DE69016508T2

DE69016508T2 - Interleukin-7-Rezeptoren.

Info

Publication number: DE69016508T2
Application number: DE69016508T
Authority: DE
Inventors: Raymond G Goodwin; Linda S Park
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1989-06-15
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1995-09-14
Anticipated expiration: 2010-06-01
Also published as: US5543320A; US5264416A; IL94530A; IE66249B1; DK0403114T3; IL94530A0; NO914972D0; ATE118036T1; AU629958B2; EP0403114B1; CA2033082A1; JPH0347078A; NZ234048A; IE902158L; WO1990015870A1; NO914972L; IE902158A1; FI915911A0; DE69016508D1; EP0403114A1

Description

Diese Anmeldung entspricht einer Continuation-in-part der USSN Nr. 07/421201, eingereicht am 13.10.1989, noch anhängig, die eine Continuation-in-part der am 15.07.1989 eingereichten und nun fallengelassenen USSN Nr. 07/366910 ist.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Cytokinrezeptoren und insbesondere auf Interleukin-7-Rezeptoren.
Interleukin 7 (IL-7, auch bekannt als pre-B-Zellwachstumsfaktor und Lymphopoietin-1) ist ein endogenes sekretorisches Säugerprotein, das zum Induzieren der Proliferation von vom Knochenmark abgeleiteten Lymphozytenvorformen und -vorläufern fähig ist, einschließlich der spezialisierten Vorläufer, die als pre-B- Zellen bekannt sind. Von IL-7 wird auch angenommen, daß es zur Stimulation anderer Zelltypen fähig ist, beispielsweise T-Zellen und Megakaryozyten; das gesamte Repertoire von Zellen, die auf IL-7 reagieren können, ist jedoch bis jetzt nicht bekannt. Es ist wahrscheinlich, daß IL-7 auf eine Vielzahl von Zelltypen wirkt. Komplementäre DNA-Klone, die für IL-7 kodieren, sind kürzlich isoliert worden (Goodwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:302, 1989; Namen et al., Nature 333:571, 1988); sie erlauben die weitere strukturelle und biologische Charakterisierung von IL-7.
IL-7 initiiert seine biologischen Effekte auf Zellen, indem es an ein spezifisches IL-7-Rezeptorprotein bindet, das auf der Plasmamembran von IL-7-responsiven Zellen exprimiert sind. Wegen der Fähigkeit von IL-7, spezifisch an den IL-7-Rezeptor (IL-7R) zu binden, werden gereinigte IL-7R-Zusammensetzungen für diagnostische Tests auf IL-7 nützlich sein, sowie zum Erzeugen von Antikörpern gegen den IL-7-Rezeptor für die Verwendung zur Diagnose und Therapie. Zusätzlich können gereinigte IL-7-Rezeptorzusammensetzungen direkt in der Therapie zum Binden oder Abfangen von IL-7 verwendet werden, wodurch sie ein Mittel zum Regulieren der Immunaktivitäten dieses Cytokines bereitstellen. Um die strukturellen und biologischen Merkmale von IL-7R und die von IL-7R gespielte Rolle bei der Antwort von verschiedenen Zellpopulationen auf IL-7 oder andere Cytokinstimulierung zu untersuchen, oder um IL-7R effektiv für die Therapie, Diagnose oder im Test zu verwenden, sind gereinigte IL-7R-Zusammensetzungen erforderlich. Solche Zusammensetzungen sind jedoch in handhabbaren Ausbeuten nur durch Klonieren und Exprimieren der für den Rezeptor kodierenden Gene unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie erhältlich. Bemühungen, das IL-7R-Molekül für die Verwendung in der biochemischen Analyse zu reinigen oder zu klonieren und für IL-7R kodierende Säugergene zu exprimieren, sind durch den Mangel einer geeigneten Quelle für Rezeptorprotein oder mRNA behindert worden. Vor der vorliegenden Erfindung war von keiner Zellinie bekannt, daß sie hohe Spiegel IL-7R konstitutiv und kontinuierlich exprimierte, was die Reinigung des Rezeptors zur Sequenzierung oder die Konstruktion von Genbanken für die direkte Expressionsklonierung behinderte.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Sequenzen zur Verfügung, die für Interleukin-7-Rezeptoren (IL-7R) aus Säugern oder Untereinheiten davon kodieren. Solche DNA-Sequenzen werden bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus (a) cDNA-Klonen mit einer von der kodierenden Region eines nativen IL-7R-Genes abgeleiteten Nukleotidsequenz, (b) DNA-Sequenzen, die mit den cDNA-Klonen von (a) unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren können und für biologisch aktive IL-7R-Moleküle kodieren und (c) DNA- Sequenzen, die als Folge des genetischen Kodes eine Degeneration der in (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen darstellen und für biologisch aktive IL-7R-Moleküle kodieren, besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem rekombinante Expressionsvektoren zur Verfügung, die die oben definierten DNA-Sequenzen umfassen, rekombinante IL-7R-Moleküle, die unter Verwendung rekombinanter Expressionsvektoren erzeugt werden, und Verfahren zum Erzeugen der rekombinanten IL-7R-Moleküle unter Verwendung von Expressionsvektoren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter im wesentlichen homogene oder gereinigte Proteinzusammensetzungen, die IL-7R aus Säugern umfassen, zur Verfügung. Bevorzugte IL-7R-Proteine sind lösliche Formen des nativen Rezeptors. Lösliche Rezeptoren sind verkürzte Proteine, in denen die Bereiche des Rezeptormoleküles, die für die IL-7-Bindung nicht erforderlich sind, deletiert worden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen zur Verwendung in der Therapie, Diagnose oder dem Test auf IL-7R oder für die Erzeugung von Antikörpern gegen IL-7R zur Verfügung, wobei die Zusammensetzungen wirksame Mengen eines löslichen nativen oder rekombinanten Rezeptorproteines umfassen, das entsprechend den zuvor erwähnten Verfahren hergestellt wird. Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angehefteten Zeichnungen offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt Restriktionskarten von cDNA-Klonen, die kodierende Bereiche für die gesamten oder für Teile der Human- und Maus-IL- 7R-Proteine enthalten.
Figuren 2A-2C zeigen die cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Human-IL-7R-Klones H20. Die Nukleotide sind von Beginn der 5'-untranslatierten Region numeriert. Aminosäuren sind vom Beginn der Signalpeptidsequenz numeriert. Die mutmaßliche Signalpeptidsequenz wird durch die Aminosäuren an Position -20 bis -1 dargestellt. Der Glutaminsäurerest, der den mutmaßlichen N-Terminus der reifen Sequenz darstellt, ist an Position 1 der Proteinsequenz unterstrichen. Die mutmaßliche Transmembranregion bei den Aminosäuren 220 bis 244 ist ebenfalls unterstrichen.
Die Figuren 3A-3B zeigen die cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Human-IL-7R-Klones H6. Klon H6 ist ein alternatives RNA-Spleiß-Konstrukt, von dem angenommen wird, das es für ein natives lösliches IR-7R-Protein kodiert. Nukleotide und Aminsäuren sind wie in den Figuren 2A-2C numeriert und identifiziert.
Die Figuren 4A-4C zeigen die cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz eines hybriden Maus-IL-7R-Klones, abgeleitet von den Mausklonen P1 und P2, wie in Beispiel 4 beschrieben. Nukleotide und Aminosäuren sind wie in den Figuren 2A-2C und 3A-3B numeriert und identifiziert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Definitionen

So wie sie hier verwendet werden, beziehen sich die Ausdrücke "IL-7-Rezeptor" und "IL-7R" auf Proteine mit Aminosäuresequenzen, die den nativen Interleukin-7-Rezeptor-Aminosäuresequenzen aus Säugern, die in den Figuren 2-4 offenbart sind, im wesentlichen ähnlich sind, und die biologisch aktiv sind, wie unten definiert, so daß sie Interleukin-7(IL-7)-Moleküle binden können oder ein biologisches Signal, das durch ein an eine Zelle bindendes IL-7-Molekül initiiert wird, transduzieren können, oder mit anti-IL-7R-Antikörpern, die gegen IL-7R aus natürlichen (d.h. nicht rekombinanten) Quellen erzeugt worden sind, kreuzreagieren können. Die Ausdrücke "IL-7-Rezeptor" oder "IL-7R" umfassen Analoga und Untereinheiten nativer Proteine mit mindestens 20 Aminosäuren, ohne darauf beschränkt zu sein, die mindestens einige biologische Aktivität mit IL-7R gemeinsam haben. Das berechnete Molekulargewicht des reifen Human-IL-7R ist 49500. So, wie er durch die Beschreibung hindurch verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "reif" ein Protein, das in einer Form exprimiert wird, der die Leit(Leader)-Sequenz fehlt, wie sie in Transkripten der ganzen Länge eines nativen Genes vorhanden sein kann. Verschiedene bio-äquivalente Protein- und Aminosäureanaloge sind im Detail unten beschrieben.
Der Ausdruck "im wesentlichen ähnlich", wenn er für die Definition entweder von Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen verwendet wird, bedeutet, daß eine besondere Sequenz, beispielsweise eine Mutantensequenz, von der Bezugssequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen abweicht, deren Nettoeffekt dazu führt, daß die biologische Aktivität des IL-7R- Proteines beibehalten wird. Alternativ sind Nukleinsäureuntereinheiten und Analoga "im wesentlichen ähnlich" mit den hier offenbarten speziellen DNA-Sequenzen, wenn (a) die DNA-Sequenz vom kodierenden Bereich eines nativen Säuger-IL-7R-Genes abgeleitet ist, (b) die DNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz nach (a) unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren kann und für biologisch aktive IL-7R-Moleküle kodiert, oder die DNA-Sequenz als Folge des genetischen Kodes eine Degeneration der DNA-Sequenz nach (a) oder (b) darstellt und für biologisch aktive IL-7R- Moleküle kodiert. Im wesentlichen ähnliche analoge Proteine werden der entsprechenden Sequenz des nativen IL-7R's mehr als ungefähr 30% ähnlich sein. Sequenzen mit einem geringeren Grad an Ähnlichkeit, aber vergleichbarer biologischer Aktivität, werden als Äquivalente angesehen. Bevorzugt werden die analogen Proteine den entsprechenden Sequenzen von nativem IL-7R mehr als 80% ähnlich sein, in welchem Fall sie als "im wesentlichen identisch" definiert werden. Bei der Definition von Nukleinsäuresequenzen werden alle erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, die für im wesentlichen ähnliche Aminosäuresequenzen kodieren können, als im wesentlichen ähnlich einer Bezugsnukleinsäuresequenz angesehen. Der Prozentsatz Ähnlichkeit kann beispielsweise durch Vergleich der Sequenzinformation unter Verwendung des GAP- Computerprogramms, Version 6,0, bestimmt werden, das von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist. Das GAP-Programm verwendet das Zuordnungsverfahren von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), wie es von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) revidiert worden ist. Kurz gesagt definiert das GAP-Programm Ähnlichkeit als die Anzahl zugeordneter Symbole (d.h. Nukleotide oder Aminosäuren), die ähnlich sind, geteilt durch die Gesamtzahl von Symbolen in der kürzeren der zwei Sequenzen. Die bevorzugten vorgegebenen Parameter für das GAP-Programm umfassen: (1) Eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identität und von 0 für Nicht-Identität enthält) für Nukleotide, und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie beschrieben von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Seiten 353-358, 1979, (2) 3,0 Strafpunkte für jede Lücke und zusätzlich 0,1 Strafpunkt für jedes Symbol in jeder Lücke, und (3) keine Strafpunkte für Endlücken.
"Löslicher IL-7-Rezeptor" oder "sIL-7R", wie es im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf ein Protein oder ein im wesentlichen äquivalentes Analog mit einer Aminosäuresequenz, die dem extrazellulären Bereich der nativen IL-7-Rezeptoren entspricht, beispielsweise Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die den Sequenzen der Aminosäurereste 1-219, abgebildet in Figuren 2A-2B, den Aminosäureresten 1-242, abgebildet in Figuren 3A-3B, und den Aminosäureresten 1-219, abgebildet in Figuren 4A-4B, im wesentlichen äquivalent sind. Äquivalente sIL-7Rs umfassen Polypeptide, die von den in den Figuren 2-4 gezeigten Sequenzen durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen abweichen und die die Fähigkeit, IL-7 zu binden, und die Fähigkeit von IL-7, ein Signal via die Zelloberflächen-gebundenen IL-7-Rezeptorproteine zu transduzieren, inhibieren. Weil sIL-7R-Proteine keine Transmembranregion enthalten, werden sie von der Wirtszelle, in der sie erzeugt werden, ausgeschieden. Wenn sie in therapeutischen Formulierungen verabreicht werden, zirkulieren sIL-7R-Proteine im Körper und binden an zirkulierende IL-7-Moleküle, wodurch eine Wechselwirkung von IL-7 mit natürlichen IL-7-Rezeptoren verhindert und eine IL-7-abhängige Immunantwort inhibiert wird. Die Fähigkeit eines Polypeptides, die IL-7-Signaltransduktion zu inhibieren, kann durch Transfizieren der Zellen mit rekombinanten IL-7- Rezeptor-DNAs, um Expression von rekombinantem Rezeptor zu erhalten, bestimmt werden. Die Zellen werden dann mit IL-7 in Kontakt gebracht und die resultierenden metabolischen Wirkungen untersucht. Wenn eine Wirkung auftritt, die der Wirkung des Liganden zuzuschreiben ist, dann hat der rekombinante Rezeptor Signaltransduktionsaktivität. Beispielhafte Verfahren, um festzustellen, ob ein Polypeptid signaltransduzierende Aktivität hat, sind von Idzerda et al., J. Exp. Med. März 1990 (im Druck); Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3045 (1989); Prywes et al., EMBO J. 5:2179 (1986) und Chou et al., J. Biol. Chem. 262:1842 (1987) offenbart worden. Alternativ können primäre Zellen und Zellinien, die einen endogenen IL-7-Rezeptor exprimieren und eine nachweisbare biologische Antwort auf IL-7 haben, verwendet werden. Beispielsweise antwortet die IL-7-abhängige Zellinie IxN/2b durch Kurzzeitproliferation in Antwort auf IL-7 und die IL-7-induzierte Proliferation kann spezifisch durch Zufügen von exogenem löslichen IL-7R blockiert werden.
"Rekombinant", so wie es hier verwendet wird, bedeutet, daß ein Protein aus rekombinanten (z.B. mikrobiellen oder Säuger-) Expressionssystemen abgeleitet ist. "Mikrobiell" bezeichnet rekombinante Proteine, die in bakteriellen oder Pilz- (z.B. Hefe-) Expressionssystemen hergestellt sind. Bei einem Produkt definiert "rekombinant mikrobiell" ein Protein, das in einem mikrobiellen Expressionssystem erzeugt ist, das im wesentlich frei von nativen endogenen Substanzen ist. Die in den meisten bakteriellen Kulturen, z.B. E. coli, exprimierten Proteine werden Glykan-frei sein. In Hefe exprimierte Proteine können ein Glykosylierungsmuster haben, das von dem in Säugerzellen exprimierten unterschiedlich ist.
"Biologisch aktiv", wie es in der Beschreibung als ein Merkmal von IL-Rezeptoren verwendet wird, bedeutet, daß ein besonderes Molekül eine ausreichende Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz mit den hier offenbarten erfindungsgemäßen Ausführungsformen hat, um zur Bindung nachweisbarer Mengen von IL-7, dem Weitergeben eines IL-7-Stimulus an eine Zelle, beispielsweise als ein Bestandteil eines Hybrid-Rezeptor-Konstruktes, oder zur Kreuzreaktion mit anti-IL-7R-Antikörpern, die gegen IL-7R aus natürlichen (d.h. nicht rekombinanten) Quellen erzeugt sind, fähig zu sein. Bevorzugt können biologisch aktive erfindungsgemäße IL-7-Rezeptoren mehr als 0,1 nmol IL-7 pro nmol Rezeptor binden, und besonders bevorzugt mehr als 0,5 nmol IL-7 pro nmol Rezeptor in Standardbindungstests (siehe unten).
"DNA-Sequenz" bezeichnet ein DNA-Polymer in Form eines separaten Fragmentes oder als Bestandteil eines größeren DNA-Konstruktes, das von DNA abgeleitet ist, die mindestens einmal in im wesentlichen reiner Form, d.h. frei von kontaminierenden endogenen Materialien und in einer Menge oder Konzentration, die die Identifizierung, Manipulation und Gewinnung der Sequenz und der Nukleotidsequenz der Bestandteile durch übliche biochemische Verfahren ermöglicht, isoliert worden ist, beispielsweise durch Verwendung eines Klonierungsvektors. Solche Sequenzen werden bevorzugt in Form eine offenen Leserasters zur Verfügung gestellt, das nicht durch interne nicht translatierte Sequenzen oder Introns, die in eukaryontischen Genen typischerweise vorhanden sind, unterbrochen ist. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen enthält, könnte ebenfalls verwendet werden. Sequenzen nicht translatierter DNA können 5' oder 3' vom offenen Leseraster vorhanden sein, wo sie nicht mit Manipulation oder Expression der kodierenden Bereiche interferieren.
"Nukleotidsequenz" bezeichnet ein Heteropolymer von Desoxyribonukleotiden. DNA-Sequenzen, die für erfindungsgemäße Proteine kodieren, können aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder aus einer Reihe von Oligonukleotiden zusammengesetzt werden, um ein synthetisches Gen bereitzustellen, das in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert werden kann.
"Rekombinanter Expressionsvektor" bezeichnet ein replizierbares DNA-Konstrukt, das entweder zum Amplifizieren oder zum Exprimieren von DNA verwendet wird, die für IL-7R kodiert und eine Transkriptionseinheit umfaßt, die aus (1) einem genetischen Element oder Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, beispielsweise Promotoren oder Enhancern, (2) einer Struktur- oder kodierenden Sequenz, die in mRNA transkribiert und in Protein translatiert wird, und (3) geeigneten Transkriptions- und -Translationsinitiations- und Terminationssequenzen zusammengesetzt ist. Für die Verwendung in Hefeexpressionssystemen vorgesehene Strukturelemente umfassen bevorzugt eine Leitsequenz, die die extrazelluläre Sekretion von translatiertem Protein durch eine Wirtszelle ermöglicht. Alternativ kann sie, wo rekombinantes Protein ohne eine Leit- oder Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Methioninrest enthalten. Dieser Rest kann gegebenenfalls anschließend vom exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden, um das Endprodukt zu ergeben.
"Rekombinantes mikrobielles Expressionssystem" bedeutet eine im wesentlichen homogene Monokultur eines geeigneten Wirtsorganismus, beispielsweise von Bakterien wie E. coli. oder Hefe, beispielsweise S. cerevisiae, die in die chromosomale DNA stabil integriert eine rekombinante Transkriptionseinheit enthalten oder die rekombinante Transkriptionseinheit als Bestandteil eines vorhandenen (resident) Plasmides tragen. Im allgemeinen sind die ein System konstituierenden Zellen die Nachkommen einer einzelnen Ahnentransformante. Rekombinante Expressionssysteme, so wie sie hier definiert sind, exprimieren heterologe Proteine nach Induktion der regulatorischen Elemente, die mit der DNA- Sequenz und dem synthetischen Gen, die bzw. das exprimiert werden soll, verbunden sind.

Isolierung von für IL-7R kodierenden cDNAs

Um die kodierende Sequenz für einen Säuger-IL-7R zu erhalten, kann eine für IL-7R kodierende cDNA-Sequenz aus einer rekombinanten DNA-Bank isoliert werden, die entweder unter Verwendung von genomischer DNA oder von cDNA erzeugt worden ist. In einem bevorzugten Ansatz wird eine cDNA-Bank aus polyadenylierter mRNA konstruiert, die aus einer besonderen Zellinie erhalten ist, die ein Säuger-IL-7R exprimiert. Beispielsweise kann die cDNA-Bank aus der humanen Fibroblastenzellinie WI-26VA4 (ATCC CCL 95.1) oder der humanen Daudi-Zellinie (ATCC CCL 213) konstruiert werden. Maus-Zellinien, die IL-7R exprimieren, können ebenfalls verwendet werden, einschließlich der T-Zellinie LBRM-33-1A5 (ATCC CRL 8079), der Pre-B-Zellinie 70Z/3 (ATCC TIB 158) und der myelomonozytischen Mauszellinie PU5-1.8 (ATCC TIB 61).
In der cDNA-Bank enthaltene IL-7R-Sequenzen können leicht durch Durchmustern der Bank mit einer geeigneten Nukleinsäure-Sonde identifiziert werden, die mit IL-7R cDNA hybridisieren kann. Die Sonde kann hierin offenbarte Nukleotidsequenzen beinhalten. Alternativ können für IL-7R-Proteine kodierende DNAs durch Ligation synthetischer Oligonukleotid-Untereinheiten zusammengesetzt werden, um eine vollständige kodierende Sequenz zur Verfügung zu stellen.
Für die Durchführung dieser Erfindung wurden die für IL-7R kodierenden cDNAs durch direkte Expression isoliert. Eine cDNA- Bank wurde konstruiert, indem zuerst zytoplasmatische mRNA aus der humanen Fibroblastenzellinie WI-25VA4 isoliert wurde. Polyadenylierte RNA wurde isoliert und zur Herstellung doppelsträngiger cDNA verwendet. Die gereinigten cDNA-Fragmente wurden dann in pDC302-Vektor-DNA ligiert, die von pDC201 (einem Derivat von pMLSV, zuvor beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768, 1984) abgeleitete regulatorische Sequenzen, SV40- und Zytomegalivirus-DNA verwendet, wie im Detail in Beispiel 2 unten beschrieben wird. pDC302 ist bei der American Type Culture Collection unter dem Namen pCAV/NOT-IL-7R (mit einem den IL-7R-Klon H1 enthaltenden Insert) hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer ATCC 68014 erhalten. Die die IL-7R-cDNA-Fragmente enthaltenden pDC302-Vektoren wurden in E. coli-Stamm DH5α transformiert. Die Transformanten wurden plattiert, um ungefähr 1000 Kolonien pro Platte zu ergeben. Die resultierenden Kolonien wurden geerntet und jeder Pool wurde verwendet, um Plasmid-DNA für die Transfektion in COS-7-Zellen im wesentlichen so herzustellen, wie von Cosman et al. (Nature 312:768, 1984) und Luthmann et al. (Nucl. Acid Res. 11:1295, 1983) beschrieben. Transfektanten, die biologisch aktive Zelloberflächen-IL-7-Rezeptoren exprimierten, wurden identifiziert, indem auf ihre Fähigkeit zur Bindung von ¹²&sup5;I-IL-7 durchmustert wurde. In diesem Durchmusterungsansatz wurden transfizierte COS-7-Zellen mit Medium inkubiert, das ¹²&sup5;I-IL-7 enthält, die Zellen gewaschen, um ungebundenes markiertes IL-7 zu entfernen, und die Zelleinzelschichten mit Röntgenfilmen in Kontakt gebracht, um die Konzentrationen der IL-Bindung nachzuweisen, wie von Sims et al., Science 241:585 (1988), offenbart. Auf diese Weise nachgewiesene Transfektanten erscheinen als schwarze Foci gegen einen relativ hellen Hintergrund.
Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden ungefähr 100000 cDNAs in Pools von ungefähr 1000 cDNAs durchmustert, bis der Test eines Transfektanten-Pools auf positive Foci für IL-7-Bindung hinwies. Eine gefrorene Stammsuspension von Bakterien dieses positiven Pools wurde in Kultur wachsengelassen und plattiert, um Einzelkolonien zu ergeben, die durchmustert wurden, bis ein einzelner Klon (der Klon H1) identifiziert worden war, der die Synthese eines Oberflächenproteines mit nachweisbarer IL-7-Bindungsaktivität steuerte. Diese Klon wurde isoliert und sein Insert sequenziert, um die Nukleotidsequenz von humaner IL-7R-cDNA zu bestimmen. Die Sequenz des humanen IL-7R-cDNA-Klones H1, die nach diesem Verfahren isoliert wurde, wurde dann als Hybridisierungssonde verwendet, um den humanen cDNA-Klon H20 (Figur 2A- 2C), den Klon H6 (Figuren 3A-3B) und die Mausklone P1 und P2 (von denen eine Hybrid-cDNA in den Figuren 4A-4C gezeigt ist) aus geeigneten Banken zu isolieren. Unter Verwendung analoger Verfahren können cDNA-Klone aus cDNA-Banken anderer Säugetierarten durch Kreuzhybridisierung zwischen den Arten isoliert werden. Für die Verwendung bei der Hybridisierung kann die für IL- 7R kodierende DNA mit dem Fachmann gut bekannten Verfahren mit einer nachweisbaren Substanz, beispielsweise einer fluoreszierenden Gruppe, einem radioaktiven Atom oder einer chemilumineszierenden Gruppe, kovalent markiert werden. Solche Sonden könnten auch für die in vitro-Diagnose bestimmter Zustände verwendet werden.
Wie die meisten Säugergene, sind die IL-7-Rezeptoren in Säugern vermutlich von Genen mit mehreren Exons kodiert. Alternative mRNA-Konstrukte, die unterschiedlichen mRNA-Spleiß-Ereignissen nach der Transkription zugeschrieben werden können, und die große den hier beanspruchten cDNAs identische oder ähnliche Bereiche haben, werden als innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung liegend angesehen.

Proteine und Analoge

Die vorliegende Erfindung stellt im wesentlichen homogene rekombinante Säuger-IL-7R-Polypeptide zur Verfügung, die im wesentlichen frei von kontaminierenden endogenen Materialien und gegebenenfalls ohne assoziierte Glykosylierung nach nativem Muster vorliegen. Erfindungsgemäßer Säuger-IL-7R umfaßt beispielsweise Primaten-, Human-, Maus-, Hunde-, Katzen-, Rinder-, Schaf-, Pferde- und Schweine-IL-7R. IL-7R-Derivate innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung umfassen auch verschiedene Strukturformen des primären Proteines, die biologische Aktivität behalten. Infolge der Gegenwart ionisierbarer Amino- und Carboxylgruppen kann ein IL-7R-Protein beispielsweise in Form saurer oder basischer Salze vorliegen oder in neutraler Form. Einzelne Aminosäurereste können außerdem durch Oxidation oder Reduktion modifiziert werden.
Die primäre Aminosäurestruktur kann durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Gruppen, beispielsweise Glykolsylgruppen, Lipiden, Phosphat, Acetylgruppen und ähnlichen, oder durch Erzeugen von Aminosäuresequenz- Mutanten modifiziert werden. Kovalente Derivate werden durch Verbinden besonderer funktioneller Gruppen mit den Aminosäureseitenketten von IL-7R oder mit dem N- oder C-Terminus hergestellt. Andere IL-7R-Derivate innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung umfassen kovalente oder aggregative Konjugate von IL- 7R oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, beispielsweise durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Beispielsweise kann ein konjugiertes Peptid eine Signal-(oder Leit-)Polypeptidsequenz am N-terminalen Bereich des Proteines sein, die co-translational oder post-translational den Transfer des Proteines von der Synthesestelle zur Stelle seiner Funktion innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder -wand steuert (z.B. die Hefe-α-Faktor- Leitsequenz). IL-7R-Proteinfusionen können Peptide umfassen, die zur Erleichterung der Reinigung oder Indentifizierung von IL-7R zugefügt worden sind (z.B. Poly-His). Die Aminosäuresequenz des IL-7R-Rezeptors kann außerdem mit dem Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988) verbunden werden. Die letztgenannte Sequenz ist hochantigen und stellt ein Epitop zur Verfügung, das von einem spezifischen monoklonalen Antikörper reversibel gebunden wird, was einen schnellen Test und eine leichte Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteines ermöglicht. Die Sequenz wird außerdem spezifisch durch Rindermucosa-Enterokinase an dem Rest gespalten, der der Asp-Lys-Paarung unmittelbar folgt. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid geschützt sind, können außerdem gegen den intrazellulären Abbau in E. coli resistent sein.
IL-7R-Derivate können außerdem als Immunogene verwendet werden, als Reagenzien in Immuntests auf Rezeptorgrundlage, oder als Bindungsmittel für Affinitätsreinigungsverfahren von IL-7 oder anderen bindenden Liganden. IL-7R-Derivate an den Cystein- und Lysinresten können auch durch quervernetzende Mittel, beispielsweise M-Maleimidobenzoyl-succinimidester und N-Hydroxysuccinimid, erhalten werden. IL-7R-Proteine können durch reaktive Seitengruppen kovalent an verschiedene unlösliche Substrate gebunden werden, beispielsweise Bromcyan-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldiimidazol-aktivierte oder Tosyl-aktivierte Agarosestrukturen, oder durch Adsorption an Polyolefinoberflächen (mit oder ohne Glutaraldehydquervernetzung). Sobald es an ein Substrat gebunden ist, kann IL-7R verwendet werden, um anti-IL- 7R-Antikörper oder IL-7 (zum Zweck des Testes oder der Reinigung) selektiv zu binden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch IL-7R mit oder ohne assoziierte Glykosylierung nach nativem Muster. In Hefe- oder Säuger-Expressionssystemen, z.B. COS-7-Zellen, exprimiertes IL-7R kann hinsichtlich Molekulargewicht und Glykosylierungsmuster den nativen Molekülen in Abhängigkeit vom Expressionssystem ähnlich oder leicht unterschiedlich davon sein. Die Expression von IL- 7R-DNAs in Bakterien, beispielsweise E. coli, stellt nicht- glykosylierte Moleküle zur Verfügung. Funktionelle mutierte Analoge von Säuger-IL-7R mit inaktivierten N-Glykosylierungsstellen können durch Oligonukleotidsynthese und Ligation oder durch stellenspezifische Mutageneseverfahren erzeugt werden. Diese analogen Proteine können in einer homogenen Form mit reduzierten Kohlehydraten in guter Ausbeute unter Verwendung von Hefeexpressionssystemen erzeugt werden. N-Glykosylierungsstellen in eukaryontischen Proteinen sind durch die Aminosäuretripletts Asn- A&sub1;-Z charakterisiert, wobei A&sub1; jede Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist, und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz stellt das Asparagin eine Seitenkettenaminogruppe für die kovalente Anheftung von Kohlenhydrat zur Verfügung. Eine solche Stelle kann durch Einsetzen einer anderen Aminosäure für Asn oder für den Rest Z eliminiert werden, wodurch Asn oder Z eliminiert wird, oder durch Einfügen einer nicht-Z-Aminosäure zwischen A&sub1; und Z, oder einer von Asn verschiedenen Aminosäure zwischen Asn und A&sub1;.
IL-7R-Derivate können außerdem durch Mutationen von IL-7R oder seinen Untereinheiten erhalten werden. Eine IL-7R-Mutante, wie hier darauf bezuggenommen wird, ist ein zu IL-7R homologes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die von nativen IL-7R wegen einer Deletion, Insertion oder Substitution verschieden ist.
Bioäquivalente Analoge von IL-7R-Proteinen können beispielsweise durch verschiedene Substitutionen von Resten oder Sequenzen oder Deletieren von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen, die für die biologische Aktivität nicht erforderlich sind, konstruiert werden. Beispielsweise können Cysteinreste deletiert werden oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von inkorrekten intramolekularen Sulfidbrücken nach der Renaturierung zu verhindern. Zusätzlich weisen Unterschiede in den verschiedenen cDNA-Klonen, die aus verschiedenen Zellinien isoliert worden sind, darauf hin, daß die Aminosäure 46 (bezogen auf den cDNA-Klon H20) Ile oder Thr sein kann, die Aminosäure 118 kann Val oder Ile sein, die Aminosäure 224 kann Thr oder Ile sein und die Aminosäure 336 kann Ile oder Val sein. Andere Ansätze zur Mutagenese involvieren die Modifikation benachbarter dibasischer Aminosäurereste, um die Expression in Hefesystemen zu fördern, in denen es eine KEX2-Protease-Aktivität gibt. Im allgemeinen sollten diese Substitutionen konservativ vorgenommen werden, d.h., daß die am stärksten bevorzugten Ersatzaminosäuren solche sind, deren physikochemische Eigenschaften denen des zu ersetzenden Restes ähnlich sind. Ähnlich sollte dann, wenn die Strategie einer Deletion oder Insertion angewendet wird, der mögliche Effekt der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität berücksichtigt werden.
Untereinheiten von IL-7R können durch Deletieren terminaler oder interner Reste oder Sequenzen konstruiert werden. Besonders bevorzugte Untereinheiten umfassen solche, in denen der Transmembranbereich und die intrazelluläre Domäne von IL-7R deletiert sind oder durch hydrophile Reste substituiert sind, um die Sekretion des Rezeptors in das Zellkulturmedium zu erleichtern. Das resultierende Protein ist ein lösliches verkürztes IL-7R- Molekül, das seine Fähigkeit zur Bindung von IL-7 beibehalten kann. Besondere Beispiele von löslichem IL-7R umfassen Polypeptide, die eine erhebliche Identität mit der Sequenz der Aminosäurereste 1-219 in den Figuren 2A-2B, der Reste 1-242 in Figuren 3A-3B und der Reste 1-219 in Figuren 4A-4B haben.
Mutationen in Nukleotidsequenzen, die für die Expression von analogen IL-7Rs konstruiert worden sind, müssen natürlich das Leseraster der kodierenden Sequenzen bewahren und führen bevorzugt nicht zu komplementären Bereichen, die hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen zu erzeugen, beispielsweise Schleifen oder Haarnadeln, die die Translation der Rezeptor-mRNA nachteilig beeinflussen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorbestimmt sein kann, ist es nicht notwendig, daß die Natur der Mutation per se vorbestimmt ist. Beispielsweise kann, um auf optimale Merkmale von Mutanten an einer gegebenen Stelle zu selektionieren, eine Zufallsmutagenese am Zielkodon durchgeführt werden und die exprimierten IL-7R-Mutanten können auf die gewünschte Aktivität durchmustert werden.
Nicht alle Mutationen in der Nukleotidsequenz, die für IL-7R kodieren, werden im Endprodukt exprimiert werden; beispielsweise können Nukleotidsubstitutionen vorgenommen werden, um die Expression zu beschleunigen, in erster Linie, um Sekundärstrukturschlaufen in der transkribierten mRNA zu vermeiden (siehe EPA 75444A, die hier durch Verweis einbezogen wird), oder um Kodons bereitzustellen, die vom ausgewählten Wirt leichter translatiert werden, z.B. die gut bekannten E. coli-Präferenzkodons für die Expression in E. coli.
Mutationen können an bestimmten Orten durch Synthetisieren von Oligonukleotiden, die eine Mutantensequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, die die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz möglich machen, eingeführt werden. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz für ein Analog mit der gewünschten Aminosäureinsertion, Substitution oder Deletion.
Alternativ können Oligonukleotid-gerichtete stellenspezifische Mutageneseverfahren verwendet werden, um ein verändertes Gen bereitzustellen, in dem besondere Kodons im Einklang mit der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion verändert sind. Beispielhafte Verfahren zur Herstellung der Änderungen, die oben ausgeführt sind, sind von Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (Bio/Techniques, Januar 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); und den US-Patenten mit den Nummern 4518584 und 4737462 offenbart und werden hier durch Verweis einbezogen.

Expression von rekombinantem IL-7R

Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren zur Verfügung, die synthetische oder cDNA-abgeleitete DNA- Fragmente umfassen, die für Säuger-IL-7R oder bioäquivalente Analoge kodieren und funktionell an geeignete Transkriptions- oder Translations-regulierende Elemente gebunden sind, die aus Säugergenen, mikrobiellen, viralen oder Insektengenen abgeleitet sind. Solche regulatorischen Elemente umfassenen einen Transkriptionspromotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, um die Transkription zu kontrollieren, eine für geeignete mRNA- Ribosomen-Bindungsstellen kodierende Sequenz und Sequenzen, die die Transkriptions-Termination kontrollieren, wie es im Detail unten beschrieben ist. Die Fähigkeit, in einem Wirt zu replizieren, die gewöhnlich durch einen Replikationsursprung verliehen wird, und ein Selektionsgen, um die Erkennung von Transformanten zu erleichtern, können zusätzlich vorgesehen werden. DNA-Bereiche sind funktionell miteinander verbunden, wenn sie funktionell miteinander in Verbindung stehen. Beispielsweise ist die DNA für ein Signalpeptid (sekretorische Leitsequenz) funktionell mit der DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als ein Vorläufer exprimiert wird, der an der Ausscheidung des Polypeptides teilnimmt; ein Promotor ist mit einer kodierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist mit einer kodierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn sie so angeordnet ist, daß sie die Translation erlaubt. Im allgemeinen bedeutet funktionell miteinander verbunden benachbart und im Fall von Sekretionsleitsequenzen benachbart und im Leseraster.
DNA-Sequenzen, die für Säuger-IL-7-Rezeptoren kodieren, die in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, enthalten bevorzugt keine Introns, die die Transkription der DNA in mRNA vorzeitig beenden könnten; die vorzeitige Termination der Transkription kann jedoch beispielsweise erwünscht sein, wo sie zu Mutanten mit vorteilhaften C-terminalen Verkürzungen führen würde, beispielsweise Deletionen einer Transmembranregion, um einen löslichen Rezeptor zu ergeben, der nicht an die Zellmembran gebunden ist. Infolge der Degeneration des Kodes kann es eine beträchtliche Variation der Nukleotidsequenzen, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, geben; beispielhafte DNA-Ausführungsformen sind solche, die den in den Figuren gezeigten Nukleotidsequenzen entsprechen. Andere Ausführungsformen umfassen Sequenzen, die zur Hybridisierung mit den Sequenzen der Figuren unter mäßig stringenten Bedingungen (50ºC, 2 X SSC) fähig sind und weitere Sequenzen, die mit den oben beschriebenen hybridisieren oder eine Degeneration dieser Sequenzen darstellen, die für biologisch aktive IL-7-Rezeptorpolypeptide kodieren.
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren konstruierten IL-7R-Vektoren transformiert oder tranfiziert worden sind. Transformierte Wirtszellen exprimieren im allgemeinen IL-7R, aber Wirtszellen, die zum Zweck der Klonierung oder Amplifizierung von IL-7R-DNA transformiert sind, brauchen kein IL-7R zu exprimieren. Exprimiertes IL-7R wird in Abhängigkeit von der ausgewählten IL-7R- DNA in der Zellmembran abgelagert oder in den Kulturüberstand ausgeschieden. Geeignete Wirtszellen für die Expression von Säuger-IL-7R umfassen Prokaryonten, Hefe oder höhere eukaryontische Zellen unter Kontrolle von entsprechenden Promotoren. Prokaryonten umfassen Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise E. coli oder Bacilli. Höhere eukaryontische Zellen umfassen etablierte Zellinien mit Säugerursprung, wie unten beschrieben. Zellfreie Translationssysteme könnten ebenso verwendet werden, um Säuger-IL-7R unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die von den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten abgeleitet sind. Geeignete Klonierung- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit zellulären bakteriellen, Pilz-, Hefe- und Säugerwirten sind von Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) beschrieben, woraus die relevante Offenbarung hier durch Verweis einbezogen wird.
Prokaryontische Expressionswirte können für die Expression von IL-7Rs verwendet werden, die keine umfangreiche proteolytische und Disulfidprozessierung erfordern. Prokaryontische Expressionsvektoren umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker, beispielsweise ein Gen, das für Proteine kodiert, die antibiotische Resistenz verleihen oder eine Autotrophie komplementieren, und einen Replikationsursprung, der von dem Wirt erkannt wird, um die Amplifikation innerhalb des Wirtes sicherzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl andere ebenfalls zur Wahl stehen und verwendet werden können.
Nützliche Expressionsvektoren für die Verwendung in Bakterien können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind, die genetische Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten. Solche kommerziellen Vektoren umfassen beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-"Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz verbunden. E. coli wird typischerweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem von einer E. coli-Art abgeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt daher ein einfaches Mittel für die Identifizierung transformierter Zellen zur Verfügung.
Weithin in rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendete Promotoren umfassen das β-Lactamase-(Penicillinase-) und Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), das Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; und EPA 36776) und den Tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches bakterielles Expressionssystem verwendet den λ-Phagen PL-Promotor und seinen thermolabilen Repressor cI857ts. Von der American Type Culture Collection erhältliche Plasmidvektoren, die Derivate des λPL-Promotors enthalten, umfassen das Plasmid pHUB2, vorhanden im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092), und pPlc28, vorhanden in E. coli RR1 (ATCC 53082).
Rekombinante IL-7R-Proteine können außerdem in Hefewirten, bevorzugt der Art Saccharomyces, beispielsweise S. cerevisiae, exprimiert werden. Hefen anderer Gattungen, beispielsweise Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren enthalten im allgemeine einen Replikationsursprung vom Hefeplasmid 2u oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, für IL-7R kodierende DNA, Sequenzen für die Polyadenylierung und Transkriptionstermination und ein Selektionsgen. Bevorzugt umfassen Hefevektoren einen Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker, der die Transformation sowohl von Hefe als auch von E. coli erlaubt, z.B. das Amplicillinresistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Hefemutantenstamm bereitstellt, dem die Fähigkeit zum Wachstum ohne Tryptophan fehlt, und einen Promotor, der von einem hoch exprimierten Hefegen abgeleitet ist, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktursequenz zu induzieren. Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellengenom stellt dann eine wirksame Umgebung für den Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan zur Verfügung.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für Metallothionin, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat- Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat- Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung für die Expression in Hefe sind weiter in R. Hitzemann et al., EPA 73657, beschrieben.
Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen aus pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen und Replikationsursprung) und Hefe-DNA-Sequenzen einschließlich eines Glukose-reprimierbaren ADH2-Promotors und einer α-Faktor-Sekretionssignalsequenz zusammengesetzt werden. Der ADH2-Promotor ist von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300:724, 1982) beschrieben worden. Die Hefe-α-Faktor-Leitsequenz, die die Ausscheidung von heterologen Proteinen steuert, kann zwischen dem Promotor und dem Strukturgen insertiert werden, um exprimiert zu werden. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Die Leitsequenz kann modifiziert werden, um nahe ihrem 3'-Ende eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten, um die Fusion der Leitsequenz an Fremdgene zu erleichtern.
Geeignete Hefetransformationsprotokolle sind dem Fachmann bekannt; ein beispielhaftes Verfahren wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978, beschrieben, in dem in einem selektiven Medium, das aus 0,67% Hefestickstoffbase, 0,5% Casamino-Acids, 2% Glucose, 10 ug/ml Adenin und 20 ug/ml Uracil besteht, für Trp&spplus;-Transformanten selektioniert wird.
Wirtsstämme, die mit Vektoren transformiert sind, die den ADH2- Promotor umfassen, können zur Expression in einem reichen Medium wachsen gelassen werden, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose besteht, supplementiert mit 80 ug/ml Adenin und 80 ug/ml Uracil. Die Derepression des ADH2-Promotors tritt nach Erschöpfung der Glucose im Medium auf. Rohe Hefeüberstände werden durch Filtration geerntet und vor der Reinigung bei 4ºC gehalten.
Zur Expression von rekombinanten Proteinen können verschiedene Säuger- oder Insektenzellkultursysteme verwendet werden. Eine Übersicht über Baculovirus-Systeme zur Erzeugung von heterologen Proteinen in Insektenzellen bieten Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Beispiele für geeignete Säuger-Wirtszellinien umfassen die COS-7-Linker aus Affennierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23:175, 1981), und andere Zellinien, die zur Expression eines geeigneten Vektors fähig sind, einschließlich beispielsweise von L-Zellen, C127, 3T3, Chinese Hamster Ovary (CHO), HeLa und BHK Zellinien. Säugerexpressionsvektoren können nicht transkribierte Elemente umfassen, beispielsweise einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und einen Enhancer, der mit dem zu exprimierenden Gen verbunden ist, und andere 5'- oder 3'-flankierende, nicht transkribierte Sequenzen, und 5'- oder 3'-nicht translatierte Sequenzen, beispielsweise notwendige Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleiß-Donor-und -akzeptorstellen und Transkriptionsterminationssequenzen.
Die Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in Expressionsvektoren, die für die Transformation von Vertebratenzellen verwendet werden sollen, können von viralen Resourcen bereitgestellt werden. Beispielsweise sind weithin verwendete Promotoren und Enhancer von Polyoma, Adenovirus 2, Simianvirus 40 (SV40) und humanem Cytomegalievirus abgeleitet. Vom viralen SV40-Genom abgeleitete DNA-Sequenzen, beispielsweise der SV40-Replikationsursprung, der frühe und der späte Promotor, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente bereitzustellen, die für die Expression einer heterologen DNA-Sequenz erforderlich sind. Die frühen und späten Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht als ein Fragment aus dem Virus erhalten werden, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Kleinere oder größerer SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, daß die ungefähr 250 Basenpaare umfassende Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zur BglI- Stelle, die im viralen Replikationsursprung angeordnet ist, erstreckt, enthalten ist. Weiter können der genomische IL-7R-Promotor aus Säugern, Kontroll- und/oder Signalsequenzen verwendet werden, vorausgesetzt, daß solche Kontrollsequenzen mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sind. Weitere Einzelheiten, betreffend die Verwendung eines Vektors für eine hohe Expression in Säugern zur Erzeugung von rekombinantem Säuger-IL-7-Rezeptor, werden im Beispiel 2 unten zur Verfügung gestellt. Beispielhafte Vektoren können konstruiert werden, wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart.
Ein nützliches System für eine stabile Expression von Säuger- Rezeptor-cDNAs auf hohem Niveau in C127-Maus-Mammaria-Epithelzellen kann im wesentlichen wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) beschrieben konstruiert werden.
Ein besonders bevorzugter eukaryontischer Vektor für die Expression von IL-7R-DNA ist unten in Beispiel 2 offenbart. Dieser Vektor, der als pDC302 bezeichnet wird, wurde von dem Säugervektor pDC201 für hohe Expression abgeleitet und enthält regulatorische Sequenzen von SV40, Adenovirus 2 und humanem Cytomegalievirus.
Gereinigte Säuger-IL-7-Rezeptoren oder Analoge werden durch Kultivieren geeigneter Wirts/Vektorsysteme zur Expression der rekombinanten Translationsprodukte der erfindungsgemäßen DNAs hergestellt, die dann aus dem Kulturmedien oder Zellextrakten gereinigt werden.
Beispielsweise können Überstände aus Systemen, die rekombinantes Protein in die Kulturmedien ausscheiden, zuerst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, beispielsweise einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix aufgetragen werden. Beispielsweise kann eine geeignete Affinitätsmatrix IL-7 oder Lektin oder Antikörpermoleküle enthalten, das (die) an einen geeigneten Träger gebunden ist (sind). Alternativ kann ein Anionaustauscherharz verwendet werden, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit daran hängenden Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen. Die Matrices können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere Typen sein, die gemeinhin für die Proteinreinigung verwendet werden. Alternativ kann ein Kationenaustauscherschritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher umfassen verschiedene unlösliche Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen umfassen. Sulfopropylgruppen sind bevorzugt.
Schließlich können ein oder mehrere der Umkehrphasenhochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)-Schritte, die hydrophobe RP-HPLC-Medien verwenden, z.B. Silicagel mit daran hängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, zur weiteren Reinigung einer IL-7R-Zusammensetzung verwendet werden. Einige oder alle der voranstehenden Reingigungsschritte können in verschiedenen Kombinationen ebenfalls zum Bereitstellen eines homogenen rekombinanten Proteines verwendet werden.
In bakterieller Kultur erzeugtes rekombinantes Protein wird gewöhnlich durch eine anfängliche Extraktion aus Zellpellets isoliert, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrationsschritten, Aussalzschritten, wäßrigen Ionenaustauscher- oder Größenausschlußchromatographieschritten. Schließlich kann Hochdruckflüssigkeitschromatograpie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen, die für die Expression von rekombinantem Säuger-IL-7R verwendet werden, können durch jedes geeignete Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich von Gefrier- und Tauzyklen, Beschallen, mechanischem Aufbrechen oder der Verwendung von zelllysierenden Mitteln.
Die Fermentation von Hefe, die Säuger-IL-7R als ausgeschiedenes Protein exprimieren, erleichtert die Reinigung sehr. Ausgeschiedenes rekombinantes Protein, das aus einer Fermentation im großen Maßstab stammt, kann durch Verfahren gereinigt werden, die denen von Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) analog sind. Diese Literaturstelle beschreibt zwei aufeinanderfolgende Umkehrphasen-HPLC-Schritte für die Reinigung von rekombinantem humanem GM-CSF auf einer präparativen HPLC-Säule.
In rekombinanter Kultur synthetisiertes humanes IL-7R ist durch die Gegenwart von nicht-humanen Zellbestandteilen, einschließlich von Proteinen, in Mengen und von einem Charakter gekennzeichnet, die von den Reinigungsschritten abhängen, die zur Gewinnung des humanen IL-7Rs aus der Kultur angewendet werden. Diese Bestandteile stammen gewöhnlich aus Hefe, Prokaryonten oder nicht humanen höheren Eukaryonten und sind bevorzugt in unschädlichen kontaminierenden Mengen in der Größenordnung von weniger als ungefähr 1 Gew.-% vorhanden. Weiter ermöglichen rekombinante Zellkulturen die Erzeugung von IL-7R, das frei von Proteinen ist, die normalerweise mit IL-7R assoziiert sind, wie es in der Natur in der Ursprungsspezies gefunden wird, z.B. in Zellen, Zellexsudaten oder Körperflüssigkeiten.
IL-7R-Zusammensetzungen werden für die Verabreichung durch Mischen von IL-7R mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch verträglichen Trägern hergestellt. Solche Träger sind für die Empfänger in den verwendeten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch. Gewöhnlich umfaßt die Herstellung solcher Zusammensetzungen das Vereinen von IL-7R mit Puffern, Antioxidanzien, beispielsweise Ascorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextrinen, chelatbildenden Mitteln, beispielsweise EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Korrigenzien.
IL-7R-Zusammensetzungen können verwendet werden, um IL-7-vermittelte Immunantworten zu attenuieren. Um dieses Ergebnis zu erhalten, wird eine therapeutisch wirksame Menge einer IL-7- Rezeptorzusammensetzung einem Säugetier, bevorzugt einem Menschen, in Verbindung mit einem pharmazeutischen Täger oder Verdünnungsmittel verabreicht.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen und nicht einschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1

Bindungstests

A. Radiomarkierung von IL-7

Rekombinantes Maus-IL-7 wurde in HeLa-Zellen exprimiert und im wesentlichen, wie von Namen et al., Nature 333:571, 1988 beschrieben, gereinigt. Das gereinigte Protein wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen "Enzymobead"-Radioiodierungsmittels (BioRad) radiomarkiert. In diesem Verfahren wurden 7,5 ug rekombinantes IL-7 in 50 ul 0,2 M Natriumphosphat, pH 7,2, mit 50 ul "Enzymobead"-Reagenz, 2 mCi Natriumiodid in 20 ul 0,05 M Natriumphosphat, pH 7, und 10 ul 2,5% β-D-Glucose vereint. Nach 10 Minuten bei 25ºC wurden Natriumazid (10 ul einer 50 mM Lösung) und Natriummetabisulfid (10 ul einer Lösung von 5 mg/ml) zugesetzt und die Inkubation 5 Minuten bei 25ºC fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltration auf einem Bettvolumen von 2 ml Sephadex G25 (Sigma), equilibriert in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, enthaltend 2,5% (w/v) Rinderserumalbimin (BSA), 0,2% (w/v) Natriumazid und 20 mM Hepes pH 7,4 (Bindungsmedium), equilibriert. Der letztlich erhaltene Pool von ¹²&sup5;I-IL-7 wurde zu einer Arbeitsstammlösung von 1 x 10&supmin;&sup7; M in Bindungsmedium verdünnt und bis zu einem Monat bei 4ºC ohne nachweisbaren Verlust der Rezeptorbindungsaktivität gelagert. Die spezifische Aktivität beträgt routinemäßig im Bereich von 1 bis 5 x 10¹&sup5; cpm/mmol IL-7.

B. Bindung an intakte Zellen

Bindungstests, durchgeführt mit Zellen, die in Suspensionskultur wachsengelassen worden waren oder aus Kulturflaschen durch Behandlung mit EDTA (d.h. WI-26VA4) entfernt worden waren, wurden durch ein Phthalatöl-Trennverfahren (Dower et al., J. Immunol. 132:751, 1984) im wesentlichen wie von Park et al., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986, beschrieben, durchgeführt. Die Bindungstests wurden auch mit COS-Zellen durchgeführt, die mit einem Säugerexpressionsvektor transfiziert waren, der cDNA enthielt, die entweder für ein Human- oder Maus-IL-7R-Molekül kodierte. Für die Scatchard-Analyse der Bindung an intakte Zellen wurden COS-Zellen nach dem Verfahren von Luthman et al., Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983, und McCutchan et al., J. Natn. Cancer Inst. 41:351, 1968, mit Plasmid-DNA transfiziert. Acht Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert, in Costar- Platten mit sechs Vertiefungen in einer Dichte von 6 x 10&sup4; COS- IL-7-Rezeptortransfektanten, gut gemischt mit 6 x 10&sup5; transfizierten COS-Kontrollzellen als Träger, erneut ausgesät. Zwei Tage später wurden die Einzelschichten auf die Bindung von ¹²&sup5;I-IL-7 entweder zwei Stunden bei 4ºC oder 30 Minuten bei 37ºC getestet, im wesentlichen nach dem Verfahren, das von Park et al., J. Exp. Med. 166:476, 1987, beschrieben worden ist. Die unspezifische Bindung von ¹²&sup5;I-IL-7 wurde in Gegenwart eines 200- fachen oder größeren molaren Überschusses von nicht markiertem IL-7 gemessen. Um eine Internalisierung von ¹²&sup5;I-IL-7 durch die Zellen bei 37ºC zu verhindern, wurde allen Bindungstests Natriumazid (0,2%) zugefügt.

C. Festphasenbindungstests

Die Fähigkeit von IL-7R, aus Detergenz-Extrakten von Human- oder Mauszellen stabil an Nitrozellulose adsorbiert zu werden und dennoch IL-7-Bindungsaktivität beizubehalten, stellt ein Mittel für den Nachweis von IL-7R zur Verfügung. Die Zellextrakte wurden hergestellt, indem ein Zellniederschlag mit einem zweifachen Volumen PBS, enthaltend 1% Triton X-100 und einen Cocktail von Proteaseinhibitoren (2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 uM Pepstatin, 10 uM Leupeptin, 2 mM o-Phenanthrolin und 2 mM EGTA) durch heftiges Mischen gemischt wurden. Die Mischung wurde 10 Minuten auf Eis inkubiert, anschließend wurde sie 10 Minuten bei 8ºC und 12000 x g zentrifugiert, um Kerne und andere Zelltrümmer zu entfernen. Aliquots von 2 Mikrolitern der Zellextrakte wurden auf eine trockene BA85/21-Nitrozellulosemembran (Schleicher und Schüll, Keene, NH) aufgebracht und trocknengelassen. Die Membranen wurden 30 Minuten in Gewebekulturschalen in Tris(0,05 M)- gepufferter Kochsalzlösung (0,15 M), pH 7,5, enthaltend 3% w/v BSA, inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Membran wurde dann mit 5 x 10&supmin;¹¹ M ¹²&sup5;I-IL-7 in PBS + 3% BSA bedeckt und 2 Stunden bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Membranen dreimal in PBS gewaschen, getrocknet und auf einem Kodak X-Omat AR-Film 18 Stunden bei -70ºC gehalten.

D. Bindungstest für lösliches IL-7R

Lösliches IL-7R, das in COS-7-Zellüberständen vorhanden ist, wurde durch Inhibition der Bindung von ¹²&sup5;I-IL-7 an eine IL-7- abhängige Zellinie, beispielsweise IxN/2b (Namen et al., J. Exp. Med. 167:988, 1988; Park et al., J. Exp. Med., im Druck, 1990) oder jede andere Maus- oder Humanzellinie, die IL-7-Rezeptoren exprimiert, gemessen. Die Überstände der COS-7-Zellen wurden 3 Tage nach der Transfektion geerntet, 10-fach konzentriert und mit ¹²&sup5;I-IL-7 1 Stunde bei 37ºC vorinkubiert. IxN/2b-Zellen (2 x 10&sup6;) wurden einem Gesamtvolumen von 150 ul zugesetzt, die Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC fortgesetzt und die Bindung wurde getestet und analysiert, wie von Park et al., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986, beschrieben.

Beispiel 2

Isolierung humaner IL-7R-cDNA durch direkte Expression von aktivem Protein in COS-7-Zellen

Verschiedene Maus- und Humanzellinien wurden auf die Expression von IL-7R auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Bindung an ¹²&sup5;I- markiertes IL-7 durchmustert. Von der humanen Fibroblastenzellinie WI-26VA4 wurde festgestellt, daß sie von allen getesteten Zellinien die höchste Anzahl von Rezeptoren pro Zelle exprimierte. Gleichgewichtsbindungsstudien, die entsprechend Beispiel 1B durchgeführt worden waren, zeigten, daß die Zellinie eine biphasische Bindung von ¹²&sup5;I-IL-7 mit ungefähr 6000 hochaffinen Stellen (Ka = 10&sup9;-10¹&sup0;M¹&supmin;) und 30000 Stellen mit niedriger Affinität (Ka = 10&sup7;-10&sup8;M&supmin;¹)pro Zelle aufweist.
Eine größensortierte cDNA-Bank wurde durch reverse Transkription polyadenylierter mRNA konstruiert, die aus aus humanen WI-26VA4 Fibroblastenzellen isolierter Gesamt-RNA in Gegenwart von Kermesbeeren(pokeweed)-Mitogen unter Verwendung von Standardtechniken isoliert worden war (Gubler et al., Gene 25:263, 1983; Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, 1987). Die Zellen wurden durch Lysieren der Zellen in einer Guanidinhydrochloridlösung geerntet und die Gesamt-RNA wie zuvor beschrieben (March et al., Nature 315:641, 1985) isoliert.
Die Poly-A&spplus;-RNA wurde durch Oligo-dT-Zellulosechromatographie isoliert und doppelsträngige cDNA nach einem dem Verfahren von Gubler und Hoffmann (Gene 25:263, 1983) ähnlichen Verfahren hergestellt. Kurz gesagt wurde die Poly-A&spplus;-RNA durch reverse Transkriptase unter Verwendung von Oligo-dT als Primer in ein RNA- cDNA-Hybrid überführt. Das RNA-cDNA-Hybrid wurde dann unter Verwendung von RNAase H in Kombination mit DNA-Polymerase I in doppelsträngige cDNA überführt. Die resultierende doppelsträngige cDNA wurde mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Der stumpfendigen cDNA wurden EcoRI-Linker-Adaptoren (mit einer internen NotI-Stelle) zugefügt, die an nur einem Ende phosphoryliert waren (Invitrogen). Die Linker-Adapter-versehene cDNA wurde mit T4-Polynukleotidkinase behandelt, um den 5'-über-hängenden Bereich des Linker-Adapters zu phosphorylieren, und nicht ligierte Linker wurden entfernt, indem die cDNA über eine Sepharose CL4B- Säule gegeben wurde. Die Linker-Adapter-versehene cDNA wurde mit einer äquimolaren Konzentration von mit EcoRI geschnittenen und dephosphorylierten Armen vom Bakteriophagen λgt10 ligiert (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL- Press, Seiten 49-78). Die ligierte DNA wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits in Phagenpartikel verpackt, um eine Genbank der Rekombinanten herzustellen. Die Rekombinanten wurden weiter gereinigt, indem Phagen auf einem Bakterienrasen vom E. coli-Stamm C600(hfl&supmin;) amplifiziert wurden.
Aus der resultierenden λgt10-cDNA-Bank wurde Phagen-DNA gereinigt und die cDNA-Inserts durch Abbau mit dem Restriktiosenzym NotI ausgeschnitten. Nach Elektrophorese des Abbaus durch ein Agarosegel wurden cDNAs mit mehr als 500 bp isoliert.
Die resultierenden cDNAs wurden in den eukaryontischen Expressionsvektor pDC302 ligiert, der so entworfen war, das er cDNA- Sequenzen exprimiert, die in seine multiplen Klonierungsstellen insertiert sind, wenn er in Säugerzellen transfiziert wird. pDC302 wurde zusammengesetzt aus pDC201 (ein Derivat von pMLSV, zuvor beschrieben von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984), SV40 und Cytomegalievirus-DNA und umfaßt in dieser Reihenfolge in Transkriptionsrichtung vom Replikationsursprung: (1) SV40- Sequenzen von den Koordinaten 5171-270, einschließlich des Replikationsursprungs, Enhancersequenzen und früher und später Promotoren; (2) Cytomegalievirus-Sequenzen einschließlich der Promotor- und Enhancerbereiche (Nukleotide 671 bis +63 von der von Boechart et al., Cell 41: 521, 1985, publizierten Sequenz); (3) Adenovirus-2-Sequenzen, enthaltend das erste Exon und Teile des Introns zwischen dem ersten und zweiten Exon der dreiteiligen Leitsequenz (tripartite leader), das zweite Exon und einen Teil des dritten Exons der dreiteiligen Leitsequenz und eine multiple Klonierungsstelle (MCS), die Stellen für XhoI, KpnI, SmaI, NotI und BglI enthält; (4) SV-40-Sequenzen von den Koordinaten 4127-4100 und 2770-2533, die die Polyadenylierungs- und Terminationssignale für die frühe Transkription enthalten; (5) von pBR322 abgeleitete Sequenzen und die virusassoziierten Sequenzen VAI und VAII von pDC201, mit Adenovirussequenzen 10532- 11156, enthaltend die VAI- und VAII-Gene, gefolgt von pBR322- Sequenzen von 4363-2486 und 1094-375, enthaltend das Ampicillin- Resistenzgen und den Replikationsursprung.
Die resultierende WI-26VA4-cDNA-Bank in pDC302 wurde verwendet, um den E. coli-Stamm DH5α zu transformieren, und die Rekombinanten wurden ausgestrichen, um ungefähr 1000 Kolonien pro Platte zu ergeben, und ausreichend Platten, um ungefähr 50000 Kolonien pro Durchmusterung zur Verfügung zu stellen. Die Kolonien wurden von jeder Platte abgekratzt, vereint und aus jedem Pool Plasmid- DNA hergestellt. Die gepoolte DNA wurde dann verwendet, um subkonfluente Schichten von Affen-COS-7-Zellen unter Verwendung von DEAE-Dextran zu transfizieren, gefolgt von Chlorochin- Behandlung, wie beschrieben von Luthman et al. (J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986) und McCutchan et al. (J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986). Die Zellen wurden dann in Kultur 3 Tage wachsengelassen, um eine vorübergehende Expression der insertierten Sequenzen zu erlauben. Nach 3 Tagen wurden die Zellkulturüberstände verworfen und die Zelleinzelschichten in jeder Platte auf IL- 7-Bindung wie folgt getestet. Drei ml Bindungsmedium, enthaltend 5 x 10&supmin;¹&sup0; M ¹²&sup5;I-IL-7 wurden jeder Platte zugefügt und die Platten 90 Minuten bei 25ºC inkubiert. Das Medium wurde dann verworfen und jede Platte einmal mit kaltem Bindungsmedium (das kein markiertes IL-7 enthielt) und zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Die Ecken jeder Platte wurden dann abgebrochen, wobei sie eine flache Scheibe zurückließen, die dann mit Röntgenfilmen 72 Stunden bei -70ºC unter Verwendung eines intensivierenden Schirmes in Kontakt gebracht wurden. Die IL-7-Bindungsaktivität wurde auf den exprimierten Film als dunkler Focus gegen einen relativ gleichmäßigen Hintergrund sichtbar gemacht.
Nachdem ungefähr 100000 Rekombinanten der Bank auf diese Weise durchmustert worden waren, wurde ein Transfektantenpool beobachtet, der IL-7-bindende Foci ergab, die gegen die Hintergrundexpression eindeutig sichtbar waren.
Eine gefrorene Bakterienstammsuspension des positiven Pools wurde dann verwendet, um Platten mit ungefähr 200 Kolonien zu erhalten. Replikas dieser Platten wurden auf Nitrozellulosefiltern angefertigt, und die Platten wurden dann abgekratzt und Plasmid- DNA hergestellt und transfiziert, wie oben beschrieben, um eine positive Platte zu identifizieren. Bakterien aus individuellen Kolonien von den Nitrozellulosereplikas dieser Platte wurden in 2 ml-Kulturen wachsengelassen, die verwendet wurden, um Plasmid- DNA zu erhalten, die, wie oben beschrieben, in COS-7-Zellen transfiziert wurden. Auf diese Weise wurde ein einzelner Klon, Klon H1, isoliert, der in der Lage war, die Expression von humanem IL-7R in COS-Zellen zu induzieren. Das cDNA-Insert wurde in das Plasmid pGEMBL18 subkloniert, das ein Derivat des Standardklonierungsvektor pBR322 ist und einen Polylinker mit einer einzelnen EcoRI-Stelle, einer BamHI-Stelle und verschiedenen anderen einmal vorkommenden Restriktionsstellen enthält. Ein beispielhafter Vektor dieses Typs wird von Dente et al. (Nucl. Acids Res. 11:1645, 1983) beschrieben. Die kodierende cDNA- Region des Klones H1 entspricht der Sequenz der Nukleotide 1-882 der Figuren 2A-2C mit der Ausnahme, daß Klon H1 ein ATC-Kodon, das für Ile&sup4;&sup6; kodiert, und ein GTC-Kodon, das für Val¹¹&sup8; kodiert, hat; Klon H1 hat außerdem eine Nukleotidsequenz GTG AGT GTT TTT GGT GCT, die für eine C-terminale Aminosäuresequenz Val Ser Val Phe Gly Ala kodiert. Eine bakterielle Stichkultur (stab) des IL- 7R-cDNA-Klones H1 im Expressionsvektor pDC302 ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, unter dem Namen pCAV/NOT-IL-7R, Hinterlegungsnummer 68014, hinterlegt.
Ein weiterer humaner cDNA-Klon, der für IL-7R kodiert, wurde aus einer cDNA-Bank isoliert, die durch reverse Transkription polyadenylierter mRNA konstruiert wurde, die aus Gesamt-RNA isoliert wurde, die aus T-Lymphozyten aus peripherem Blut (gereinigt durch E-Rosettenbildung) extrahiert wurden, die 18 Stunden mit Phytohemaglutinin und Phorbol-12-myristat-13-acetat aktiviert worden waren. Die polyadenylierte mRNA wurde durch Chromatographie auf Oligo-dT-Zellulose isoliert und unter Verwendung von Standardverfahren zur Bereitstellung eines ersten cDNA-Stranges revers transkribiert. Diese cDNA wurde unter Verwendung von DNA- Polymerase doppelsträngig gemacht, mit EcoRI-Methylase methyliert, um EcoRI-Spaltstellen innerhalb der cDNA zu schützen, und an EcoRI-Linker ligiert. Die resultierenden Konstrukte wurden mit EcoRI verdaut, um alle bis auf eine Kopie der Linker an jedem Ende der cDNA zu entfernen, und mit EcoRI-geschnittenen und dephosphorylierten Armen des Bakteriophagen λgt10 (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL-Press, Seiten 49-78) ligiert. Die ligierte DNA wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits zur Schaffung einer rekombinanten Bank (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA) in Phagenpartikel verpackt. Die Rekombinanten wurden auf E. coli- Stamm C600(hfl&supmin;) plattiert und mittels Plaquehybridisierungsverfahren unter hoch stringenten Bedingungen (63ºC, 0,2 x SSC) unter Verwendung einer ³²P-markierten Sonde, die aus dem humanen IL-7R-cDNA-Klon H1 gemacht wurde, durchmustert. Ein hybridisierender Klon (Klon H20) wurde identifiziert, der den gesamten kodierenden Bereich von IL-7R überspannt. Die Figuren 2A-2C zeigen die Nukleotidsequenz des kodierenden Bereiches des cDNA-Klones H20 und die korrespondierende Aminosäuresequenz eines biologisch aktiven membrangebundenen humanen IL-7R-Proteines.

Beispiel 3

Isolierung humaner cDNA-Klone für löslichen IL-7R, die mit humanen IL-7-Rezeptor-Sonden-DNAs hybridisieren und für biologisch aktives humanes IL-7R kodieren

Eine ³²P-markierte Sonde, die vom Klon H1 abgeleitet wurde, wurde zur erneuten Durchmusterung der WI-26-Bank und zur Isolierung eines hybridisierenden Klones (Klon H6) verwendet. Die Sequenzanalyse zeigte, daß Klon H6 die Nukleotidsequenz der Figuren 3A- 3B hat, die für ein lösliches IL-7-Bindungsprotein kodiert, dem eine Transmembranregion fehlt. Von Klon H6 wird angenommen, daß er das Ergebnis eines alternativen mRNA-Spleiß-Ereignisses ist, in dem das Exon, das die Transmembranregion (die den Nukleotiden 729-822 des Klones H20 mit der vollen Länge, gezeigt in Figuren 2A-2C, entspricht) enthält, deletiert ist. Der Klon H6 kodiert daher für eine ausgeschiedene lösliche Form des IL-7-Rezeptors.

Beispiel 4

Isolierung von Maus-cDNA-Klonen, die mit humanen IL-7-Rezeptor-Sonden-DNAs hybridisieren

Eine ³²P-markierte Sonde wurde aus dem 2131 Basenpaare(bp)- Fragment des Klones H1 (siehe Beispiel 2) durch zufälliges Primen unter Verwendung von DNA-Polymerase-I hergestellt, wie vom Hersteller beschrieben (Amersham, Arlington Heights, IL, USA).
Durch reverse Transkription polyadenylierter mRNA, die aus Gesamt-RNA isoliert war, die aus kultivierten Zellen der Maus-pre- B-Zellinie 70Z/3 (ATCC Hinterlegungsnummer TIB 158) extrahiert worden war, wurde eine cDNA-Bank konstruiert. Die cDNA wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase-I doppelsträngig gemacht, mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig, mit EcoRI-Methylase methyliert, um EcoRI-Spaltstellen innerhalb der cDNA zu schützen, und mit EcoRI-Linkern ligiert. Die resultierenden Konstrukte wurden mit EcoRI verdaut, um bis auf eine alle Kopien des Linkers an jedem Ende der cDNA zu entfernen, und mit mit EcoRI geschnittenen und dephosphorylierten Armen des Bakteriophagen λgt10 (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL-Press, Seiten 49-78) ligiert. Ligierte DNA wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA 92121) in Phagenpartikel verpackt, um eine Rekombinantenbank zu erzeugen. Die Rekombinanten wurden auf E. coli-Stamm C600(hfl&supmin;) plattiert und durch übliche Plaquehybridisierungsverfahren unter moderat stringenten Bedingungen (50ºC, 2 x SSC) durchmustert.
Beim Durchmustern von ungefähr 300000 Phagenklonen aus der 70Z/3-cDNA-Bank wurden zwei Maus-cDNA-Klone (Klone P1 und P2) isoliert, die mit der humanen IL-7R-Sonde hybridisierten. Die Klone wurden Plaque-gereinigt und zur Herstellung von Bakteriophagen-DNA verwendet, die mit EcoRI verdaut wurde, gefolgt von präparativer Agarosegelelektrophorese, und dann in mit EcoRI geschnittenen pGEMBL subkloniert wurde. Klon P1 überspannt den gesamten kodierenden Bereich des Rezeptorproteines, enthält jedoch infolge eines Spleißfehlers ein Insert von 74 Nukleotiden im 5'- Bereich der cDNA, das zu einer vorzeitigen Beendigung der Translation führen würde, wenn es exprimiert wird. Klon P2 kodiert nur für den 5'-Teil der cDNA. Um einen Maus-IL-7R-cDNA-Klon mit voller Länge zu erhalten, wurde aus den Klonen P1 und P2 im in Beispiel 2 beschriebenen Expressionsvektor pDC302 ein Hybrid- cDNA-Molekül konstruiert. Ein 5'-HindIII-Restriktionsfragment des cDNA-Klones P2 wurde mit einem 3'-Restriktionsfragment des cDNA-Klones P1 ligiert. Eine Teilnukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des kodierenden Bereiches der resultierenden Hybrid-cDNA ist in den Figuren 4A-4C gezeigt.

Beispiel 5

Bindungsmerkmale humaner IL-7-Rezeptoren

Die verschiedenen, oben isolierten oder synthetisierten Klone wurden unter Verwendung des im Beispiel 1 beschriebenen Bindungstests analysiert. Gleichgewichtsbindungsexperimente, die mit WI-26VA4-Zellen (1,33 x 10&sup7; Zellen/ml) wie im Beispiel 1B durchgeführt wurden, erzeugten krummlinige Scatchardplots (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949), wie mit der Maus-pre-B-Zellinie IxN/2b beobachtet wurde (Park et al., J. Exp. Med., im Druck, 1990), die sowohl hohe (Ka = 5,6 ± 3,4 x 10&sup9; M&supmin;¹) als auch niedrige (Ka = 9,7 ± 3,5 x 10&sup7; M&supmin;¹) Bindungsaffinitäten zeigt.
Humanes IL-7R wurde analysiert, indem COS-Zellen mit dem humanen IL-7R-Klon H20 transfiziert wurden, wie in Beispiel 1B beschrieben. Die Daten erzeugten biphasische Scatchardplots, die den für die ¹²&sup5;I-IL-7-Bindung an WI-26VA4-Zellen beobachteten ähnlich sind. Im Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten hatten die COS-Zellen, die den humanen IL-7R-Klon H20 exprimieren, ungefähr 100000 hoch-affine Stellen (Ka = 3 x 10&sup9; M&supmin;¹) und mehr als 1 x 10&sup6; Stellen mit geringer Affinität (Ka = 1 x 10&sup7; M&supmin;¹) pro Zelle. COS-Zellen, die humanes IL-7R vom Klon H20 exprimieren, erzeugten ebenfalls einen krummlinigen Scatchardplot, der die Gegenwart von zwei Klassen von IL-7-Bindungsstellen zeigt, mit offensichtlichen Ka-Werten von 4,6 x 10&sup9; M&supmin;¹ und 4,1 x 10&sup7; M&supmin;¹. Obwohl die Anzahl von spezifischen Bindungsstellen pro Zelle von Transfektion zu Transfektion unterschiedlich war, weisen die Daten, die verwendet wurden, um den oben erwähnten Ka-Wert zu berechnen, auf ungefähr 3960 hoch-affine Stellen und insgesamt 3,8 x 10&sup5; Stellen mit niedriger Affinität hin. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Bindungsmerkmale von in COS-7-Zellen exprimierten rekombinanten humanen IL-7R denen der natürlich auftretenden Rezeptoren, die auf WI-26VA4-Zellen gefunden werden, sehr ähnlich sind.
Die Bindungsmerkmale des vom cDNA-Klon H6 kodierten Rezeptormoleküles wurden ebenfalls analysiert. Dem Klon H6 fehlt die mutmaßliche Transmembrandomäne und er wird von COS-7-Zellen ausgeschieden. Nach der Transfektion dieses Klones in COS-7-Zellen sind neben den natürlicherweise auf COS-7-Zellen auftretenden keine Oberflächen-gebundenen Rezeptoren nachweisbar. Zellüberstände der COS-7-Zellen wurden getestet, wie oben in Beispiel 1D beschrieben, um festzustellen, ob die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem IL-7 an die auf IxN/2b-Zellen vorhandenen IL-7-Rezeptoren inhibiert wurde. Eine Vorinkubation des ¹²&sup5;I-markierten IL-7 mit konditioniertem Medium von COS-7-Zellen, die mit H6-cDNA transfiziert waren, führte zur anschließenden Inhibition der Bindung von ¹²&sup5;I-IL-7 an IxN/2b-Zellen. Medien von COS-7-Zellen, die mit dem Plasmid pDC302 alleine tranfiziert waren, oder von Zellen, die den membrangebundenen Rezeptor exprimieren, für den die cDNA H20 kodiert, hatten eine geringe oder keine Wirkung. Das Rezeptorprotein, für das die cDNA H6 kodiert, dem die Transmembran- und C-terminalen Domänen fehlen, wird daher ausgeschieden und kann IL-7 in Lösung binden.

Beispiel 6

Herstellung monoklonaler Antikörper gegen IL-7R

Präparationen von gereinigtem rekombinantem IL-7R, beispielsweise humanem IL-7R, oder transfizierte COS-Zellen, die hohe Spiegel von IL-7R exprimieren, werden zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen IL-7R unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, beispielsweise der in dem US-Patent 4411993 offenbarten Verfahren, verwendet. Solche Antikörper sind wahrscheinlich nützlich, um die IL-7-Bindung an IL-7-Rezeptoren zu stören, beispielsweise für die Abschwächung toxischer oder anderer unerwünschter Wirkung von IL-7, oder als Bestandteile eines diagnostischen oder Forschungstest auf IL-7 oder löslichen IL-7-Rezeptor.
Zur Immunisierung von Mäusen wird IL-7-Immunogen in vollständigem Freund'schen Adjuvanz emulgiert und in Mengen im Bereich von 10 bis 100 ug subkutan in Balb/c-Mäuse injiziert. 10-12 Tage später werden die immunisierten Tiere mit weiterem Immunogen, emulgiert in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz, und anschließend periodisch nach einem wöchentlichen oder zweiwöchentlichen Impfplan aufgefrischt. Durch retroorbitale Blutentnahme oder Schwanzspitzenexzision werden periodisch Serumproben zum Test durch Dot-blot-Tests (Antikörper-Sandwich) oder ELISA (enzymgebundener Immunadsorptionstest) genommen. Andere Testverfahren sind ebenfalls geeignet. Nach dem Nachweis eines geeigneten Antikörpertiters wird den positiven Tieren eine intravenöse Injektion von Antigenen in Kochsalzlösung gegeben. 3-4 Tage später werden die Tiere getötet, Splenozyten geerntet und mit der Maus-Myelomzellinie NS1 fusioniert. Die nach diesem Verfahren erzeugten Hybridomzellinien werden in mehreren Mikrotiterplatten in selektivem HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) plattiert, um die Proliferation von nicht fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellenhybriden zu inhibieren.
Die so erzeugten Hybridomklone können mit ELISA auf Reaktivität mit IL-7R durchmustert werden, beispielsweise durch Anpassung der von Engvall et al., Immunochem. 8:871 (1971) und im US- Patent 4703004 offenbarten Verfahren. Positive Klone werden dann in die Peritonealhöhlen syngenischer Balb/c-Mäuse injiziert, um eine Ascites mit hohen Konzentrationen (> 1 mg/ml) monoklonaler anti-IL-7R-Antikörper zu erzeugen. Der resultierende monoklonale Antikörper kann durch Ammoniumsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelausschlußchromatographie und/oder Affinitätschromatographie auf der Grundlage der Bindung von Antikörper an Protein A von Staphylococcus aureus gereinigt werden.

Claims

1. Isolierte DNA, kodierend für einen Interleukin-7 Rezeptor (IL-7R), umfassend eine DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus:

a) dem kodierenden Bereich einer DNA-Sequenz, die aus den folgenden Nukleotidsequenzen ausgewählt ist:

b) einer DNA-Sequenz, die an eine Nukleotidsequenz nach (a) unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren kann; und

c) einer DNA-Sequenz, die als Folge des genetischen Kodes eine Degeneration einer DNA-Sequenz nach (a) oder (b) darstellt;

worin die DNA-Sequenz für einen IL-7R kodiert, der IL-7 binden kann.

2. Isolierte DNA nach Anspruch 1, worin die DNA eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus den Nukleotiden 23-1402 und 83-1402 von

den Nukleotiden 33-818 und 93-818 von

den Nukleotiden 48-1427 und 108-1427 von

3. Isolierte DNA nach Anspruch 1, die für ein IL-7R-Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die mindestens 80 % identisch mit einer Aminosäuresequenz ist, die ausgewählt ist aus den Aminosäuren 1-439 und 1-219 von

den Aminosäuren 1-242 von

den Aminosäuren 1-438 und 1-219 von

4. Isolierte DNA nach Anspruch 3, die für ein IL-7R-Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus den in Anspruch 3 ausdrücklich zitierten Aminosäuresequenzen ausgewählt ist.

5. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 3, die für ein humanes IL-7R-Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die mindestens 80 % identisch mit einer Aminosäuresequenz ist, die ausgewählt ist aus den Aminosäuren 1-219 und 1-439 von

worin der Rest 46 Ile oder Thr, der Rest 118 Val oder Ile, der Rest 224 Thr oder Ile und der Rest 336 Ile oder Val ist.

6. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven Säuger- IL-7R-Proteins, umfassend das Kultivieren einer geeigneten Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert ist, unter Bedingungen, die die Expression des IL-7R-Proteins fördern.

8. Gereinigtes biologisch aktives IL-7R-Protein, wobei das Protein von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodiert wird.

9. Gereinigtes IL-7R-Protein nach Anspruch 8, wobei das IL-7R ein lösliches IL-7R-Protein ist.

10. Gereinigtes IL-7R-Protein nach Anspruch 8, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80 % identisch mit einer Aminosäuresequenz ist, die ausgewählt ist aus den Aminosäuren 1-439 und 1-219 von

den Aminosäuren 1-242 von

den Aminosäuren 1-438 und 1-219 von

11. Gereinigtes IL-7R-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus den in Anspruch 10 ausdrücklich zitierten Aminosäuresequenzen ausgewählt ist.

12. Verwendung eines gereinigten löslichen IL-7R-Proteins nach Anspruch 9 bei der Herstellung eines Medikamentes zum Regulieren einer Immunantwort in einem Säuger.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein gereinigtes lösliches IL-7R-Protein nach Anspruch 9 und ein geeignetes Verdünnungsmittel, ein Korrigens, einen Stabilisator oder einen Träger.

14. Verwendung eines IL-7R-Proteins nach Anspruch 8 in einem in vitro-Test zum Nachweisen der Gegenwart von IL-7 oder der Bindung von IL-7 an IL-7R.

15. Antikörper, der mit einem Säuger-IL-7-Rezeptor nach Anspruch 8 immunreaktiv ist.