist im Kyte-Doolittle-Profil
durch einen hohen Hydrophobizitätsindex über eine
Spanne von zwischen 20–30
Aminosäuren
gekennzeichnet. Für ein
Beispiel der Kyte-Doolittle-Analyse
des EPO-Rezeptors siehe US-Patent Nr. 5,278,065. Siehe auch US-Patent
Nr. 5,292,654 (mutanter EPO-R).
Zur Produktion der Ligandenbindungsdomäne eines Rezeptors wird die
cDNA, welche die extrazelluläre
Domäne
kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor wie beispielsweise
pET11a (Invitrogen) für
E. coli, pVL1393 (Invitrogen) für
Insektenzellen oder pcDNA (Invitrogen) für Säugetierzellen kloniert. An/vor
der ersten Aminosäure
der TM-Domäne
wird ein Stopp-Kodon eingeführt. Wenn
dieser so genannte lösliche
Rezeptor in Hefen, Insektenzellen oder Säugetierzellen exprimiert wird,
wird das Protein in das Zellkulturmedium sezerniert (siehe Kikuchi
et al., J. Immunol. Methods 167: 289 (1994)). Alternativ sammelt
sich der lösliche
Rezeptor in dem periplasmatischen Raum an, wenn die Ligandenbindungsdomäne in E.coli
exprimiert wird (siehe Cunningham et al., Science 254: 821 (1991)).
Zur Erleichterung von Reinigung und Bindungsassays kann die extrazelluläre Domäne in Fusion
mit einem Epitop-Marker wie beispielsweise dem Epitop für den Anti-myc-Antikörper 9E10
oder dem „Flag"-Epitop (IBI) exprimiert
werden (siehe Kolodziej and Young, Methods Enzymol 194: 508 (1991)).
Alternativ kann die Ligandenbindungsdomäne in Fusion mit der schweren
Kette eines Immunglobulins exprimiert werden, wie beschrieben in
(Ashkenazi et al., PNAS 99: 10535 (1991)). Die Ligandenbindungsdomäne kann
in E.coli, Hefen, Insektenzellen, Säugetierzellen exprimiert werden
oder mithilfe eines In-vitro-Transkriptions-/Translations-Systems
(Promega) produziert werden. Expression in Säugetierzellen wird mittels
transienter Expression oder durch Auswahl stabiler Klone mithilfe
eines selektierbaren Wirkstoffes wie beispielsweise G418 erreicht.
Für Einzelheiten
zu Expressionssystemen siehe Goeddel (Hrsg.) Methods Enzymol., Band
185 (1990). Siehe auch 7.
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Reinigung
des exprimierten Proteins kann durch Chromatographie-Standardverfahren,
durch Liganden-Affinitätschromatographie
oder mithilfe von Fusionspartnern wie beispielsweise einem Antikörperepitop oder
der schweren Kette eines Immunglobulins erreicht werden.
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Zur
Testung auf Verbindungen, die Ligand-Rezeptor-Interaktionen blockieren,
wird die gereinigte Ligandenbindungsdomäne zunächst in einer Mikrotiterschale
immobilisiert und mit einer Testverbindung und einem radioaktiv
markierten Liganden gemischt. Der Ligand ist typischerweise iodiert,
wie beispielsweise in Pennica et al., Biochemistry 31: 1134 (1992).
Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden die Vertiefungen mit Puffer
gewaschen und der gebundene Ligand wird durch Szintillations- oder
Gamma-Zählung
bestimmt. Verbindungen, die mit der Bindung des Liganden interagieren,
werden durch eine Reduzierung der an die Platte gebundenen Radioaktivität bestimmt.
Die Ligandenbindungsdomäne
kann technisch verändert
werden, um mehrere Aspekte des Assays zu ermöglichen. Wenn die Rezeptorligandenbindungsdomäne beispielsweise
als Fusionsprotein mit einer schweren Kette eines Immunglobulins
exprimiert wird, kann das Protein über einen Antikörper gegen
die konstante Region der schweren Kette an die Mikrotiterplatte
gebunden werden. Alternativ kann der Assay in Lösung durchgeführt, der
gebundene und ungebundene Ligand anschließend mittels Protein-A-Sepharose
oder Pansorbin (Calbiochem) durch Immunpräzipitation abgetrennt werden
(siehe Pennica et al., Biochemistry 31: 1134 (1992)). Außerdem können Aminosäuresubstitutionen
in den Liganden eingeführt werden,
um eine Dimerisierung des Rezeptors zu verhindern (siehe Fuh et
al., Science 256: 1677 (1992)). Dies vereinfacht die Fest stellung
organischer kleiner Moleküle,
die mit der Ligandenbindung wechselwirken.
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Es
können
weitere Bindungsassaykonfigurationen vorteilhaft sein. Beispielsweise
kann man einen Liganden an einer Platte befestigen und anschließend die
Testverbindungen in Lösung
mit dem löslichen
Rezeptor inkubieren. Nach einer geeigneten Zeit werden die Vertiefungen
gewaschen und die Menge an gebundenem Rezeptor festgestellt. Die
Feststellung kann durch direkte radioaktive Markierung des Rezeptors
oder über
eine Markierung am Rezeptor erreicht werden. Beispielsweise ein
ELISA durch eine Epitop-Markierung, ein ELISA über ein nichtwechselwirkendes
Epitop des Rezeptors oder über
Biotin, das zur Markierung des Rezeptors verwendet wurde. Ein alternativer
Assay nutzt den BIAcore, wobei der Ligand auf der Durchflusszelle („Chip") immobilisiert ist
und die Bindung des Liganden in Abwesenheit oder Gegenwart einer
Testverbindung gemessen wird (siehe Corcoran et al., Eur. J. Biochem.
223: 831 (1994)).
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Beispiel 6: Identifizierung
von Rezeptorbindungsmolekülen
aus synthetischen Bibliotheken mit molekularer Diversität
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Neuartige
Liganden können
auch mithilfe synthetischer kombinatorischer Bibliotheken identifiziert werden,
die auf Kügelchen
immobilisiert sind (Gordon, E. M., Barrett, R. W., Dower, W. J.,
Fodor, S. P. und Gallop, M. A., „Applications of combinatorial
technologies to drug discovery. 2. Combinatorial organic synthesis,
library screening strategies, and future directions", J. Med. Chem.,
37: 1385–1401
(1994)), von denen jedes eine spezielle Verbindung enthält. Mithilfe
bekannter Verfahren und Materialien kann man Bibliotheken von Millionen
von Peptiden und Nicht-Peptid-Liganden synthetisieren. Zur Testung
der Bibliothek wird die gereinigte extrazelluläre Rezeptordomäne markiert
und anschließend
mit den Kügelchen
in einem geeigneten Puffer inkubiert. Nach dem Waschen der Mischung
werden Kügelchen
identifiziert, die den Rezeptor gebunden haben. Die ausgewählten Kügelchen
werden isoliert und die Struktur der Verbindung auf dem Kügelchen
wird bestimmt (siehe 5). Aus dem Stand der Technik
sind verschiedene Materialien und Verfahren bekannt, die sich dafür eignen,
den Rezeptor so zu markieren, dass das gebundene Kügelchen
festgestellt werden kann. Dazu gehört das Markieren des Rezeptors
mit einem Fluoreszenzmolekül,
Biotin oder einer Epitop-Markierung, die mit der Domäne fusioniert
sind. Sichtbarmachung wird durch Fluoreszenzmikroskopie oder durch
einen enzymverknüpften
Assay anhand eines Substrates erreicht, welches das Kügelchen
mit gebundenem Rezeptor beobachtbar macht. Immobilisierte kombinatorische
Bibliotheken sind beispielsweise verwendet worden, um Liganden zu
identifizieren, die an die Src SH3-Domäne binden (Yu, H., Chen, J.
K., Feng, S., Dalgarno, D. C., Brauer, A. W. und Schreiber S. L., „Structural
basis for the binding of prolinerich peptides to SH3 domains", Cell 76: 933–945 (1994)).
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Beispiel 7:
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Antagonismus
ligandenvermittelter Zellaktivierung Aggregation der intrazellulären Domäne der T-Zellrezeptor-Zeta-Kette aktiviert
die IL-2-Produktion in T-Zellen (Irving, B. A. und Weiss, A., „The cytoplasmic
domain of the T cell receptor zeta chain is sufficient to couple
to receptorassociated signal transduction pathways", Cell 64: 891–901 (1991)).
Es können
Zelllinien etabliert werden, bei denen die T-Zell-Signaltransduction
und IL-2-Produktion (oder die Produktion eines Produktes, das unter
der Transkriptionskontrolle von NFAT von einem Reportergen kodiert
wird) stimuliert wird, indem dem Medium, in dem die Zellen gehalten
werden, ein Wachstumsfaktor wie beispielsweise EPO zugegeben wird.
In solch einer technisch veränderten
Zelllinie dimerisiert der Ligand seinen Rezeptor, wodurch die intrazelluläre Domäne der Zeta-Untereinheit
aggregiert und die NFAT-kontrollierte Transkription aktiviert wird.
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Eine
Rezeptorchimäre
wird durch PCR oder durch ortsspezifische Deletionsmutagenese konstruiert, um
die Rezeptorligandenbindung (extrazelluläre Domäne) in Fusion mit der transmembranären oder
intrazellulären
Domäne
der T-Zellrezeptor-Zeta-Kette
zu kodieren. Verfahren zur Erzeugung einer solchen Chimäre mit der
Zeta-Kette sind in Irving und Weiss, Cell 64: 891 (1991) und Spencer
et al., Science 262: 1019 (1993) beschrieben. Weitere Verfahren
zum Erzeugen von Cytokinrezeptorchimären sind in Fuh et al., Science
256: 1677 (1992) zu finden. Eine cDNA, welche die Rezeptor-Zeta-Ketten-Chimäre kodiert,
wird in einen Säugetierexpressionsvektor
eingeführt,
wie beispielsweise von Spencer et al. beschrieben. Der Rezeptorexpressionsvektor
wird in Jurkat-Zellen, eine T-Zelllinie,
eingeführt,
zusammen mit einem IL-2-Reportergen unter der Kontrolle von NFAT.
Zellen, welche sowohl die Rezeptorchimäre als auch das Reportergen
stabil exprimieren, werden durch G418-Selektion ausgewählt und
der Rezeptor auf der Zelloberfläche
durch FACS-Analyse festgestellt.
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Mit
den Zellen werden in Gegenwart des Liganden Testverbindungen inkubiert.
Verbindungen, die an den Rezeptor binden und mit der Ligandenbindung
(und der Rezeptoraktivierung) wechselwirken, blockieren die IL-2-Produktion.
Anstelle von IL-2- können
alternative Reporter für
NFAT-abhängige
Genexpression verwendet werden, wie beispielsweise Beta-Galactosidase, alkalische
Phosphatase oder Luciferase. Es können geeignete Kontrollen durchgeführt werden,
um Moleküle
zu eliminieren, die unspezifisch agieren. Das Koppeln eines Rezeptors
an die Zeta-Kette in einer stabilen Zelllinie stellt einen viel
empfindlicheren Funktionstest bereit als die Verwendung von Bioassays
mit primären
Zellen. Dies ermöglicht
auch die Auswahl eines robusteren Zelltyps, der für die Testung
natürlicher
Produkt- und chemischer Bibliotheken geeignet ist.
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Es
können
alternative zelluläre
Systeme verwendet werden, wie beispielsweise die Zelllinie FDC-P1, deren
Wachstum von G-CSF abhängt
(Fuh et al., Science 256: 1677 (1992)). Expression eines chimären Rezeptors,
der eine Ligandenbindungsdomäne
und die transmembranäre
und intrazelluläre
Domäne
des G-CSF-Rezeptors
enthält,
in FDC-P1-Zellen resultiert in Zellen, deren Proliferation von dem
Liganden von Interesse abhängt.
Testverbindungen, die mit der Bindung eines Liganden an eine Rezeptordomäne wechselwirken,
blockieren die ligandenvermittelte Zellproliferation.
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Anmerkungen der Übersetzerin:
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- PDF S. 5/Zeile 10 „Fate" – Wörtliche Übersetzung schwierig; „in die
Hände geben" ?
- PDF S. 10/Zeile 7 und folgende: „Genetically engineered" oder auch „engineered" in Verbindung mit
Zellen wird meist als „(gen)technisch
verändert" übersetzt.
