[go: up one dir, main page]

TW201934752A - 一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因 - Google Patents

一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因 Download PDF

Info

Publication number
TW201934752A
TW201934752A TW108104187A TW108104187A TW201934752A TW 201934752 A TW201934752 A TW 201934752A TW 108104187 A TW108104187 A TW 108104187A TW 108104187 A TW108104187 A TW 108104187A TW 201934752 A TW201934752 A TW 201934752A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
seq
human insulin
encoding
Prior art date
Application number
TW108104187A
Other languages
English (en)
Inventor
王菲菲
陳磊
王宏偉
Original Assignee
大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 filed Critical 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
Publication of TW201934752A publication Critical patent/TW201934752A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本發明涉及一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因。具體而言，本發明涉及一種密碼子優化的用於酵母表達胰島素類似物前體的核酸分子，包含一種胰島素類似物前體核酸分子和一種酵母分泌信號肽α-因子核酸分子的融合。該經優化的核酸分子使得胰島素類似物前體在畢赤酵母中的表達量大幅提高，降低人胰島素類似物的生產成本，進而降低治療糖尿病藥物的成本。

Description

一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因
本發明涉及一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和一種密碼子優化的α-因子(α-factor)信號肽基因，並提供了該人胰島素類似物前體基因的表達方法。
人胰島素是由51個胺基酸組成的多肽，包含兩條鏈，分別為A鏈和B鏈。胰島素的主要藥效是調節糖代謝，在糖尿病治療中，胰島素干預作為替代或補充治療是最直接有效的方法。胰島素還有促進脂肪合成、抑制脂肪分解、減少酮體生成的作用，所以亦被用來糾正胰島素相關酮症和酸血症的各種症狀。
胰島素最早一直由豬、牛等動物胰腺提取而得，但這些產品與人胰島素結構有所不同，故存在免疫原性。上世紀八十年代初、中期美國禮來和丹麥諾和諾德公司相繼開發出基因重組人胰島素生產技術，從此基因工程表達人胰島素及其類似物成為工業主流手段。但是人胰島素作用時間較短，使得病人必須頻繁注射，極為不便。因此，人們致力於獲得一些能夠更長時間作用於人體的胰島素類似物及其衍生物。其中，使用醯化基團修飾人胰島素或其類 似物，是一種提高其半衰期的有效方法。WO2018024186公開了一種B29位被長鏈脂肪酸取代、B30位胺基酸缺失的人胰島素類似物，公開了該人胰島素類似物的結構和生物活性。WO9507931公開了一種B29位連接一個十四醯基側鏈、B30位胺基酸缺失的胰島素類似物及其製劑。WO2005012347公開了一種B29位被一個谷胺酸和長鏈脂肪酸取代、B30位胺基酸缺失的人胰島素類似物。目前常用的表達人胰島素及其類似物的表達系統主要有是大腸桿菌、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母，其中大腸桿菌表達為包涵體形式，需經過包涵體裂解和複性，工藝繁瑣且得率低，釀酒酵母與畢赤酵母有著操作簡易、易於培養、對外源蛋白修飾、可以分泌表達等遺傳表達優點，但釀酒酵母分泌效率低、表達菌株不夠穩定，相比之下畢赤酵母是工業生產重組蛋白應用更廣泛的表達系統。工業上，生產過程中發酵產量是控制生產成本的關鍵因素，由於胰島素市場需求量大，作為重要生產商的諾和諾德利用酵母表達生產時罐子規模達到幾十噸，對廠房、設備要求很高，成本也高，所以提高人胰島素及其類似物的發酵產量對工業生產有著重要意義。
遺傳密碼子是三聯體密碼，一個密碼子由信使核糖核酸(mRNA)上相鄰的三個鹼基組成。遺傳密碼共有64種，但不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對不同密碼子使用頻率並不相同，具有一定的偏愛性。外源基因的密碼子主要在轉譯層級上影響基因的表達，很多文獻已經證明密碼子的優化對於在畢赤酵母中提高外源蛋白的表達量卓有成效。畢赤酵母表達外源基因分為胞內表達和分泌表達兩種，後者需要信號肽來引導外源基因表達產物的分泌，目前最普遍使用的信號肽為來源於釀酒酵母α-因子信號肽，其核苷酸序列也來源於釀酒酵母，目前還沒有報道針對畢赤酵母優化的α- 因子信號肽核苷酸序列。胰島素前體密碼子優化的相關文獻很多，如Gurramkonda等人優化的人胰島素前體基因序列並在畢赤酵母的表達研究(Gurramkonda et al.Application of simple fed-batch technique to high-level secretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequent purification and conversion to human insulin.Microbial Cell Factories,2010,9：31)，專利WO1998028429公開了表達人胰島素類似物前體的基因序列，該基因編碼的胰島素前體胺基酸序列是EEGEPK-B(1-29)-AAK-A(1-21)，其中EEGEPK為胰島素前體N端延伸，稱為間隔肽或前導肽，可以保護胰島素前體的N端免於酵母蛋白酶的水解作用，並且能提高胰島素前體的表達效率；B(1-29)是缺失B30位蘇胺酸的人胰島素B鏈；A(1-21)是人胰島素A鏈胺基酸序列；AAK為連接B鏈和A鏈的連接肽，也稱為C肽。
為了進一步提升人胰島素及其類似物前體的產量，本發明結合畢赤酵母密碼子偏好性，優化了胰島素類似物前體基因和α-因子信號肽基因，在畢赤酵母中進行分泌表達，並與現有技術中的人胰島素類似物前體基因作為對照，結果表明，本發明中經過密碼子優化後的基因表達人胰島素類似物前體量提高了近2倍，能夠大大降低後期人胰島素及其類似物工業生產的成本。
本發明的一些實施方案中提供了核酸分子，其包含如下結構：5'-(PS)a-(SP)b-(LS)c-GE-(P'S)d-3'，其中，PS是編碼加工位點的核酸分子，a是0或1；SP是編碼信號肽的核酸分子，b是0或1； LS是編碼間隔肽的核酸分子，c是0或1；GE是編碼目標多肽的核酸分子；P'S是編碼加工位點的核酸分子，d是0或1。
一些實施方案中提供了核酸分子，其包含如下結構：5'-(PS)a-(SP)b-(LS)c-GE-(P'S)d-3'，其中，PS是編碼加工位點的核酸分子，a是0或1；SP是編碼信號肽的核酸分子，b是1；LS是編碼間隔肽的核酸分子，c是1；GE是編碼目標多肽的核酸分子；P'S是編碼加工位點的核酸分子，d是0或1。
在一些實施方案中，編碼信號肽的核酸分子包含如SEQ ID NO：1所示序列。
在一些實施方案中，目標多肽是人胰島素類似物前體多肽；編碼人胰島素類似物前體多肽的核酸分子包含如SEQ ID NO：3所示序列。
在一些實施方案中，編碼信號肽的核酸分子(SP)的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示： SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
在一些實施方案中，編碼目標多肽的核酸分子(GE)可以是編碼人胰島素類似物前體的核酸分子，其可以是B30位蘇胺酸缺失的人胰島素。人胰島素類似物前體的核酸分子序列如SEQ ID NO：3所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示： SEQ ID NO：3
SEQ ID NO：4
在一些實施方案中，編碼人胰島素類似物前體的核酸分子的88至96位(即GCTGCTAAG)為編碼連接肽(也稱C肽)的核酸分子，其可以被替代，包括但不限於如下的序列：GCCGCTAAG、GCTGCCAAG、GCTGCTAAA、GCCGCCAAG。
在一些實施方案中，編碼間隔肽的核酸分子(LS)的序列如SEQ ID NO：5所示：gaagaaggtgaaccaaag SEQ ID NO：5
在一些實施方案中，PS和/或P'S是編碼酶切位點的核酸分子；較佳的，PS是編碼EcoR I酶切位點的核酸分子，和/或P'S是編碼Not I酶切位點的核酸分子。
在一些實施方案中，提供能夠表達人胰島素類似物前體的核酸分子，其包含編碼間隔肽的核酸分子和編碼人胰島素類似物前體的核酸分子，能夠與包含信號肽的載體重組後表達人胰島素類似物前體。
在一些實施方案中，人胰島素類似物前體核酸分子編碼的人胰島素類似物前體胺基酸序列如下：EEGEPK-B(1-29)-AAK-A(1-21)
其中，“EEGEPK(SEQ ID NO：16)”可以是胰島素前體N端延伸，稱為間隔肽或前導肽；“B(1-29)”可以是缺失B30位蘇胺酸的人胰島素B鏈；“A(1-21)”可以是人胰島素A鏈胺基酸序列，“AAK”為連接B鏈和A鏈的連接肽，也稱為C肽。
在一些實施方案中，人胰島素類似物前體核酸分子的序列可以如SEQ ID NO：6所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示： SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：7
在一些實施方案中，提供另一種能夠表達人胰島素類似物前體的核酸分子，該序列中包含信號肽序列、間隔肽序列和編碼人胰島素類似物前體的序列，其能夠與不包含信號肽的載體重組後表達人胰島素類似物前體。
在一些實施方案中，表達人胰島素類似物前體的核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO：8所示，編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示： SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：9
在一些實施方案中，表達人胰島素類似物前體的核酸分子還可以連接酶切位點序列，該酶切位點較佳EcoR I酶切位點和Not I酶切位點。
在一些實施方案中，還提供了一種能夠在真核或原核細胞中表達的載體，其能夠在原核或真核細胞中分泌表達人胰島素類似物前體。
在一些實施方案中，還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞較佳為酵母菌，更較佳為畢赤酵母，其能夠分泌表達人胰島素類似物前體。
在一些實施方案中，還提供一種製備人胰島素類似物的方法，包括使用如前所述的核酸分子，載體，和/或宿主細胞。
該方法還可以包含如下步驟：1)藉由編碼人胰島素類似物前體的核酸分子在真核細胞中表達人胰島素類似物前體；2)藉由酶切處理人胰島素類似物前體得到人胰島素類似物，該編碼人胰島素類似物前體的核酸分子可以如SEQ ID NO：6所示，該酶切處理胰島素前體採用本領域技術人員公知的方法。
在一些實施方案中，步驟1)中包含用表達載體表達人胰島素類似物前體，所述的表達載體包含信號肽序列，該信號肽序列可以如SEQ ID NO：1所示。
在一些實施方案中，該人胰島素類似物為B30缺失的人胰島素，所述的人胰島素類似物進一步經過醯化基團的取代。
在一些實施方案中，該B30缺失的人胰島素在B29位的賴胺酸處被醯化基團取代。
較佳的，上述取代的取代產物為賴胺酸B29(Nε-(Nα-十六烷脂肪二酸-L-賴胺酸-Nε-氧代丁醯基))des(B30)人胰島素。
縮寫和術語
“密碼子優化”是指利用宿主細胞偏愛密碼子規則，使用偏愛密碼子並避免使用利用率低或稀有密碼子來合成基因。
“對照1”是“EEGEPK”的編碼核酸分子(雙下底線所示的GAAGAAGGTGAACCAAAG)與專利WO1998028429中的胰島素前體基因的編碼核酸分子相連，如下SEQ ID NO：10所示： SEQ ID NO：10
“對照2”是“EEGEPK”的編碼核酸分子(雙下底線所示)與Gurramkonda等人的文獻(Microbial Cell Factories,2010,9：31)中經優化的胰島素前體基因的編碼核酸分子相連，如下SEQ ID NO：11所示： SEQ ID NO：11
“IP-S”是經密碼子優化的胰島素前體基因對應的核酸分子。
“α-因子”是Invitrogen公司提供的pPIC9K表達載體帶有的α-因子信號肽基因對應的核酸分子，來源於釀酒酵母。
“α-因子-S”是經密碼子優化的α-因子信號肽基因對應的核酸分子。
“載體”包括核酸分子，其能夠運輸它連接的另一核酸，包括但不局限於質粒和病毒載體。某些載體能夠在其被引入的宿主細胞中自主複製，而其它載體可在引入宿主細胞時整合到宿主細胞的基因組中，並因此與該宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導有效連接到它們的基因的表達，此類載體此處稱作“重組表達載體”(或簡單地“表達載體”)，並且典型載體為本領域熟知。
“目標多肽”是能夠在酵母中表達的多肽，包括但不限於酶、抗體、干擾素、胰島素、白介素等及其變體、前體、中間體，例如可以是胰島素前體。
“細胞”、“宿主細胞”可互換使用。
“多核苷酸分子”、“核酸分子”可互換使用，其序列可以是DNA序列。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但並非限制本發明的範圍。
本發明實施例中所用的載體、宿主菌和培養基均購自Invitrogen公司，其中畢赤酵母表達載體pPIC9K含有醇氧化酶AOX1啟動子，可受甲醇誘導，該載體還含有α-因子信號肽序列，能夠分泌表達外源蛋白；畢赤酵母表達載體pPIC3.5K含有醇氧化酶AOX1啟動子，可受甲醇誘導，該載體不含有α-因子信號肽序列；宿主菌為畢赤酵母GS115菌株；培養基為畢赤酵母手冊提供的培養基配方。
實施例1 構建胰島素前體重組表達載體
將對照1(SEQ ID NO：10)、對照2(SEQ ID NO：11)、IP-S(SEQ ID NO：6)的5'端和3'端都分別加入EcoR I和Not I酶切位點，由南京金斯瑞生物科技公司進行合成，並將合成的核酸分子序列連接到T載體。
SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：11
用內切酶EcoR I和Not I將上述帶有胰島素前體核酸分子的T載體和表達載體pPIC9K進行雙酶切，之後採用膠回收試劑盒分別回收目標片段和載體片段，用T4連接酶將酶切純化後的目標片段分別與酶切純化後的載體pPIC9K進行連接。
將上述連接液分別轉化到大腸桿菌TOP10感受態細胞，塗布含胺苄青黴素的抗性平板，培養後，挑取純株菌提取質粒，雙酶切驗證，藉由驗證最終得到三種重組表達載體，分別含有對照1、對照2、IP-S的序列。
實施例2 畢赤酵母重組菌表達胰島素前體
將實施例1中構建的三種重組表達載體分別轉化到畢赤酵母GS115中，表達對照1和對照2的重組菌為對照菌株，表達IP-S的重組菌為實驗菌株。
將三種重組菌的菌落接種至5mL的YPD培養基中，30℃恆溫搖床250rpm振盪培養至OD600=10左右(16-18小時)。收集並重新懸浮細胞於50mL BMGY培養基中，30℃恆溫搖床250rpm振盪培養過夜，至OD600為30左右。1500rpm離心5分鐘收集細胞，用25mL BMMY培養基重新懸浮。在培養基中加入1/200體積的甲醇(終濃度為0.5%)，30℃恆溫搖床250rpm振盪培養96小時，其中每24小時補加1/200體積的甲醇。表達結束後，10,000rpm離心取上清，藉由HPLC檢測上清液中胰島素前體的產量，換算為 相對於對照菌株胰島素前體表達量的百分比，胰島素前體的表達量百分比如表1所示。
表1的數據顯示，經過優化的胰島素前體基因表達的胰島素前體量與兩個對照組相比提高到1.8到2.25倍，可見經過優化的胰島素前體基因有更好的表達效果，其表達的胰島素前體的產量顯著提高。
實施例3 構建融合了不同α-因子的胰島素前體基因的重組表達載體
在IP-S前分別加入α-因子(SEQ ID NO：12)和α-因子-S(SEQ ID NO：1)，融合後的核酸分子序列分別如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：8所示，進行合成，合成後的核酸分子的5'端和3'端分別帶有EcoR I和Not I酶切位點，並將合成的核酸分子連接到T載體。
SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：8
將對照1前分別加入α-因子(SEQ ID NO：12)和α-因子-S(SEQ ID NO：1)，融合後的核酸分子序列分別如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示，進行合成，合成後的核酸分子5'端和3'端分別帶有EcoR I和Not I酶切位點，並將合成的核酸分子連接到T載體。
SEQ ID NO：14
SEQ ID NO：15
用內切酶EcoR I和Not I將上述T載體和表達載體pPIC3.5K進行雙酶切，之後採用膠回收試劑盒分別回收目標片段和載體片段，用T4連接酶將酶切純化後的目標片段分別與酶切純化後的載體pPIC3.5K進行連接。
將上述連接液分別轉化到大腸桿菌TOP10感受態細胞，塗布含胺苄青黴素的抗性平板，培養後，挑取純株菌提取質粒，雙酶切驗證，藉由驗證最終得到四種重組表達載體，分別融合了α-因子信號肽和α-因子-S信號肽，表達不同核苷酸序列的胰島素前體基因。
實施例4 畢赤酵母重組菌表達優化前後的胰島素前體
將實施例3中構建的重組表達載體分別轉化到畢赤酵母GS115中。
將重組菌菌落接種至5mL的YPD培養基中，30℃恆溫搖床250rpm振盪培養至OD600=10左右(16-18小時)。收集並重新懸浮細胞於50mL BMGY培養基中，30℃恆溫搖床250rpm振盪培養過夜，至OD600為30左右。1500rpm離心5分鐘收集細胞，用25mL BMMY培養基重新懸浮。在培養基中加入1/200體積的甲醇(終濃度為0.5%)，30℃恆溫搖床250rpm振盪培養96 小時，其中每24小時補加1/200體積的甲醇。表達結束後，10,000rpm離心取上清，藉由HPLC檢測上清液中胰島素前體的產量。
將表達融合α-因子的對照1基因的重組菌作為對照菌，將其他菌株的胰島素前體產量換算為相對於對照菌株產量的百分比，如表2所示。
表2的數據顯示，僅信號肽優化的核酸分子序列表達胰島素前體的量提高到1.5倍，僅胰島素前體基因優化的核酸分子序列表達胰島素前體的量提高到2.25倍，而經信號肽和胰島素前體基因同時優化的核酸分子序列表達胰島素前體量提高到2.75倍。綜合以上，密碼子優化使得胰島素前體的表達量增加到1.5至2.75倍。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
<120> 一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因
<130> 719003CPCT
<150> CN201810131794.3
<151> 2018-02-09
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(255)
<223> 編碼信號肽的核酸分子
<400> 1
<210> 2
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(85)
<223> 信號肽
<400> 2
<210> 3
<211> 162
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(162)
<223> 編碼人胰島素類似物前體的核酸分子
<400> 3
<210> 4
<211> 53
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(53)
<223> 人胰島素類似物前體
<400> 4
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(18)
<223> 編碼間隔肽的核酸分子
<400> 5
<210> 6
<211> 180
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
<210> 7
<211> 59
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
<210> 8
<211> 435
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
<210> 9
<211> 144
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 9
<210> 10
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 編碼間隔肽的核酸分子
<400> 10
<210> 11
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 編碼間隔肽的核酸分子
<400> 11
<210> 12
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(255)
<223> 編碼α-因子的核酸
<400> 12
<210> 13
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(435)
<223> 編碼α-因子的核酸+編碼胰島素類似物前體的核酸
<400> 13
<210> 14
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(435)
<223> 編碼α-因子的核酸+編碼胰島素類似物前體的核酸
<400> 14
<210> 15
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(435)
<223> 編碼α-因子的核酸+編碼胰島素類似物前體的核酸
<400> 15
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(6)
<223> 間隔肽
<400> 16

Claims (23)

  1. 一種核酸分子，其包含具有以下通式的分子或結構：5'-(PS)a-(SP)b-(LS)c-GE-(P'S)d-3'，其中，PS是編碼加工位點的核酸分子，a是0或1；SP是編碼信號肽的核酸分子，b是1；LS是編碼間隔肽的核酸分子，c是0或1；GE是編碼目標多肽的核酸分子；P'S是編碼加工位點的核酸分子，d是0或1；該編碼信號肽的核酸分子包含如SEQ ID NO：1所示序列。
  2. 一種核酸分子，其包含具有以下通式的分子或結構：5'-(PS)a-(SP)b-(LS)c-GE-(P'S)d-3'，其中，PS是編碼加工位點的核酸分子，a是0或1；SP是編碼信號肽的核酸分子，b是0或1；LS是編碼間隔肽的核酸分子，c是0或1；GE是編碼人胰島素類似物前體多肽的核酸分子；P'S是編碼加工位點的核酸分子，d是0或1；該編碼人胰島素類似物前體多肽的核酸分子包含如SEQ ID NO：3所示序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的核酸分子，其中，該目標多肽是人胰島素類似物前體，編碼該人胰島素類似物前體的核酸分子包含編碼SEQ ID NO：4所示胺基酸序列的核酸分子。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的核酸分子，其中，編碼該人胰島素類似物前體的核酸分子包含如SEQ ID NO：3所示核酸序列。
  5. 如申請專利範圍第2項所述的核酸分子，其中編碼該信號肽的核酸分子包含編碼SEQ ID NO：2所示胺基酸序列的核酸分子。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的核酸分子，其中，編碼該信號肽的核酸分子包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12所示核酸序列。
  7. 如申請專利範圍第2至6項中任一項所述的核酸分子，其中，該編碼人胰島素類似物前體的核酸分子在相當於SEQ ID NO：3的第88-96位被替換。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的核酸分子，其中，該編碼人胰島素類似物前體的核酸分子在相當於SEQ ID NO：3的第88至96位被被GCCGCTAAG、GCTGCCAAG、GCTGCTAAA或GCCGCCAAG替換。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的核酸分子，其中，該間隔肽的胺基酸序列包含EEGEPK(Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys)。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的核酸分子，其中，該編碼間隔肽的核酸分子包含如SEQ ID NO：5所示序列。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的核酸分子，其包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15所示序列中的任意一個；或為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15所示序列中的任意一個。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的核酸分子，其中，該加工位點是連接酶切位點。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的核酸分子，其中，PS是編碼EcoR I酶切位點的核酸分子和/或P'S是編碼Not I酶切位點的核酸分子。
  14. 一種載體，其包含如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的核酸分子。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的載體，其是真核細胞表達載體或原核細胞表達載體。
  16. 一種宿主細胞，其含有申請專利範圍第1至13項中任一項任一項所述的核酸分子和/申請專利範圍第14或15項所述的載體。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的宿主細胞，其為酵母菌。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的宿主細胞，其為畢赤酵母。
  19. 一種製備人胰島素類似物的方法，包括使用申請專利範圍第1至13項中任一項所述的核酸分子，申請專利範圍第14或15項所述的載體，和/或申請專利範圍第16至18項中任一項所述的宿主細胞。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的方法，其還包括如下步驟：1)表達人胰島素類似物前體；2)酶切步驟1)獲得的人胰島素類似物前體，得到人胰島素類似物。
  21. 如申請專利範圍第19或20項所述的方法，該人胰島素類似物為B30缺失的人胰島素，和/或進一步經過醯化基團的取代。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中，該取代是B29位的賴胺酸被取代。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的方法，其中，該取代是取代的產物為賴胺酸B29(Nε-(Nα-十六烷脂肪二酸-L-賴胺酸-Nε-氧代丁醯基))des(B30)人胰島素。
TW108104187A 2018-02-09 2019-02-01 一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因 TW201934752A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810131794 2018-02-09
??201810131794.3 2018-02-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201934752A true TW201934752A (zh) 2019-09-01

Family

ID=67548783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108104187A TW201934752A (zh) 2018-02-09 2019-02-01 一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210032307A1 (zh)
EP (1) EP3750998A4 (zh)
JP (1) JP2021513330A (zh)
KR (1) KR20200119237A (zh)
CN (1) CN111094572B (zh)
AU (1) AU2019218315A1 (zh)
BR (1) BR112020015238A2 (zh)
CA (1) CA3086618A1 (zh)
MX (1) MX2020007929A (zh)
RU (1) RU2020128190A (zh)
TW (1) TW201934752A (zh)
WO (1) WO2019154311A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111560379B (zh) * 2020-05-26 2022-09-13 北京惠之衡生物科技有限公司 密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用
CN116751817B (zh) * 2023-05-29 2024-07-09 广东东阳光药业股份有限公司 检测胰岛素或其类似物的生物学活性的方法及试剂盒
CN117384275B (zh) * 2023-12-13 2024-03-15 北京科为博生物科技有限公司 胰岛素样生长因子突变体igf1m及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340772C (en) * 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
CN1056618C (zh) 1993-09-17 2000-09-20 诺沃挪第克公司 酰化的胰岛素和含有这种胰岛素的药物组合物
US5639642A (en) * 1994-06-16 1997-06-17 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
JP4187796B2 (ja) * 1996-12-20 2008-11-26 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵母で発現されたｎ末端伸長タンパク質
IL136770A0 (en) * 1998-01-23 2001-06-14 Novo Nordisk As Process for making desired polypeptides in yeast
AR025646A1 (es) * 2000-09-13 2002-12-04 Beta Lab Sa Cepa de levaduras metilotroficas recombinantes productoras de un precursor de insulina, construcciones de adn y metodo para obtener la cepa.
US7547821B2 (en) * 2003-06-17 2009-06-16 Sembiosys Genetics Inc. Methods for the production of insulin in plants
BRPI0413276B8 (pt) 2003-08-05 2021-05-25 Novo Nordisk As derivado de insulina, complexo de zinco do mesmo, e, composição farmacêutica
CN1873006A (zh) * 2005-05-30 2006-12-06 上海新生源医药研究有限公司 一种重组人胰岛素原的生产方法
KR101702342B1 (ko) * 2009-03-12 2017-02-03 빅텍 프라이빗 리미티드 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 및 이의 방법
AR087433A1 (es) * 2011-08-08 2014-03-26 Merck Sharp & Dohme Analogos de insulina n-glicosilados
JP6153206B2 (ja) * 2011-12-15 2017-06-28 シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッドＳｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． ヒト・インスリン類似体及びそのアシル化誘導体
CN114478747B (zh) 2016-08-02 2024-06-14 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人胰岛素或其类似物的酰化衍生物

Also Published As

Publication number Publication date
MX2020007929A (es) 2020-10-01
CN111094572B (zh) 2023-04-04
AU2019218315A1 (en) 2020-07-09
CN111094572A (zh) 2020-05-01
RU2020128190A (ru) 2022-03-09
WO2019154311A1 (zh) 2019-08-15
RU2020128190A3 (zh) 2022-03-09
KR20200119237A (ko) 2020-10-19
CA3086618A1 (en) 2019-08-15
US20210032307A1 (en) 2021-02-04
JP2021513330A (ja) 2021-05-27
EP3750998A4 (en) 2022-02-23
BR112020015238A2 (pt) 2020-12-29
EP3750998A1 (en) 2020-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102239183B (zh) 大量分泌的蛋白的筛选和它们作为融合配偶体在重组蛋白制备中应用
JP7014774B2 (ja) 組換えヒト血清アルブミンの高発現のための遺伝子工学操作された細菌の構築
JPH08333395A (ja) ヒトプロインスリン誘導体およびヒトインスリンの製造方法
EP3874047B1 (en) Carbon-source regulated protein production in a recombinant host cell
JP5860413B2 (ja) タンパク質のグリコシル化を低下させる方法、その産生方法およびタンパク質
TW201934752A (zh) 一種密碼子優化的人胰島素類似物前體基因和信號肽基因
JP2799348B2 (ja) 発現分泌ベクター
CN1279171C (zh) N端部份为蛭素衍生物的融合蛋白在生产酵母分泌的重组蛋白中的应用
EP1364030B1 (en) Supersecretable peptides, processes for their production, and parallel improvement of the secreted form of one or more other polypeptides
WO2020187270A1 (zh) 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途
Hou et al. High-level expression of fusion protein containing 10 tandem repeated GLP-1 analogs in yeast Pichia pastoris and its biological activity in a diabetic rat model
JP2021511792A (ja) 小胞体ターゲッティングシグナル
CN109852601B (zh) 一种可高效应用的n-糖基化褐藻胶裂解酶突变体及基因工程菌构建方法
KR100975153B1 (ko) Pdi를 융합파트너로 이용한 수용성 및 활성형 재조합단백질의 제조방법
JP6943841B2 (ja) メタノール資化性酵母由来新規タンパク質及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法
CN113462713B (zh) 提高胰高血糖素样肽六连体在毕赤酵母中表达水平的方法
US20240084084A1 (en) Promoter for yeast
WO2020200414A1 (en) Protein production in mut-methylotrophic yeast
JP2020513834A (ja) ペプチドの発現および大規模生産
KR102740997B1 (ko) 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템
RU2729353C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF646, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН АСПАРТ, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН АСПАРТ
RU2728611C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF265, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА
JP7570346B2 (ja) Ｍｕｔ－メチロトローフ酵母
RU2729357C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF267, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЛИЗПРО, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЛИЗПРО
RU2263147C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS05, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА ESCHERICHIA COLI, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS05, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pHINS05 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА