DE69022559T2

DE69022559T2 - Expression des rekombinanten Tumor-Nekrosisfaktor-Bindungsproteins I (TBP-I).

Info

Publication number: DE69022559T2
Application number: DE69022559T
Authority: DE
Inventors: Dan Aderka; Cord Brakebusch; Hartmut Engelmann; Oliver Kemper; Yaron Nophar; David Wallach
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1989-12-13
Filing date: 1990-12-13
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2010-12-14
Also published as: ATE128184T1; JPH0578396A; AU6803790A; DK0433900T3; ES2080098T3; EP0433900A1; EP0433900B1; GR3018123T3; AU642938B2; DE69022559D1; CA2032191A1; CA2032191C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das menschliche Tumornekrosefaktor(TNF)-Eindungsprotein I, nachstehend als TBP-I bezeichnet (= löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Typ I (sTNF-RI)), und insbesondere die Clonierung des Gens, das dieses Protein codiert, und seine Expression in eukaryotischen Wirtszellen.
TNF-α und TNF-ß (Lymphotoxin) sind strukturell verwandte Polypeptid-Cytokine, die hauptsächlich durch mononucleäre Leucocyten produziert werden und deren Wirkung auf die Zellfunktionen darin besteht, daß sie entscheidend an der Auslösung der entzündlichen Antwort beteiligt sind. Die TNFS beeinflussen die Zellen auf verschiedene Art und Weise, ihre Funktionsweise gleicht z.T. der anderer Entzündungsmediatoren, wie Interleukin-1 (IL-1) und Interleukin-6 (IL-6). Die auffallendste Wirkung der TNFs ist häufig eine Zell- und Gewebezerstörung. Immer mehr beweise sprechen dafür, daß eine Über-Induktion dieser zerstörerischen Wirkung an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt ist, aus diesem Grund besteht ein besonderes Interesse daran, den Mechanismus und die Regulation aufzuklären (Old, L. J., Sci. Am. 258 (1988), 41-49).
Rezeptoren mit hoher Affinität, an die sowohl TNF-α als auch TNF-β binden (Beutler, B. A., et al., J. Exp. Med. 161 (1985), 984-995), spielen bei der Initiation und der Kontrolle der durch diese Cytokine ausgelösten Antwort der Zelle eine entscheidende Rolle. Diese Rezeptoren werden auf der Oberfläche verschiedener Zellen exprimiert. Studien zeigen, daß Antikörper, die mit den extrazellulären Teilen reagieren, die Zellen in einer sehr ähnlichen Art und Weise beeinflussen wie die TNFs, diese Studien machen deutlich, daß die Rezeptoren und die mit ihnen assoziierten zellulären Komponenten ausreichen, um die intrazelluläre Signalübertragung auszuführen, wodurch die Wirkung der TNFs erhalten wird (Espevik, T., et al., J. Exp. Med. 171 (1990), 415-426).
Andere Studien haben gezeigt, daß Moleküle, die mit den TNF-Rezeptoren verwandt sind (TNF-Rs), auch in löslichen Formen vorliegen. Zwei immunologisch verschiedene Spezies solcher löslicher TNF-Rs wurden kürzlich aus menschlichem Urin isoliert und als TNF-Bindungsproteine I und II oder TBP-I und TBP-II bezeichnet (Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 11974-11980; Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 1531-1536; Olsson, I., et al., Eur. J. Haematol. 42 (1989), 270-275; Seckinger, P., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989a), 11966-11973). Immunologische Untersuchungen zeigten, daß die zwei Proteine strukturell mit zwei Zelloberflächen- TNF-Rs mit bestimmten Molekülstrukturen (den Typ I- bzw. Typ II-Rezeptoren) verwandt sind. Es wurde gezeigt, daß Antikörper gegen die zwei löslichen Proteine die Bindung von TNF an einen der beiden Rezeptoren spezifisch blockieren und daß sie zur Immunfällung der Rezeptoren verwendet werden können. Außerdem wurde gefunden, daß Antikörper gegen eines der beiden löslichen Proteine (TBP-I) in Zellen, die die immunologisch kreuzreaktiven Zellrezeptoren exprimieren, die für TNF charakteristischen Effekte induzieren (Engelmann, H., et al., (1990), a.a.O.). Die löslichen Formen dieser Rezeptoren binden spezifisch TNF, wie auch die TNF-Rezeptoren auf der Zelloberfläche, und können somit die Bindung von TNF an Zellen stören. Man vermutet, daß sie physiologische Inhibitoren der TNF-Aktivität sind (Engelmann et al., (1989), a.a.O.; Olsson et al., (1989), a.a.O.; Seckinger et al., (1989a), a.a.O.).
Lösliche Formen der Zelloberflächenrezeptoren können entweder durch proteolytische Spaltung der Zelloberflächenform des Rezeptors oder durch einen anderen Mechanismus hergeleitet werden, der in zwei kürzlich veröffentlichten Studien vorgeschlagen wird, wobei die Clonierung der cDNAs für die IL-4- und IL-7-Rezeptoren beschrieben wird. In diesen Studien wurden die c-DNA-Clone isoliert, die die Rezeptoren in voller Länge codieren, außerdem wurden noch Clone isoliert, die verkürzte lösliche Formen dieser Rezeptoren codieren. Man vermutet, daß diese letzteren Clone von Transkripten stammen, die spezifisch lösliche Formen der Rezeptoren codieren, wobei diese Transkripte von denselben Genen transkribiert werden, die auch die Zelloberflächenformen codieren, nur daß sie hier anders gespleißt werden (Mosley, B., et al., Cell 59 (1989), 335-348; Goodwin, R. G. et al. Cell 60 (1990), 941-951).
Die molekulare Clonierung und Expression von menschlichen Typ I-TNF-Zelloberflächenrezeptoren wurde in zwei kürzlich veröffentlichen Studien beschrieben (Loetscher, H., et al., Cell 61 (1990), 351-359, Schall, T. J., et al., Cell 61 (1990), 361-370).
Die vorliegende Erfindung betrifft die Produktion von menschlichem TBP-I nach einem Verfahren, umfassend die Transfektion von eukaryotischen Zellen, vorzugsweise CHO-Zellen, mit einem Expressionsvektor, der ein DNA-Molekül enthält, welches den vollständigen menschlichen TNF-Rezeptor Typ I codiert (TNF-RI), die Züchtung der transfizierten eukaryotischen Zellen und die Isolierung von TBP-I aus dem Medium. Wenn man das vollständige DNA-Molekül einsetzt, erzeugen die transfizierten Zellen zusammen mit dem Zelloberflächenrezeptor auch lösliche Proteine und sezernieren sie ins Medium.
Figur 1 zeigt die Nucleotidsequenz der Typ I-TNF-Rezeptor-cDNA und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des codierten Proteins.
(A) zeigt die zum Absuchen der cDNA verwendeten Sonden, wobei: (a) die NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz von TBP-I darstellt; (b) synthetische Oligoncleotidsonden zeigt, die auf der Basis der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz konstruiert wurden und die für das erste Absuchen verwendet wurden; und wobei
(c) und (d) Sonden sind, die mit (b) überlappen, die verwendet wurden, um die Richtigkeit der beim ersten Absuchen isolierten Clone zu bestätigen.
(B) zeigt eine schematische Darstellung der cDNA-Clone, die aus einer menschlichen Colon(C2)- und aus CEM-Lymphocyten(E13)-Genbanken isoliert wurden und ein Diagramm der vollständigen cDNA-Struktur. Untranslatierte Sequenzen werden durch eine Linie dargestellt. Codierende Regionen sind min Kästchen umrandet. Die schattierten Abschnitte zeigen die Sequenzen, welche die Signalpeptid- und die Transmembranbereiche codieren.
(C) zeigt das Hydropathie-Profil der vorausgesagten Aminosäuresequenz des TNF-Rezeptors. Die Werte für Hydrophobie (über der Linie) und Hydrophilie (unter der Linie) wurden bestimmt, hierfür wurde das Softwarepaket für die Sequenzanalyse der Universität Wiscontin, Genetic Computer Group, (UWCG) gemäß Kyte und Doolittle (1982), verwendet. Die Kurve stellt den durchschnittlichen Hydropathie-Index für jeden Rest über einem Fenster von neun Resten dar.
(D) zeigt die Nucleotidsequenz und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des Typ I-TNF-Rezeptors. Die mutmaßlichen Start- und Stopp-signale sind durch Sternchen, die drei von TBP-I hergeleiteten Sequenzen durch eine darüberstehende gestrichelte Linie, die Transmembran- und Leaderbereiche durch Kästchen mit abgerundeten Ecken und die vier repetitiven Sequenzen im extrazellulären Bereich durch dickes Unterstreichen gekennzeichnet. Cysteinreste sind durch Kästchen hervorgehoben. Glykosylierungsstellen sind durch eine darüberstehende Linie gekennzeichnet, das mutmaßliche Polyadenylierungssignal ist unterstrichen.
Figur 2 zeigt den Nachweis von Typ I-TNF-R unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gegen TBP-I in mit E13-cDNA transfizierten CHO-Zellen.
CHO-Zellen, die Clone R-18 (transfiziert mit einem Expressionsvektor, in welchem die E13-cDNA unter Kontrolle eines SV40-Promotors stand) und C-6 (Kontrolle; ein Clon von Zellen, transfiziert mit einem Expressionvektor, in welchem E13 in umgekehrter Richtung eingefügt war) und HeLa-Zellen wurden mit den monoclonalen Anti-TBP-I-Antikörpern 17, 18, 20 und 30 gefärbt, wobei sie anschließend mit FITC-konjugiertem Anti-Maus- F(ab) inkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensität wurde mit der Fluoreszenzintensität verglichen, die beobachtet wurde, wenn im ersten Schritt der Färbung ein monoclonaler Maus-Antikörper gegen TNF als Kontrolle verwendet wurde.
Figur 3 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC der löslichen Form von Typ I-TNF-R, erzeugt in CHO-Zellen.
Ein Konzentrat des konditionierten Mediums der CHO-R18- Clone (vgl. Fig. 2) und ein Konzentrat des CHO-C-6-Clons, versetzt mit 3 ng reinem TBP-I, wurden auf eine Aquapore RP300- Säule aufgetragen. Die Elution wurde mit einem Acetonitril- Gradienten in 0,3%iger wäßriger Trifluoressigsäure (---) durchgeführt. Mittels ELISA ( ) wurde der Proteingehalt () und der Gehalt an der löslichen Form des Typ I-Rezeptors in den Fraktionen getestet (wie in Beispiel 1, Verfahren, beschrieben). Keine der eluierten Fraktionen eines Konzentrates des CHO-C-6-Clons, bei dem kein TBP-I zugesetzt worden war, enthielt nachweisbare Mengen der löslichen Form des Rezeptors (nicht gezeigt).
Figur 4 stellt den zeitlichen Verlauf der Freisetzung von COOH-terminalen Aminosäuren aus TBP-I durch Carboxypeptidase Y dar.
Figur 5 zeigt die Konstruktion von Plasmid pSV-TBP, das die mit dem starken frühen SV40-Promotor fusionierte TBP-I-codierende DNA-Sequenz enthält.
Figur 6 zeigt die Konstruktion von Plasmid pCMV-TBP, das die mit dem Promotor des Cytomegalievirus (CMV) fusionierte TBP-I-codierende DNA-Sequenz enthält.
Aus menschlichem Urin isoliertes, gereinigtes TBP-I wurde in der Europäischen Patentanmeldung EP 0 308 378 der gleichen Anmelder beschrieben, wobei dieses Protein am N-Terminus die in Fig. 1Aa gezeigte Aminosäuresequenz aufwies.
Der COOH-Terminus von TBP-I wurde jetzt bestimmt, dabei wurde gezeigt, daß er eine Hauptfraktion, die die Sequenz Ile- Glu-Asn umfaßt, welche in Fig. 1D in den Positionen 178 bis 180 durch eine darüberstehende gestrichelte Linie gekennzeichnet ist, und mindestens eine kleinere Fraktion enthält, die mindestens zwei weitere Aminosäuren Val-Lys in den Positionen 181 bis 182 umfaßt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein I (TBP-I), biologisch aktiven Vorstufen und Analoga davon, umfassend:
i) Transfektion eukaryotischer Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein den vollständigen menschlichen Typ I-TNF- Rezeptor codierendes DNA-Molekül enthält, und
ii) Züchtung der transfiziercen Zellen, wobei das gewünschte Protein erzeugt und ins Medium sezerniert wird.
Die DNA-Sequenz&sub1; die den vollständigen Typ I-TNF-Rezeptor codiert, ist in Figur 1D dargestellt. Die lösliche Domäne davon umfaßt die Sequenz bis zu Position 180 (Asn) oder 182 (Lys) oder auch noch einige weitere Aminosäuren hinter der Position 182.
Die menschlichen TBP-I-Proteine, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren von transfizierten Zellen erzeugt und ins Medium sezerniert werden, können am N-Terminus die Sequenz Asp-Ser-Val aufweisen, die in Fig. 1D (TBP-I) in den Positionen 9 bis 11 durch eine darüberstehende gestrichelte Linie gekennzeichnet ist, oder sie können die Sequenz Leu-Val-Pro in den Positionen 9 bis 11 oder Ile-Tyr-Pro in den Positionen 1 bis 3 oder eine beliebige andere Sequenz zwischen Ile(+1) und Asp(20) aufweisen. Die Proteine können am COOH-Terminus eine der vorstehenden Sequenzen enthalten. Alle diese menschlichen TBP-I-Proteine sind, sofern sie eine biologische Aktivität besitzen, die der von TBP-I ähnlich ist, als Vorstufen und Analoga von TBP-I in der Erfindung eingeschlossen.
Gemäß der Erfindung wurden Oligonucleotidsonden, die anhand der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz von TBP-I konstruiert wurden, nach bekannten Verfahren synthetisiert und zum Absuchen von cDNA-Genbanken auf die TBP-I-codierende cDNA verwendet. In einer menschlichen Colon-cDNA-Genbank wurde eine C2-cDNA-Insertion gefunden, die mit den Sonden hybridisierte, diese wurde für das weitere Absuchen einer menschlichen CEM- Lymphocyten-Lambda-ZAP-cDNA-Genbank eingesetzt, wodurch die in Fig. 1D gezeigte cDNA erhalten wurde.
Die DNAs der positiven Clone wurden sodann nach Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, in entsprechend konstruierte Expressionsvektoren eingefügt. Damit ein Expressionsvektor ein gewünschtes Protein exprimieren kann, sollte er auch spezifische Nucleotidsequenzen umfassen, die transkriptionale und translationale regulatorische Informationen enthalten und die mit der das gewünschte Protein codierenden DNA in solcher Art und Weise gekoppelt sind, daß die Expresssion des Gens und die Produktion des Proteins zustandekommt. Dem Gen muß ein Promotor vorangestellt sein, damit es transkribiert wird. Hierfür werden verschiedene Promotoren verwendet, deren Wirksamkeit unterschiedlich ist (starke und schwache Promotoren).
Das DNA-Molekül, umfassend die Nucleotidsequenz, die ein die Aminosäuresequenz von TBP-I enthaltendes Protein codiert, d.h. TBP-I, eine Vorstufe oder ein Analogon davon, mit einer davorstehenden Nucleotidsequenz eines Signalpeptids und den funktionell verbundenen transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signalen, wird in einen Vektor eingefügt, der befähigt ist, die gewünschten Gensequenzen in das Chromosom der Wirtszelle einzubauen. Die Zellen, bei denen die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen eingebaut ist, können sodann selektiert werden, indem man außerdem einen oder mehrere Marker einführt, die die Selektion der den Expressionsvektor enthaltenden Wirtszellen ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das eingeführte DNA-Molekül in ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingebaut, der sich im Empfängerwirt autonom replizieren kann. Wichtige Faktoren zur Selektion eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors umfassen die Fragen, wie einfach die den Vektor enthaltenden Empfängerzellen erkannt und von den den Vektor nicht enthaltenden Empfängerzellen selektiert werden können, wie groß die Kopienzahl des Vektors ist, die in einem bestimmten Wirt gewünscht wird, und ob es wünschenswert ist, daß der Vektor als Shuttlevektor in Wirtszellen verschiedener Arten eingesetzt werden kann. Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, die das (die) Konstrukt(e) enthält, für die Expression vorbereitet wurde, kann (können) das (die) DNA-Konstrukt(e) in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, wobei ein beliebiges Verfahren verwendet werden kann, z.B. Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphatfällung, direkte Mikroinjektion usw.
Die eukaryotischen Wirtszellen werden erfindungsgemäß mit Plasmiden transfiziert, welche die cDNA umfassen, die den vollständigen Typ I-TNF-Rezeptor codiert. Bevorzugte eukaryotische Wirte sind Säugerzellen, z.B. Zellen von Menschen, Affen, Maus und Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen). Sie stellen, zusätzlich zum Zelloberflächenrezeptor, die lösliche Form des Proteins bereit und führen posttranslationale Modifikationen der Proteinmoleküle durch, einschließlich korrekte Faltung oder Glykosylierung an den richtigen Stellen. Bevorzugte erfindungsgemäße Säugerzellen sind die CHO-Zellen.
Nach der Einführung des Vektors werden die Wirtszellen in einem Selektivmedium gezüchtet, welches das Wachstum von Zellen selektiert, die den Vektor enthalten. Die Expression der cionierten Genseqzenz(en) führt zur Produktion des gewünschten löslichen Proteins, das ins Medium sezerniert wird und das anschließend durch ein herkömmliches Verfahren isoliert und gereinigt werden kann, z.B. Extraktion, Fällung, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die CHO-Zellen mit der in Fig. 1D dargestellten Typ I-TNF-R-cDNA transfiziert, sie produzieren dann sowohl den Zelloberflächenrezeptor als auch TBP-I, seine lösliche Form, und/oder Vorstufen und Analoga davon.
Die in der vorliegenden Anmeldung dargestellten Daten sind mit der Vorstellung vereinbar, daß TBP-I - die lösliche Form von Typ I-TNF-R - ein Fragment der Zelloberflächenform dieses Rezeptors darstellt, welches der extrazellulären Domäne dieses Moleküls entspricht. Der Rezeptor wird von mehreren monoclonalen Antikörpern gegen TEP-I erkannt, die mit verschiedenen räumlich unterschiedenen Epitopen in diesem Protein interagieren. Die Aminosäuresequenz in der extrazellulären Domäne entspricht der Sequenz von TBP-I.
Besonders informativ zur Aufklärung des Mechanismus der Bildung von TBP-I ist der in der vorliegenden Erfindung beschriebene Befund, daß die mit der TNF-R-cDNA transfizierten CHO-Zellen eine lösliche Form des Typ I-TNF-R erzeugen. Hieraus kann man schließen, daß in den Zellen ein Mechanismus oder mehrere Mechanismen vorliegen, mit deren Hilfe die lösliche Form des TNF-R aus dem gleichen Transkript hergestellt wird, das auch die Zelloberflächenform codiert.
Die niedrige Produktionsrate der löslichen Form des Typ I-TNF-R durch die E13-transfizierten CHO-Zellen spiegelt nicht unbedingt die maximale Aktivität wider. In HT29-Zellen findet die spontane Freisetzung einer löslichen Form von Typ I-TNF-R mit einer etwa 10-mal höheren Rate statt als beim CHO-R-18- Clon.
Die löslichen Formen von TNF-Rezeptoren lassen sich aus den gleichen Transkripten ableiten, die auch die Zelloberflächenformen codieren, der hierfür zuständige Mechanismus ist höchstwahrscheinlich eine proteolytische Spaltung. Tatsächlich liegen in der Aminosäuresequenz des Rezeptors, benachbart zum Aminosäurerest, der dem NH&sub2;-Terminus von TBP-I entspricht, zwei basische Aminosäurereste (Lys-Arg) vor, die als Spaltstelle für Trypsin-ähnliche Proteasen dienen können. Welche Proteasen die Spaltung am COOH-Terminus von TBP-I bewirken, ist bisher noch nicht bekannt.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlicher erläutert.

Beispiel 1

Verfahren

a) Bestimmung von Aminosäuresequenzen der TNF-Bindungsproteine TBP-I und TBP-II

Die TNF-Bindungsproteine TBP-I und TBP-II wurden aus konzentrierten Urinpropteinpräparaten isoliert, wobei Liganden- (TNF)-Affinitätschromatographie und anschließende Umkehrphasen-HPLC eingesetzt wurden, wie früher bereits beschrieben (Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 1531-1536). TBP-I wurde mit Cyanbromid gespalten, wodurch zwei Peptide erhalten wurden, die nach Reduktion und Alkylierung durch Umkehrphasen-HPLC isoliert wurden. Die NH&sub2;-terminalen Sequenzen der zwei Peptide (CNBr-1 und CNBr-2 in Tabelle I) wurden auf einem Puls-Flüssig-Gasphasen-Protein-Mikrosequenator (Modell 475A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) analysiert. Die Sequenz, die für eines der Peptide (CNBr-1) gefunden wurde, war mit der NH&sub2;-Sequenz des intakten TBP-I-Proteins identisch.
Die COOH-terminale Aminosäuresequenz von TBP-I wurde bestimmt, indem das Proteins mit Carboxypeptidase Y gespalten und anschließend die freigesetzten Aminosäuren nacheinander analysiert wurden. Eine Probe des reinen TBP-I (32 ug) wurde mit 1 nMol Norleucin als innerem Standard gemischt, gründlich getrocknet und in 8 ul 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5, enthaltend 0,8 ug Carboxypeptidase Y (Sigma, St. Louis, MO), resuspendiert. Die Spaltung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Aliquots zu je 2 ul, die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen wurden, wurden sodann durch Zusatz von jeweils 3 ul 10 % Essigsäure angesäuert und anschließend mit 15 ul 0,5 % EDTA versetzt. Sodann wurden sie einer automatischen Aminosäureanalyse unterworfen (Applied Biosystems, U.K., Modell 420A) . Die Ergebnisse (dargestellt in Fig. 4) zeigen die Sequenz -Ile-Glu-Asn-COOH. Außerdem wurden noch kleinere Fraktionen nachgewiesen, die zwei oder mehrere weitere Aminosäuren enthielten.
Sequenzen von TBP-II wurden bestimmt, indem tryptische Peptide dieses Proteins hergestellt wurden. Eine Probe des reinen TBP-II (200 ug) wurde reduziert, alkyliert und erneut auf einer Aquapore RP-300 Umkehrphasen-HPLC-Säule gereinigt. Die Fraktionen, welche das modifizierte Protein enthielten, wurden vereinigt und der pH-Wert mit NaHCO&sub3; auf eine Wert von 8,0 eingestellt. Die Spaltung mit TPCK-Trypsin (238 E/mg, Millipore Corp., Freehold, NJ) wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur und einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:20 (Gew./Gew.) durchgeführt. Das Spaltprodukt wurde auf eine C&sub1;&sub8;-RP-P-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Synchrom, Linden, IN) aufgetragen und die Peptide mit einem linearen Acetonitril-Gradienten von 0 bis 40 % in wäßriger 0,3%iger Trifluoressigsäure aufgetrennt. Die NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenzen der Peptide und des intakten Proteins (N-Terminus) sind in Tabelle I dargestellt. Die Peptide wurden entsprechend der Reihenfolge ihrer Elution von der RP-P-Säule durchnumeriert. In den mit 39, 44, 46, 53 und 54 bezeichneten Fraktionen, in denen die Sequenzen eine Heterogenität zeigten, sind sowohl die Hauptsequenzen als auch die sekundären Sequenzen dargestellt.

b) Isolierung von cDNA-Clonen

Drei Gemische aus synthetischen Oligonucleotidsonden (Fig. 1Ab und 1Ac) wurden für das Absuchen der cDNA-Genbanken eingesetzt, diese Sonden wurden aus der Nucleotidsequenz hergestellt, die aus der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz von TBP-I abgeleitet wurde (Fig. 1Aa). Die ersten Absuchschritte wurden mit 48-fach degenerierten Sequenzen mit 26 Nucleotiden durchgeführt, in die Desoxyinosin eingeführt war, wo immer aufgrund der Mehrdeutigkeit der Codons alle vier Nucleotide möglich waren (Fig. 1Ab). Die Richtigkeit der positiven Clone wurde untersucht, indem ihre Hybridisierung mit zwei gemischten Nucleotidsequenzen mit 17 Nucleotiden getestet wurde, enthaltend 96 und 128 Degenerationen, entprechend zwei überlappenden Aminosäuresequenzen, die einen Teil der den 26-Basen-Sonden entsprechenden Sequenzen ausmachen (Fig. 1Ac und d). Ein weiteres Absuchen von cDNA-Genbanken auf einen cDNA- Clon in voller Länge wurde mit Hilfe einer Oligonucleotidsonde durchgeführt, die einer Sequenz entsprach, die nahe beim 5'- Terminus des längsten der partiellen cDNA-Clone lag, die mit den degenerierten Sonden isoliert worden waren (Nucleotide 478 bis 458 in Fig. 1D). Die ³²P-Markierung der Sonden, die Verwendung von T4-Polynucleotidkinase, die Plattierung der Phagen in Bakterienrasen, das Absuchen mit den radioaktiv markierten Sonden, die Isolierung der positiven Clone und die Subclonierung ihrer cDNA-Insertionen wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt (Sambrook, J., et al., (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press).

c) Nucleotid-Sequenzierung der cDNA-Clone

Die cDNA-Insertionen, die aus positiven rekombinanten Lambda-GT11-Phagen isoliert wurden, wurden in den pBluescript KS(-)-Vektor subcloniert. Die in Lambda-ZAP-Phagen gefundenen Insertionen wurden entnommen, indem das Plasmid pBluescript SK(-) ausgeschnitten wurde, wobei der Helferphage R408 verwendet wurde (Short, J. M., et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 7583-7600). Die DNA-Sequenzierung in beiden Richtungen wurde nach dem Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren durchgeführt. Überlappende Deletionsclone der cDNAs wurden in beiden Richtungen hergestellt, indem die cDNA mit Exonuclease III gespalten wurde ("Erase a base" Kit, Promega Biotec, Madison, WI). Einzelsträngige Matrizen, die aus diesen Clonen unter Verwendung des Phagen R408 abgeleitet wurden, wurden mittels eines T7- DNA-Polymerase-Sequenzierungssystems (Promega) sequenziert.

d) Konstitutive Expression von menschlichem Typ I-TNF-R in CHO-Zellen

Die E13-Insertion wurde in eine modifizierte Version des pSVL-Expressionsvektors eingeführt. Dieses Konstrukt wurde zusammen mit dem pSV2-DHFR-Plasmid, das die DHFR-cDNA enthält, in DHFR-defiziente CHO-Zellen transfiziert, wobei das Verfahren der Calciumphosphat-Fällung verwendet wurde. Die Transfektion mit einem rekombinanten pSVL-Vektor, der die E13-Insertion in umgekehrter Richtung enthielt, diente als Kontrolle. Zellen, die das DHFR-Gen exprimierten, wurden selektiert, indem sie in nucleotidfreiem MEM-alpha-Medium gezüchtet wurden, das fetales Kälberserum enthielt, das gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert worden war. Einzelne Clone wurden herausgegriffen und anschließend für die Amplifikation der transfizierten cDNAs durch Züchtung in Gegenwart von 500 nM Natriummethotrexat weiter selektiert.

e) Nachweis des auf der Oberfläche exprimierten Typ I-TNF-R in den CHO-Zellen

Die Bindung von radioaktiv markiertem menschlichem rTNF an Zellen (ausgesät in 15 mm-Gewebekulturschalen mit einer Dichte von 2,5 x 10&sup5; Zellen/Schale) wurde quantitativ bestimmt, wie bereits beschrieben (Holtmann, H. und Wallach, D., J. Immunol. 139 (1987), 1161-1167).
Um die Bindung der monoclonalen Antikörper gegen TBP-I an CHO-Zellen feststellen zu können, wurden die Zellen durch Inkubation in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS: 140 mM NaCl, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 8 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 2,7 M KCl, 0,5 M MgCl&sub2;, 0,9 M CaCl&sub2;), enthaltend 5 mM EDTA, abgelöst und anschließend 45 Minuten bei 0ºC mit 50 ug/ml des monoclonalen Testantikörpers in PBS, enthaltend 0,5 % Rinderserumalbumin und 15 mM Natriumazid (PBS/BSA), inkubiert. Die Zellen wurden nach dem Waschen mit PBS/BSA weitere 30 Minuten bei 0ºC mit FITC-markiertem, affinitätsgereinigtem Ziegenantikörper gegen das F(ab)-Fragment von Maus-IgG (1:20 in PBS/BSA) (Bio-Makor, Israel) inkubiert, anschließend wurde die Intensität der Fluoreszenz in Proben mit jeweils 10&sup4; Zellen bestimmt, wobei der Fluoreszenz- aktivierte Cellsorter 440 von Becton Dickinson eingesetzt wurde. Drei monoclonale Antikörper gegen TBP-I, die Clone 17, 18 und 20, für die durch Kreuz-Kompetitions-Analyse gezeigt wurde, daß sie drei räumlich unterschiedene Epitope im TBP-I- Molekül erkennen (Europäische Patentanmeldung Nr. 90115105.0), und als Kontrolle ein monoclonaler Antikörper gegen TNF-α wurden verwendet (alle Antikörper wurden durch Ammoniumsulfatfällung aus Ascitesflüssigkeiten gereinigt und waren vom IgG2- Isotyp).

f) Quantitative Bestimmung der löslichen Form des Typ I-TNF- R durch ELISA

Ein empfindlicher Enzyme-linked Immunosorbent Assay wurde eingesetzt, hierfür wurden TBP-I-spezifische monoclonale und polyclonale Antikörper in Sandwich-Technik verwendet. Immunglobuline des monoclonalen Amti-TBP-I-Antikörpers Clon 20 (Europäische Patentanmeldung Nr. 90115105.0) wurden an ELISA- Platten mit 96 Vertiefungen (Maxisorp, Nunc, Dänemark) adsorbiert, indem die Platten zwei Stunden bei 37ºC mit einer Lösung von 25 ug/ml des Antikörpers in PBS inkubiert wurden. Die Vertiefungen wurden sodann mit einer Lösung, die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 1 % BSA, 0,02 % NaN&sub3; und 0,05 % Tween 20 enthielt (Blockierungslösung), versetzt und wieder zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, um weitere unspezifische Bindung von Protein zu blockieren, anschließend wurden jeweils 50 ul der Testproben pro Vertiefung zugegeben. Sodann wurden die Platten zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, dreimal mit PBS, angereichert mit 0,05 % Tween 20 (Waschlösung), gespült und sodann die Vertiefungen mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum gegen TBP-I, 1:500 verdünnt mit Blockierungslösung, versetzt. Nach einer weiteren Inkubation von 12 Stunden bei 4ºC wurden die Platten erneut gespült und zwei Stunden mit Meerrettich- Peroxidase-konjugiertem gereinigtem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG inkubiert. Zur Entwicklung des Tests wurde als Substrat 2,2'- Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma) verwendet. Das Produkt der Enzymreaktion wurde kolorimetrisch bei 600 nm bestimmt. Reines TBP-I diente als Standard.

g) Nachweis einer löslichen Form des Typ I-TNF-R im Wachstumsmedium der transfizierten CHO-Zellen und dessen Analyse durch Umkehrphasen-HPLC

Die Menge der löslichen Form von Typ I-TNF-R in den Proben des Mediums der getesteten CHO-Zellen wurde durch den vorstehend beschriebenen Immuntest bestimmt, wobei das Medium 48 Stunden nach einem Mediumaustausch entnommen wurde. Zur Analyse des löslichen Rezeptors durch Umkehrphasen-HPLC wurden die CHO-Zellen 48 Stunden in serumfreiem Medium (nucleotidfreies MEM-α) gezüchtet. Die Mediumproben wurden durch Ultrafiltration mit einer Amicon PM5-Membran 100-fach eingeengt, anschließend wurden Aliquots zu jeweils 100 ul auf eine Aquapore RP300-Säule (4,5 × 30 mm, Brownlee Labs) aufgetragen, die mit wäßriger 0,3%iger Trifluoressigsäure voräquilibriert worden war. Die Säule wurde solange mit dieser Lösung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine entfernt waren, und sodann mit einem Acetonitril-Gradienten in wäßriger 0,3%iger Trifluoressigsäure eluiert, wie vorher beschrieben (Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 11974-11980). Fraktionen zu jeweils 0,5 ml wurden gesammelt und nach Einengung unter vermindertem Druck mit 1 M HEPES-Puffer, pH 9,0, neutralisiert. Die Menge des löslichen Typ I-TNF-R in den Fraktionen wurde durch ELISA und die Proteinkonzentration durch das Fluorescamin-Verfahren bestimmt.

Beispiel 2

a) Clonierung der cDNA für den Typ I-TNF-R

Die Clonierung der cDNAs, welche das TNF-Bindungsprotein TBP-I und den damit verwandten TNF-Rezeptor codieren, wurde durchgeführt, indem mehrere cDNA-Genbanken abgesucht wurden, wobei drei überlappende Oligonucleotidsonden verwendet wurden, die anhand der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz von TBP-I konstruiert wurden (Fig. 1A). In einer Lambda-GT11-Genbank, hergeleitet aus mRNA von menschlichem Colon (hergestellt mit Zufalls-Primer geprimt, Clontech, Palo Alto, CA), wurden vier rekombinante Phagen nachgewiesen, die mit den drei Sonden hybridisierten. Die Insertionen in diesen vier Phagen wiesen eine ähnliche Größe auf und überlappten sich, letzteres wurde bei der Restriktionskartierung und der Sequenzanalyse deutlich.
Die vollständige Sequenzanalyse der längsten der vier Sequenzen (C2 in Fig. 1B, hinterlegt am 06.12.1989 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (C.N.C.M.), Paris, France, Hinterlegungsnummer I-917) zeigte ein offenes Leseraster, das sich über die gesamte Länge erstreckte. Eine in diesem Leseraster codierte Polypeptidkette stimmt vollständig mit der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz von TBP-I überein. In der C2-Insertion wurde weder ein Initiations- noch ein Stopp-Codon gefunden. Ein erneutes Absuchen der Colon-cDNA- Genbank unter Verwendung einer anderen Sonde, die einer in C2 vorliegenden Sequenz entsprach (vgl. Beispiel 1, Verfahren), ergab mehrere andere rekombinante Phagen, die Insertionen enthielten, welche mit der C2-Insertion überlappten. Jedoch lieferte keine davon weitere Informationen über die Sequenz der cDNA in 5'- oder 3'-Richtung. In einer Lambda-ZAP-cDNA- Genbank, die von der mRNA von CEM-Lymphocyten hergeleitet war (Oligo-dT und hergestellt mit Zufalls-Primer randomisiert geprimt, Clontech), wurden fünf Phagen nachgewiesen, die mit dieser Sonde hybridisierten und die deutlich längere Insertionen als C2 enthielten.
Die längste Insertion (E13, Fig. 1B) wurde in ihrer Gesamtheit sequenziert (Fig. 1D), dabei zeigte sich, daß sie die C2-Sequenz (Nucleotide 346-1277 in Fig. 1B) innerhalb eines langen offenen Leserasters von 1365 Bp enthielt, flankiert von untranslatierten Bereichen von 255 und 555 Nucleotiden an ihrem 5'- bzw. 3'-Ende. Vor der potentiellen ATG-Initiationsstelle, die sich in Position 256 bis 258 der Nucleotidsequenz findet (in Fig. 1D mit einem Sternchen gekennzeichnet), liegt stromaufwärts im Raster bei den Basen 244 bis 246 ein Terminationscodon. Die Startstelle stimmt mit einer der möglichen Alternativen für die Translationsinitiations-Consensus-Sequenz überein (GGCATGG, Nucleotide 253 bis 259).
In der Nähe des 3'-Endes der cDNA befindet sich kein charakteristisches Poly(A)-Additionssignal. Die Sequenz ACTAAA der Nucleotide 2045 bis 2050 könnte als Alternative für dieses Signal dienen, wobei jedoch die Wirksamkeit nur gering ist. Bei den Nucleotiden 1965 bis 2000 liegen sechs aufeinanderfolgende Wiederholungen der Sequenz G(T)n vor (wobei n zwischen 4 und 8 liegt).
Das durch die cDNA codierte Protein (etwa 50 kD) ist signifikant größer als TBP-I. Die Computerauswertung des Hydropathie-Index der abgeleiteten Aminosäuresequenz (Fig. 1C) zeigte zwei hydrophobe Hauptbereiche (vgl. die Kästchen mit abgerundeten Ecken in Fig. 1D). Einer davon liegt am NH&sub2;- Terminus und stellt offensichtlich das Signalpeptid dar, dessen Spaltstelle höchstwahrscheinlich zwischen dem Glycin- und dem Isoleucinrest liegt, die in Fig. 1D mit -1 bzw. +1 bezeichnet sind. Die andere hydrophobe Hauptdomäne befindet sich zwischen den Resten 191 und 213 und ist an beiden Enden von mehreren geladenen Aminosäuren flankiert, die für eine Membranankerregion charakteristisch sind. Auf die hydrophobe Domäne folgen an deren COOH-Terminus basische Aminosäuren, wie bei mehreren anderen Transmembranproteinen auch. Die Transmembrandomäne teilt das vorausgesagte Protein in zwei fast gleich große Domänen, eine extrazelluläre und eine intrazelluläre Domäne.
Die extrazelluläre Domäne enthält drei mutmaßliche Stellen für eine Asparagin-gekoppelte Glykosylierung (in Fig. 1D durch eine darüberstehende Linie gekennzeichnet). Wenn man annimmt, daß die Oligosaccharid-Menge in der extrazellulären Domäne ähnlich ist wie beim TBP-I (Seckinger, P., et al., Cytokine I 149 (1989b), (Abstract)), dann ist die Molekülgröße des reifen Protein der für den Typ I-Rezeptor bestimmten sehr ähnlich (etwa 58 kD) (Hohmann, H. P., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 14927-14934).

b) Merkmale der vorausgesagten Aminosäuresequenz des Typ I- TNF-R und Verwandtschaft mit der Struktur von TBP-I und TBP-II

Die Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des durch die E13-cDNA codierten Proteins stimmt vollständig mit verschiedenen Aminosäuresequenzen überein, die in TBP-I nachgewiesen wurden (Tabelle I). Die Aminosäuren 20 bis 32 entsprechen der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz von TBP-I (vgl. Fig. 1D und Fig. 1Aa), die Aminosäuren 178 bis 180 entsprechen dem COOH-Terminus von TBP-I und außerdem ist eine Sequenz, angrenzend an den ersten Methioninrest, der weiter stromabwärts im codierten Protein liegt mit der NH&sub2;-terminalen Aminosäuresequenz eines Cyanbromid-Spaltungsfragments von TBP-I identisch (gestrichelte Linien in Fig. 1D). Außerdem zeigen die Aminosäurezusammensetzung der extrazellulären Domäne des Rezeptors und die von TBP-I große Ähnlichkeit (Tabelle II).
Das hervorstechendste Merkmal dieser Aminosäurezusammensetzung ist ein sehr hoher Gehalt an Cysteinresten (in Fig. 1D durch Kästchen markiert). Die Lage der Cysteinreste und anderer Aminosäuren in der extrazellulären Domäne zeigt ein Muster mit viermaliger Wiederholung (in Fig. 1D unterstrichen). Die Aminosäuresequenz in der extrazellulären Domäne von TNF-R, die der COOH-terminalen Sequenz von TBP-I entspricht (vgl. Tabelle I und Fig. 4), liegt am COOH-Terminus der Cystein-reichen repetitiven Region. Die der NH&sub2;-terminalen Sequenz von TBP-I zugeordneten Sequenz entspricht einer Sequenz, die wenige Aminosäuren stromaufwärts des NH&sub2;-terminalen Endes dieses Bereichs (gestrichelte Linien in Fig. 1D) in der extrazellulären Domäne liegt.
Im Gegensatz zur Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen von TBP-I und der extrazellulären Domäne des Typ I-TNF-Rezeptors waren die in der löslichen Form des Typ II-TNF-R nachgewiesenen Sequenzen (TEP-II, Tabelle I) nicht identisch mit einer beliebigen Sequenz von Typ I-TNF-R. Diesen Befund hatte man erwartet, da zwischen den zwei Rezeptoren keine immunologische Kreuzreaktivität vorlag (Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 1531-1536).
Im Gegensatz zu dem sehr hohen Gehalt an Cysteinresten in der mutmaßlichen extrazellulären Domäne des Typ I-TNF-R liegen in der intrazellulären Domäne nur fünf Cysteinreste vor. Zwischen den zwei Cysteinresten, die sehr nahe an der Transmembrandomäne liegen (Positionen 227 und 283), erstrecken sich 55 Aminosäuren, die reich an Prolinresten (15 % der Reste) und noch reicher an Serin- und Threoninresten (36 %) sind, von denen die meisten sehr nahe beieinander oder direkt nebeneinander liegen.

Beispiel 3

Expression der Typ I-TNF-R-cDNA

Die Verwandtschaft zwischen dem durch die E13-cDNA codierten Protein und TBP-I wurde weiter erforscht, zu diesem Zweck wurde dieses Protein in CHO-Zellen exprimiert. Die E13- cDNA wurde in einen Expressionsvektor eingeführt und zusammen mit einem rekombinanten Vektor, der die Dihydrofolat-Reductase(DHFR)-cDNA enthielt, in DHFR-defiziente Zellen transfiziert. Nach Selektion durch Züchtung in einem nucleotidfreien Medium wurden einzelne Clone amplifiziert, indem sie in Gegenwart von Methotrexat gezüchtet wurden. Mehrere Clone wurden nachgewiesen, die mit verschiedenen monoclonalen Antikörpern reagierten, welche an räumlich unterschiedene Epitope von TBP- I binden (Fig. 2). Die Expression des Proteins ging mit einem Anstieg der spezifischen Bindung von menschlichem TNF an die Zellen einher (Tabelle III).
Mit Hilfe eines empfindlichen Immuntests auf TBP-I, bei dem polyclonale Antikörper und ein monoclonaler Antikörper gegen dieses Protein eingesetzt wurden (Verfahren, Beispiel 1f), konnte im Medium der CHO-Zellen, welche den menschlichen TNF-R auf ihrer Oberfläche exprimierten, auch eine lösliche Form des Proteins nachgewiesen werden (Tabelle III). Alle fünf verschiedenen CHO-Clone, die den TNF-R exprimierten, erzeugten dieses lösliche Protein. Mehrere andere transfizierte Clone, die den Zelloberflächenrezeptor nicht exprimierten, erzeugten auch seine lösliche Form nicht. Bei der Analyse durch Umkehrphasen-HPLC eluierte der durch CHO-Zellen produzierte lösliche TNF-R als einzelner Peak mit der gleichen Retentionszeit wie TBP-I (Fig. 3).

Beispiel 4

Clonierung der TBP-I-codierenden cDNA und Expression von TBP-I in Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen)

Plasmide wurden hergestellt, die für eine wirkungsvolle Expression der DNA, die eine lösliche Domäne des Typ I-TNF- Rezeptors codiert, in Säugerzellen geeignet waren, hierfür wurde das Gen von Posititon 256 bis Position 858 der in Fig. 1D gezeigten DNA-Sequenz in zwei Expressionsvektoren cloniert: In einem Plasmid stand die Genexpression unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors, im zweiten Plasmid unter der Kontrolle des Cytomegalievirus(CMV)-Promotors. Diese Vektoren wurden durch Calciumphosphat-Co-Fällung zusammen mit einem Plasmid für DHFR als selektierbaren genetischen Marker in CHO- Zellen eingeführt.

Konstruktion von Exoressionsvektoren

1) Fusion des frühen SV40-Promotors mit TBP-I: Plasmid pSV- TBP

Die konstitutive Expression von TBP-I kann erreicht werden, indem ein Expressionvektor eingesetzt wird, der die TBP- I-codierende DNA-Sequenz enthält, welche mit dem starken frühen SV40-Promotor verknüpft ist (Fig. 5).
Schritt 1: Ein DNA-Fragment, das TPP-I codiert, einschließlich dessen Signalpeptid, und sich bis zu Aminosäure 180 erstreckte, wurde durch PCR-Amplifikation hergestellt. Für die Amplifikation wurden zwei Oligonucleotide als Primer verwendet: Der 5'-End-Primer enthält die Sequenz, die die ersten sieben Aminosäuren des Signalpeptids codiert, und davor noch sechs Nucleotide; das 3'-End-Oligonucleotid enthält die Sequenz, die die Aminosäurereste 174 bis 180 codiert, und anschließend noch zwei Stopp-Codons (TGA und TAA).
Die folgenden Bedingungen wurden bei der PCR-Amplifikation eingesetzt: Temperatur ºC Zeit Min. Zyklen Zyklus
Schritt 2: Die Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments wurde überprüft, sodann wurde es durch die Ligierung von glatten Enden in die HincII-Restriktionsstelle von Plasmid pGEM-1 cloniert. Auf diese Weise wurden zwei Plasmide erhalten, die Plasmide pTBP-16 und pTBP-17, sie unterscheiden sich in der Richtung der TBP-I-Insertion in Bezug auf den Clonierungsvektor.
Schritt 3: Das TBP-I-enthaltende DNA-Fragment wurde aus dem Plasmid pTBP-17 ausgeschnitten, wobei die zwei benachbarten Restriktionsstellen HindIII (am 5'-Ende) und BamHI (am 3'-Ende) genutzt wurden.
Schritt 4: Schließlich wurde dieses Fragment zwischen die HindIII- und die BclI-Restriktionsstelle des Expressionsvektors pSVE3 cloniert.
Das resultierende Plasmid wird mit pSV-TBP bezeichnet (Fig. 5).

2) Fusion des CMV-Promotors mit TBP-I: Plasmid pCMV-TBP

In einer anderen Ausführungsform kann eine konstitutive Expression von TBP-I erreicht werden, indem ein Expressionsvektor eingesetzt wird, der die TBP-I-codierende DNA-Sequenz enthält, welche mit dem CMV-Promotor verknüpft ist (Fig. 6).
Die ersten zwei Schritte der Konstruktion des Vektors auf CMV-Basis sind mit den Schritten identisch, die vorstehend für die Konstruktion des fusionierten SV40-TBP-I-Plasmids beschrieben wurden.
Schritt 3: Das TBP-I enthaltende DNA-Fragment wurde aus Plasmid pTBP-17 ausgeschnitten, wobei die zwei benachbarten Restriktionsstellen HindIII (am 5'-Ende) und XbaI (am 3'-Ende) genutzt wurden.
Schritt 4: Schließlich wurde dieses Fragment zwischen die HindIII- und die XbaI-Restriktionsstelle des Expressionsvektors Rc/CMV cloniert.
Das resultierende Plasmid wird mit pCMV-TBP bezeichnet.

Expression von menschlichem TBP-I in CHO-Zellen

Die CHO-Zellen CHO-K1 DHFR&supmin;, denen die DHFR-Aktivität fehlte, wurden durch Calciumphosphat-Co-Fällung zusammen mit einem 12:1-Gemisch aus ungespaltener pSV-TBP-DNA (73 ug) und mpSV2DHFR-DNA (6 ug) transformiert, wobei die letztere den selektierbaren Marker darstellte. In einer anderen Ausführungsform wurden die CHO-Zellen mit einem 5:1-Gemisch aus pCMV-TBP (30 ug) und mpSV2DHFR (6 ug) transformiert.
Die Zellen wurden in Nährmischung F12 (Gibco) mit 10 % Kälberserum (FCS) in 5 % CO&sub2; bei 37ºC gezüchtet. Zur DNA- Transfektion wurden 5 × 10&sup5; Zellen einen Tag in 9 cm-Schalen gezüchtet. Ein Calciumphosphat-DNA-Co-Niederschlag wurde hergestellt, indem die Plasmid-DNAs, die in 0,45 ml Tris-HCl, pH 7,9, 0,1 mM EDTA, gelöst waren, mit 0,05 ml 2,5 M CaCl&sub2; gemischt wurden; danach wurden unter vorsichtigem Mischen 0,5 ml 280 mM Na&sub3;PO&sub4;, 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,1, zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 bis 40 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, damit sich der Niederschlag bilden konnte. Nach Zugabe der Calciumphosphat-DNA zu den Zellen und 30-minütigem Stehenlassen der Zellen bei Raumtemperatur wurden 9 ml Nährmischung F12, 10 % FCS, zugegeben und die Kulturen vier Stunden in den CO&sub2;-Inkubator gestellt. Das Medium wurde entfernt und die Zellen mit 10 % Glycerin in F12 vier Minuten einem osmotischen Schock unterworfen. Nach 48 Stunden Züchtung in nicht-selektivem Medium wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in selektivem Medium 1:10 subkultiviert, wobei das Medium aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (H21, Gibco), 150 ug/ml Prolin und 10 % FCS zusammengesetzt war und gründlich gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert worden war. In einigen Fällen wurde MEM-alpha-Medium ohne Nucleotide (F20, Gibco) verwendet. Die Kulturen wurden bei 37ºC und 10 % CO&sub2; gehalten und das Medium wurde alle drei bis vier Tage ausgewechselt. Nach etwa 15 Tagen wurden die Clone isoliert, mit Trypsin behandelt und in Massenkulturen gezüchtet.
Transformanten wurden erhalten, die befähigt waren, in Medium ohne Thymidin (DMEM mit dialysiertem Serum) zu wachsen. Die Kulturüberstände einzelner Transfomanten-Clone oder der Kulturüberstand von gemischten Populationen wurden auf menschliches TBP-I abgesucht, indem der Spiegel des sezernierten Proteins durch den "Enzyme-linked Immunoassay" bestimmt wurde, der in Beispiel 1f beschrieben wird. In den Kulturüberständen von gemischten Zellpopulationen wurden TBP-I-Spiegel von bis zu 10 ng/ml nachgewiesen.
Dieses Beispiel zeigt, daß TBP-I oder ein ähnliches lösliches Protein auch erhalten werden kann, wenn man Säugerzellen mit einer DNA transfiziert, die die lösliche Domäne des Typ I-TNF-Rezeptors codiert.

Beispiel 5

Expression von TBP-I in E. coli

Zur Expression von TBP-I in E. coli muß die Sequenz entfernt werden, die das Signalpeptid und die ersten 19 Aminosäuren (Arg) codiert (Fig. 1D). Außerdem muß vor dem Asp-Rest ein Met-Rest stehen. Das gewünschte Fragment wird sodann in den Expressionsvektor pKK223-3 cloniert, der den hybriden tryp- lac-Promotor enthält. Um dies zu erreichen, wird Plasmid pTBP- 16 (Fig. 5) an den zwei einmalig vorliegenden Restriktionsstellen StyI und HindIII gespalten. Die Styl-Restriktionsstelle ist C/CAAGG und deshalb wird hinter Pro24 gespalten. Die HindIII-Restriktionsstelle liegt im Polylinker des Plasmids und stromabwärts der zwei angefügten Stopp-Codons, die auf Asn180 folgen (Fig. 5).
Das resultierende TBP-I-codierende DNA-Fragment hat ein intaktes 3'-Ende und ein verkürztes 5'-Ende, wobei die Sequenz entfernt worden ist, die vor der StyI-Stelle liegt und die Asp-Ser-Val-Cys-Pro codiert.
Für die Clonierung des StyI-HindIII-Fragments in den Expressionsvektor pKK223-3 wird das folgende synthetische Oligonucleotid-Paar verwendet:
Ein Ende dieses doppelsträngigen Oligonucleotids ist eine EcoRI-Restriktionsstelle Dieses Ende wird an die EcoRI-Stelle von Plasmid pKK223-3 ligiert, die stromabwärts des tryp-lac- Promotors liegt. Das zweite Ende des doppelsträngigen Oligonucleotids ist eine StyI-Restriktionsstelle, die mit der StyI- Stelle des TBP-I-DNA-Fragments ligiert wird.
Die restliche Sequenz sieht so aus, daß die Codons vorliegen, die die ersten fünf Aminosäuren codieren, und daß ein weiteres Met-Codon vor dem Asp20 angefügt ist. Der Expressionsvektor wird erhalten, indem das mit EcoRI und HindIII gespaltene Plasmid pKK223-3 mit dem doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotid und dem StyI-HindIII-TBP-I-Fragment ligiert wird.
E. coli-Zellen werden mit diesem Expressionsvektor transfiziert, so daß sie TBP-I erzeugen. Tabelle I Aminosäuresequenzen von TBP-I und TBP-II TBP I: CNBr- (=N-Terminus) C-Terminus TBP-II: N-Terminus Tabelle II Ähnlichkeit der Aminosäurezusammensetzung des TNF-Bindungsproteins TBP-I und der Aminosäurezusammensetzung eines entsprechenden Bereichs der extrazellulären Domäne des TNF-R (Typ I) Aminosäure Mol/100 Mol Aminosäuren TBP-I* Reste 20 bis 180 in der extrazellulären Domäne** * nach Olsson et al., 1989 ** Rest 20 entspricht der NH&sub2;-terminalen Aminosäure von TBP-I. Rest 180 ist der COOH-terminale Rest von TBP-I. Tabelle III Expression der Zelloberflächen- und der löslichen Formen des menschlichen Typ I- TNF-R in CHO-Zellen CHO-Zellen Spez. Bindung von TNF (cpm/10&sup6; Zellen) Zellen die menschl. Zelloberflächen-TNF-R exprimieren (% fluoresz. Zellen) menschl. lösl. Typ I-TNF-Rezeptoren (pg/ml) nicht-transfiziert
Die R-16- und R-18-clone bestehen aus Zellen, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor, enthaltend E13-cDNA, transfiziert sind. C-6-Zellen wurden mit einem Kontrollvektor transfiziert. Die Bindung von radioaktiv markiertem TNF an die Zellen wurde in fünffachen Proben bestimmt. Die immunreaktiven Rezeptoren auf der Zelloberfläche wurde unter Verwendung der kombinierten monoclonalen Anti-TBP-I-Antikörper 17, 18, 20 und 30 nachgewiesen. Die Ergebnisse sind als prozentualer Anteil der fluoreszierenden Zellen angegeben (Hintergrundwerte, die durch Färbung der Zellen mit einem monoclonalen Anti-TNF-Antikörper erhalten wurden, sind abgezogen).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem TBP-I (Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein I = löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Typ I (sTNF-RI)) umfassend:

(a) Transfektion eukaryotischer Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein den vollständigen menschlichen TNF-RI codierendes DNA-Molekül enthält;

(b) Züchtung der transfizierten eukaryotischen Zellen; und

(c) Isolierung des TBP-I aus dem Medium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das den vollständigen TypI-TNF-Rezeptor codierende DNA-Molekül die cDNA mit der in Figur 1D dargestellten Sequenz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die cDNA in einen Expressionsvektor eingefügt und mit einem rekombinanten, die Dihydrofolatreduktase (DHFR)-cDNA enthaltenden Vektor in DHFR-defiziente Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) cotransfiziert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen durch Wachstum in einem nucleotidfreien Medium selektioniert werden, einzelne Clone durch Wachstum in Gegenwart von Methotrexat amplifiziert werden und das in das Medium sezernierte TBP-I durch Reaktion mit gegen TBP-I gerichteten monoclonalen und/oder polyclonalen Antikörpern nachgewiesen wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das erhaltene TBP-I eine TBP-I-Vorstufe oder ein TBP-I-Analogon ist.