DE69522670T2

DE69522670T2 - Gefrorenes echo, verfahren zur speicherung von ultraschall-gassuspensionen

Info

Publication number: DE69522670T2
Application number: DE69522670T
Authority: DE
Inventors: Jean Brochot; Michel Schneider; Feng Yan
Original assignee: Bracco Research SA
Current assignee: Bracco Research SA
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2015-12-15
Also published as: EP0744962B2; DK0744962T4; CN1141001A; FI963202L; DE69522670T3; ATE205404T1; DK0744962T3; NO963327D0; IL116328A; CA2181340C; US5827504A; IL116328A0; ES2162943T3; CA2181340A1; ZA9510721B; KR970701066A; FI120722B; NZ295744A; PT744962E; CN1066965C

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Suspensionen von Gasbläschen, die innerhalb eines gefrorenen wässrigen Trägermediums immobilisiert sind. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der gefrorenen Gasbläschensuspensionen und deren Verwendung zur Herstellung von injizierbaren Suspensionen für eine Verwendung als Kontrastmittel für die bildgebende Ultraschalluntersuchung des menschlichen und tierischen Körpers.

Zugrundeliegender Stand der Technik

Die schnelle Entwicklung von Ultraschallkontrastmitteln in den letzten Jahren hat eine Anzahl von unterschiedlichen Formulierungen hervorgebracht, die bei der bildgebenden Ultraschalluntersuchung von Organen und Geweben des menschlichen oder tierischen Körpers nützlich sind. Diese Mittel sind so gestaltet, dass sie primär als intravenöse oder intraarterielle Injektionsmittel in Verbindung mit der Verwendung von medizinischen echographischen Geräten verwendet werden. Diese Instrumente kombinieren typischerweise B-Mode-Bilderzeugung (basierend auf der räumlichen Verteilung von Rückstreuungseigenschaften des Gewebes) und Doppler-Signalverarbeitung (basierend auf "Continuous Wave"- (Dauerstrich-) oder gepulster Doppler-Verarbeitung von Ultraschallechos, um Blut- oder Flüssigkeitsflussparameter zu bestimmen). Andere Ultraschallbilderzeugungsmethoden könnten in der Zukunft ebenfalls von diesen- Mitteln profitieren, wie die Ultraschallcomputertomographie (Ultrasound Computed Tomography, die die Dämpfung in Transmission misst) oder die Diffraktionscomputertomographie (Diffraction Computed Tomography, die Streuungs- und Dämpfungsparameter in schräger Reflexion misst). Basierend auf Suspensionen von Gas-Mikrobläschen in wässrigen flüssigen Trägern können diese injizierbaren Formulierungen grundsätzlich in zwei Kategorien eingeteilt werden: wässrige Suspensionen, in denen die Gas-Mikrobläschen durch die Gas/Flüssigkeits-Grenzfläche oder eine vergängliche Hülle, die die Moleküle der Flüssigkeit und eines grenzflächenaktiven Mittels lose gebunden an die Gas- Flüssigkeits-Grenzfläche umfasst, begrenzt werden, und Suspensionen, in denen die Mikrobläschen eine materielle Abgrenzung oder eine greifbare Hülle, gebildet aus natürlichen oder synthetischen Polymeren, aufweisen. In dem letztgenannten Fall werden die Mikrobläschen als Mikroballons bezeichnet. Es gibt noch eine andere Art von Ultraschallkontrastmitteln: Suspensionen von porösen Teilchen von Polymeren oder anderen Feststoffen, die Gas-Mikrobläschen enthalten, die innerhalb der Poren der Mikropartikel eingeschlossen sind. Diese Kontrastmittel werden hier als eine Variante des Mikroballon-Typs angesehen. Obwohl sie sich körperlich unterscheiden, sind beide Arten von Gas-Mikrobläschen, wenn sie sich in Suspension befinden, als Ultraschallkontrastmittel nützlich. Mehr über diese unterschiedlichen Formulierungen kann man in EP-A 0 077 752 (Schering), EP-A-0 123 235 (Schering), EP-A-0 324 938 (Widder et al.), EP-A-0 474 833 (Schneider et al.), EP-A-0 458 745 (Bichon et al.), US-A-4,900,540 (Ryan), US-A-5,230,882 (Unger) u. s. w. finden.
Bestimmte der oben erwähnten Ultraschallkontrastmittel sind entwickelt und kommerziell erhältlich, wohingegen sich andere in unterschiedlichen Stadien der klinischen Versuche befinden. Unabhängig davon, ob sie kommerziell erhältlich sind oder sich in klinischen Studien befinden, leiden diese Produkte jedoch alle an Problemen, die mit der Lagerung verbunden sind. Die Lagerungsprobleme sind inhärent für Suspensionen, die aufgrund ihrer ureigenen Natur eine Phasentrennung oder -segregation, Gasbläschenaggregation, Gasdiffusion und, nach langen Zeiträumen, sogar eine Präzipitation verschiedener Additive erfahren. Die Segregation der Gas-Mikrobläschen oder -Mikroballons resultiert aus der Tatsache, dass die Suspensionen typischerweise aus unkalibrierten Mikrobläschen, deren Größen von ungefähr 1 um bis ungefähr 50 um variieren, hergestellt werden. Es wird festgestellt, dass eine große Mehrzahl der Gasbläschen in den bekannten Suspensionen zwischen 1 um und ungefähr 10 um liegt.
Aufgrund der Mikrobläschen-Größenverteilung erfahren diese Suspensionen während der Lagerung eine Segregation, in welcher größe Mikrobläschen nach oben wandern, während die kleineren sich in den unteren Teilen konzentrieren, was oftmals zu einer vollständigen Phasentrennung führt. Versuche, dieses Problem durch die Verwendung von viskositätserhöhenden Mitteln zu lösen, haben gezeigt, dass die Segregationsgeschwindigkeit verringert, aber nicht eliminiert werden kann.
Die Aggregation von Gas-Mikrobläschen ist ein Prozess, während dem die größeren Bläschen die kleineren absorbieren, wodurch sie an Größe zunehmen. Mit einer Phasentrennung beschleunigt sich dieser Prozess und aus Suspensionen mit Mikrobläschen, die eine durchschnittliche Größe von z. B. zwischen 2 um und 8 um aufweisen, können sich nach einer Weile Suspensionen mit einer Mikrobläschengröße zwischen z. B. 5 um und 12 um oder größer entwickeln. Dies ist besonders unerwünscht in Fällen, wo Suspensionen von kalibrierten Mikrobläschen und Suspensionen, die für die Opakifikation des linken Herzens bestimmt sind, betroffen sind. Die Größenveränderung verändert nicht nur die echogenen Eigenschaften des Kontrastmittels, sondern macht das Mittel auch für bestimmte Anwendungen unanwendbar, wie jene, die auf dem Hindurchtreten der Mikrobläschen durch die Lungen basieren. Es ist unwahrscheinlich, dass Mikrobläschen mit Größen über 10 um durch die Lungenkapillaren hindurchgehen und dementsprechend sind solche Suspensionen zusätzlich dazu, dass sie gefährliche Zustände erzeugen, weniger geeignet für die Erzeugung von Bildern des linken Herzens. Ein anderes Problem mit Gassuspensionen und ihrer Lagerung resultiert aus der Gasdiffusion, die mit relativ geringen Geschwindigkeiten auftritt, sich aber mit einer Phasentrennung beschleunigt. Das unvermeidliche Austreten des Gases aus den Mikrobläschen-Suspensionen wird so weiter verschlimmert und kann in extremen Fällen zu einer vollständigen Verarmung des Mediums an Gas führen. Folglich führt die kombinierte Wirkung dieser verschiedenen Mechanismen der Zerstörung der Gassuspensionen daher zu einer sehr schnellen Zerstörung des Mittels.
Bei einigen Ansätzen der Ultraschall-Bilderzeugung besteht einer der wünschenswerten Aspekte dieser Kontrastmittel darin, dass die Mikrobläschen oder Gas enthaltenden Partikel innerhalb eines engen Größenfensters verteilt sind. Der Grund wird nachfolgend angegeben. Die Wirksamkeit dieser Mittel, den Kontrast in Bildern, die durch medizinische Ultrasonographiegeräte erzeugt werden, zu erhöhen, basiert primär auf der stark verstärkten Streuung der einfallenden Ultraschallenergie und zweitens auf modifizierten Dämpfungseigenschaften der Gewebe, die diese Mittel enthalten. Mit Kontrast ist ein Maß der relativen Signalamplitude gemeint, die aus Regionen erhalten wird, die von dem Kontrastmittel durchströmt werden sollen, verglichen mit der Signalamplitude aus Regionen, die das Kontrastmittel nicht erhalten. Mit Verstärkung wird eine Zunahme des Kontrastwerts gemeint, der nach einer Verabreichung des Kontrastmittels erhalten wird, verglichen mit dem Kontrast, der vor der Verabreichung beobachtet wird. Wie bereits früher erwähnt, ist der Typ von Bilderzeugungsvorrichtung, der von diesen Mitteln am direktesten profitiert, die Familie der echographischen Instrumente (B-Mode oder Doppler). Die unterschiedlichen Dämpfungseigenschaften von Geweben, die das Mittel enthalten, verglichen mit jenen, die das Mittel nicht enthalten, können auch ausgenutzt werden, um den diagnostischen Wert des bildgebenden Verfahrens zu verbessern. Darüber hinaus kann die Ultraschallfrequenzabhängigkeit sowohl der Streuungs- als auch der Dämpfungseigenschaften des Mittels ausgenutzt werden, um die räumliche Gewebeunterscheidung weiter zu verbessern. In diesen Fällen hängen die physikalischen Gesetze, die diese Frequenzabhängigkeit steuern, systematisch von der Mikrobläschen- oder Partikelgröße ab. Folglich sind die verwendeten Algorithmen effizienter, wenn sie an Echos zum Einsatz kommen, die von Mikrobläschen oder Partikeln mit einer engen Größenverteilung stammen. Als ein Beispiel nutzt ein solcher Ansatz die nicht-lineare Oszillation von Mikrobläschen aus, um Echo-Frequenzkomponenten bei der zweiten Oberschwingung der Anregungsgrundfrequenz nachzuweisen. Da die das Kontrastmittel nicht enthaltenden Gewebe nicht das gleiche nichtlineare Verhalten wie die Mikrobläschen zeigen, ist dieses Verfahren in der Lage, den Kontrast zwischen den Regionen, die das Kontrastmittel enthalten, und jenen, die das Kontrastmittel nicht enthalten, signifikant zu verstärken. Diese Verstärkung ist für eine gegebene Partikelanzahl pro Einheitsvolumen stärker ausgeprägt, wenn die Größen eng verteilt sind. Jedoch ist die Herstellung von Produkten mit solch engen Größenverteilungen zeitaufwändig; das Bereitstellen eines jederzeit verfügbaren Vorrats dieser kalibrierten Suspensionen würde die weitere Entwicklung und Verwendung dieser Technik stark vereinfachen. Eine verlässliche Lagerung solcher Präparationen mit unveränderten Größenverteilungen ist also ebenfalls von großem Interesse.
Mit weiteren Schwierigkeiten bei der Lagerung von wässrigen Gassuspensionen wird man bei Ultraschallkontrastmitteln, die Phospholipide als Stabilisatoren der Gas-Mikrobläschen enthalten, konfrontiert. Aufgrund einer Hydrolyse der Phospholipide wird die Konzentration des Stabilisators (Tensid) während der Lagerung fortwährend vermindert, was einen Verlust des Mikrobläschengehalts und einen Abbau der echogenen Eigenschaften der Suspension verursacht. Folglich bleibt das Problem der Lagerung von Ultraschallkontrastmitteln, die Gas-Mikrobläschen-Suspensionen enthalten, offen.
Eine kalte Lagerung von wässrigen Gassuspensionen durch Einfrieren ist seit einiger Zeit in der Lebensmittelindustrie bekannt. Beispielsweise offenbart US-A-4,347,707 (General Foods Corp.) die Lagerung von mit Gas beladenem Eis mit hohem Gasgehalt und guter Lagerungsstabilität durch ein Verfahren, in dem das mit Gas beladene Eis hergestellt wird, indem eine wässrige Flüssigkeit mit Hydrat-bildenden Gasen in Berührung gebracht wird, unter einem solchen Druck und bei einer solchen Temperatur, dass der in der Flüssigkeit suspendierte Gas- Hydrat-Komplex gebildet wird, und die Temperatur und der Druck in kontrollierbarer Weise verringert werden, um z. B. kohlensäurehaltiges Eis mit 85-110 ml CO&sub2;/g zu erzeugen. Gemäß dem Dokument hat das mit Gas beladene Eis einen hohen Gasgehalt, eine verlängerte Lagerungsstabilität, ist für einen kommerziellen Vertrieb in gefrorenem Zustand geeignet und erzeugt, wenn es in Wasser gegeben wird, kräftiges Aufwallen.
Es folgt, dass das Einfrieren der Gassuspensionen, um sie für verlängerte Zeiträume zu lagern und die aufbewahrten Suspensionen wiederzuverwenden, wenn dies notwendig wird, für Ultraschallkontrastmittel nicht geeignet sein würde, da das suspendierte Gas eine Tendenz zeigt, während des Auftauens aus dem Trägermedium zu entweichen. Eine weitere Schwierigkeit mit den gefrorenen Gassuspensionen von Mikrobläschen liegt in der Tatsache, dass die Ausdehnung des Trägermediums während des Einfrierens interne Kräfte erzeugt, die die Mikrobläschenhülle einfach zerstören oder aufbrechen und so das eingeschlossene Gas freisetzen und dieses entweder während der Lagerung oder später während des Auftauens der Suspension entweichen lassen. Dieses Problem ist besonders schwerwiegend bei Suspensionen von Mikrobläschen, die stoffliche oder greifbare Hüllen aufweisen.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz zusammengefasst, betrifft die Erfindung gefrorene Suspensionen von Gasbläschen, die innerhalb eines gefrorenen wässrigen Trägermediums immobilisiert sind, wobei das die Gasbläschen zusammen mit gewöhnlichen Additiven enthaltende Trägermedium ein physiologisch verträglicher Träger ist. Die immobilisierten Gasbläschen sind Mikrobläschen, die durch eine vergängliche Hülle oder eine greifbare Membran begrenzt werden, und die Suspensionen können, wenn sie in flüssiger Form vorliegen, in Lebewesen injiziert werden und sind als Kontrastmittel für die bildgebende Ultraschalluntersuchung oder -diagnostik des Blutpools und von Gewebe von menschlichen und tierischen Patienten nützlich.
Gemäß der Erfindung liegen die Temperaturen der gefrorenen Suspensionen zwischen -1ºC und -196ºC, vorzugsweise zwischen -10ºC und -76ºC, wobei die Größe der Gas-Mikrobläschen unter 10 um liegt. Besonders nützlich sind Suspensionen, in denen die Größe der Mikrobläschen zwischen 2 um und 9 um liegt, während die Suspensionen von Mikrobläschen mit einer Größe zwischen 3 um und 5 um sogar noch nützlicher sind.
Angesichts des Unterschieds hinsichtlich der biologischen Abbaubarkeit zwischen den Suspensionen, die Gas-Mikroballons oder Mikrobläschen mit einer greifbaren Hülle, wobei die Membran aus synthetischem oder natürlichem Polymer oder Protein hergestellt ist, enthalten, und den Suspensionen, die Gas-Mikrobläschen mit vergänglichen Hüllen umfassen, sind die gefrorenen Suspensionen der Letztgenannten vorteilhafter, insbesondere wenn lamellare Phospholipide in Form von ein- oder mehrmolekularen Membranschichten verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen der gefrorenen Mikrobläschen-Suspensionen, in dem die flüssige Suspension der Mikrobläschen in eine Kühlvorrichtung plaziert wird, Mikrobläschen innerhalb des Trägermediums durch Kühlen auf eine Temperatur zwischen -1ºC und -196ºC und mehr, bevorzugt zwischen -10ºC und -76ºC immobilisiert werden und die Gefrierbedingungen für verlängerte Zeiträume beibehalten werden. Gegebenenfalls können die gefrorenen Suspensionen in einer Atmosphäre eines inerten Gases oder einer Mischung von Gasen, von denen mindestens eines das in den Mikrobläschen verkapselte Gas ist, aufbewahrt werden. Das Gas wird vorzugsweise aus Halogen enthaltenden Gasen, Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid oder Mischungen davon ausgewählt.
Die Verwendung der gefrorenen Suspensionen der Erfindung zur Herstellung von injizierbaren Suspensionen für die Ultraschallechographie-Bilderzeugung oder -Diagnostik von Organen und Geweben und die Herstellung von Ultraschallkontrastmitteln werden ebenfalls offenbart.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm der Veränderung der Bläschenkonzentration (Anzahl) in aufgetauten Suspensionen von SF6 und 5% C&sub5;F&sub1;&sub2; enthaltenden Luft-Mikrobläschen in einem wässrigen Trägermedium als Funktion der Lagerungstemperatur.
Fig. 2 ist ein Diagramm der Veränderung des gesamten Gasvolumens von aufgetauten Suspensionen von SF6 und 5% C&sub5;F&sub1;&sub2; enthaltenden Luft-Mikrobläschen in einem wässrigen Trägermedium als Funktion der Lagerungstemperatur.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Veränderung der Absorption von aufgetauten Mikrobläschen-Suspensionen als Funktion des angelegten äußeren Drucks und der Lagerungstemperatur.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Veränderung der relativen Absorption als Funktion des an aufgetaute Suspensionen angelegten äußeren Drucks nach Lagerung bei verschiedenen Temperaturen zeigt.
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Mikrobläschengrößenverteilung hinsichtlich Anzahl (Fig. 5A) und Gasvolumen (Fig. 5B) von kalibrierten Mikrobläschen mit einer durchschnittlichen Größe von 3 um, 4 um und 6 um zeigt.
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Mikrobläschengrößenverteilung hinsichtlich Anzahl (Fig. 6A) und Gasvolumen (Fig. 6B) für eine Probe von nicht-kalibrierten Mikrobläschen zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß der Erfindung wird eine gefrorene Suspension von Gas- Mikrobläschen bereitgestellt, in der Mikrobläschen, die Gase oder Gasmischungen mit Siedepunkten, die unter -18ºC liegen, enthalten, innerhalb eines gefrorenen wässrigen Trägermediums, das zusätzlich zu den Mikrobläschen gewöhnliche Additive enthält, immobilisiert sind. Der wässrige Träger ist physiologisch verträglich und die Suspension kann, wenn sie in einer flüssigen Form vorliegt, in Lebewesen injiziert werden und ist als Ultraschallkontrastmittel zur Erzeugung von Bildern vom Blutpool und von Geweben von menschlichen und tierischen Patienten nützlich. Die durch eine vergängliche Tensid-Gas/Flüssigkeits-Hülle oder eine greifbare Membran, hergestellt aus synthetischem oder natürlichem Polymer oder Protein, begrenzten Mikrobläschen sind zwischen Molekülen des gefrorenen Trägermediums, dessen Temperatur zwischen -1ºC und -196ºC, vorzugsweise zwischen -10ºC und -76ºC liegt, eingeschlossen. Der genaue verwendete Temperaturbereich hängt von der Wahl des Gases in den Mikrobläschen ab, aber auch von der Art und der Menge der verwendeten Additive. So kann beispielsweise im Falle von Luft oder Stickstoff die Temperatur irgendwo zwischen -1ºC und -196ºC liegen, wohingegen im Falle von C&sub4;F&sub8; die Temperatur zwischen -1ºC und -5ºC liegen wird. Wenn Polyoxypropylen/Polyoxyethylen-Copolymere oder Polyethylenglycol als Additive verwendet werden, kann die höchste akzeptable Temperatur abhängig von der in der Suspension vorhandenen Gesamtmenge anstelle von -1ºC -5ºC oder sogar -10ºC sein.
Die Größe des Hauptteils der Mikrobläschen in der Suspension liegt unter 10 um.
Für die meisten Anwendungen würden die Suspensionen mit Mikrobläschen, die eine Größenverteilung zwischen 2 um und 9 um aufweisen, die Erfordernisse erfüllen; wenn es sich jedoch um Suspensionen von kalibrierten Mikrobläschen handelt, können die Größen irgendwo in jenem Bereich liegen. Beispielsweise zwischen 2-4 um, 3-5 um, 4-6 um, 5-7 um, 6-8 um, 7-9 um, jedoch sind die Mikrobläschen mit dem Größenbereich zwischen 3 um und 5 um bevorzugt.
So stellt die Erfindung auch gefrorene Suspensionen von Mikrobläschen mit einer sehr engen Größenverteilung bereit.
Typische Mikrobläschengrößenverteilungen von Suspensionen von kalibrierten Mikrobläschen sind, die in Fig. 5 gezeigten, wo die Verteilungen als Mikrobläschenanzahlverteilung (wie durch einen Coulter-Zähler bestimmt), Fig. 5A, und als Mikrobläschenvolumenverteilung (wie durch einen Coulter-Zähler bestimmt), Fig. 5B, angegeben sind. Im Gegensatz zu Suspensionen, die kalibrierte Mikrobläschen enthalten, werden die nicht-kalibrierte Gasbläschen enthaltenden Suspensionen typischerweise Anzahl- und Volumengrößenverteilungsmuster aufweisen, die den in den Fig. 6A & 6B gezeigten ähnlich sind. Aus diesen Figuren wird leicht ersehen, dass die echographischen Antworten von Suspensionen, die aus kalibrierten Gas- Mikrobläschen hergestellt worden sind, gleichförmiger sind, weniger Streuung und folglich schärfere Bilder ergeben als die Suspensionen mit nicht-kalibrierten Mikrobläschen. Wie bereits erwähnt, sind diese kalibrierten Suspensionen sehr wünschenswert, aber ihre Verwendung war bisher sehr begrenzt. So sind diese wünschenswerten Suspensionen jetzt durch eine einfache Umwandlung von gefrorenen Suspensionen leicht erhältlich, die bei niedrigen Temperaturen für verlängerte Zeiträume ohne übermäßigen Verlust ihrer anfänglichen Echogenität gelagert werden können.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung resultiert aus der Tatsache, dass, um Echo-Signalkomponenten bei der doppelten Grundfrequenz zu erzeugen, die Bilderzeugung ausgehend von der zweiten Oberschwingung eine nicht-lineare Oszillation des Kontrastmittels erfordert. Ein solches Verhalten erfordert, dass das Ultraschallanregungsniveau einen bestimmten akustischen Schwellenwert bei einer bestimmten Tiefe im Gewebe überschreitet. Während einer nicht-linearen Oszillation findet eine Frequenzkonversion statt, die die Konversion der akustischen Energie von der Anregungsgrundfrequenz hinauf zu deren zweiter Oberschwingung bewirkt. 50 machen signifikante Energien, die während dieses Typs der Bilderzeugung auf die Mikrobläschen übertragen werden, Mikrobläschen erforderlich, die ausreichend widerstandsfähig sind, um diese Bedingungen zu überstehen. Die Erfindung ermöglicht einen leichten und bequemen Zugang zu Suspensionen, die Mikrobläschen mit guter Widerstandsfähigkeit gegenüber Druckvariationen aufweisen, da sie jetzt vorab hergestellt, gelagert und, wenn benötigt, verwendet werden können.
Wie bereits erwähnt, enthalten die gefrorenen Suspensionen der Erfindung zusätzlich zu den Gas-Mikrobläschen Additive, die verschiedene Tenside, viskositätserhöhende Mittel, Stabilisatoren u. s. w. umfassen. Tenside, die filmbildende und nichtfilmbildende Tenside umfassen können, umfassen Fhospholipide in lamellarer oder laminarer Form, die bekanntermaßen die vergängliche Gas/Flüssigkeits-Hülle der Mikrobläschen stabilisieren. Die lamellaren Phospholipide können in Form von ein- oder mehrmolekularen Membranschichten oder Liposomen vorliegen. Abhängig von dem Typ von Mikrobläschen, d. h. mit einer vergänglichen Hülle oder einer greifbaren Membran, kann das Trägermedium als Additive hydratisierende Mittel und/oder hydrophile Stabilisatorverbindungen, wie Polyethylenglycol, Kohlenhydrate, wie Galactose, Lactose oder Saccharose, Dextran, Stärke und andere Polysaccharide, oder andere herkömmliche Additive, wie Polyoxypropylenglycol und Polyoxyethylenglycol und deren Copolymere; Ether von Fettalkoholen mit Polyoxyalkylenglycolen; Ester von Fettsäuren mit polyoxyalkyliertem Sorbitan; Seifen; Glycerolpolyalkylenstearat; Glycerolpolyoxyethylenricinoleat; Homo- und Copolymere von Polyalkylenglycolen; polyethoxyliertes Sojabohnenöl und Rizinusöl wie auch hydrierte Derivate; Ether und Ester von Saccharose oder anderen Kohlenhydraten mit Fettsäuren, Fettalkohole, wobei diese gegebenenfalls polyoxyalkyliert sind; Mono-, Di- und Triglyceride von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren. umfassen; Glyceride von Sojabohnenöl und Saccharose können ebenfalls verwendet werden. Die Tenside können filmbildend oder nichtfilmbildend sein und können polymerisierbare amphiphile Verbindungen des Typs von Linoleyllecithinen oder Polyethylendodecanoat umfassen. Vorzugsweise sind die Tenside filmbildend und sind insbesondere Phospholipide, ausgewählt aus Phosphatidsäure, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol, Cardiolipin, Sphingomyelin und Mischungen davon. Zusätzlich zu den erwähnten filmbildenden Tensiden können die Suspensionen ferner bis zu 50 Gew.-% nicht-laminare Tenside, ausgewählt aus Fettsäuren, Estern und Ethern von Fettsäuren und Alkoholen mit Polyolen, wie Polyalkylenglycolen, polyalkylenierten Zuckern und anderen Kohlenhydraten und polyalkyleniertem Glycerol, enthalten. Besonders geeignete Substanzen umfassen Dicetylphosphat, Cholesterol, Ergosterol, Phytosterol, Sitosterol, Lanosterol, Tocopherol, Propylgallat» Ascorbylpalmitat und butyliertes Hydroxytoluol.
Es versteht sich, dass die Erfindung nicht nur auf die Suspensionen von Gas-Mikrobläschen mit einer vergänglichen Hülle beschränkt ist. Jegliche geeignete Partikel, die mit Gasen gefüllt sind, wie poröse Partikel, Liposome oder Mikroballons, die eine aus Phospholipiden, synthetischen oder natürlichen Polymeren oder Proteinen hergestellte Hülle aufweisen, können in geeigneter Weise verwendet werden. So ist ermittelt worden, dass mit Albumin hergestellte Mikroballons oder Liposomenvesikel im gefrorenen Zustand erfolgreich über verlängerte Zeiträume hinweg gelagert werden können. Aufgetaute Suspensionen, die diese Mikroballons enthalten, haben akzeptable Echogenitäten gezeigt, was einen relativ geringen Verlust von Mikrobläschen zeigt. Suspensionen, in denen die Mikrobläschen mit Sorbitol oder nicht-ionischen Tensiden, wie Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Copolymeren (kommerziell als Pluronic® bekannt) stabilisiert wurden, haben nach einer Lagerung ein gleich gutes Bilderzeugungsvermögen gezeigt.
Die für die Suspensionen der Erfindung verwendeten Additive können ferner viskositätserhöhende Mittel und/oder Stabilisatoren, die aus linearen und vernetzten Poly- und Oligosacchariden, Zuckern, hydrophilen Polymeren und iodierten Verbindungen ausgewählt werden, umfassen. In einem solchen Fall liegt das Gewichtsverhältnis dieser Verbindungen zu den Tensiden zwischen 1 : 5 und 100 : 1.
Die erfindungsgemäßen und mit verschiedenen Gasen oder Gasmischungen hergestellten Suspensionen enthalten üblicherweise 10&sup7;-10&sup8; Mikrobläschen/ml, 10&sup8;-10&sup9; Mikrobläschen/ml oder 10&sup9;-10¹&sup0; Mikrobläschen/ml. Diese Konzentrationen bleiben nach verlängerter Lagerung, d. h. mehreren Monaten, praktisch die gleichen, und wenn Suspensionen mit SF&sub6;, C&sub3;F&sub8; oder deren Mischungen oder Mischungen von Luft mit SF&sub6; oder C&sub5;F&sub1;&sub9; hergestellt werden, verändern sie sich sogar nach wiederholten Einfrier-und-Auftau-Zyklen nicht.
Wenn die Mikrobläschen in der Suspension eine greifbare Membran aufweisen, ist die Membran aus synthetischem oder natürlichem Polymer oder Protein hergestellt. Das Polymer, das die Hülle oder Bindungsmembran der injizierbaren Mikroballons bildet, kann aus den meisten hydrophilen, biologisch abbaubaren, physiologisch verträglichen Polymeren ausgewählt werden. Unter solchen Polymeren kann man Polysaccharide von geringer Löslichkeit in Wasser, Polylactide und Polyglycolide und deren Copolymere, Copolymere von Lactiden und Lactonen, wie E-Caprolacton, ä-Valerolacton und Polypeptide aufführen. Die große Vielseitigkeit bei der Auswahl von synthetischen Polymeren ist hier von Vorteil, da man, wie beispielsweise bei allergischen Patienten, vielleicht wünscht, eine Verwendung von aus natürlichen Proteinen (Albumin, Gelatine) hergestellten Mikroballons zu vermeiden. Andere geeignete Polymere umfassen Poly- (ortho)ester, Copolymere von Milch- und Glycolsäure, Poly(DLlactid-co-δ-caprolacton), Poly(DL-lactid-co-δ-valerolacton), Poly(DL-lactid-co-g-butyrolacton), Polyalkylcyanoacrylate; Polyamide, Polyhydroxybutyrat; Polydioxanon; Poly-β-aminoketone, Polyphosphazene und Polyanhydride. Polyaminosäuren, wie Folyglutamin- und Polyasparaginsäuren können auch verwendet werden wie auch deren Derivate, d. h. partielle Ester mit niederen Alkoholen oder Glycolen. Ein nützliches Beispiel solcher Polymere ist Poly(tert.-butylglutamat).
Wenn die Membran aus proteinartigem Material hergestellt wird, ist das Protein Albumin.
Obwohl in Verbindung mit geeigneten Tensiden und Stabilisatoren Halogen enthaltende Gase, Luft, Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid allein verwendet werden können, ist unlängst auch die Verwendung von Mischungen der Halogen enthaltenden Gase mit Luft, Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid vorgeschlagen worden. Die Halogen enthaltenden Gase sind Gase, ausgewählt aus Schwefelhexafluorid, Tetrafluormethan, Chlortrifluormethan, Dichlordifluormethan, Bromtrifluormethan, Bromchlordifluormethan, Dibromdifluormethan, Dichlortetrafluorethan, Chlorpentafluorethan, Hexafluorethan, Hexafluorpropylen, Octafluorpropan, Hexafluorbutadien, Octafluor-2-buten, Octafluorcyclobutan, Decafluorbutan, Perfluorcyclopentan, Dodecafluorpentan oder Mischungen davon, und vorzugsweise Schwefelhexafluorid, Tetrafluormethan, Hexafluorethan, Hexafluorpropylen, Octafluorpropan, Hexafluorbutadien, Octafluor- 2-buten, Octafluorcyclobutan, Decafluorbutan, Perfluorcyclopentan, Dodecafluorpentan.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von gefrorenen Mikrobläschen-Suspensionen, in welchem die flüssige Suspension der Mikrobläschen in eine Kühlvorrichtung, wie einen Kühlschrank, plaziert wird, Mikrobläschen innerhalb des Trägermediums durch Kühlen auf eine Temperatur zwischen -1ºC und -196ºC und mehr bevorzugt zwischen -10ºC und -76ºC immobilisiert werden und die Gefrierbedingungen für verlängerte Zeiträume aufrechterhalten werden. Gegebenenfalls wird die gefrorene Suspension in einer Atmosphäre eines inerten Gases oder einer Mischung von Gasen, von denen mindestens eines das in den Mikrobläschen verkapselte Gas ist, aufbewahrt. Das Gas wird vorzugsweise aus Halogen enthaltenden Gasen, Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid oder Mischungen davon ausgewählt.
Es ist ermittelt worden, dass Gase oder Gasmischungen, die für die gefrorene Suspension der Erfindung verwendet werden, Siedepunkte haben sollten, die unter -18ºC liegen. Dies bedeutet, dass mit halogenierten Gasen, wie C&sub4;F&sub8; und C&sub5;F&sub1;&sub0;, allein hergestellte Suspensionen sehr schlechte Lagerungsstabilität haben werden und praktisch ihre gesamte Echogenität nach dem Einfrieren verlieren werden. Dies war besonders überraschend, da alle anderen halogenierten Gase sehr stabile gefrorene Suspensionen erzeugten, die mehrere Einfrier/Auftau-Zyklen ohne einen signifikanten Verlust von Echogenität überstanden. Sogar ein "Dopen" dieser Gase mit geringen Mengen anderer halogenierter Gase oder sogar Dämpfen von halogenierten Substanzen, die bei Raumtemperaturen Flüssigkeiten sind, wie C&sub5;F&sub1;&sub2;, hat Mischungen erzeugt, die nicht gefroren gelagert werden konnten. Andererseits hat ein Mischen von Luft mit bestimmten Mengen dieser Gase Suspensionen erzeugt, die sehr gute Lagerungsstabilität und sehr gute Echogenität nach mehreren Einfrier/Auftau-Zyklen aufwiesen.
Wie oben erwähnt, sind die gefrorenen Suspensionen der Erfindung als Kontrastmittel für die Ultraschallbilderzeugung oder -diagnostik von Organen und Gewebe nützlich. Selbstverständlich werden die Suspensionen vor einer Verwendung aufgetaut und gegebenenfalls eine Zeit lang bei Raumtemperatur gehalten und dann dem Patienten verabreicht. Der Patient wird dann mit einer Ultraschallsonde gescannt und es wird ein Bild des gescannten Bereichs erzeugt.
Ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegt ein Verfahren zur Herstellung von injizierbaren Ultraschallechographiekontrastmitteln aus den gefrorenen Suspensionen der Erfindung. Mit der Herstellung ist gemeint, dass ziemlich konzentrierte Suspensionen (z. B. 10¹&sup0;-10¹¹ Mikrobläschen/ml oder mehr) von kalibrierten oder nicht-kalibrierten Mikrobläschen in einem gefrorenen Zustand für einen Zeitraum gelagert werden und aufgetaute Suspensionen, wenn sie benötigt werden, gegebenenfalls auf die gewünschte Konzentration durch Zugabe der gleichen oder einer unterschiedlichen physiologisch verträglichen Trägerlösung verdünnt werden. Es wird auch in Betracht gezogen, dass an diesem Punkt weitere Additive oder Konditioniermittel zugesetzt werden können.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht:

Beispiel 1

Achtundfünfzig Milligramm Diarachidoylphosphatidylcholin (DAPC), 2,4 mg Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA), beide von Avanti Polar Lipids (USA), und 3,94 g Polyethylenglycol (PEG 4000 von Siegfried) wurden bei 60ºC in tert.-Butanol (20 ml) in einem Glasrundkolben gelöst. Die klare Lösung wurde schnell auf -45ºC abgekühlt und lyophilisiert. Aliquots (25 mg) des erhaltenen weißen Kuchens wurden in 10 ml-Glasampullen gefüllt. Die Ampullen wurden mit Gummistopfen verschlossen, evakuiert und mit ausgewählten Gasen oder Gasmischungen (siehe Tabelle 1) gefüllt. Kochsalzlösung (0,9% NaCl) wurde dann durch die Stopfen hindurch eingespritzt (5 ml pro Ampulle) und die Lyophilisate wurden durch kräftiges Schütteln gelöst. Die Mikrobläschen-Suspensionen wurden in einen Kühlraum (-18ºC) gestellt. Drei Tage später wurden sie bei Raumtemperatur (23ºC) aufgetaut und hinsichtlich der Bläschenkonzentration (durch Verwendung eines Coulter-Multisizer) und Absorption einer 1/50-Verdünnung bei 700 nm analysiert. Die Absorption bei 700 nm ist ein Maß der Gesamttrübung der Bläschensuspension. TABELLE 1
* ausgedrückt als Bunsch-Koeffizient
Die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass die Stabilität gegenüber dem Einfrieren von dem Siedepunkt und der Löslichkeit des Gases in Wasser abhängt. Im Falle von Gasen mit Siedepunkten über -18ºC wurden weniger Bläschen rückgewonnen. Hinsichtlich der Gase mit Siedepunkten unter -18ºC ist die Rückgewinnung von Bläschen umso höher, je niedriger die Löslichkeit in Wasser ist. Es ist auch interessant, festzuhalten, dass die Zugabe einer geringen Menge eines hochmolekularen Gases mit geringer Löslichkeit in Wasser, wie Dodecafluorpentan (C&sub5;F&sub1;&sub2;) die Rückgewinnung von Bläschen nach dem Auftauen im Falle von Gasen mit niedrigen Siedepunkten verbessert, nicht aber für Gase mit Siedepunkten über -18ºC.
Schließlich haben mit C&sub4;F&sub8; und C&sub4;F&sub1;&sub0; gefüllte Mikrobläschen allein oder in Mischungen mit geringen Mengen von Dodecafluorpentan sehr geringe Stabilität gegenüber dem Einfrieren/Auftauen. Wenn diese Gase jedoch in Kombination mit Luft verwendet werden, zeigen Suspensionen von Mikrobläschen, die die Mischungen enthalten, bessere Ergebnisse hinsichtlich der Echogenität oder des Mikrobläschenverlusts als die Luft-Mikrobläschen enthaltenden Suspensionen.

Beispiel 2

Suspensionen von SF&sub6;-Mikrobläschen, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden waren, wurden langsam (ungefähr 30 min) auf -18ºC oder schnell (innerhalb von einer Minute) auf -45ºC eingefroren. Andere Suspensionen von SF&sub6;-Mikrobläschen wurden vor dem Einfrieren zuerst bei Raumtemperatur gehalten, bis alle Bläschen an die Oberfläche gestiegen waren. Andere wurden eingefroren, während die Bläschen homogen in der Lösung verteilt waren. Die gefrorenen Suspensionen wurden einen Monat bei -18ºC und -45ºC gelagert und dann aufgetaut. TABELLE 2
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass die Geschwindigkeit des Einfrierens einen relativ geringen Einfluss auf das Endergebnis hat. Die Rückgewinnung im Falle von homogenen Suspensionen ist besser als im Falle von Suspensionen von dekantierten Mikrobläschen.

Beispiel 3

Multilamellare Liposome (MLVs) wurden hergestellt, indem 4,5 g hydriertes Sojabohnen-Phosphatidylcholin (HSPC von Nattermann) und 0,5 g Dicetylphosphat (Fluka, Schweiz) in Chloroform-Methanol (2/l) gelöst wurden, dann die Lösemittel in einem Rundkolben unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bis zur Trockene eingedampft wurden. Der zurückbleibende Lipidfilm wurde in einem Vakuumexsiccator getrocknet. Nach Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser wurde die Suspension unter Bewegung 30 min bei 70ºC inkubiert. Die Liposomensuspension wurde durch Zugabe von destilliertem Wasser auf eine Lipidendkonzentration von 25 mg pro ml eingestellt.
Ein Aliguot der Liposomensuspension (100 ml) wurde in einen gasdichten Glasreaktor, der mit einer mechanischen Hochgeschwindigkeitsemulgiermaschine (Polytron) ausgestattet war, eingefüllt. Die Gasphase in dem Reaktor war Luft, die 5% C&sub5;F&sub1;&sub2; enthielt (wie durch Dichtemessung bestimmt). Nach Homogenisierung (10000 Upm, 1 min) wurde die erhaltene milchartige Suspension in einen Scheidetrichter eingefüllt. Nach 6 h konnte eine weiße Phase von Bläschen auf der Lösung festgestellt werden. Die untere (Liposomen enthaltende) Phase wurde entfernt, eine geringe Menge frisches Wasser wurde zugesetzt und die Mikrobläschenphase wurde erneut homogenisiert. Die Prozedur (Dekantation) wurde wiederholt und es wurden vier Proben mit unterschiedlichen Mikrobläschengrößen hergestellt (siehe WO94/09829). Die Proben wurden bei -18ºC eingefroren und 24 h später auf Raumtemperatur aufgetaut. TABELLE 3
An den erhaltenen Ergebnissen (Tabelle 3) zeigt sich, dass die Einfrier/Auftau-Behandlung keinen Einfluss auf den mittleren Mikrobläschendurchmesser hat. Aus den Experimenten zeigt sich, dass Mikrobläschen mit größerem Durchmesser (> 2,5 um) die Einfrier/Auftau-Behandlung besser überstehen als Mikrobläschen mit kleinerem Durchmesser. Es wird des weiteren beobachtet, dass in bestimmten Fällen die Auftaugeschwindigkeit die Endkonzentration der Mikrobläschen, die in der Probe vorhanden ist, beeinflussen könnte. Die genaue Beziehung ist noch unklar, jedoch gibt es Hinweise darauf, dass der Verlust von Mikrobläschen umgekehrt proportional zur Auftaugeschwindigkeit ist. Vorläufige Ergebnisse lassen darauf schließen, dass bessere Ergebnisse hinsichtlich der Mikrobläschenkonzentration (Anzahl) und des gesamten Gasvolumens in den Suspensionen bei beschleunigtem Auftauen, d. h. Auftauen, das in einem Wasserbad bei 25ºC ausgeführt wird, erhalten werden, als wenn die Proben bei 5 W oder 20ºC stehengelassen werden, um sie allmählicher aufzutauen. Der größte Verlust an Gasvolumen wurde für Proben beobachtet, die bei 5ºC aufgetaut worden waren.

Beispiel 4

Das in Beispiel 3 beschriebene Experiment wurde unter Verwendung einer Mischung von Tensiden anstelle von MLVs wiederholt. Die Tensidmischung wurde erhalten, indem 1 g Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG Na-Salz von Avanti Polar Lipids, USA) und 3 g Pluronic F68 (ein Polyoxyethyleri-Polyoxypropylen-Copolymer mit einem Molekulargewicht von 8400) in destilliertem Wasser (80 ml) gelöst wurden. Nach Erwärmen bei ungefähr 70ºC wurde eine klare Lösung erhalten. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur abgekühlt und das Volumen mit Glycerol auf 100 ml aufgefüllt. Die Tensidlösung wurde in den mit einer Polytron-Emulgiermaschine ausgestatteten dichten Glasreaktor eingefüllt. Nach Homogenisierung (10000 Upm, 1 min) wurde eine milchartige Suspension mit einer darauf befindlichen Schaumschicht erhalten. Der Schaum wurde verworfen und die untere Phase, die 109 Mikrobläschen pro ml enthielt, wurde gewonnen. Diese Phase wurde mehrere Stunden stehengelassen, bevor die Phase mit den weißen Mikrobläschen gesammelt wurde. Die gesammelten Mikrobläschen wurden in destilliertem Wasser erneut homogenisiert, ein zweites Mal dekantiert und, wie zuvor beschrieben, eingefroren/aufgetaut. Vergleicht man die Eigenschaften der Bläschen vor und nach dem Einfrieren, wurde keine signifikante Variation bei der gesamten Bläschenkonzentration (vorher 1,3 · 10 Bläschen pro ml, danach 1,25 · 10&sup8;) oder dem mittleren Durchmesser Dn (vorher 4; 0 um, danach 3,9) beobachtet.

Beispiel 5

SF6-Bläschen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und, wie in Beispiel 3 beschrieben, dekantiert. Während der Entfernung der unteren wässrigen Phase wurde ein äquivalentes Volumen SF6-Gas in den Trichter eingespeist. Die Bläschenphase wurde in destilliertem Wasser, 0,9% NaCl, 3% wässriger Glycerol-Lösung und 100 mg/ml Trehalose-Lösung resuspendiert. Die Bläschenkonzentrationen und die Absorption bei 700 nm (nach Verdünnung) wurden vor und nach einer Einfrier-Auftau-Behandlung bestimmt.
Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen eine hervorragende Rückgewinnung der Bläschen unabhängig von dem Suspendierungsmedium. Es ist wichtig, festzuhalten, dass die Mikrobläschenrückgewinnung hier zwischen 66 und 96% beträgt, was in einem Gegensatz zu früheren Ergebnissen, die in Tabelle 1 & 2 gezeigt sind zu stehen scheinen könnte. Jedoch sind in diesem Fall erstens die Mikrobläschen kalibriert, d. h. stabiler als nicht-kalibrierte, und zweitens liegt die Größe der hier verwendeten Bläschen über 4 um. TABELLE 4

Beispiel 6

Dekantierte SF&sub6;-Mikrobläschen wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, erhalten. Die Mikrobläschenphase wurde in unterschiedlichen Bläschenkonzentrationen in 0,9% NaCl suspendiert, dann bei -18ºC eingefroren, ungefähr 4 Monate gelagert und bei Raumtemperatur aufgetaut. TABELLE 5
* in Klammern: nach einer zweiten Einfrier/Auftau-Behandlung erhaltene Ergebnisse
Die in Tabelle S zusammengestellten Ergebnisse zeigen keinen signifikanten Einfluss der Bläschenkonzentration auf die Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Einfrieren/Auftauen. Sogar eine zweite Einfrier/Auftau-Behandlung, die nach der Lagerung ausgeführt wurde, beeinflusste die Endkonzentration nicht, was zeigt, dass diese Suspensionen sogar nach einer Lagerung gegenüber wiederholten Einfrier- und Auftau-Zyklen ohne großen Verlust bei der Bläschenanzahl und Schädigung der Echogenität der Proben beständig sind.

Beispiel 7

Beschallte Albumin-Mikrosphären wurden unter Verwendung des in EP-A-0 324 928 (Widder) beschriebenen Verfahrens hergestellt. Kurz zusammengefasst, wurden 5 ml einer sterilen 5%-igen Lösung von menschlichem Albumin (von dem Blood Transfusion Service des Schweizerischen Roten Kreuzes, Bern, Schweiz) in eine kalibrierte 10 ml-Spritze eingefüllt. Eine Beschallungssonde (Modell 250 von Branson Ultrasonic Corp. USA) wurde in die Lösung bis zu der 4 ml-Markierung hinein gesenkt,. Eine Beschallung wurde für 30 s bei einer Energieeinstellung von 7 ausgeführt. Dann wurde die Beschallungssonde bis zu der 6 ml- Markierung (d. h. über den Spiegel der Lösung hinaus) angehoben und es wurde eine Beschallung im Pulsmodus (0,3 s/Zyklus) für 40 s ausgeführt. Nach Entfernung einer Schaumschicht wurde eine Suspension von Albumin-Mikrosphären, die 1,5 · 10&sup8; Bläschen pro ml mit einem Zahlenmittel-Durchmesser von 3,6 um enthielt, erhalten. Diese Suspension wurde bei -18ºC eingefroren und bei dieser Temperatur über Nacht stehengelassen. Am Tag danach wurde die Suspension bei Raumtemperatur aufgetaut. Die vor und nach dem Einfrieren/Auftauen analysierte Suspension hatte die folgenden Eigenschaften: TABELLE 6
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen ein bestimmtes Ausmaß an Zerstörung der Luft enthaltenden Mikrobläschen durch den Einfrier/Auftau-Zyklus. Wenn anstelle von reiner Luft die Albumin-Mikrobläschen mit Mischungen von Luft, die ungefähr 5 Vol-% C&sub5;F&sub1;&sub2; oder C&sub3;F&sub8; enthielt, hergestellt wurden, wurde die Stabilität der Mikrosphären gegenüber dem durch das Einfrieren/Auftauen bedingten Verlust der Bläschenanzahl stark verbessert (siehe Tabelle 7). Aus den mit Albumin-Mikrosphären erhaltenen Ergebnissen kann auch ersehen werden, dass Einfrier/Auftau-Zyklen im Falle von Luft-Mikrobläschen für das untere Ende der Größen der Mikrobläschenpopulation abträglich sind, d. h. dass die Mikrobläschen mit einer durchschnittlichen Größe von ungefähr 5 um oder mehr bessere Widerstandsfähigkeit und Überlebenschancen als die kleineren Mikrobläschen haben. TABELLE 7

Beispiel 8

Wenn 3 g Saccharid-Mikropartikel SHU-454, ein kommerziell vertriebenes Echokontrastmittel (Echovist®, Schering, Deutschland), in einer Galactoselösung (8,5 ml, 200 mg/ml) rekonstituiert wurden, wie von dem Hersteller empfohlen, und einer Einfrier/Auftau-Behandlung unterzogen wurden, waren nach dem Auftauen nur wenige Bläschen in der Lösung vorhanden. Wenn 10 mg pro ml einer Mischung von Dipalmitoylphosphatidylglycerol und Pluronic® F68 (1 : 5, Gew. /Gew.) der Galactcxselösung vor der Zugabe der Saccharid-Mikropartikel zugesetzt wurden, konnten stabile Mikrobläschen in einer Konzentration von 2,5 · 108 Bläschen pro ml erhalten werden. Nach Einfrieren und Auftauen sank die Bläschenkonzentration um ungefähr drei Größenordnungen auf 2, 3 · 105 pro ml, was auf einen beträchtlichen Verlust von Mikrobläschen während der Behandlung schließen lässt. Wenn jedoch vor der Rekonstitution Luft in der Gasphase durch eine Mischung von Luft, die 10% C&sub5;F&sub1;&sub2; enthielt, ersetzt wurde, waren die Bläschen stabiler und auch widerstandsfähiger gegenüber einer Einfrier/Auftau-Behandlung. Der Verlust von Mikrobläschen in dem letzteren Falle betrug nur 2,3 · 10&sup8;, da die Konzentration von 3,9 · 10&sup8; auf 1,6 · 10&sup8; Bläschen pro ml abnahm.

Beispiel 9

Polymere Mikroballons wurde unter Verwendung der in Beispiel 4 von EP-A-0 458 745 (Bracco International) beschriebenen Technik hergestellt. Das bei dieser Herstellung verwendete Polymer war poly-POMEG, das in US 4,888,398 beschrieben ist. Die Mikroballons wurden zu einer Konzentration von 1,8 · 10&sup8; Partikel pro ml in destilliertem Wasser, 0,9% NaCl, 5% Dextrose und 3% Glycerol suspendiert. Jede dieser Suspensionen wurde eingefroren, dann aufgetaut. Nach dem Auftauen wurde weder hinsichtlich der gesamten Partikelkonzentration noch hinsichtlich des mittleren Partikeldurchmessers irgendeine nachweisbare Veränderung beobachtet.

Beispiel 10

Eine Menge von 126 mg Eilecithin und 27 mg Cholesterol wurden in 9 ml Diethylether in einem 200 ml Rundkolben gelöst. Der Lösung wurden 3 ml einer 0,2-molaren wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat mit dem Ionophor A23187 zugesetzt und das resultierende Zwei-Phasen-System beschallt, bis es homogen wurde. Die Mischung wurde bis zur Trockene an einem Rotavapor eingedampft und es wurden 3 ml einer 0,2-molaren wässrigen. Bicarbonatlösung dem Kolben, der die Lipidabscheidung ent- hielt, zugesetzt.
Nach Stehenlassen für eine Weile wurde die resultierende Lipdsomensuspension gegen Kochsalzlösung dialysiert, um nicht-eingeschlossenes Bicarbonat zu entfernen, und angesäuert. Nach einer Weile wurde diese mit destilliertem Wasser gewaschen und dann mehrere Male durch eine Kaskade von Carbonatfiltern geleitet. Ein Aliquot der Suspension von Liposomen mit einer Größe unter 50 um wurde dann bei -18ºC eingefroren und bei dieser Temperatur gelagert. Zwei Wochen später wurde die Suspension bei Raumtemperatur aufgetaut. Die vor und nach dem Einfrieren/Auftauen analysierte Suspension zeigte einen akzeptabel geringen Verlust an Echogenität und Mikrobläschenanzahl.

Beispiel 11

Die Vorgehensweise von Beispiel 3 wurde unter Verwendung von SF6 und Luft, die 5% C&sub5;F&sub1;&sub2; enthielt, als Gasphase wiederholt und die Proben der resultierenden Suspension wurden bei -18ºC, -45ºC, -76ºC und -196ºC eingefroren. Nach 30 Tagen Lagerung bei den entsprechenden Gefriertemperaturen wurden die Proben aufgetaut und die Suspensionen analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Die Konzentration an Mikrobläschen in den Proben vor dem Einfrieren betrug 11,6 · 10&sup7;/ml für SF&sub6; und 9,8 · 10&sup7;/ml für die Luft/5% C&sub5;F&sub1;&sub2;-Mischung, während die jeweiligen Volumen von Gasen in den Proben vor dem Lagern 2,9 ul/ml und 5,9 ul/ml betrugen. Der durchschnittliche Mikrobläschendurchmesser für die zwei Gase betrug 2,3 um und 4,2 um.
Aus den Ergebnissen folgt, dass, je niedriger die Lagerungstemperatur ist, umso höher der Verlust bei der Mikrobläschenkonzentration und der gesamten Menge von Gas, die nach dem Auftauen rückgewonnen werden, ist. Die Ergebnisse zeigen ferner, dass für aufgetaute Proben von Suspensionen mit SF&sub6; der durchschnittliche Durchmesser zuerst zunimmt, dann, wenn die Temperatur gesenkt wird, scharf abnimmt. Für die Luft/5% C&sub5;F&sub1;&sub2;- Mischung gibt es eine relativ geringe Veränderung des Mikrobläschendurchmessers. Die Ergebnisse zeigen auch, dass der durchschnittliche Mikrobläschendurchmesser mit der Abnahme der Lagerungstemperatur abnimmt. Wie in Fig. 1 für Suspensionen mit SF6 und Luft/C&sub5;F&sub1;&sub2;-Mischung gezeigt, werden nur 51,7% und 52% der anfänglichen Mikrobläschenpopulation nach einer Lagerung bei -196ºC rückgewonnen. Jedoch beträgt, wie aus Fig. 2 ersehen werden kann, das gesamte rückgewonnene Gasvolumen nach der Lagerung für SF6 21,1% des anfänglichen Volumens, während für die Luft/C&sub5;F&sub1;&sub2;-Mischung das rückgewonnene Volumen 46,5% beträgt. Dies lässt darauf schließen, dass die Größe der Mikrobläschen im Falle von Suspensionen, die mit SF&sub6; hergestellt worden sind, sich verändert hat, d. h. dass die rückgewonnenen Mikrobläschen verringerte Durchmesser haben. TABELLE 8
Fig. 3 und 4 veranschaulichen die Wirkung der Einfrier- oder Lagerungstemperatur auf die Widerstandsfähigkeit von Suspensionen von Mikrobläschen, die eine Mischung von Luft mit 5% C&sub5;F&sub1;&sub2; enthalten, gegenüber einer Druckveränderung. In dem Diagramm in Fig. 3 ist die Absorption (gemessen bei 700 nm) als Funktion des an Suspensionen angelegten Drucks nach einer Lagerung für drei Tage bei unterschiedlichen Temperaturen angegeben. Aus diesem Diagramm folgt, dass die Abnahme der Lagerungstemperatur einen derartigen Einfluss auf die Eigenschaften der Suspensionen hat, dass die Veränderung der Eigenschaften der bei Temperaturen zwischen -18ºC und -76ºC gelagerten Suspensionen signifikant ist, während die Veränderung für die Proben, die zwischen -76ºC und -196ºC gelagert wurden, relativ gering ist. So scheint ein Beibehalten von Lagerungstemperaturen unter -76ºC keine weiteren Vorteile zu liefern. Angesichts der involvierten Kosten kann die Wahl von Temperaturen unter -76ºC nur in Ausnahmefällen gerechtfertigt sein.
Fig. 4 zeigt andererseits, dass, wenn Suspensionen von Mikrobläschen, die eine Luft/5% C&sub5;F&sub1;&sub2;-Mischung enthalten, drei Tage bei niedrigen Temperaturen gelagert werden, ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Druckvariation relativ unverändert bleibt, während die gleiche Suspension, die während des gleichen Zeitraums bei 25ºC gehalten wurde, ungefähr 10% ihrer anfänglichen Widerstandsfähigkeit gegenüber Druckvariationen verliert.
Die genaue Vorgehensweise und Bedeutung des kritischen Drucks und der Absorptionsmessung sind bereits in EP-A-0 554 213 erläutert worden.

Beispiel 12

Es wurde eine zweidimensionale Echographie unter Verwendung eines ACUSON 128 XP 5-Geräts (Acuson Corp. USA) mit den Präparaten der Beispiele 1, 3 und 7 bei Minischweinen als Versuchstieren nach einer Injektion von 0,04 ml/kg Körpergewicht in eine periphere Vene ausgeführt. Es wurde im Falle von nativen wie auch gefrorenen/aufgetauten Proben die Echokontrastverstärkung der linken Kammer bestimmt. Es wurden sogar in den Fällen von Proben wie jenen, die in Beispiel 7 für Albumin- Mikrosphären beschrieben wurden, keine signifikanten Unterschiede festgestellt, was zeigt, dass die restlichen Bläschen im Großen und Ganzen ausreichend waren, um eine starke und langdauernde Echoverstärkung zu erzeugen.

Claims

1. Gefrorene Suspension von Gasbläschen, die in einem gefrorenen wässrigen Trägermedium bei einer Temperatur zwischen -1ºC und -196ºC immobilisiert sind, wobei das die Gasblasen und gewöhnliche Additive enthaltene Trägermedium ein physiologisch verträglicher Träger ist, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Gasbläschen Gase oder Gasmischungen enthalten, die Siedepunkte unter -18ºC aufweisen und Mikrobläschen sind, die durch eine Tensid Gas/ Flüssigkeitshülle oder eine greifbare Membran begrenzt sind, die aus synthetischem oder natürlichem Polymer oder Protein gebildet ist, und die eine Größe von weniger als 10 um haben, wobei die Suspension in flüssiger Form injizierbar und als Kontrastmittel für die Ultraschalldiagnostik des Blutpools und Gewebes von Lebewesen geeignet ist.

2. Suspension nach Anspruch 1, bei der die Temperatur des gefrorenen Mediums zwischen -10ºC und -76ºC liegt.

3. Suspension nach Anspruch 1, bei der die Größe der Mikrobläschen zwischen 2 um und 9 um liegt.

4. Suspension nach Anspruch 3, bei der die Größe der Mikrobläschen zwischen 3 um und 5 um liegt.

5. Suspension nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Additive als Tenside lamellare Phospholipide in der Form von mono- oder multimolekularen Membranschichten umfassen.

6. Suspension nach Anspruch 5, bei der die lamellaren Phospholipide in der Form von unilamellaren oder multilamellaren Liposomen vorliegen.

7. Suspension nach Anspruch 5, bei der die lamellaren Phospholipide gesättigte Phospholipide sind.

8. Suspension nach Anspruch 6 oder 7, bei der die Phospholipide unter Phosphatidsäure, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinositol, Cardiolipin und Sphingomyelin oder Mischungen davon ausgewählt ist.

9. Suspension nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Additive Substanzen umfassen, die aus Dicetylphosphat, Cholesterin, Ergosterin, Phytosterin, Sitosterin, Lanosterin, Tocopherol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat und butyliertem Hydroxytoluol ausgewählt sind.

10. Suspension nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Additive Sorbitol oder nichtionische Tenside wie Polyoxyethylen/- Polyoxypropylen-Copolymere umfassen.

11. Suspension nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei der die Additive Mitte l zur Erhöhung der Viskosität und/oder Stabilisatoren umfassen, die aus linearen und vernetzten Poly- und Oligosacchariden, Zuckern, hydrophilen Polymeren und iodierten Verbindungen ausgewählt sind, in einem Gewichtsverhältnis zu den enthaltenen Tensiden zwischen 15 und 100. 1.

12. Suspension nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei der die Additive weiterhin bis zu 50 Gew.-% nicht-laminare Tenside enthalten, die unter Fettsäuren, Estern und Ethern von Fettsäuren und Alkoholen mit Polyolen ausgewählt sind.

13. Suspension nach Anspruch 12, bei der die Polyole Polyalkylenglykole, polyalkylenierte Zucker und andere Kohlenhydrate und polyalkyleniertes Glycerin sind.

14. Suspension nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend 10&sup7; bis 10&sup8; Mikrobläschen/ml, 10&sup8; bis 10&sup9; Mikrobläschen/ml oder 109 bis 10¹&sup0; Mikrobläschen/ml.

15. Suspension nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Membran aus synthetischem oder natürlichem Polymer oder Protein hergestellt ist.

16. Suspension nach Anspruch 15, bei der das Polymer aus Polysacchariden, Polyaminosäuren und deren Estern, Polylactiden und Polyglykoliden und deren Copolymeren, Copolymeren von Lactiden und Lactonen, Polypeptiden, Poly(ortho)estern, Polydioxanonen, Poly-β-aminoketonen, Polyphosphazenen, Polyanhydriden, Polyalkyl(cyano)acrylaten, Polyolefinen, Polyacrylaten, Polyacrylnitril, nicht-hydrolysierbaren Polyestern, Polyurethanen und Polyharnstoffen, Polyglutamin- oder Polyasparaginsäurederivaten und deren Copolymeren mit anderen Aminosäuren ausgewählt ist.

17. Suspension nach Anspruch 15, bei der das Protein Albumin ist.

18. Suspension nach Anspruch 1, bei der das Gas aus Halogen enthaltenden Gasen, Luft, Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid und Mischungen davon ausgewählt ist.

19. Suspension nach Anspruch 18, bei der das Halogen enthaltene Gas aus der aus SF&sub6;, CF&sub4;, C&sub2;F&sub6;, C&sub2;F&sub6;, C&sub3;F&sub6;, C&sub3;F&sub8;, C&sub4;F&sub6;, C&sub4;F&sub8;, C&sub4;F&sub1;&sub0;, C&sub5;F&sub1;&sub0;, C&sub5;F&sub1;&sub2; und Mischungen daraus bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

20. Verfahren zur Herstellung der gefrorenen Suspension von Gasbläschen gemäß den Ansprüchen 1 bis 19, gekennzeichnet durch die Schritte:

a) Platzieren der flüssigen Suspension der Mikrobläschen in einem wässrigen Trägermedium in eine Kühlvorrichtung,

b) Immobilisieren der Mikrobläschen durch Kühlen auf eine Temperatur zwischen -1ºC und -196ºC und vorzugsweise eine Temperatur zwischen -10ºC und -76ºC und

c) Aufrechterhalten der Gefrierbedingungen für verlängerte Zeiträume.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die gefrorene Suspension in einer Atmosphäre eines inerten Gases oder einer Mischung von Gasen, von denen mindestens eines das in den Mikrobläschen verkapselte Gas ist, aufbewahrt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Mikrobläschen Gas oder eine Mischung von Gasen enthalten, von denen mindestens eines einen Siedepunkt unter -18ºC hat.

23. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die Suspension vor ihrer Verwendung aufgetaut und für einen Zeitraum bei Raumtemperatur aufbewahrt wird.

24. Verwendung einer gefrorenen Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung einer injizierbaren Suspension zur Verwendung bei der Ultraschalldiagnostik von Organen und Gewebe.

25. Verwendung einer gefrorenen Suspension gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung einer injizierbaren Suspension zur Verwendung bei der Herstellung von Ultraschallechographiekontrastmitteln.