DE69523943T2

DE69523943T2 - Neue antithrombotische formulierung, verfahren zur herstellung und gebrauch davon

Info

Publication number: DE69523943T2
Application number: DE69523943T
Authority: DE
Inventors: Jan-Erik Loefroth; Anna-Lena Ungell
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2015-11-30
Also published as: AU689994B2; SE9404196D0; IL116153A; EE03338B1; IL116153A0; ATE208628T1; FI972332A7; HU216631B; IS4483A; JPH10513438A; EP0799052B1; NZ297118A; SK61797A3; DE69523943D1; WO1996016671A1; CA2206459A1; NO972475D0; FI972332A0; AU4191596A; PL320692A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue pharmazeutische Formulierung, enthaltend den Thronbin- Inhibitor HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab in Kombination mit einem oder mehreren Resorptionsverbesserern, ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen pharmazeutischen Formulierung und die Verwendung einer derartigen Formulierung bei der Behandlung von Thromboembolie sowie eine Methode zur Behandlung eines Patienten, der einer derartigen Behandlung mit der Formulierung bedarf.

HINTERGRUND

Die Blutgerinnung ist als Schlüsselprozeß sowohl an der Hämostase (d.h. Verhinderung von Blutverlust aus einem beschädigten Gefäß) als auch an der Thrombose (d.h. dem pathologischen Verschluß eines Blutgefäßes durch ein Blutgerinnsel) beteiligt. Die Gerinnung ist das Ergebnis einer komplizierten Reihe enzymatischer Reaktionen, wobei in einem der letzten Schritte das Proenzym Prothrombin in das aktive Enzym Thrombin umgewandelt wird.
Das Thrombin spielt bei der Koagulation eine zentrale Rolle. Es aktiviert Thrombozyten, wandelt Fibrinogen in Fibrinmonomere um, die spontan zu Fäden polymerisieren, und aktiviert den Faktor XIII, der wiederum das Polymer zu unlöslichem Fibrin vernetzt. Thrombin aktiviert außerdem in einer positiven Rückkopplungsreaktion den Faktor V und den Faktor VIII. Von Thrombin-Inhibitoren wird daher erwartet, daß sie wirksame Antikoagulantien darstellen, indem sie die Thrombozytenaktivierung, die Fibrinbildung und die Fibrinstabilisierung inhibieren. Durch Inhibierung des positiven Rückkopplungsmechanismus sollen sie die Inhibierung in einer frühen Phase der zu Koagulation und Thrombose führenden Ereigniskette ausüben.
Peptidische oder peptidähnliche Thrombin- Inhibitoren zeigen wie viele andere peptidähnliche Substanzen bei Verabreichung häufig eine begrenzte oder variable Resorption. Dies ist auf den Einfluß verschiedener Barrieren mit metabolischem und physikalischem Charakter zurückzuführen, wie z.B. enzymatischen Abbau, Neigung zur Bildung von Komplexen mit Komponenten aus der Formulierung oder der biologischen Umgebung, Beschränkungen der Transportmöglichkeiten usw. Eine Aufgabe der in Rede stehenden pharmazeutischen Formulierung besteht darin, die Überwindung derartiger Barrieren für den Wirkstoff zu erleichtern und eine verbesserte und reproduzierbare Resorption des Wirkstoffs zu erhalten. Formulierungskomponenten, die einen derartigen Einfluß haben und somit eine Hilfe für den Wirkstoff darstellen können, werden als Resorptionsverbesserer bezeichnet.

Stand der Technik

Über die Verswendung von Resorptionsverbesserern in pharmazeutischen Formulierungen gibt es in der Literatur einige Berichte und Übersichtsartikel. Verbessernde Eigenschaften sind für verschiedene Arten von Substanzen angegeben worden, wie z.B. für Tenside und Lipide, Chelatbildner und Polymere. Umfassende Übersichtsartikel wurden von E.J. von Hoogdalem et al., Pharmac. Theor., Band 44, 407-443 (1989), S. Muranishi, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., Band 7, 1-33 (1990) und E.S. Swenson und W.J. Curatolo, Adv. Drug Deliv. Rev., Band 8, 39-92 (1992), sowie in Drug Absorption Enhancement (Hrsg.: A.B.G. de Boer), Harwood Academic Publishers 1994, vorgelegt.
In den Druckschriften WO 91/07976, WO 93/11152 und WO 94/29336 werden verschiedene Thrombin- Inhibitoren beschrieben.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Es wurde gefunden, daß die Resorption des therapeutisch aktiven bzw. wirksamen Thrombin- Inhibitors HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab durch Einarbeitung von Resorptionsverbesserern in die die therapeutisch wirksame Verbindung enthaltende Formulierung modifiziert werden kann.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung von neuen pharmazeutischen Formulierungen, enthaltend den Thrombin-Inhibitor HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab in Kombination mit einem oder mehreren Resorptionsverbesserern sowie gegebenenfalls einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger, und eines Verfahrens zur Herstellung derartiger pharmazeutischer Formulierungen.
Wege zur Herstellung der verbesserten Formulierungen dieses therapeutisch wirksamen Arzneistoffs basieren auf der Verwendung von Resorptionsverbesserern, wie z.B. Tensiden, Lipiden, anderen Arzneistoffen und Polymeren, zur Erzielung positiver Effekte, die zu einer verbesserten und/oder weniger variablen Resorption des therapeutischen Wirkstoffs bei Applikation auf verschiedenen Verabreichungswegen, wie z.B. auf oralem, rektalem, bukkalem, nasalem oder pulmonalem Wege oder durch Inhalation, führen, und Kombinationen derartiger Mittel, wobei sogar positive synergistische Effekte erzielbar sind, die zu einer noch weiter verbesserten Resorption führen.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen resorptionsverbessernden Effekte sollen durch ein oder mehrere Additive in der Formulierung erhalten werden, wie z.B.:
Nichtsteroidale Antiinflammatorika und Derivate, wie Natriumsalicylat, Natrium-5- methoxysalicylat, Indomethacin und Diclofenac;
Tenside, wie nichtionische Tenside, z.B. Sorbitanester (Span-Reihe), Polysorbate (Tween- Reihe), polyoxyethylierte Glykolmonoether (wie die Brij-Reihe), polyoxylierte Alkylester (Myrj-Reihe), polyoxyethylierte Alkylphenole (wie die Triton-Reihe), Alkylglucoside wie Zuckerglycoside, z.B. Dodecylmaltosid, Zuckerfettsäureester, z.B. Saccharoselaurat, Saccharosemonostearat usw., und Saponine;
ampholytische Tenside, z.B. Betaine;
anionische Tenside, z.B. sulfatierte Fettalkohole, sulfatierte polyoxyethylierte Alkohole, andere, wie Dioctylsulfosuccinat;
kationische Tenside, z.B. Ammoniumverbindungen. Gallensalze, wie z.B. Dihydroxygallensalze wie Natriumdesoxycholat, Trihydroxygallensalze wie Natriumglycocholat und Fusidate, z.B. Natriumdihydrofusidat;
Seifen und Fettsäuren und deren Salze, z.B. Octansäure, Decansäure und Natriumdecanoat;
Lipide, wie Glyceride, z.B. Glycerylmonooctanoat und Glycerylmonoolein;
Phospholipide, z.B. DPPC und DMPC;
Öle, z.B. Sojabohnenöl und Sonnenblumenöl;
Enamine, wie z.B. DL-Phenylalanin und Ethylacetoacetatenamin;
Chelatbildner, z.B. EDTA, EGTA und Citronensäure;
Phenothiazine, wie z.B. Chlorpromazin;
Fettsäurederivate von Carnitin und Peptiden, z.B. Palmitoyl-DL-carnitin und N-Myristoyl-Lpropyl-L-prolyl-glycinat;
Andere Substanzen, z.B. Azon, Concanavalin A, Phosphat- und Phosphonat-Derivate, wie z.B. DLα-glycerophosphat und 3-Amino-1-hydroxypropyliden-1,1-diphosphonat, Diethylmaleat und Diethylethoxymethylenmalonat;
Produkte von Maillard-Reaktionen, z.B. Verbindungen aus einer Glucoselysinreaktion;
Polymere, wie z.B. Polyacrylsäuren, z.B. Carbopol®, Polycarbophil; Chitosan und Chitosanderivate; und Blockcopolymere, z.B. Poloxamere, Poloxamine und Meroxapole.
Als vorgesehene Kombinationen der Resorptionsverbesserer eignen sich u.a.:
Lipide und Gallensalze, z.B. Monoolein und Natriumtaurocholat;
Lipide und Phospholipide, z.B. mittelkettige Glyceride und Lecithine;
Tenside und Öle, z.B. Saccharosefettsäureester und Sojabohnenöl; und
Polymere und Lipide, z.B. Polycarbophil und Monoolein.
Als Dosierungsform kann man eine nach bekannten Methoden hergestellte feste, halbfeste oder flüssige Zubereitung verwenden. Der Wirkstoff macht üblicherweise zwischen 0,1 und 99 Gew.-% der Zubereitung aus und liegt insbesondere zwischen 0,1 und 50 Gew.-% für Zubereitungen für die parenterale Verabreichung und zwischen 0,2 und 90 Gew.-% für Zubereitungen für die orale Verabreichung.
Geeignete Tagesdosen des therapeutisch wirksamen Arzneistoffs bei der therapeutischen Behandlung von Menschen betragen etwa 0,001-100 mg/kg Körpergewicht für die perorale Verabreichung und 0,001- 50 mg/kg Körpergewicht bei parenteraler Verabreichung.
Der Resorptionsverbesserer bzw. Kombinationen von Resorptionsverbesserern machen zwischen 0,1 und 99 Gew.-% der Zubereitung aus. Die so erhaltenen Formulierungen verbessern die Resorption und/oder minimieren die Variabilität der Resorption des therapeutisch wirksamen Arzneistoffs durch verschiedene Mechanismen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen, die das modifizierte Dipeptid HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab und die Resorptionsverbesserer enthalten, sind zur Prophylaxe und Behandlung bei arterieller sowie venöser Thromboembolie vorgesehen.
Einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet ein Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Formulierung, bei dem man einer Lösung einer therapeutisch wirksamen Verbindung HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab die Resorptionsverbesserer zusetzt, gegebenenfalls den pH-Wert mit einer Puffersubstanz auf einen therapeutisch unbedenklichen pH-Wert, beispielsweise zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 7 und 8, z.B. 7,4, einstellt und alle Bestandteile vermischt. Bei der Puffersubstanz kann es sich um einen Phosphatpuffer, wie K&sub2;HPO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, handeln. Der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierung können auch andere, üblicherweise in pharmazeutischen Formulierungen verwendete und dem Fachmann bekannte Bestandteile beigefügt werden, wie z.B. Träger und Isotonisierungsmittel, wie NaCl.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt den Effekt von zwei Resorptionsverbesserern auf die Permeabilität der Darmmembran für HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab.

NÄHERE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgende Beschreibung dient zur Erläuterung von Aspekten der Erfindung.

EXPERIMENTELLER TEIL

Allgemeine experimentelle Verfahrensweisen

Zur Aufnahme der Massenspektren diente ein Tripelquadropolmassenspektrometer der Bauart Finnigan MAT TSQ 700 mit Elektrospray-Interface.
Zur Durchführung der ¹H-NMR- und ¹³C-NMR- Messungen dienten Spektrometer der Bauart BRUKER AC-P 300 und BRUKER AM 500 mit einer ¹H-Betriebsfrequenz von 500,14 MHz und einer ¹³C-Betriebsfrequenz von 125,76 MHz bzw. einer ¹H-Betriebsfrequenz von 300,13 MHz und einer ¹³C-Betriebsfrequenz von 75,46 MHz.
Als Proben dienten etwa 10-50 mg Substanz, die in 0,6 ml eines der folgenden Lösungsmittel gelöst waren: CDCl&sub3; (Isotopenreinheit > 99, 8%), CD&sub3;OD (Isotopenreinheit > 99,95%), D&sub2;O (Isotopenreinheit > 99, 98%). Alle Lösungsmittel wurden von der Dr. Glaser AG, Basel, bezogen.
Die ¹H- und ¹³C-chemischen Verschiebungen in CDCl&sub3; und CD&sub3;OD beziehen sich auf Tetramethylsilan als externen Standard. Die ¹H-chemischen Verschiebungen in D&sub2;O beziehen sich auf das Natriumsalz von 3-(Trimethylsilyl)-d&sub4;-propansäure, und als Referenz für die ¹³C-chemischen Verschiebungen in D&sub2;O dient 1,4-Dioxan (67,3 ppm), jeweils als externer Standard. Die Kalibrierung mit einem externen Standard kann in einigen Fällen geringfügige Verschiebungsunterschiede gegenüber einem internen Standard verursachen, jedoch beträgt die Differenz der ¹H-chemischen Verschiebung weniger als 0,02 ppm und die Differenz der ¹³Cchemischen Verschiebung weniger als 0,1 ppm.
Das ¹H-NMR-Spektrum von Peptidsequenzen, die einen Prolinrest oder einen "Prolin-ähnlichen" Rest enthalten, zeigt häufig zwei Sätze von Resonanzen. Dies entspricht der Existenz von zwei beitragenden Konformeren bezüglich der Drehung um die Amidbindung, wobei Prolin den N-Teil der Amidbindung darstellt. Die Konformere werden als cis und trans bezeichnet. Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen ergeben die Sequenzen (R)Cha-Aze- und (R)Cha-Pic- häufig ein cis-trans- Gleichgewicht mit einem überwiegenden Konformer (> 90%). In diesen Fällen werden nur die ¹H-chemischen Verschiebungen des Hauptrotamers angegeben. Nur in den Fällen, in denen die Signale des untergeordneten Rotamers klar aufgelöst sind, werden sie in der NMR- Dokumentation angegeben. Dasselbe Kriterium gilt für die NH-Signale in CDCl&sub3;: nur in den Fällen, in denen die Signale klar aufgelöst sind, werden sie in der NMR- Dokumentation angegeben. Daraus geht hervor, daß die für einige der Zwischenprodukte angegebene Protonenzahl kleiner als die aus der chemischen Formel zu erwartende Protonenzahl ist.
Die Flashchromatographie erfolgte an Kieselgel 60 (40-63 mm, 230-400 Mesh) von Merck unter Druckluft.
Die Gefriertrocknung erfolgte auf einem Gerät des Modells Lyovac GT 2 von Leybold-Heraeus.

Herstellung von Edukten

4-Aminomethyl-1-(N-benzoyloxycarbonylamidino)-benzol (H-Pab(Z))

(i) 4-Cyanobenzylazid

Eine Lösung von 20,23 g (0,31 mol) Natriumazid in 50 ml Wasser wurde bei Raumtemperatur zu 49,15 g (251 mmol) 4-Cyanobenzylbromid in 200 ml DMF gegeben, wobei eine exotherme Reaktion stattfand. Nach 1,5 h wurde die Reaktionsmischung mit 200 ml Toluol verdünnt (Vorsicht: Zur Vermeidung der Abtrennung von potentiell explosiven Azidverbindungen sollte man die Reaktionsmischung zunächst mit dem Toluol und erst danach mit dem Wasser versetzen) und 500 ml Wasser verdünnt. Die wäßrige Phase wurde mit weiteren 2 · 50 ml Toluol extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 2 · 50 ml Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und schließlich getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert. Die Lösung wurde als solche im nächsten Schritt eingesetzt.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;); δ 4.4 (s, 2H), 7.4 (d, 2H), 7.7 (d, 2H).

(ii) 4-Amidinobenzylazid

In ein Gemisch aus 250 ml absolutem Ethanol und der Lösung aus obigem Schritt (i) (ungefähr 200 ml) wurde bei -5ºC bis zur Sättigung Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach Lagerung bei 8ºC über einen Zeitraum von 24 h und Abziehen des größten Teils des Lösungsmittels und anschließender Ausfällung durch Zugabe von wasserfreiem Ether wurden weiße Kristalle erhalten, die abfiltriert und in 1,8 l alkoholischem Ammoniak gelöst wurden. Nach 48 h wurde der größte Teil des Lösungsmittels abgezogen und mit 200 ml 3,75 M NaOH-Lösung versetzt, wobei 4-Amidinobenzylazid in Form von farblosen Kristallen ausfiel. Die Kristalle wurden abfiltriert. An diesem Punkt betrug die Ausbeute an 4-Amidinobenzylazid 22,5 g (insgesamt 51%). Ethylimidatobenzylazid-hydrochlorid:
¹H-NMR (500 MHz, CD&sub3;OD); δ 1.6 (t, 3H), 4.5 (s, 2H), 4.65 (q, 2H), 4.8 (br s, 2H), 7.6 (d, 2H), 8.1 (d, 2H).

4-Amidinobenzylazid:

¹H-NMR (500 MHz, CDCl&sub3;); δ 4.3 (s, 2H), 5.7 (br s, 3H), 7.3 (d, 2H), 7.6 (d, 2H).
¹³C-NMR (125 MHz, CDCl&sub3;): Amidin-Kohlenstoffatom: δ 165.5.

(iii) 4-(Benzyloxycarbonylamidino)benzylazid

Die Kristalle aus obigem Schritt (ii) wurden in 500 ml Methylenchlorid gelöst, wonach die erhaltene Lösung getrocknet (K&sub2;CO&sub3;), filtriert und mit 27 ml (194 mmol) Triethylamin versetzt wurde. Die gerührte Lösung wurde langsam unter Kühlen in einem Eisbad mit 25 ml Chlorameisensäurebenzylester versetzt. Nach 30 Minuten wurden weitere 2 ml Chlorameisensäurebenzylester zugesetzt, und es wurde weitere 30 Minuten gerührt. Danach wurde Wasser zugesetzt und die wäßrige Phase mit 2 M HCl auf pH 7 eingestellt. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Schließlich wurde 4-(Benzyloxycarbonylamidino)benzylazid in Form von farblosen Kristallen aus Ether/Methylenchlorid/Hexan isoliert.
¹H-NMR (500 MHz, CDCl&sub3;); δ 4.4 (s, 2H), 5.3 (s, 2H), 6.3-7.0 (br s, 1H), 7.3-7.4 (m, 5H), 7.5 (d, 2H), 7.9 (d, 2H), 9.3-9.6 (br s, 1H).
¹³C-NMR (125 MHz, CDCl&sub3;): Amidin-Kohlenstoffatom: δ 167.5.

(iv) 4-Aminomethyl-1-(N-benzyloxycarbonylamidino)- benzol (H-Pab(Z))

Eine Lösung des 4-(Benzyloxycarbonylamidino)- benzylazids aus obigem Schritt (iii) in 160 ml THF wurde bei Raumtemperatur mit 26,3 g (100 mmol) Triphenylphosphan versetzt. Nach 16 h wurden weitere 6,6 g (25 mmol) Triphenylphosphan zugesetzt, wonach die Lösung 4 h stehengelassen wurde und danach in Vakuum vom Lösungsmittel befreit wurde. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst und mit 2 M HCl extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mit Methylenchlorid und Ether gewaschen und anschließend mit 3,75 M Natriumhydroxidlösung alkalisch gestellt. Nach Extraktion mit Methylenchlorid, Trocknen (K&sub2;CO&sub3;) und Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wurden 20 g (die Gesamtausbeute ausgehend von Cyanobenzylbromid beträgt 28%) eines gelben Öls erhalten, das beim Stehen fest wurde.
¹H-NMR (500 MHz, CDCl&sub3;); δ 1.2-2.2 (br s, 2H), 3.8 (s, 2H), 5.2 (s, 2H), 7.2-7.35 (m, 5H), 7.4 (d, 2H), 7.8 (d, 2H), 9.1-9.6 (br s, 1H).
¹³C-NMR (125 MHz, CDCl&sub3;): Amidin- und Carbonylkohlenstoffatome: δ 164.6 und 168.17.
H-Aze-OMe · HCl
Diese Verbindung wurde nach der Methode von D. Seebach et al., Liebigs Ann. Chem., S. 687, 1990, hergestellt.

Boc-(R)Cgl-OH

Eine Lösung von 32,6 g (0, 13 mol) Boc- (R) -Pgl- OH in 300 ml Methanol wurde mit 5 g Rh/Al&sub2;O&sub3; versetzt. Die Lösung wurde 3 Tage bei 5,2 bis 2,8 MPa hydriert. Nach Abfiltrieren und Abziehen des Lösungsmittels lagen laut NMR etwa 25% des Methylesters der Titelverbindung vor. Das Rohmaterial wurde in 500 ml THF und 300 ml Wasser gelöst und mit 20 g LiOH versetzt. Nach Rühren über Nacht wurde das THF abgezogen. Die verbleibende Wasserphase wurde mit KHSO&sub4; angesäuert und dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und eingedampft, was 28, 3 g (83%) des gewünschten Produkts ergab.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.9-1.7 (m, 20H), 4.0-4.2 (m, 1H), 5.2 (d, 1H).

Boc-(R)Cgl-Aze-OH

(i) Boc-(R)Cgl-Aze-OMe

Eine gerührte Mischung aus 3,86 g (15 mmol) Boc-(R)Cgl-OH, 2,27 g (15 mmol) H-Aze-OMe · HCl und 2,75 g (22,5 mmol) DMAP in 40 ml CH&sub3;CN wurde bei 5ºC mit 3,16 g (16,5 mmol) EDC versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 48 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand in 150 ml EtOAc und 20 ml H&sub2;O gelöst. Die abgetrennte organische Schicht wurde mit 2 · 20 ml 0,5 M KHSO&sub4;, 2 · 10 ml NaHCO&sub3; (gesättigt), 1 · 10 ml H&sub2;O, 1 · 10 ml Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Nach Abziehen des Lösungsmittels wurden 4,91 g (92%) der Titelverbindung erhalten, die ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt wurde.
¹H-NMR (500 MHz, CDCl&sub3;, 0,1 g/ml): Hauptrotamer, 0.83-1.35 (m, 5H), 1.38 (s, 9H), 1.47-1.84 (m, 6H), 2.18-2.27 (m, 1H), 2.50-2.62 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.94-4.06 (m, 1H), 4.07-4.15 (m, 1H), 4.39-4.47 (m, 1H), 4.68 (dd, J = 9.1, J = 5.1, 1H), 5.09 (d, J = 9.2, 1H). Aufgelöste Signale des Nebenrotamers: 2.27-2.35 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.80-3.87 (m, 18), 3.88-3.95 (m, 1H), 4.92 (d, J = 9.2, 1H), 5.21 (dd, J = 9.1, J ~ 5, 1H).

(ii) Boc-(R)Cgl-Aze-OH

Die Hydrolyse von Boc-(R)Cgl-Aze-OMe wurde wie für Boc-(R)Cha-Pic-OEt (siehe unten) beschrieben durchgeführt. Das Produkt wurde aus EtOH/Aceton/Wasser (1/1/3,95) kristallisiert. Ausbeute 80%.
¹H-NMR (500 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.85-1.3 (m, 5H), 1.40 (s, 9H), 1.5-1.9 (m, 6H), 1.95-2.2 (m, 2H), 3.92 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.95 (m, 1H), 5.16 (bd, 1H).

Herstellung der Verbindung HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab

(i) Boc-(R)Cgl-Aze-Pab(Z)

Eine gerührte Mischung aus 3,40 g (10 mmol) Boc-(R)Cgl-Aze-OH (siehe Herstellung von Edukten) und 5.13 g DMAP (42 mmol) in 120 ml CH&sub3;CN wurde mit 3,18 g H-Pab(Z) · 801(siehe Herstellung von Edukten) versetzt. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung auf -8ºC abgekühlt und mit 2,01 g (10,5 mmol) EDC versetzt. Der Ansatz wurde auf Raumtemperatur kommen gelassen und noch 47 Stunden weitergerührt. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand in 200 ml EtOAc gelöst. Die organische Phase wurde mit 1 · 50 ml Wasser, 1 · 50 + 2 · 25 ml 0,5 M KHSO&sub4;, 2 · 25 ml NaHCO&sub3; (gesättigt), 1 · 50 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurden 5,21 g (86%) der Titelverbindung erhalten.
¹H-NMR (500 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.8-1.9 (m, 20H, davon 1.30 (s, 9H)), 2.35-2.6 (m, 2H), 3.74 (bt, 1H), 4.10 (m, 1H), 4.25-4.4 (m, 2H), 4.45-4.6 (m, 1H, Rotamere), 4.75-5.0 (m, 1H, Rotamere), 5.08 (bd, 2H), 5.15 (s, 2H), 7.15-7.35 (m, 5H), 7.41 (d, 2H), 7.77 (d, 2H), 8.21 (m, 1H).

(ii) H-(R)Cgl-Aze-Pab (Z)

Eine kalte (Eisbadtemperatur) Lösung von 18,8 g HCl(g) in 195 ml EtOAc wurde mit 4,69 g (7,743 mmol) Boc-(R)Cgl-Aze-Pab(Z) zusammen mit 40 ml EtOAc versetzt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur kommen gelassen und 30 min gerührt. Nach Zusatz von 140 ml Et&sub2;O zur klaren Lösung bildete sich ein Niederschlag. Der Ansatz wurde noch 1 h und 40 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Dann wurde der Niederschlag abfiltriert, schnell mit 150 ml Et&sub2;O gewaschen und im Vakuum getrocknet. Der Niederschlag wurde in 50 ml Wasser gelöst und mit 15 ml 2 M NaOH alkalisch gestellt. Dann wurde die alkalische Wasserphase mit 1 · 100 + 1 · 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit 1 · 20 ml Wasser und 1 · 20 ml Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;). Nach Abziehen des Lösungsmittels wurden 3,44 g (88%) der Titelverbindung erhalten.
¹H-NMR (500 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.8-2.0 (m, 11H), 2.51 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 3.07 (d, 1H), 4.11 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 4.43 (dd, 1H), 4.53 (dd, 1H), 4.91 (m, 1H), 5.22 (s, 2H), 7.2-7.4 (m, 7H), 7.45 (d, 2H), 8.51 (d, 2H).

(iii) BnOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab(Z)

Ein Gemisch aus 1,13 g (2,2 mmol) H-(R)Cgl-Aze- Pab(Z), 0,9 g (2,6 mmol) 2-(ortho-Nitrobenzolsulfonyloxy) essigsäurebenzylester ((2-NO&sub2;)Ph-SO&sub2;-OCH&sub2;- COOBn) (siehe Herstellung von Edukten), 0,99 g (5,6 mmol) K&sub2;CO&sub3; und 113 ml CH&sub3;CN wurde in einem 60ºC heißen Ölbad 3 h erhitzt. Nach Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wurde mit EtOAc versetzt und die Mischung mit Wasser gewaschen, die organische Phase mit 1 M KHSO&sub4; extrahiert und diese Wasserphase mit EtOAc gewaschen. Die saure Wasserphase wurde mit 1 N NaOH bis zu einem pH-Wert > 8 alkalisch gestellt und mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum eingedampft, was 1,17 g eines Rückstands ergab, der zweimal flashchromatographiert wurde, wobei zunächst CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (NH&sub3;-gesättigt) (95/5) und dann Diethylether/MeOH (NH&sub3;-gesättigt) (9/l) als Elutionsmittel verwendet wurde, was 0,525 g (36%) der Titelverbindung ergab.
Die Alkylierung wurde auch mit 2-(para- Nitrobenzolsulfonyloxy)essigsäurebenzylester ((4-NO&sub2;)Ph- SO&sub2;-OCH&sub2;-COOBn) (siehe Herstellung von Edukten) nach der gleichen Verfahrensweise wie oben durchgeführt, was die Titelverbindung in einer Ausbeute von 52% ergab.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.85-2.15 (m, 11H), 2.48 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.88 (d, 1H), 3.24 (d, 1H), 3.27 (d, 1H), 3.95 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.91 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 7.2-7.4 (m, 10H), 7.45 (d, 2H), 7.79 (d, 2H), 8.42 (m, 1H).

(iva) HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab · 2 HCl

Eine Lösung von 20 mg (0,031 mmol) BnOOC-CH&sub2;- (R)Cgl-Aze-Pab(Z) in 5 ml Methanol wurde mit einigen Tropfen Chloroform und 5% Pd/C versetzt, wonach die Mischung bei Normaldruck 1 h hydriert wurde. Nach Filtrieren und Eindampfen wurde das Produkt aus Wasser lyophilisiert, was 11 mg (72%) der Titelverbindung ergab.
¹H-NMR (500 MHz, D&sub2;O): s 1.0-2.0 (m, 11H), 2.10 (m, 1H), 2.44 (m, 1H), 2.82 (m, 1H), 3.90 (s, 2H), 4.09 (d, 1H), 4.4-4.55 (m, 2H), 4.66 (s, 2H), 5.08 (m, 1H), 7.65 (d, 2H), 7.89 (d, 2H).
¹³C-NMR (75.5 MHz, D&sub2;O): Amidin- und Carbonylkohlenstoffatome: δ 167.3, 167.9, 169.9 und 172.4.

(ivb) HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab

Eine Lösung von BnOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab(Z) in EtOH (99%ig) wurde an 5% Pd/C bei Normaldruck 5 Stunden hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators über Celite und Abziehen des Lösungsmittels wurde die Titelverbindung in einer Ausbeute von 97% erhalten.
¹H-NMR (500 MHz, CD&sub3;OD, Gemisch aus zwei Rotameren): Hauptrotamer: δ 1.00-1.12 (m, 1H), 1.13- 1.34 (m, 4H), 1.55-1.70 (m, 3H), 1.73-1.85 (m, 2H), 1.94-2.02 (bd, 1H), 2.32-2.42 (m, TH), 2.54-2.64 (m, 1H), 2.95-3.10 (AB-System plus d, 3H), 4.18-4.25 (bq, 1H), 4.28-4.32 (bq, 1H), 4.43-4.60 (AB-System, 2H), 4.80-4.85 (dd, 1H), 7.48-7.54 (d, 2H), 7.66-7.71 (d, 2H).
Aufgelöste Signale des Nebenrotamers erscheinen bei δ 0.95 (m), 1.43 (m), 2.24 (m), 2.84 (d), 3.96 (m), 4.03 (m), 7.57 (bd), 7.78 (bd).
¹³C-NMR (125 MHz, CD&sub3;OD): Amidin- und Carbonylkohlenstoffatome: δ 168.0, 173.0, 176.3 und 179.0.

Herstellung der Formulierungen

Formulierung A: HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab (Base) 1,1 mg/10 ml Saccharosemonostearat (S-1570) 1,1 mg/10 ml Phosphatpuffer (KH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;) 0,1 M pH 7,4 ad 10 ml
Formulierung B: HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab (Base) 1,1 mg/10 ml Saccharosemonopalmitat (P-1570) 1,1 mg/10 ml Phosphatpuffer (KH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;) 0,1 M pH 7,4 ad 10 ml
Die Formulierungen A und B wurden in Rattencolonsegmenten, die in Ussing-Kammern (beschrieben von Artursson et al., Pharm. Research, Band 10, Nr. 8, S. 1123-29 (1993)) befestigt waren, getestet. Nach verschiedenen Zeitintervallen wurden auf beiden Seiten der Membranen Proben der Lösung gezogen und auf ihre Konzentration an HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab analysiert. Die Fähigkeit zur Durchquerung der Darmmembran wurde als Indikation der Permeabilität getestet. Der Permeabilitätskoeffizient wurde unter Verwendung der Rate dQ/dt des Erscheinens der Verbindung auf der Serosa-Seite der Segmente mit der Oberfläche A im stationären Zustand und der Anfangskonzentration auf der Mukosa-Seite Co nach der Gleichung Papp = dQ/dt*1/AC&sub0; berechnet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. In der Figur gibt N die Zahl der verwendeten Ratten an. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Permeabilität des Thrombin-Inhibitors HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab zur Durchquerung der Darmmembran unter Eintritt in den Blutkreislauf im Vergleich zur Kontrolle für beide Saccharoseester, nämlich das Monostearat und das Monopalmitat, um den Faktor 2 bis 3 zunimmt. Die Ergebnisse untermauern somit die Schlußfolgerung, daß die Gegenwart derartiger Resorptionsverbesserer die Bioverfügbarkeit des therapeutischen Wirkstoffs verbessert.

ABKÜRZUNGEN

Aze = (S)-Azetidin-2-carbonsäure
Cgl = (S)-Cyclohexylglycin
Pab = 1-Amidino-4-aminomethylbenzol

Claims

1. Pharmazeutische Formulierung, enthaltend die therapeutisch aktive Verbindung HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab als solche oder ein Stereoisomer davon oder ein physiologisch unbedenkliches Salz davon und einen oder mehrere Resorptionsverbesserer sowie gegebenenfalls einen pharmazeutischen Träger.

2. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Tensid handelt.

3. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, bei der es sich bei dem Tensid um ein Alkylglycosid wie Zuckerglycosid handelt.

4. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, bei der es sich bei dem Tensid um einen Zuckerfettsäureester handelt.

5. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 4, bei der es sich bei dem Zuckerfettsäureester um Saccharosemonostearat oder Saccharosemonopalmitat handelt.

6. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um einen nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneistoff oder ein Derivat davon handelt.

7. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Gallensalz handelt.

8. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Lipid handelt.

9. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um eine Seife, eine Fettsäure oder ein Fettsäurederivat von Carnitin oder ein Peptid handelt.

10. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Öl handelt.

11. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Enamin handelt.

12. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um einen Chelatbildner handelt.

13. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Phenothiazin handelt.

14. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Produkt von Maillard-Reaktionen handelt.

15. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um ein Polymer handelt.

16. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um Azon, Concanavalin A, Phosphat- oder Phosphonatderivat, Diethylmaleat oder Diethylethoxymethylenmalonat handelt.

17. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um eine Kombination von Lipiden, einem Lipid und einem Phospholipid, einem Lipid und einem Gallensalz, einem Lipid und einem Öl, einem Lipid und einem Tensid oder einem Lipid und einem Polymer handelt.

18. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem Resorptionsverbesserer um eine Kombination von Tensiden und Ölen handelt.

19. Pharmazeutische Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die aktive Verbindung HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab in Form der freien Base vorliegt.

20. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einer Lösung der Verbindung HOOC-CH&sub2;-(R)Cgl-Aze-Pab einen Resorptionsverbesserer zusetzt, den pH-Wert mit einer Puffersubstanz auf einen therapeutisch unbedenklichen pH-Wert einstellt und alle Bestandteile vermischt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem man den Resorptionsverbesserer unter einem Tensid, einem Alkylglycosid, einem Zuckerfettsäureester, einem Gallensalz, einem Lipid, einer Seife, einer Fettsäure oder einem Fettsäurederivat von Carnitin, einem Peptid, einem nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneistoff, einem Ol, einem Enamin, einem Chelatbildner, einem Phenothiazin, einem Polymer, einem Produkt von Maillard-Reaktionen, einem Azon, Concanavalin A, Phosphat- oder Phosphonatderivaten, Diethylmaleat, Diethylethoxymethylenmalonat oder einer Kombination davon auswählt.

22. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem man den Resorptionsverbesserer unter Saccharosemonostearat und Saccharosemonopalmitat auswählt.