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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Konstrukt, das eine Carboxypeptidase
Y kodiert und von Aspergillus erhältlich ist.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Pilzvakuole ist eine saure Organelle, die viele Hydrolasen, einschließlich mehrerer
Proteasen enthält
und im Wesentlichen mit dem Säuger-Lysosom
gleichwertig ist. Mehrere der Hydrolasen wurden in einer oder mehreren
Pilzspezies, insbesondere in Hefe identifiziert und charakterisiert,
wobei diese Protease A (PEP4 oder PrA), Protease B (PrB), Aminopeptidase
(APE), Dipeptidylaminopeptidase B (DPAP B), Carboxypeptidase Y (CPY)
und Carboxypeptidase S (CPS) einschließen. Die meisten der vakuolären Hydrolasen
sind Glycoproteine, die als inaktive Vorstufen synthetisiert werden.
Tatsächlich
weisen alle der vorstehend erwähnten
Proteasen mit Ausnahme von APE Signalpeptide auf, die zum Übergang
durch den Sekretionsweg führen. Im
ehemaligen Golgi werden vakuoläre
Proteine von Sekretionsproteinen sortiert und schließlich in
der Vakuole freigesetzt. Zusätzlich
zu einem Signalpeptid weisen die meisten vakuolären Proteine auch ein Propeptid auf,
das durch Abgabe an die Vakuole unter Bildung des reifen aktiven
Enzyms gespalten wird. Es zeigte sich, dass die Aminosäureinformation
in PrA und CPY, die zum vakuolären
Zielen erforderlich ist, im Propeptid vorliegt (Johnson et al. Cell
48: 875–885,
1987; Rothman et al. PNAS USA 83: 3248–3252, 1989; Valls et al.,
Cell 48: 887–897,
1989; Valls et al. J. Cell Biol. 111: 361–368, 1987). Für CPY zeigte
sich eine Reihe von vier Aminosäureresten
(QRPL) als zur Lokalisierung an der Vakuole erforderlich (Valls
et al., J. Cell Biol. 111: 361–368, 1990).
Nach der Abgabe der Vakuole spaltet Proteinase A (pep4) das Propeptid
von CPY und PrB, was zur Aktivierung der Proteasen führt (Ammerer
et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2490–2499, 1986; Woolford et al.,
Mol. Cell. Biol. 6: 2500–2510,
1986).
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In
S. cerevisiae wurden drei Mutantenklassen, die vakuoläre Proteine
fehllokalisieren oder fehlsortieren, identifiziert (Bankaitis et
al., PNAS USA 83: 9075–9079,
1986; Robinson et al., Mol. Cell. Biol., 8: 4936–4948, 1988; Rothman et al.,
EMBO J. 8: 2057–2065,
1989; Rothman and Stevens, Cell 47: 1041–1051, 1986). Diese Mutanten
werden vps oder vakuoläres
Protein sortierende Mutanten genannt. Mehrere dieser Mutanten werden
unter Verwendung einer Selektion auf der Basis der Beobachtung dessen
isoliert, dass eine Überexpression
einer vakuolären
Protease aufgrund einer hohen Kopieanzahl auf einem Plasmid zu einer
Sekretion von vakuolären
Proteasen führt
(Stevens et al., J. Cell Biol. 102: 1551–1557, 1986; Rothman et al, PNAS
USA 83: 3248–3242,
1986). Dies legt nahe, dass es möglich
ist, die Sortierungsmaschinerie innerhalb der ehemaligen Golgi zu
sättigen.
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In
S. cerevisiae zeigte sich ebenso, dass für PEP4, CPY und PrB deletierte
Stämme
aufgrund einer Verminderung in der Proteolyse des gewünschten
Produkts höher
Gehalte an heterologen Proteinen erzeugen. Deshalb sind die fraglichen
vakuolären
Proteasen aus wirtschaftlicher Sicht wichtig, da die sie erzeugenden
Pilze zur rekombinanten Reproduktion von heterologen Proteinen verwendet
werden. Die Gegenwart dieser Proteasen bei der Fermentation ist
unerwünscht,
das sie das Protein von Interesse abbauen können, wodurch die Ausbeute
deutlich reduziert wird. Eine Eliminierung der Funktion einer beliebigen
vorgegebenen Protease wird durch die Unterbrechung oder Deletion
des sie kodierenden Gens erleichtert, jedoch erfordert dies zuerst
die Identifikation und Isolierung des entsprechenden Gens in der
Wirtsspezies von Interesse. Wie vorstehend angegeben wurden wenige
solcher Gene von verschiedenen Hefestämmen isoliert, jedoch sind
die Gene, die vakuoläre
Proteasen in Fadenascomyceten oder -deuteromyceten kodieren, weniger
bekannt. Zum Beispiel wurden Gene von PEPC (Frederick et al., Gene
125: 57–64,
1993) und PEPE (Jarai et al., Gene 145: 171–178, 1994), die zwei andere
vakuoläre
Proteasen von Aspergillus niger kodieren, isoliert. PEPC kodiert für ein Proteinase-B(PrB)-Homolog
und PEPE kodiert für
ein Proteinase-A-Homolog. Das Gen PEP4 von Neurospora crassa, das
ein PrA-Homolog kodiert, wurde ebenso geklont (Bowman, 17th Fungal
Genetics Conference, 1993). Zum ersten Mal ist hier das Gen beschrieben,
das eine vakuoläre
CPY von einem Fadenascomyceten oder -deuteromyceten kodiert.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine
Nukleinsäuresequenz, die
eine von Aspergillus erhältliche
Carboxypeptidase Y kodiert, wobei
- i) die Nukleinsäuresequenz
die in 1 dargestellte Nukleinsäure oder
Homologe, die ein Carboxypeptidase-Y-Protein mit mindestens 70%iger
Identität
mit der in 1 dargestellten Aminosequenz
kodieren, ist, oder
- ii) die Nukleinsäuresequenz,
die in 2 dargestellte Nukleinsäure oder
Homologe, die Carboxypeptidase-Y-Protein mit mindestens 70%iger
Identität
mit der in 2 dargestellten Aminosequenz
kodieren, ist.
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Wie
hier verwendet, soll der Begriff „Nukleinsäure-Konstrukt" ein beliebiges Nukleinsäuremolekül vom Ursprung
einer cDNA, genomischen DNA, synthetischen DNA oder RNA angeben.
Der Begriff „Konstrukt" soll ein Nukleinsäuresegment
angeben, bei welchem es sich um einen Einzel- oder Doppelstrang
handeln kann und das in vollständiger
oder teilweiser Form aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert
werden kann oder das so modifiziert wurde, dass es DNA-Segmente
enthält,
die in einer Weise kombiniert oder nebeneinander gestellt sind,
die in der Natur sonst nicht vorkommt. Das Konstrukt kann gegebenenfalls
andere Nukleinsäuresegmente
enthalten.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Carboxypeptidase
nicht erzeugenden Aspergillus-Zelle bereit, dass das Unterbrechen
oder Deletieren des Carboxypaptidase-Y-Gens und Erhalten daraus
einer im Wesentlichen keine Carboxypeptidase Y erzeugenden Zelle
umfasst, wobei das Carboxypeptidase-Y-Gen in 1 dargestellt
ist, oder Homologe, die ein Protein mit mindestens 70%iger Identität mit der
in 1 dargestellten Aminosäuresequenz
kodieren, oder wobei das Carboxypeptidase-Y-Gen in 2 dargestellt
ist, oder Homologe, die ein Protein mit mindestens 70%iger Identität mit der
in 2 dargestellten Aminosäuresequenz
kodieren.
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Die
Carboxypeptidase nicht erzeugende Aspergillus-Zelle kann durch klassische
Mutagenese unter Verwendung von physikalischen oder chemischen Behandlungen
hergestellt werden. Zudem umfasst die Erfindung auch eine Aspergillus-Mutantzelle, die
mindestens 25% weniger Carboxypeptidase Y erzeugt, als eine entsprechende
Zelle vom Wildtyp, wenn sie unter identischen Bedingungen gezüchtet wird,
wobei ein in 1 dargestelltes Carboxypeptidase-Y-Gen
oder Homologe, die ein Protein mit mindestens 70%iger Identität mit der
in 1 dargestellten Aminosäuresequenz
oder die Nukleinsäuresequenz
die in 2 dargestellte Nukleinsäuresequenz
oder Homologe, die ein Protein mit mindestens 70%iger Identität mit der
in 2 dargestellten Aminosäuresequenz
ist, unterbrochen oder deletiert wurde oder wobei die Nukleinsäuresequenz
eine nichtfunktionelle Carboxypeptidase Y kodiert.
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Solche
Organismen stellen die Basis für
ein verbessertes Verfahren von rekombinanter Proteinherstellung
bereit, wobei der Carboxypeptidase-mangelnde Mikroorganismus mit
dem das Protein von Interesse kodierenden Nukleinsäure-Konstrukt transformiert
und unter die Expression des Protein leitenden Bedingungen gezüchtet wird.
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Weiterhin
betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung
eines Proteins von Interesse, dass das Züchten unter die Expression
des Pro teins leitenden Bedingungen einer Aspergillus-Mutantzelle
der Erfindung, die mindestens 25% weniger Carboxypeptidase Y als
eine entsprechende unter identischen Bedingungen gezüchtete Zelle
vom Wildtyp erzeugt, wobei die Zelle auch eine das Protein kodierende Nukleinsäuresequenz
enthält
und Gewinnen des Proteins aus der Kultur umfasst.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 veranschaulicht die DNA-Sequenz und
Translation des Bo-1-genomischen CPY-Klons von A. niger.
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2 veranschaulicht die DNA-Sequenz und
Translation der SFAG-2-CPY-cDNA
von A. niger. Die vorhergesagte Stelle der Signalpeptidasespaltung
und der N-Terminus des reifen CPY sind angegeben.
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3 veranschaulicht
das beim Unterbrechen von CPY verwendete Konstrukt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Versuche
zum Isolieren einer Carboxypeptidase Y von Aspergillus werden durch
Aufbau einer Reihe von degenerierten Oligonukleotiden unter Verwendung
der Sequenzen von CPY von S. cerevisiae, Carboxypeptidase S1 von
Penicillium janthinellum (Svedsen et al., FEBS 333: 39–43, 1993)
und Malz-Carboxypeptidase
MIII (S⌀rensen
et al., Carlsberg Res. Commun. 54: 193–202, 1993) initiiert. Die
Oligoneukleotidsequenzen sind in den nachstehenden Beispielen bereitgestellt.
Diese Sequenzen werden als Primer in verschiedenen Kombinationen
in einer PCR-Reaktion unter Verwendung des Stamms von Bo-1-genomischer DNA von Aspergillus
niger als Templet verwendet. Zwei der Reaktionen (mit den Primern
1-2 und 2-1 und 1-2 und 2-2) ergeben ein Amplifikationsprodukt mit
1100 Bp, das untergeklont und sequenziert wird, jedoch weist keiner
der Unterklone eine deutliche Homologie mit CPY, dass als das Gen
von Interesse identifiziert ist, auf.
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Ferner
werden dann PCR-Reaktionen mit den Primern 3-1, 3-2, 4-1, 4-2, 2-1
und 2-2 hergestellt. In zwei der Reaktionen (Primer 4-1 und 2-1;
und 4-2 und 2-1) wird ein Amplifikationsprodukt mit 600 Bp erhalten. Dieses
Produkt wird untergeklont, und 11 der Unterklone werden sequenziert,
wobei neun dieser Unterklone identisch sind und eine Homologie mit
Carboxypeptidase-Y-Genen von anderen Fällen aufweisen. Die Einfügung von
einem der Unterklone wird als Sonde von genomischer DNA von A. niger
verwendet, wobei eine Hybridisierung mit einzelnen Banden mit BamHI
zu beobachten ist. HindIII und SalI verdaut, was nahe legt, dass ein
einzelnes CPY-Gen in A. niger vorliegt. Hybridisierungen werden
bei 65°C
in 1,5 × SSPE,
1,0% SDS, 0,5% fettarmer Milch und 200 μg/ml Lachssperma-DNA durchgeführt.
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Eine
genomische DNA-Genbank von A. niger in EMBL4 wird mit dem PCR-CPY-abgeleiteten
Genfragment (32P-markiert) hergestellt und
sondiert, um ein Gen mit voller Länge zu isolieren. Außerhalb
von etwa 28.000 Plaques werden 11 Positive aufgenommen; wobei neun
davon immer noch mit der Sonde nach der Reinigung hybridisieren.
Ein 5,5- HindIII-Fragment, das für
eine Hauptzahl dieser Klone üblich
ist, wird als CPY-Gen von A. niger identifiziert. Dieses Fragment
wird untergeklont und sequenziert; wobei die Sequenz des Fragments,
einschließlich
der CPY-kodierenden Region und der vorhergesagten Aminosäuresequenz,
in 1 dargestellt ist.
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Anschließend wird
auch eine cDNA-Bank von einem anderen Stamm von A. niger durchgemustert. Mindestens
ein Klon mit voller Länge
wird ebenso aus dieser Bibliothek identifiziert. Dieser Klon wird
sequenziert, und die Sequenz ist in 2 dargestellt.
Beide DNA-Sequenzen sagen eine CPY-Vorstufe von 557 Aminosäuren in
der Länge
voraus. Auf der Basis eines Vergleichs mit dem homologen Gen von
S. cerevisiae scheint CPY von A. niger ein Prä-Propeptid von 137 oder 138
Aminosäuren
aufzuweisen. Das Gen enthält
ein Intron von 61 Basenpaaren. Ein Vergleich der beiden Sequenzen
von A. niger zeigt einen geringen Unterschied in der Aminosäuresequenz,
was wahrscheinlich die verschiedenen Stämme, von welchen die genomischen
und cDNA-Klone isoliert werden, wiedergibt. Ein Vergleich mit der
Aminosäuresequenz
der entsprechenden CPY-Gene S. cerevisiae und C. albicans zeigt
eine 65%ige bzw. 66%ige Identität.
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Die
vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung der in den 1 und 2 offenbarten
Sequenzen nicht beschränkt.
Erstens umfasst die Erfindung auch Nukleotidsequenzen, die dieselbe
wie in 1 oder 2 umrissene
Aminosäure
erzeugen, sich jedoch aufgrund der Abbaubarkeit des genetischen
Kodes unterscheiden. Zudem zeigt der Unterschied in der für die zwei
Stämme
derselben Spezies dargestellten Aminosäuresequenz, dass eine Variation
in der Sequenz einer einzelnen Spezies toleriert wird und unter
Verwendung der hier beschriebenen Techniken solche Varianten leicht
identifiziert werden können.
Wird deshalb "A.
niger" in diesem
Zusammenhang genannt, ist es klar, dass er alle solche Variationen
umfasst. Insbesondere umfasst die Erfindung auch eine beliebige
Variantnukleotidsequenz und das dadurch kodierte Protein, wobei
das Protein eine mindestens etwa 80%ige, vorzugsweise etwa 85%ige,
und besonders bevorzugt etwa 90–95%ige Homologie
mit der in 1 oder 2 dargestellten
Aminosäuresequenz
und qualitativ die Aktivität
der hier beschriebenen Sequenz beibehält. Nützliche Varianten in den vorstehend
definierten Kategorien schließen
z. B. diejenigen ein, in welchen bewahrende Aminosäuresubstitutionen
durchgeführt
wurden, wobei die Substitutionen die Aktivität des Proteins nicht deutlich
beeinflussen. Der Begriff „bewahrende
Substitution" bedeutet, dass
Aminosäuren
derselben Klasse durch eine andere dieser Klasse substituiert werden
können.
Zum Beispiel können
die nichtpolaren aliphatischen Reste Ala, Val, Leu, und Ile wie
die basischen Reste Lys und Arg oder die sauren Reste Asp und Glu
untereinander ausgewechselt werden. Gleichermaßen sind Ser und Thr bewahrende
Substitutionen füreinander,
wie es Asn und Gln sind.
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Zudem
stellt das isolierte Gen ein Mittel zum Isolieren von homologen
Genen aus anderen Aspergillus-Spezies, z. B. A. oryzae, A. foetidus,
A. japonicus, A. aculeacus, oder A. nidulans bereit.
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Das
Gen oder ein Nukleotid auf der Basis davon kann als Sonde in Southern-Hybridisierung zum
Isolieren von homologen Genen dieser anderen Spezies verwendet werden.
Insbesondere können
solche Sonden unter gering- bis hochstrengen Bedingungen (z. B.
Vorhybridisierung und Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSPE, 0,3% SDS, 200 μ g/ml geschnittener
und denaturierter Lachssperma-DNA, und entweder 50, 35 oder 25%
Formamid für
hohe, mittlere bzw. geringe Strengen) für eine Hybridisierung mit der
genomischen oder cDNA der Spezies von Interesse, gefolgt von Standard-Southern-Blottverfahren
verwendet werden, um das entsprechende CPY-Gen darin zu identifizieren
und zu isolieren. Eine PCR-Reaktion
unter Verwendung der hier erwähnten
degenerierten Sonden und von genomischer DNA oder Erststrang-cDNA
von einem Fadenpilz kann ebenso ein CPY-spezifisches Produkt ergeben,
dass dann als Sonde zum Klonen der entsprechenden genomischen oder
cDNA verwendet werden könnte.
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Das
vorliegende Gen ist bei der Bildung eines Carboxypeptidase-mangelndem
Aspergillus-Mutanten besonders nützlich.
Dies kann auf einer Anzahl von Wegen erzielt werden. In einem Verfahren
wird, wie detaillierter nachstehend beschrieben, eine selektierbare
Markierung in die Mitte des CPY-Gens geklont. Das unterbrochene
Fragment wird dann von dem parentalen Plasmid unter Verwendung von
Restriktionsenzymen abgegeben. Das linearisierte DNA-Fragment wird
zum Transformieren der ausgewählten
Wirtszelle verwendet. In der Wirtszelle führen das homologe Endpaar mit
dem Wirtszellenchromosom und die homologe Rekombination zur chromosomalen
Genersetzung. Nützliche
selektierbare Markierungen zur Verwendung mit Pilzzellenwirten schließen amdS,
pyrG, argB, niaD, sC und hygB ein. In einer anderen Ausführungsform
kann ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung einer selektierbaren
Zwei-Wege-Markierung eingesetzt werden. In einem solchen Verfahren
wird ein Plasmid, enthaltend ein abgeschnit tenes CPY-Gen und das
selektierbare Markierungsgen, mit einem Restriktionsenzym verdaut,
das auf einmal im CPY-Fragment abschneidet, um die die Integration
der CPY-Lokalisierung während
der Transformation zu erzielen. Man lässt die Transformanten dann
auf Medium, dass für
den Verlust der selektierbaren Markierungsgene, z. B. wenn die Markierung
pyrG ist, selektiert, wachsen, wobei das Medium 5-Fluoroticsäure erhalten
kann. Der Verlust des selektierbaren Gens tritt häufig durch
eine Rekombination zwischen dem CPY vom Wildtyp und dem eingebrachten
abgeschnittenen CPY-Gen auf. Etwa 50% des erhaltenen Stamms sollten
nur das abgeschnittene CPY-Gen enthalten, während die anderen 50% nur das
Gen vom Wildtyp enthalten. Solche Verfahren sind in Rothstein, Meth. Enzymol.
194. 281–301,
1991 beschrieben.
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Die
so gebildeten CPY-mangelnden Mutanten sind bei der Expression von
heterologem Protein besonders nützlich.
Der Begriff „heterologes
Protein" bedeutet
in diesem Zusammenhang ein Protein, das für die Wirtszelle nicht nativ
ist, ein natives Protein in welchem Modifikationen zum Abändern der
nativen Sequenz durchgeführt
wurden oder ein natives Protein, dessen Expression quantitativ als
Ergebnis einer Manipulation der Wirtszelle durch rekombinante DNA-Techniken
abgeändert
wurde. Ebenso in diesem Begriff eingeschlossen sind native Proteine,
für welche
die Expression in den Mutanten die Verwendung von genetischen Elementen,
die für
die Wirtszelle nicht nativ sind, oder die Verwendung von nativen
Elementen, die zum Wirken in einer Weise, die gewöhnlich in
der Wirtszelle nicht ersichtlich ist, beinhalten.
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Wie
schon angemerkt kann die Herstellung von Proteasen durch eine ausgewählte Wirtszelle
die Ausbeute des gewünschten
Proteins durch Degradieren des Produkts, bevor es gewonnen werden
kann, ernsthaft beschränken.
Die Eliminierung oder Reduktion der durch einen Wirt erzeugten CPY-Menge
kann deshalb die Ausbeute eines vorgegebenen Proteins wesentlich
erhöhen
und eine sonst wirtschaftlich ungeeignete Wirtszelle für die rekombinante
Proteinherstellung wirtschaftlich realisierbarer machen. In einer
bevorzugten Ausführungsform
erzeugen die CPY-mangelnden Zellen mindestens 25% weniger, vorzugsweise
mindestens 50% weniger und besonders bevorzugt 70% weniger CPY bis
zu einem Gesamtverlust der CPY-Funktion als der entsprechende Stamm
vom Wildtyp.
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Die
Aspergillus-Mutantzellen der vorliegenden Erfindung können bei
der rekombinanten Proteinherstellung in derselben Weise wie die
Stämme
vom Wildtyp verwendet werden. Der Fachmann erkennt leicht routinemäßige Variationen
von den hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen, die beim Anpassen
der Methodologie an die vorstehend angegebenen Stämme nützlich sind.
Ein Gen von Interesse kann in aktiver Form unter Verwendung eines
Expressionsvektors exprimiert werden. Ein nützlicher Expressionsvektor
enthält ein
Element, das die stabile Integration des Vektors in das Wirtszellengenom
oder die autonome Replikation des Vektors in einer Wirtszelle unabhängig von
dem Genom der Wirtszelle gewährt
und vorzugsweise eine oder mehrere phänotypische Markierungen, die
die leichte Selektion von transformierten Wirtszellen gewähren. Der
Expressionsvektor kann auch Kontrollsequenzen einschließen, die
einen Promoter, eine Ribosombindungsstelle, ein Translationsinitiierungssignal
und gegebenenfalls ein Repressorgen oder verschiedene Aktivatorgene
kodieren. Zum Gewähren
der Sekretion des exprimierten Proteins können eine Signalsequenz kodierende
Nukleotide vor der Kodierungssequenz des Gens eingefügt werden.
Zur Expression unter der Leitung von Kontrollsequenzen wird ein
erfindungsgemäß zu verwendendes
Gen funktionsfähig
an die Kontrollsequenzen in genauem Ablesegerüst gebunden.
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Der
Expressionsvektor kann ein beliebiger Vektor sein, der günstigerweise
den rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen wurde, und die Wahl des
Vektors hängt
typischerweise von der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen
ist. Die Wirtszelle ist ein Stamm der Gattung Aspergillus. Folglich
kann der Vektor ein autonom reflektierender Vektor, d. h. ein Vektor,
der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei die Replikation
davon von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z. B. ein Plasmid
oder ein extrachromosomales Element, Minichromosom oder ein künstliches
Chromosom sein. In einer anderen Ausfüh rungsform kann der Vektor
einer sein, der beim Eindringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellgenom
integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welches)
er integriert wurde, repliziert wird.
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Im
Vektor sollte die Sequenz des Gens funktionsfähig an eine geeignete Promotersequenz
gebunden sein. Der Promoter kann eine beliebige DNA-Sequenz sein,
die Transkriptionsaktivität
in der Wirtszelle der Wahl zeigt und von Genen, die Proteine entweder
homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodieren, abgeleitet werden.
Zur Transkription in einen Pilzwirt sind Beispiele für nützliche
Promoter diejenigen, die von der das Gen kodierenden TAKA-Amylase
von A. oryzae, Aspartamproteinase von Rhizomucor miehei, neutralen α-Amylase
von A. niger, säurestabilen α-Amylase
von A. niger, Glucoamylase (glaA) von A. niger oder A. awamori,
Lipase von Rhizomucor miehei, alkalischen Protease von A. oryzae,
Triosephosphatisomerase von A. oryzae oder Acetamidase von A. nidulans
abgeleitet werden. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase und die glaA-Promoter.
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Der
Expressionsvektor der Erfindung kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator
und in Eukaryoten, Polyadenylierungssequenzen, die funktionsfähig an die
die heterologe Gensequenz kodierende DNA-Sequenz gebunden sind,
umfassen. Terminierungs- und Polyadenylierungssequenzen können in
geeigneter Weise von denselben Quellen wie der Promoter abgeleitet
sein. Der Vektor kann ferner eine DNA-Sequenz umfassen, die es ermöglicht,
dass der Vektor in der fraglichen Wirtszelle repliziert. Beispiele
für solche Sequenzen
sind die Replikationsursprünge
der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und PIJ702.
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Der
Vektor kann auch eine selektierbare Markierung, z. B. ein Gen, wobei
das Produkt davon einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, oder
eines, das Antibiotikumresistenz, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol-
oder Tetracyclin-Resistenz
verleiht, umfassen. Beispiele für
Selektionsmarkierungen von Aspergillus schließen amdS, pyrG. argB, niaD,
sC, und hygB, eine Markierung, die eine Hygromycinresistenz erhöht, ein. Bevorzugt
zur Verwendung in einer Aspergillus-Wirtszelle sind die amdS- und
pyrG-Markierungen von A. nidulans oder A. oryzae. Weiterhin kann
eine Selektion durch Co-Transformation, z. B. wie in WO 91/17243
beschrieben, durchgeführt
werden.
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Es
ist allgemein bevorzugt, dass die Expression zu einem Produkt führt, das
extrazellulär
ist. Das Protein von Interesse kann folglich eine Präregion umfassen,
die die Sekretion des exprimierten Proteins in das Kulturmedium
gewährt.
Falls gewünscht,
kann diese Präregion
für das
Protein der Erfindung nativ sein oder mit einer anderen Präregion oder
Signalsequenz, günstigerweise
durchgeführt
durch Substitution der DNA-Sequenz, die die jeweiligen Präregionen
kodieren, substituiert sein. Zum Beispiel kann die Präregion von
einem Glucoamylase- oder einem Amylasegen von einer Aspergillus-Spezies,
einem Amylasegen von einer Bacillus-Spezies, einem Lipase- oder
Proteinasegen von Rhizomucor miehei, dem Gen für den α-Faktor von Saccharomyces cerevisiae
oder dem Präprochymosingen
vom Kalb abgeleitet sein. Besonders bevorzugt ist, wenn der Wirt
eine Pilzzelle ist, die Präregion
für TAKA-Amylase
von A. oryzae, neutrale Amylase von A. niger, die maltogene Amylase
von Bacillus NCIB 11837, die α-Amylase
von B. stearothermophilus oder Subtilisin von Bacillus licheniformis.
Eine wirksame Signalsequenz ist das TAKA-Amylasesignal von A. oryzae,
das Aspartamproteinasesignal von Rhizomucor miehei und das Lipasesignal
von Rhizomucor miehei.
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Die
zum Binden des DNA-Konstrukts der Erfindung des Promoters, des Terminators
bzw. von anderen Elementen und zu ihrem Einfügen in geeignete die zur Replikation
der nötigen
Information enthaltende Vektoren verwendeten Verfahren sind dem
Fachmann bekannt (vergleiche z. B., Sambrook et al. Molecular Cloning, 1989).
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Die
CPY-mangelnden Mutanten können
zum Exprimieren von beliebigen prokaryotischen und eukaryotischen
Proteinen von Interesse verwendet werden und werden vorzugsweise
zum Exprimieren von eukaryotischen Proteinen verwendet. Von besonderem
Interesse für
diese Zellen ist deren Verwendung bei der Expression von Pilzenzymen
wie Katalase, Lactase, Phenoloxydase, Oxidase, Oxidoreduktasen,
Cellulase, Xylanase, Peroxidase, Lipase, Hydrolase, Esterase, Cutinase,
Protease und andere proteolytische Enzyme, Aminopeptidase, Carboxypeptidase,
Phytase, Lyase, Pektinase und andere pektiolytische Enzyme, Amylase,
Glucoamylase, α-Galactosidase, β-Galactosidase, α-Glucosidase, β-Glucosidase,
Mannosidase, Isomerase, Invertase, Transferase, Ribonuclease, Chitinase,
und Desoxyribonuclease. Es ist dem Fachmann klar, dass der Begriff „Pilzenzyme" nicht nur native
Pilzenzyme sondern auch diejenigen Pilzenzyme einschließt, die
durch Aminosäuresubstitutionen,
-deletionen, -additionen oder andere Modifikationen, die zum Verbessern
der Aktivität,
Wärmestabilität, pH-Toleranz
und dergleichen durchgeführt
werden, modifiziert wurden. Die Mutanten können auch zum Exprimieren von
heterologen Proteinen von pharmazeutischem Interesse, wie Hormonen, Wachstumsfaktoren,
Rezeptoren und dergleichen verwendet werden.
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Die
Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele veranschaulicht.
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BEISPIELE
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I. ISOLIERUNG DES CPY-GENS
VON ASPERGILLUS NIGER
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A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
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i. Stämme
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Die
folgenden biologischen Materialien werden in den nachstehend beschriebenen
Verfahren verwendet. Escherichia coli K802(ek4-(nrca), mcrB, hsdR2,
galK2, GalT22, supE44, metB1; E. coli SOLR(E14-(mcrA)Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171, sbcC, recB, recJ, uvrC, umuC::Tn5(kanr),
lac, gyrA96, relAl, thi-1, endAl, λR[F'proABlacIqZΔM15]Su–,
E. coli JM101supE, thi-1, Δ(lac-proAB),
[F'traD36, proAB,
lacIqZΔM15],
E. coli XL-1 Blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdRl7, supE44, relA1,
lac, [F'proAB, lacIqZΔM15],
Tn10 (tetR)], Aspergillus niger Bo-1, A.
niger SFAG-2.
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ii. PCR-Amplifikation
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PCR-Reaktionen
werden unter Verwendung von Standardprotokollen mit bei 45°C durchgeführten Abkühlungsschritten
durchgeführt.
Genomische Bo-1-DNA von A. niger wird als Templet verwendet, und
die folgenden degenerierten Oligonucleotide werden verwendet.
Primer
1-1(94-282)-GGIGGICCIGGITGYTC
Primer 1-2(94-283)-GGIGGICCIGGITGYAG
Primer
2-1(94-284)-CCIAGCCARTTRCADAT
Primer 2-2(94-285)-CCYAACCARTTRCADAT
Primer
3-1(94-331)-GTIGGITTYTCITAYTCIGG
Primer 3-2(94-332)-GTIGGITTYAGYTAYAGYGG
Primer
4-1(94-329)-GARTCITAYGCIGGICAYTA
Primer 2-1(94-284)-GARAGYTAYGCIGGICAYTA
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In
den vorstehende Primern steht I für Inosin, Y für C oder
T, R für
A oder G und D für
A, G oder T.
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iii. Unterklonen von PCR-Produkten
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PCR-Produkte
werden zum Sequenzieren unter Verwendung des TA-Klonbausatzes (Invitrogen) nach den
Protokollen des Herstellers untergeklont.
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iv. Exzision in vivo von
Lambda-Zap-II
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Von
den CPY-cDNA-Lambda-Zap-Klonen wird ein Plasmid, enthaltend die
cDNA-Einfügungen
in einem p-Bluescript-SK-Vektor durch Durchleiten durch den Stamm
SOLR von E. coli nach den von Stratagene bereitgestellten Protokollen
befreit.
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v. DNA-Sequenzieren
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Nukleotidsequenzieren
wird unter Verwendung von TAQ-Polymerase-Zyklussequenzieren mit Fluoreszenz-markierten
Nukleotiden bestimmt. Die Sequenzierungsreaktionen werden auf einer
automatischen DNA-Sequenzapparatur von Applied Biosystems (Modell
363A, Version 1.2.0) elektrophoresiert. Die folgenden CPY-spezifischen
Primer werden zusätzlich
zu den M13-Umkehr(-48) und M13(-20)-Vorwärtsprimern verwendet (Sanger
et al., J. Mol. Biol. 143; 163–178):
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B. ERGEBNISSE
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Unter
Verwendung der genomischen Bo-1-DNA von A. niger als Templet werden
PCR-Reaktionen unter Verwendung von verschiedenen Kombinationen
der CPY-spezifischen
degenerierten Oligonukleotide, der Primer 1-1, 1-2, 2-1, und 2-2
(1) durchgeführt. Alle Reaktionen werden
unter Verwendung von einem Zyklus bei 95°C für eine Dauer von 5 Minuten,
bei 45°C
für eine
Dauer von 1 Minute und bei 72°C
für eine
Dauer von 2 Minuten, gefolgt von 25 Zyklen bei 95°C für eine Dauer
von 1 Minute, bei 45°C
für eine
Dauer von 1 Minute und bei 72°C
für eine
Dauer von 2 Minuten durchgeführt.
Aliquote (10 μl)
der Reaktionen wurden auf einem Agarosegel elektrophoresiert und
in zwei der Reaktionen, einer mit den Primern 1-2 und 2-1 und einer mit
den Primern 1-2 und 2-2, ist das Amplifikationsprodukt mit etwa
1100 Bp die Hauptspezies. Die vorbestimmte Größe eines Produkts unter Verwendung
dieser Oligonukleotidkombinationen unter Annahme dessen, dass keine
Intronen im Gen vorliegen, beträgt
900 Bp. Das Amplifikationsprodukt mit 100 Bp wird unter Verwendung
der Vorwärts-
und Rück wärtsprimer
subgeklont und sequenziert. Sieben der Unterklone werden sequenziert,
jedoch keines davon durch einen Homologiekode für CPY.
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PCR-Reaktionen
und die Verwendung von verschiedenen Kombinationen der Primer 3-1,
3-2, 4-1, 4-2, 2-1 und 2-2 werden unter Verwendung derselben Bedingungen
wie vorstehend durchgeführt.
Aliquote werden auf einem Agarosegel elektrophoresiert und in zwei
der Reaktionen, einer mit den Primern 4-1 und 2-1 und einer mit
den Primern 4-2 und 2-1, ist ein Amplifikationsprodukt mit etwa
600 Bp die Hauptspezies. Die erwartete Größe für dieses Amplifikationsprodukt
auf der Basis der Homologie zu anderen Carboxypeptidasen beträgt 600 Bp.
Das Amplifikationsprodukt mit 600 Bp wird untergeklont und die DNA-Sequenz
für 11
der Unterklone unter Verwendung der Vorwärts- und Rückwärtsprimer bestimmt. Neun der
11 Unterklone kodieren auf der Basis einer Identität von 69%
für S.
cerevisiae, für
CPY von A. niger. Alle 9 sind miteinander identisch, was nahe legt,
dass nur ein Gen für
Carboxypeptidase in A. niger vorliegt. Der Unterklon, der das CPY-PCR-Produkt
von A. niger mit 600 Bp enthält,
wird als pDSY17 bezeichnet.
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Ein
Southern-Blot von Bo-1-genomischer DNA von A. niger wird mit der
Einfügung
von pDSY17 sondiert. Die Sonde wird unter Verwendung eines Nick-Translationsbausatzes
von Gibco-BRL radiomarkiert. Die verwendeten Hybridisierungsbedingungen
sind 60°C
in 1,5 × SSPE,
1% SDS, 0,5% fettarme Milch und 200 μg/ml Lachssperma-DNA. Der Blot
wird bei 65°C
für eine
Dauer von 15 Minuten zweimal in 0,2 × SSC, 1% SDS und 0,1% Na-Pyrophosphat
gewaschen. In den BamHI, HindIII- und SAlI-Verdaus hybridisieren
einzelne Banden von etwa 10, 5,5 bzw. 7 kb zu der CPY-Sonde.
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Zum
Isolieren des vollständigen
Gens für
CPY, wird eine genomische Bank in EMBL4 von Bo-1 von A. niger enthaltend
etwa 26.000 Rekombinanten, mit dem PCR-abgeleiteten CPY-Genfragment
sondiert, mit dem Gibco-BRL-Nick-Translationkit
radiomarkiert. Etwa 28.000 Plaques werden auf Filter aufgebracht und
sondiert. Elf Positive dieser Platten werden aufgefangen. Nach der
Reinigung hybridisieren 9 der primären Klone immer noch mit der
CPY-Sonde. DNA wird von den 9 Klonen isoliert und Restriktionsverdaus
werden durchgeführt, um
ihre Charakterisierung zu starten. Von den Restriktionsmustern sind
7 der 9 identisch. Die anderen zwei Klone sind einheitlich. Von
den Southern-Verdaus der Klone wird bestimmt, dass 8 der 9 dasselbe
HindIII-Fragment mit etwa 5,5 kb aufweisen, das zu der CPY-Sonde
hybridisiert. Der Klon, der dasselbe HindIII-Fragment nicht enthält, enthält ein größeres (> 12 kb) HindIII-Fragment,
das zu der CPY-Sonde
hybridisiert. Das allgemeine HindIII-Fragment wird zum DNA-Sequenzieren untergeklont.
Die genomische DNA-Sequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz
ist in 1 dargestellt.
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Eine
cDNA-Bank in Lambda-ZAPII (Stratagene) von A. niger SFAG-2 wird
ebenso durchgemustert. Etwa 42.000 Plaques werden auf Filter aufgebracht
und mit der CPY-Sonde wie vorstehend sondiert und 112 dieser Plaques
scheinen unter den vorstehend definierten strengen Bedingungen zu
hybridisieren. Zwanzig der anfänglichen
Positive werden aufgenommen und wieder durchgemustert, und durch
Reinigung hybridisieren immer noch 18 mit der CPY-Sonde. Von 4 der
positiven Klone wird DNA unter Verwendung des Exzitierungsprotokolls
in vivo, bereitgestellt mit dem Lambda-Zap-Kit, isoliert. Die befreiten
Plasmide werden mit EcoRI verdaut und auf einem Agarosegel zur Bestimmung
der Größen der
Einfügungen
elektrophoresiert. Zwei der Klone (2-1 und 3-2) scheinen genug Einfügungen aufzuweisen,
um die cDNA mit voller Länge
für CPY
zu enthalten, und jede enthält
zwei EcoRI-Fragmente mit etwa 1700 und 250 Bp. Die vorhergesagte
Größe für eine cDNA
mit voller Länge
beträgt
etwa 1600 Bp. Die anderen zwei cDNA Klone (2-2 und 2-4) weisen kleinere Einfügungen auf;
jedoch enthalten sie alle das EcoRI-Fragment mit 250 Bp. Teil-DNA-Sequenzen
von der Klone 3-2 und 2-2 werden bestimmt, und 3-2 enthält die cDNA
mit voller Länge
während.
Klon 2-2 am 5'-Ende
um etwa 200 Bp verkürzt
ist.
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Die
vollständige
cDNA-Sequenz wird von beiden Strängen
bestimmt (2). Es wird vorhergesagt, das
cDNA für
eine CPY-Vorstufe mit 557 Aminosäuren
in der Länge
kodiert. Bis heute liegen die meisten der Nukleotidunterschiede,
die zwischen den cDNA- und genomischen Klonen zu finden sind, in
der Planlaufabweichung, was nicht überraschend ist, da sie von
zwei verschiedenen Stämmen
von A. niger stammen. Auf der Basis einer Ausrichtung mit CPY von
S. cerevisiae, scheint CPY von A. niger sowohl ein Signalpeptid
als auch ein Propeptid aufzuweisen, und das reife CPY-Protein ist
entweder 419 oder 420 Aminosäuren
lang. CPY von A. niger weist eine etwa 65%ige und 66%ige Identität mit CPY
von den Hefen S. cerevisiae bzw. C. albicans auf (Mukhtar et al.,
Gene 121: 173–177,
1992).
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II. HERSTELLUNG EINES
CPY-MANGELNDEN MUTANTENS
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Zum
Bilden eines Stamms von A. niger, der für CPY deletiert ist, wird ein
Konstrukt hergestellt, in welchem das pyrG Gen von A. oryzae in
die Kodierungsregion von CPY eingefügt ist (3). Ein
HindIII-Fragment mit ~6,5 kb, das fast das vollständige Gen
von CPY enthält
und ~6 kb stromabwärts
des Gens, wird in ein pKS + (Stratagene)-Derivat subgeklont, in
welchem die PstI-Stelle zerstört
wurde. Der erhaltene Rekombinant wird mit PstI verdaut, um ein Fragment
mit 815 Bp von der CPY-kodierenden Region zu erhalten, und die Überhänge, die
durch die Verdauung mit PstI gebildet sind, werden durch die Zugabe
von T4-DNA Polymerase und
allen 4 dNTPs abgestumpft. Der erhaltene Vektor mit stumpfem Ende
wird an ein abgestumpftes Endfragment mit ~3,8 kb, erhalten durch
Verdau mit HindIII, gefolgt von einer Auffüllreaktion unter Verwendung
eines Klenow-Fragments, gebunden. Das Endkonstrukt, in welchem das
CPY-Gen das eingefügte
pyrG aufweist, wird mit HindIII verdaut, um ein lineares Fragment
zu bilden, dass zum Transformieren eines pyrG-Stamms von A. niger,
selektierend für
Wachstum auf Minimalmediumplatten, verwendet wird. Transformante
werden durch Southern-Blotten durchgemustert, um zu bestimmen, welche
Stämme
ein unterbrochenes CPY-Gen enthalten. Die Transformanten werden weiter
durch Southern-Blotten durchgemustert, um zu bestimmen, welche Stämme ein
unterbrochenes CPY-Gen enthalten. Die Transformanten werden weiter
durch Western-Blotten analysiert, um nach der Abwesenheit von CPY-Intrazellularität zu suchen.
Nachdem der Stamm so identifiziert wurde, dass er eine Unterbrechung
von CPY enthält,
wird die Wirkung auf heterologes Protein bestimmt.
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Hinterlegung
von biologischen Materialien
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Die
folgenden biologischen Materialien wurden am 13. September 1994
in der Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL),
1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 hinterlegt.
| Zellreihe | Zugangsnummer |
| E.
coli, enthaltend pDSY23(EMCC #0120) | NTRRL
B-21326 |
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