DE69534217T2

DE69534217T2 - Verfahren zur hemmung von nichtspezifischer hybridisierung in primerverlängerungsreaktionen

Info

Publication number: DE69534217T2
Application number: DE69534217T
Authority: DE
Inventors: Akio Takata-gun YAMANE
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-12-11
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2015-12-12
Also published as: DE69534217D1; EP0799888A1; WO1996017932A1; US6033851A; EP0799888B1; EP0799888A4; CA2206451A1; CA2206451C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unterdrücken unspezifischer Verlängerung von Primern in Primer-Verlängerungsverfahren.
Hintergrund-Fachgebiet
Die Primer-Verlängerungsreaktion, welche eine Nucleinsäure komplementär zu einer Nucleinsäurematrize bildet, hat nicht nur eine wichtige Rolle in einem Organismus, sondern wird außerdem als eine essentielle Technik in der Gentechnik verwendet. Bei der Reaktion bilden eine Matrize und ein Primer, welcher komplementär zu der Matrize ist, einen Doppelstrang, und dann addiert Polymerase die zur Matrize komplementären Mononucleotide im 3'-Ende des Primers. Vary et al. schlugen ein Verfahren zum Detektieren von Nucleinsäuren unter Verwendung der obigen matrizenabängigen Primer-Verlängerungsreaktion vor (U.S. Patent Nr. 4,851,331).
Verschiedene Genamplifikationsverfahren, die das obige Primer-Verlängerungsverfahren verwenden (beispielsweise das PCR-Verfahren, SDA-Verfahren, RCR-Verfahren, NASB-Verfahren, 3SR-Verfahren: Keller, G.H. et al., DNA Probes, S. 255–297, Stockton Press (1993); Persing, D.H. et al., Diagnostic Molecular Microbiology, S. 51–87, American Society for Microbiology (1993)) sind entwickelt worden, welche signifikant zum Fortschritt der Gentechnik beigetragen haben.
Jedoch sind bei diesen Genamplifikationsverfahren unter Verwendung des Primer-Verlängerungsverfahrens überschüssi ge Mengen an Reagentien (Polymerase, Primer, Einheit-Nucleinsäure, etc.) relativ zu einem Matrizengen, das amplifiziert werden soll, am Anfang der Reaktion notwendig, um das Gen ungefähr millionenfach zu amplifizieren. Deshalb ist es sehr wahrscheinlich, dass unspezifische Hybridisierungen auftreten (Chou et al., Nucleic Acids Res., 20, 1717 (1992)). Außerdem ist es selbst bei dem PCR-Verfahren, von dem man glaubt, dass es das beste hinsichtlich der Spezifität ist, schwierig, hochspezifische Amplifikation durchzuführen, wenn die Menge an Matrizennucleinsäure extrem klein ist, oder große Mengen an Verunreinigungen, die von einer Probe stammen, vorhanden sind. Außerdem fand man, dass Primer-Dimere ein unerwartetes Problem bei dem PCR-Verfahren verursachen (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4580–4584 (1990)).
Um die obigen Probleme zu lösen, wurden das Heiß-Start-Verfahren („Hot Start Method") (Chou et al., Nucleic Acids Res. 20, 1717–1723 (1992)), ein Verfahren unter Verwendung eines Polymerase-Antikörpers (Kellogg et al., Bio Techniques 16, 1134–1137 (1994); Sharkey et al., BIO/TECHNOLOGY 12, 506–507 (1994)) und andere vorgeschlagen. Jedoch kann keines dieser Verfahren unspezifische Hybridisierung, auch nicht unspezifische Erweiterungsreaktion nach dem Start der PCR-Reaktion ausreichend unterdrücken und kann auch kein anderes Amplifikationsverfahren außer dem PCR-Verfahren angewendet werden. Ein verschachteltes PCR-Verfahren, das zwei Sätze an Primern verwendet (Pierre et al., J. Clin. Microbiol. 29, 712–717 (1991)) verbessert definitiv die Spezifität; jedoch wird dieses Verfahren als verfahrenstechnisch unpraktikabel angesehen.
U.S. 5,348,853 offenbart ein Verfahren für eine Polymerase-abhängige Erweiterungsreaktion zum Synthetisieren eines Erweiterungsprodukts, komplementär zu einer Zielnucleinsäure innerhalb einer größeren Nucleinsäurematrize.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Unterdrücken unspezifischer Hybridisierung beim Primer-Verlängerungsverfahren bereitzustellen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Unterdrücken unspezifischer Hybridisierung in einem Primer-Verlängerungsverfahren bereitgestellt, das umfasst:
gemeinsames Inkubieren eines Primers, einer Matrize und eines dritten Nucleinsäuremoleküls unter für das Verlängern des Primers ausreichenden Bedingungen,
wobei der Primer in der Lage ist, spezifisch an das dritte Nucleinsäuremolekül zu hybridisieren, wobei die Affinität des Primers zu dem dritten Nucleinsäuremolekül geringer ist oder gleich wie die Affinität des Primers zu der Matrize, und wobei das dritte Nucleinsäuremolekül an den Primer auf eine andere Art als Hybridisierung gebunden ist, um intramolekulare Hybridisierung zu ermöglichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein Verfahren zum Verlängern eines Primers bereitgestellt, das umfasst:
gemeinsames Inkubieren eines Primers, einer Matrize und eines dritten Nucleinsäuremoleküls unter für das Verlängern des Primers ausreichenden Bedingungen,
wobei der Primer in der Lage ist, spezifisch an den 3'-Teil des dritten Nucleinsäuremoleküls zu hybridisieren, wobei die Affinität des Primers zu dem dritten Nucleinsäuremolekül geringer als oder gleich wie die Affinität des Primers zu der Matrize ist, und wobei das dritte Nucleinsäuremolekül in der Lage ist, an das 3'-Ende des Primers zu hybridisieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird unspezifische Hybridisierung bei der Primer-Verlängerungsreaktion unterdrückt. Es wird angenommen, dass dies durch die Abnahme bei der unspezifischen Hybridisierung des Primers an den Nucleinsäure-Matrizenstrang in Gegenwart der zum Primer komplementären Nucleinsäure bedingt ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Ausdruck „Nucleinsäure" betrifft hierin Nucleinsäuren, umfassend Ribonucleotide und/oder Desoxyribonucleotide, welche DNA, RNA und Oligonucleotide, die ein Gemisch von Ribonucleotiden und Desoxyribonucleotiden umfassen, einschließen.
Weiterhin bezieht sich der Ausdruck „Nucleinsäurederivat" hierin auf Derivate, bei welchen Atome (z. B. ein Wasserstoffatom, Sauerstoffatom) oder funktionelle Gruppen (z. B. eine Hydroxylgruppe, Aminogruppe) der Base, Ribose, Phosphorsäurediesterbindung oder anderer Anteile bzw. Gruppierungen einer Nucleinsäure durch andere Atome (z. B. ein Wasserstoffatom, Schwefelatom), funktionelle Gruppen (z. B. eine Aminogruppe) oder Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen substituiert sind; oder durch Schutzgruppen (z. B. eine Methylgruppe oder Acylgruppe) geschützt sind; oder genannte Anteile sind durch Gruppierungen nichtnatürlicher Art (z. B. Peptide) substituiert.
Beispiele derartiger Derivate schließen Peptidnucleinsäure (PNA, „peptide nucleic acid"), bei welcher Basengruppierungen durch Peptidbindungen verbunden sind (Nielsen et al., J. Amer. Che. Soc., 114, 9677–9678 (1992)), seltene Nucleinsäuren, die in der Natur gefunden werden (Nucleic Acids Research, 22 (2), 2183 (1994)), Nucleinsäuren, bei denen Wasserstoffatome von Aminogruppen von Basengruppierungen durch Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen substituiert sind, Nucleinsäuren, bei welchen die Stereokonfiguration der Hydroxylgruppen von Ribosegruppierungen verändert ist, und Nucleinsäuren, bei welchen Sauerstoffatome von Phosphorsäurediesterbindungs-Anteilen durch Schwefelatome substituiert sind, ein.
Weiterhin bezieht sich der Ausdruck „Primer" auf Nucleinsäuremoleküle und ihre Derivate, welche beim Start der Reaktion für Nucleinsäuresynthese erforderlich sind. Dementsprechend können die obige DNA und RNA und ihre Derivate auch als die Primer verwendet werden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist in erste Linie die Primer-Verlängerungsreaktion, welche eine Nucleinsäurekette, die komplementär zu einem Nucleinsäurematrizenstrang ist, durch einen Primer bildet, wobei die Reaktion zwischen dem Primer und dem Matrizenstrang in Gegenwart einer Nucleinsäure oder eines Derivats davon durchgeführt wird, welche(s) komplementär zu dem Primer ist und eine Affinität zu dem Primer aufweist, welche gleichwertig wie oder geringer als die des Primers zu dem Nucleinsäurematrizenstrang (Primer-komplementäre Nucleinsäure) ist. Wie nachstehend verwendet, schließt der Ausdruck „Primer-komplementäre Nucleinsäure" ihre Derivate ein.
Eine Theorie für das Unterdrücken der unspezifischen Hybridisierung ist wie folgt, aber nicht darauf beschränkt: zunächst ist unspezifische Hybridisierung ein Phänomen, bei welchem der Primer an einer anderen Stelle als der Zielregion, wo der Primer hybridisiert werden soll, hybridisiert wird und folglich wird eine andere Sequenz als die Zielsequenz, ausgehend von dieser Stelle, gebildet. Wenn eine Primer-komplementäre Nucleinsäure, welche komplementär zu dem Primer ist, und die Affinität zu dem Primer aufweist, welche gleichwertig wie oder geringer als die des Primers zu dem Matrizenstrang hier vorhanden ist, könnte diese Primer-komplementäre Nucleinsäure von dem Anteil des Primers, welcher nicht an die Zielstelle hybridisiert ist, angezogen werden und mit dem Anteil hybridisieren. Als ein Ergebnis ist weniger wahrscheinlich, dass der Primer an eine andere Stelle als die Ziel region hybridisiert, wodurch unspezifische Hybridisierung unterdrückt wird. Ferner hat, weil die Affinität der Primer-komplementären Nucleinsäure zu dem Primer gleich wie oder geringer als die des Matrizenstrangs zu dem Primer ist, die Primer-komplementäre Nucleinsäure keinen nachteiligen Effekt auf die Hybridisierung des Primers an die Zielregion.
Der Ausdruck „Affinität" hierin kann beispielsweise durch Hitzestabilität einer Verbindung, wie ausgedrückt durch ihre Schmelztemperatur (Tm) verwendet werden (Higgins et al., Nucleic Acid Hybridization, S. 80, IRL PRESS (1985)). Ein großer Tm-Wert bedeutet nämlich hohe Affinität und ein kleiner Tm-Wert bedeutet geringe Affinität.
Ein Verfahren, die Affinität zwischen der Primer-komplementären Nucleinsäure und dem Primer zu reduzieren ist, die Primer-komplementäre Nucleinsäurekette kürzer als den Primer zu machen. Weil unspezifische Hybridisierung an einer Stelle näher an dem 3'-Ende des Primers zu einem wichtigeren Faktor wird, ist es wünschenswert, die Primerkomplementäre Nucleinsäure von dem 3'-Ende zu kürzen. Die Kettenlänge der Primer-komplementären Nucleinsäure kann geeignet bestimmt werden, indem man die Affinität berücksichtigt. Beispielsweise ist sie vorzugsweise 1–0,4, stärker bevorzugt 0,9–0,6, wenn die Kettenlänge des Primers auf 1 gesetzt ist.
Außerdem kann die Affinität reduziert werden, indem man ein Nucleotid in die Primer-komplementäre Nucleinsäure einfügt, welches nicht mit dem Primer komplementär ist. Die Affinität kann außerdem durch Einführen einer Base reduziert werden, welche komplementär zu der des Primers ist, aber einen komplementären Strang mit einer schwächeren Wasserstoff-Brückenbindung bildet, beispielsweise Inosin (Martin et al., Nucleic Acids Res. 13, 8927–8938 (1985)).
Es ist vorzuziehen, die Primer-Verlängerungsaktivität der Primer-komplementären Nucleinsäure, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, vorher zu inaktivieren, weil die Primer-komplementäre Nucleinsäure selbst als ein Primer wirken kann. Die Inaktivierung kann beispielsweise durch Desoxygenierung des 3'-Endes (beispielsweise Desoxygenierung des Nucleotids am 3'-Ende zu 2',3'-Didesoxyribonucleotid) oder durch Schutz mit einer Schutzgruppe (beispielsweise einer Methylgruppe oder Acylgruppe) durchgeführt werden.
In der vorliegenden Erfindung binden der Primer und die Primer-komplementäre Nucleinsäure aneinander, um ein Molekül zu bilden. Wenn die Primer-komplementäre Nucleinsäure in sehr naher Nachbarschaft zu dem Primer ist, d.h. beide Stränge in demselben Molekül sind, kann der Primeranteil leicht von der Primer-komplementären Nucleinsäure abgefangen werden, um eine intramolekulare Bindung zu bilden, wenn der Primer nicht an den Zielmatrizenstrang hybridisiert ist. Auf diese Weise kann unspezifische Hybridbildung wirksam unterdrückt werden.
Dementsprechend betrifft der Ausdruck „ein Molekül" einen Zustand, bei welchem die Primer-komplementäre Nucleinsäure direkt oder indirekt durch eine andere Art als Hybridisierung (beispielsweise kovalente Bindung) an den Primer gebunden ist.
Das Verfahren, das verwendet wird, um das eine Molekül zu bilden, sollte vorzugsweise das Hybridisierungsvermögen des Primers an die Primer-komplementäre Nucleinsäure nicht verringern. Beispiele von Bindungsstellen, welche die Hybridisierung nicht vermindern, sind die Hydroxylgruppe, die Basengruppierung und der Phosphosäurediester am 5'-Ende für den Primer und die Hydroxylgruppe, die Basengrup pierung und der Phosphosäurediesteranteil am 5'-Ende oder 3'-Ende für die Primer-komplementäre Nucleinsäure.
Spezifischer wird beispielsweise das eine Molekül durch ein Verfahren gebildet, bei welchem ein Oligonucleotid modifiziert wird (Ecrstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL PRESS (1991)), um einen Linker zu inkorporieren, und die beiden werden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Quervernetzungsmittels quervernetzt.
Jede Länge des Linkers kann geeignet sein, solange sie die Hybridisierung zwischen dem Primer und der Primerkomplementären Nucleinsäure nicht verringert. Die geeignete Länge hängt von der Länge des Primers und der Primerkomplementären Nucleinsäure oder der Stelle der Quervernetzung ab; beispielsweise ist ein Abstand von 3–50 Atomen (vorzugsweise 5–30 Atomen) geeignet. Der Linker kann aus beliebigen Elementen bestehen, solange sie die Hybridisierung des Primers an die Primer-komplementäre Nucleinsäure oder die Primer-Verlängerungsreaktion nicht beeinflussen.
Beispiele des Linkers schließen gesättigte und ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppen, alicyclische Kohlenwasserstoffgruppen, aromatische Kohlenwasserstoffgruppen und heterocyclische Gruppen ein. Beispiele der gesättigten Kohlenwasserstoffe schließen Alkylgruppen mit 3–50 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Alkylgruppen mit 5–30 Kohlenstoffatomen, stärker bevorzugt Alkylgruppen mit 5–10 Kohlenstoffatomen, ein.
Das Linkermolekül kann Esterbindungen, Etherbindungen, Peptidbindungen, Sauerstoffatome, Schwefelatome und Stickstoffatome alleine oder in Kombination enthalten, und eines oder mehrere seiner Wasserstoffatome kann durch eine Carboxylgruppe, Aminogruppe, Alkoxygruppe, Acylgruppe, Alkoxycarbonylgruppe, Acyloxygruppe, Hydroxylgruppe oder ein Halogenatom substituiert sein. Der Linker kann eine norma le Kette sein oder kann verzweigte Ketten enthalten. Der Linker ist vorzugsweise hydrophil und kann beispielsweise Etherbindungen, Peptidbindungen oder dergleichen enthalten.
Die Quervernetzung wird beispielsweise durch ein Verfahren durchgeführt, bei welchem Linker mit einer Aminogruppe und Thiolgruppe in beide Nucleinsäuren eingeführt werden und anschließend die Nucleinsäuren unter Verwendung eines bifunktionellen Quervernetzungsmittels (beispielsweise N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimid (EMCS), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)) quervernetzt werden. Die Quervernetzung kann außerdem unter Verwendung eines Reagenses zur Einführung eines Abstandhalters bzw. Spacers zwischen Nucleotiden (Nelson et al., Nucleic Acids Res. 20, 6253–6259 (1992)) und Synthetisieren des Primers und der Primer-komplementären Nucleinsäure in Aufeinanderfolge unter Verwendung eines DNR-Synthetisierers durchgeführt werden.
Der Ausdruck „Primer-Verlängerungsreaktion" hierin betrifft eine Reaktion, bei welcher eine Nucleinsäure, komplementär zu einem Nucleinsäure-Matrizenstrang, unter Verwendung von Polymerase an das 3'-Ende eines Primers angefügt wird. Beispiele von Prozessen, bei welchen das Primer-Verlängerungsverfahren verwendet wird, schließen Genamplifikationsverfahren, wie z.B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Verfahren), das selbst-anhaltende Sequenz-Replikationsverfahren (3SR-Verfahren, „Self-sustained Sequence Replication method"), das Nucleinsäure-basierte Amplifikationsverfahren (NASBA-Verfahren, „Nucleic Acid Based Amplification method"), das Reparatur-Kettenreaktionsverfahren (RCR-Verfahren, „Repair Chain Reaction method"), das Strangersetzungs-Amplifikationsverfahren (SDA-Verfahren, „Strand Displacement Amplification method"), das Polymerase/Ligase-Kettenreaktionsverfahren (P/LCR-Ver fahren, „Polymerase/Ligase Chain Reaction method") und das Sanger-Verfahren ein.
Die Primer-Verlängerungsreaktion kann in einer Reaktionslösung durchgeführt werden, die einen Nucleinsäure-Matrizenstrang, einen Primer, eine Polymerase, Mononucleotide, etc. enthält. Zuerst wird die Reaktionslösung unter Hybridisierungsbedingungen platziert (beispielsweise bei einer Temperatur, niedriger als die Schmelztemperatur) und dann wird der Primer unter Verwendung von Polymerase verlängert.
Weiterhin kann die Reaktionslösung einen Nucleinsäure-Matrizenstrang, Polymerase, Mononucleotide, etc. enthalten. Der Nucleinsäure-Matrizenstrang kann DNA oder RNA oder ein Derivat davon sein. Beispiele von zu verwendender Polymerase schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, DNA-Polymerase, RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) und RNA-Polymerase. Beispiele von Mononucleotiden schließen Ribonucleotide und Desoxyribonucleotide und Derivate davon (beispielsweise ein Derivat, bei welchem die 3'-Hydroxylgruppe desoxygeniert ist) oder Gemische davon ein.
Der Ausdruck „spezifizierter Primer" bezieht sich auf einen Primer, welcher in Relation zu der Matrizen-Nucleinsäure in dem Reagens spezifiziert ist. Dementsprechend ist die zu diesem Primer komplementäre Nucleinsäure spezifiziert. Beispielsweise ist, wenn die Matrizen-Nucleinsäure das Protein A-Gen von Staphylococcus aureus ist, der spezifizierte Primer eine Nucleinsäure mit einer zum Zielgen komplementären Sequenz, beispielsweise SPA1 und SPA2, wie in Beispiel 1 beschrieben.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erklärt werden. Jedoch ist nicht beabsichtigt, dass die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt ist.
Oligodesoxyribonucleotidsynthese wurde in der vorliegenden Erfindung gemäß dem Phosphoramidit-Verfahren (Caruthers et al., Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)) unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts, Modell 381A (Applied Biosystems) durchgeführt. Ein am 5'-Ende markiertes Oligonucleotid wurde hergestellt, indem zuerst in ein Oligonucleotid eine 5'-Ende-Aminogruppe eingeführt wurde und dann mit einem geeigneten Markierungsreagens (z. B. Biotingruppe, Dinitrophenolgruppe (DNP)) markiert wurde. Weiterin wurde ein Oligonucleotid mit einer in das 3'-Ende eingeführten Aminogruppe gemäß dem Verfahren von Nelson et al. (Nelson et al., Nucleic Acids Res., 17, 7187–7194 (1989)) hergestellt. Die PCR-Reaktion wurde gemäß dem in PCR Protocols (Innis, M.A.S. Academic Press (1990)) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Amplifikation durch die PCR-Reaktion wurde gemäß dem ED-PCR-Verfahren (offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 252300/1989) durchgeführt.
Beispiel 1: Detektion des spezifizierten Gens durch PCR-Verfahren (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
Das Protein A-Gen, einzigartig in Staphylococcus aureus, wurde als das spezifizierte Gen verwendet (Shuttleworth H.L. et al., Gene 58, 283–295 (1987)). Ein Teil des für Protein A codierenden Gens (224 Basenpaare) wurde gemäß dem PCR-Verfahren unter Verwendung des folgenden Satzes an Primern spezifisch amplifiziert und durch Agarosegelelektrophorese bestätigt.
SPA1: 5'-BIO-TACATGTCGTTAAACCTGGTG-3'
SPA2: 5'-DNP-TACAGTTGTACCGATGAATGG-3'
Eine Biotin(BIO)-Gruppe und eine Dinitrophenol(DNP)-Gruppe wurden an den 5'-Enden von SPA1 bzw. SPA2 eingeführt.
Durch das ED-PCR-Verfahren unter Verwendung der obigen Primer produzierte PCR-Produkte wurden wie folgt detektiert.
Zuerst wurde eine PCR-Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung hergestellt.

10 X Amplitaq (Handelsname)-Reaktionslösung 5 μl

20 mM dNTP 0,5 μl

SPA1 50 ng/μl 1 μl

SPA2 50 ng/μl 1 μl

Amplitaq (Handelsname)-DNA-Polymerase (1,25 U/μl) 1 μl

H₂O 41,5 μl
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der obigen Reaktionslösung mit und ohne Staphylococcus aureus-DNA (400 pg/μl, 1 μl) als eine Matrizen-DNA durchgeführt. SPA1 und SPA2 wurden als Primer verwendet. Die PCR-Reaktion wurde über 35 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und 60 Sekunden bei 72°C war. Die Reaktion wurde in der Reaktionslösung (10 μl), supplementiert mit einem alkalischen Phosphatase-markierten Antikörper auf einer Streptavidin-Platte durchgeführt.
Nach 30 Minuten wurde die Reaktionslösung entfernt und die Platte wurde 3-mal mit einer Waschlösung gewaschen.
Schließlich wurden eine Pufferlösung und ein färbendes Substrat (1 M Diethanolaminamin (pH 9,8), 0,5 mM MgCl₂, 4 mg/ml p-Nitrophenylphosphorsäurephosphat) zu der Platte für eine Farbreaktion zugegeben und die optische Dichte wurde unter Verwendung eines Platten-Lesegeräts gemessen.
Farbentwicklung, ausgedrückt durch die optische Dichte nach 10 Minuten, mit und ohne Staphylococcus aureus-DNA (400 pg) war 1,80 bzw. 0,01. Wenn die PCR-Reaktion über 40 Zyklen durchgeführt wurde, war Farbentwicklung nach 10 Minuten mit und ohne Staphylococcus aureus-DNA (400 pg) 1,93 bzw. 1,00.
In anderen Worten wurde die Detektion von positiven und negativen Reaktionen für Staphylococcus aureus schwierig, wenn die Anzahl der Zyklen der PCR-Reaktion von 35 auf 40 erhöht wurde.
Beispiel 2: Unterdrücken unspezifischer Verlängerungsreaktion in PCR-Verfahren (1) (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
Oligonucleotide, komplementär zu Primern SPA1 und SPA2 wurden synthetisiert und auf ihre Unterdrückung der unspezifischen Verlängerungsreaktion im PCR-Verfahren hin getestet.
SPA1-C1: 5'-CACCRGGTTTAAC-3' NH₂
SPA2-C1: 5'-CCATTCATCGGTA-3' NH₂
SPA1-C1 weist eine Sequenz, komplementär zu den 13 Basen von dem 3'-Ende des Primers SPA1 auf, und SPA2-C1 weist eine Sequenz, komplementär zu den 13 Basen vom 3'-Ende des Primers SPA2, auf. Weiterhin wurde eine Aminogruppe (NH₂) am 3'-Ende der zu jedem Primer komplementären Oligonucleotide inkorporiert.

PCR-Reaktionslösungen, die die unten angegebenen Zusammensetzungen aufwiesen, wurden hergestellt und die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von SPA1 und SPA2 als Primer durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde 40 Zyklen lang durchgeführt, wobei ein Zyklus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und 60 Sekunden bei 72°C war. Reaktionslösung 1

10 X Amplitaq (Handelsname)-Reaktionslösung	5 μl
20 mM dNTP	0,5 μl
SPA1 50 ng/μl	1 μl
SPA2 50 ng/μl	1 μl
Amplitaq (Handelsname)-DNA-Polymerase (1,25 U/μl)	1 μl
SPA1-C1 500 ng/μl	5 μl
SPA2-Cl 500 ng/μl	5 μl
H₂O	31,5 μl

Reaktionslösung 2

10 X Amplitaq (Handelsname)-Reaktionslösung	5 μl
20 mM dNTP	0,5 μl
SPA1 50 ng/μl	1 μl
SPA2 50 ng/μl	1 μl
Amplitaq (Handelsname)-DNA-Polymerase (1,25 U/μl)	1 μl
SPA1-C1 500 ng/μl	10 μl
SPA2-C1 500 ng/μl	10 μl
H₂O	21,5 μl

Reaktionslösung 3

10 X Amplitaq (Handelsname)-Reaktionslösung	5 μl
20 mM dNTP	0,5 μl
SPA1 50 ng/μl	1 μl
SPA2 50 ng/μl	1 μl
Amplitaq (Handelsname)-DNA-Polymerase (1,25 U/μl)	1 μl
H₂O	41,5 μl

Die PCR-Reaktion wurde für jede Reaktionslösung mit oder ohne Zugabe von Staphylococcus aureus-DNA (400 pg/μl, 1 μl) durchgeführt, und die optische Dichte wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen.
Farbentwicklung nach 12 Minuten war wie folgt:
Beispiel 3: Unterdrücken unspezifischer Verlängerungsreaktion im PCR-Verfahren (2) (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
Unterdrückung unspezifischer Verlängerungsreaktion im PCR-Verfahren wurde unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide SPA1-C2 und SPA2-C2, komplementär zu Primern SPA1 bzw. SPA2, versucht.
SPA1-C2: 5'-CACCAGGTTTARCGACAT-3' NH₂
SPA2-C2: 5'-CCATTCATCGGTACAACT-3'-NH₂
SPA1-C2 war zu 18 Basen vom 3'-Ende des Primers SPA1 komplementär und SPA2-C2 war zu 18 Basen vom 3'-Ende des Primers SPA2 komplementär.

PCR-Reaktionslösungen, die die untenstehenden Zusammensetzungen aufwiesen, wurden hergestellt, und die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von SPA1 und SPA2 als Primer durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde 40 Zyklen lang durchgeführt, wobei ein Zyklus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und 60 Sekunden bei 72°C war. Reaktionslösung 4

10 X Amplitaq (Handelsname)-Reaktionslösung	5 μl
20 mM dNTP	0,5 μl
SPA1 50 ng/μl	1 μl
SPA2 50 ng/μl	1 μl
Amplitaq (Handelsname)-DNA-Polymerase (1,25 U/μl)	1 μl

H₂O

41,5 μl

Reaktionslösung 5

10 X Amplitaq (Handelsname)-Reaktionslösung	5 μl
20 mM dNTP	0,5 μl
SPA1 50 ng/μl	1 μl
SPA2 50 ng/μl	1 μl
Amplitaq (Handelsname)-DNA-Polymerase (1,25 U/μl)1	1 μl
SPA1-C2 500 ng/μl	1 μl
SPA2-C2 500 ng/ml	1 μl
H₂O	39,5 μl

Die PCR-Reaktion wurde für jede oben stehende Reaktionslösung durchgeführt und die optische Dichte wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen. Ferner wurde ein ähnliches Experiment mit Lösungen, ergänzt mit menschlicher DNA (700 ng pro Reaktion) als eine Matrize durchgeführt.
Farbentwicklung nach 10 Minuten war wie folgt:
Beispiel 4: Unterdrücken unspezifischer Verlängerungsreaktion in PCR-Verfahren (3)
(1) Synthese von Primer, gebunden an Primer-komplementäre Nucleinsäure
Primer, gebunden an Primer-komplementäre Nucleinsäuren, wie unten gezeigt, wurden synthetisiert.
SPA1C: 5'-BIO-CACCAGGTTTAAC-(Linker)-TACATGTCGTTAAACCTGGTG
SPA2C: 5'-DNP-CCATTCATCGGTA-(Linker)-TACRGTTGTACCGATGAATGG
Für SPA1C wurde der Primerteil zuerst synthetisiert, gemäß dem allgemeinen Oligonucleotid-Syntheseverfahren. Die oben stehende Sequenz wurde sequentiell vom 3'-Ende addiert und nachdem die Base des 5'-Endes des Primers addiert war, wurde C6-Thiol Modifier (Handelsname, Clonetech) addiert, um eine Thiolgruppe einzuführen. Das so synthetisierte Produkt wurde von dem Träger entfernt und die Schutzgruppen wurden gemäß konventioneller Verfahren entfernt. Ein Rohprodukt wurde durch Gelfiltration (Sephadex G-50, 50 mM TEAB-Puffer, pH 7,2) erhalten. Das Rohprodukt (10 A₂₆₀ Einheiten) wurde durch Evaporation getrocknet und in 100 μl 0,1 M TEAA (Triethylammoniumacetat), pH 7,5, gelöst. 1 M AgNO₃ (15 μl) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang reagieren gelassen. Als nächstes wurden 10 μl 1,0 M DTT (Dithiothreitol) zugegeben und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang fortgesetzt. Das so gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt und durch Gelfiltration (Sephadex G-50, 40 mM Phosphatpuffer, pH 6,0) gereinigt. Das resultierende Eluat wurde für die nächste Reaktion verwendet.
Der zum Primer komplementäre Anteil wurde wie folgt synthetisiert. Um eine Aminogruppe unter Verwendung des Trägers des Nelson-Verfahrens (Nelson, Nucleic Acids Res., 17, 7187–7194 (1989)) am 3'-Ende einzuführen, wurde die zum Primer komplementäre Basensequenz sequentiell addiert. Nach dem Addieren der letzten Base wurde Biotin ON-Phosphoramidit (Clonetech) an das 5'-Ende angehängt, um die Biotingruppierung einzuführen. Das so synthetisierte Produkt wurde von dem Träger entfernt und die Schutzgruppen wurden gemäß konventioneller Verfahren entfernt. Ein Rohprodukt wurde durch Gelfiltration erhalten (Sephadex G-50, 50 mM TEAB-Puffer, pH 7,2). Das Rohprodukt (10 A₂₆₀ Einheiten) wurde durch Evaporation getrocknet und in 40 μl Wasser gelöst. 1 M NaHCO₃ (10 μl) wurde zugegeben, dann wurden 50 μl einer DMF-Lösung von EMCS (Dojindo, 20 mg/ml) zugegeben und die Reaktion wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das Reagens durch Gelfiltration (Sephadex G-50, 50 mM TEAB-Puffer, pH 7,2) entfernt.
Die oben stehenden zwei Arten an Oligonucleotiden wurden aneinander wie folgt gebunden. Zuerst wurde das Oligonucleotid, das Biotin am 5'-Ende und die Aminogruppe am 3'-Ende aufwies, durch Evaporation getrocknet, wozu das gesamte Volumen der Phosphatpufferlösung des Oligonucleotids mit der Thiolgruppe am 5'-Ende gegeben wurde. Das Gemisch wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde der Puffer durch Gelfiltration (Sephadex G-50, 50 mM TEAB-Puffer, pH 7,2) ausgetauscht und die resultierende Lösung wurde durch Evaporation getrocknet. Das resultierende Gemisch wurde durch Gelelektrophorese mit 20 % Polyacrylamid, enthaltend 8,3 M Harnstoff, gereinigt. Das Oligonucleotid wurde von der Bande langsamerer Mobilität wiedergewonnen, um SPA1C-Primer, gebunden an die Primer-komplementäre Nucleinsäure, zu erhalten.
SPA2C-Primer wurde auf dieselbe Weise synthetisiert, außer dass DNP-ON-Phosphoramidit (Clonetech) verwendet wurde, um beim Synthetisieren des zum Primer komplementären Teils DNP am 5'-Ende einzuführen.
(2) Unterdrückung unspezifischer Amplifikationsreaktion durch Primer SPA1C und SPA2C
Eine Reaktionslösung, die die untenstehende Zusammensetzung aufwies, wurde hergestellt, und der an die zum Primer komplementäre Nucleinsäure gebundene Primer wurde auf seine Effekte beim Unterdrücken der unspezifischen Verlängerungsreaktion hin getestet.

10 X Amplitaq (Handelsname)-Reaktionslösung 5 μl

20 mM dNTP 0,5 μl

SPA1C 100 ng/μl 1 μl

SPA2C 100 ng/μl 1 μl

Amplitaq (Handelsname)-DNA-Polymerase (1,25 U/μl) 1 μl

H₂O 41,5 μl
Die PCR-Reaktion wurde für jede Reaktionslösung ohne Matrize oder mit Staphylococcus aureus-DNA-Matrize oder menschlicher DNA-Matrize durchgeführt. Die optische Dichte wurde auf dieselbe Art wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Farbentwicklung nach 10 Minuten war wie folgt:
Wie oben gezeigt, wurde unspezifische Amplifikationsreaktion unterdrückt; jedoch wurde spezifische Amplifikation auch unterdrückt.
(3) Ergebnisse mit Primern, gebunden an verkürzte Primerkomplementäre Nucleinsäure
Primer, gebunden an verkürzte Primer-komplementäre Nucleinsäuren, wie unten gezeigt, wurden auf dieselbe Weise wie (1) beschrieben synthetisiert und untersucht.
SPA1CS: 5'-BIO-CACCAGGT-(Linker)-TACATGTCGTTAAACCTGGTG
SPA2CS: 5'-DNP-CCATTCAT-(Linker)-TACAGTTGTACCGATGAATGG
Unter den gleichen Bedingungen wie (2) beschrieben, wurde die PCR-Reaktion durchgeführt und die optische Dichte gemessen.
Wie oben gezeigt, wurde durch Verkürzen der Kettenlänge der Primer-komplementären Nucleinsäuren die spezifische Amplifikationsreaktion effizient durchgeführt, während die unspezifische Amplifikationsreaktion unterdrückt wurde.

Claims

Verfahren zum Unterdrücken unspezifischer Hybridisierung in einem Primer-Verlängerungsverfahren, das umfasst: gemeinsames Inkubieren eines Primers, einer Matrize und eines dritten Nucleinsäuremoleküls unter für das Verlängern des Primers ausreichenden Bedingungen, wobei der Primer in der Lage ist, spezifisch an das dritte Nucleinsäuremolekül zu hybridisieren, wobei die Affinität des Primers zu dem dritten Nucleinsäuremolekül geringer als oder gleich wie die Affinität des Primers zu der Matrize ist, und wobei das dritte Nucleinsäuremolekül an den Primer auf eine andere Art als Hybridisierung gebunden ist, um intramolekulare Hybridisierung zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Primer, die Matrize und das dritte Nucleinsäuremolekül jeweils DNA oder RNA sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül kürzer als der Primer ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül ein Nucleotid enthält, das nicht. zu dem Primer komplementär ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül ein Nucleotid enthält, das in der Lage ist, eine schwache Wasserstoffbrückenbindung mit dem Primer auszubilden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül und der Primer direkt oder indirekt aneinander gebunden sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül und der Primer durch einen Linker aneinander gebunden sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül Peptidnucleinsäure (PNA, „peptide nucleic acid") ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Primer durch das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren, das 3SR-Verfahren, das NASBA-Verfahren, das RCR-Verfahren, das SDA-Verfahren, das P/LCA-Verfahren oder das Sanger-Verfahren verlängert wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül zur 3'-Seite des Primers komplementär ist.
Verfahren zum Verlängern eines Primers, das umfasst: gemeinsames Inkubieren eines Primers, einer Matrize und eines dritten Nucleinsäuremoleküls unter für das Verlängern des Primers ausreichenden Bedingungen, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül in der Lage ist, spezifisch an den 3'-Teil des Primers zu hybridisieren, wobei die Affinität des Primers zu dem dritten Nucleinsäuremolekül geringer als oder gleich wie die Affinität des Primers zur Matrize ist, und wobei das dritte Nucleinsäuremolekül auf eine andere Art als Hybridisierung an den Primer gebunden ist, um intramolekulare Hybridisierung zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Primer, die Matrize und das dritte Nucleinsäuremolekül jeweils DNA oder RNA sind.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül kürzer als der Primer ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül ein Nucleotid enthält, das nicht zu dem Primer komplementär ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül ein Nucleotid enthält, das in der Lage ist, eine schwache Wasserstoffbrückenbindung mit dem Primer auszubilden.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül und der Primer direkt oder indirekt aneinander gebunden sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 16, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül und der Primer aneinander durch einen Linker gebunden sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das dritte Nucleinsäuremolekül Peptidnucleinsäure (PNA, „peptide nucleic acid") ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 18, wobei der Primer durch das Polymerase-Kettenreaktionsverfahren, das 3SR-Verfahren, das NASBA-Verfahren, das RCR-Verfahren, das SDA-Verfahren, das P/LCA-Verfahren oder das Sanger-Verfahren verlängert wird.