DE3751846T2 - Hybrid-Rezeptoren, diese kodierende Nukleinsäure, ihre Herstellung und ihre Verwendung zur Bestimmung von Liganden sowie deren Antagonisten oder Agonisten - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Screenen von Arzneimittel-Kandidaten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, einen Rezeptor solcherart zu binden, daß die Funktion eines Liganden, der üblicherweise mit dem Rezeptor in vivo in eine Wechselwirkung tritt, imitiert oder antagonisiert wird. Sie betrifft weiters Verfahren zum funktionellen Assay von Liganden.
• Rezeptoren sind als proteinartige Makromoleküle definiert, die sich auf Zellmembranen befinden und eine signalübertragende Funktion erfüllen. Viele Rezeptoren befinden sich auf der äußeren Zell membran. Diese Zelloberflächen-Rezeptoren besitzen extrazelluläre und zytoplasmische Domänen, wobei die extrazelluläre Domäne fähig ist, eine Substanz spezifisch zu binden, sodaß die zytoplasmische Domäne als Funktion der Bindung des Substrats durch die extrazelluläre Domäne mit einem weiteren Zellmolekül in Wechselwirkung tritt. Die Substanz, die durch den Rezeptor gebunden wird, wird Ligand genannt, ein Ausdruck, der definitionell nur hinsichtlich seines Rezeptor- Gegenstücks Bedeutung hat. Der Ausdruck "Ligand" impliziert keine bestimmte Molekülgräße oder ein anderes strukturelles oder zusammensetzungsbezogenes Merkmal, außer daß die betreffende Substanz zur Bindung, Spaltung oder sonstigen Wechselwirkung mit dem Rezeptor dahingehend fähig ist, daß der Rezeptor Informationen über die Cegenwart des Liganden an ein Zielmolekül übermittelt. Anders ausgedrückt sind nicht alle zur Bindung eines Rezeptors fähigen Substanzen Liganden, doch alle Liganden kännen einen Rezeptor binden. Rezeptoren umfassen keine solchen Substanzen wie Immunglobuline.
• Rezeptoren sind typischerweise strukturell in drei Domänen unterteilt. Ein stark hydrophober Bereich von etwa 20 bis 25 Resten, von dem man glaubt, daß er für das Einbetten des kezeptors in der Zellmembran verantwortlich ist, wird an seinen Aminound Carboxyltermini von Bereichen flankiert, die sich jeweils in die extrazelluläre und zyte plasmische Umgebung erstrecken. Der extrazelluläre Bereich umfaßt die Ligandenbindungs-Domäne. Der zytoplasmische Bereich enthält eine Domäne zur Bewirkung einer Anderung im Zytoplasma. Typischerweise enthält der zytoplasmische Bereich eine enzymatische Funktion, die durch Rezeptor-Aggregation oder Konformationsänderungen aktiviert wird, die durch Ligandenbindung entstehen.
• Man ist der Ansicht, daß Rezeptoren durch einen Vorgang funktionieren, der als Aktivierung oder Signalübertragung bezeichnet wird. Ein Ligand bindet sich so an die extrazelluläre Ligandenbindungs-Domäne, daß sich die Konformation des Rezeptormoleküls innerhalb des zytoplasmischen Bereichs ändert. Diese als Aktivierung bezeichnete Konfomationsänderung modifiziert die Wirkung des Rezeptors auf zytoplasmische Komponenten. Unter den durch die Rezeptoraktivierung hervorgerufenen Änderungen befinden sich Änderungen der bzw. die Entwicklung von Enzymaktivität des Rezeptors.
• Die pharmazeutische Industrie konzentrierte sich in den letzten Jahren in ihrer Forschung auf die Rolle der Rezeptoren bei Krankheiten und Verletzungen sowie auf die Entwicklung von Arzneimitteln, im allgemeinen niedermolekulare Substanzen, die sich an die Rezeptoren binden können. Die in diesem Anfangsscreenen identifizierten Arzneimittel werden dann auf die erwünschte Aktivität in vivo oder in Gewebe- Explantaten untersucht. Das Ergebnis ist, daß sich herkömmliche Verfahren nicht zum Screenen im großen Umfang eignen. Gewebeproben oder isolierte Zellen, die die Zielrezeptoren enthalten, z.B. Herzarteriengewebe, sind teuer, in beschränkter Menge vorhanden Lind kännen nur mit Schwierigkeiten in einem funktionell lebensfähigen Zustand gehalten werden. Außerdem ist es oft problematisch, den Arzneimittel- Kandidaten in zuverlässiger und reproduzierbarer Weise den Gewebeproben zuzuführen. Screenassays unter Verwendung primärer Explantate in Gewebekultur werden im größerem Umfang durchgeführt, als dies mit Gewebeproben möglich ist. Es ist jedoch schwieriger, die physiologische Wirkung zu untersuchen und die Assays werden oft durch andere Quellen beeinträchtigt, z.B. durch Kulturmedien oder Kultivierungsbedingungen. Schließlich weisen Assays, die aus natürlichen Materialien isolierte Rezeptoren verwenden, den Nachteil auf, daß der Rezeptor natürlicher Variabilität unterliegt und geeignete natürliche Quellen möglicherweise nicht immer verfügbar sind. Es ist ein Ziel der Erfindung, leicht reproduzierbare, einfache Assaysysteme bereitzustellen, die nicht nur zum Feststellen der Ligandenbindung, sondern auch zur Bestimmung des Charakters der Bindung als agonistisch oder antagonistisch in großem Umfang praktiziert werden können.
• In ähnlicher Weise hängt eine sinnvolle klinische Diagnose oft vom Assay des biologisch aktiven Liganden ohne Störung durch inaktive Formen des Liganden, wie z.B. Liganden, die enzymatischer oder anderer Verarbeitung durch die Versuchsperson ausgesetzt waren, die die Aktivität des Liganden ändern oder sogar ausschalten, ab. Immunassay-Verfahren werden bei der Bestimmung von Liganden in Versuchsproben in großem Umfang angewendet. Es ist jedoch oft recht schwierig, Antikörper zu identifizieren, die zwischen den aktiven und inaktiven Formen eines Liganden unterscheiden können. Rezeptoren wurden hin und wieder anstelle von Antikörpern als Analyten-Bindungsreagentien eingesetzt. Nicht alle Substanzen aber, die sich an Rezeptoren binden, sind notwendigerweise in der Lage, Rezeptoraktivität herbeizuführen, d.h. biologisch aktiv zu sein. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das Liganden in klinischen Versuchsproben identifiziert, die Signalübertragung durch ihre Rezeptoren aktiv herbeiführen oder hemmen.
• Es wurden viele Rezeptoren identifiziert, die zunimdest eine gewisse bekannte in vitro untersuchbare Aktivität aufweisen, die von der Liganden-Wechselwirkung abhängt. Beispielsweise stimuliert die Bindung von EGF am epidermalen Wachstumsrezeptor eine Phosphotransferase-Domäne im Rezeptor, um best mmte Phosphorylat-Zielaminosäurereste zu phosphorylieren, die sich in seiner intrazellulären zytoplasmischen Domäne befinden, ein Autophosphorylierung genannter Vorgang. Es ist auch bekannt, daß kezeptoren Antikörper oder spezifische zytoplasmische Substratpolypeptide phosphorylieren, die sich an den Bereich binden, in dem sich ihre aktive Phsophotransferase-Stelle befindet. Leider besitzen andere Rezeptoren keine bekannte ligandenabhängige Enzymaktivität, obwohl sie bekanntermaßen Liganden mit hoher Affinität binden, oder es ist ihre Aktivität so schwach, daß es schwierig ist, die ligandenabhängige Aktivierung quantitativ zu untersuchen. Es kann aus therapeutischen Gründen wünschenswert sein, eine Liganden-Wechselwirkung mit derartigen kryptischen Rezeptoren zu antagonisieren oder agonisieren, doch in Abwesenheit des betreffenden Gewebes oder - in einigen Fällen - eines intakten Organismus steht kein Verfahren zur Verfügung, mit dem man bestimmen kann, ob ein Arzneimittel-Kandidat den Rezeptor in funktionsneutraler Weise einfach bindet, oder ob sich der Kandidat als Agonist oder Antagonist bindet. Demzufolge ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Screenen von Arzneimittel-Kandidaten bezüglich Liganden-agonistischer oder - antagonistischer Aktivität bereitzustellen, worin der Rezeptor für den Liganden keine bekannte Signal übertragungs-Eigenschaft aufweist.
Zusammenfassung
• Diese Ziele werden durch die Verwendung eines neuartigen Rezeptorhybrids erreicht, umfassend die Liganden-Bindungsdomäne eines Rezeptors, der mit einem heterologen Reporterpolypeptid fusioniert ist, das in der Lage ist, eine bestimmbare Änderung der Konformation oder Funktion zu erfahren, wenn sich die Liganden-Bindungsdomäne des Rezeptors entweder an den Liganden oder einen Agonisten bzw. Antagonisten des Liganden bindet.
• Wenn eine Krankheit oder Verletzung das Ergebnis eines Liganden ist, der auf einen bestimmten Rezeptor einwirkt, besteht das Ziel darin, Substanzen zu identifizieren, die der Wirkung des Liganden auf den entscheidenden Rezeptor gegensteuern können, d.h. Ligandenantagonisten. Ein Therapiemodel 1 für einen durch unzureichende Ligandenaktivität gekennzeichneten klinischen Zustand würde hingegen aus Arzneimitteln bestehen, die einen mangelhaften oder fehlenden Liganden verstärken bzw. ergänzen, d.h. Ligandenagonisten.
• Der erfindungsgemäße Hybridrezeptor eignet sich für Screenverfahren zum Identifizieren rezeptoraktiver agon istischer Arzneimittel. Man inkubiert den Hybridrezeptor mit dem Arzneimittel-Kandidaten und untersucht ihn hinsichtlich der Erzeugung eines Signals durch das heterologe Reporterpolypeptid. Im allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, wird das durch das Reporterpolypeptid erzeugte Signal als Aktivierung oder Stimulierung einer enzymatischen Funktion des Reporterpolypeptids getestet. Es ist nicht erforderlich, Standards mit bekannten Mengen an Liganden vorzusehen, es sei denn, man möchte die agonistische Aktivität des Kandidaten quantifizieren; tatsächlich kann der die Rezeptoraktivität in vivo modulierende Ligand völlig unbekannt sein. Einer der Vorteile des vorliegenden Assaysystems liegt darin, daß weder der Ligand für den Rezeptor noch der in vivo signalübertragende Mechanismus der Rezeptoren bekannt sein muß, um agonistische Arzneimittel zu identifizieren.
• Der Hybridrezeptor wird zum Ermitteln der Mengen an biologischem Ligand in Versuchsproben in gleicher Weise verwendet wie beim Screenen hinsichtlich agonistischer Arzneimittel. Da diese Nützlichkeit per definitionem einen bekannten Liganden voraussetzt, wird eine Standardkurve mit bekannten Ligandenmengen erstellt und mit den Ergebnissen der Versuchsprobe verglichen.
• Antagonistische Arzneimittel-Kandidaten werden durch den gleichen Assay ausgewählt wie der zum Identifizieren von Agonisten verwendete, außer daß der Hybridrezeptor hier mit einem bekannten Rezeptoragonisten inkubiert wird. Der Agonist, der ein Arzneimittel oder der normale in vivo-Ligand sein kann, wird vor oder vorzugsweise gleichzeitig mit dem In-Kontakt-Bringen des Rezeptors mit dem Arznei mittel-Kandidaten mit dem Rezeptor inkubiert. Die antagonistische Aktivität ist eine Funktion der Verdrängung von agonistischer oder Ligandenaktivität, gemessen anhand der Veränderungen im Reporterpolypeptid.
• Ein besonderer Vorteil des Hybridrezeptors besteht darin, daß er ein universelles, übertragbares Assaysystem für jede beliebige Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung ermöglicht. Die vorliegende Erfindung sieht z.B. vor, daß die zytoplasmische Domäne eines ersten Rezeptors als übertragbares Reporterpolypeptid ausgewählt wird. Diese Domäne wird dann bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridrezeptoren für die zytoplasmische Domäne anderer Rezeptoren substituiert. Das für den ersten Rezeptor geeignete Assaysystem, z.B. ein Autophosphorylierungs-Assay, ist dann für alle anderen Hybridrezeptoren geeignet, die die zytoplasmische Domäne des ersten Rezeptors enthalten.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
• Fig. 1a zeigt die Zusammensetzung eines Plasmids, das bei der Expression von Hybriden der Insulin- und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren verwendet wird. Der für unterschiedliche Rezeptormutanten kodierende Bereich wird durch einen schraffierten Balken dargestellt (cDNA). Durch dicke schwarze Pfeile gekennzeichnete frühe SV40- Promotorsequenzen und PolyA-Additionsstellen wurden markiert. Die Dihydrofolat- Reductase- (DHFR) Kodiersequenz (Simonsen und Levinson, 1983, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80: 2495-2499) und für Plasmidkonstruktionen verwendete Restriktionsstellen sind ebenfalls dargestellt. Die Expression beider cDNAs wurde durch Promotorsequenzen des frühen Simianvirus (SV) 40-Bereichs und durch untranslatierte 3'-Sequenzen des Gens gesteuert, das für das Hepatitis B Virus-Oberflächenantigen kodiert (Crowley et al., 1983, "Mol. Cell. Biol." 3: 44-45). Sequenzen des E.coli- Plasmids pML (ein zur Verwendung in Säugetierzellen geeignetes pBR322-Derivat; Lusky und Botchan, 1981, "Nature" 293: 79), die den Replikationsursprung und das Ampicillinresistenz-Gen enthielten, waren vorhanden, was die Plasmidreplikation in E.coli ermöglicht.
• Fig.1b ist ein schematischer Vergleich von Insulin- (HIR) und EGF- (HER) Rezeptoren und cer daraus gebildeten Hybridrezeptoren IER und IαER. Die cDNAs aus menschlichem EGF-Rezeptor (HER), menschlichem Insulinrezeptor, Insulin-EGF- Rezeptorchimäre (IER) und Insulin-α-Untereinheit-EGF-Rezeptorchimäre (IαER) sind durch horizontale Linien dargestellt und Kodiersequenzen als punktierter Kasten für HIRα-Sequenzen (α), als schraffierter Kasten für HIRβ-Sequenzen und als offener Kasten für HER-Sequenzen gezeigt. Die Kodierbereiche werden an der transmembranen Domäne zusammengeschlossen (nicht maßstabsgetreu abgebildet). Das Kodiersegment für die Protein-Signalsequenz ist durch (S) gekennzeichnet, und die Vorläufer-Spaltstellen sind durch eine vertikale Linie dargestellt. Die Verbindung der heterologen Rezeptor-cDNAs ist durch eine Zickzack-Linie dargestellt, und die an den Verbindungen verwendeten synthetischen Oligonukleotide sind durch schwarze Balken abgebildet. DNA-Restriktions-Endonuklease-Spaltsstellen, die für die Konstruktionen relevant sind, sind über den cDNA-Sequenzen markiert.
• Fig.2 veranschaulicht, daß die ¹²&sup5;I-Insulinbindung an COS-7-Zellen zunimmt, wenn diese mit den cDNA-Konstrukten von Fig.1a transfiziert werden (im Vergleich zu Zellen, die mit einem Vergleichs-Expressionsvektor transfiziert werden).
• Figuren 3a-3d sind reduzierende SDS-PAG E-Elektrophorese-Gele autophosphoryl ierter Detergenslysate aus verschiedenen transformierten und Vergleichszellen, die mit geeigneten Antikörpern immungefällt wurden (siehe Beispiel). Die (+) und (-) Gele stellen Insulin oder - im Falle von A431 - mit EGF behandelte Rezeptoren dar. Die Zahlen an den Rändern sind Marker-Molekulargewichte.
• Fig.3a zeigt die immungefällten anti-HER-Autophosphorylierungs-Produkte scheintransformierter Vergleichsproben und rekombinanter Transformantenzellen. Dies zeigt die Expression von Hybridinsulin-EGF-Rezeptorkonstrukten in den Rekombinanten.
• Fig.3b zeigt, daß die Autophosphorylierung des Hybrids, das die vollständige extrazelluläre Domäne des Insulinrezeptors enthält, durch Insulin aktiviert wird.
• Fig.3c veranschaulicht die Kinetik der durch Insulin aktivierten Autophosphorylierung des IER-Rezeptors. Es zeigt, daß die beobachtete Autophosphorylierung von der Zeit der Phosphorylierungsreaktion abhängt.
• Fig.3d zeigt die Änderung der SDS-PAGE-Wanderung des IER-Rezeptors nach der Insulinaktivierung.
• Fig.4 zeigt die Struktur von HER-erbB, einem Hybridrezeptor, der die extrazelluläre epidermale Wachstumsfaktor-Domäne und ein Fragment des erbb-Onkogens enthält, um als Reportermolekül zu dienen.
• Fig.5 zeigt Elektrophorese-Gele, die die Autophosphorylierung eines Onkogen- Rezeptor-Hybridkonstrukts in Gegenwart (+) oder Abwesenheit von Liganden (EGF) (-) anzeigen.
Ausführliche Beschreibung
• Der Hybridrezeptor ist der Kern der hierin beschriebenen Verfahren. Er umfaßt vor allem eine Liganden-Bindedomäne und ein Reporterpolypeptid. Die Liganden- Bindungsdomäne befindet sich innerhalb des extrazellulären Bereichs eines Rezeptors. Es ist oft schwierig, die genauen Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die an der Ligandenbindung beteiligt sind. Mehrere Bereiche können an der Ligandenbindung beteiligt sein, besonders wenn der Ligand ein Polypeptid ist. Somit ist es vorzuziehen, daß der gesamte extrazelluläre Bereich des Rezeptors in das Hybrid eingefügt wird. Dadurch läßt sich auch sicherstellen, daß die Liganden-Bindungsdomäne in ihrer richtigen Konformation beibehalten wird.
• Geeignete Liganden-Bindungsdomänen werden in unterschiedlicher Weise ausgewählt. Wenn man beabsichtigt, das Hybrid zu verwenden, um einen Assay hinsichtlich eines bekannten Liganden in Versuchsproben durchzuführen oder Agonisten oder Antagonisten eines solchen Liganden zu screenen, wird die Liganden-Bindungsdomäne aus einem bekannten Rezeptor für den Liganden ausgewählt. Wenn der Ligand im Gegensatz zum Rezeptor bekannt ist, ist es erforderlich, seinen Zelloberflächen- Rezeptor zu identifizieren. Dies kann folgendermaßen erreicht werden: 1) Gewinnen von Zellen aus Geweben, an die sich der Ligand erwiesenermaßen bindet bzw. mit denen er funktionell interagiert, 2) Erhalten eines Membranprotein-Präparats aus den Zellen in bekannter Weise, 3) Inkubieren des Präparats mit dem Liganden, 4) Abtrennen des Ligand-Rezeptor-Komplexes aus dem Inkubationsgemisch (z.B. durch Prämsolubilisieren des Liganden auf mit Bromcyan aktivierter Sepharose), 5) Abtrennen des Rezeptors vom Liganden, 6) Erhalten der Aminosäuresequenz aus einem Teil des Rezeptors, 7) Herstellen von Nukleinsäuresonden, die für die bestimmte Aminosäuresequenz kodieren (entweder eine einzelne lange Sonde von > etwa 40 bp oder ein Pool kürzerer Sonden), 8) Herstellen einer cDNA- oder genomischen DNA-Phagen- oder Plasmid(vektor)bibliothek aus dem Organismus oder den Zellen, aus dem bzw. denen der Rezeptor erhalten wurde, 9) Hybridisieren der Sonden mit der Bibliothek, um Plasmide oder Phagen zu identifizieren, die für den Rezeptor kodierende DNA enthalten, Lind 10) Bestimmen des Nukleotids und der mutmaßlichen Aminosäuresequenz des Rezeptors im erforderlichen Ausmaß, um den Bereich zu identifizieren, der sich vom Aminoterminus bis zu einer transmembranen Sequenz erstreckt. Wenn kein einzelner Vektor für die gesamte extrazelluläre Domäne des Rezeptors kodierende DNA enthält, wird die erwünschte DNA durch Restriktionsenzymspaltung der verschiedenen Vektoren an gemeinsamen Stellen, Isolierung der geeigneten Fragmente und erneute Ligation durch bereits an sich bekannte Verfahren konstruiert. Andere Verfahren zum Identifizieren von Rezeptoren für bekannte Liganden sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt oder werden in Zukunft zur Verfügung stehen.
• Ein mutmaßlicher Rezeptor wurde möglicherweise schon identifiziert, doch sein in vivo-Ligand bleibt unbekannt. Die Untersuchung endokriner Gewebe aus Drüsen wie der Hypophyse oder den Nebennieren führen z.B. zur Identifizierung membrangebundener Proteine, die strukturell anderen bekannten Rezeptoren ähneln, die also eine große extrazelluläre Domäne (typischerweise ) 500 Reste), eine hydrophobe transmembrane Sequenz und einen carboxyterminalen zytoplasmischen Bereich aufweisen. Ebenso ist ein Rezeptorinventar für bösartige Zellen zur Identifizierung einzelner Rezeptoren, die iii hoher Dichte vorhanden sind und mit dem transformierten Phenotyp assoziiert sein können, von Vorteil. Die extrazellulären Domänen solcher Rezeptoren sind auch hierin von Nutzen.
• Ein Rezeptor und sein Ligand wurden vielleicht schon identifiziert, doch die zytoplasmische Domäne besitzt möglicherweise keine bekannte Funktion; z.B. ist nicht bekannt, daß sie eine Phosphotransferase-Aktivität aufweist, Adenylat- oder Guanylat- Cyclase aktiviert oder Liganden transportiert. Die Liganden-Bindungsdomäne aus solchen Rezeptoren ist nützlich, obwohl die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung kein oder ein nicht ausreichend nachweisbares Signal im nativen Rezeptor erzeugt, da ein nachweisbares Signal durch das Reporterpolypeptid in der Hybridkonstruktion bereitgestellt wird. In Abwesenheit des Reporterpolypeptids würde also kein Verfahren zur Verfügung stehen, um im Falle eines Rezeptors zu bestimmen, ob sich ein rezeptorgebundener Arzneimittel-Kandidat nichtspezifisch band oder als Agon ist oder Antagonist wirkte; es wäre auch nicht möglich, einen Assay hinsichtlich biologisch aktiver nativer Liganden durchzuführen.
• Das Reporterpolypeptid ist bezüglich der Liganden-Bindungsdomäne heterolog und ist jedes Polypeptid, das seine Beschaffenheit bei Bindung eines Liganden an die Bindungsdomäne ändert. Diese Änderung der Beschaffenheit wird im allgemeinen durch eine Änderung der enzymatischen Aktivität oder immunologischen Identität des Reporterpolypeptids nachgewiesen. Im allgemeinen ist das Reporterpolypeptid die zytoplasmische Domäne eines heterologen Rezeptors oder Rezeptoranalogs, z.B. Onkogen, von dem bekannt ist, daß es bei Ligandenbindung eine Änderung der immunologischen oder enzvmatischen Identität erfährt. Es ist vorzuziehen, die zytoplasmische Phosphotransferase aus Rezeptoren wie dem Insulin oder epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren zu verwenden. Andere Rezeptoren wie z.B. der β- adrenergische Rezeptor, der Acetylcholinrezeptor, der Adrenalinrezeptor u.dgl. binden bekanntermaßen Proteine, die als G-Proteine bezeichnet werden und bei der Aktivierung oder Inhibierung von Adenylat- oder Guanylat-Cyclasen als übertragende Zwischenmoleküle dienen. Solche Proteine wurden isoliert und charakterisiert. Es liegt im Schutzbereich der Erfindung, als Reporterpolypeptid die G-Protein-Bindungsdomänen solcher Rezeptoren zu verwenden. Es ist nicht erforderlich, die gesamte zytoplasmische Domäne aus einem heterologen Rezeptor oder Rezeptoranalog zu verwenden - man braucht lediglich den Abschnitt, der die hierin erwünschte Funktion erfüllt; ebenso ist es nicht erforderlich, eine heterologe zytoplasmische Domäne zu verwenden, die eine intakte unmodifizierte Sequenz aus einem anderen Rezeptor ist. Beispielsweise eignet sich auch eine Aminosäuresequenz-Variante oder ein Derivat der zytoplasmischen Domäne des Rezeptors, der die Liganden-Bindungsdomäne bereitstellt.
• Ohne sich auf eine bestimmte Theorie der Funktion festzulegen, sind die Autoren der Ansicht, daß die Änderung der Beschaffenheit des Reporterpolypeptids nicht durch die sterische Hinderung des Reporters durch den Liganden bewirkt wird, z.B. wenn der Ligand aufgrund der sterischen Sperrigkeit eine aktive Stelle auf der Reporterdomäne verschließt. Das vorliegende Verfahren bedient sich hingegen des Signalübertragungs- Mechanismus der Rezeptoren, wodurch Veränderungen in der Liganden- Bindungsdomäne durch das Rezeptormolekül hindurch zur Reporterdomäne übertragen werden; dies geschieht durch Konformationsänderungen des Moleküls, was die Funktion oder Beschaffenheit der zytoplasmischen Domäne des Reporters beeinflußt. Die Anmelder entdeckten, daß dieser Übertragungsmechanismus auch dann wirkt, wenn das Reporterpolypeptid bezüglich der Liganden-Bindedomäne heterolog ist.
• Gegebenenfalls enthält der Hybridrezeptor eine wischen der Liganden- Bindungsdomäne und dem Reporterpolypeptid fusionierte transmembrane Sequenz. Typische transmembrane Domänen enthalten etwa 20 bis 25 Reste und zeigen einen Hydropathie-Peak von etwa 1,5 bis 3,5. Sie enthalten einen hohen Anteil an Resten mit hydrophoben Seitenketten, z.B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Valin und Methionin. Geeignete transmembrane Sequenzen werden aus dem kezeptor erhalten, der die extrazelluläre Liganden-Bindungsdomäne Bereitstellt, obwohl die Transmembrane Sequenz auch vollkommen svnthetisch sein kann oder aus ganzen Membranproteinen oder nicht verwandten Rezeptoren stammen kann, wobei sie im letzteren Fall den transmembranen Bereich enthält, der üblicherweise mit dem Reporterpolypeptid assoziiert ist, wo der Reporter die zytoplasmische Domäne eines heterologen Rezeptors ist.
• Die Hybridrezeptor-Komponenten stammen günstigerweise von Menschen, Tieren, Pflanzen, Insekten, Mikroorganismen einschließlich Parasiten, Viren und Pilzen sowie anderen geeigneten Spezies. Die Ursprungsspezies der Liganden-Bindungsdomäne wird nach dem Vorhandensein eines Rezeptors, der den Liganden von Interesse binden kann, oder nach der Gegenwart der physiologischen Zielaktivität ausgewählt. Es ist nicht notwendig, daß das Reporterpolypeptid oder der transmembrane Bereich aus der gleichen Spezies stammen wie die Liganden-Bindungsdomäne.
• Die Hybridrezeptoren werden vorzugsweise in rekombinanter Zellkultur synthetisiert, da sie im allgemeinen zu groß und komplex sind, um durch derzeit zur Verfügung stehende in vitro-Verfahren praktisch synthetisiert zu werden.
• Rekombinante Verfahren zur Synthese des Hybridrezeptors beginnen mit der Konstruktion eines replizierbaren Vektors, der für den Hybridrezeptor kodierende Nukleinsäure enthält. Vektoren erfüllen in Zusammenarbeit mit kompatiblen Wirtszellen typischerweise zwei Funktionen. Eine Funktion ist die Erleichterung der Klonierung der Nukleinsäure, die für den Hybridrezeptor kodiert, d.h. um zweckmäßige Mengen der Nukleinsäure herzustellen. Die andere Funktion ist die Lenkung der Expression des Hybridrezeptors. Eine oder beide dieser Funktionen werden durch das Vektor-Wirt-System erfüllt. Die Vektoren enthalten je nach zu erfüllender Funktion und ausgewählter Wirtszelle unterschiedliche Komponenten.
• Jeder Vektor enthält Nukleinsäure, die für den Hybridrezeptor kodiert. Typischerweise ist dies DNA, die für den Hybridrezeptor in seiner reifen Form kodiert, der an seinem Aminoterminus mit einem Sekretionssignal verbunden ist. Dieses Sekretionssignal ist vorzugsweise die Signal-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion des Rezeptors lenkt, aus dem die Liganden-Bindungsdomäne stammt. Geeignete Sekretionssignale sind jedoch auch Signale aus anderen Rezeptoren oder sekretierten Polypeptiden der gleichen bzw. verwandten Spezies.
• Das sekretierte Hybrid befindet sich in der rekombinanten Wirtsmembran, wenn es einen transmembranen Bereich enthält. Andererseits kann das Hybrid in das Kulturmedium sekretiert werden wenn ein solcher Bereich im Hybrid nicht vorhanden ist. Üblicherweise sind Hybride vorzuziehen, die einen transmembranen Bereich enthalten, um so viel strukturelle Übereinstimmung wie möglich beizubehalten. Die Reinigung der transmembrandeletierten Rezeptoren ist jedoch weniger komplex als bei membrangebundenen Rezeptoren, da der Hybridrezeptor im letzteren Fall von anderen Zellmembran-Proteinen gereinigt werden sollte. Weiters kann der zellgebundene Hybridrezeptor eine unerwünschte biologische Wirkung auf den Wirt ausüben, wenn er dazu induziert ist, sich iii großen Populationen in der Zellmembran während der Wachstumsphase anzusammeln. Dieses potentielle Problem wird dadurch gelöst, daß die für den Hybridrezeptor kodierende Nukleinsäure unter die Steuerung eines induzierbaren Promotors gestellt wird.
• In Klonierungsvektoren ist die für den Hybridrezeptor kodierende Nukleinsäure üblicherweise gemeinsam mit einer Nukleinsäuresequenz vorhanden, die die Replikation des Vektors in euler ausgewählten Wirtszelle unabhängig von den Wirtchromosomen ermöglicht. Diese Sequenz ist im allgemeinen ein Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl an Bakterien, Hefe und höheren eukaryotischen Zellen bekannt. Der Ursprung aus dem allgemein bekannten Plasmid pBR322 eignet sich für E.coli- Bakterien, der 2 µ-Plasmidursprung für Hefe Lind verschiedene virale Ursprünge für Säugetierzellen (SV40, Polyom, Adenovirus oder kinder-Papillomvirus). Es ist weniger günstig, wenn DNA durch Einsetzen in das Genom eines Wirts kloniert wird. Dies geschieht leicht mit Bacillus-Spezies, z.B. durch Insertion einer DNA, die zu genomischer Bacillus-DNA komplementär iht, iii den Vektor. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor führt zur homologen Rekombination mit dem Genom und Insertion der Hybridrezeptor-DNA. Die Gewinnung genomischer, für den Hybridzeptor kodierender DNA ist komplexer als die Bildung exogen replizierter viraler oder Plasmid- DNA, da Restriktionsenzymspaltung erforderlich ist, um die Hybridrezeptor-DNA aus dem Genom des Klonierungsvehikels zu gewinnen.
• Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das man auch als selektierbaren Marker bezeichnet. Dies ist ein Gen, das für ein Protein kodiert, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Das Vorhandensein dieses Gens stellt das Wachstum nur jener Zellen sicher, die die Inserts exprimieren. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Mangelerscheinungen ausgleichen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodiert.
• Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trpI-Gen, das in Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., 1979, "Nature", 282: 39; Kingsman et al., 1979, "Gene", 7: 141; oder Tschemper et al., 1980, "Gene", 10: 157). Das trpI- Gen bietet einen Selektionsmarker für einen Hefe-Mutantenstamm, der nicht in der Lage ist, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977, "Genetics", 85: 12). Das Vorhandensein der trpl-Läsion im Hefe-Wirtszellengenom bietet eine wirkungsvolle Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Ebenso werden Hefestämme mit Leu2- Mangel (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide komplementiert.
• Beispiele geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat- Reductase (DHFR), Thymidin-Kinase oder Proteine für Neomycin-Resistenz. Solche Marker ermöglichen die Identifizierung von Zellen, die kompetent waren, die Hybridrezeptor-Nukleinsäure aufzunehmen. Die Säugetierzellen-Transformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, wobei nur jene Transformanten überleben können, die den Marker aufgenommen haben. Der Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten in aufeinanderfolgenden Zellkultur-Durchgängen ausgeübt, worin die Konzentration des Selektionsmittels im Medium nach und nach erhöht wird, was zur Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der für den Hybridrezeptor kodierenden DNA führt. Zunehmende Mengen an Hybridrezeptor werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
• Beispielsweise erfolgt die Auswahl DHFR-transformierter Zeilen in einem Kulturmedium ohne Hypoxanthin, Glycin und Thymidin. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die chinesische Hamstereierstock- (CHO) Zellinie, die einen Mangel an DHFR-Aktivität aufweist und nach dem Ver%hren von Urlaub und Chasin, 1980, "Proc. Nat. Acad. Sci. USA" 77: 4216 hergestellt und vermehrt wird.
• Eine besonders nützliche DHFR ist eine DHFR-Mutante, die gegenüber Methotrexat (MTX) hochresistent ist (EP-117.060A). Dieses Selektionsmittel kann trotz der Gegenwart endogener DHFR mit jedem ansonsten geeigneten Wirt verwendet werden. Man gibt dem Medium einfach genügend MTX bei, um die gesamte endogene DHFR zu inaktivieren, worauf die MTX-Selektion einzig und allein eine Funktion der Amplifikation der DHFR-Mutanten-DNA wird. Die meisten eukaryotischen Zellen, die MTX adsorbieren können, scheinen methotrexat-empfindlich zu sein. Eine derartige nützliche Zellinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).
• Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die sich zur Anpassung an die Synthese des Hybridrezeptors in rekombinanter Wirbeltier-Zellkultur eignen, sind in M.J. Gething et al., "Nature" 293: 620-625 (1981); N. Mantel et al., "Nature" 281: 40-46; und A. Levinson et al., EP-1 1 7.060A Lind 117.058A beschrieben.
• Expressionsvektoren sollten im Gegensatz zu Klonierungsvektoren eine Promotorund/oder eine andere Sequenz enthalten, die durch den Wirtsorganismus erkannt wird, um eine starke Transkription der für den Hybridrezeptor kodierenden DNA zu erreichen. Dies ist im allgemeinen ein Promotor, der zum beabsichtigten Wirt homolog ist. Im Falle von Vektoren für höhere Eukaryoten eignen sich Enhancersequenzen zur Steigerung der Transkription aus Promotoren. Im Gegensatz zu Promotoren müssen sich Enhancer nicht 5' von der für den Hybridrezeptor kodierenden Nukleinsäure befinden. Üblicherweise verwendete Promotoren für Prokaryoten sind die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978, "Nature", 275: 615; und Goeddel et al., 1979, "Nature", 281: 344), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel 1980, "Nucleic Acids Res." 8: 4057 und EP-A 36-776) und Hybridpromotoren wie z.B. der tac-Promotor (H. de Boer et al., 1983, "Proc. Nat. Acad. Sci. USA" 80: 21-25). Andere bekannte mikrobielle Promotoren sind aber ebenfalls geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch sie ein Fachmann auf dem Gebiet operabel an DNA ligieren kann, die in Plasmidvektoren für den Hybridrezeptor kodiert (Siebenlist et al., 1980, "Cell" 20: 269), wobei Linker oder Adaptoren verwendet werden, um alle erforderlichen Restriktionsstellen zu liefern. Promotoren zur Verwendung in prokaryotischen Systemen enthalten auch eine Shine- Dalgarno- (S.D.) Sequenz, die operabel mit der für den Hybridrezeptor kodierenden DNA verbunden ist.
• Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind u.a. die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., 1980, "J. Biol. Chem.", 255: 2073) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, "J. Adv. Enzyme Reg.", 7:149; und Holland, 1978, "Biochemistry", 17: 4900), z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglukose-Isomerase und Glukokinase.
• Andere Hefepromotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorbereiche für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff-Stoffwechsel assozuerte Abbauenzyme und das obige Metallothionein und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind durch R. Hitzeman et al., EP- 73.657A ausführlicher beschrieben.
• Die Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird durch Promotoren und/oder Enhancer gesteuert, die aus den Genomen des Rinder-Papillomvirus, Vaccinia- Virus, Polyomvirus, Adenovirus 2, Retroviren, Hepatitis B-Virus und am bevorzugtesten aus Simianvirus 40 (SV405 erhalten wurden und operabel mit der Hybridrezeptor- Nukleinsäure verbunden sind. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden günstigerweise als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., 1978, "Nature", 273: 113). Natürlich eignen sich hierin auch Promotoren oder Enhancer aus der Wirtszelle oder verwandten Spezies.
• Nukleinsäure ist operabel verbunden, wenn sie in funktionelle Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz gesetzt ist. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promoter oder Enhancer ist operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder es ist eine Ribosomen-Bindungsstelle operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation erleichtert. Im allgemeinen bedeutet "operabel verbunden", daß die verbundenen DNA-Sequenzen angrenzend und - im Falle des sekretorischen Leaders -angrenzend und innerhalb des Leserahmens angeordnet sind.
• In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere oder Menschen) verwendete Expressionsvektoren enthalten auch Sequenzen, die zur Transkriptionstermination und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen stammen üblicherweise aus den untranslatierten 3'-Bereichen eukaryotischer oder viraler cDNAs. Diese Bereiche enthalten Bereiche, die als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Abschnitt der für den Hybridrezeptor kodierenden mRNA transkribiert werden. Die untranslatierten 3'-Bereiche enthalten auch Transkriptionsterminations- Stellen.
• Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der vorliegenden Vektoren sind Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Zu Prokaryoten zählen gramnegative oder grampositive Organismen, z.B. E.coli oder Bazillen. Ein bevorzugter Klonierungswirt ist E.coli 294 (ATCC 31.446), obwohl andere gramnegative oder grampositive Prokaryoten wie z.B. E.coli B, E.coli X1776 (ATCC 31.537), E.coli W3110 (ATCC 27.325), Pseudonomas-Spezies oder Serratia Marcescens ebenfalls geeignet sind.
• Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie z.B. Fadenpilze oder Hefe geeignete Wirte für Vektoren, die für den Hybridrezeptor kodieren. Saccharomyces cerevisiae bzw. gewöhnliche Backhefe ist der am häufigsten verwendete der niederen eukaryotischen Wirts-Mikroorganismen. Einige andere geeignete Gattungen, Spezies und Stämme stehen jedoch auch zur Verfügung und sind nützlich.
• Die bevorzugten Wirtzellen zur Expression funktioneller Hybridrezeptoren sind Kulturen von Zeilen aus multizellulären Organismen. In vielen Fällen enthalten Hybridrezeptoren hydrophobe Bereiche, die mit niederen Mikroorganismen unverträglich sind, einer komplexen Verarbeitung bedürfen, um Disulfidbindungen korrekt zu bilden und oft eule Verarbeitung der Untereinheit erfordern. Außerdem ist es wünschenswert, die Rezeptoren in einer ähnlichen Weise wie native Rezeptoren zu glykosylieren. Alle diese Funktionen können durch höhere eukaryotische Zellen am besten erfüllt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur (gleichgültig, ob aus Wirbeltier- oder Wirbellosenkultur) geeignet, obwohl Zellen aus Säugetieren wie z.B. dem Menschen stammende Zellen vorzuziehen sind. Die Vermehrung solcher Zeilen in Kultur ist an sich allgemein bekannt. Siehe Tissue Cuiture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hg. (1973). Beispiele nützlicher Säugetier-Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zel len, chinesische Hamstereierstock-Zellinien und W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien.
• Die erfindungsgemäßen Hybridrezeptoren werden beim Screenen von Arzneimitteln oder in einem Assay mit biologisch aktiven Liganden verwendet; dabei kommt ein Verfahren zum Einsatz, das vor allem das Inkubieren des Rezeptors mit der Versuchsprobe, mit Vergleichen und (gegebenenfalls) Standards sowie das anschließende Messen der Änderung im Reporterpolypeptid umfaßt. Da die Anmeder entdeckten, daß die Ligandenbindung eine Änderung der Konformation des Reporterpolypeptids bewirkt, liegt es im Schutzbereich der Erfindung, solche Änderungen durch irgendeines zahlreicher Verfahren nachzuweisen. Typischerweise mißt man die Änderungen der Proteinbindung oder der enzymatischen Aktivität des Reporterpolypeptids. In einer Ausführungsform wird ein Antikörper gegen die aktivierte Konformation gebildet und die Bindung dieses Antikörpers am Hybridrezeptor gemessen, nachdem der Rezeptor mit dem Liganden oder dem Arzneimittel-Kandidaten inkubiert wurde. Dieser Assay wurde in gleicher Weise wie herkömmliche Immunassay- Verfahren (ür jedes beliebige Proteinantigen durchgeführt. Antikörper, die Phosphotyrosin enthaltende Proteine binden können, sind an sich bekannt (Wang, 1985, "Mol. and Cell. Bio .", 5 (12): 3640-3643; Ross et al., 1981, "Nature" 294: 654; und Pang et al., 4985, "Arch. Biochem. Biophys." 242(1): 176). Während sich diese Antikörper für das vorliegende Verfahren eignen, ermöglichen Hybridrezeptoren die Auswahl von anti-Phosphotyrosin-Antikörpern, die im Gegensatz zu Antikörpern des Stands der Technik für das Reporterpolypeptid spezifisch sind und nicht mit anderen Rezeptoren oder phosphorylierten Proteinen kreuzreagieren, die jedoch bei der Messung der Auswirkung eines Liganden auf die Rezeptorbindungs-Domäne genauso vielseitig sind. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß es eine Phasentrennung erfordert, um den ungebundenen markierten Antikörper von dem am Reporter gebundenen Antikörper zu trennen. Das Verfahren erfordert jedoch keine kovalente Modifizierung des Hybridrezeptors.
• In Analogie zu Assays, die die Bindung eines spezifischen Antikörpers an das Reporterpolypeptid vorsehen, gibt es Verfahren, die die Bindung eines Nichtimmun- Bindeproteins an den Reporter, mit dem es normalerweise in Wechselwirkung tritt, direkt oder indirekt messen. Typische Bindeproteine sind die G-Proteine, die mit bestimmten ligandenaktivierten Rezeptoren assoziieren. Das Reporterpolypeptid ist in diesem Fall die zytoplasmische Domäne eines Rezeptors, z.B. des β-adrenergischen Rezeptors. Die Bindung des G-Proteins wird in gleicher Weise wie die Antikörperbindung bestimmt, z.B. durch Verdrängung des markierten G-Proteins oder durch Bestimmung der GTP- oder ATP-Bindung an das aktivierte G-Protein.
• Wenn das Reporterpolypeptid die enzymatisch aktive zytoplasmische Domäne eines heterologen Rezeptors ist, ist das bevorzugte Nachweisverfahren ein Assay hinsichtlich dieser Aktivität. Derzeit umfaßt eine derartige Aktivität Protein-Phosphorylkinase- Aktivität, vor allem Tyrosinkinase-Aktivität, doch in einigen Fällen Serin- oder Threoninkinase-Aktivität. Die Kinase-Aktivität ist in jeder Weise meßbar, in der die Kinase-Aktivität bislang getestet wurde. Ein herkömmliches und derzeit vorzuziehendes Verfahren für die Kinase-Aktivität ist das Bestimmen des Einbaus von Radiophosphor in das Reporterpolypeptid durch Autophosphorylierung mit ³²P. Es ist vorzuziehen, Hybride von Rezeptoren mit der gleichen Aktivitätsklasse zu bilden.
• Es liegt jedoch im Schutzbereich der Erfindung, die Änderungen im Reporterpolypeptid durch andere Verfahren als enzymologische Aktivität oder Polypeptid- Wechselwirkungen zu messen. Ein solches Verfahren umfaßt die Bindung einer organischen Gruppe an den Rezeptor, der bei der Ligandenbindung eine Änderung seiner Eigenschaft erfährt. Beispielsweise wird das Reporterpolypeptid mit einem stabilen freien Radikal, einer chemilumineszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül, z.B. Fluoresceinisothiocyanat, markiert. Jede dieser Markierungen ist auf dem Gebiet der diagnostischen Immunchemie allgemein bekannt; das gleiche gilt für herkömmliche Verfahren zu ihrer kovalenten Bindung an Proteine. Diese Verfahren eignen sich zum Markieren des Reporterpolypeptids in der gleichen Weise wie andere Proteine. Änderungen der Konformation des Rezeptorpolypeptids bei Bindung von Ligand oder dem aktiven Arzneimittel-Kandidaten an die Liganden- Bindungsdomäne werden durch Änderungen in der Markierung nachgewiesen. Beispielsweise nimmt das Drehmoment einer stabilen Freiradikal-Markierung durch ligandenaktivierte Änderungen der Reporterpolypeptid-Konformation zu oder ab. Ebenso ändert sich die Fluoreszenz oder Lumineszenz von Reporterpolypeptid- Markierungen bei der Bindung von Ligand oder aktivem Kandidat an den Rezeptor aufgrund der Umorientierung der Polypeptidspezies, die an intramolekularen Energietransfers teilnehmen. Dies wird durch Änderungen der Intensität, Polarisierung oder Wellenlänge des Markierungsmoleküls nachgewiesen; typischerweise wird die Verstärkung bzw. der Verlust der Markierungsfluoreszenz oder -Chemilumineszenz nachgewiesen. Der Vorteil des Verfahrens mit dem markierten Reporter besteht darin, daß der Ligand- oder Arzneimittelkandidat-Assay ausschließlich iii wäßriger Lösung stattfindet und keine Phasentrennung erforderlich ist. Dies ermöglicht die Automatisierung des Screenverfahrens unter Verwenung von Dauerflußinstrumenten wie z.B. von Autoanalyzern. Solche Verfahren eignen sich für Nativ- sowie für Hybridrezeptoren.
• Zur Vereinfachung der Beispiele wird auf einige häufig angewendete Verfahren durch Kurzbezeichnungen Bezug genommen.
• "Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die vorliegenden Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich, uneingeschränkt öffentlich zugänglich oder können aus solchen zur Verfügung stehenden Plasmiden gemäß veröffentlichter Verfahrensweisen hergestellt werden. Außerdem sind andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet bzw. dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
• "Digestion" oder "Spaltung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Solche Enzyme werden Restriktionsenzyme genannt, und die Stellen, für die jedes spezifisch ist, nennt man eine Restriktionsstelle. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, wobei die von den Enzym-Lieferfirmen vorgegebenen Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Kriterien bei der Verwendung berücksichtigt wurden. Restriktionsenzyme werden im allgemeinen durch Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben bestehen, gefolgt von anderen Buchstaben, die den Mikroorganismus darstellen, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich stammt, und dann einer Zahl, die das jeweilige Enzym kennzeichnet. Geeignete Puffer und Substratmengen tür die jeweiligen Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller angegeben. lnkubationszeiten von etwa 1 bis zu mehreren Stunden bei 37ºC sind üblich, können aber je nach Anweisungen der Lieferfirma variieren. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die gespaltene Nukleinsäure durch Fällen mit Ethanol aus der wäßrigen Fraktion gewonnen. Auf die Spaltung mit einem Restriktionsenzym folgt manchmal die Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase, um zu verhindern, daß die zwei restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments "ringschließen" bzw. eine geschlossene Schleife bilden, die die Insertion eines weiteren DNA-Fragments au der Restriktionsstelle verhindern würde. Soferne nicht anders angegeben, schließt sich an die Spaltung von Plasmiden keine terminale 5'- Dephosphorylierung an. Verfahren und Reagentien zur Dephosphorylierung sind herkömmlich (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, 5.133-134).
• "Auffüllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf das Verfahren, durch das das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer mit Restriktionsenzym gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Dies beseitigt den kohäsiven Terminus und bildet ein stumpfes Ende. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Instrument zur Umwandlung eines restriktionsgeschnittenen Endes, das mit den Enden, die durch nur eines oder einige wenige andere Restriktionsenzyme hergestellt werden, kohäsiv sein kann, zu einem Terminus, der mit jeder beliebigen stumpfschneidenden Restriktions-Endonuklease oder einem anderen aufgefüllten kohäsiven Terminus kompatibel ist. Typischerweise erfolgt das Abstumpfen durch Inkubieren von 2 - 15 µg der Ziel-DNA in 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM NACl, 10 mM Tris- (pH 7,5) Puffer bei etwa 37ºC in der Gegenwart von 8 Units des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I und 250 µM jedes der vier Desoxynukleosidtriphosphate. Die Inkubation wird im allgemeinen nach 30 min durch Phenol- und Chloroformextraktion und Ethanolfällung abgebrochen.
• "Gewinnung" oder "Isolation" eines bestimmen DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest umfaßt die Trennung des Digests auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, die Identifizierung des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität mit jener von Marker-DNA-Fragmente mit bekanntem Molekulargewicht, die Entfernung des das erwünschte Fragment enthaltenden Gelabschnitts und die Trennung der DNA vom Gel. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe z.B. R. Lawn et al., 1981, "Nucleid Acids Res." 9: 6103-6114, und D. Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8: 4057.
• "Transformation" ist das Einbringen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA entweder als extrachromosomales Element oder chromosomaler Integrant replizierbar ist. Soferne nicht anders angeführt, ist das hierin zur Transformation von E.coli angewendete Verfahren das CaCl&sub2;-Verfahren nach Mandel et al., 1970, "J. Mol. Biol." 53:154.
• "Ligation" bezieht sich auf ein Verfahren zur Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., ebda., S. 146). Hoferne nicht anders angegeben, kann die Ligation mit bekannten Puffern und unter bekannten Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 1 µg der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
• "Herstellung" von DNA aus Transformanten bezieht sich auf das Isolieren von Plasmid- DNA aus mikrobieller Kultur. Soferne nicht anders angegeben, kann das Alkali/SDS- Verfahren nach Man atis et al., ebda., S.90, angewendet werden.
• "Oligonukleotide" sind kurze ein- oder doppeistrangige Polydesoxynukeotide, die chemisch durch bekannte Verfahren synthetisiert und dann auf Polyacrylamidgelen gereinigt werden.
• Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung der besten derzeit bekannten Durchführungsart der Erfindung, die jedoch keinesfalls darauf beschränkt ist.
• Alle Literaturstellen sind ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
Beispiel 1 Konstruktion des Insulinrezeptor-(IR)Expressionsplasmids
• Ein gelgereinigtes SalI-Fragment ( 5,2 kb) aus λHIR-P12, das die gesamte HIR- Kodiersequenz enthält, wurde in den pUC12- (New England Biolabs) Polylinkerbereich durch Spalten von pUC12 mit SalI und Ligieren des gereinigten SalI-Fragments an den Vektor subkloniert. Die Kolonien wurden gezüchtet und auf Klone gescreent, die die erwünschte Ausrichtung, mit dem 5'-Ende der HIR-Kodiersequenz angrenzend zur PUC12-XbaI-Stelle, aufweisen. Dieser Vektor wurde mit XbaI und DraI geschnitten (DraI befindet sich im untranslatierten 3'-Bereich von HIR) und das HIR enthaltende Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in einen Säugetier-Expressionsvektor (pCVSVEHBVE400, EP-A Nr. 117.060) eingesetzt, der zuerst mit Bamhl gespalten worden war. Die kohäsiven BamHI-Termini wurden aufgefüllt und das Plasmid dann mit XbaI gespalten. Somit war die Einsetzung von XbaI-DraI nur in der zur Expression der HIR-mRNA erforderlichen Ausrichtung möglich. Das resultierende Insulinrezeptor- Expressionsplasmid wurde als pCVSV-HIRc bezeichnet.
Beispiel2 Konstruktion eines Vektors zur Expression eines Insulin-EGF-Rezeptorhybrids
• Die folgenden Fragmente wurden in einer Ligation aus vier Teilen ligiert: (a) ein 931 bp- BamHI-AatII-Restriktionsfragment aus dem IR-Expressionsplasmid pCVSVE-HIRc, (b) ein 1150 bp-ApaI-SstI-Restriktionsfragment aus der menschlichen EGF-Rezeptorsequenz, die im rekombinanten Phagen λHER-A64 enthalten ist (Ullrich et al., 1984, "Nature" 309: 418-425), (c) ein synthetischer Oligonukleotidlinker mit
• 5'-CCCGTCAAATATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCC-3' und
• 5'-CCCACCATCCCAGTGGCGATATTTGACGGGACGT-3',
• und (d) pUC12, geöffnet mit SstI und BamHI.
• Auf diese Weise wurden die für die extrazelluläre Domäne des Insulinrezeptors kodierenden Sequenzen mit für die transmembrane und zytoplasmische Domäne des EGF-Rezeptors kodierenden Sequenzen verbunden und in ein Expressionsplasmid eingesetzt. Das Plasmid pUC12/HIR-HER Int., das die für das Hybrid kodierende DNA enthielt, wurde aus einer ampicillinresistenten Kolonie transformanter E.coli 294 gewonnen. Dieses Plasmid wurde mit BamHI und ApaI gespalten und ein 965 bp- Fragment, das die IER-Verbindungsstelle enthält, gewonnen (Fragment 1). pCVSV-HIRc wurde mit PvuI und BamHI gespalten und ein 31171bp-Fragment, das den Rest der IR- Kodiersequenz und Teile des Säugetier-Expressionsvektors enthält, gewonnen (Fragment 2). λHER-A64 wird mit ApaI-BglII gespalten und ein 810 bp-Fragment gewonnen (Fragment 3) sowie mit BglII-XmnI gespalten und ein 1 kb-Fragment gewonnen (Fragment 4). Die Fragmente 3 und 4 kodieren für die Transmembrane und zytoplasmische Domäne des menschlichen EGF-Rezeptors. pCVSVEHBVE400 wird mit BamHI gespalten, die Restriktionsstelle endaufgefüllt und die DNA anschließend mit PvuI gespalten. Ein 4 kb-BamHI-PvuI-Fragment wurde gewonnen (Fragment 5), das für Teile des beschriebenen Säugetier-Expressionsvektors kodiert. Ein Gemisch der Fragmente 1, 2, 3, 4 und 5 wurde ligiert und dazu verwendet, E.coli 294-DNA zu transformieren. Ampicillinresistente Kolonien wurden durch Restriktionsanalyse gescreent. Ein 241 bp-PstI-Fragment, das die HIR-HER-Verbindungsstelle überlappt, wurde in M13Ty131 kloniert und sequenziert, um die erwartete Verbindungsstelle zu verifizieren.
• Ein Expressionsvektor für einen keinen transmembranen Bereich enthaltenen Hybridrezeptor wird in gleicher Weise wie oben unter Verwendung von pCVSV-HIRc konstruiert, außer daß der transmembrane Bereich stromabwärts vom ApaI-EGF- Rezeptor durch M13-Mutagenese deletiert und ein innerhalb des Rahmens befindlicher ApaI-Adaptor an das deletierte ER-Fragment ligiert wird.
• Ein Vektor, der für den Hybridrezeptor IαEF kodiert, ein Hybrid der Insulinrezeptor-α- Kette mit der transmembranen und zytoplasmischen EGF-Rezeptor-Domäne ohne irgendeiner HIR B-Kettensequenz, wurde durch oglionukleotid-gerichtete Deletionsmutagenese des IER-Plasmids hergestellt. Ein 2,1 kb-BHIII-Restriktionsfragment, das für die verbundenen Insulin- und EGF-Rezeptorsequenzen kodiert, wurde an der BamHI- Stelle eines M13mp10-Vektors eingefügt. Moleküle mit der erwünschten Ausrichtung der IR-Sequenzen angrenzend zur HindIII-Stele von M13mp10 wurden identifiziert und eine einstrangige Schablone für die Deletionsmutagenese mit dem Oligonukleotid 5'- CCCCAGGCCATCTATCGCCACTGGGA-3', basierend auf den Arbeitsvorschriften von Adelman et al., "DNA" 2: 183-193 (1983) hergestellt. 50 ng phosporylierter Primer wurden an 2 µg einzelstrangige M13-Schablone hybridisiert. Der mutagenisierte zweite Strang wurde vervollständigt, und doppelstrangige Moleküle wurden in E.coli JM101 eingebracht. Die resultierenden Plaques wurden nach dem Verfahren von Benton und Davis "Science" 196: 180-182 (1977) bei Bedingungen hoher Stringenz mittels des Primers als Hybridisie rungssonde gescreent. Doppelstrangige DNA wurde hergestellt und ein 1 2 kb-Bstell-Restriktionsfragment, das den mutierten Bereich enthält, dazu verwendet, das jeweilige DNA-Fragment im IER-Expressionsplasmid zu ersetzen, wodurch plαER entstand.
Beispiel3 Expression des Hybridinsulins und von EGF-Rezeptoren
• COS-7-Affennierenzellen (Gluzman, 1981, "Cell 23: 175-182) wurden in DMEM kultiviert, das 50:50 mit F12-Medium vermischt war (enthielt 10% Rinderfötenserum und Antibiotika). Alle Zellkulturmedien (Gibco) enthielten 2 mM L-Glutamin und 20 mM HEPES, pH 7,4.
• pIER oder plαER aus Beispiel 2 wurde durch Kalziumphosphat-Cofällung auf der Grundlage der Arbeitsvorschrift von Graham und Van der Eb, 1973, "Virology" 52: 456- 467 in COS-7-Zellen eingebracht. Subkonfuente Zellen wurden mit 10 µg Plasmid- DNA pro 8 cm Petrischale transfiziert. Plasmid-DNA wurde in 0,55 mli mM Tris, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 250 mM CaCl&sub2; aufgelöst; danach wurden 0,5 ml 50 mM HEPES, pH 7,12, 280 mM NaCl Lind 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4; langsam zugegeben. Innerhalb von 45 min bildete sich langsam ein Niederschlag, der dem Zellkulturmedium zugegeben wurde. Die transfizierten COS-7-Zellen wurden 53 h lang bei 37ºC in DMEM kultiviert, das 50:50 mit F-12-Medium vermischt war (enthielt Antibiotika, 2 mM L-Glutamin, 20 mM HEPES und 10 Volums-%) Rinderfötenserum, pH 7,4).
• Mit pIER oder pIαER transformierte COS-7-Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 2 h lang bei 21ºC in 1 ml serumfreien Zellkulturmedium pro 2,2 cm-Napf inkubiert; die Näpfe eithielten 0,2% Rinder-Serumalbumin (Sigma), Bacitracin (0,5 mg/ml Sigma) und ¹²&sup5;I-Insulin (0,5 µCi/Napf) bei 93 µCi/µg. Die Zellen wurden bei 4ºC dreimal mit PBS gewaschen und in 0,5 ml 0,1% SDS, 0,1 M NaOH 30 min lang bei 37ºC lysiert. Die Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler ermittelt. Fig.2a zeigt, daß die Insulinbindung an die Transtormanten über jene der Vergleiche stieg. Menschliche Epidermoid-Karzinomzellen A431 (eine Quelle von EGF-Rezeptorvergleichen) wurden in DMEM kultiviert, das 4,5 mg Glukose pro Liter, 10% Rinderfötenserum und Antibiotika enthielt.
Beispiel4 Hormonstimulierte Autophosphorylierung von normalen und Hybrid rezeptoren
• Mit pIER oder pIαER transformierte und scheintransformierte COS-7-Zeilen- Einzelzeischichten, die 53 h lang in 8 cm-Petrischalen gezüchtet wurden, oder A431- Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und wie in Kris et al., 1985, "Cell" 40: 619- 625 solubilisiert. 1 ml 50 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, mit 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 1 mM EGTA, 10% Glyzerin, 1% Triton X-100, 1% Aprotinin (Sigma) und 4 µg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Sigma) sowie 0,5 mg/ml Bacitracin (Sigma) wurden den Einzelzelschichten bei 4ºC 5 min lang zugegeben. Der Puffer, der die solubilisierten zellulären Proteine enthielt, wurde aus der Petrischale entfernt und bei 10.000 g 5 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Die Kulturüberstände aus mit transmembrangelöschtem Hybridrezeptor transformierten Zellen werden 5 min lang bei 4ºC und 10.000 g zentrifugiert. 0,2 ml der Zellyse bzw. des Kulturüberstands wurde mit 200 nM Insulin (Sigma) oder 1 µm EGF 1 Stunde lang inkubiert.
• Ein monoklonaler Mäuseantikörper, der den Insulinrezeptor binden kann (CII25.3, beschrieben durch Ganguly et al., 1985, "Current Topics in Cellular Regulation" 27: 83- 94), wurde durch Adsorption an Protein-Ä-Sepharose insolubilisiert. Man beachte jedoch, daß jeder polyklonale oder monoklonale anti-lnsulinrezeptor-Antikörper verwendet werden kann. 1 pl Antikörper wurde mit 50 µl einer gequollenen und vorgewaschenen 1:1-Protein-A-Sepharose-Aufschlämmung in detergensfreiem Lysepuffer 30 min lang vermischt, um den anti-IR-Antikörper zu adsorbieren.
• 50 µl insolubilisierte anti-IR-Antikörperaufschtämmung wurde dem mit EGF oder Insulin behandelten Zellysat oder Zellkultur-Überstand zugegeben und 15 min lang bei 4ºC inkubiert. Das resultierende Immunprezipitat wurde viermal mit 0,9 ml HNTG-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 100/o Glyzerin und 0,1% Triton X-100) gewaschen. Das Prezipitat wurde in einem Volumen von 30 µl auf 5 mM MnCl&sub2; eingestellt und 15 µCi γ-³²P-ATP (5.000 Ci/mMol) 0,5-10 min lang bei 4ºC zugegeben. Die ATP-Endkonzentration betrug 0,1 pM ATP (für EGF-, IER- oder IαER-Transfomianten und ihre Vergleiche) oder 100 µM ATP (für HIR-Transformanten und ihre Vergleiche). Die Autophosphorylierungsreaktion wurde durch Zugabe von 20 µl dreifach konzentriertem SDS-Probenpuffer abgebrochen. Die Autophosphorylierungsreaktion wurde in den Figuren 3a und 3d nach 5 min, in Fig.3b nach 1 min und nach den in Fig.3c angeführten Zeitpunkten durch fünfminütiges Kochen abgebrochen. Die Proben wurden zentrifugiert und 20 µl Aliquote auf 5%-igen/7%-igen SDS-Polyacrylamidgelen analysiert (Laemmli, 1970, "Nature" 277: 680-685).
• Die auf reduzierenden SDS-PAGE-Gelen erzielten Muster stimmten mit dem ³&sup5;S-Met- Markierungsergebnis für jene Polypeptide überein, die Tyrosinkinase-Sequenzen enthalten. Fig.3b (HIR+) zeigt, daß die durch Insulin stimulierte Autophosphorylierung der menschlichen Insulinrezeptor-β-Untereinheit oberhalb des endogenen COS-7- Vergleichs liegt. In diesem Fall ist die Insulin-Induktionswirkung stark, obwohl das visualisierte Signal aufgrund der durch die Insunrezeptor-Kinase erforderlichen ATP- Konzentration (100 µM) schwach ist. Im Gegensatz dazu sind nur picomolare Konzentrationen erforderlich, um EGF-Rezeptorkinase-Aktivität und EGF-Stimulation zu messen, wie im A431-Zellen-EGF-Rezeptor-Vergleich (A431) gezeigt ist. Die Eigenschaften des chimären Rezeptormoleküls IER spiegelt die Gegenwart der EGF- Rezeptorkinase aufgrund der niedrigen notwend gen ÄTP-Konzentrationen wider. Da die Ligandeninduktion die Vmax der Kinase steigert, kann man in einer 30 Sekunden dauernden Reaktion bei 4ºC eine maximale Induktion (vierfach) beobachten (Fig.3c). Dieses Ergebnis steht in guter Korrelation mit den kinetischen Eigenschaften des E7GF- Rezeptors der Wildform (Staros et al., 1985, in Molecular Aspects of Cellular Regulation Vol.4; Molecular Mechanisms of Transmembrane Signaling) und deutet daraufhin, daß die EGF-Rezeptorkinase ihre ursprünglichen Eigenschaften beibehält, wenn sie durch die Insulin-Bindungsdomäne gesteuert wird.
• Überraschenderweise weisen die durch Insulin stimulierten und unstimulierten 130 kd- Phosphoprotein-Untereinheiten des IE-Rezeptorhybrids eine geringfügige, doch reproduzierbare Größendifferenz auf (Fig.3d). Diese Beobachtung läßt auf die Möglichkeit schließen, daß die durch Liganden hervorgerufene enzymatische Aktivität eine Phosphorylierung von Tyrosinresten bewirkt, die bei niedrigen Werten nicht modifiziert sind; eine anschließende Konformationsänderung der zytoplasmischen Rezeptordomäne könnte die Wanderungseigenschaften in SDS-Gelen ändern. Eine ähnliche Änderung kann im intakten EGF-Rezeptor eintreten, wurde aber aufgrund der größeren Größe des monomeren 170 kd-Glykoproteins nicht nachgewiesen. Änderungen der elektrophoretischen Beweglichkeit wurden bei anderen autophosphorylierten Proteinen festgestellt, z.B. bei Ca²&spplus;/Calmodulin-abhängiger Proteinkinase (Kuret et al., 1985, "J. Biol. Chem." 260: 6427-6433), cAMP-abhängiger Proteinase des Typs II (Hemmings et al., 1981, "Eur. J. Biochem." 119:443-451).
• Da ungespaltener chimärer Prorezeptor-IER insulinstimul ierte Autophosphorylierung zeigt (Fig.3b und 3c, IER + Gel, obere Bande) muß die zur Insulinbindung und Signalübertragung notwendige tertiäre Struktur vor der proteolytischen Insulinrezeptor- Verarbeitung gebildet werden, wobei dies mit früheren Berichten übereinstimmt (Blackshear et al., 1983, "FEBS" 158: 243-246; Rees-jones et al., 1983, "Biochem. Biophys. Res. Comm. 116: 417-422). Die Versuche der Annielder mit dem chimären Konstrukt IαER, in dem der extrazelluläre Abschnitt der Insulinrezeptor-β-Untereinheit und die Prorezeptor-Spaltungsstelle deletiert sind (Fig.3b, IαER, vergleiche + und -), zeigen, daß trotz der offensichtlichen Fähigkeit des resultierenden 180 kd-Einzelketten- Glykoproteins zur Insulinbindung die Insulinaktivierung der zytoplasmischen Kinasedomäne verloren gegangen ist.
• Wie oben gezeigt, reguliert Insulin die Rate der EGF-Rezeptor- Autophosphorylierungsaktivität bei subpicomolekularen Konzentrationen von ATP, Bedingungen, unter denen die Phosphotransferase des Insulinrezeptors inaktiv ist. Hormonelle Steuerung wurde nur bei Hybrid-IER beobachtet, der den vollständigen extrazellulären Abschnitt des Insulinrezeptors einschließlich des Signals zur Rezeptorverarbeitung in die α- und β-Untereinheiten und den Aminoterminus der β- Untereinheit enthält. Der Rezeptor scheint im Expressionssystem der Anmelder verarbeitet zu werden. In Fall des Chimären-IαER ohne Abschnitte der β-Untereinheit und daher ohne Abspaltungssignal konnte man keine hormonelle Wirkung feststellen. Die Annielder schließen daraus, daß diese strukturelle Differenz zwischen IER und IαER eine große Wirkung auf die Struktur des chimären Rezeptors ausübt, die für die Signalübertragung entscheidend ist.
Beispiel 5 Konstruktion eines für Rezeptor-Onkogen-Hybrid (HER-erbB) kodierenden Vektors
• Die Anmelder konstruierten einen Hybridrezeptor, der aus der intrazellulären Domäne des v-erbB-Onkogenprodukts bestand, das mit der extrazellulären und transmembranen Domäne des EGF-Rezeptors (HER-erbB; Fig.4) fusioniert war.
• Der Hybridrezeptor wird unter der Steuerung des frühen SV40-Promotors aus einem Plasmid exprimiert. Dieses Plasmid enthält auch ein DHFR-Mutantengen für Methotrexat- (MTX) Resistenz. Die Selektion wird durch Cotransformation mit einem für ein Neomycinresistenzgen kodierenden Plasmid durchgeführt und die DNA durch Selektion in MTX enthaltenden Kulturmedien amplifiziert.
• λHER-A64 (Ullrich et al.) wurde mit SacI und NarI gespalten und ein Restriktionsfragment gewonnen, das für die vollständige extrazelluläre und transmembrane Domäne des EGF-Rezeptors kodiert. Ein 1,7 kb-AhaII-StuI-Restriktionsfragment, das für den vollständigen intrazellulären Abschnitt von AEV-erbB (H) kodiert (Yamamoto, T. et al., 1983, "Cell" 35: 71-78), wurde gemeinsam mit dem EGF-Fragment in ein mit SacI und SmaI geöffnetes pUC12-Plasmid ligiert. Das rekombinante Plasmid wurde in E.coli HB101 amplifiziert und der Kodierbereich für den vollständigen chimären Rezeptor in einem 3,7 kb-SacI-XmnI-Restriktionsfragment entfernt, wobei sich beide Stellen in den untranslatierten Bereichen des EGF-Rezeptors bzw. der v-erbB-Sequenz befinden.
• p324E (Crowley et al., 1983., "Mol. Cell. Biol." 3: 44-55) wurde mit EcoRI gespalten und das geöffnete Plasmid gewonnen. Ein Adaptor mit der Sequenz
• EcoRI SacI EcoRI
• GAATTCGAGCTC
• CTCGAGCTTAAG
• wird mit dem geöffneten Plasmid ligiert, das Ligationsgemisch in E.coli 294 transfiziert und das Plasmid pCVSVE-HBS mit dem Adaptorinsert aus einer ampicillinresistenten Kolonie gewonnen.
• pCVSVE-HBS wird mit SacI zum Teil gespalten und das linearisierte Vektorfragment (I) gewonnen. Das linearisierte Plasmid wird mit HpaI gespalten und das Vektorfragment gewonnen.
• Das PCVSVE-HBS-Vektorfragment wird an das für den Hybridrezeptor kodierende SacI- XmnI-Fragment ligiert und Expressionvektor pCVSV-HER-erbB aus einer transformierten E.coli HB101-Kolonie gewonnen.
Beispiel 6 Expression von Rezeptor-Onkogen-Hybrid
• Expressionsvektor PCVSVE-HER-erbB wird in normale Rat1-Fibroblasten gemeinsam mit neomycinresistentem Expressionsplasmid durch Kalziumphosphat-Cofällung gemäß der Arbeitsvorschrift von Graham und van der Eb (1973) co-transfiziert. Subkonfluente Zellen wurden mit 10 µg Plasmid-DNA pro 8 cm-Petrischale transfiziert. DNA wurde in 0,55 ml mM Tris, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 250 mM CaCl&sub2; aufgelöst und 0,5 ml 50 mM HEPES, pH 7.12, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4; langsam zugegeben. Es bildete sich innerhalb von 40 min allmählich ein Niederschlag, der den 10 ml Zellkulturmedium zugegeben wurde. 5 h nach der Transfektion wurden die Zellen einer einminütigen Glyzerin-Schockbehandlung durch Inkubation in 3 ml 200/o Glyzerin in PBS ausgesetzt. Das Glyzerin wurde abgewaschen, und die Zellen wurden im ursprünglichen Medium weiter kultiviert.
• Das Neomycinresistenz-Gen unter der Steuerung des frühen SV40-Promotors diente als auswählbarer Marker. Mit 400 µg/ml Geneticin (Sigma G5013) ergänztes Medium wurde zur Selektion verwendet, die 2 Tage nach der Transfektion begann. Neomycinresistente Zellen wurden dann in einem Medium gezüchtet, das mit 200 nM und später 1000 nM Methotrexat-Konzentration (Sigma A6770) mit 7% dialysiertem Rinderfötenserum ergänzt war. Das Ergebnis war eine schrittweise Amplifikation der cDNA-Expression in neomycinresistenten Zellinien.
• Die Expression des Hybrids in den Transfomianten wurde zunächst durch Analysieren der mit ³³S-Methionin metabolisch markierten Proteine nach der Immunfällung von Detergenslysaten mit einem monoklonalen EGF-Mäuse-Äntikörper R1, der für menschlichen EGF-Rezeptor spezifisch ist, überwacht. Stabil exprimierende Zellinien wurden metabolisch mit S-Methionin markiert. Spezifische Proteine wurden durch an Protein A-Sepharose adsorbierten R1-Antikörper aus Detergenslysaten (Herstellung wie oben) immungefällt und auf reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Der monoklonale R1-Mäuseantikörper (Waterfield et al., 1982, "J. Cell. Biochem." 20:149- 161) erkennt den endogenen Rat1-Zellen-EGF-Rezeptor nicht. Das HER-erbB-Protein wurde in Immunprezipitaten vor und nach der Methotrexat-Amplifikation leicht nachgewiesen. Wie erwartet, war das HER-erbB-Protein kleiner als der in A431-Zellen exprimierte EGF-Rezeptor der Wildform. Im Vergleich zu den sehr hohen Werten an in A431-Zellen exprimiertem EGF-Rezeptor exprimierten amplifizierte Rat1-Zellen nur dreimal weniger HER-erbB.
• Das HER-erbB-Hybridprotein zeigte eine spezifische EGF-Bindung, da ¹²&sup5;I-EGF bei verschiedenen Konzentrationen an transformante Zellen gebunden war. Die Bindung konnte gesättigt und in Gegenwart eines 100-fachen Überschusses an unmarkiertem EGF vollständig verdrängt werden. Die Menge der Bindung von 1-markiertem EGF an konfluente RatI-Kulturen entsprach genau der Menge des EGF-Rezeptors oder chimären Rezeptors, der durch die jeweiligen Zellkulturen exprimiert wurde. Somit enthielten die konstruierten Proteine Vollfunktionelle EGF-Bindungsdomänen und wurden zuverlässig zur Zelloberfläche transportiert.
Beispiel7 EGF-stimulierte in vitro-Autophosphorylierung
• Um zu testen, ob HER-erbB in vitro-Autophosphorylierungsaktivität besitzt, wurden Zellysate wie oben immungefällt, mit ³²P-γ-ATP inkubiert und durch Polyacrylamidgel- Elektrophorese und Autoradiographie analysiert. In 8 cm-Petrischalen gezüchtete transformante Einzelzelschichten wurden zweimal mit PBS gewaschen und nach dem Verfahren von Kris et al., "Cell" 40: 619-625 (1985) solubilisiert. 1 ml 50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 1 mM EGTA, 10% Glyzerin, 1% Triton X-100, 1 % Aprotinin und 4 µg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wurde bei 4ºC 5 min lang den Einzelzelschichten zugegeben. Die solubilisierten Zellen wurden 5 min lang bei 4ºC und 10.000 g zentrifugiert und der Überstand entweder bei -70ºC gelagert oder weiter verarbeitet.
• Die EGF-Stimulation der Autophosphorylierung wurde durch 15-minütiges Inkubieren der Detergens-Zellysate, die vor der Immunfällung auf eine 0,5%-ige TX-100- Konzentration in 0,4 ml verdünnt wurden, mit 3 µg/ml EGF bei 4ºC hervorgerufen. R1- Antikörper, der 30 min lang an Protein A-Sepharose vorgebunden worden war, wurde zugegeben (1 µl Antikörper/50µl Aufschlämmung 1:1) und die Inkubation 15 min lang bei 4ºC fortgesetzt. Die Immunprezipitate wurden fünfmal in 0,9 ml HNTG-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% Glyzerin und 0,1% Triton X-100) gewaschen. Die gewaschenen Immunprezipitate wurden in einem Volumen von 30 pl auf 5 mM MnCl&sub2; eingestellt und 15 µCi 7-³²P-ATP 0,5 min lang bei 4ºC zugegeben. Die Autophosphorylierungsreaktion wurde durch Zugabe von 20 µl von dreifach konzentriertem SDS-Probenpuffer abgebrochen. Die Proben wurden 5 min lang gekocht, zentrifugiert und 20 µl-Aliquote auf reduzierenden 5%-igen/7%-igen SDS- Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970) analysiert. Die Gele wurden fixiert und unter Vakuum bei 70ºC getrocknet. Normale Rat1-Fibroblasten wurden als Vergleich verwendet. Größenmarker sind in Kilodalton angegeben. Wie der EGF-Rezeptor der Wildform enthielt das HER-erbB-Hybrid beträchtliche Mengen an ³²P in Immunprezipitaten. Das Ausmaß der Phosphorylierung nahm durch die Zugabe von EGF (als + bezeichnet) zu; bei der Messung nach 30 Sekunden erwies sich die Phosphorylierungsrate in Gegenwart von EGF ais dreimal höher. Das v-erbB-Protein seibst besitzt nur eine sehr geringe Autophosphorylierungsaktivität (Lax et al., 1985, "EMBO Journal" 4: 3179-3182). Trotz der niedrigen Autophosphorylierungsaktivität, die man im Hybrid beobachtet, führte die Wiederherstellung der EGF-Bindungsdomäne zu einer durch Liganden hervorrufbaren Autophosphorylierungsaktivität.

Claims (20)

1. Hybridrezeptor für einen Liganden, welcher Rezeptor auf Zellmembranen angeordnet werden kann und folgendes umfaßt: (a) eine Liganden-Bindungsdomäne mit einer extrazellulären Domäne eines vorbestimmten Rezeptors, worin der vorbestimmte Rezeptor kein Immunglobulin ist, und (b) ein Reporterpolypeptid, das zum Rezeptor heterolog ist, aus dem die Liganden-Bindungsdomäne erhalten wird, und das eine nachweisbare Änderung der Konformation oder Funktion erfahren kann, wenn sich die Liganden-Bindungsdomäne des Rezeptors entweder an einen Liganden oder einen Agonisten oder Antagonisten des Liganden bindet, worin der Hybridrezeptor eine Transmembran-Domäne aufweist, die zwischen der Liganden-Bindungsdomäne und dem heterologen Reporterpolypeptid angeordnet ist.

2. Hybrid rezeptor nach Anspruch 1, worin das Reporterpolypeptid eine Zytoplasma-Domäne eines Rezeptors oder Onkogens ist.

3. Hybridrezeptor nach Anspruch 1, worin das Reporterpolypeptid ein Enzym ist.

4. Hybridrezeptor nach Anspruch 3, worin das Enzym durch die Bindung eines Liganden an den Hybridrezeptor nicht sterisch gehindert wird.

5. Hybridrezeptor nach Anspruch 3, worin das Enzym eine Phosphorylkinase ist.

6. Nukleinsäure, die für einen Hybridrezeptor nach Anspruch 1 kodiert.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, weiters umfassend einen replizierbaren Vektor.

8. Vektor nach Anspruch 7, weiters umfassend eine Wirtszelle.

9. Verfahren zur Herstellung eines Hybridrezeptors nach Anspruch 1, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor, der eine Nukleinsäure enthält, die für den Hybridrezeptor kodiert, der mit einem Promotor zur Steuerung der Transkription des Hybridrezeptors operabel verbunden ist; und

(b) das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen zum Exprimieren des Hybridrezeptors.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Hybridrezeptor aus dem Kulturmedium der Wirtszelle gewonnen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Hybrid rezeptor aus der Zellmembran der Wirtszelle gewonnen wird.

12. Verfahren zum Assay auf einen biologisch aktiven Liganden oder einen Antagonisten oder Agonisten für den Liganden, umfassend:

(a) das Bereitstellen eines Hybridrezeptors nach Anspruch 1;

(b) das Inkubieren des Rezeptors mit einer Versuchsprobe, von der man annimmt, daß sie den Liganden, Antagonisten oder Agonisten enthält;

(c) das Nachweisen einer Änderung in einem Reporterpolypeptid; und

(d) das Korrelieren der Änderung mit der Gegenwart des Liganden, Antagonisten oder Agonisten in der Versuchsprobe.

13. Verfahren nach Anspruch 1 2, worin der Ligand ein Polypeptid ist und die Liganden-Bindungsdomäne nicht die Antigen-Bindungsstelle eines Immunglobulins ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Änderung im Reporterpolypeptid eine Modifikation der enzymatischen Aktivität des Polypeptids ist.

15. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Änderung im Reporterpolypeptid Autophosphorylierung des Reporterpolypeptids ist.

16. Verfahren nach Anspruch 12, worin man annimmt, daß die Versuchsprobe einen Antagonisten enthält, und worin der Rezeptor mit der Versuchsprobe und einer vorbestimmten Aktivität des Liganden oder Liganden-Agonisten inkubiert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Änderung im Reporterpolypeptid eine Änderung in einem Immunepitop ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Änderung im Immunepitop durch Inkubieren des Rezeptors mit einem Antikörper, der sich an das Reporterpolypeptid binden kann, und Bestimmen der Menge an gebundenem oder ungebunden verbliebenem Polypeptid nachgewiesen wird.

19. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Reporterpolypeptid weiters ein stabiles freies Radikal, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Gruppe umfaßt und die Änderung im Reporterpolypeptid durch Messen einer Änderung des Drehungsmoments des stabilen freien Radikals oder einer Änderung der Intensität, Wellenlänge oder Polarisierung der fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Gruppe bestimmt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 12, worin sich das Reporterpolypeptid an ein G-Protein binden kann.