Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von glial-abstammendem neurotrophen
Faktor (GDNF) als ein nervenschützendes Mittel und insbesondere als ein Anti-Krampf-
Therapeutikum.
Hinterrund der Erfindung
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Epilepsie ist eine häufige neurodegenerative Störung. Kinder und Teenager haben die höchste
Häufigkeit der Störung, wobei 75% der Patienten in dieser Altersgruppe Epilepsie vor dem
Alter von 20 entwickeln. Die Störung ist gekennzeichnet durch chronische oder wiederholt
auftretende Krampfanfälle, was ein Anzeichen für eine Funktionsstörung des zentralen
Nervensystems ist, die durch eine Vielzahl verschiedener ätiologischer Faktoren verursacht sein
kann. Zum Beispiel wurde die Epilepsie teilweise einer übermäßigen Freisetzung oder einer
beeinträchtigten Aufnahme von endogenen excitatorischen Aminosäuren, wie Glutamat,
zugeschrieben, was zu Nervenschädigung und Nekrose führen kann (Sperk, Prog. in Neurobiol.,
42: 1-32 (1994); McNamara, J. Neurosci., 14: 3413-1325 (1994)).
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Krampfanfälle können im normalen Gehirn durch Behandlungen, wie Elektroschock
(Swinyard et al., J. Pharmac. Exp. Ther., 140: 375-384 (1952)), Aufregung (Goddard et al.,
Exy. Neurol., 25: 295 (1969)) oder chemische Krampfmittel (Nadler, Life Sci., 24: 2031-2042
(1981); Ben-Ari et al., Neurosci., 6: 1361-1391 (1981)) hervorgerufen werden. Die
Krampferzeugung mittels dieser Verfahren und die daraus resultierende Hirnschädigung initiieren eine
komplexe Kaskade regenerativer und plastischer Veränderungen, einschließlich der
Expression von immediate-early-Genen und Wachstumsfaktoren im Hippocampus und in anderen
Gehirnregionen der erwachsenen Ratte (Sperk, Prog. in Neurobiol., 42: 1-32 (1994)).
Veränderungen hinsichtlich der Expression von Nervenwachstumsfaktor (NGF), basic
Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und aus Hirn stammendem neurotrophen Faktor (BDNF) tragen
zur Plastizität des verletzten Hirns bei Krampfanfall-Modellen nach Gall et al., Mol. Brain
Res., 9: 113-123 (1991); Ernfors et al., Neuron, 7: 165-176 (1991); und Follesa et al., Exy.
Neurol., 127: 37-44 (1994) bei.
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Systemische oder intrakraniale Verabreichung von Kainsäure an Ratten induziert ein
Syndrom. das durch einen akuten limbischen Status epilepticus und darauffolgende neuronale
Hirnschädigung gekennzeichnet ist, ähnlich demjenigen, das bei einer temporalen Lappen-
Epilelpsie bei Menschen beobachtet wird. So wird Kainsäure verbreitet als ein Werkzeug
verwendet, um temporale Lappen-Epilepsie bei Versuchstieren zu studieren (Ben-Ari et al.,
Neurosci., 6: 1361-1391 (1981); und Nadler, Life Sci., 24: 2031-2042 (1981)).
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Der Kainat-Rezeptor ist einer von drei ionotropen Glutamatrezeptoren, die anderen beiden
werden nach ihren bevorzugten Agonisten benannt: NMDA (N-methyl-D-aspartat) und
AMF'A (a-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat). Die Kainat- und AMPA-
Rezeptoren werden oft kollektiv als nicht-NMDA-Rezeptoren bezeichnet. Nicht-NMDA-
Rezeptoren übermitteln hauptsächlich monovalente Kationen und vermitteln schnelle
exzitatorische synaptische Transmissionen, und vor kurzem ist gezeigt worden, daß sie eine
wichtige Rolle bei dem Aufrechterhalten bestimmter Plastizitätsprozesse spielen (Miller, Neurosci.,
14: 477-479 (1991); und Muller et al., Science, 242: 1694 : 1697 (1988)).
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In einem neueren Bericht wurde gezeigt, daß mRNA-Konzentrationen für einen neuen
neurotrophen Faktor, glial-abstammenden neurotrophen Faktor (GDNF), im erwachsenen
Hippocampus nach Krampfanfällen ansteigen, die durch Kainsäure induziert worden sind (Humpel
et aL, Neurosci., 59: 791-795 (1994)). Der glial-abstammende neurotrophe Faktor, ein
Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor-β(TGF-β)-Superfamilie ist kloniert, exprimiert
worden, und es ist gezeigt worden, daß er potente trophische Aktivität bei ventralen
mesencephalischen, dopaminergen Neuronen aus Embryonenmittelhirn in vitro hervorruft (Lin et al.,
Science, 2601130-1132 (1993); und Lin. et al., J. Neurochem., 63: 758-768 (1994)). Es ist
ebenso demonstriert worden, daß rekombinanter menschlicher GDNF (rhGDNF) das Sprießen
von dopaminergen Fasern in vivo induziert (Hudson et al., Soc. Neurosci. Abstr., 19: 652
(1993)), den Umsatz von Dopamin in der substantia nigra von Ratten erhöht (Hudson et al.,
supra.; Miller et al., Soc. Neurosci. Abstr., 20: 535.7 (1994)), Neuronen gegen 6-OHDA-
Läsionen schützt und das Wachstum und die Faserbildung von Nigra-Gewebetransplantaten
aus Rattenfötus in oculo verstärkt (Stromberg et al., Exp. Neurol., 124: 401-412 (1993)).
Darüberhinaus hat eine in situ-Hybridisierungsanalyse eine Expression von GDNF-mRNA in
Embryonen-, aber nicht in normalen erwachsenen Hirnen gezeigt, was nahelegt, daß rhGDNF
ein Ziel-abgeleiteter Faktor während der Entwicklung sein kann (Olson et al., Soc. Neurosci.
Abstr., 19: 652 (1993); und Stromberg et al., Exp. Neurol., 124: 401-412 (1993)).
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Epilepsie wird oft mit Arzneien behandelt, um das Auftreten von Krampfanfällen zu
verhindern. Von den Patienten, die auf eine solche Therapie reagieren, erfahren ungefähr noch 60%
Krampfanfälle, obwohl weniger häufig. Von den 40% der Patienten, die behandelbar sind,
erfahren viele dieser Patienten nichtsdestotrotz schwere Nebenwirkungen, zum Beispiel
Erschöpfung, Schläfrigkeit und Impotenz, die die Lebensqualität eines Patienten erheblich
beeinträchtigen. Entsprechend gibt es einen Bedarf für alternative Therapien, die wirksam sind
und nicht solche schweren Nebenwirkungen hervorrufen. Die vorliegende Erfindung
befriedigt desen Bedarf und stellt auch damit zusammenhängende Vorteile bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Entdeckung, daß GDNF für Nervenschutz
gegenüber Störungen sorgt, die mit Krampfanfällen, wie Epilepsie verbunden sind.
Entsprechend offenbart die vorliegende Erfindung Verfahren zu Inhibierung von Krampfanfällen
durch Verabreichung von GDNF an einen Patienten, der einer Anti-Krampftherapie bedarf, in
einer Menge, die ausreicht, das Ausbrechen von Krampfanfällen zu inhibieren oder zu
verhindern.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von glial-abstammendem
neurotrophen Faktor zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Inhibierung der Krampfaktivität
bereitgestellt, wobei besagtes therapeutisches Mittel nicht zur Verabreichung als ein
rekombinantes Adenovirus vorgesehen ist, das eine heterologe DNA-Sequenz umfaßt, die für den
glial-abstammenden neurotrophen Faktor kodiert.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso die Verwendung von glial-abstammendem
neurotrophen Faktor für die Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Inhibierung von
neuronalem Zellverlust bereitgestellt, der sich aus der Krampfaktivität ergibt.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von
glialabstammendem neurotrophen Faktor für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung
bei der Anti-Krampfbehandlung bereitgestellt, wobei besagtes Medikament nicht zur
Verabreichung als ein rekombinantes Adenovirus vorgesehen ist, das eine heterologe DNA-Sequenz
umfaßt, die für den glial-abstammenden neurotrophen Faktor kodiert.
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Bevorzugt wird der GDNF rekombinant produziert und wird in einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger verabreicht. Deshalb offenbart die vorliegende Erfindung weiterhin
pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge GDNF und einen
phannazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt, daß rhGDNF gegen Kainsäure-induzierten neuronalen Verlust schützt.
Intraventrikulärer GDNF (0,5, 550 ug/2u1) schützt Hippocampus-CA1- (Fig. 1A),
Amydgala(Fig. 1 B) und Thalamus-Neuronen (Fig. 1 C) gegen Kainsäure induzierte (12 mg/kg
subkutan) Läsionen. Die Tiere empfingen entweder rhGDNF 0,05, 0,5, 5 bzw. 50 ug/4u1 (C-F)),
inaktiven GDNF (B) oder Trägersubstanz (A) 1 Stunde vor Verabreichung der Kainsäure. Die
Gruppe G repräsentiert normale Tiere, die keine Behandlungen erfuhren. Im Vergleich mit
der Kainsäure/Trägersubstanz-Gruppe erhöhten die GDNF-behandelten Tiere das neuronale
Überleben signifikant in allen untersuchten Regionen. Neuronenzählungen sind der
Durchschnitt + S.E.M. von 9-24 Bestimmungen. Die Signifikanz des Unterschiedes zwischen
Trägersubstanz und rhGDNF war P < 0,01 (**) und P < 0,05 (*) unter Verwendung des Students
t-Test. In ähnlicher Weise gab es einen signifikanten Unterschied (P < 0,01) zwischen der
Trägersubstanz (A) und den Gruppen mit keiner Behandlung (G).
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Fig. 2 zeigt, daß rhGDNF gegen Kainsäure-induzierten Hippocampus-CA1-pyramidalen
Zellverlust schützt. Koronale Schnitte der CA1-Hippocampus-Region aus Ratte zeigten eine
Färbung mit Cresyl-violet · 25 (Fig. 2A): 7 Tage nach Kainsäure (12mg/kg s.c.) +
Trägersubstanz (2 ul icv). Man beachte die Nekrose der CA1-pyramidalen Zellen. (Figure 2B):
Normale Ratte, die zur selben Zeit geopfert wurde. (Fig. 2C): 7 Tage nach Kainsäute (12 mg/kg
s.c.) + rhGDNF (50 ug/2 ul, icv). Man beachte den Schutz der CA1-pyramidalen Zellen.
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Fig. 3 zeigt die Effekte von rhGDNF (50 ug/2u1 icv), Trägersubstanz (2 ul icv), o
Kainsäure (12mg/kg s.c.) + rhGDNF (50 ug/2u1, icv), Kainsäure (12 mg/kg s.c.) + rhGDNF
(0,5 ug/2u1 icv) und Kainsäure (12 mg/kg s.c.) + Trägersubstanz (2 ul, icv) bei mittlerem
Gewichtsverlust. Die Körpergewichte wurden täglich für sieben Tage gemessen, und die
Werte sind als Körpergewichtsveränderung vom Tag null ausgedrückt. Die Verbindungen
wurden am Tag null verabreicht. Die Werte sind Mittelwert + S.E.M., (n = 7-11).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von glial-abstammendem neurotrophen
Faktor zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Inhibierung der Krampfaktivität
bereit, wobei, das therapeutische Mittel nicht zur Verabreichung als ein rekombinantes
Adenovirus vorgesehen ist, das eine heterologe DNA-Sequenz umfaßt, die für den
glialabstammenden neurotrophen Faktor kodiert.
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In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der bevorzugte GDNF das natürlich
vorkommende menschliche Protein. Das natürlich vorkommende menschliche Protein wird zur
Therapie am Menschen bevorzugt, teilweise, weil geglaubt wird, daß es ein geringeres Risiko
darstellt, unvorhergesehene und unerwünschte physiologische Nebenwirkungen bei damit
behandelten Patienten hervorzurufen. Jedoch wird in dem Ausmaß, das nicht-menschliche
GDNFs, wie etwa Ratten-GDNF, im wesentlichen mit menschlichen GDNFs äquivalent sind
und äquivalente biologische Aktivität besitzen, davon ausgegangen, daß auch sie innerhalb
des Umfangs dieser Erfindung sind.
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Für die Zwecke hierin wird davon ausgegangen, daß ein Protein "natürlich vorkommend" ist,
wenn gefunden wird, daß es oder ein im wesentlichen äquivalentes Protein normalerweise bei
gesunden Menschen vorhanden ist. "Natürliche vorkommende" Proteine schließen
insbesondere Proteinformen ein, von denen gefunden wird, daß sie bei gesunden Menschen
vorkommen, die am Amino- oder Carboxy-Terminus von solchen Proteinen partiell trunkiert sind,
oder die Aminosäuren haben, die deamidiert oder anderweitig chemisch modifiziert sind.
"Natürlich vorkommende" Proteine können mittels rekombinanter DNA-Methoden sowie
durch Isolierung aus Zellen, die sie normalerweise produzieren, erhalten werden. "Natürlich
vorkommend" umfaßt ebenso Proteine, die als Konsequenz aus einer E. coli Expression eine
NH&sub2;-tenninale Methionylgruppe enthalten oder nicht.
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"Im wesentlichen äquivalent", wie in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen
verwendet, wird so definiert, daß es einen-hohen-Grad-Aminosäurerest-Homologie-besitzend
bedeutet (siehe im allgemeinen M. Dayoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Band 5,
S. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.) sowie
vergleichbare biologische Aktivität besitzend.
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Ein besonders bevorzugter GDNF der vorliegenden Erfindung ist das natürlich vorkommende
Protein, das aus serumfreiem, wachstumskonditioniertem Medium von B49-Gliobastom-
Zellen isoliert worden ist, wie zuvor in der PCT-Veröffentlichungsnummer WO 93/06116
beschrieben wurde. Andere bevorzugte Formen von GDNF sind ebenso in WO 93/06116
beschrieben.
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Die Nukleinsäuresequenzen der Gene, die für menschliche und Ratten-GDNFs kodieren, und
die Aminosäuresequenzen von solchen Proteinen werden ebenso in der WO 93/06116
Anmeldung angegeben. Die vorliegende Erfindung umfaßt nicht-glykosylierte Formen von
GDNF sowie trunkierte Formen der natürlich vorkommenden und rekombinanten GDNF-
Proteine.
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Modifizierte Formen von GDNF werden ebenso bei der Verwendung der vorliegenden
Verfahren umfaßt. Zum Beispiel kann GDNF durch Anhängen von einem oder mehreren
Polyethylenglykol (PEG)-, anderen sich wiederholenden polymeren Gruppen, oder anderen
Seitenketten, angehängt an das Polypeptid-Grundgerüst von GDNF, modifiziert sein. In einer
weiteren Ausführungsform kann die Aminosäuresequenz der Polypeptidkette modifiziert werden,
zum Beispiel durch die Substitution, Addition oder Deletion von einer oder mehreren
Aminosäuren, solange wie die erwünschte Anti-Krampfmittel-Aktivität von GDNF nicht
wesentlich beeinträchtigt wird. Entsprechend soll der Begriff "GDNF" alle Formen von GDNF
umfassen.
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Verfahren zum Herstellen der verschiedenen Formen von GDNF werden ebenso in der WO
93/06116-Anmeldung offenbart. Eine offenbarte Methode besteht darin, GDNF aus
verschiedenen Quellen, wie etwa serumfreiem Medium von B49-Zellen zu isolieren. Ein zweites
offenbartes Verfahren beinhaltet das Isolieren der Gene, die für die Kodierung von GDNF
verantwortlich sind, Klonieren des Gens in geeignete Vektoren und Zelltypen und Exprimieren
des Gens, um den GDNF zu produzieren. Das letztere Verfahren, das für rekombinante DNA-
Methoden im allgemeinen beispielhaft ist, ist ein bevorzugtes Verfahren der vorliegenden
Erfindung. Rekombinante DNA-Methoden werden teilweise bevorzugt, weil sie in der Lage
sind, vergleichsweise höhere Mengen an Protein mit größerer Reinheit zu erreichen.
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Bevorzugt wird der oben beschriebene GDNF durch das zuvor erwähnte Verfahren in "im
wesentlichen reiner" Form produziert. Mit "im wesentlichen rein" wird gemeint, daß der
GDNF, in einer nicht-modifizierten Form, eine vergleichsweise hohe spezifische Aktivität
hat. Es sollte jedoch erkannt werden, daß Derivate oder modifizierte Formen unterschiedliche
spezifische Aktivitäten haben können.
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Weil es möglich ist, daß die Anti-Krampfaktivität von GDNF durch eine oder mehrere
diskrete und abtrennbare Teile des Proteins verliehen wird, wird ebenso in Erwägung gezogen,
daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung durch Verabreichen einer therapeutischen
Zusammensetzung ausgeübt werden könnte, deren aktiver Inhaltsstoff aus diesem Teil (oder
diesen Teilen) von GDNF besteht, der (die) die Anti-Krampf-Funktion kontrolliert (oder
kontrollieren).
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung soll eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die GDNF umfaßt, in einer wirksamen Menge an Patienten zum Schutz
vor Nervenschädigung verabreicht werden. Für therapeutische Anwendungen kann GDNF in
einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert werden, um pharmazeutische
Zusammensetzungen zu produzieren. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Träger", wie hierin
verwendet, bedeutet eine nicht-toxische, im allgemeinen inerte Trägersubstanz für das aktive
Mittel, die das Mittel oder den Patienten, an den die Zusammensetzung verabreicht wird,
nicht nachteilig beeinträchtigt. Geeignete Trägersubstanzen oder Träger können in
pharmazeutischen Standardtexten gefunden werden, zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16 Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Solche Träger schließen zum
Beispiel wässrige Lösungen, wie Hydrogencatbonatpuffer, Phosphatpuffer, Ringer-Lösung
und physiologische Kochsalzlösung ein. Zusätzlich kann der Träger andere pharmazeutisch
annehmbare Bindemittel zum Modifizieren oder Aufrechterhalten des pH, Osmolarität,
Viskosität, Klarheit, Farbe, Sterilität, Stabilität, Auflösungsrate oder Geruch der Formulierung
enthalten.
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Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können mittels auf dem Gebiet bekannter
Verfahren hergestellt werden, einschließlich dem einfachen Mischen von Reagenzien als ein
Beispiel. Fachleute werden wissen, daß die Auswahl des pharmazeutischen Trägers und die
geeignete Zubereitung der Zusammensetzung von der beabsichtigten Verwendung und
Verabreichungsart abhängen.
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In einer Ausführungsform wird in Erwägung gezogen, daß der Träger und GDNF als das
aktive Mittel eine physiologisch kompatible Formulierung mit langsamer Freisetzung darstellen.
Es ist möglich, die Freisetzungsrate des aktiven Mittels (der aktiven Mittel) durch eine
passende Auswahl an labilen Linker-Gruppen in dem Oligonukleotid, die Fachleuten bekannt
wären, zu kontrollieren. Das primäre Lösungsmittel in einem solchen Träger kann entweder
wässrig oder nicht-wässrig in seiner Natur sein. Zusätzlich kann der Träger andere
pharmakologisch annehmbare Bindemittel zum Modifizieren oder Aufrechterhalten des pH,
Osmolärität, Viskosität, Klarheit, Farbe, Sterilität, Stabilität, Auflösungsrate oder Geruch der
Formulierung enthalten. Auf ähnliche Weise kann der Träger noch andere pharmakologisch
annehmbare Bindemittel zum Modifizieren oder Aufrechterhalten der Stabilität, Auflösungsrate,
Freisetzung oder Absorption der aktiven Mittel enthalten. Solche Bindemittel sind die
Substanzen, die gewöhnlich und üblicherweise verwendet werden, um Dosierungen für die
parenterale Verabreichung in entweder Einheitsdosis- oder Multi-Dosis-Form zu formulieren.
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Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung formuliert worden ist, kann sie in sterilen
Gefäßen als eine Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder dehydriertes oder
lyophilisiertes Pulver gelagert werden. Solche Formulierungen können entweder in einer
gebrauchsfertigen Form gelagert werden oder eine Wiederherstellung unmittelbar vor der
Verabreichung erfordern. Die bevorzugte Lagerung von solchen Formulierungen liegt bei
Temperaturen so niedrig wie 4ºC und bevorzugt bei -70ºC. Es wird ebenso bevorzugt, daß solche
Formulierungen, die die aktiven Mittel enthalten, bei oder nahe dem physiologischem pH
gelagert und verabreicht werden. Es wird gegenwärtig davon ausgegangen, daß die Verabreichung
in einer Formulierung bei einem hohen pH (d. h. größer als 8) oder bei einem niedrigen pH (d.
h. weniger als 5) unerwünscht ist.
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Die Art der Verabreichung der pharmazeutischen Formulierungen, die die aktiven Mittel
enthalten, zur systemischen Abgabe kann intrakranial, subkutan, intramuskulär, intravenös oder
oral sein. Bevorzugt ist die Art der Verabreichung der die aktiven Mittel enthaltenden Formu-
lierungen zur örtlichen Abgabe direkt in das Hirn auf intrakranialem ventrikulärem Wege
(icv) mit der Hilfe von Kathetern und Pumpen.
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Zur oralen Verabreichung wird die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung eingekapselt. Die eingekapselten aktiven Mittel können mit oder ohne
pharmazeutisch annehmbare Träger formuliert werden, die beim Zusammensetzen von festen Dosierungsformen
gewöhnlicherweise verwendet werden. Bevorzugt ist die Kapsel so angelegt, daß
der aktive Teil der Formulierung an dem Punkt im Gastrointestinaltrakt freigesetzt wird, wenn
die Bioverfügbarkeit maximal ist und ein prä-systemischer Abbau minimal ist. Zusätzliche
Bindemittel können eingeschlossen werden, um eine Absorption der aktiven Mittel zu
erleichtern. Verdünnungsmittel, Geschmackstoffe, Wachse mit niedrigem Schmelzpunkt,
pflanzliche Öle, Schmiermittel, Suspensionsmittel, tablettenauflösende Mittel und Binder
können ebenso verwendet werden.
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Ohne Rücksicht auf die Art der Verabreichung wird die spezifische Dosis gemäß dem
angenäherten Körpergewicht des Patienten berechnet. Andere Faktoren beim Bestimmen der
geeigneten Dosierung können die zu behandelnde oder verhindernde Krankheit oder Zustand,
die Verabreichungsroute und das Alter, Geschlecht und der medizinische Zustand des
Patienten sein. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Dosierung und Verabreichung so
angelegt, daß sie einen vorgewählten Konzentrationsbereich von GDNF im Blutstrom des
Patienten erschaffen. Bevorzugt wird GDNF in Dosen zwischen ungefähr 0,0005 mg/kg und 1 mg/kg
verabreicht. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die notwendig sind, um die
geeignete Dosierung zur Behandlung unter Einbezug jeder der oben erwähnten Formulierungen zu
bestimmen, wird routinemäßig von Fachleuten durchgeführt und liegt innerhalb des
Aufgabenbereichs, der routinemäßig von ihnen ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt
wird, insbesondere im Lichte der Dosierungsinformation und der Assays, die hierin offenbart
sind. Diese Dosierungen können durch die Verwendung von etablierten Assays zum
Bestimmen von Dosierungen, die im Zusammenhang mit geeigneten Dosis-Antwort-Daten
verwendet werden, bestätigt werden.
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Wie oben beschrieben, kann die Dosierung, die ausreicht, um eine "therapeutisch wirksame
Menge" GDNF abzugeben, von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt
werden. Eine "therapeutisch wirksame Menge" kann als die Menge GDNF definiert werden,
die ausreicht, um Krampfanfälle in dem Patienten zu inhibieren oder zu verhindern.
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Es sollte beachtet werden, daß die hierin beschriebenen GDNF-Formulierungen zu
veterinären als auch menschlichen Anwendungen verwendet werden können und daß der Begriff
"Patient" nicht auf eine beschränkende Weise ausgelegt werden sollte. Im Falle von veterinären
Anwendungen sollten die Dosierungsbereiche dieselben sein, wie oben spezifiziert.
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Bei Studien, betreffend die vorliegende Erfindung und in größeren Einzelheiten in den
Beispielen beschrieben, wurde gezeigt, daß rhGDNF Kainat-induzierte Krampfanfälle und den
assoziierten neuronalen Zeilverlust verhindert. Dieser Effekt wurde in relativ geringen Dosen
und in einer Dosis-abhängigen Weise erreicht. Die deutliche Immunfärbung auf rhGDNF in
Hippocampus-CA1- und CA3-Regionen stimmt mit den Hippocampus-Regionen überein, die
gegenüber Kainsäure-induzierter Toxizität extrem verletzlich sind, wie von J. V: Nadler, The
Hlppocampus-New Vistas, 5.463-481 (Alan R. Liss, 1989) berichtet. Die intensive
Immunfärbung auf rhGDNF durch einen polyklonalen anti-GDNF-Antikörper wurde bilateral
erreicht, was anzeigt, daß sich dieses Protein durch das ventrikuläre System bewegen kann, was
die bilaterale Erhaltung von CA1-Neuronen erklären würde.
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Die Resultate zeigen an, daß rhGDNF sowohl eine Anti-Krampf als auch anti-epileptogene
Aktivität haben kann, wie durch die Inhibierung der tonisch-klonischen Krämpfe bzw. wet
dog shakes angezeigt wird. Die Anti-Krampf-Eigenschaften von rhGDNF scheinen potenter
als die anti-epileptogenen Wirkungen zu sein. Die Epileptogenese und Krampfanfälle
scheinen unterschiedliche pharmakologische Profile zu haben. Die Epileptogenese kann durch
NMDA-Rezeptor-Antagonisten blockiert werden (Stasheffet al., Science, 245: 648-651
(1989)). Im Gegensatz dazu können Krampfanfälle eine höhere Konzentration Antagonist
erfordern, oder es kann sein, daß sie überhaupt nicht durch NMDA-Antagonisten blockiert
werden, jedoch ziemlich empfindlich gegenüber allgemein verwendeten Anti-Krampfmittel-
Arzneien sind. Die Epileptogenese ist eine relativ permanente Veränderung, die stattfindet,
wenn Neuralgewebe von einem normalen in einen epileptischen Zustand transformiert wird
(Stasheffet al., supra). Bei diesen Studien wurden die Effekte von rhGDNF nicht direkt auf
diese permanenten Veränderungen im Neuralgewebe bewertet; jedoch wurden wet dog
shakes, eine Vorstufe zu solchen Veränderungen, durch rhGDNF inhibiert.
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Kainsäure induzierte Krampfanfälle produzieren ein übereinstimmendes Muster an
Hirnschädigung, wenn ein status epilepticus erreicht ist und über eine kritische Zeitperiode
aufrechterhalten wird (Ben-Ari, Neurosci., 375-403 (1985); und Tanaka et al., Prog. Neurobiol., 38: 317-
334 (1992)). Das Muster der Hirnschädigung, das bei diesen Studien beobachtet worden ist,
ist ähnlich demjenigen, über das zuvor in der Literatur berichtet wurde. Der Mangel an
Kainsäure-induziertem neuronalem Verlust in der Hippocampus-CA3-Region ist bei einer
peripheren Kainat-Verabreichung beobachtet worden (Nadler, The Hippocampus-New Vistas, S.
463-481 (Alan R. Liss, 1989). Die vor Nervenschädigungen schützenden Effekte von
rhGDNF auf Hippocampus-, Thalamus- und amygdaloide Neuronen stimmt überein mit einer
Reduktion hinsichtlich der Krampfaktivität durch diesen neurotrophen Faktor. Jedoch kann
ein möglicher direkter Effekt von rhGDNF auf Kainsäure induzierte Excitotoxizität nicht
ausgeschlossen werden, da andere neurotrophe Faktoren, bFGF und NGF gegen
Glutamatinduzierte Excitotoxizität schützen können, wie beschrieben von Hefti et al., Neurobiol.
Aging, 10: 515-588 (1989); Berlove et al., Soc. Neurosci. Abstr., 17: 1267 (1991); Shingeno et
al., J. Neurosci., 11: 2914-2919 (1991); Cheng and Mattson, Neuron, 7: 1031-1041 (1991);
Shimohama et al., Neurosci. Lett., 164: 55-58 (1993); und Mattson and Cheng, troke, 24:I-
136-I-140 (1993).
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Es wird jedoch geglaubt, daß rhGDNF wahrscheinlich nicht als ein Inhibitor von
Glutamatrezeptor-Kanal-Komplexen fungieren kann, auf der Grundlage der strukturellen Erfordernisse
dieser Rezeptoren für die Aktivierung, wie beschrieben in Dingledine et al., Neurobiology,
14: 1-96 (1988). Es ist wahrscheinlicher, daß rhGDNF downstream-Ereignisse oder Systeme
beeinflussen würde, die mit der Glutamatrezeptor-Aktivierung assoziiert sind. Es ist gezeigt
worden, daß andere neurotrophe Faktoren die folgenden beeinflussen: (a) Veränderungen
hinsichtlich der Glutamatrezeptoranzahl oder -funktion; (b) Induktion von Schutzenzymen,
entweder Streßproteinen oder Enzymen des Superoxid-Stoffwechsels; (c) Veränderungen
hinsichtlich der Ionenbalancen - spezifisch in intrazellulären Kalziumvorräten oder Na&spplus;/K&spplus;-
ATPäse-Aktivität; und (d) indirekte Vermittlereffekte über Glia-Zellen.
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Die Möglichkeit, daß rhGDNF allgemein eine unterdrückende Aktivität auf die synaptische
Transmission haben kann, würde die Inhibierung der Kainsäure-induzierten Krampfaktivität
erklären. Jedoch zeigten vorläufige elektrophysiologische in vitro-Studien unter Verwendung
von Ratten-Hippocampus-Schnitten an, daß rhGDNF in 2 ug/ml hervorgerufene Potentiale,
die in den Gebieten CA1 und CA3 unter Verwendung von standard-extrazellulären
Aufnahmetechniken aufgenommen worden sind, nicht beeinflußt. Die Verbesserung von
Kainsäureinduzierten Krampfanfällen mag eine Verringerung hinsichtlich der Bioverfügbarkeit von
Kainsäure durch rhGDNF reflektieren. Dies scheint unwahrscheinlich auf der Grundlage der
unterschiedlichen Dosis-Antwort-Beziehungen für rhGDNF beim Verringern von wet dog
shakes und tonisch-klonischen Krampfanfällen. Darüberhinaus verhinderte inaktiver rhGDNF
nicht Kainsäure induzierte Krampfanfälle.
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Die Fähigkeit des Hippocampus, GDNF-mRNA nach Kainsäure-induzierten Krampfanfällen
zu exprimieren, legt nahe, daß das Gehirn die Fähigkeit haben kann, GDNF unter bestimmten
Streßbedingungen zu produzieren. Dieses Phänomen ist nicht ungewöhnlich, weil viele
Mitglieder der NGF-Genfamilie durch excitotoxische Läsionen und/oder Krampfanfälle
hochreguliert werden. Obwohl nicht gewünscht wird, an eine besondere Theorie gebunden zu sein,
wird geglaubt, daß die lokale Produktion von GDNF als eine Bremse auf den
Krampfanfall/excitoxischen Prozeß wirkt, was so den möglichen Schaden begrenzt, der stattfinden
kann. Hippocampus-Neuronen exprimieren sowohl ionotrope als auch metabotrope
Glutamatrezeptoren, und die Aktivierung des ionotropen NMDA-Rezeptors indirekt durch Kainat
scheint bei der Regulierung von GDNF-mRNA beteiligt zu sein. Dieses Ergebnis wird durch
die jüngeren Studien unterstützt, die zeigen, daß der spezifische NMDA-Rezeptor-
Kanalblocker MK-801 (Wong et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 83: 7104-7108 (1986))
Kainsäure induzierte GDNF-mRNA-Expression abschwächte (Humpel., Neurosci., 59: 791 -
795 (1994)). Diese Verringerung in der GDNF-mRNA-Expression stimmt überein mit dem
obigen Glauben, da eine epileptiforme Aktivität reduziert würde, weniger excitotoxischer
Schaden stattfinden würde in der CA1-Hippocampus-Region, und der Stimulus für die
endogene GDNF-Produktion würde reduziert.
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Das Ergebnis, das eine intracerebrale, ventrikuläre Einzelbolus-Injektion von rhGDNF die
Körpergewichte von Ratten reduziert, unterstützt frühere Studien, daß eine zentrale oder
periphere Verabreichung von neurotrophinen Gewichtsverlust induzieren (Altar et al., Proc., Natl
Acad. Sci. U.S.A., 89: 11347-11351 (1992); Martin-Iverson et al.; J. Neurosci., 14 1262-1270
(1994)). Mögliche Mechanismen, die der Abnahme an Körpergewicht zugrunde liegen,
können mit Veränderungen hinsichtlich zentraler Monoamine, wie Dopamin und 5-HT,
zusammenhängen.
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Eine periphere Verabreichung von Kainsäure induzierte ebenfalls
Körpergewichtsveränderungen. Vor kurzem zeigten Hajnal et al., Brain Res. Bull., 29: 209-916 (1992), daß die durch
iontophoretisch in den zentralen Amygdala-Kern eingebrachte Kainsäure produzierten
Mikroläsionen Körpergewichtsverlust, Hypo- oder Aphagie und Hypo- oder Adipsie in einer
dosisabhängigen Weise verursachten. Diese Studien legten ebenso nahe, daß die dauerhaften
Nahrungsaufnahinestörungen, die durch Kainsäure an die Amygdala produziert wurden, nicht
kausal mit den pathologischen EEG-Aktivitätsveränderungen verwandt waren, sondern im
Zusammenhang standen mit der Beeinträchtigung von komplexen regulatorischen Mechanismen,
die bei dem Nahrungsaufnahmeverhalten beteiligt sind. Die Amygdala ist nicht die
einzige Hirnregion, die das Nahrungsaufnahmeverhalten kontrolliert, und die Excitotoxizität, die
durch Kainat produziert wird, kann andere Hirnregionen beeinflussen, die das
Nahrungsaufnahmeverhalten kontrollieren. Die Beobachtung, daß geringe Dosen rhGDNF
Kainsäureinduzierten Gewichtsverlust abschwächten, kann mit seiner Fähigkeit, excitotoxischen
Schaden zu verringern und die Zerstörung der neuralen Verschaltung zu verhindern, die bei dem
Nahrungsaufnahmeverhalten beteiligt ist, übereinstimmend sein. Die Akzentuierung des
Gewichtsverlusts durch die höchste Dosis von rhGDNF repräsentiert mehr als die Summe der
Effekte von Kainsäure und rhGDNF. Daher kann eine Synergie zwischen rhGDNF und
anderen endogenen Vermittlern, die während einer Hirnverletzung freigesetzt werden, beim
Vermitteln der Gewichtsverlust-Phänomene beteiligt sein.
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Frühere in vitro-Studien zeigten an, daß rhGDNF ein potenter neurotropher Faktor ist, der das
Überleben von dopaminergen Mittelhirn-Neuronen verstärkt, und daß diese Effekte relativ
spezifisch für dieses Transmittersystem schienen (Lin et al., Science, 260: 1130-1132 (1993)).
Die vorliegenden Studien zeigen an, daß rhGDNF zusätzliche Wirkungen auf andere
Neurotransmittersysteme haben kann; wie etwa das glutaminerge System. Dieses Anzeichen wird
weiterhin durch das Ergebnis gestützt, daß GDNF-mRNA sich auf neuronale Populationen,
die nicht Dopamin-enthaltende Neuronen sind, erstreckt (Schaar et al., Exp. Neurol., 124: 368-
371 (1993); Humpel et al., Neurosci., 59: 791-795 (1994)).
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Die Verwendung von neutrotrophen Faktoren als eine potentielle Therapie bei der Epilepsie
scheint ein neuer Ansatz zu sein, und es wird geglaubt, daß diese Studien die erste
Demonstration der effektiven Blockade von Krampfaktivität durch einen neurotrophen Faktor in
einem Modell der temporalen Lappen-Epilepsie ist.
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Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, nicht aber beschränken.
BEISPIEL 1
A. Herstellung von aktiven rhGDNF
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Reifer rhGDNF wurde in E. coli mit denselben, in McDonald et al., Biochim. Biophys. Acta,
1090: 70-80 (1991) beschriebenen Verfahren hergestellt, hierin durch Bezugnahme einbezogen.
Danach wurde rhGDNF in der Form von Inclusion-bodies gewonnen, die aus dem Zell-
Lysat mittels Zentrifugation isoliert und in 4 M Guanidin, 90 mM Cystein, 20 mM Tris, pH
8,5 löslich gemacht werden. Das Protein wurde in die aktive Spezies durch 10X Verdünnung
mit 0,2 M Guanidin, 2 M Harnstoff, 20 mM Tris, pH 8,75, renaturiert. Die
Rückfaltungsmischung wurde bei 4ºC für 2 Tage gehalten, bevor sie auf eine SP Sepharose Big Bead-Säule
(Pharmacia) geladen wurde, die in 20 mM Natriumacetat, 300 mM Natriumchlorid pH 5
äquilibriert worden war. Rekombinanter menschlicher GDNF wurde aus der Säule unter
Verwendung eines Salzgradienten von 0,3 M bis 0,6 M Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen,
die rhGDNF enthielten, wurden kombiniert und mit einem gleichen Volumen 5 M
Natriumchlorid, 20 mM Natriumcitrat verdünnt, bevor sie auf eine Phenyl-Sepharose-Säule (High
Capacity, Pharmacia) geladen wurden, die in 2,5 M Natriumchlorid, 20 mM Natriumcitrat,
pH 5 äqilibriert worden war. Der rhGDNF wurde von der Hochkapazitätssäule mit einem
abnehmenden Salzgradienten von 2,5 M bis 0 M Natriumchlorid eluiert. Die geeigneten
Fraktionen werden vereinigt und mit einem gleichen Volumen 20 mM Natriumacetat verdünnt.
Die verdünnte Proteinmischung wurde als nächstes auf eine SP Sepharose High Performance
Säule (Pharmacia) aufgebracht, die in 20 mM Natriumacetat, 475 mM Natriumchlorid, pH 5
äquilibiert worden war. Der rhGDNF wurde aus der Säule mit einem Salzgradienten von 475
mM bis 675 mM Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen, die den aufgereinigten rhGDNF
enthielten, wurden kombiniert, konzentriert und bei -20ºC gelagert.
B. Herstellung von inaktiven rhGDNF
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Rekombinanter menschlicher GDNF wurde chemisch inaktiviert durch Blockieren der
Carbonsäuregruppen des Proteins mit einem Überschuß Glycinmethylester über Carbodiimid-
Kopplung. 100 mg aufgereinigte rhGDNF wurde in 0,5 M MES pH 5 in einer. Protein-
Endkonzentration von 1 mg/ml dia-filtriert. EDC und Glycinmethylester wurden auf 80 bzw.
800 mM zugegeben. Die Reaktion ließ man bei Zimmertemperatur für 1 Stunde stehen. Die
Mischung wurde gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung dialysiert, um überschüssige
Reagenzien zu entfernen, bevor sie bei -20ºC gelagert wurde.
BEISPIEL 2
Chirurgie
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Erwachsene männliche F344-Ratten (Harlen), die 200-225 g wogen, wurden verwendet. Die
Tiere wurde bei einer konstanten Temperatur (22ºC) und einem 12 Stunden-Licht-und-
Dunkel-Zyklus gehalten. Sie hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden
mit 2,5% Isofluran + O&sub2; betäubt und in einen stereotaktischen Kopf-Rahmen unter
andauernder Betäubung positioniert. Diese Tiere empfingen eine einseitige Injektion von entweder
rhCiDNF (50, 5, 0,5 0,05 ug/2ml), Trägersubstanz (Phosphat-gepufferte Salzlösung; 2 ul) oder
inaktiven GDNF (2 ug/2ml) über eine 5-minütige Periode in den Ventriculus Latetalis unter
Verwendung einer 26-Gauge-Hamilton-Spritze. Die Hamilton-Spritze wurde an Ort und
Stelle für weitere 5. Minuten vor ihrer Entfernung belassen. Die Injektionskoordinaten relativ
zum Bregma waren: AP -0,8, ML -1,5, bei einer Tiefe von 3,5 mm von der Dura. Die Tiere
bekamen ihre Haut mit Wundklammern genäht und durften sich erholen. Entweder rhGDNF,
inaktiver GDNF oder Träger wurden 1 Stunde vor der Kainsäure gegeben. Die Kainsäure
(Tocris Neuramin, England.,) wurden zwölf mg/kg in 0,9% Salzlösung aufgelöst und
subkutan verabreicht. Die Tiergewichte wurden täglich für die Dauer der Studie aufgezeichnet.
BEISPIEL 3
Hirnhistologie
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Sieben Tage nach der KA-Verabreichung wurden die Ratten mit Natriumpentobarbiton
55 mg/kg (i.p.) betäubt und transcardial mit Phosphat-gepufferter Formalinlösung perfundiert.
Die Gehirne wurden entfernt und für wenigstens 24 h in demselben Fixierungsmittel
immersionsfixiert. Die Gehirne wurden dann dehydratisiert, in Paraffinwachs eingebettet und
coronal in 5 um-dicken Schnitten geschnitten, und die Schnitte wurden Nissl-gefärbt. Unter
Verwendung eines Leitz-Mikroskops wurden Zählungen von lebensfähigen Zellen bilateral in den
CA1 - und CA3-Regionen des Hippocampus, Thalamus (parafasciculäre Thalamus und
periventriculäre Thalamuskerne) und Amygdala (Amygdala-Hippocampus-Region,
anterolateral; basomediales Corpus Amygdaloideum, posterior; basolateraler Corpus Amygdaloideum,
posterior, und postermediales, corticales Corpus Amygdaloideum). Die Zählungen, Längen
und Gebiete wurden bei Bregma -4,166 mm (Paxinos und Watson) durchgeführt. Die
gesamtlineare Länge des Hippocampus-CA1-Abschnitts wurde mittels des Image-1 (Universal
Imaging Corp., West Chester, PA) Bildanalysesystems gemessen. Das Gebiet der Thalamus-
und Amygdala-Gebiete wurde mittels eines 100 mm²-Oculargitters gemessen, was 0,25 mm²
auf einer linear kalibrierten Scala unter Verwendung eines 20x-Objektivs entspricht. Die
Zellzählungen wurden als Zellen/mm für die Hippocampus-Region und Zellen/mm² für den
Thalamus und die Amygdala ausgedrückt.
BEISPIEL 4
Verteilung von rhGDNF
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Vierundzwanzig Stunden nach der intrakranialen ventricularen (icv) Injektion von rhGDNF
(100 ug/4 ul) wurden die Ratten mit 10% neutral-gepuffertem Formalin perfundiert, die
Gehirne wurden entfernt; in Paraffin eingebettet und in 5 Mikron auf beladene Objektträger
geschnitten. Die Schnitte wurden auf GDNF immungefärbt unter Verwendung eines
Affinitätsaufgereinigten Kaninchen-Antikörpers gegen rhGDNF. Der Antikörper (0,59 mg/ml) wurde
in einer 1 : 100 Verdünnung verwendet und mit den Schnitten für eine Stunde vor dem
Aufbringen des monovalenten, biotinylierten Anti-Kaninchens inkubiert und darauffolgend die
Omnitags Streptavidin-alkalische-Phosphatase (Lipshaw Immunon, Pittsburgh, PA). Die
Schnitte wurden entwickelt unter Verwendung des Neuen Fuchsin-Substrat-Systems (Dako
Cop., Caropinteria, CA). Die negativen Kontrollen schlossen Schnitte, in denen ein
irrelevanter Antikörper in ähnlichen Konzentrationen gegen den primären Antikörper getauscht
war, und Schnitte von Rätten, denen Phosphat-gepufferte Salzlösung injiziert worden war,
ein. Die Objektträger wurden mit Crystal Mount (Biomeda, Foster City, CA) und später
Permount (Fischer Scientific, Fairlawn, NJ) versehen, um eine permanente Präparation zu
machen. Die Verteilung von rhGDNF wurde unter Verwendung eines Leitz-Mikroskops, das mit
einem Ocular-Mikrometer ausgestattet war, bewertet.
BEISPIEL 5
Bioassay
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Der Bioassay auf rhGDNF- und inaktive GDNF-Aktivität wurde durchgeführt, wie von Lin et
al., J. Biol. Chem., 265 : 8942-8947 (1990) beschrieben, hierin durch Bezugnahme
miteinbezogen. In Kürze, der in vitro-Assay auf GDNF-Aktivität mißt das Überleben von Sympaticus-
Ketten (E9)-Neuronen aus Hühnerembryo. Zweitausend aufgereinigte Neurone wurden in
jeden Napf einer 96-Napf-Platte gebracht, und serielle Verdünnungen von GDNF-Proben
wurden zugegeben. Nach 44 Stunden wurde die neuronale Überlebensrate anhand der Fähigkeit
von lebenden Zellen, den Vitalfarbstoff MTT zu reduzieren (3-4[,5-dimethylthiazol-2-yl]-
2,5-diphenyltetrazolium) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bewertet. Die Bioaktivität
von rhGDNF wurde als ein EC&sub5;&sub0;-Wert ausgedrückt, eine Verdünnung von rhGDNF, die 50%
der maximalen Neuronen-Überlebensrate ergab, auf der Grundlage des MTT-Assay.
BEISPIEL 6
Statistik
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Histologische Vergleiche zwischen Kontroll- und GDNF-behandelten Tieren wurden unter
Verwendung des Students t-Test analysiert. Eine logistische Regression wurde durchgeführt,
um auf einen Dosis-Antwort-Effekt aufgrund von rhGDNF auf Wet dog shakes und
tonischklonnsche Krampfanfälle zu testen, gefolgt von einem Fisher-Exact-Test.
Körpergewichtsvergleiche wurden analysiert unter Verwendung eines Wald-Test, Ein-Weg-Analyse der Varianz
(ANOVA) gefolgt von einer Vielfach-Vergleich-Scheffe-Prozedur.
BEISPIEL 7
Resultate
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Peripherinjektionen von 12 mg/kg Kainat an Fischer 344-Ratten induzierte Wet dog shakes
und Krampfanfälle innerhalb von zwei Stunden und Tod innerhalb der ersten acht Stunden
(Tabelle 1)
Tabelle 1
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Tabelle 1 zeigt die Anti-Krampfmittelaktivität von rhGDNF gegen Kainsäure (12mg/kg s.c.).
Rekombinanter menschlicher GDNF, Trägersubstanz oder inaktiver GDNF wurden (icv)
gegeben 1 Stunde vor der Kainsäure. Die Werte zeigen die Zahl der Ratten an, die Wet dog
shakes, tonisch-klonisch-Krampfanfälle hatten oder starben. Alle Tiere wurden für die ersten
12 Stunden nach der Verabreichung der Kainsäure und dann auf einer täglichen Grundlage
überwacht. Unter Verwendung des Fischer-Exact-Test betrugen die Dosierungs-Level, die für
Wet dog shakes signifikant waren, 50 ug (p = 0,00009) und 5 ug (p = 0,042). Für
tonischklonische Krampfanfall waren die 0,05 (p = 0,012), 0,5 (p = 0,00001), 5 (p = 0,00007) und 50
(p = 0,0000009) Dosierungen signifikant.
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Diese Verhaltensveränderungen, die in Tabelle 1 berichtet werden, waren mit früheren
Studien übereinstimmend, über die in Lothman & Collins, Brain Res., 218: 299-318 (1981)
berichtet wurde. Intraventriculärer rhGDNF (0,05-50 ug/2 ug) schwächte Kainsäure induzierte Wet
dog shakes in einer Dosis-abhängigen Weise signifikant (p = 0,0036) ab. In ähnlicher Weise
wiesen Kainsäure-behandelte Ratten, die rhGDNF auf die intracerebroventriculäre Route in
Dosierungen zwischen (0,5-50 ug/2u1) empfingen, keine tonisch-klonische
Krampfanfallaktivität auf, während 50% der Tiere in der geringen Dosierung von rhGDNF (0,05 ug/21) und alle
Tiere, denen entweder Trägersubstanz (PBS n = 13) oder inaktiver GDNF (2 ug/2.d) injiziert
worden war, tonisch-klonische Krampfanfälle hatten (p = 0,0008), logistische
Regressionsanalyse; siehe Tabelle 1). Keine Todesfälle traten bei Ratten auf, die rhGDNF empfingen,
während Todesfälle bei Ratten auftraten, die Trägersubstanz oder inaktiven GDNF
empfingen. Darüberhinaus verzögerte rhGDNF den Ausbruch von Wet dog shakes.
Trägersubstanzbehandelte Tiere zeigten Wet dog shakes innerhalb von 30 Minuten nach
Kainsäureverabreichung. Rekombinanter menschlicher GDNF (50 und 50 ug/2ul) verzögerte den Ausbruch von
Wet dog shakes um weitere 30-60 Minuten, während die geringeren Dosen den Ausbruch um
nur 15-20 Minuten verzögerte.
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Peripherinjektionen von Kainat erzeugten übereinstimmend selektiven Hippocampus-CA1-,
Thalamus- und Amygdala-neuronalen Verlust, der sieben Tage später nachgewiesen wurde.
Eine histologische Untersuchung des Hippocampus zeigte einen 50-60%-Verlust von CA1-
Pyramidenzellen in allen Tieren, die Trägersubstanz oder inaktiven GDNF (icv) empfingen,
im Vergleich zu normalen Kontrolltieren (Fig. 1 und 2). Der Verlust von CA1-
Pyramidenzellen aufgrund von Kainat war hochsignifikant (p < 0,01, Students t-Test). Die
Verabreichung von rhGDNF (0,5-50 ug/2u1, icv) schwächte den ausgedehnten CA1-
Pyramiden-Zellverlust, der durch Kainat in sowohl linken als auch rechten Hippocampi
induziert worden war, signifikant (p < 0,001) im Vergleich mit den Trägersubstanz (2 ul icv)-,
niedrig dosiertem GDNF (0,05 ug/2u1)- oder inaktiven GDNF (2 ug/2u1)-behandelten Tieren
ab. Die Anzahl an lebensfähigen CA1-Pyramidenzellen war in den rhGDNF (50ug)-
behandelten nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu normalen Tieren (Fig. 1).
Kainsäure verursachte ebenso weitreichenden Thalamus- und Amygdala- neuronalen Verlust,
der durch rhGDNF (0,5-50 ug/pil) (Fig. 1) signifikant (p < 0,01) abgeschwächt war.
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Der Schutz durch rhGDNF (50 ug/2u1) gegenüber Kainsäure-induziertem neuronalem
Zellverlust wurde ebenso anhand der Inhibierung der umfassenden Necrose und Vacuolisierung
der Thalamus-Formation durch Kainsäure ohne rhGDNF gezeigt.
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Immungefärbte Schnitte von Ratten, denen rhGDNF (100 ug/4u1) injiziert worden war,
zeigten eine weitreichende Verteilung des Proteins durch das Ventricularsystem, periveritriculare
Gewebe, den. Subarachnoidalraum und das darunterliegende Neuropil 24 Stunden nach der
Injektion von rhGDNF. Eine positive Immunfärbung war in der lateralen Ansicht des
Hippocampus in den Gebieten CA1b, CA1c, CA2 und CA3 vorhanden, die den hinteren Teilen der
Lateralventricel angrenzen.
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Eine Verabreichung von rhGDNF (SOgg/2u1) icv an naive Tiere erzeugte eine starke
Abnahme hinsichtlich des Körpergewichts und eine geringere Körpergewichtszunahmerate während
der Studiendauer, im Vergleich zu Trägersubstanz-behandelten Tieren (Fig. 3). Die Analyse
zeigte sowohl einen Unterschied in der Körpergewichtsveränderungsrate vom Tag 0 bis Tag 7
(Wald-Test p < 0,001) als auch einen Unterschied in der Gesamtgewichtsveränderung (Wald-
Test p < 0,001). Die Veränderung von der Grundlinie zum Tag 7 im Körpergewicht zwischen
Kainat- und rhGDNF-Dosierungsgruppen sowie die Kainat- und Trägersubsfanz-Gruppe
wurden verglichen (Ein-Weg-ANOVA). Die Analyse zeigte einen klaren Unterschied zwischen
der Gewichtsveränderung unter den Behandlungsgruppen (p < 0,001). Geringere Dosen
rhGDNF scheinen den durch Kainat verursachten Gewichtsverlust abzuschwächen, während
sie keinen zusätzlichen Gewichtsverlust selbst produzieren (Scheffe-Test p < 0,05). Jedoch
scheinen die Zugabe von höheren Dosen von rhGDNF (50 und 5 ug/u1) den Gewichtsverlust
zu verschlimmern (Scheffe-Test p < 0,05) (Tabelle 2).
Tabelle 2
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Hochaufgereiniger rhGDNF förderte die Lebensrate in der Kultur von Sympathicus-Ketten-
Neuronen aus Hühnchen. Der Assay auf das Hühnerembryo-Sympathicus-Ketten-Neuronen-
Überleben zeigte im Hinblick auf chemisch modifizierten rhGDNF (bis zu 7SOng/ml) keine
nachweisbare biologische Aktivität im Vergleich zum aktiven rhGDNF (EC&sub5;&sub0; 10 ng/ml).
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Die inaktiven und aktiven Formen von GDNF wurden auf Lipopolysaccharid (LPS) und E.
coli-Protein (ECP)-Levels getestet. Diese Levels waren > 1 EU/mg bzw. > 50 ppm.
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Die vorhergehende Beschreibung der Erfindung dient als Beispiel zu Illustrations- und
Erklärungszwecken.