CN105418755A

CN105418755A - 速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法

Info

Publication number: CN105418755A
Application number: CN201511017005.6A
Authority: CN
Inventors: 赖红星; 肖拥军; 马文柱; 罗湘冀; 夏玉平; 祝捷; 陈武光
Original assignee: Zhuhai Jinbaikang Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Zhuhai Jinbaikang Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明提供一种门冬胰岛素前体，其氨基酸序列为：Z₁(XY)_nZ₂Z₃Z₄-B(1-29)-C₁C₂C₃-A(1-21)，其中Z₁、X、Z₂分别为Asp或Glu；Y为Ala或Gly；n为1~10之间的整数；Z₃为Pro、Glu或Asp；Z₄、C₃分别为Lys或Arg；C₁、C₂分别为Glu、Asp、Ala或Gly；B(1-29)为门冬胰岛素B链1-29位氨基酸；并且A(1-21)为门冬胰岛素A链1-21位氨基酸。本发明还提供其编码基因、包含该编码基因的克隆载体或表达载体、转化体，以及利用该速效胰岛素前体蛋白制备速效胰岛素的方法。本发明的产物表达量高的优势、发酵表达产物纯度高、提取方法简单且收率高。

Description

速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种速效胰岛素前体蛋白、其编码基因、包含该编码基因的克隆载体或表达载体、转化体，以及利用该速效胰岛素前体蛋白制备速效胰岛素的方法。

背景技术

根据国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederation，IDF)的最新统计数据显示，2014年全球糖尿病患者人数已经高达3.87亿，按目前的增长速度，预测到2035年全球将有近5.92亿人患糖尿病。令人担忧的是，中国糖尿病患者更是高达9628.8万人，是全球糖尿病患者人数最多的国家。

包括门冬胰岛素、赖脯胰岛素在内的速效胰岛素属于第三代胰岛素，可用于成人I型糖尿病和II型糖尿病的治疗。门冬胰岛素还可用于儿童、青少年和孕妇及哺乳期妇女糖尿病的治疗。门冬胰岛素的问世，为拯救糖尿病患者的生命，提高患者的生活质量，带来了新的曙光。

门冬胰岛素是一种人胰岛素类似物，由A、B两条链组成，与人胰岛素不同的是其B链第28位脯氨酸替换为天门冬氨酸，利用电荷的排斥作用阻止了胰岛素单体的自我聚集，从而迅速吸收，因此起效比人胰岛素更快。因此，门冬胰岛素弥补了人胰岛素的不足，使外源性胰岛素能更好地满足餐时胰岛素需求，包括餐前注射吸收迅速、稳定，达峰时间短，从而更有效地控制餐后高血糖。

目前用重组DNA技术表达胰岛素及胰岛素类似物，主要有三种方法。第一种方法是利用大肠杆菌表达胞内融合蛋白，通过破壁收获包涵体，再经变复性、酶解方式等处理获得胰岛素或胰岛素类似物分子。大肠杆菌有生长迅速，培养成本低等优势，但是其缺点也非常明显：因为大肠杆菌表达的蛋白质大多数以包涵体形式存在，必须经过破壁、包涵体收集与变复性处理才能得到活性分子，但这些处理方法存在能耗大，工艺繁琐，收率不高等诸多缺点。

例如，美国专利US20140221606A1公布了一种肠杆菌制备速效胰岛素的方法，该方案在A链和B链之间添加了一段35个氨基酸残基的C肽，使速效胰岛素前体分子的表达能力提高至3～5g/L。但是该法通过大肠杆菌表达的速效胰岛素前体分子需经过破壁、包涵体的收集与洗涤、包涵体溶解、稀释复性、纯化、蛋白酶解等复杂过程才能获得完整的速效胰岛素分子，再经过一系列层析步骤获得纯品，其制备工艺十分复杂，产品收率不高。

第二种方法是利用酿酒酵母表达胰岛素或胰岛素类似物前体分子，使产物分泌到胞外培养基中，然后经捕获、酶解和转肽等方法制备胰岛素或胰岛素类似物分子。虽然酿酒酵母能够将蛋白质分泌到胞外，但也存在一些缺点：如酿酒酵母容易使表达产物发生高度糖基化，增加了人体发生免疫反应的风险，因此必须在药物纯化过程中增加步骤控制杂质含量。再者，酿酒酵母还存在生长缓慢，发酵密度不高，启动子能力较弱等问题，这些缺点导致产物表达量低。

例如，美国专利US5,618,913公布了诺和诺德公司制备门冬胰岛素的方法。该方法以酿酒酵母为表达宿主，利用重组DNA技术生产得到门冬胰岛素前体，再通过转肽等一系列复杂工艺制备门冬胰岛素。该方法技术壁垒高，特别在宿主菌改造、质粒构建等方面技术难度大、工艺复杂。由于酿酒酵母自身表达能力较弱，因此产物表达量不高，其工程菌摇床培养最高为21.5mg/L，一定程度上增加了药品生产成本。

第三种是利用毕赤酵母表达胰岛素或胰岛素类似物前体分子，表达产物同样分泌到胞外培养基中，经捕获、酶解和转肽等方法制备胰岛素或胰岛素类似物分子。毕赤酵母是一种非常优秀的表达系统，它可以将蛋白质直接分泌到胞外，还有发酵密度高，产量高等优势。

但是，目前使用毕赤酵母表达系统生产胰岛素的方案中仍然面临着表达量不高、产率偏低的挑战，原因涉及编码序列、纯化方法等多方面。因此，仍有必要提供一种能够以更高效率和得率生产胰岛素的系统和方法。

发明内容

本发明一方面提供一种门冬胰岛素前体，其氨基酸序列为Z₁(XY)_nZ₂Z₃Z₄-B(1-29)-C₁C₂C₃-A(1-21)，其中Z₁、X、Z₂分别为Asp或Glu；Y为Ala或Gly；n为1～10之间的整数；Z₃为Pro、Glu或Asp；Z₄、C₃分别为Lys或Arg；C₁、C₂分别为Glu、Asp、Ala或Gly；B(1-29)为门冬胰岛素B链1-29位氨基酸；并且A(1-21)为门冬胰岛素A链1-21位氨基酸。

在一个实施方式中，其中Z₁是Glu。在一个实施方式中，其中X是Glu。在一个实施方式中，其中Y是Ala。在一个实施方式中，其中Z₂是Glu。在一个实施方式中，其中Z₃是Pro。在一个实施方式中，其中C₁是Glu或Asp。在一个实施方式中，其中C₂是Gly或Ala。在一个实施方式中，n为3～10之间的整数，或n为5～10之间的整数，或n为7～10之间的整数。

在一个实施方式中，本发明的门冬胰岛素前体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明另一方面提供一种编码本发明所述的门冬胰岛素前体的核苷酸序列。在本发明的一个实施方式中，该核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。在本发明的一些实施方式中，该核苷酸序列是因密码子简并性或宿主偏好性而与SEQIDNO.1所示序列具有一个或几个核苷酸差异的核苷酸序列。

本发明的另一个方面提供一种含有上述核苷酸序列的克隆载体。在一些实施方式中，所述克隆载体为重组质粒pPIC9K，重组质粒pPICZαA或重组质粒pPinkαHC。

在本发明的一个实施例中，将编码所述的门冬胰岛素前体基因克隆到质粒pPIC9K中。该重组质粒含有一个AOX1基因启动子序列，其后连有一个来自酿酒酵母α-交配因子信号肽序列，其后连有一个门冬胰岛素前体基因序列，其后连有一个转录终止子序列，其后连有一个筛选标记HIS4基因序列，其后连有一个筛选标记卡那霉素抗性基因序列，其后连有一个AOX1基因的3’末端序列。

在本发明的另一个实施例中，将编码所述门冬胰岛素前体基因克隆到质粒pPICZαA中。该重组质粒含有一个AOX1基因启动子序列，其后连有一个来自酿酒酵母α-交配因子信号肽序列，其后连有一个门冬胰岛素前体基因序列，其后连有一个转录终止子序列，其后连有一个筛选标记Zeocin抗性基因序列。

在本发明的另一个实施例中，将编码所述门冬胰岛素前体基因克隆到质粒pPinkα-HC中。该重组质粒含有一个AOX1基因启动子序列，其后连有一个来自酿酒酵母α-交配因子信号肽序列，其后连有一个门冬胰岛素前体基因序列，其后连有一个转录终止子序列，其后连有一个筛选标记ADE2基因序列。

本发明的再一方面提供一种包含本发明所述克隆载体的表达系统。在一些实施方式中，一个所述表达系统含有1-12个拷贝的克隆载体。在一些实施方式中，所述表达系统为毕赤酵母细胞。在一些实施方式中，所述毕赤酵母细胞为毕赤酵母GS115、毕赤酵母X-33或毕赤酵母PichiaPink。

本发明的再一方面提供一种制备门冬胰岛素的方法，该方法包括：(a)培养本发明所述的表达系统；(b)分离、富集得到门冬胰岛素前体；(c)用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶进行转肽，获得门冬胰岛素粗品；以及(d)纯化获得门冬胰岛素。在一些实施方式中，在步骤(a)之前，对本发明所述的表达系统进行筛选，以选择出表达水平最高的表达系统，再培养所筛选出的表达系统。

在一个实施方式中，本发明提供一种制备门冬胰岛素的方法，该方法包括：(a)培养含有本发明编码序列的毕赤酵母细胞，收集含门冬胰岛素前体的发酵上清液；(b)大孔树脂富集门冬胰岛素前体，冷冻干燥获得干粉；(c)用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶进行转肽，获得门冬胰岛素粗品；(d)用DEAE离子交换树脂和C8介质纯化获得门冬胰岛素纯品。

与原研药和其他门冬胰岛素表达技术相比，本发明具有以下优势：

(1)产物表达量高的优势：本发明首次设计了独特的前导肽引导门冬胰岛素的表达，该前导肽是一段亲水性的短肽，可以使表达产物在结构上更加稳定，免受宿主菌蛋白酶的破坏，大大提高门冬胰岛素前体的表达量。本发明还使用了启动能力强的醇氧化酶启动子AOX1，分泌能力强的α-交配因子信号肽以及可高密度发酵培养的毕赤酵母表达宿主，进一步增加了门冬胰岛素前体的表达和分泌能力。使用本发明的表达方法，摇床培养门冬胰岛素前体最高表达可达150mg/L，20L发酵罐高密度培养时最高表达量可达5g/L。

(2)发酵表达产物纯度高，杂质少的优势：传统门冬胰岛素的表达方法，未添加前导肽，存在以下两方面的缺陷：(1)使门冬胰岛素前体B链的第一个氨基酸(Phe)暴露于外部环境中，容易被毕赤酵母的氨肽酶破坏，增加了杂质的含量。(2)当表达量过高时，由于毕赤酵母的KEX2蛋白酶相对不足，从而使部分门冬胰岛素前体的N末端残留了1-9个的α信号肽的氨基酸残基，也增加了杂质的含量。这些杂质与门冬胰岛素的性质十分相似，难以去除。本发明发酵表达产物纯度高，且门冬胰岛素前体的N末端存在前导肽，故不会产生Phe缺失的杂质。另外，即使N末端残留了部分α信号肽的氨基酸残基，也会在制备过程中一并切除。

(3)产物分泌到胞外培养基中，提取方法简单的优势：本发明产物以水溶性存在，且分泌到胞外培养基中，通过过滤或离心方法很容易得到含门冬胰岛素前体的上清液，然后直接用于后续纯化和制备。

(4)制备方法简单，收率高的优势：本发明只需要使用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶将门冬胰岛素前体经过一步转肽反应即可得到完整的门冬胰岛素分子，过程简单。

附图说明

图1显示含门冬胰岛素前体基因的重组表达质粒pPIC9K-N-B(1-29)-C-A(1-21)的结构。

图2显示含门冬胰岛素前体基因的重组表达质粒pPICZαA-N-B(1-29)-C-A(1-21)的结构。

图3显示含门冬胰岛素前体基因的重组表达质粒pPinkαHC-N-B(1-29)-C-A(1-21)的结构。

图4显示不含前导肽的门冬胰岛素前体菌种发酵上清液的RP-HPLC纯度分析结果。

图5显示含前导肽的门冬胰岛素前体菌种发酵上清液的RP-HPLC纯度分析结果。

图6显示用赖氨酰内切酶制备的门冬胰岛素纯品的RP-HPLC分析结果。

图7显示用胰蛋白酶制备的门冬胰岛素纯品的RP-HPLC分析结果。

具体实施方式

本发明将接合以下具体实施例做进一步说明，要理解的是，说明书中所给出的实施例仅是示例性的，不应解释为对本发明的范围的限制。本领域技术人员在阅读说明书后，可以对本发明的实施例作出适当改变，而这些改变仍然属于本发明的范围之内。

在本发明中，当涉及氨基酸序列时，字母代表以下含义。

中文名称

英文名称

三字母

单字母

中文名称

英文名称

三字母

单字母

甘氨酸

Glycine

Gly

G

苏氨酸

Threonine

Thr

T

丙氨酸

Alanine

Ala

A

半胱氨酸

Cysteine

Cys

C

缬氨酸

Valine

Val

V

甲硫氨酸

Methionine

Met

M

亮氨酸

Leucine

Leu

L

天冬酰胺

Asparagine

Asn

N

异亮氨酸

Isoleucine

Ile

I

谷氨酰胺

Glutamine

Gln

Q

脯氨酸

Proline

Pro

P

色氨酸

Tryptophan

Trp

W

苯丙氨酸

Phenylalanine

Phe

F

丝氨酸

Serine

Ser

S

酪氨酸

Tyrosine

Tyr

Y

赖氨酸

Lysine

Lys

K

天冬氨酸

Aspartic acid

Asp

D

精氨酸

Arginine

Arg

R

谷氨酸

Glutamic acid

Glu

E

组氨酸

Histidine

His

H

实施例1构建含门冬胰岛素前体基因的重组质粒pPIC9K-N-B(1-29)-C-A(1-21)

根据门冬胰岛素前体的氨基酸序列设计相应的cDNA序列，再从密码子偏好性、GC含量、密码子适应指数CAI、发夹结构和顺式作用元件等方面对序列进行优化，然后在序列C末端添加终止密码子TAA，5’末端添加限制酶XhoI序列CTCGAG，3’末端添加限制酶NotI序列GCGGCCGC，得到门冬胰岛素前体编码基因。委托苏州省心生物技术有限公司进行全基因合成。将合成的基因插入经限制酶EcoRV消化的pUC57质粒得到克隆质粒pUC57-N-B(1-29)-C-A(1-21)(其中N代表N段前导肽序列Z1(XY)nZ2Z3Z4，C代表连接肽序列C1C2C3)。

用限制酶XhoI和NotI酶切克隆质粒pUC57-N-B(1-29)-C-A(1-21)，回收基因片段，连接至经XhoI(1192-1197bp)和NotI酶切的质粒pPIC9K，转化子大肠杆菌TOP10，将耐受氨苄青霉素的转化子，用测序引物5’gactggttccaattgacaagc进行测序，选取未发生基因突变且读码框正确的转化子，即得到重组表达质粒pPIC9K-N-B(1-29)-C-A(1-21)。

图1显示含门冬胰岛素前体基因的重组表达质粒pPIC9K-N-B(1-29)-C-A(1-21)的结构。其中GOI代表门冬胰岛素前体基因，α-Factorsecretionsignal代表α交配因子信号肽，5’AOX1promoter代表AO1启动子，AOX1TT代表AOX1终止子，HIS4ORF代表组氨酸脱氢酶编码基因，Kanamycin代表卡那霉素抗性基因，3’AOX1代表AOX1整合位点，CYC1TT代表CYC1终止子，pBR322origin代表pBR322复制子，Ampicillin代表氨苄青霉素抗性基因。

实施例2构建含门冬胰岛素前体基因的重组质粒pPICZαA-N-B(1-29)-C-A(1-21)

用限制酶XhoI和NotI酶切克隆质粒pUC57-N-B(1-29)-C-A(1-21)，回收基因片段，连接至经XhoI和NotI酶切的质粒pPICZαA，转化子大肠杆菌TOP10，将耐受氨苄青霉素的转化子，用测序引物5’gactggttccaattgacaagc进行测序，选取未发生基因突变且读码框正确的转化子，即得到重组表达质粒pPICZαA-N-B(1-29)-C-A(1-21)。

图2显示含门冬胰岛素前体基因的重组表达质粒pPICZαA-N-B(1-29)-C-A(1-21)的结构。其中GOI代表门冬胰岛素前体基因，α-Factorsecretionsignal代表α交配因子信号肽，AOX1promoter代表AO1启动子，AOX1TT代表AOX1终止子，TEFpromoter代表TEF启动子，EM7promoter代表EM7启动子，Zeocin代表Zeocin抗性基因，CYC1TT代表CYC1终止子，pUCorigin代表pUC复制子。

实施例3构建含门冬胰岛素前体基因的重组质粒pPinkαHC-N-B(1-29)-C-A(1-21)

以5’tcgcgaatgcatctagatgagtcttgac(其中gagtcttgac为限制酶MlyI识别序列)和5’acgggcccgggatccgatggtacc(其中ggtacc为限制酶KpnI识别序列)为引物，以克隆质粒pUC57-N-B(1-29)-C-A(1-21)为模板，PCR扩增门冬胰岛素前体基因片段，连接至经StuI和KpnI酶切的质粒pPinkα-HC，转化子大肠杆菌TOP10，将耐受氨苄青霉素的转化子，用测序引物5’gactggttccaattgacaagc进行测序，选取未发生基因突变且读码框正确的转化子，即得到重组表达质粒pPinkαHC-N-B(1-29)-C-A(1-21)。

图3显示含门冬胰岛素前体基因的重组表达质粒pPinkαHC-N-B(1-29)-C-A(1-21)的结构。其中GOI代表门冬胰岛素前体基因，α-Factorsecretionsignal代表α交配因子信号肽，5’AOX1promoter代表AO1启动子，CYC1TT代表CYC1终止子，ADE2代表ADE2启动子，ADE2ORF代表磷酸核糖酰氨基眯唑羧化酶编码基因，TRP2gene代表TRP2基因，pUCori代表pUC复制子，Ampicillin代表氨苄青霉素抗性基因。

实施例4门冬胰岛素前体N-B(1-29)-C-A(1-21)在毕赤酵母GS115中表达

用限制酶SalⅠ消化重组表达质粒pPIC9K-N-B(1-29)-C-A(1-21)，回收10～20μg线性化质粒片段，电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布于MD平板(13.4g/L酵母氮碱，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂粉)，28℃倒置培养3～5天直到出现转化子。

收集MD平板上的转化子，用无菌水稀释至酵母细胞数为5×10³个/ml后取0.2ml涂布至含0.25mg/mlGeneticin的YPG平板(20g/LTryptone，10g/LYeastExtract，20g/L甘油，15g/L琼脂粉)；稀释至酵母细胞数为5×10⁴个/ml后取0.2ml涂布含0.5mg/mlGeneticin的YPG平板；稀释至酵母细胞数为5×10⁵个/ml后取0.2ml涂布含0.75mg/ml；稀释至酵母细胞数为5×10⁶个/ml后取0.2ml涂布含1.0mg/ml和1.5mg/mlGeneticin的YPG平板；稀释至酵母细胞数为5×10⁷个/ml后取0.2ml涂布含2.0mg/ml和3.0mg/ml和4.0mg/mlGeneticin的YPG平板。28℃倒置培养培养3～5天直到出现抗性菌落。

挑取单菌落接种至25mlBMGY(20g/LTryptone，10g/LYeastExtract，13.4g/L酵母氮碱，0.4mg/L生物素，10g/L甘油，3.01g/LK₂HPO₄·3H₂O，11.81g/LKH₂PO₄，pH6.0)培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝2-6(对数生长期，大约16-18小时)，3000rpm室温离心5min收集细胞，用BMMY(20g/LTryptone，10g/LYeastExtract，13.4g/L酵母氮碱，0.4mg/L生物素，5g/L甲醇，3.01g/LK₂HPO₄·3H₂O，11.81g/LKH₂PO₄，pH6.0)培养基重悬细胞至OD₆₀₀＝1.0，28℃，220rpm继续培养进行诱导表达(大约100-200ml)，每24小时，加甲醇至终浓度为0.5％继续诱导。诱导72h，取1ml培养基至1-5ml离心管，1200rpm室温离心5min，收集上清液用RP-HPLC检测(C18柱)门冬胰岛素前体含量。

表1显示了不同前导肽和连接肽的门冬胰岛素前体相对于不含前导肽的对照组的相对表达量。

表1

前导肽	连接肽	门冬胰岛素前体	相对表达量(％)
				无(对照)	DGK	B(1-29)-DGK-A(1-21)	100
无	DAK	B(1-29)-DAK-A(1-21)	116
				无	AAK	B(1-29)-AAK-A(1-21)	38
无	EGK	B(1-29)-EGK-A(1-21)	86
				EEAEPK	DGK	EEAPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	192
E(EA)₂EPK	DGK	E(EA)₂EPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	217
				E(EA)₃EPK	DGK	E(EA)₃EPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	290
E(EA)₅EPK	DGK	E(EA)₅EPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	296
				E(EA)₈EPK	DGK	E(EA)₈EPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	324
EEAEPK	AAK	EEAPK-B(1-29)-AAK-A(1-21)	118
				E(EA)₅EPK	AAK	E(EA)₅EPK-B(1-29)-AAK-A(1-21)	155
E(EA)₃EPK	DAK	E(EA)₃EPK-B(1-29)-DAK-A(1-21)	214
				E(EA)₅EPK	DAK	E(EA)₅EPK-B(1-29)-DAK-A(1-21)	302
E(EA)₃EPK	EGK	E(EA)₃EPK-B(1-29)-EGK-A(1-21)	190

实施例5门冬胰岛素前体N-B(1-29)-C-A(1-21)在毕赤酵母X-33中表达

用限制酶SacⅠ消化重组表达质粒pPICZαA-N-B(1-29)-C-A(1-21)，回收10～20μg线性化质粒片段，电转化至毕赤酵母X-33感受态细胞，涂布于含0.1mg/mlZeocin的YPG平板，28℃倒置培养3～5天直到出现转化子。

收集YPG平板上的转化子，用无菌水稀释至酵母细胞数为5×10³个/ml后取0.2ml涂布至含0.25mg/mlZeocin的YPG平板；稀释至酵母细胞数为5×10⁴个/ml后取0.2ml涂布含0.5mg/mlZeocin的YPG平板；稀释至酵母细胞数为5×10⁵个/ml后取0.2ml涂布含0.75mg/ml；稀释至酵母细胞数为5×10⁶个/ml后取0.2ml涂布含1.0mg/ml和1.5mg/mlZeocin的YPG平板；稀释至酵母细胞数为5×10⁷个/ml后取0.2ml涂布含2.0mg/ml和3.0mg/ml和4.0mg/mlZeocin的YPG平板。28℃倒置培养培养3～5天直到出现抗性菌落。

按实施例3中的方法进行摇床培养，收集上清液用RP-HPLC检测(C18柱)门冬胰岛素前体含量。

表2显示了不同前导肽和连接肽的门冬胰岛素前体相对于不含前导肽的对照组的相对表达量。

表2

实施例6门冬胰岛素前体N-B(1-29)-C-A(1-21)在毕赤酵母PichiaPink中表达

用限制酶EcoNⅠ消化重组表达质粒pPinkαHC-N-B(1-29)-C-A(1-21)，回收10～20μg线性化质粒片段，电转化至毕赤酵母PichiaPink感受态细胞，涂布于PAD平板(1pouch/LPADAgar，20g/L葡萄糖)，28℃倒置培养3～10天直到出现转化子。选取生长较好的白色单菌落，按实施例3中的方法进行摇床培养，收集上清液用RP-HPLC检测(C18柱)门冬胰岛素前体含量。

表3显示了不同前导肽和连接肽的门冬胰岛素前体相对于不含前导肽的对照组的相对表达量。

表3

前导肽	连接肽	门冬胰岛素前体	相对表达量(％)
				无(对照)	DGK	B(1-29)-DGK-A(1-21)	100
无	DAK	B(1-29)-DAK-A(1-21)	113
				EEAEPK	DGK	EEAPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	182
E(EA)₃EPK	DGK	E(EA)₃EPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	286
				E(EA)₃EPK	DAK	E(EA)₃EPK-B(1-29)-DAK-A(1-21)	209
E(EA)₅EPK	DAK	E(EA)₅EPK-B(1-29)-DAK-A(1-21)	277

实施例7门冬胰岛素前体在20L发酵罐中的培养与表达

从-80℃冰箱取出门冬胰岛素前体基因工程菌，取0.3ml接种至50mlYPG培养基(20g/LTryptone，10g/LYeastExtract，20g/L甘油)，28℃，220rpm培养24h，得到一级种子液。取30ml一级种子液接种至400mlYPG培养基，28℃，220rpm培养24h，得到二级种子液。

将400ml二级种子液接种至含8L基础盐发酵培养基(26.7ml/L85％磷酸，0.93g/L硫酸钙，9.1g/L硫酸钾，7.45g/L七水合硫酸镁，2.07g/L氢氧化钾，20g/L甘油，4ml/L微量元素)的20L发酵罐。1L微量元素配方为：6.0g五水硫酸铜，0.02g硼酸，35.6g七水硫酸锌，65g七水硫酸亚铁，0.5g六水氯化钴，0.08g碘化钾，3g一水硫酸锰，0.2g二水钼酸钠，0.2g生物素，5ml浓硫酸，余量为水。以搅拌转速100rpm，通气量4L/min，温度30℃，pH5.6的初始条件开始培养，通过调整转速和通气量维持DO(溶解氧)高于40％，当发酵培养基中的甘油完全消耗后，开始补加甘油补料培养基(40g/L甘油，8ml/L微量元素，余量为水)继续培养。当发酵液浓度OD₆₀₀达到120时停止加甘油补料培养基，同时开始补加含8ml/L微量元素的100％甲醇，温度降低为28℃，通过调整转速和通气量维持DO)高于20％。补加甲醇120h时停止培养，收集发酵上清液用RP-HPLC检测(C18柱)门冬胰岛素前体含量。

表4显示了不同前导肽和连接肽的门冬胰岛素前体菌种的发酵产量。

表4

前导肽	连接肽	门冬胰岛素前体	产量(g/L)
				无	DGK	B(1-29)-DGK-A(1-21)	2.14
无	DAK	B(1-29)-DAK-A(1-21)	2.32
				EEAEPK	DGK	EEAPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	3.30
E(EA)₃EPK	DGK	E(EA)₃EPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	5.95
				E(EA)₃EPK	DAK	E(EA)₃EPK-B(1-29)-DAK-A(1-21)	4.89
E(EA)₅EPK	DAK	E(EA)₅EPK-B(1-29)-DAK-A(1-21)	5.78
				E(EA)₁₀EPK	DGK	E(EA)₁₀EPK-B(1-29)-DGK-A(1-21)	6.23

发酵上清液用RP-HPLC检测(C18柱)检测门冬胰岛素前体的纯度及杂质含量。

图4显示了不含前导肽的门冬胰岛素前体菌种发酵上清液的RP-HPLC纯度分析结果。图中出峰时间为17.725min为含前导肽的门冬胰岛素前体目标峰，出峰时间0～5min为溶剂峰，除去溶剂峰后，目标峰占比为40.1％，说明发酵液中门冬胰岛素前体纯度为40.1％。

图5显示了含前导肽的门冬胰岛素前体菌种发酵上清液的RP-HPLC纯度分析结果。图中出峰时间为17.906min为含前导肽的门冬胰岛素前体目标峰，出峰时间0～5min为溶剂峰，除去溶剂峰后，目标峰占比为60.4％，说明发酵液中门冬胰岛素前体纯度为60.4％。

实施例8用赖氨酰内切酶制备门冬胰岛素

(1)纯化获得门冬胰岛素前体：以8000rpm，室温，30min的条件离心发酵液，收集发酵上清液，用大孔吸附树脂富集上清液中的门冬胰岛素前体，同时去除发酵上清液中的培养基残留物、菌体碎片和其他大颗粒杂质。用聚合物色谱填料反向层析进一步纯化，去除一部分杂质和色素，收集液用稀盐酸调节pH至5.0，10℃静置3h。以8000rpm，10℃，10min的条件离心，收集沉淀物，然后冷冻干燥后获得门冬胰岛素前体粉末。

(2)制备门冬胰岛素酯：用赖氨酰内切酶进行转肽反应，反应体系为：20％的DMSO、60％的PEG400，20％纯化水，30mg/ml门冬胰岛素前体粉末，按1mol门冬胰岛素前体100mol叔丁醚苏氨酸叔丁酯的量投入叔丁醚苏氨酸叔丁酯，按1g门冬胰岛素前体50AU赖氨酰内切酶的量投入赖氨酰内切酶，调节pH6.6，37℃反应10h，取样用RP-HPLC分析，发现转肽效率为73％。

(3)门冬胰岛素酯的纯化及脱脂：用聚合物色谱填料反向层析转肽反应液，除去门冬胰岛素前导肽、反应溶剂等，收集液用冷冻干燥后得门冬胰岛素酯粉末。然后按质量体积比为1g:4ml的量加入丙酮，用真空泵抽干，重复一次上述操作。按质量体积比为1g:5.5ml的量加入三氟乙酸，15℃反应1h即得门冬胰岛素。

(4)门冬胰岛素的纯化：将上述脱脂后的门冬胰岛素反应液加入到25mMTris-HCl0.05MNaCl，pH8.90的缓冲液中，用DEAE离子交换树脂纯化。收集液用C8介质(100A，10um)进行精纯化，取收集液用RP-HPLC分析，发现门冬胰岛素的纯度为99.1％。

图6显示了用赖氨酰内切酶制备的门冬胰岛素纯品的RP-HPLC分析结果。图中出峰时间为22.362min为门冬胰岛素目标峰，目标峰占比为99.1％，说明纯化后的门冬胰岛素纯度为99.1％。

实施例9用胰蛋白酶制备门冬胰岛素

取实施例8中获得的门冬胰岛素前体粉末进行转肽反应，反应体系为：20％的DMSO、60％的PEG400，20％纯化水，30mg/ml门冬胰岛素前体粉末，按1mol门冬胰岛素前体100mol叔丁醚苏氨酸叔丁酯的量投入叔丁醚苏氨酸叔丁酯，按1g门冬胰岛素前体100mg胰蛋白酶的量投入胰蛋白酶，调节pH6.6，37℃反应10h，取样用RP-HPLC分析，发现转肽效率为58.2％。

按实施例8中的方法对门冬胰岛素酯进行脱脂反应，再用DEAE离子交换树脂C8介质进行纯化，获得门冬胰岛素纯品，用RP-HPLC分析，发现门冬胰岛素的纯度为98.624％。

图7显示了用胰蛋白酶制备的门冬胰岛素纯品的RP-HPLC分析结果。图中出峰时间为22.122min为目标峰，目标峰占比为98.624％，说明纯化后的门冬胰岛素纯度为98.624％。

<110>珠海冀百康生物科技有限公司

<120>速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法

<160>2

<170>PatentInVersion4.3

<210>1

<211>183

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaagaagctgaagctgaaccaaagtttgttaaccaacatttgtgtggttctcatttggtt60

gaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctacactgataaggatggtaag120

ggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgt180

aac183

<210>2

<211>61

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

GluGluAlaGluAlaGluProLysPheValAsnGlnHisLeuCysGly

151015

SerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGluArgGlyPhe

202530

PheTyrThrAspLysAspGlyLysGlyIleValGluGlnCysCysThr

354045

SerIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsn

505560

Claims

1.一种门冬胰岛素前体，其氨基酸序列为：

Z₁(XY)_nZ₂Z₃Z₄-B(1-29)-C₁C₂C₃-A(1-21)，其中

Z₁、X、Z₂分别为Asp或Glu；Y为Ala或Gly；n为1~10之间的整数；Z₃为Pro、Glu或Asp；Z₄、C₃分别为Lys或Arg；C₁、C₂分别为Glu、Asp、Ala或Gly；B(1-29)为门冬胰岛素B链1-29位氨基酸；并且A(1-21)为门冬胰岛素A链1-21位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Z₁是Glu。

3.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中X是Glu。

4.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Y是Ala。

5.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Z₂是Glu。

6.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Z₃是Pro。

7.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中C₁是Glu或Asp。

8.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中C₂是Gly或Ala。

9.一种编码权利要求1所述的门冬胰岛素前体的核苷酸序列。

10.一种含有权利要求9所述的核苷酸序列的克隆载体。

11.根据权利要求10所述的克隆载体，所述克隆载体为重组质粒pPIC9K，重组质粒pPICZαA或重组质粒pPinkαHC。

12.一种包含权利要求10或11所述克隆载体的表达系统。

13.根据权利要求12所述的表达系统，其中一个所述表达系统含有1-12个拷贝的克隆载体。

14.根据权利要求12或13所述的表达系统，其中所述表达系统为毕赤酵母细胞。

15.根据权利要求14所述的表达系统，其中毕赤酵母细胞为毕赤酵母GS115、毕赤酵母X-33或毕赤酵母PichiaPink。

16.一种制备门冬胰岛素的方法，包括：

培养权利要求13所述的表达系统；

分离、富集得到门冬胰岛素前体；

用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶进行转肽，获得门冬胰岛素粗品；以及

纯化获得门冬胰岛素。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤（a）之前，对权利要求13所述的表达系统进行筛选，以选择出表达水平最高的表达系统。