DE69523915T2

DE69523915T2 - Synthetische leaderpeptid-sequenz

Info

Publication number: DE69523915T2
Application number: DE69523915T
Authority: DE
Inventors: Thomas Boerglum Kjeldsen; Knud Vad
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2002-08-22
Anticipated expiration: 2015-06-17
Also published as: BR9508033A; CN1115413C; FI965005L; NO965362L; HUT76378A; DE69523915D1; ES2168367T3; JP3676369B2; EP0763117B1; US5795746A; CN1154143A; MX9606492A; JPH10501413A; KR100251054B1; PL317722A1; UA40648C2; CZ290069B6; CZ364196A3; EP0763117A1; HU9603477D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft synthetische Leaderpeptid-Sequenzen zum Sezernieren von Polypeptiden in Hefe.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Hefe-Organismen produzieren eine Anzahl von Proteinen, die intrazellulär synthetisiert werden, die aber eine Funktion außerhalb der Zelle haben. Solche extrazellulären Proteine werden als sezernierte Proteine bezeichnet. Diese sezernierten Proteine werden zu Beginn innerhalb der Zelle in einer Vorläufer- oder Präproteinform exprimiert, die eine Präsequenz enthält, die das effektive Dirigieren des exprimierten Produkts durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) hindurch sicherstellt. Die Präsequenz, die normalerweise als Signalpeptid bezeichnet wird, wird im allgemeinen von dem gewünschten Produkt während der Translokation abgespalten. Wurde einmal der Weg zur Sekretion eingeschlagen, wird das Protein zu dem Golgi-Apparat transportiert. Von dem Golgi aus kann das Protein verschiedenen Routen folgen, die zu Kompartimenten, wie der Zellvakuole oder der Zellmembran, führen oder es kann aus der Zelle hinaus geschleust werden, um in das äußere Medium sezerniert zu werden (Pfeffer, S. R., und Rothman, J. E. Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 829-852).
Es sind verschiedene Strategien für die Expression und Sekretion von zu Hefe heterologen Proteinen in Hefe vorgeschlagen worden. Die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 88 632 beschreibt ein Verfahren, durch welche zu Hefe heterologe Proteine exprimiert, prozessiert und sezerniert werden, indem ein Hefeorganismus mit einem Expressionsvehikel, das DNA beherbergt, das das gewünschte Protein und ein Signalpeptid codiert, transformiert wird, eine Kultur des transformierten Organismus hergestellt wird, die Kultur gezüchtet wird und das Protein aus dem Kulturmedium gewonnen wird. Das Signalpeptid kann das Signalpeptid des gewünschten Proteins selbst, ein heterologes Signalpeptid oder ein Hybrid aus einem nativen und einem heterologen Signalpeptid sein.
Ein Problem, auf das man bei der Verwendung von Signalpeptiden, die zu Hefe heterolog sind, stößt, könnte sein, dass das heterologe Signalpeptid keine effiziente Translokation und/oder Spaltung nach dem Signalpeptid sicherstellt.
Der Mfα1 (α-Faktor) aus Saccharomyces cerevisiae wird als eine Präproform von 165 Aminosäuren synthetisiert, die ein Signal- oder Präpeptid von 19 Aminosäuren gefolgt von einer "Leadersequenz" oder einem Propeptid von 64 Aminosäuren, das drei N- verknüpfte Glykosylierungsstellen gefolgt von (LysArg- ((Asp/Glu)Ala)&sub2;&submin;&sub3;α-Faktor)&sub4; enthält, umfasst (Kurjan, J., und Herskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943). Der Signal-Leader- Teil von Präpro-Mfα1 ist umfassend eingesetzt worden, um eine Synthese und Sekretion von heterologen Proteinen in S. cerevisiae zu erhalten.
Eine Verwendung von zu Hefe homologen Signal/Leader-Peptiden ist unter anderem aus der U.S.-Patentschrift Nr. 4,546,082, den veröffentlichten Europäischen Patentanmeldungen Nr. 116 201, 123 294, 123 544, 163 529 und 123 289 und der dänischen Patentanmeldung Nr. 3614/83 bekannt.
In EP 123 289 ist die Verwendung des S. cerevisiae-a-Faktor- Vorläufers beschrieben, wohingegen WO 84/01153 die Verwendung des S. cerevisiae-Invertase-Signalpeptids und DK 3614/83 eine Verwendung des S. cerevisiae-PH05-Signalpeptids für die Sekretion von fremden Proteinen angibt.
Die U.S.-Patentschrift Nr. 4,546,082, EP 16 201, 123 294, 123 544 und 163 529 beschreiben Verfahren, durch welche die α- Faktor-Signal-Leadersequenz aus S. cerevisiae (Mfα1 oder Mfα2) in dem Sekretionsverfahren von exprimierten heterologen Proteinen in Hefe verwendet wird. Durch Fusionieren einer DNA- Sequenz, die die S. cerevisiae-Mfα1-Signal/Leader-Sequenz codiert, an das 5'-Ende des Gens für das gewünschte Protein, wurde eine Sekretion und Prozessierung des gewünschten Proteins gezeigt.
EP 206 783 offenbart ein System für die Sekretion von Polypeptiden aus S. cerevisiae unter Verwendung einer α-Faktor- Leadersequenz, die verkürzt worden ist, um die vier α-Faktor- Einheiten, die auf der nativen Leadersequenz vorhanden sind, zu eliminieren, wodurch das Leaderpeptid selbst fusioniert an ein heterologes Polypeptid über die α-Faktor-Prozessierungsstelle LysArgGluAlaGluAla übrigbleibt. Es wird angegeben, dass dieses Konstrukt zu einer effizienten Prozessierung kleinerer Peptide (weniger als 50 Aminosäuren) führt. Für die Sekretion und Prozessierung von größeren Polypeptiden ist die native α- Faktor-Leadersequenz so verkürzt worden, dass eine oder zwei der α-Faktor-Einheiten zwischen dem Leaderpeptid und dem Polypeptid übrigbleiben.
Eine Anzahl von sezernierten Proteinen wird so dirigiert, dass sie einem proteolytischen Prozessierungssystem, das die Peptidbindung an dem Carboxylende von zwei aufeinanderfolgenden basischen Aminosäuren spalten kann, ausgesetzt werden. Diese enzymatische Aktivität wird in S. cerevisiae durch das KEX 2- Gen codiert (Julius, D. A., et al., Cell 37 (1984b) 1075). Die Prozessierung des Produkts durch die KEX 2-Protease wird für die Sekretion von aktivem S. cerevisiae-Paarungsfaktor 1 ("mating"-Faktor 1) (MFα1 oder α-Faktor) benötigt, wohingegen KEX 2 an der Sekretion von aktivem S. cerevisiae-Paarungsfaktor a ("mating"-Faktor a) nicht beteiligt ist.
Sekretion und korrekte Prozessierung eines Polypeptids, das sezerniert werden soll, wird in einigen Fällen erhalten, wenn ein Hefeorganismus, der mit einem wie in den oben aufgeführten Referenzen angegeben konstruierten Vektor transformiert ist, gezüchtet wird. In vielen Fällen ist jedoch das Sekretionsausmaß sehr gering oder es gibt keine Sekretion oder die proteolytische Prozessierung ist möglicherweise nicht korrekt oder unvollständig. Es ist dementsprechend der Gegenstand der Erfindung, Leaderpeptide bereitzustellen, die eine effizientere Expression und/oder Prozessierung von Polypeptiden sicherstellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Überraschenderweise wurde ein neuer Typ von Leaderpeptid gefunden, der die Sekretion eines Polypeptids in Hefe in hoher Ausbeute erlaubt.
Dementsprechend betrifft die Erfindung eine DNA-Expressionskassette, die die folgende Sequenz umfasst:
5'-P-SP-LS-PS-*Gen*-(T)i-3',
worin
P eine Promotorsequenz ist,
SP eine ein Signalpeptid codierende DNA-Sequenz ist,
LS eine DNA-Sequenz ist, die ein Leaderpeptid mit der allgemeinen Formel I codiert:
GlnProIle(Asp/Glu)(Asp/Glu)X¹(Glu/Asp)X²AsnZ(Thr/Ser)X³ (I),
worin
X¹ eine Peptidbindung oder eine codierbare Aminosäure ist;
X² eine Peptidbindung, eine codierbare Aminosäure oder eine Sequenz von bis zu 4 codierbaren Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, ist;
Z eine codierbare Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist; und
X³ eine Sequenz von 4 bis 30 codierbaren Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, ist;
PS eine eine Prozessierungsstelle codierende DNA-Sequenz ist;
*Gen* eine ein Polypeptid codierende DNA-Sequenz ist;
T eine Terminatorsequenz ist; und
i 0 oder 1 ist.
In dem vorliegenden Kontext versteht sich der Ausdruck "Leaderpeptid" so, dass er ein Peptid bezeichnet, dessen Funktion darin besteht, es dem exprimierten Polypeptid zu erlauben, aus dem endoplasmatischen Retikulum zu dem Golgi-Apparat und weiter zu einem sekretorischen Vesikel für eine Sekretion in das Medium (d. h. ein Ausschleusen des exprimierten Polypeptids durch die Zellwand hindurch oder zumindest durch die Zellmembran hindurch in den periplasmatischen Raum der Zelle hinein) dirigiert zu werden. Der Begriff "synthetisch", der in Verbindung mit Leaderpeptiden verwendet wird, soll angeben, dass das Leaderpeptid in der Natur nicht gefunden wird.
Der Begriff "Signalpeptid" soll eine Präsequenz bedeuten, die von überwiegend hydrophober Natur ist und als eine N-terminale Sequenz der Vorläuferform eines in Hefe exprimierten extrazellulären Proteins vorhanden ist. Die Funktion des Signalpeptids besteht darin, es dem zu sezernierenden exprimierten Protein zu ermöglichen, in das endoplasmatische Retikulum einzutreten. Das Signalpeptid wird normalerweise im Verlauf dieses Prozesses abgespalten. Das Signalpeptid kann zu dem Hefeorganismus, der das Protein produziert, heterolog oder homolog sein.
Der Ausdruck "Polypeptid" soll ein heterologes Polypeptid, d. h. ein Polypeptid, das von dem Hefe-Wirtsorganismus in der Natur nicht produziert wird, wie auch ein homologes Polypeptid, d. h. ein Polypeptid, das von dem Hefe-Wirtsorganismus in der Natur produziert wird, und eine jegliche Präform davon bezeichnen. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die Expressionskassette der Erfindung ein heterologes Polypeptid.
Der Ausdruck "eine codierbare Aminosäure" soll eine Aminosäure bezeichnen, die durch ein Triplett ("Codon") von Nukleotiden codiert werden kann.
Wenn in den in den vorliegenden Unterlagen angegebenen Aminosäuresequenzen die Drei-Buchstaben-Codes von zwei Aminosäuren, die durch einen Schrägstrich getrennt sind, in Klammern angegeben sind, z. B. (Asp/Glu), soll dies angeben, dass die Sequenz entweder die eine oder die andere dieser Aminosäuren an der betreffenden Position aufweist.
Unter einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids in Hefe, wobei das Verfahren umfasst, eine Hefezelle, die in der Lage ist, ein Polypeptid zu exprimieren, und die mit einem Hefe- Expressionsvektor, wie oben beschrieben, der eine Leader- Peptidsequenz der Erfindung umfasst, transformiert ist, in einem geeigneten Medium zu züchten, um eine Expression und Sekretion des Polypeptids zu erhalten, wonach das Polypeptid aus dem Medium gewonnen wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter veranschaulicht, in denen:
Fig. 1 schematisch das Plasmid pAK492 zeigt;
Fig. 2 einen Teil der DNA-Sequenz, die den Signalpeptid/Leader/MI3-Insulin-Vorläufer codiert, zeigt;
Fig. 3 die Konstruktion des Plasmids pAK546 zeigt;
Fig. 4 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 4 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 5 die DNA-Sequenz des S. cerevisiae-Expressionsplasmids pAK546, das das YAP3-Signalpeptid, die Leadersequenz SEQ ID No. 4 und den MI3-Insulinvorläufer codiert, und die codierte Aminosäuresequenz zeigt;
Fig. 6 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 6 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 7 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 8 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 8 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 17 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 9 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 16 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 10 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 19 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 11 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 20 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 12 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 21 und die diese codierende DNA-Sequenz zeigt;
Fig. 13 das DNA-Fragment von pAK527, das als direkte Matrize bei der Konstruktion der SEQ ID Nos. 4 und 6 verwendet wurde, zeigt;
Fig. 14 das DNA-Fragment von pAK531, das als direkte Matrize bei der Konstruktion von SEQ ID No. 8 verwendet wurde, zeigt;
Fig. 15 das DNA-Fragment von pAK555, das als direkte Matrize bei der Konstruktion der SEQ ID Nos. 16 und 17 verwendet wurde, zeigt;
Fig. 16 das DNA-Fragment von pAK559, das als direkte Matrize bei der Konstruktion der SEQ ID Nos. 19 und 20 verwendet wurde, zeigt; und
Fig. 17 das DNA-Fragment von pAK562, das als direkte Matrize bei der Konstruktion von SEQ ID No. 21 verwendet wurde, zeigt;
Fig. 18 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID NO. 27 und die diese codierende DNA-Sequenz SEQ ID No. 66 zeigt;
Fig. 19 die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 70 eines N-terminal verlängerten MI3-Insulinvorläufers und die diese codierende DNA-Sequenz SEQ ID No. 71 zeigt.
Fig. 20 die Aminosäuresequenz der Leadersequenz SEQ ID No. 67 und die diese codierende DNA-Sequenz SEQ ID NO: 69 zeigt;
Fig. 21 das DNA-Fragment SEQ ID No. 72 von pAK614, das als direkte Matrize bei der Konstruktion von SEQ ID No. 27 verwendet wurde, zeigt; und
Fig. 22 das DNA-Fragment SEQ ID No. 73 von pAK625, das als direkte Matrize bei der Konstruktion von SEQ ID No. 67 verwendet wurde, zeigt.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Wenn X¹ in der allgemeinen Formel I eine Aminosäure bezeichnet, ist diese vorzugsweise Ser, Thr oder Ala. Wenn X² in der allgemeinen Formel I eine Aminosäure bezeichnet, ist diese vorzugsweise Ser, Thr oder Ala. Wenn X² in der allgemeinen Formel I eine Abfolge von zwei Aminosäuren bezeichnet, ist diese vorzugsweise SerIle. Wenn X² in der allgemeinen Formel I eine Abfolge drei Aminosäuren bezeichnet, ist diese vorzugsweise SerAlaIle. Wenn X² in der allgemeinen Formel I eine Abfolge von vier Aminosäuren bezeichnet, ist diese vorzugsweise SerPheAla-Thr. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X³ eine Aminosäureabfolge der allgemeinen Formel 11
X&sup4;-X&sup5;-X&sup6; (II)
worin X&sup4; eine Sequenz von 1 bis 21 codierbaren Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, ist, X&sup5; Pro oder eine der Aminosäuresequenzen ValAsnLeu oder LeuAlaAsnValAlaMetAla ist, und X&sup6; eine Sequenz von 1 bis 8 codierbaren Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, ist.
In der allgemeinen Formel II ist X&sup4; vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eines oder mehrere der Motive LeuValAsnLeu, SerValAsnLeu, MetAlaAsp, ThrGluSer, ArgPheAlaThr oder ValAla-MetAla umfasst, oder X&sup4; ist eine Aminosäuresequenz, die die Sequenz AsnSerThr oder AsnThrThr umfasst, oder X&sup4; ist eine Aminosäuresequenz, die die Sequenz
(Ser/Leu)ValAsnLeu,
(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAsp,
(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAsp,
(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSer,
(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerIle oder
(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThr
umfasst, oder X&sup4; ist eine Aminosäuresequenz, die die Sequenz
Asn(Thr/Ser)ThrLeu,
Asn(Thr/Ser)ThrLeuAsnLeu oder
Asn(Thr/Ser)ThrLeuValAsnLeu;
oder eine jegliche Kombination davon umfasst.
In der allgemeinen Formel II ist X&sup5; vorzugsweise Pro oder eine Aminosäuresequenz, die die Sequenz ValAsnLeu, LeuAlaAsnValAla-MetAla, LeuAspValValAsnLeuProGly oder LeuAspValValAsnLeuIle-SerMet umfasst.
Wenn X&sup6; in der allgemeinen Formel 11 eine Aminosäure bezeichnet, ist diese vorzugsweise Ala, Gly, Leu, Thr, Val oder Ser. Wenn X&sup6; in der allgemeinen Formel 11 eine Abfolge von zwei Aminosäuren bezeichnet, sie diese vorzugsweise GlyAla oder SerAla. Wenn X&sup6; in der allgemeinen Formel 11 eine Abfolge von drei Aminosäuren bezeichnet, ist diese vorzugsweise AlaValAla. Wenn X&sup6; in der allgemeinen Formel 11 eine Abfolge von acht Aminosäuren bezeichnet, ist diese vorzugsweise GlyAlaAspSer-LysThrValGlu.
Beispiele von bevorzugten Leaderpeptiden, die durch die DNA- Sequenz LS codiert werden, sind:
SEQ ID No. 1 GlnProIleAspGluAspAsnAspThrSerValAsnLeuProAla
SEQ ID No. 2 GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla
SEQ ID No. 3 GlnProIleAspAspGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;
SEQ ID No. 4 GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProVal;
SEQ ID No. 5 GlnProIleAspAspThrGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla
SEQ ID No. 6 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuPro-Ala;
SEQ ID No. 7 GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuMetAla
SEQ ID No. 8 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuPro-GlyAla;
SEQ ID No. 9 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-Ala;
SEQ ID No. 10 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnValPro-Thr;
SEQ ID Na. 11 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnValPro-Thr;
SEQ ID No. 12 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuPro-Thr;
SEQ ID No. 13 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnValPro-GlyAla;
SEQ ID No. 14 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaProAlaValAla;
SEQ ID No. 15 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AspLeuAlaValGlyLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 16 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla
SEQ ID No. 17 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeu-ProGlyAla;
SEQ ID No. 18 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnLeuPro-GlyAla;
SEQ ID No. 19 GlnproIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLauProLeu;
SEQ ID No. 20 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
SEQ ID No. 21 GlnProIleAspASpThrGluSerAlaIleAsnThrThrLeuValAsn-LeuProGlyAla;
SEQ ID No. 22 GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuVal-AsnLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 23 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu;
SEQ ID No. 24 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 25 GlnProIleAspAspThrGluSerAlaAlaIleAsnThrThrLeuVal-AsnLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 26 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
SEQ ID No. 27 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerArgPheAläThrAsnThrrhrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla;
SEQ ID No. 28 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAsnThrThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla; and
SEQ ID No. 67 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaLysArg.
Besonders bevorzugte Leaderpeptide, die durch die DNA-Sequenz LS codiert werden, sind:
SEQ ID No. 15 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AspLeuAlaValGlyLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 16 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 17 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeu-ProGlyAla;
SEQ ID No. 18 GlnProIleAspAspThrGluSarAsnThrThrLeuValAsnLeuPro-GlyAla;
SEQ ID No. 19 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeur
SEQ ID No. 20 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;
SEQ ID No. 21 GlnProIleAspAspThrGluSerAlaIleAsnThrThrLeuValAsn-LeuProGlyAla;
SEQ ID No. 22 GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThrLeuVal-AsnLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 23 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu;
SEQ ID No. 24 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuProGlyAla
SEQ ID No. 25 GlnProIleAspAspThrGluSerAlaAlaIleAsnThrThrLeuVal-AsnLeuProGlyAla;
SEQ ID No. 26 GlnProIleAspMpThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla; and
SEQ ID No. 28 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAsnThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla.
SEQ ID No. 67 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMet-AlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAlaLysArg.
Die Signalsequenz (SP) kann ein jegliches Signalpeptid codieren, das eine effektive Einschleusung des exprimierten Polypeptids in den Sekretionsmechanismus der Zelle sicherstellt. Das Signalpeptid kann ein natürlich vorkommendes Signalpeptid oder funktionelle Teile davon sein oder es kann ein synthetisches Peptid sein. Es hat sich erwiesen, dass geeignete Signalpeptide das α-Faktor-Signalpeptid, das Signalpeptid der Speicheldrüsen-Amylase aus der Maus, ein modifiziertes Carboxypeptidase-Signalpeptid, das Hefe-BAR1-Signalpeptid oder das Humicola lanuginosa-Lipase-Signalpeptid oder ein Derivat davon ist. Die Speicheldrüsen-Amylase-Signalsequenz aus der Maus wird von Hagenbüchle, O., et al., Nature 289 (1981) 643-646 beschrieben. Die Carboxypeptidase-Signalsequenz wird von Valls, L. A., et al., Cell 48 (1987) 887-897, beschrieben. Das BAR1-Signalpeptid wird in WO 87/02670 offenbart. Das Asparaginsäureprotease 3-Signalpeptid aus der Hefe wird in der dänischen Patentanmeldung Nr. 0828/93 beschrieben.
Die von der DNA-Sequenz PS codierte Hefe-Prozessierungsstelle kann in geeigneter Weise eine beliebige paarweise Kombination von Lys und Arg, wie LysArg, ArgLys, ArgArg oder LysLys, sein, die eine Prozessierung des Polypeptids durch die KEX 2- Protease von Saccharomyces cerevisiae oder die äquivalente Protease in anderen Hefespezies erlaubt (Julius, D. A., et al., Cell 37 (1984) 1075). Wenn die KEX 2-Prozessierung nicht geeignet ist, z. B. wenn diese zu einer Spaltung des Polypeptidprodukts führen würde, z. B. aufgrund der Anwesenheit von zwei aufeinanderfolgenden basischen Aminosäuren innerhalb des gewünschten Produkts, könnte eine Prozessierungsstelle für eine andere Protease gewählt werden, die eine Aminosäurekombination umfasst, die in dem Polypeptidprodukt nicht gefunden wird, z. B. die Prozessierungsstelle für FXa, IleGluGlyArg (siehe Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989).
Das durch das Verfahren der Erfindung produzierte Protein kann ein jegliches Protein sein, das in vorteilhafter Weise in Hefe produziert werden kann. Beispiele von solchen Proteinen sind heterologe Proteine, wie Aprotinin, Gewebefaktor-"Pathway"- Inhibitor oder andere Proteaseinhibitoren, Insulin oder Insulinvorläufer, menschliches Wachstumshormon oder jenes vom Rind, Interleukin, Glucagon, GLP-1, IGF-I, IGF-II, Gewebeplasminogenaktivator, transformierender Wachstumsfaktor α oder β, Plättchenwachstumsfaktor, Enzyme oder ein funktionelles Analog davon. In dem vorliegenden Kontext wird der Begriff "funktionelles Analog" so verstanden, dass er ein Protein mit einer gleichen Funktion wie das native Protein bezeichnet (dies soll so verstanden werden, dass es sich eher auf die Natur als auf das Ausmaß der biologischen Aktivität des nativen Proteins bezieht). Das Protein kann dem nativen Protein strukturell ähnlich sein oder kann von dem nativen Protein durch Hinzufügung von einer oder mehreren Aminosäuren an an einem oder beiden der C- und N-terminalen Enden des nativen Proteins, Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder einer Anzahl von unterschiedlichen Stellen in der nativen Aminosäuresequenz, Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder beiden Enden des nativen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der nativen Aminosäuresequenz abgeleitet sein. Solche Modifizierungen sind für mehrere der oben erwähnten Proteine wohlbekannt. Auch können Vorläufer oder Zwischenstufen für andere Proteine durch das Verfahren der Erfindung hergestellt werden. Ein Beispiel eines solchen Vorläufers ist der MI3-Insulinvorläufer, der die Aminosäuresequenz B(1-29)AlaAlaLysA(1-21) umfasst, worin A(1-21) die A-Kette von menschlichem Insulin und B(1-29) die B-Kette von menschlichem Insulin, in der Thr(B30) fehlt, ist.
Bevorzugte DNA-Konstrukte, die Leadersequenzen codieren, sind wie in den Fig. 4-12 gezeigt oder geeignete Modifizierungen davon. Beispiele von geeigneten Modifizierungen der DNA- Sequenz sind Nukleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz des Proteins führen, sondern die möglicherweise der Codonverwendung des Hefeorganismus, in den das DNA-Konstrukt eingeschleust wird, entsprechen, oder Nukleotidsubstitutionen, die zu einer unterschiedlichen Aminosäuresequenz und dementsprechend möglicherweise einer unterschiedlichen Proteinstruktur führen. Andere Beispiele von möglichen Modifizierungen sind eine Insertion von einem oder mehreren Codons in die Sequenz, eine Hinzufügung von einem oder mehreren Codons an einem Ende der Sequenz und eine Deletion von einem oder mehreren Codons an einem Ende von oder innerhalb der Sequenz.
Der rekombinante Expressionsvektor, der die Expressionskassette
5'-P-SP-LS-PS-*Gen*-(T)i-3',
trägt, worin P, SP, LS, *Gen*, T und i wie oben definiert sind, kann ein jeglicher Vektor sein, der zu einer Replikation in Hefeorganismen in der Lage ist. Der Promotor kann eine jegliche DNA-Sequenz sein, die transkriptionelle Aktivität in Hefe zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine codieren, die entweder homolog oder heterolog zu Hefe sind. Der Promotor wird vorzugsweise von einem Gen, das ein zu Hefe homologes Protein codiert, abgeleitet. Beispiele von geeigneten Promotoren sind die Mfα1-, TPI-, ADH- oder PGK-Promotoren aus Saccharomyces cerevisiae.
Die oben gezeigten Sequenzen sollten vorzugsweise auch funktionell bzw. in funktionsfähiger Weise mit einem geeigneten Terminator, z. B. dem TPI-Terminator (siehe Alber, T., und Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982) 419-434), verknüpft sein.
Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung umfasst ferner eine DNA-Sequenz, die dem Vektor die Replikation in Hefe ermöglicht. Beispiele solcher Sequenzen sind die Hefe-Plasmid 2u-Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsstartpunkt. Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker umfassen, z. B. das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen, wie von Russell, P. R., Gene 40 (1985) 125-130, beschrieben.
Die Methoden, die verwendet werden, um die Sequenz 5'-P-SP-LS- PS-*Gen*-(T)i-3' zu ligieren und diese in geeignete Hefe- Vektoren, die die für die Replikation in Hefe erforderliche Information enthalten, zu insertieren, sind Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt (siehe z. B. Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., a.a.O.). Es versteht sich, dass der Vektor konstruiert werden kann, indem entweder zuerst ein DNA- Konstrukt hergestellt wird, das die vollständige Sequenz 5'-P- SP-LS-PS-*Gen*-(T)i-3' enthält, und nachfolgend dieses Fragment in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert wird, oder indem nacheinander DNA-Fragmente in einen geeigneten Vektor, enthaltend die genetische Information für die einzelnen Elemente (wie die Promotorsequenz, das Signalpeptid, die Leadersequenz GlnProIle(Asp/Glu)(Asp/Glu)X¹(Glu/Asp)X²AsnZ(Thr/Ser)- X³, die Prozessierungsstelle, das Polypeptid, und, sofern vorhanden, die Terminatorsequenz), insertiert werden, gefolgt von einer Ligation.
Der in dem Verfahren der Erfindung verwendete Hefeorganismus kann ein jeglicher geeigneter Hefeorganismus sein, der bei einer Züchtung große Mengen des gewünschten Polypeptids produziert. Beispiele von geeigneten Hefeorganismen können Stämme der Hefe-Spezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces uvarum sein. Die Transformation der Hefezellen kann beispielsweise durch Protoplastenbildung gefolgt von einer Transformation in einer an sich bekannten Weise erfolgen. Das zur Züchtung der Zellen verwendete Medium kann ein jegliches herkömmliches Medium sein, das zum Züchten von Hefeorganismen geeignet ist. Das sezernierte Polypeptid, von dem ein signifikanter Anteil in dem Medium in korrekt prozessierter Form vorhanden sein wird, kann aus dem Medium durch herkömmliche Vorgehensweisen gewonnen werden, einschließlich eines Abtrennens der Hefezellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitieren der proteinhaltigen Komponenten des Überstands oder Filtrats mittels eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von einer Reinigung durch verschiedene chromatographische Prozeduren, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder ähnliches.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen, die nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung, wie sie beansprucht wird, verstanden werden sollen, beschrieben.

BEISPIELE

Plasmide und DNA-Material

Alle Expressionsplasmide sind von dem C-POT-Typ. Solche Plasmide werden in der EP-Patentanmeldung Nr. 171 142 beschrieben und sind dadurch gekennzeichnet, dass sie das Schizosaccharomyces Pombe-Triosephosphatisomerase-Gen (POT) zum Zwecke der Plasmidselektion und -stabilisierung enthalten. Ein Plasmid, das das POT-Gen enthält, ist aus einem hinterlegten E. coli- Stamm (ATCC 39685) erhältlich. Die Plasmide enthalten darüber hinaus den S. cerevisiae-Triosephosphatisomerase-Promotor und -Terminator (PTPI und TTPI). Sie sind identisch mit pMT742 (Egel-Mitani, M., et al., Gene 73 (1988) 113-120) (siehe Fig. 1) mit Ausnahme des Bereichs, der durch die EcoR I-Xba I- Restriktionsstellen definiert wird, der die codierende Region für Signal/Leader/Produkt umfasst.
Die Plasmide pAK527, pAK531, pAK555, pAK559, pAK562, pAK614 und pAK625 wurden als DNA-Matrizen in den PCR-Reaktionen, die bei der in den Beispielen beschriebenen Konstruktion der Leadersequenzen angewandt wurden, verwendet. Die synthetischen DNA-Fragmente, die als direkte Matrize dienten, sind in den Fig. 13-17 gezeigt. Mit Ausnahme der gezeigten DNA-Regionen sind die Plasmide identisch mit dem in Fig. 1 gezeigten pAK492.
Synthetische DNA-Fragmente wurden an einer automatischen DNA- Synthetisiervorrichtung (Applied Biosystems Modell 380A) unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie und kommerziell erhältlichen Reagenzien synthetisiert (Beaucage, S. L., und Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869).
Alle anderen Methoden und Materialien, die verwendet wurden, sind Kenntnisse des allgemeinen Standes der Technik (siehe z. B. Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).

BEISPIEL 1

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 4 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK546).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 4 hat die folgende Aminosäuresequenz: GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProVal.
Es wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:
Die folgenden Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden unter Verwendung des Gene Amp PCR reagent-Kits (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Während der Reaktion waren die PCR- Mischungen mit 100 ul Mineralöl (Sigma Chemical CO, St. Louis MO, USA) überschichtet:

Polymerasekettenreaktion Nr. 1

5 ul Oligonukleotid # 94 (50 umol)
5 ul Oligonukleotid # 333 (50 umol)
10 ul 10X PCR-Puffer
16 ul dNTP-Mischung
0,5 ul Taq-Enzym
0,5 ul pAK527-Plasmid (Fig. 13) als Matrize (0,2 ug DNA)
63 ul Wasser
Insgesamt wurden 12 Cyclen ausgeführt, ein Cyclus bestand aus 1 min 94ºC, 2 min 37ºC, 3 min 72ºC. Die PCR-Mischung wurde dann auf ein 2%-Agarosegel aufgeladen und es wurde eine Elektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken (Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., a.a.O.) ausgeführt. Das resultierende DNA-Fragment wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und unter Verwendung des Gene Clean-Kits (Bio 101 inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert.

Polymerasekettenreaktion Nr. 2

5 ul Oligonukleotid # 312 (50 umol)
5 ul Oligonukleotid # 94 (50 umol)
10 ul 10X PCR-Puffer
16 ul dNTP-Mischung
0,5 ul Taq-Enzym
10 ul gereinigtes DNA-Fragment aus der PCR Nr. 1
53,5 ul Wasser
Insgesamt wurden 12 Cyclen ausgeführt, ein Cyclus bestand aus 1 min 94ºC, 2 min 37ºC, 3 min 72ºC. Das DNA-Fragment aus der Polymerasekettenreaktion Nr. 2 wurde unter Verwendung des Gene Clean-Kits (Bio 101 inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und gereinigt.
Das gereinigte PCR-DNA-Fragment wurde in 10 ul Wasser und Restriktionsendonukleasepuffer gelöst und mit den Restriktions-endonukleasen Asp 718 und Hind III in einem Gesamtvolumen von 15 ul gemäß Standardtechniken (Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., a.a.O.) geschnitten. Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 167 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen und unter Verwendung des Gene Clean- Kits, wie beschrieben, gereinigt. Das S. cerevisiae-Expressionsplasmid pAK492 (in Fig. 1 gezeigt) ist ein Derivat des zuvor beschriebenen Plasmids pMT742, in dem das den Signal/Leader/Insulin-Vorläufer codierende Fragment durch das in Fig. 2 gezeigte EcoR I-Xba I-Fragment ersetzt worden ist. Dieses Fragment ist an einer Applied Biosystems DNA-Synthetisiervorrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert worden. Das Plasmid pAK492 wurde mit den Restriktionsendonukleasen Asp 718 und Xba I geschnitten und das Vektorfragment von 10986 bp wurde isoliert. Das Plasmid pAK492 wurde mit den Restriktionsendonukleasen Hind III und Xba I geschnitten und das DNA-Fragment von 140 bp, das einen Teil des MIB-Insulinvorläufers codierte, wurde isoliert. Die drei DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase unter Standardbedingungen (Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., a.a.O.) zusammen ligiert. Mit der Ligationsmischung wurde dann ein kompetenter E. coli-Stamm (R-, M+) transformiert und Transformanten wurden durch Ampicillinresistenz identifiziert. Aus den resultierenden E. coli-Kolonien wurden unter Verwendung der Standard-DNA-Miniprep-Technik (Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., a.a.0.) Plasmide isoliert, mit den passenden Restriktionsendonukleasen, d. h. EcoR I, Xba I, Nco I und Hind III, überprüft. Es wurde durch DNA-Sequenzierungsanalyse (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.) unter Verwendung des Primers # 94 gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK546, eine DNA- Sequenz enthielt, die die Leadersequenz SEQ ID No. 4 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, die die Leadersequenz SEQ ID No. 4 codiert, siehe Fig. 4). Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK546 transformiert, wie in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 214 826 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK546 benannt. Die DNA- Sequenz des Protein-codierenden Bereichs des Expressionsplasmids ist in Fig. 5 angegeben.

BEISPIEL 2

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 6 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK531).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 6 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProAla
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 331 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde.
Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 168 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA- Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert. Es wurde durch DNA- Sequenzierungs-analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK531, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 6 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, die die Leadersequenz SEQ ID No. 6 codiert, siehe Fig. 6. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK531 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK531 benannt. Die das Signalpeptid und den Insulinvorläufer MI3 codierenden DNA-Sequenzen waren die gleichen wie jene, die in Fig. 5 gezeigt sind.

BEISPIEL 3

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 8 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK547).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 8 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuProGlyAla
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
# 345 5'-AACGAATCTCTTAGCACCTGGCAAGTTGACAGAAGT-3' SEQ ID No. 34
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 345 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK531 (Fig. 14) als Matrize verwendet wurde.
Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 171 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA- Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert. Es wurde durch DNA- Sequenzierungs-analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK547, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 8 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, die die Leadersequenz SEQ ID No. 8 codiert, siehe Fig. 7. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK547 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK547 benannt. Die das Signalpeptid und den Insulinvorläufer MI3 codierenden DNA-Sequenzen waren die gleichen wie jene, die in Fig. 5 gezeigt sind.

BEISPIEL 4

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 17 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK561)

Die Leadersequenz SEQ ID No. 17 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerOleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 376 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK555 (Fig. 15) als Matrize verwendet wurde.
Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 180 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA- Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert. Es wurde durch DNA- Sequenzierungs-analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK561, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 17 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, die die Leadersequenz SEQ ID No. 17 codiert, siehe Fig. 8. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK561 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK561 benannt. Die das Signalpeptid und den Insulinvorläufer MI3 codierenden DNA-Sequenzen waren die gleichen wie jene, die in Fig. 5 gezeigt sind.

BEISPIEL 5

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 16 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK559).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 16 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 375 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK555 (Fig. 15) als Matrize verwendet wurde.
Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 222 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA- Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert. Es wurde durch DNA- Sequenzierungs-analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK559, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 16 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, die die Leadersequenz SEQ ID No. 16 codiert, siehe Fig. 9. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK559 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK559 benannt. Die das Signalpeptid und den Insulinvorläufer MI3 codierenden DNA-Sequenzen waren die gleichen wie jene, die in Fig. 5 gezeigt sind.

BEISPIEL 6

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 19 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK580).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 19 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 384 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK559 (Fig. 16) als Matrize verwendet wurde.
Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 228 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA- Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert. Es wurde durch DNA- Sequenzierungs-nalyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK580, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 19 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, die die Leadersequenz SEQ ID No. 19 codiert, siehe Fig. 10. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK580 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK580 benannt. Die das Signalpeptid und den Insulinvorläufer MI3 codierenden DNA-Sequenzen waren die gleichen wie jene, die in Fig. 5 gezeigt sind.

BEISPIEL 7

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 20 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK583).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 20 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 390 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK559 (Fig. 16) als Matrize verwendet wurde.
Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 231 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA- Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert. Es wurde durch DNA- Sequenzierungs-analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK583, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 20 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, die die Leadersequenz SEQ ID No. 20 codiert, siehe Fig. 11. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK583 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK583 benannt. Die das Signalpeptid und den Insulinvorläufer MI3 codierenden DNA-Sequenzen waren die gleichen wie jene, die in Fig. 5 gezeigt sind.

BEISPIEL 8

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 21 für eine Expression des MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK586).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 21 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAlaIleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
Die Polymerasekettenreaktion wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 401 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK562 (Fig. 17) als Matrize verwendet wurde.
Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 183 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA- Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert. Es wurde durch DNA- Sequenzierungs-analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK586, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 21, siehe Fig. 12, codiert. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK586 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK586 benannt. Die das Signalpeptid und den Insulinvorläufer MI3 codierenden DNA-Sequenzen waren die gleichen wie jene, die in Fig. 5 gezeigt sind.

BEISPIEL 9

Expression des MI3-Insulinvorläufers unter Verwendung von ausgewählten Leadersequenzen gemäß der Erfindung

Hefestämme, die Plasmide, wie oben beschrieben, beherbergten, wurden in YPD-Medium (Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981) gezüchtet. Für jeden Stamm wurden 6 individuelle 5 ml-Kulturen bei 30ºC 72 h geschüttelt mit einer endgültigen OD&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 15. Nach Zentrifugation wurde der Überstand für eine HPLC- Analyse entfernt, durch welche Methode die Konzentration des sezernierten Insulinvorläufers durch eine von Snel, L., et al., Chromatographia 24 (1987) 329-332, beschriebene Methode gemessen wurde.
In Tabelle 1 sind die Expressionsausmaße des Insulinvorläufers, MI3, die durch Verwendung von ausgewählten Leadersequenzen gemäß der Erfindung erhalten wurden, als Prozentsatz des Ausmaßes, das mit Transformanten von pMT742 unter Einsatz der MFα(1)-Leadersequenz von S. cerevisiae erhalten wurde, angegeben.

Tabelle 1

Leadersequenz Expressionsausmaß, %

MT748 α-Leadersequenz 100
SEQ ID No. 15 87
SEQ ID No. 16 215
SEQ ID No. 17 157
SEQ ID No. 19 166
SEQ ID No. 20 86
SEQ ID No. 21 145
SEQ ID No. 22 137
SEQ ID No. 23 121

BEISPIEL 10

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 27 für eine Expression des verlängerten MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (Stamm yAK677).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 27 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla
Es wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:
Die Polymerasekettenreaktionen wurden ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 440 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK614 als Matrize verwendet wurde. Für die zweite Polymerasekettenreaktion wurde Oligonukleotid # 441 anstelle von Oligonukleotid # 312 verwendet.
Das gereinigte PCR-DNA-Fragment wurde isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen Asp 718 und Hind III verdaut, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von 268 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Asp 718/Hind III-DNA-Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid, wie in Beispiel 1 beschrieben, subkloniert mit der Ausnahme, dass das 140 bp-Hind III/Xba I-DNA-Fragment von pAK602 abgeleitet war und menschliches AspB28-Insulin codierte.
Es wurde durch DNA-Sequenzierungsanalyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid, pAK616, eine DNA-Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 27 codiert. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, SEQ ID No. 66, die die Leadersequenz SEQ ID No. 27 codiert, siehe Fig. 18. Das 268 bp-Asp 718/Hind III-DNA-Fragment von pAK616 wurde isoliert und mit dem 10986 bp-Asp 718/Xba I-DNA-Fragment von pAK601 und dem 140 bp-DNA-Fragment Hind III/XbaI von pAK464 (das eine verlängerte Version von menschlichem AspB28 Insulin codiert) ligiert und pAK 625 benannt. Das 180 bp-Asp 718/Nco I-DNA-Fragment von pAK625 wurde isoliert und mit dem 221 bp-Nco I/Xba I-DNA-Fragment von pJB146 (das eine verlängerte Version des Insulinvorläufers codiert) und dem 10824 bp-Asp 718/Xba I-DNA-Fragment von pAK601 ligiert und das resultierende Plasmid wurde pAK677 benannt. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK677 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK677 benannt. Mit Ausnahme der die Leadersequenz codierenden DNA-Sequenz ist die DNA-Sequenz, die das Signalpeptid codiert, wie in Fig. 5 beschrieben. Die DNA-Sequenz, die den verlängerten MI3-Insulinvorläufer codiert, ist, wie in Fig. 19 beschrieben.

BEISPIEL 11

Synthese der Leadersequenz SEQ ID No. 67 für eine Expression des verlängerten MI3-Insulinvorläufers in S. cerevisiae (yAK680).

Die Leadersequenz SEQ ID No. 67 hat die folgende Aminosäuresequenz:
GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsn- LeuIleSerMet- Ala
Es wurde das folgende Oligonukleotid synthetisiert:
Die PCR wurde ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Oligonukleotid # 577 anstelle von Oligonukleotid # 333 verwendet wurde und das Plasmid pAK625 als Matrize verwendet wurde und die zweite PCR nicht ausgeführt wurde. Das PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen Asp 718 und NcoI verdaut, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das Asp 718/Nco I-DNA-Fragment von 190 bp wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das 10824 bp-Asp 718/Xba I-Vektor-DNA-Fragment aus und aus pAK601 isoliert wurde. Das 190 bp-Asp 718/Nco I-DNA-Fragment wurde in das S. cerevisiae-Expressionsplasmid subkloniert, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das 221 bp-DNA- Fragment Nco I/Xba I (das eine verlängerte Version des MI3- Insulinvorläufers codiert) aus pAK677 isoliert wurde und anstelle des Hind III/Xba I-DNA-Fragments verwendet wurde. Es wurde durch DNA-Sequenzierungsanalyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezeigt, dass das ausgewählte Plasmid die DNA- Sequenz enthält, die die Leadersequenz SEQ ID No. 67 codiert, und das ausgewählte Plasmid wurde pAK680 benannt. Hinsichtlich der DNA-Sequenz, SEQ ID No. 69, die die Leadersequenz SEQ ID No. 67 codiert, siehe Fig. 20. Der S. cerevisiae-Stamm MT663 wurde mit dem Plasmid pAK680 transformiert, wie in der Europäischen Patentanmeldung 86306721.1 beschrieben, und der resultierende Stamm wurde yAK680 benannt. Mit Ausnahme der die Leadersequenz codierenden DNA-Sequenz ist die DNA-Sequenz, die das Signalpeptid codiert, wie in Fig. 5 beschrieben und die verängerte MI3-Insulinvorläufer-DNA-Sequenz ist, wie in Fig. 19 beschrieben.

BEISPIEL 12

Expression von N-terminal verlängerten MI3-Insulinvorläufern unter Verwendung der Leadersequenzen SEQ ID No. 27 und SEQ ID No. 67 gemäß der Erfindung.

Hefestämme, die die Plasmide, wie oben beschrieben, beherbergten, wurden in YPD-Medium (Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981) gezüchtet. Für jeden Stamm wurden 6 individuelle 5 ml-Kulturen bei 30ºC 72 h geschüttelt mit einer endgültigen OD&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 15. Nach Zentrifugation wurde der Überstand für eine HPLC-Analyse entfernt, durch welche Methode die Konzentration des sezernierten Insulinvorläufers durch eine von Snel, L., et al., Chromatographia 24 (1987) 329-332, beschriebene Methode gemessen wurde.
In Tabelle 2 sind die Expressionsausmaße von einigen N-terminal verlängerten MI3-Insulinvorläufern, die durch Verwendung der Leadersequenzen SEQ ID No. 27 und SEQ ID No. 67 gemäß der Erfindung erhalten wurden, als Prozentsatz des Ausmaßes, das mit Transformanten von pMT742 unter Einsatz der MFα(1)- Leadersequenz von S. cerevisiae erhalten wurde, angegeben. Tabelle 2

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Novo Nordisk A/S
(B) STRASSE: Novo Allé
(C) STADT: DK-2880 Bagsværd
(E) LAND: Dänemark
(G) TELEFON: +45 44448888
(H) TELEFAX: +45 44490555
(I) TELEX: 37173
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: SYNTHETISCHE LEADERPEPTIDSEQUENZEN
(iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 73
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Novo Nordisk A/S Corporate Patents
(B) STRASSE: Novo Allé
(C) STADT: DK-2880 Bagsvaerd
(E) LAND: Dänemark
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DK 0705/94 und US 08/282,852
(B) EINREICHUNGSDATUM: 16. Juni 1994 und 29. Juli 1994
(viii)ANGABEN ZUM ANWALT/AGENTEN:
(A) NAME: Jørgensen, Dan et al.
(C) REFERENZ/AKTENNUMMER: 4085-WO, DJ
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: +45 44448888
(B) TELEFAX: +45 44493256
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO: 25:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
TAAATCTATA ACTACAAAAA ACACATA 27
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
GACTCTCTTA ACTGGCAAGT TGACA 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 56 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
AAGTACAAAG CTTCAACCAA GTGAGMCCA CACAAGTGTT GGTTAACGAA TCTCTT 56
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
CATACACAAT ATAAACGACG G 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
GAATCTCTTA GCTGGCAAGT TGACAGAAGT AGTGTTAGTT TCAGAGTCGT CAATT 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
AACGAATGTC TTAGCACCTG GCAAGTTGAC AGAAGT 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
AACGAATCTC TTAGCACCTG GCAAGTTGAC CAAAGTAGTG TTGATAGATT CAGTGTCGTC 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO: 36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
AACGAATCTC TTAGCCATGG CAACGTTAGC CAAGTTAACC AAAGT 45
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 372 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 82...351 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 89 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(A) LAGE: 1...45 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 297 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1...276 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 91 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1...51 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 54 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE 1..54 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 57 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1..57 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 99 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1..99 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 105 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1..105 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 108 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1..108 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 1..60 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 276 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 113..274 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 54 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 282 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 113..280 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 56 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 282 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 113..280 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 56 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 330 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 113..328 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 72 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 288 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (codierende Sequenz)
(B) LAGE: 113..286 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 63:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 63:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 64:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 82 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 64:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 65:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 54 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 65:
CAAGTACAAA GCTTGAACCA AGTGGGAACC GCACAAGTGT TGGTTAACGA ACTT 54
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 66:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 117 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 66:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 67:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 41 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 67:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 68:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 51 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 68:
TCTCTTAGCC ATGGAGATCA AGTTAACAAC ATCCAAAGCC AAAGTAGTGT T 51
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 69:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 123 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 69:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 70:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 65 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 70:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 71:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 219 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(v) ART DES FRAGMENTS: intern (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 71:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 72:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 348 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 72:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 73:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 379 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 73:

Claims

1. DNA-Expressionskassette, die die folgende Sequenz umfasst:

5'-P-SP-LS-PS-*Gen*-(T)i-3',

worin

P eine Promotorsequenz ist,

SP eine ein Signalpeptid codierende DNA-Sequenz ist,

LS eine DNA-Sequenz ist, die ein Leaderpeptid mit der allgemeinen Formel I:

GlnProIle(Asp/Glu)(Asp/Glu)X¹(Glu/Asp)X²AsnZ(Thr/Ser)X³ (I),

codiert, worin

X¹ eine Peptidbindung oder eine codierbare Aminosäure ist;

X² eine Peptidbindung, eine codierbare Aminosäure oder eine Sequenz von bis zu 4 codierbaren Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, ist;

Z eine codierbare Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist; und

X³ eine Sequenz von 4 bis 30 codierbaren Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, ist;

PS eine eine Prozessierungsstelle codierende DNA-Sequenz ist;

*Gen* eine ein Polypeptid codierende DNA-Sequenz ist;

T eine Terminatorsequenz ist; und

i 0 oder 1 ist.

2. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei X¹ in der allgemeinen Formel I Ser, Thr oder Ala ist.

3. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei X² in der allgemeinen Formel I Ser, Thr oder Ala ist.

4. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei X² in der allgemeinen Formel I SerIle ist.

5. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei X² in der allgemeinen Formel I SerAlaIle ist.

6. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei X² in der allgemeinen Formel I SerPheAlaThr ist.

7. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei X³ in der allgemeinen Formel I eine Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel II

X&sup4;-X&sup5;-X&sup6; (II),

ist, worin X&sup4; eine Sequenz von 1 bis 21 codierbaren Aminosäuren ist;

X&sup5; Pro oder eine Aminosäuresequenz ist, die die Aminosäuresequenz ValAsnLeu, LeuAlaAsnValAlaMetAla, LeuAspValValAsnLeuProGly oder LeuAspValValAsnLeulleSerMet umfasst;

und X&sup6; eine Sequenz von 1 bis 8 codierbaren Aminosäuren ist.

8. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup4; in der allgemeinen Formel II eine Aminosäuresequenz ist, die eines oder mehrere der Motive LeuValAsnLeu, SerValAsnLeu, MetAlaAsp, ThrGluSer, ArgPheAlaThr und ValAlaMetAla umfasst.

9. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup4; in der allgemeinen Formel II eine Aminosäuresequenz ist, die die Sequenz AsnSerThr oder AsnThrThr umfasst.

10. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup4; in der allgemeinen Formel II eine Aminosäuresequenz ist, die die Sequenz

(Ser/Leu)ValAsnLeu,

(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAsp,

(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAsp,

(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSer,

(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerIle oder

(Ser/Leu)ValAsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThr

umfasst.

11. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup4; in der allgemeinen Formel II eine Aminosäuresequenz ist, die die Sequenz

Asn(Thr/Ser)ThrLeu,

Asn(Thr/Ser)ThrLeuAsnLeu oder

Asn(Thr/Ser)ThrLeuValAsnLeu

umfasst.

12. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup5; in der allgemeinen Formel II Pro ist.

13. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup5; in der allgemeinen Formel II die Aminosäuresequenz ValAsnLeu ist.

14. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup5; in der allgemeinen Formel II die Aminosäuresequenz LeuAlaAsnValAla-MetAla ist.

15. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup5; in der allgemeinen Formel II die Aminosäuresequenz LeuAspValValAsn-LeuProGly ist.

16. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup5; in der allgemeinen Formel II die Aminosäuresequenz LeuAspValValAsn-Leu- IleSerMet ist.

17. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup6; in der allgemeinen Formel II Ala, Gly, Leu, Thr, Val oder Ser ist.

18. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup6; in der allgemeinen Formel II GlyAla oder SerAla ist.

19. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup6; in der allgemeinen Formel II AlaValAla ist.

20. Expressionskassette nach Anspruch 7, wobei X&sup6; in der allgemeinen Formel II GlyAlaAspSerLysThrValGlu ist.

21. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei das durch die DNA-Sequenz LS codierte Leaderpeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend:

SEQ ID No. 1 GlnProIleAspGluAspAsnAspThrservalAsnLeuProAla;

SEQ ID No. 2 GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLeuProAla;

SEQ ID No. 3 GlnProIleAspAspGluSerAsnThrThrSarValAsnLeuPro-Ala;

SEQ ID No. 4 GlnProIleAspAspGluAsnThrThrSerValAsnLauProVal

SEQ ID No. 5 GlnPraIleAspAspThrGluAsnThrThrSerValAsnLeuPro-Ala:

SEQ ID No. 6 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSarValAsnLeu-PrcAla;

SEQ ID No. 7 GlnProIleAspAspGluSerAsnThrThrSerValAnLeuMetAla;

SEQ ID No. 8 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnVal-ProGlyAla

SEQ ID No. 9 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MatAIa:

SEQ ID No 10 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnVal-PraThr

SEQ ID No. 11. GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnVal-PreThr;

SEQ ID No. 12 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-ProThr;

SEQ ID No. 13 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuValAsnVal-ProGlyAla;

SEQ ID No. 14 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAlaProAlaValAla;

SEQ IP No. 15 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAspLeuAlaValGlyLeuProGlyAla;

SEQ ID No. 16 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAlaAspAspThrAlsSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuProGlyAla;

SEQ ID No. 17 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrPhrLeuValAsn-LeuProGlyAla;

SEQ ID No. 19 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrLeuAsnAsnLeu-ProGlyAla;

SEQ ID No. 19 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPhaAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu;

SEQ ID No. 20 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MatAlaAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;

SEQ ID No. 21 GlnProIleAspAspThrGluSerAlaIleAsnThrThrLeuVal-AsnLeuProGlyAla;

SEQ ID No. 22 GlnProIleAspAspThrGluSerPheAlaThrAsnThrThr-LeuValAsnLeuProGlyAla;

SEQ ID No. 23 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLeuValAsn-LeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuProLeu;

SEQ ID No. 24 GlnProIleAspAspThrGluSerIleAsnThrThrLevVal-AsnLeuMetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuProGlyAla

SEQ ID No. 25 GlnProIleAspAspThrGluSerAlaAlaIleAsnThrThrThrLeu-ValAsnLeuProGlyAla;

SEQ ID No. 26 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuValAsnLeuAlaAsnValAlaMetAla;

SEQ ID No. 27 GlnProIleAspASpThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla;

SEQ ID No. 28 GlnProIleASpAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAlaAsnThrThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAspValValAsnLeuIleSerMetAla;

SEQ ID No. 67 GlnProIleAspAspThrGluSerAsnThrThrSerValAsnLeu-MetAlaAspAspThrGluSerArgPheAlaThrAsnThrThrLeuAlaLeuAspValValAsnLeuIleSerMatAlaLysArg.

22. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei SP eine DNA- Sequenz ist, die das α-Faktor-Signalpeptid, das Signalpeptid der Speicheldrüsen-Amylase aus der Maus, das Carboxypeptidase-Signalpeptid, das Hefe-Asparaginsäureprotease 3- Signalpeptid oder das Hefe-BAR1-Signalpeptid codiert.

23. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei PS eine DNA- Sequenz ist, die LysArg, ArgLys, ArgArg, LysLys oder Ile-GluGlyArg codiert.

24. Expressionskassette nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus det Gruppe, bestehend aus Aprotinin, Gewebefaktor-"Pathway"-Inhibitor oder anderen Proteaseinhibitoren, Insulin- oder Insulinvorläufern, Insulin- ähnlichem Wachstumsfaktor I, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor II, Wachstumshormon vom Menschen oder vom Rind, Interleukin, Glucagon, Glucagon-ähnlichem Peptid 1, Gewebeplasminogenaktivator, transformierendem Wachstumsfaktor α oder β, Plättchenwachstumsfaktor, Enzymen oder einem funktionellen Analog davon.

25. Hefe-Expressionsvektor, umfassend eine Expressionskassette nach einem der vorangegangenen Ansprüche.

26. Hefezelle, die in der Lage ist, ein Polypeptid zu exprimieren und die mit einem Hefe-Expressionsvektor nach Anspruch 25 transformiert ist.

27. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids in Hefe, wobei das Verfahren umfasst, eine Hefezelle, die in der Lage ist, das gewünschte Polypeptid zu exprimieren und die mit einem Hefe-Expressionsvektor nach Anspruch 25 transformiert ist, in einem geeigneten Medium zu züchten, um eine Expression und Sekretion des Polypeptids zu erhalten, wonach das Polypeptid aus dem Medium gewonnen wird.