CN101875699B

CN101875699B - 人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101875699B
Application number: CN2009102464461A
Authority: CN
Inventors: 孙家驹; 周银华
Original assignee: SHANGHAI SIRUIBAO BIOTECH Inc
Current assignee: SHANGHAI SIRUIBAO BIOTECH Inc
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2029-11-23
Also published as: CN101875699A

Abstract

本发明提供了一种人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白，包括第一部分和第二部分，所述的第一部分为人表皮生长因子，第二部分为人金属硫蛋白，所述的人金属硫蛋白位于人表皮生长因子的C端。本发明还提供了上述的融合蛋白在制备治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的药物中的应用和在制备皮肤护理药物中的应用。本发明中的融合蛋白和原来的人表皮生长因子和金属硫蛋白相比，稳定性增加了、清除速率降低了和降解减少了，为EGF-MT融合蛋白的使用带来了好处和便利，从而可以减少用药量和用药频率。同时，本发明所形成的融合蛋白是一个双功能分子，其具有EGF和MT双重功效。

Description

人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种融合蛋白，具体地本发明是一种人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1962年Cohen从小鼠颌下腺中发现了表皮生长因子(EGF)，于1975年测定了EGF的氨基酸组成，而人的EGF基因是在1986年才克隆得到。天然表皮生长因子是一个53个氨基酸的蛋白质，分子量约6000道尔顿，含有三对二硫键(Cohen等，J.Biol.Chem，1962，237：1555-1562)，具有多种生物学活性(Karnes等，Epidermal growth factor and transforming growth factor alpha，1994，RavenPress，New York)。由于表皮生长因子较小，单独在大肠杆菌中表达有一定难度，但有许多在酵母和哺乳动物细胞中表达人表皮生长因子的资料。马清钧将EGF与ANG融合(CN01120099.5)表达，黄秉仁在酵母中表达EGF(97115284.5)，甘人宝(00127953.X)在大肠杆菌中分泌表达了人EGF。

1957年Margoshes发现金属硫蛋白(MT)，分子量为6500道尔顿，具有清除体内自由基、抗电离辐射、抗紫外线照射、防止机体衰老，解除重金属的毒性，治疗消化道溃疡、各种炎症以及美容护肤等方面发挥重要的作用。它结合重金属离子能力是结合一般金属离子能力的1000倍。此外，MT与细胞生长因子有协同作用，已经有利用工程菌生产MT的尝试(01128543.5，01132046.X)。

随着基因工程的发展，需要在各种系统中表达所需要的蛋白质，为满足治疗用重组蛋白质有效性的需要，在蛋白质设计和化学修饰方面，有了很大进步，融合蛋白的设计，既可以充分发挥二者的特性，也可以减少目标蛋白质的降解。本发明利用基因工程技术，针对现有EGF、MT存在的问题，对EGF进行了融合改造，所获得的新型人表皮生长因子融合蛋白，具有产量高、兼俱EGF和MT的活性，在抗辐射、解除重金属的毒性，皮肤损伤、皮肤保养和各种溃疡的治疗方面，具有很好的疗效。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白，所述的这种人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白要解决现有技术中的单独的人表皮生长因子或金属硫蛋白在治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的过程中效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白，包括第一部分和第二部分，所述的第一部分为人表皮生长因子，第二部分为人金属硫蛋白。

进一步的，所述的人金属硫蛋白位于人表皮生长因子的C端。

进一步的，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明还提供了一种分离的核酸分子，编码权利要求1所述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白。

进一步的，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

进一步的，所述的融合蛋白中的人表皮生长因子的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

进一步的，所述的融合蛋白中的人金属硫蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。

本发明还提供了一种载体，所述载体含有上述的核酸分子。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述的细胞含有上述的载体，或者所述的细胞用上述的核酸分子转化或转染。

本发明还提供了一种生产上述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白的方法，包括一个克隆和培养上述的宿主细胞的过程，包括一个利用所述的宿主细胞表达所述的融合蛋白的过程，包括一个分离所述的融合蛋白的过程。

本发明还提供了上述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白在制备治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的药物中的应用。

本发明还提供了上述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白在制备皮肤护理药物中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物，含有上述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白以及药学上可接受的载体或者赋形剂或者稀释剂。

本发明还提供了上述药物组合物在制备治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的药物中的应用。

本发明还提供了上述药物组合物在制备皮肤护理药物中的应用。

本文中所用的术语“融合蛋白”是指两个以上蛋白质或多肽分子连接到一起，所形成的新的蛋白质。连接可以通过公知的遗传工程或化学合成方法来进行，优选通过遗传工程方法，即通过重组DNA技术来实现多个蛋白质或多肽分子的融合。本发明的融合蛋白中亦可包括一些化学修饰部分，如水溶性聚合物。优选水溶性聚合物要为药学上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，丙二醇同源共聚物，多聚氨基酸等。它们可以延长融合蛋白的体内代谢时间，加速生物体对融合蛋白的吸收，增强融合蛋白的稳定性等。根据生产中所使用的宿主细胞的不同，如原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如哺乳动物细胞)，本发明的融合蛋白可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。

本文中所用的术语“功能等价物”指的是与原有多肽或蛋白质的活性基本相同的变异体多肽。该变异体多肽是在原有多肽或蛋白质序列中变异一个或几个氨基酸残基而获得的多肽，优选是变异不超过五个氨基酸残基而获得的多肽，最佳地，是变异一个至三个氨基酸残基而获得的多肽。变异可以通过缺失、插入或取代来实施。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、插入或删除了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在变异的氨基酸残基中，优选变异为与原氨基酸残基侧链性质相似的其它氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。

本发明所述的人表皮生长因子、金属硫蛋白是指天然存在的人表皮生长因子和金属硫蛋白及其功能等价物，包括N末端带有或不带有甲硫氨酸，最佳地，所述的融合蛋白由人表皮生长因子、金属硫蛋白成熟肽组建而成。本发明除提供EGF-MT融合蛋白通过肽键连接的方式以外，也可以通过本领域熟知的化学连接物进行连接。

本发明中的人表皮生长因子，除天然存在的53个氨基酸的形式外，亦包括其N末端带有甲硫氨酸的形式，以及其截短突变体，如C端缺失氨基酸所形成的52肽，本发明优选N端带有甲硫氨酸的形式。

本发明中金属硫蛋白与表皮生长因子可以使用接头肽连接，也可以直接连接，优选直接连接。

本发明中的核酸分子，根据宿主菌的特性，根据最佳密码子使用原则，采用了人工合成的方式，获得所需的人表皮生长因子基因。本发明中，“最佳密码子”，也称“惯用码”，是指根据不同物种中编码同一个氨基酸的不同遗传密码出现的频率高低，有意识地按照出现频率较高的去组织所需目的基因，使得目的基因在这个宿主菌中易于获得高表达。在本文中，“核酸分子”、“基因”、“DNA”可以相互替换使用，均指一个含意。本发明的多核苷酸，优选DNA形式。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码新型人表皮生长因子融合蛋白的核苷酸序列或其片段。

本文中的术语“表达载体”，是指本领域中常用的细菌质粒、酵母质粒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体)、在哺乳动物细胞中表达用的载体(逆转录病毒载体、腺病毒载体等)。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。

本发明的宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，脂质体包裹、电融合法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

本发明的宿主细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱，反向色谱，以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括但不限于：盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、缓冲液及其各种组合。药物制剂应该与给药方式相匹配。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、乳液剂、霜剂、注射剂、喷雾剂型。优选该药物组合物为注射剂型、喷雾剂型、乳液剂或霜剂的剂型。这些组合物包含不同缓冲液内容(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)、相应的离子强度和pH值，以及其它物质(如聚乳酸等)。

本发明中的融合蛋白具有如下优点：人EGF-MT融合蛋白表现出较原来各自蛋白较佳的特性，如稳定性增加、清除速率降低和减少降解的优点，为EGF-MT融合蛋白的使用带来了好处和便利，从而可以减少用药量和用药频率。本发明所形成的融合蛋白是一个双功能分子，其具有EGF和MT双重功效。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1人表皮生长因子基因合成组装示意图。

图2显示了人表皮生长因子-金属硫蛋白质粒(重组质粒pBV220-EM)酶切电泳结果，M代表分子量标准，第1～3道切出的片段大小合适，第4道则是非目的物。

图3是人表皮生长因子融合蛋白的SDS-PAGE结果图，显示了新型人表皮生长因子融合蛋白表达产物的电泳分析鉴定结果，其中第1道为未诱导样品，第2道为诱导样品，第3-5道为其他克隆。

图4是含有人表皮生长因子的表达质粒pBV220-EM示意图。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了，而这些等价修改，均应属于本发明所限定的范围。

具体实施方式

以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》，2002年，科学出版社)所述方法进行。

实施例1 人表皮生长因子基因的合成和组装

整个新型人表皮生长因子融合蛋白的全部序列，按大肠杆菌惯用的密码子人工设计，并分为六条寡核苷酸进行合成(分别命名为EU1、EU2、EU3、ED1、ED2、ED3)(如图1所示)，寡核苷酸EU1的碱基序列如SEQ ID No：5所示，寡核苷酸EU2的碱基序列如SEQ ID No：6所示，寡核苷酸EU3的碱基序列如SEQ ID No：7所示，寡核苷酸ED1的碱基序列如SEQ ID No：8所示，寡核苷酸ED2的碱基序列如SEQ ID No：9所示，寡核苷酸ED3的碱基序列如SEQ ID No：10所示，委托上海英骏生物技术公司合成，其中，EU1和ED1两条寡核苷酸链在退火后，形成一个EcoR I的粘性末端，而EU3和ED3在退火后，则形成一个Xba I的粘性末端，以便克隆。

将合成的寡核苷酸以TE溶解后，每条寡核苷酸各取100pmpl，在10mmol/LTris.Cl-1mmol/L EDTA-100mmol/L NaCl退火体系中，90℃退火5分钟，然后缓慢降温至室温。与经EcoR I和Xba I双酶切的载体pGEM-3zf(+)在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌Top10F’，加入IPTG和X-gal，铺平板，进行蓝白筛选。白色克隆提取质粒，以EcoR I和XbaI双酶切进行鉴定，能够切出约160bp片段的克隆暂认定为阳性克隆，保留甘油菌种，送上海生工进行序列测定，测序正确的克隆命名为pGE04。

实施例2 人金属硫蛋白基因的合成和组装

按已经发表的人金属硫蛋白(MT1M)序列(如SEQ ID No：4所示)，使用大肠杆菌惯用密码子设计其编码基因(如SEQ ID No：11所示)，并在该编码基因的5′端设计Xba I位点，在其3′端设计Hind III位点，以便克隆。该人金属硫蛋白编码基因委托上海英骏生物技术公司进行全基因合成。

上海英骏生物技术公司提供了经测序验证的带有上述合成的人金属硫蛋白编码基因的克隆质粒，将其命名为pGM01。

实施例3 融合蛋白大肠杆菌表达载体的构建

将含有命名为pGE04的重组质粒的大肠杆菌菌株，含有命名为pGM01的重组质粒的大肠杆菌菌株，和含有大肠杆菌表达载体pBV220的大肠杆菌菌株，接种到含氨苄青霉素50mg/L的10ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按照Qiagen公司质粒提取试剂盒使用手册说明，分别提取质粒。重组质粒pGE04以EcoR I和Xba I双酶切，含pGM01的重组质粒以Xba I和Hind III双酶切，表达载体pBV220用EcoR I和Hind III进行酶切，具体条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，各限制性内切酶分别使用10个活性单位(New England Biolabs公司)，加入10×缓冲液1μl，用去离子水补齐，37℃酶切2小时。酶切结束后，加1μl 200mM EDTA终止反应。在1.2％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。在紫外灯下，分别切下电泳凝胶中表达载体pBV220对应的约4.0kb条带，重组质粒pGE04对应的约160bp条带，重组质粒pGM01对应的约200bp条带，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体和片段1∶3的比例将两个片段和表达载体混合，反应体系10μl，由T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜。按照常规方法(氯化钙法)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺于含氨苄青霉素50mg/L的LB平板上，37℃倒置过夜。

挑取平板上的单克隆，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，按照常规方法提取质粒，EcoR I和Hind III进行双酶切鉴定(如图3所示)。酶切鉴定阳性的克隆，筛选得到的大肠杆菌表达菌株命名为：pBV220-EGFMT(如图5所示)，其含有编码Seq.No.1所示的融合蛋白的核苷酸序列。次日以2％转接于5ml LB培养基中，继续培养2~3小时，当细菌OD₆₀₀达到0.5左右时，转入42℃进行温度诱导，诱导5小时后，离心收菌，弃上清，菌体加入20μl水，再加入20μlSDS-PAGE 2x上样缓冲液混合，100℃煮沸10分钟，13000rpm，离心10分钟，取15μl，15％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，与未诱导的细菌对比，观察结果(如图4所示)。含有表达条带的菌株留存甘油菌种，储存于超低温冰箱中。同时进行序列测定，以确保克隆正确无误。

实施例4 工程菌的发酵

1、培养基：LB培养基用于试管种子菌的培养，半合成培养基用于发酵罐补料分批培养，每升含：蛋白胨5g，甘油5mL，十二水磷酸氢二钠6g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铵1.5g，氯化铵1g，七水合硫酸镁0.25g，氯化钙0.02g，硫酸亚铁0.04g，甘氨酸0.5g。每升补料培养基含：甘油120mL，蛋白胨50g，酵母抽提物50g，七水合硫酸镁2g。除特殊说明，培养基的pH值全部调为7.0。培养基、补料和微量元素溶液高压灭菌后使用，除发酵培养基和补料培养基外，各种培养基使用前加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL。

2、种子菌活化：取-70℃保存菌种100μL接种于5mL LB培养基中，30℃，200r/min培养12h。

3、种子菌的摇瓶扩大培养：取活化种子菌，按2％接种量接种于400mL LB培养基中。30℃，200r/min培养8h左右。

4、溶氧反馈-分批补料高密度发酵：将400mL发酵种子菌接种入8L发酵培养基中，利用NBS Bioflo IV20L发酵罐进行高密度发酵，以AFS-BioCommandBioprocessing Software(Version 2.61)软件对其进行数据采集(每30s采集数据1次)和实现计算机在线控制，全过程共20h。

主要参数：

温度：生长阶段温度控制在30℃，16h后采用一步法迅速升温至42℃诱导表达4h。

pH值：自动流加分析纯氨水，将pH始终控制在7.0或以上一点。

溶解氧：空气流量设定为12L/min。溶解氧在整个发酵过程中控制在40％。

搅拌速度：设定搅拌速度下限为200r/mim，上限为1000r/min。生长过程中溶氧反馈控制当溶氧低于设定值时通过计算机由AFS-BioCommand BioprocessingSoftware(Version 2.61)软件控制每分钟增长4转。诱导过后，搅拌速度改为由NBS Bioflo IV发酵罐直接溶氧反馈控制。

补料流加：补料泵的运转直接由当前溶氧值实施反馈控制。在前16h生长阶段，当溶氧高在3min内持续于60％时补料泵以5％的速率进行补加营养。诱导阶段当溶氧值在3min内持续高于50％时补料泵以100％的速率进行补加营养1min。

5、发酵完成后离心收集菌体备用。

实施例5 融合蛋白的纯化

工程菌经过高密度发酵后，裂菌获得以包涵体形式表达的目标产物，经过6-8摩尔/升的尿素变性溶解，再采用反相层析纯化：分离介质：SOURCE 30RPC，在pH8.5，6M尿素条件下，配合0～40％异丙醇梯度洗脱纯化，15％SDS-PAGE检测，收集合并目的蛋白峰备用；然后再采用阴离子柱离子层析纯化：分离介质：QSepharose，Sepharose Q HP，或SOURCE 30Q，在pH8.5，8M尿素条件下，配合0～1mol/L氯化钠梯度洗脱纯化，15％SDS-PAGE检测，收集合并目的蛋白峰进行复性处理，复性液含有：低浓度变性剂(0.5-4摩尔/升的尿素或/和0.5-3摩尔/升盐酸胍)、低浓度(体积百分比0.05-1％)去垢剂(如Triton X100、Triton X114、吐温20、吐温80、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基溴化铵、NP40、Brij35)、合适的氧化还原体系(如0.1微摩尔/升-0.1毫摩尔/升的铜离子或/和还原剂/氧化剂比例为摩尔比从10∶1到1∶2，其中还原剂的浓度范围在0.05-10毫摩尔/升，所使用的还原剂可以是：还原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐、巯基乙醇、半胱氨、二硫苏糖醇、二硫赤癣糖醇，所使用的氧化剂可以是：氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫苏糖醇和二硫赤癣糖醇、胱氨酸及其盐酸盐、胱氨)、以及其它复性添加剂(如：0.05-10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二醇6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，0.02-1.0摩尔/升的精氨酸及其盐酸盐或其它碱性氨基酸及其盐酸盐或三(羟甲基)氨基甲烷，1％-20％的甘油及一定量的肝素)的偏碱性(pH7-11)复性液中复性12-48小时，然后进行超滤浓缩和除盐处理(要求处理后的复性蛋白溶液中尿素低于2mol/L，盐浓度低于40mmol/L，pH8.5)，再分别经过进行以下层析纯化：阴离子交换：分离介质：Q Sepharose，Sepharose Q HP，或SOURCE 30Q，在pH8.5，1.5M尿素条件下，配合0～1mol/L氯化钠梯度洗脱纯化，15％SDS-PAGE检测，收集合并目的蛋白峰再进行分子排阻层析纯化：分离介质：Sephacryls100，在pH7.5，0.15mol/L氯化钠等度洗脱纯化，15％SDS-PAGE检测，收集合并目的蛋白峰，经过上述处理的目的蛋白的纯度能够达到95％以上，然后经制剂、除菌后就可以作为半成品储存或进入成品生产环节。

实施例6 EGF-MT融合蛋白EGF活性测定

取传代培养BalB/c 3T3细胞，用含10％小牛血清的1640培养基按5x104细胞/孔的密度稀释细胞，并分别加入到96孔细胞培养板中，每孔100ul，37℃、5％CO2培养18-24小时，更换含0.4％小牛血清的1640培养基100ul，继续在37℃、5％CO2饥饿培养24小时，加入含有EGF融合蛋白样品的维持培养基，调节其终质量浓度均为100ng/ml，用维持培养基倍比稀释，继续培养48-72小时，MTT法检测其活性，即每孔加入20ulMTT溶液，37℃、5％CO2培养5小时；每孔吸去80ul上清，加入裂解液100ul，室温放置30分钟后，比色，测定波长510nm，记录和计算结果。其ED50为2ng/ml，效价为3x10⁴IU/ml。

实施例7 融合蛋白清除自由基能力实验

用10μmol/L硫酸亚铁铵，10％H₂O₂与0.1mmol/L鲁米那混合均匀，立即测试其发光值。测定样品时，将10μl样品加入到体系中(1000μl)，再测定其发光值。据此可计算出其清除率。

清除率(％)＝(对照组发光强度-实验组发光强度)/对照组发光强度×100％

EGF-MT对自由基的清除(x±s)

实施例8 烫伤动物模型的实验研究

选用体质量为8-10kg的家养断乳小猪10只，全身麻醉，背部剃毛，然后用记号笔划出边长为2cm的圆形实验区，制备烧伤模型，将自制圆柱型铜柱一端在100℃沸水中置10分钟，迅速用纱布擦干，接触背部时间为7秒，造成深II度烫伤(经病理检测证实)，共制备4个圆形创面，直径为1.6cm，面积约2cm2。每只实验动物背部2个创面为实验组，另两个为对照组。伤后1小时用药，用0.1％洗必泰及生理盐水冲洗后，创面敷单层无菌网眼纱布，取EGF均匀喷涂以浸透纱布(100U/CM2，1次/天)，以后连续1周每2天换药1次，换药时揭去外层纱布，保留内层纱布，补充给药。对照组的创面，单用凡士林纱布包扎，不喷用EGF，余治疗同前。对照组分为给予生理盐水和不予处理两种。

观察指标：每次换药时观察创面情况

疗效评定：肉眼观察，创面愈合时间较对照组提前1D为有效，愈合时间相同为无效。统计学处理：所有数据均进行统计学处理，愈合时间D用均数+_标准差表示，行t检验。

结果：治疗组创面结痂出现时间比对照组早，治疗组为7.85±0.96，对照组为9.75±1.71.愈合时间(以痂皮脱落为标准)也显著早于对照组，治疗组为14±0.82，对照组为20±0.91。

相差均十分显著。(p＜0.01)

组织学检测，发现有大量的坏死样组织，也见许多活跃的血管和胶原纤维生长，肉芽组织生长活跃，并可见新生表皮组织的生长情况。

表两组深度烧伤创面愈合时间比较

组别创面深度创面个数愈合时间

治疗组深II度 20 14±0.82

对照组深II度 20 20±0.91

序列表

<110>上海司睿宝生物科技有限公司

<120>人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>117

<212>PRT

<213>人表皮生长因子-金属硫蛋白的融合蛋白

<400>1

Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu

1 5 10 15

His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys

20 25 30

Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu

35 40 45

Lys Trp Trp Glu Leu Arg Ser Arg Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Thr

50 55 60

Thr Gly Val Ser Cys Ala Cys Thr Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys

65 70 75 80

Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly

85 90 95

Cys Ala Lys Cys Ala His Gly Cys Val Cys Lys Gly Thr Leu Glu Asn

100 105 110

Cys Ser Cys Cys Ala

115

<210>2

<211>354

<212>DNA

<213>人表皮生长因子-金属硫蛋白的融合蛋白

<400>2

atgaatagcg attctgaatg tccactgagc catgatggtt attgcctgca tgatggtgtt 60

tgcatgtata ttgaagcact ggataaatat gcatgcaact gtgtggttgg ttacattggt 120

gaacgttgtc agtatcgtga tctgaaatgg tgggaactgc gctctagaat ggaccccaac 180

tgctcctgca ccactggtgt ctcctgcgcc tgcaccggct cctgcaagtg caaagagtgc 240

aaatgcacct cctgcaagaa gagctgctgc tcctgctgcc ccgtgggctg tgccaagtgt 300

gcccacggct gtgtctgcaa agggacgttg gagaactgca gctgctgtgc ctga 354

<210>3

<211>54

<212>PRT

<213>人EGF-MT融合蛋白中的表皮生长因子

<400>3

Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu

1 5 10 15

His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys

20 25 30

Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu

35 40 45

Lys Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210>4

<211>61

<212>PRT

<213>人EGF-MT融合蛋白中的金属硫蛋白

<400>4

Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Thr Thr Gly Val Ser Cys Ala Cys Thr

1 5 10 15

Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser

20 25 30

Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Hi s Gly Cys

35 40 45

Val Cys Lys Gly Thr Leu Glu Asn Cys Ser Cys Cys Ala

50 55 60

<210>5

<211>49

<212>DNA

<213>人表皮生长因子的核苷酸序列EU1

<400>5

ggaattcatg aatagcgatt ctgaatgtcc actgagccat gatggttat 49

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>人表皮生长因子的核苷酸序列EU2

<400>6

tgcctgcatg atggtgtttg catgtatatt gaagcactgg ataaatatgc atgcaactg 59

<210>7

<211>62

<212>DNA

<213>人表皮生长因子的核苷酸序列EU3

<400>7

tgtggttggt tacattggtg aacgttgtca gtatcgtgat ctgaaatggt gggaactgcg 60

ct

62

<210>8

<211>61

<212>DNA

<213>人表皮生长因子的核苷酸序列ED1

<400>8

aacaccatca tgcaggcaat aaccatcatg gctcagtgga cattcagaat cgctattcat 60

g

61

<210>9

<211>59

<212>DNA

<213>人表皮生长因子的核苷酸序列ED2

<400>9

ccaatgtaac caaccacaca gttgcatgca tatttatcca gtgcttcaat atacatgca 59

<210>10

<211>48

<212>DNA

<213>人表皮生长因子的核苷酸序列ED3

<400>10

ctctagagcg cagttcccac catttcagat cacgatactg acaacgttca 50

<210>11

<211>198

<212>DNA

<213>人金属硫蛋白的核苷酸序列

<400>11

ctctagaatg gaccccaact gctcctgcac cactggtgtc tcctgcgcct gcaccggctc 60

ctgcaagtgc aaagagtgca aatgcacctc ctgcaagaag agctgctgct cctgctgccc 120

cgtgggctgt gccaagtgtg cccacggctg tgtctgcaaa gggacgttgg agaactgcag 180

ctgctgtgcc taagcttg 198

Claims

1.人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白，其特征在于：包括第一部分和第二部分，所述的第一部分为人表皮生长因子，第二部分为人金属硫蛋白，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于：编码权利要求1所述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

3.一种载体，其特征在于：所述载体含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于：所述的细胞为用权利要求2所述的核酸分子转化或转染的细胞。

5.一种生产权利要求1所述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白的方法，其特征在于：包括一个克隆和培养权利要求4所述的宿主细胞的过程，包括一个利用所述的宿主细胞表达所述的融合蛋白的过程，包括一个分离所述的融合蛋白的过程。

6.权利要求1所述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白在制备治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的药物中的应用。

7.权利要求1所述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白在制备皮肤护理药物中的应用。

8.一种药物组合物，其特征在于：含有权利要求1所述的人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述可接受的载体为赋形剂。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述可接受的载体为稀释剂。

11.权利要求8所述药物组合物在制备治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的药物中的应用。

12.权利要求8所述药物组合物在制备皮肤护理药物中的应用。