DE69524405T2

DE69524405T2 - Photometrische Durchflussvorrichtung für kleine Probenvolumina

Info

Publication number: DE69524405T2
Application number: DE69524405T
Authority: DE
Inventors: Patrick Kaltenbach
Original assignee: Agilent Technologies Deutschland GmbH
Current assignee: Agilent Technologies Deutschland GmbH
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1995-09-06
Publication date: 2002-05-23
Anticipated expiration: 2015-09-07
Also published as: DE69524405D1; US5917606A; EP0762119B1; JPH09170981A; EP0762119A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Spektroskopie und spezieller auf Spektroskopie von kleinen Proben in Lösung.

Hintergrund der Erfindung

Bei Geräten zur Probenanalyse und insbesondere bei Separationssystemen wie Flüssigchromatographie- und Kapillar-Elektrophoresesystemen resultieren kleinere Abmessungen allgemein in verbesserten Leistungsfähigkeitscharakteristika und führen gleichzeitig zu reduzierten Analysekosten. Diese Techniken werden vorzugsweise unter Verwendung von Kapillaren mit kleinen Innendurchmessern im Bereich von 5 Mikrometer bis 100 Mikrometer durchgeführt, um die extrem kleinen Volumina von strömenden, flüssigen Proben zu handhaben.
Als ein Beispiel wurde die Mikrosäulen-Flüssigchromatographie (uLC) beschrieben, bei der Säulen mit Durchmessern von 100 um bis 200 um im Vergleich zu Säulen mit Durchmessern von etwa 4,6 mm eingesetzt werden.
Eine andere Vorgehensweise war die Verwendung der kapillaren Elektrophorese, die eine Separationstechnik darstellt, die in Kapillaren mit einem Durchmesser von 5 um bis 100 um ausgeführt wird.
Es wurde gezeigt, dass die Kapillar-Elektrophorese als Verfahren zur Separation von gelösten Stoffen in geringer Menge nützlich ist. Siehe zum Beispiel Journal of Chromatography, Bd. 218, Seite 209, 1981; sowie Analytical Chemistry, Bd. 53, Seite 1298, 1981.
Es bleiben jedoch mehrere, jenen Technologien inhärente, grundlegende Probleme bestehen.
Zum Beispiel gibt es wesentliche Detektionsbeschränkungen in der herkömmlichen Kapillar-Elektrophorese-Technologie. Im Fall der Kapillar-Elektrophorese wird zum Beispiel die optische Detektion im Allgemeinen an der Säule selbst durch eine Detektionstechnik mit einmaliger Durchleitung durchgeführt, wobei elektromagnetische Energie durch die Probe geleitet wird, wobei der Lichtstrahl senkrecht zu der Achse der Kapillare verläuft und die Kapillare lediglich einmal kreuzt. Demgemäß ist die Detektionspfadlänge in herkömmlichen Kapillar-Elektrophoresesystemen inhärent durch den Durchmesser der Kapillare beschränkt.
Gemäß dem Beer'schen Gesetz steht das Absorptionsvermögen durch die folgende Gleichung in Bezug zu der Pfadlänge:
A = e*b*c
wobei:
A = Absorptionsvermögen
E = molarer Absorptionsgrad (l/m*cm)
B = Pfadlänge (cm)
C = Konzentration (m/l)
Aus der vorstehenden Gleichung ist ohne weiteres ersichtlich, dass das Absorptionsvermögen (A) einer Probe in einer Kapillare von 25 um im Vergleich zu dem Absorptionsvermögen in einer herkömmlichen Zelle mit einer Pfadlänge von 1 cm, die in der UV/Vis-Spektroskopie typischerweise verwendet wird, 400 Mal geringer ist.
Übliche Detektionszellen, die in herkömmlichen Flüssigchromatographiegeräten verwendet werden, weisen den Nachteil auf, dass ihr Zellenvolumen um ungefähr drei Größenordnungen zu groß ist, um die kleinen Probenvolumina im Nanoliter(nl)-Bereich der vorstehend erwähnten Kapillarseparationstechniken zu handhaben. Ein Herunterskalieren der herkömmlichen Form dieser Zellen zur Anpassung an die nl-Volumina ist problematisch, sowohl vom Gesichtspunkt der Fertigung als auch vom photometrischen Aspekt her. Um zum Beispiel ein Zellenvolumen von ungefähr 10 nl mit einer Pfadlänge von 1 mm zu bekommen, muss der kreisförmige Innendurchmesser einer derartigen Zelle kleiner als 120 um sein.
Bei üblichen UV- und UV/Vis-Detektionsmethoden unter Verwendung herkömmlicher Lampen, wie Deuteriumlampen oder Xenon-Blitzlampen, ist es schwierig, genug Licht durch einen derartigen engen Kanal hindurchzuführen. Der Verlust an Lichtdurchsatz wirkt jeglicher Steigerung der optischen Pfadlänge entgegen, und eine Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber Säulendetektion ist nicht mehr möglich.
Des Weiteren ist es mit den Bearbeitungswerkzeugen des Standes der Technik, wie Bohr-, Fräs- oder Ultraschallbearbeitung, sehr schwierig, die Abmessung dieser Detektionszellen herunterzuskalieren, um diesen Anforderungen zu genügen, Zellenvolumina in dem bevorzugten Bereich von 3 nl bis 15 nl zu haben. So verwenden die meisten der gegenwärtig verfügbaren Instrumente die vorstehend erwähnte Methode der Detektion an der Säule selbst.
Im Lichte dieser signifikanten Einschränkung der Detektion gab es eine Anzahl von Versuchen, die im Stand der Technik eingesetzt wurden, um die Detektionspfadlängen und somit die Empfindlichkeit der Analyse in Kapillar-Elektrophoresesystemen zu erhöhen.
US-A-5 061 361 beschreibt eine Vorgehensweise, die eine Mikromanipulation der Kapillarströmungszelle erfordert, um am Punkt der Detektion eine Blase zu bilden.
US-A-5 141 548 beschreibt die Verwendung einer Z-förmigen Konfiguration in der Kapillare, wobei die Detektion über den langgestreckten Teil des Z hinweg durchgeführt wird.
Noch eine weitere Methode hat versucht, die Detektionspfadlänge durch Detektieren entlang der Hauptachse der Kapillare zu vergrößern (Axialstrahldetektion). Siehe Xi et al., Analytical Chemistry, Bd. 62, Seite 1580, 1990.
US-A-5 273 633 beschreibt eine weitere Vorgehensweise für vergrößerte Detektionspfadlängen auf dem Gebiet der Kapillar-Elektrophorese, wobei eine reflektierende Oberfläche außerhalb der Kapillare bereitgestellt wird, wobei das System des Weiteren ein Eintrittsfenster und ein Austrittsfenster stromabwärts des Eintrittsfensters beinhaltet. Licht, das in das Eintrittsfenster eintritt, durchläuft einen Bereich der Kapillare durch interne Mehrfachreflexionen, bevor es durch das Austrittsfenster tritt, wo es detektiert wird, wobei die internen Mehrfachreflexionen eine effektive Erhöhung der Pfadlänge ergeben.
Diese Vorgehensweisen können nicht vermeiden, dass sich Teile des Lichts nicht durch die Mitte der Kapillare ausbreiten, sondern wenigstens teilweise durch die transparente Kapillarenwand, ohne mit der Probe in Kontakt zu kommen. Dies verringert die Linearität des Detektors und reduziert die effektive Pfadlänge, welche die Empfindlichkeit des Detektors bestimmt.
Die europäische Patentanmeldung EP-A-523 680 beschreibt eine photometrische Vorrichtung, bei der eine Strömungszelle mit einem Fluorpolymer beschichtet ist, um das Licht axial entlang einer mit Flüssigkeit gefüllten Röhre oder Kapillare zu leiten. Um eine interne Totalreflexion des Lichts an der Zellenwand zu erhalten, muss das Fluorpolymer einen Brechungsindex aufweisen, der niedriger als der Brechungsindex der Flüssigkeit in der Röhre ist. Wenngleich diese Polymere verfügbar sind, sind sie sehr teuer, und die Stabilität der Beschichtung, wenn sie Lösungsmitteln und Säuren ausgesetzt ist, beschränkt ihre Verwendbarkeit.
Wenngleich jede der vorstehend erwähnten Vorgehensweisen den Punkt der Erweiterung der Pfadlänge berücksichtigt, ist jede Vorgehensweise dahingehend beschränkt, dass sie die Ausführung der Kapillare nach Sachlage erfordert oder ansonsten schwierige technische Methoden verwendet.
Methoden zur Detektion an der Säule selbst verwenden oftmals Aufbauten ähnlich jenen, die in Fig. 8 und Fig. 9 gezeigt sind.
Wie in Fig. 8 und Fig. 9 in einem kleinen Gebiet nahe des Austritts gezeigt, wird eine Kapillare mit Licht von einer UV/Vis-Lichtquelle beleuchtet, und ein Schlitz mit einer Breite o ist hinter der Kapillare platziert, um Streulicht durch die Kapillarenwand zu blockieren. Das durch den Schlitz transmittierte Licht wird detektiert. Unter Verwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes ist das Detektorsignal für eine ideale Zelle bestimmt durch:
A(λ) = &epsi;(λ)·C·D = log(I&sub0;(λ)/I(λ))
wobei: A(λ) = Absorptionsvermögen in Einheiten des Absorptionsvermögens (AU) als Funktion der Wellenlänge,
&epsi;(λ) = Extinktion des molaren Absorptionskoeffizienten als Funktion der Wellenlänge,
C = molare Konzentration gelöster Stoffe
D = Pfadlänge,
I&sub0; = einfallender Photonenfluss,
I = transmittierter Photonenfluss.
Wenn Streulicht durch die Säulenwand den Detektor erreichen kann, muss die vorstehende Gleichung umgeschrieben werden:
A = log((I&sub0; + IS)/(I + IS))
wobei: IS = Streulicht durch die Kapillarenwand.
In Fig. 10 ist eine typische Detektorantwort gezeigt. Die untere Grenze der Detektion ist durch das Basislinienrauschen des Detektors und seine Empfindlichkeit bestimmt, die durch die Steigung dA/dc der Detektorantwort beschrieben werden kann.
Die obere Grenze der Detektion ist durch die Nichtlinearität der Detektorantwort bei höheren Konzentrationspegeln bestimmt.
Unerwünschtes Streulicht verursacht eine Abweichung von der theoretischen linearen Steigung gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz. Die Steilheit der Steigung im Vergleich zu typischen HPLC-Detektionszellen (HPLC = Hochdruck- Flüssigchromatographie ("High Pressure Liquid Chromatography") ist von der effektiven Pfadlänge (die mit dem Innendurchmesser der Kapillare in Beziehung steht) und dem Streulicht durch die Kapillarenwand abhängig. Als Ergebnis gibt es einen linearen Bereich, in dem der Detektor betrieben werden kann, um zuverlässige Resultate zu erhalten.
Fig. 11 zeigt einen Querschnitt einer Strömungszelle des Standes der Technik, die in der Flüssigchromatographie verwendet wird.
Der Zellenaufbau 1100 ist zwischen einer Strahlungsquelle 1102 und einer Photodetektorvorrichtung 1104 positioniert. Eine Linse 1106 ist zwischen der Strahlungslichtquelle 1102 und dem Zellenaufbau 1100 angeordnet, um die von der Strahlungsquelle 1102 emittierte Strahlung zu fokussieren.
Ein Zellenkörper 1108 weist auf einen maschinell bearbeiteten Kanal 1110 darin zum Halten einer flüssigen Probe auf. Fenster oder Linsen 1112 und 1114 sind gegenüber dem Zellenkörper 1108 durch Dichtungen 1116 abgedichtet. Schrauben 1118 und 1120 pressen die Fenster 1112, 1114 gegen den Zellenkörper 1108.
Eine Eintrittsröhre 1122 und eine Austrittsröhre 1124 sind durch mit Gewinde versehene Passstücke 1126 mit einem Eintrittsanschluss 1128 beziehungsweise einem Austrittsanschluss 1130 verbunden, um die Probe der Zelle 1100 zuzuführen und aus dieser abzuführen. Die Röhren 1122, 1124, die normalerweise aus Edelstahl bestehen, sind durch die mit Gewinde versehenen Passstücke 1126 mit dem Zellenkörper 1108 verbunden.
Typischerweise besitzen diese Zellen 1100 Zellenvolumina 1110 im Bereich von 3 ul bis 15 ul. Die Zelle 1100 weist einen Innendurchmesser von 0,5 mm bis 1,5 mm und eine Länge von 3 mm bis 10 mm auf. Der Innendurchmesser der Zelle 1100 ist derart, dass verhindert wird, dass Lichtstrahlen auf die Zellenwand treffen, was ansonsten zu unvorhersagbaren Störungen des gemessenen photometrischen Signals führt. Öffnungen, konische Zellenformen und/oder Linsen werden ebenfalls zur Vermeidung dieses Problems verwendet.
Am üblichsten werden Deuteriumlampen als Strahlungsquelle 1102 für UV/Vis- Messungen des Absorptionsvermögens verwendet.
In der Kapillar-Elektrophorese und u-Flüssigchromatographie sind die Probenvolumina etwa drei Größenordnungen kleiner als vorstehend beschrieben. Demgemäß muss eine Strömungszelle viel kleiner sein.
Der Lichtdurchsatz durch eine derart kleine Zelle wird dramatisch reduziert, wenn keine zusätzlichen Änderungen durchgeführt werden.
Der reduzierte Lichtdurchsatz führt zu erhöhtem photometrischem Rauschen, und die gewünschte Verstärkung der Empfindlichkeit ist nicht erreichbar.
Aus US-A-4 575 424 ist eine Strömungszelle für einen Mikroskalen-Chromatographen bekannt. Diese Strömungszelle beinhaltet einen Lichtpfadeinsatz aus Metall. Der Lichtpfadeinsatz besteht aus einem oberen Teil und einem unteren Teil, die jeweils eine Vertiefung aufweisen, durch die Licht hindurchtreten kann. Die Vertiefungen werden zuerst in den oberen Teil beziehungsweise den unteren Teil gefräst, dann werden die Vertiefungen mit Metall plattiert, und danach wird die Metallbeschichtung poliert.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Hauptaufgabe dieser Erfindung besteht darin, eine photometrische Strömungszelle bereitzustellen, die für Flüssigphasendetektionstechniken mit kleinen Probenvolumina verwendet wird, wobei die Strömungszelle eine erhöhte Empfindlichkeit und Linearität bei der Detektion aufweist.
Diese Aufgabe wird durch eine photometrische Strömungszelle gemäß Anspruch 1 gelöst, wobei zusätzliche Merkmale für diese in den abhängigen Ansprüchen definiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt eine photometrische Vorrichtung für kleine Probenvolumina mit einem Zellenkörper, einem Lichteintrittsmittel, das benachbart zu einer ersten Oberfläche des Zellenkörpers angeordnet ist, einer Lichtquelle, die Licht einer vorgegebenen Wellenlänge oder eines vorgegebenen Wellenlängenbereichs durch das Lichteintrittsmittel emittiert, einem Lichtaustrittsmittel, das benachbart zu einer zweiten Oberfläche des Zellenkörpers gegenüberliegend zu der ersten Oberfläche angeordnet ist, einem Lichtdetektor, der benachbart zu dem Lichtaustrittsmittel angeordnet ist, und einem Strömungskanal bereit, der in dem Zellenkörper ausgebildet ist, wobei Oberflächen der Wände des Kanals eine Rauhigkeit aufweisen, die geringer als die vorgegebene Wellenlänge beziehungsweise jegliche Wellenlänge des Wellenlängenbereichs ist, und wobei die Wände der Kanäle durch wenigstens drei einzelne, den Strömungskanal bildende Teile gebildet sind, wobei diejenigen Oberflächen der den Strömungskanal bildenden Teile, die dem Inneren des Kanals zugewandt sind, aus flachen Bereichen bestehen und wobei die Oberfläche vor dem Zusammenbau des Zellenkörpers auf die Rauhigkeit poliert wurde, die geringer als die vorgegebene Wellenlänge beziehungsweise jegliche Wellenlänge des Wellenlängenbereichs ist.
Der Zellenkörper kann aus einem nicht-transparenten Material bestehen, so dass Licht von der Lichtquelle durch den Kanal, jedoch nicht durch die Zellenwand läuft.
Durch Vermeiden von Streulicht durch die Kanalwand wird maximale Linearität erreicht.
Die verbundenen Kapillaren können einen erweiterten Innendurchmesser am Austritt aufweisen, um Strömungsstörungen zu reduzieren und den Innendurchmesser der Kapillare an den Durchmesser des Kanals anzupassen. Totvolumina werden vermieden, indem die Kapillare durch Muffenkupplung mit dem Kanal verbunden wird.
Diese Kombination ermöglicht eine äußerst empfindliche und lineare Detektion von nl- Probenvolumina, während die Effizienz von Kapillarseparationstechniken aufrechterhalten wird.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A ist eine Querschnittansicht einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Fig. 1B und 1C stellen den Fertigungsprozess für den Zellenkörper dar;
Fig. 2A zeigt Brechung und Reflexion eines Lichtstrahls auf einer Oberfläche eines transparenten Körpers;
Fig. 2B und 2C stellen den Unterschied zwischen gerichteter Reflexion und diffuser Reflexion an der Zellenwand dar;
Fig. 3 zeigt ein Diagramm, welches das Reflexionsvermögen in Abhängigkeit vom Einfallswinkel an einer Oberfläche eines transparenten Körpers veranschaulicht;
Fig. 4 ist eine Querschnittansicht einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Fig. 5 ist eine Querschnittansicht einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Fig. 6 zeigt ein Elektropherogramm, das den Bandverbreiterungseffekt aufgrund unterschiedlicher Durchmesser der Kapillare und des Kanals am Übergang darstellt;
Fig. 7 zeigt ein Elektropherogramm, das die Verstärkung der Empfindlichkeit darstellt, die durch die vorliegende Erfindung erreicht wird;
Fig. 8 und 9 zeigen eine Schlitz- und Kapillarenanordnung, die in einer Methode an der Säule selbst verwendet wird;
Fig. 10 zeigt die prinzipielle Antwortcharakteristik des Detektors;
Fig. 11 zeigt eine Strömungszelle des Standes der Technik, die in der Flüssigchromatographie verwendet wird.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Bevor die Erfindung detailliert beschrieben wird, versteht es sich, dass diese Erfindung nicht auf die speziellen Komponententeile der beschriebenen Vorrichtungen beschränkt ist, da derartige Vorrichtungen variieren können.
Es versteht sich außerdem, dass die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung spezieller Ausführungsformen dient und nicht als beschränkend gedacht ist.
Weiter versteht es sich, dass die gleiche Grundkonstruktion nicht nur für Messungen des Absorptionsvermögens verwendet werden kann, sondern auch für Fluoreszenz- oder Raman-Spektroskopie oder Kolorimetrie mit strömenden oder statischen Proben.
In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen, die folgen, wird auf eine Anzahl von Ausdrücken Bezug genommen, die per Definition die folgenden Bedeutungen haben sollen:
Der Ausdruck "Flüssigphasenanalyse" wird dazu verwendet, auf jegliche Analyse Bezug zu nehmen, die auf entweder kleine und/oder makromolekulare gelöste Stoffe in der flüssigen Phase angewendet wird.
Der Ausdruck "Flüssigphasenanalyse", wie er hierin verwendet wird, beinhaltet chromatographische Separationen, elektrophoretische Separationen und elektrochromatographische Separationen.
Der Ausdruck "chromatographischer Prozess" beinhaltet im Allgemeinen bevorzugte Separationen von Komponenten und umfasst Umkehrphasen-, hydrophobe Interaktions-, Ionenaustausch-, molekulare Sieb-Chromatographie und ähnliche Verfahren.
Der Ausdruck "elektrophoretische Separation" bezieht sich auf die Migration von Partikeln oder Makromolekülen mit einer elektrischen Nettoladung, wobei die Migration durch ein elektrisches Feld beeinflusst wird. Daher umfasst "elektrophoretische Separation" Separationen, die in mit Gelen (wie Polyacrylamid, Agarose und Kombinationen derselben) gepackten Säulen durchgeführt werden, ebenso wie Separationen, die in Lösung durchgeführt werden.
Der Ausdruck "elektrochromatographische Separation" bezieht sich auf Kombinationen von elektrophoretischen und chromatographischen Techniken.
Im Folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Eine Strömungszelle gemäß der bevorzugten Ausführungsform wird zur Analyse kleiner Probenvolumina von nur 3 nl bis 15 nl verwendet.
Dies wird durch ein Design, das einen hohen Lichtfluss durch die Zelle erlaubt, und Merkmale erreicht, die Strömungsstörungen minimieren, um hocheffiziente Separationen aufrechtzuerhalten.
Fig. 1A zeigt eine Querschnittansicht einer photometrischen Strömungsvorrichtung 100 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die photometrische Strömungszelle 100 beinhaltet einen Zellenkörper 102 aus einem nicht-transparenten Material. Ein erstes transparentes Fenster 104 ist benachbart zu einer ersten Oberfläche des Zellenkörpers 102 angeordnet.
Eine Lichtquelle 105 und/oder Lichtleitungsmittel (nicht gezeigt), wie Linsen oder Spiegel, sind benachbart zu dem ersten transparenten Fenster 104 angeordnet, um Licht einer vorgegebenen Wellenlänge oder eines vorgegebenen Wellenlängenbereichs durch dieses hindurch zu emittieren.
Ein zweites transparentes Fenster 106 ist benachbart zu einer zweiten Oberfläche des Zellenkörpers 102 gegenüberliegend zu der ersten Oberfläche angeordnet.
Ein Photodetektormittel 107 ist benachbart zu dem zweiten transparenten Fenster 106 angeordnet. Das Photodetektormittel 107 kann Spiegel, Gitter (nicht gezeigt) und Photodiodenfelder umfassen.
Im Inneren des Zellenkörpers 102 ist ein Strömungskanal 108 ausgebildet. Gemäß der in Fig. 1A gezeigten Ausführungsform beinhaltet der Strömungskanal 108 drei Bereiche 108a, 108b, 108c. Der erste Bereich 108a des Strömungskanals 108 ist benachbart zu dem ersten transparenten Fenster 104 ausgebildet und erstreckt sich im Wesentlichen parallel zu der ersten Oberfläche des Zellenkörpers 102. Der zweite Bereich 108b des Strömungskanals 108 erstreckt sich von der ersten Oberfläche zu der zweiten Oberfläche des Zellenkörpers 102. Der dritte Bereich 108c des Strömungskanals 108 ist benachbart zu dem zweiten transparenten Fenster 106 ausgebildet und erstreckt sich im Wesentlichen parallel zu der zweiten Oberfläche des Zellenkörpers 102.
Wie aus Fig. 1A ersichtlich, beinhalten der erste, der zweite und der dritte Bereich 108a bis 108c des Strömungskanals 108 Übergangsbereiche 108d. Diese Übergangsbereiche 108d verbinden die jeweiligen Bereiche 108a, 108b und 108b, 108c des Strömungskanals 108 vorzugsweise unter einem Winkel von 45º.
Es ist ersichtlich, dass andere Winkel als 45º für die Verbindung der Bereiche des Strömungskanals möglich sind.
Es ist jedoch möglich, die jeweiligen Übergangsbereiche 108d ohne jegliche Schrägung zu verbinden.
Die transparenten Fenster 104, 106 können aus Quarzglas bestehen und können direkt an den Zellenkörper 102 angeschmolzen sein.
In der Zelle 100 sind Öffnungen 110 und 112 vorgesehen, um die Enden einer Eintrittskapillare 114 und einer Austrittskapillare 116 aufzunehmen. Diese Öffnungen 110 und 112 können mit Ultraschall maschinell bearbeitet werden.
In Fig. 1A ist ein Merkmal gezeigt, das sich auf die Kopplung von Kapillare und Strömungskanal in der vorliegenden Erfindung bezieht.
Insbesondere in der Kapillar-Elektrophorese ist es wichtig, Störungen des elektrischen Feldes an Übergangsbereichen zwischen Kapillare und Strömungskanal zu minimieren, um die Separationseffizienz aufrechtzuerhalten.
Wie in Fig. 1A gezeigt, ist die Eintrittskapillare 114, die einen kleineren ID (ID = Innendurchmesser) als die Breite des Kanals 108 in dem Zellenkörper 102 aufweist, mit der Zelle 100 gekoppelt. Die Eintrittskapillare 114 weist an dem Übergang zwischen Kapillare und Strömungskanal einen breiteren ID auf, um den Durchmesser an die Breite des Kanals anzupassen.
Es sind verschiedene Vorgehensweisen möglich, um den ID der Kapillare 114 zu vergrößern.
In einer Ausführungsform wird das Volumen innerhalb der Kapillare mit Druck beaufschlagt, und die Kapillare wird in einer Gasflamme gedreht, bis der ID der Kapillare auf die gewünschte Erweiterung vergrößert ist. Dies kann einige Sekunden dauern.
Dann wird die Kapillare in der Mitte des Hohlraums eingekerbt, und es wird eine axiale Spannung angelegt. Die Kapillare bricht in der Mitte des Hohlraums mit einer glatten und rechteckigen Kante. So wird ein Übergang zwischen Kapillare und Strömungskanal mit graduellen Kurven und Übergangsbereichen bereitgestellt, um eine gleichmäßige Strömung zu erreichen und Turbulenzen zu vermeiden.
Die für Mikrosäulen-Separationen, wie Kapillar-Elektrophorese oder u- Flüssigchromatographie, verwendeten Kapillaren weisen Innendurchmesser auf, die typischerweise im Bereich von 25 um bis 100 um liegen.
Die in Fig. 1A gezeigte Zelle ist für sehr kleine Probenvolumina ausgelegt. In dieser Ausführungsform weist der Strömungskanal der Zelle einen rechteckigen Querschnitt von weniger als 150 um · 150 um sowie eine Kanallänge von weniger als 1,3 mm auf, was zu einem Zellenvolumen von weniger als 10 nl führt. Eine Detektionspfadlänge von 1 mm resultiert in einer Empfindlichkeit, die im Vergleich zu Detektionsmethoden an der Säule selbst, die Quarzglas-Kapillaren mit einem ID von 50 um verwenden, bis zu 20 Mal höher ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Zellenkörper 102 aus einem nichttransparenten Material, wie schwarzem Suprasil (eingetragene Marke) (schwarzes Quarzglas), das von Heraeus erhältlich ist.
Wie in Fig. 1 B gezeigt, beinhaltet der Zellenkörper 102 einen ersten und einen zweiten Bereich 102a und 102b. Ein erster und ein zweiter, den Strömungskanal bildender Teil 118a und 118b sind zwischen dem ersten Bereich 102a und dem zweiten Bereich 102b des Zellenkörpers 102 derart angeordnet, dass der in Fig. 1A gezeigte Strömungskanal 108 gebildet wird. Der Zellenkörper 102 wird erzeugt, indem der erste Bereich 102a des Zellenkörpers 102, der erste und der zweite, den Strömungskanal bildende Teil 118a, 118b sowie der zweite Bereich 102b des Zellenkörpers direkt aneinander angeschmolzen werden.
Ein derartiger Prozess ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird häufig für Küvetten und dergleichen verwendet.
Fig. 1C ist eine Querschnittansicht des Zellenkörpers 102, welche die den Strömungskanal bildenden Teile 118a und 118b sowie den resultierenden Strömungskanal 108 detaillierter zeigt.
Die Bereitstellung eines Zellenkörpers 102, der nicht-transparent ist, weist einen signifikanten Vorteil dahingehend auf, dass das Auftreten von Streulicht durch die Zellenwand verhindert wird.
Wie vorstehend bereits ausgeführt, ist dieses Streulicht ein bekanntes inhärentes Problem bei Detektoren des Standes der Technik, die eine Detektion an der Säule selbst oder Zellen mit transparenten Wänden verwenden. Es reduziert die Linearität des Detektors und reduziert außerdem die effektive Pfadlänge und somit die Empfindlichkeit.
In einem nicht-transparenten Zellenkörper definiert der Zellenaustritt eine glatte Öffnung, die vorteilhaft ist, wenn die Zelle zum Beispiel in einem Diodenfeld-Detektor verwendet wird.
Bevor die in Fig. 1B und 1C gezeigten Teile aneinander angeschmolzen werden, werden die Teile maschinell bearbeitet und poliert, um eine gleichmäßige und flache Oberfläche zu erhalten. Es muss eine Oberflächenrauhigkeit in der Größenordnung von weniger als 0,5 um erzielt werden, da dies eine Anforderung für einen anschließenden Verschmelzungsprozess ist.
Die Bereitstellung einer überlegenen Oberflächenqualität ist jedoch auch eine Anforderung für ein weiteres wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung. Die überlegene Oberflächenqualität bewirkt, dass Lichtstrahlen, die in die Zelle eintreten und auf die Zellenwand treffen, unter dem gleichen Winkel reflektiert werden, unter dem sie auf diese Wand einfallen.
Dieses Merkmal wird detaillierter in den Fig. 2A, 2B und 2C beschrieben.
Wie in Fig. 2A gezeigt, wird ein erster Teil 200 eines auf ein transmittierendes Medium 204, wie Quarz, einfallenden Lichtstrahls 202 in das Material 204 gebrochen, wobei ein zweiter Teil 206 des einfallenden Lichts 202 reflektiert wird.
Während der Brechungswinkel θt von dem Brechungsindex n beider Medien, wie Luft und Quarz, abhängig ist, ist der Reflexionswinkel θr stets gleich dem Einfallswinkel θi.
Die Menge an reflektiertem Licht ist vom Einfallwinkel θi abhängig.
Die Fig. 2B und 2C zeigen den Unterschied zwischen der diffusen und der gerichteten Reflexion.
Wie aus Fig. 2B ersichtlich, weist die Oberfläche eines Mediums 208 Unregelmäßigkeiten auf, wobei diese Unregelmäßigkeiten groß im Vergleich zu der Wellenlänge des einfallenden Lichts 210 sind. Diese Unregelmäßigkeiten führen zu einer diffusen Reflexion des einfallenden Lichts 210.
Das Medium 212 weist eine glatte Oberfläche mit Unregelmäßigkeiten auf, die klein im Vergleich zu der Wellenlänge des reflektierten Lichts sind. Dies ist eine Voraussetzung für gerichtete Reflexion des einfallenden Lichts 214.
Fig. 3 zeigt ein Diagramm des Reflexionsvermögens in Abhängigkeit vom Einfallswinkel unter der Annahme von Wasser (n = 1,33) als Einfallsmedium und Quarz (n = 1,5) als Material, in welches das Licht gebrochen wird.
Das Diagramm zeigt, dass bei Einfallswinkeln von mehr als 80 Grad die Menge an reflektiertem Licht dramatisch zunimmt.
Die Abhängigkeit des Reflexionsvermögens vom Einfallswinkel kann durch die folgenden Gleichungen ausgedrückt werden:
Rp(i) = (tan(θi - θt(i)))²/(tan(θi + θt(i)))²
Rr(i) = (sin(θi - θt(i)))²/(sin(θi + θt(i)))²
Die vorliegende Erfindung nutzt diesen Effekt, um einen hohen Lichtdurchsatz durch die Zelle zu erreichen und somit das photometrische Rauschen gering zu halten. Die Kanalwände werden eben und poliert gehalten, um eine gerichtete Reflexion zu erzielen, so dass das Licht durch die Zelle hindurchgeleitet wird. Für UV/Vis-Detektion unter Verwendung herkömmlicher Lichtquellen erfordert die Beleuchtung kleiner Volumina eine schnelle Optik. Da die Kanalabmessungen klein und der Kanal schmal sind, ist es wichtig, Licht, das in die Zelle eintritt, zu dem Detektor hinzuführen und es nicht durch diffuse Reflexion an der Zellenwand zu verlieren.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform, die in Fig. 4 gezeigt ist, beinhaltet die photometrische Strömungszelle 100 des Weiteren ein erstes Kapillarenträgermittel 120, das die Eintrittskapillare 114 trägt, und ein zweites Kapillarenträgermittel 122, das die Austrittskapillare 116 trägt.
Die Kapillaren 114, 116 können unter Verwendung eines Klebstoffes 124 oder von Kunststoffpassstücken, die üblicherweise zur Abdichtung der Kapillare gegenüber der Zelle verwendet werden, an der Zelle befestigt werden.
Es ist ersichtlich, dass andere Mittel zum Führen und Anbringen der Kapillaren verwendet werden können.
Fig. 5 zeigt eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die in Fig. 5 gezeigte Strömungszelle 500 entspricht teilweise der ersten und der zweiten Ausführungsform, so dass die Beschreibung gleichartiger Teile mit den gleichen Bezugszeichen wie in der ersten und der zweiten Ausführungsform weggelassen wird.
Im Gegensatz zu der ersten und der zweiten Ausführungsform beinhaltet die in Fig. 5 gezeigte Strömungszelle 500 kein erstes und zweites transparentes Fenster.
Die Strömungszelle 500 beinhaltet einen ersten, nicht-transparenten Bereich 504, der benachbart zu der ersten Oberfläche des Zellenkörpers 102 angeordnet ist, und einen zweiten, nicht-transparenten Bereich 506, der benachbart zu der zweiten Oberfläche des Zellenkörpers 102 angeordnet ist.
Gemäß der dritten Ausführungsform wird Licht durch einen optischen Eintrittswellenleiter 510 von einer Lichtquelle (nicht gezeigt) zu dem Zellenkörper 102 geleitet.
Das Licht, das durch den Eintrittswellenleiter 510 zu der Strömungszelle 102 geleitet wird und durch den Kanal 108 wandert, wird vorzugsweise durch eine optische Austrittsfaser 512 gesammelt, die das Licht zu irgendeiner Art von optischem Detektor führt, wie einem Photoelektronenvervielfacher, einer Diode, einem Spektrometer etc.
Die nicht-transparenten Bereiche 504, 506 sind vorzugsweise aus Black Suprasil (eingetragene Marke) gebildet.
Es ist zu erwähnen, dass die Fasern 510, 512 vorzugsweise in direkter Verbindung mit dem Strömungskanal 108 stehen.
Die in Fig. 5 gezeigte Ausführungsform ist vorteilhaft dahingehend, dass sie eine Fernmessung und/oder eine thermische Isolierung der flüssigkeitsleitenden Mittel in einem Flüssigphasen-Analyseinstrument erlauben.
Fig. 6 zeigt ein Elektropherogramm, bei dem eine Kapillare mit (Mikrozelle #1) und eine ohne (Mikrozelle #2) erweiterten ID an dem Übergang zwischen Kapillare und Strömungskanal verwendet wurden.
Das Elektropherogramm wurde unter den folgenden Bedingungen aufgezeichnet:
Puffer: Borat 20 mH pH8
Probe: p-Hydroxyacetophenon (100 uM in Wasser)
Kassettentemperatur: 25ºC
Injektion: 10&sup4; N·sec/m² (100 mbarsec)
Detektion: 325 nm, 4 nm BW, 0,2 sec Rt.
Spannung: 25 kV
Kapillarenlänge: 56 cm
Es ist klar zu erkennen, dass die Kapillare mit dem geraden Ende stärkere Spitzenwert- Ausläufer und somit eine geringere Effizienz zeigt.
In Fig. 7 ist ein Diagramm gezeigt, welches die Verstärkung der Empfindlichkeit darstellt, die in einer elektrophoretischen Separation unter Verwendung einer Mikrozelle gemäß der vorliegenden Erfindung leicht erreicht wird.
Das Elektropherogramm wurde unter den folgenden Bedingungen aufgezeichnet:
Puffer: Borat 20 mH pH8
Probe: p-Hydroxyacetophenon (1 uM in Wasser)
Kassettentemperatur: 25ºC
Injektion: 2·10&sup4; N·sec/m² (200 mbarsec)
Nachinjektion: 10&sup4; N·sec/m² (100 mbarsec)
Detektion: 325 nm, 4 nm BW, 0,2 sec Rt.
Spannung: 25 kV
Kapillarenlänge: 56 cm
Die Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung wurde mit der empfindlichsten Methode einer Detektion an der Säule selbst verglichen, die für Kapillaren-Elektrophorese leicht verfügbar ist, wobei eine Kapillare mit einem ID von 75 um verwendet wurde, der am Punkt der Detektion um das Dreifache erweitert ist.
Die vorliegende Erfindung bietet eine noch nie dagewesene Empfindlichkeit in der Detektion für eine Flüssigphasenanalyse von mikroskopischen Proben.
Es ist zu erwähnen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die transparenten Fenster, wie sie in der ersten und der zweiten Ausführungsform beschrieben sind, oder auf die Lichteintritts- und Lichtaustritts-Wellenleiter beschränkt ist. Es können auch andere Mittel zum Eintreten des Lichts in die Strömungszelle und zum Austreten des Lichts aus der Strömungszelle in ein Detektormittel verwendet werden.
Wenngleich die vorliegende Erfindung detailliert unter Bezugnahme auf eine spezielle bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, werden Fachleute auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht, erkennen, dass verschiedene Modifikationen und Verbesserungen durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Ansprüche abzuweichen, die folgen.

Claims

1. Photometrische Vorrichtung für kleine Probenvolumina mit:

einem Zellenkörper (102);

einem Lichteingabemittel (104; 510), das benachbart zu einer ersten Oberfläche des Zellenkörpers (102) angeordnet ist;

einer Lichtquelle (105), die Licht einer vorgegebenen Wellenlänge oder eines vorgegebenen Wellenlängenbereichs durch das Lichteingabemittel (104; 510) emittiert;

einem Lichtausgabemittel (106; 512), das benachbart zu einer zweiten Oberfläche des Zellenkörpers (102) gegenüberliegend zu der ersten Oberfläche angeordnet ist;

einem Lichtdetektor (107), der benachbart zu dem Lichtausgabemittel (106; 512) angeordnet ist; und

einem Strömungskanal (108), der in dem Zellenkörper (102) ausgebildet ist;

dadurch gekennzeichnet, dass

Oberflächen der Wände des Kanals (108) eine Rauhigkeit aufweisen, die geringer als die vorgegebene Wellenlänge beziehungsweise jegliche Wellenlänge des Wellenlängenbereichs ist, und

die Wände des Kanals durch wenigstens drei einzelne, den Strömungskanal bildende Teile (118a, 118b, 102a, 102b) gebildet sind, wobei diejenigen Oberflächen der den Strömungskanal bildenden Teile, die dem Inneren des Kanals zugewandt sind, aus flachen Bereichen bestehen und wobei jede der flachen Oberflächen vor dem Zusammenbau des Zellenkörpers auf die Rauhigkeit poliert wurde, die geringer als die vorgegebene Wellenlänge beziehungsweise jegliche Wellenlänge des Wellenlängenbereichs ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Lichteingabemittel einen optischen Einqabewellenleiter (510) beinhaltet und wobei das Lichtausgabemittel einen optischen Ausgabewellenleiter (512) beinhaltet.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Lichteingabemittel ein erstes transparentes Fenster (104) beinhaltet und wobei das Lichtausgabemittel ein zweites transparentes Fenster (106) beinhaltet.

4. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Zellenkörper (102) aus einem nicht-transparenten Material gebildet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder nach Anspruch 4 in Verbindung mit Anspruch 3, wobei der Strömungskanal beinhaltet:

einen ersten Bereich (108a), der benachbart zu dem ersten transparenten Fenster (104) ausgebildet ist und sich im Wesentlichen parallel zu der ersten Oberfläche des Zellenkörpers (102) erstreckt;

einen zweiten Bereich (108b), der sich von der ersten Oberfläche zu der zweiten Oberfläche des Zellenkörpers (102) erstreckt; und

einen dritten Bereich (108c), der benachbart zu dem zweiten transparenten Fenster (106) ausgebildet ist und sich im Wesentlichen parallel zu der zweiten Oberfläche des Zellenkörpers (102) erstreckt.

6. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 mit einer Einlasskapillare (114) und einer Auslasskapillare (116), die mit dem Strömungskanal (108) in Fluidverbindung stehen.

7. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Einlasskapillare (114) oder die Auslasskapillare (116) am Übergang von Kapillare zu Strömungskanal einen erweiterten Innendurchmesser aufweist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7 mit einem Kapillarenträgermittel (120, 122), das an dem Zellenkörper (102) angebracht ist, um die Einlass- und die Auslasskapillare (114, 116) zu tragen.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Einlasskapillare und die Auslasskapillare (114, 116) durch Klebstoff (124) oder Kunststoffverbindungsstücke an dem Kapillarenträgermittel (120, 122) befestigt sind.

10. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Strömungskanal (108) einen rechteckigen Querschnitt von weniger als 150 um · 150 um und eine Kanallänge von weniger als 1,5 mm aufweist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei der Strömungskanal (108) einen rechteckigen Querschnitt von weniger als 150 um · 150 um, eine Kanallänge von weniger als 1,5 mm und ein Gesamtvolumen von weniger als 10 nl aufweist.

12. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 3 oder 4 bis 11 in Verbindung mit Anspruch 3, wobei die transparenten Fenster (104, 106) aus Quarzglas bestehen.