DE69912304T2

DE69912304T2 - Verwendung von staurosporine derivaten zur behandlung von okularen neovaskularen erkrankungen

Info

Publication number: DE69912304T2
Application number: DE69912304T
Authority: DE
Inventors: Kimbro Romulus BRAZZELL; Marjorie Jeanette WOOD; Anthony Peter CAMPOCHIARO; Elizabeth Frances KANE
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1998-11-23
Filing date: 1999-11-22
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2019-11-23
Also published as: CA2348890C; ES2211197T3; WO2000030651A1; ID29970A; CN1328462A; PT1131073E; ATE252387T1; ZA200103925B; AU1506600A; CA2348890A1; KR100698449B1; AU761092B2; BR9915569A; CN1172673C; DE69912304D1; NO328085B1; EP1131073A1; DK1131073T3; NO20012490D0; IL142757A0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung von Staurosporinderivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer okularen neovaskulären Krankheit, z. B. der retinalen Neovaskularisation und der Choroidea-Neovaskularisation.
Die Retina des Auges erhält ihre Blutversorgung von zwei Vaskularbahnen, die retinalen Gefäße, die die inneren zwei Drittel der Retina versorgen, und die Choroideagefäße, die das äußere Drittel versorgen. Ein Schaden an retinalen Blutgefäßen, der zu einem Verschluss von retinalen Kapillaren führt, tritt bei mehreren Krankheitsprozessen auf einschließlich diabetischer Retinopathie, Retinopathie der Frühgeburt, Okklusion der verzweigten retinalen Vene und Okklusion der zentralen retinalen Vene; sie werden kollektiv als ischämische Retinopathien bezeichnet. Die retinale Ischämie führt zu einer Freisetzung einer oder mehrerer angiogener Faktoren, die die Neovaskularisation stimulieren. Die neuen Gefäße brechen durch die interne Begrenzungsmembran (ILM), die die innere Oberfläche der Retina auskleidet, und wachsen entlang der äußeren Oberfläche des Glasköpers. Diese vereinnahmen viele andere Zellen und erzeugen Schichten aus Gefäßen, Zellen und extrazellulärer Matrix, die einen Zug auf die Retina ausüben, was oft zu einer Retinaablösung und zum ernsthaften Sehverlust führt.
Die Choroidea-Neovaskularisation tritt bei einer Anzahl von Krankheitsprozessen auf, von denen die allgemeinste die mit dem Alter verbundene makulöse Degeneration ist. In diesem Zustand wird die Makula, die speziell für die genaue und detaillierte Sehkraft angepasst ist, durch einen allmählichen Tod von Fotorezeptor- und RPE-Zellen geschädigt. Dies bildet den Degenerationsteil der Krankheit, der zum allmählichen Verlust der zentralen Sehkraft führt. Der Grund für den Zelltod ist unbekannt und es gibt gegenwärtig keine Behandlung. Wenn die Degeneration auftritt, gibt es bei neuen Blutgefäßen eine Tendenz, von der Choroidea zu wachsen, um in die sub-RPE- und subretinalen Räume einzudringen. Dieser Prozess wird Choroidea-Neovaskularisation (CNV) genannt und er führt oft zum schnellen und ernsthaften Verlust der Sehkraft durch Bluten und Vernarbung. Falls das CNV gut charakterisiert ist und sich nicht unter dem Zentrum der Fovea befindet, was für eine kleine Minderheit von Patienten. erfüllt ist, kann eine Laserbehandlung manchmal helfen. Sogar wenn der Laser anfänglich erfolgreich ist, gibt es eine hohe Rate von wieder auftretendem CNV und einem Verlust der Sehkraft. Eine Behandlung, die auf den Stimulus für das Wachstum von Blutgefäßen gerichtet ist, wird benötigt und würde Patienten mit entweder retinaler oder choroidealer Neovaskularisation zugute kommen.
Die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zum Behandeln oder Verhindern okularer neovaskulärer Krankheiten einschließlich der retinalen Neovaskularisation und choroidealer Neovaskularisation. Das Verfahren besitzt den Schritt des Verabreichens einer effektiven Menge eines Staurosporinderivats oder eines Salzes davon.
Die Staurosporinbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung ist hoch wirksam beim Hemmen und Verhindern der okularen Neovaskularisation, anders als die Laserbehandlung des Stands der Technik, die eine begrenzte Wirksamkeit besitzt. Zusätzlich ist die Staurosporinbehandlung einfach zu verabreichen, anders als die Behandlungsverfahren des Stands der Technik, z. B. Laserbehandlung, die invasiv sind und eine komplexe Ausrüstung erfordern.
Das Arzneimittel gemäß der vorliegenden Erfindung dient zur Benutzung in einem Verfahren zum Behandeln okularer neovaskulärer Krankheiten. Das Verfahren verwendet ein Arzneimittel, das ein Staurosporinderivat enthält. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Verbindungen der Formel (I) hoch nützlich zum Behandeln der okularen Neovaskularisation, einschließlich der retinalen Neovaskularisation und der choroidealen Neovaskularisation sind.
Demgemäß bezieht sich die vorliegende Endung auf die Verwendung einer Verbindung der Formel (I)
wobei R für ein Hydrocarbylradikal R^o oder ein Acylradikal Ac steht, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Verhinderung okularer neovaskulärer Krankheiten.
Geeignete Hydrocarbyhadikale umfassen acyclische, carbocyclische und carbocyclisch-acyclische Hydrocarbylradikale mit einer maximalen Gesamtzahl von Kohlenstoffatomen von vorzugsweise 30, insbesondere 18. Zusätzlich geeignete Hydrocarbykadikale sind heterocyclische Radikale und heterocyclisch-acyclische Radikale. Die Hydrocarbylradikale (R^o) können gesättigt oder ungesättigt und substituiert oder unsubstituiert sein. Geeignete Acylradikale umfassen optional funktionell modifizierte Carbonsäure und organische Sulfonsäure und optional veresterte Phosphorsäure, z. B. Pyro- oder Ortho-Phosphorsäure.
Bevorzugte acyclische Hydrocarbyh-adikale umfassen C₁-C₂₀tλlkylradikale, C₁-C₂₀Hydroxyalkyhadikale, deren Hydroxygruppe in einer beliebigen Position außer der 1-Position ist, Cyano[C₁-C₂₀]Alkylradikale, Carboxy[C₁-C₂₀]Alkykadikale, deren Carboxygruppe, und C₃-C₂₀Alkenylradikale, deren freie Valenz sich nicht an dem selben Kohlenstoffatom wie die Doppelbindung befindet. Beispielhafte acyclische Hydrocarbyhadikale sind Radikale von Niederalkyl, z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl und Heptyl, Niederalkenyl, z. B. Propenyl, 2- oder 3-Methallyl und 2- oder 3-Butenyl, Niederalkadienyl, z. B. 1-Penta-2,4-dinyl, und Niederalkinyl, z. B. Propargyl oder 2-Butinyl. Bevorzugte carbocyclische Hydrocarbylradikale sind Radikale von mono-, bi- oder polycyclischem Cycloalkyl, z. B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Bicyclo[2,2,2]octyl, 2-Bicyclo[2,2,1]heptyl und Adamantyl, Cycloalkenyl, Cycloalkandienyl, und entsprechendes Aryl. Arykadikale umfassen Radikale von Phenyl, Naphthyl (z. B. 1- oder 2-Naphthyl), Biphenylyl (z. B. 4-Biphenylyl), Anthryl, Fluorenyl, Azulenyl und aromatische Analoga davon mit einem oder mehreren gesättigten Ringen. Bevorzugte carbocyclisch-acyclische Radikale sind acyclische Radikale, die einen oder mehrere carbocyclische Radikale tragen. Heterocyclische Radikale und heterocyclisch-acyclische Radikale umfassen monocyclische, bicyclische, polycyclische, aza-, thia-, oxa-, thaza-, oxaza-, diaza-, triaza- und tetraza-cyclische Radikale aromatischen Charakters.
Beispielhafte Acylradikale, die von einer optional funktionell modifizierten Carbonsäure (Ac¹) erhalten sind, besitzen die Formel Z-C(=W)-, wobei W für Sauerstoff, Schwefel oder Imino steht und Z für Wasserstoff, Hydrocarbyl R^o, Hydrocarbyloxy R^oO oder Amino steht. Bevorzugt steht W für Sauerstoff oder Schwefel und Z für C₁-C₇Alkyl, insbesondere C₁-C₄Alkyl, das optional mit Halogen, Carboxy oder C₁-C₄Alkoxycarbonyl substituiert ist. Zusätzlich bevorzugtes Z ist Phenyl, Pyridyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Benzofuranyl oder Benzimidazolyl, von denen jedes unsubstituiert oder mit C₁-C₄Alkyl, C₁-C₄Alkoxy, Halogen, Nitro, Trifluoromethyl, Carboxy, C₁-C₄Alkoxycarbonyl, Methylendioxy, Cyano substituiert ist und/oder ein Salz davon. Bevorzugte Ac¹ Acylradikale besitzen die Formel R_b ^o-CO-, wobei R_b ^o für Wasserstoff, Benzoyl oder ein Hydrocarbylradikal, z. B. C₁-C₁₉Alkylradikal, steht, das optional mit einer Carboxygruppe, Cyanogruppe, Estergruppe, Aminogruppe oder Halogen substituiert ist. Eine andere Gruppe bevorzugter Ac¹ Acrylradikale besitzen die Formel R^o-O-CO-.
Noch eine andere Gruppe bevorzugter Ac¹ Acrylradikale besitzen die Formel
wobei R₁ und R₂ unabhängig ausgewählt aus Wasserstoff und unsubstituiertem acyclischen C₁-C₇Hydrocarbyl, bevorzugt C₁-C₄Alkyl und C₃-C₇Alkenyl sind. R₁ und R₂ können unabhängig monocyclisches Aryl, Aralkyl oder Aralkenyl mit einem Maximum von 10 Kohlenstoffatomen sein, von denen jedes optional mit C₁-C₄Alkyl, C₁-C₄Alkoxy, Halogen und/oder Nitro substituiert sein kann. Besonders erwünschte Radikale dieser Gruppe besitzen Wasserstoff als R₁ und optional substituiertes C₁-C₄Alkyl, C₃-C₇Alkenyl, Phenyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Benzofuranyl oder Benzimidazolyl als R₂.
Beispielhafte Acyhadikale, die von einer organischen Sulfonsäure (Ac²) erhalten sind, besitzen die Formel R^o-SO₂-, wobei R^o ein Hydrocarbykadikal ist. Bevorzugt steht R^o des Sulfonsäureacylradikals für C₁-C₇Alkyl, Phenyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Benzofuranyl oder Benzimidazolyl, von denen jedes unsubstituiert ist oder mit C₁-C₄Alkyl, C₁-C₄Alkoxy, Halogen, Nitro, Trifluoromethyl, Carboxy, C₁-C₄Alkoxycarbonyl, Methylendioxy, Cyano substituiert ist und/oder ein Salz davon.
Beispielhafte Acylradikale, die von optional veresterter Phosphorsäure (Ac³) erhalten sind, besitzen die
wobei R₁ und R₂ unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, unsubstituiertem acyclischen C₁-C₇Hydrocarbyl, bevorzugt C₁-C₄Alkyl und C₃-C₇Alkenyl. R₁ und R₂ können unabhängig monocyclisches Aryl, Aralkyl oder Aralkenyl mit einem Maximum von 10 Kohlenstoffatomen sein, von denen jedes optional mit C₁-C₄Alkyl, C₁-C₄Alkoxy, Halogen und/oder Nitro substituiert ist.
Zusätzlich geeignete Staurosporinderivate umfassen Staurosporine der Formel (I), bei der R aus einer α-Aminosäure erhalten ist, die ausgewählt ist aus Glycin, Phenylglycin, Alanin, Phenylalanin, Prolin, Leucin, Serin, Valin, Tyrosin, Arginin, Histidin und Asparagin oder ein Salz davon. Geeignete Staurosporinderivate für die vorliegende Erfindung sind detaillierter in US 5 093 330 A , Caravatti et al., offenbart. Die Beschreibung der Staurosporinderivate in dem Patent ist hier durch Bezugnahme enthalten.
Besonders bevorzugte Staurosporinderivate der Formel (I) für die vorliegende Erfindung umfassen:
N-(3-Carboxypropionyl)-staurosporin, N-Benzoylstaurosporin, N-Trifluoracetylstaurosporin, N-Methylaminothiocarbonylstaurosporin, N-Phenylcarbamoylstaurosporin, N-(3-Nitrobenzoyl)-staurosporin, N-(3-Fluorobenzoyl)-staurosporin, N-tert-Butoxycarbonylstaurosporin, N-(4-Carboxybenzoyl)-staurosporin, N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-staurosporin, N-Alanylstaurosporin, N-Ethylstaurosporin, N-Carboxymethylstaurosporin, N-[(tert-Butoxycarbonylamino)-acetyl]-staurosporin, N-(2-Aminoacetyl)-staurosporin und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel (I) als das aktive Ingredienz enthalten, können enteral, nasal, buccal, rectal, topical, oral und parenteral verabreicht werden, z. B. intravenöse, intramuskuläre, intravitreale, sub-conjunctivale oder subcutane Verabreichung, um die okulare Neovaskularisation bei Säugersubjekten, insbesondere beim Menschen, zu behandeln. Die Zusammensetzungen können das aktive Ingredienz allein oder, bevorzugt, das aktive Ingredienz zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Die wirksame Dosierung des aktiven Ingredienz hängt von dem Typ der Zielkrankheit, wie auch von der Spezies, dem Alter, dem Gewicht und dem physischen Zustand des Subjektes, pharmakokinetischen Daten und der Art der Verabreichung ab.
Die Verbindungen der Formel (I) werden in einer Menge verabreicht, die gegen pathologische Zustände eines Säugers, z. B. eines Menschen, wirksam ist. Für ein Individuum, das ein Körpergewicht von ungefähr 70 kg besitzt, beträgt die tägliche systemisch verabreichte Dosis ungefähr 0,1 g bis ungefähr 20 g, bevorzugt ungefähr 0,5 g bis ungefähr 5 g des aktiven Ingredienz, und geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können ungefähr 1% bis ungefähr 95% des aktiven Ingredienz aufweisen. Geeignete Einheitsdosisformen umfassen beschichtete und unbeschichtete Tabletten, Ampullen, Glasfläschchen, Suppositorien oder Kapseln. Andere geeignete Dosierungsformen umfassen injizierbare, intraokulare Vorrichtungen, intravitreale Vorrichtungen, Salben, Cremes, Pasten, Schäume, Tinkturen, Lippenstifte, Augentropfen, Ohrentropfen, Sprays, Dispersionen und dergleichen. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen werden in einer in der Technik bekannten Weise erzeugt, z. B. mittels konventioneller Misch-, Granulier-, Beschichtungs-, Auflösungs- oder Lyophilisierprozessen.
Vorzug wird der Verwendung von Lösungen des aktiven Ingredienz und auch Suspensionen oder Dispersionen gegeben, insbesondere isotonische wässrige Lösungen, Dispersionen oder Suspensionen. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen, die das aktive Ingredienz enthalten, können Träger besitzen, z. B. Mannitol und Stärke, Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Salze zum Regulieren des osmotischen Druckes, Puffer und dergleichen. Die Zusammensetzungen werden in einer in der Technik bekannten Weise erzeugt, z. B. mittels herkömmlicher Auflösungs- und Lyophilisierprozesse. Eine Lösungs- oder Suspensionsform der Zusammensetzung kann viskositätserhöhende Mittel enthalten, z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylpryrrolidon und Gelatinen, und Lösungsvermittler, z. B. Tween 80 [Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat, Handelsmarke von ICI Americas, Inc., USA].
Geeignete Träger umfassen Füllstoffe, z. B. Zucker, z. B. Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol, Cellulosezubereitungen, Calciumphosphate, z. B. Tricalciumphosphat und Calciumhydrogenphosphat, Binder, z. B. Stärken, Methylcellulose, Hydroxypropyhnethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und Polyvinylpynolidon, und, falls erwünscht, Sprengmittel, z. B. Stärken, vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Alginsäure oder Salze davon. Zusätzlich geeignete Bindemittel sind Mittel zur Erhaltung der Rieselfähigkeit und Gleitmittel, z. B. Kieselsäure, Talk, Stearinsäure und Salze davon, wie beispielsweise Magnesium- oder Calciumstearat, Polyethylenglycol und Derivate davon.
Das aktive Ingredienz, d. h. ein Staurosporinderivat, der vorliegenden Erfindung hemmt vollständig oder im Wesentlichen vollständig die okulare Neovaskularisation, insbesondere die retinale Neovaskularisation und die choroideale Neovaskularisation. Zusätzlich wird eine Präventivwirksamkeit beobachtet, wenn eine Verbindung der vorliegenden Erfindung an ein Individuum verabreicht wird. In jedem Fall ist die Wirkung auf die pathologischen Blutgefäße dramatisch und nachhaltig mit vollständiger oder fast vollständiger Hemmung, aber es gibt keinen identifizierbaren toxischen Effekt auf reife retinale Gefäße.
Die vorliegende Erfindung wird weiter mit den folgenden Beispielen veranschaulicht. Jedoch sollen diese nicht als die Erfindung darauf beschränkend verstanden werden.
Beispiel 1
Ischämische Retinopathie wird in C57/BL6J-Mäusen durch ein Verfahren erzeugt, das durch Smith et al., Oxygen-induced Retinopathy in the Mouse, Invest. Ophthahnol. Vis. Sci. 35, 101–111 (1994), beschrieben ist. 7 Tage alte Mäuse und ihre Mütter werden in einen luftdichten Inkubator gebracht und einer Atmosphäre von 75 ± 3% Sauerstoff 5 Tage lang ausgesetzt. Die Inkubatortemperatur wird auf 23 ± 2°C gehalten und Sauerstoff wird alle 8 h mit einem Sauerstoffanalysator gemessen. Nach 5 Tagen werden die Mäuse aus dem Inkubator entfernt, in Raumluft gebracht und einer Arzneimittelbehandlung unterzogen. N-Benzoylstaurosporin (NBS) wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst und auf Endkonzentration mit Wasser verdünnt; die maximale Konzentration von DMSO beträgt 1%. Ein Träger (1% DMSO) oder ein Träger, der verschiedene Konzentrationen des Arzneimittels enthält (Volumen = 10 μl/g Körpergewicht), wird in den Magen durch eine Sonde gebracht. Verschiedenen Mäusen werden 60, 300 oder 600 mg NBS pro kg Körpergewicht gegeben. Als eine Kontrolle wird einer Gruppe von Mäusen der Träger ohne NBS gegeben.
Nach 5 Tagen der Behandlung werden die Mäuse getötet, die Augen werden schnell entfernt und in einer optimalen Schnitttemperatur-Einbettungsverbindung (OCT; Miles Diagnostics, Elkhart, IN) eingefroren oder in 10%-igem Phosphat-gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Erwachsene C57BL6J-Mäuse werden auch durch eine Sonde mit dem Arzneimittel oder dem Vehikel behandelt und nach 5 Tagen werden sie getötet und ihre Augen werden weiter verarbeitet für gefrorene oder Paraffinabschnitte.
Gefrorene Abschnitte (10 um) der Augen von mit Arzneimittel behandelten und Kontrollmäusen werden histochemisch mit biotinyliertem Griffonia-Simplicifolia-Lectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gefärbt, das selektiv an endotheliale Zellen bindet. Objektträger werden in Methanol/H₂O₂ 10 Minuten lang bei 4°C inkubiert, mit 0,05 m Tris-gepufferter Salzlösung, pH 7,6 (TBS), gewaschen und 30 Minuten lang in 10%igem normalen Schweineserum inkubiert. Die Objektträger werden 2 h lang bei Raumtemperatur mit biontinyliertem Lectin inkubiert und nach dem Spülen mit 0,05 m TBS werden sie mit Avidin gekoppelt an Peroxidase (Vector Laboratories) 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem sie 10 Minuten lang mit 0,05 m TBS gewaschen wurden, werden die Objektträger mit Diaminobenzidin inkubiert, um ein braunes Reaktionsprodukt zu ergeben. Einige Objektträger werden mit Hematoxyln kontrastgefärbt und alle werden mit Cytoseal fixiert.
Um quantitative Bewertungen auszuführen, werden serielle 10 μm Abschnitte durch die Hälfte jedes Auges geschnitten und Abschnitte, die ungefähr 50 bis 60 μm getrennt sind, werden mit Lectin gefärbt, was 13 Abschnitte pro Auge für die Analyse ergibt. Lectin-gefärbte Abschnitte werden mit einem Axioskop-Mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) untersucht und die Bilder werden unter Verwenden einer 3-CCD-Farbvideokamera (IK-TU40A, Toshiba, Tokio, Japan) und einem Framegrabber digitalisiert. Image-Pro-Plus-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) wird zum Darstellen Lectin-gefärbter Zellen auf der Oberfläche der Retina verwendet und ihre Fläche wird gemessen. Das Mittel aus 13 Messungen jedes Auges wird als einzelner experimenteller Wert verwendet.
Die Mäuse mit ischämischer Retinopathie, die mit dem Träger ohne NBS behandelt sind, zeigen einen merklichen Anstieg in der Fläche der endothelialen Zellfärbung über die Retina mit großen Zellgruppen auf der Retinaoberfläche im Vergleich zu nicht-ischämischen Mäusen, die normale Gefäße in den oberflächlichen und tiefen Kapillarbahnen mit wenigen Verbindungsgefäßen zeigen. Ischämische Mäuse, denen 600 mg/kg NBS einmal am Tag 5 Tage lang gegeben wurde, besitzen eine dramatische Abnahme in der endothelialen Zellfärbung auf der Ober fläche und innerhalb der Retina im Vergleich zu den mit Träger behandelten Mäusen. Tatsächlich ist die endotheliale Zellfärbung innerhalb der Retina der mit NBS behandelten ischämischen Mäusen geringer als jene der nicht-ischämischen Mäuse. Eine starke Vergrößerung zeigt, dass es keine identifizierbaren endothelialen Zellen auf der Oberfläche der Retina gibt, was anzeigt, dass es eine vollständige Hemmung der Neovaskularisation gibt. Es gibt auch eine auffallende Abwesenheit endothelialer Zellfärbung in der inneren nuklearen Schicht und der äußeren plexiformen Schicht, wo sich die tiefen Kapillarbahnen normalerweise befinden.
Die Mäuse mit ischämischer Retinopathie, denen 300 mg/kg oder 60 mg/kg NBS zweimal am Tag durch eine Sonde gegeben wurde, zeigen einige Gruppen von Neovaskularisation auf der Oberfläche der Retina, d. h. weniger als die Gruppen in der Retina der mit dem Träger behandelten Kontrollmäuse. Die Retinas von mit NBS behandelten Mäusen zeigen auch etwas Abnahme der endothelialen Färbung innerhalb der Retina. Das Ergebnis der Bildanalyse zeigte, dass die endotheliale Zellfärbung auf und in den Retinas von Mäusen, die mit 600 oder 60 mg/kg einmal am Tag behandelt wurden, beträchtlich geringer war als jene der mit Träger behandelten Mäuse und zeigte einen dosisabhängigen Effekt im Vergleich zu den Mäusen, die zweimal am Tag behandelt wurden. Die Ergebnisse zeigen klar, dass das Staurosporinderivat die retinale Neovaskularisation hemmt.
Beispiel 2
Erwachsenen C57BL6J-Mäusen werden der Träger oder 600 mg/kg NBS durch eine Sonde einmal am Tag gegeben und nach 5 Tagen werden sie getötet und ihre Augen werden, wie im Beispiel 1, verarbeitet.
Die Bildanalyse zeigt, dass es keinen Unterschied in der Gesamtfläche der endothelialen Färbung in der Retina oder dem Erscheinungsbild retinaler Gefäße in den mit NBS behandelten Mäusen im Vergleich zu mit Träger behandelten Mäusen gibt. Die Analyse zeigt auch keinen Unterschied in der Menge der retinalen endothelialen Zellfärbung zwischen den mit NBS und mit dem Träger behandelten Mäusen. Dies zeigt, dass das Staurosporinderivat nicht toxisch für endotheliale Zellen reifer Gefäße ist.
Beispiel 3
Würfe neugeborener C57BL6J-Mäuse (neonatale Mäuse) werden in Behandlungs- und Kontrollgruppen unterteilt, die tägliche subkutane Injektionen von 100 mg/kg des Arzneimittels bzw. des Trägers erhielten. Am Tag 7 oder 10 ihres Alters werden die Mäuse mit Äther anästhesiert und mit 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 50 mg/ml mit Fluorescein markiertes Dextran enthält (2 × 10⁶ Durchschnittsmolekulargewicht, Sigma, St. Louis, MO), wie von Tobe et al., Evolution of Neovascularization in Mice with Overexpression of VEGF in Photoreceptors, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 39, 180–188 (1998), beschrieben, durchtränkt. Die Augen werden entfernt und 1 h lang in 10%igem Phosphat-gepufferten Formalin fixiert. Die Cornea und die Linse werden entfernt und die gesamte Retina wird sorgfältig aus der Augenwanne entfernt. Radiale Schnitte werden von dem Rand der Retina bis zum Äquator in allen 4 Quadranten erzeugt und die Retina wird in Aquamount mit den nach oben gerichteten Fotorezeptoren flach angeordnet. Die flachen Anordnungen werden mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht und die Bilder werden unter Verwenden einer 3-CCD-Farbvideokamera und einem Framegrabber digitalisiert. Image-Pro^TM Plus wird zum Messen der Entfernung vom Zentrum des optischen Nervs zur führenden Front sich entwickelnder retinaler Gefäße in jedem Quadranten gemessen und das Mittel wird als ein einzelner experimenteller Wert verwendet.
Am Tag 7 des Alters erreichen die retinalen Gefäße in den mit Träger behandelten Mäusen fast den peripheren Rand der Retina, aber in den mit NBS behandelten Mäusen erstrecken sich die retinalen Gefäße nur leicht mehr als halb zu der Peripherie. Am Tag 10 des Alters ist die oberflächliche Kapillarbahn vervollständigt und erstreckt sich den ganzen Weg zum peripheren Rand der Retina und die tiefe Kapillarbahn ist teilweise entwickelt.
Aber in den mit NBS behandelten Mäusen hat die oberflächliche Kapillarbahn noch nicht den Rand der Retina erreicht. Der Abstand von dem optischen Nerv zu der vaskulären Front wird durch Bildanalyse berechnet, und die Unterschiede zwischen den behandelten Mäusen und den Kontrollmäusen am Tag 7 und 10 des Alters ist statistisch signifikant. Dies zeigt an, dass das Staurosporinderivat die retinale vaskuläre Entwicklung hemmt.
Beispiel 4
C57BL/6J-Mäuse werden gemäß der Association for Research in Vision and Ophthalmology Resolution zur Behandlung von Tieren behandelt. Die choroideale Neovaskularisation wird durch Modifizieren einer zuvor beschriebenen Technik, Tobe et al., Targetet disruption of the FGF2 gene does not prevent choroidal neovascularization in a murine model, Amer. J. Path , in Druck, erzeugt. Kurz gesagt werden 4 bis 5 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse mit Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert und die Pupillen werden mit 1%igem Tropicamid geweitet. 3 Verbrennungen einer Krypton-Laser-Photocoagulation (100 um Spotgröße, 0,1 Sekundendauer, 150 mW) werden jeder Retina verabreicht unter Verwenden des Schlitzlampen-Verabreichungssystems eines Coherent Model 920 Photocoagulators und einem mit der Hand gehaltenen Bedeckungsschlitz als eine Kontaktlinse. Die Verbrennungen werden in der 9, 12 und 3 Uhr-Position des posterioren Pols der Retina ausgeführt. Die Erzeugung einer Blase zur Zeitpunkt des Laserns, die eine Ruptur der Bruchmembran anzeigt, ist ein wichtiger Faktor beim Erhalten einer CNV, sodass nur Mäuse, in denen für alle 3 Verbrennungen eine Blase erzeugt wurde, umfasst sind. 10 Mäuse werden willkürlich einer Behandlung nur mit dem Träger zugeordnet und 10 Mäuse werden zugeordnet, um einen Träger zu erhalten, der 400 mg/kg/Tag NBS enthielt, das oral durch eine Sonde gegeben wird. Nach 14 Tagen werden die Mäuse mit einer Überdosis Pentobarbitalnatrium getötet und ihre Augen werden schnell entfernt und in einer optimalen Schnitttemperatur-Einbettungsverbindung (OCT) gefroren. Gefrorene serielle Abschnitte (10 μm) werden durch den gesamten Umfang jeder Verbrennung geschnitten und histochemisch mit biotinyliertem Griffonia-Simplicifolialectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gefärbt, das selektiv an endotheliale Zellen bindet. Objektträger werden in Methanol/H₂O₂ 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert, mit 0,05 m Tris-gepufferter Salzlösung, pH 7,4 (TBS) gewaschen, und 30 Minuten lang in 10%igem normalen Schweineserum inkubiert. Die Objektträger werden mit 0,05 m TBS gewaschen und 2 h lang bei 37°C mit biotinyliertem Lectin inkubiert. Nachdem sie mit 0,05 m TBS gewaschen wurden, werden die Objektträger mit Streptavidin-Phosphatase (Kirkegaard and Perry Laboratories, Cabin John, MD) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubierung in 0,05 m Tris-Puffer, pH 7,6, werden die Objektträger in Hostomark Red (Kirkegaard and Perry) entwickelt, um ein rotes Reaktionsprodukt zu ergeben, und mit Cytoseal (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) fixiert. Einige Objektträger werden mit Contrast Blue (Kirkegaard and Perry) kontrastgefärbt.
Um quantitative Bewertungen auszuführen, werden mit Lectin gefärbte Abschnitte mit einem Axioskop-Mikroskop (Zeiss, Thomwood, NY) untersucht und die Bilder werden unter Verwenden einer 3-CCD-Farbvideokamera (IK-TU40A, Toshiba, Tokio, Japan) und einem Framegrabber digitalisiert. Image-Pro-Plus-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) wird zum Darstellen und Messen der Fläche mit Lectin-gefärbter Blutgefäße in dem subretinalen Raum verwendet. Für jede Wunde werden Flächenmessungen für alle Abschnitte durchgeführt, auf denen einige der Wunden auftraten und zusammenaddiert, um die Messung der integrierten Flächen zu ergeben. Die Werte werden im Durchschnitt ermittelt, um experimentelle Werte pro Maus zu ergeben. Ein 2-Proben-t-Test für ungleiche Varianzen wird ausgeführt, um den Logarithmus der mittleren integrierten Fläche zwischen Behandlungs- und Kontrollmäusen zu vergleichen.
Zwei Wochen nach dem Lasern zeigen alle Wunden in beiden Gruppen von Mäusen eine Diskontinuität in der Bruchmembran mit ungefähr gleichem Schaden für die darüber liegende Retina. Alle Mäuse, die mit dem Träger allein behandelt wurden, zeigen große Flächen choroidealer Neovaskularisation an dem Ort jeder Laser-induzierten Ruptur der Bruchmembran. Es gibt eine Proliferation von retinalen pigmentierten epithelialen Zellen entlang des Randes der neuen Gefäße. Die retinalen Blutgefäße, die mit Lectin gefärbt sind, sind in der darüber liegenden Retina zu sehen. Im Gegensatz dazu besitzen alle Mäuse, denen 400 mg/kg/Tag NBS gegeben wurde, eine sehr geringe choroideale Neovaskularisation, falls überhaupt, an der Stelle jeder Laser-induzierten Ruptur der Bruchmembran. In den meisten Fällen gibt es kein identifizierbares mit Lectin gefärbtes neovaskuläres Gewebe über die gesamte Verbrennung, aber einige Verbrennungen enthielten Bereiche, in denen es dünne Scheiben mit Lectin gefärbten Gewebes gibt. Es gibt eine milde Proliferation der RPE-Zellen. Trotz der merklichen Abnahme in der choroidealen Neovaskularisation in den Augen behandelter Mäuse erscheinen die darüber liegenden retinalen Gefäße normal. Dies ist am besten in Abschnitten ohne Kontrastfärbung zu sehen.
Die Quantifizierung der integrierten Fläche der Lectinfärbung pro Wunde zeigte eine dramatische Abnahme bei den Mäusen, die mit NBS (0,0090182 ± 0,0017540 mm²) behandelt wurden, im Vergleich zu Wunden in Mäusen, die mit dem Träger allein (0,0695621 ± 0,0073960 mm²) behandelt wurden. Dieser Unterschied ist statistisch hoch signifikant (p = 0,004). Diese Ergebnisse zeigen klar, dass das Staurosporinderivat dramatisch die choroideale Neovaskularisation hemmt.
Die obigen Beispiele veranschaulichen die Wirksamkeit des aktiven Ingredienz. Die Staurosporinderivate der vorliegenden Erfindung sind hoch wirksam bei der vollständigen oder im Wesentlichen vollständigen Hemmung der retinalen und choroidealen Neovaskularisation, und das aktive Ingredienz kann einem Patienten durch ein Arzneimittelbehandlungsmodus verabreicht werden, der konventionell und/oder praktisch ist.

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon,
wobei R für ein Hydrocarbylradikal R^o oder ein Acylradikal Ac steht, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Verhinderung von okularen neovaskulären Krankheiten.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Hydrocarbylradikal ein acyclisches, carbocyclisches, carbocyclischacyclisches, heterocyclisches oder heterocyclisch-acyclisches Hydrocarbylradikal ist.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der das acyclische Hydrocarbykadikal ein Radikal ist aus C₁-C₂₀Alkylradical, C₂-C₂₀Hydroxyalkylradikal, dessen Hydroxygruppe in einer beliebigen Position außer der 1-Position ist, Cyano[C₁-C₂₀]Alkylradikal, Carboxy[C₁-C₂₀]Alkylradikal, dessen Carboxygruppe, oder C₃-C₂₀Alkenylradikal, dessen freie Valenz sich nicht an dem selben Kohlenstoffatom wie die Doppelbindung befindet.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der das carbocyclische Hydrocarbylradikal ein Radikal ist aus mono-, bi- oder polycyclischem Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkandienyl und Aryl.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der die carbocyclisch-acyclischen Radikale ein acyclisches Radikal ist, das eines oder mehrere carbocyclische Radikale trägt, und das heterocyclische Radikal und das heterocyclischacyclische Radikal monocyclische, bicyclische, polycyclische, aza-, thia-, oxa-, thaza-, oxaza-, diaza-, triaza- und tetraza-cyclische Radikale aromatischen Charakters sind.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Acylradikal eine optional funktional modifizierte Carbonsäure, organische Sulfonsäure oder optional veresterte Phosphorsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Acylradikal die Formel Z-C(=W)- besitzt, wobei W für Sauerstoff, Schwefel oder Imino und Z für Wasserstoff, C₁-C₇Alkyl, Amino, Phenyl, Pyridyl, Furyl, Thienyl, Imidazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Benzofuranyl oder Benzimidazolyl steht.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Acylradikal die Formel R_b ^o-CO- besitzt, wobei R_b ^o für Wasserstoff, Benzoyl oder ein C₁-C₁ ₉Alkylradikal steht.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Acylradikal die Formel R^o-O-CO- besitzt, wobei R^o ein acyclisches, carbocyclisches, carbocyclisch-acyclisches, heterocyclisches oder heterocyclisch-acyclisches Hydrocarbylradikal ist.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Acylradikal die Formel
besitzt, wobei R₁ und R₂ unabhängig aus Wasserstoff und unsubstituiertem acyclischen C₁-C₇Hydrocarbyl ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Acylradikal die Formel R^o-SO₂- besitzt, wobei R^o ein Hydrocarbylradikal ist.
Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Acylradikal die Formel
besitzt, wobei R, und R₂ unabhängig aus Wasserstoff, unsubstituiertem acyclischen C₁-C₇Hydrocarbyl ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das aktive Ingredienz ausgewählt ist aus N-(3-Carboxypropionyl)-staurosporin, N-Benzoylstaurosporin, N-Trifluoracetylstaurosporin, N-Methylaminothiocarbonylstaurosporin, N-Phenylcarbamoylstaurosporin, N-(3-Nitrobenzoyl)-staurosporin, N-(3-Fluorobenzoyl)-staurosporin, N-tert-Butoxycarbonylstaurosporin, N-(4-Carboxybenzoyl)-staurosporin, N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-staurosporin, N-Alanylstaurosporin, N-Ethylstaurosporin, N-Carboxymethylstaurosporin, N-[(tert-Butoxycarbonylamino)-acetyl]-staurosporin, N-(2-Aminoacetyl)-staurosporin und Salze davon.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das aktive Ingredienz N-Benzoylstaurosporin oder ein Salz davon ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Behandlung und/oder Verhinderung die Behandlung und/oder Verhinderung von menschlichen okularen neovaskulären Krankheiten ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Behandlung und/oder Verhinderung die Behandlung und/oder Verhinderung von menschlichen retinalen neovaskulären Krankheiten ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Behandlung und/oder Verhinderung die Behandlung und/oder Verhinderung von menschlichen choroidealen neovaskulären Krankheiten ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Behandlung und/oder Verhinderung die Behandlung und/oder Verhinderung von okularen neovaskulären Krankheiten von Säugern ist.