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Die vorliegende Beschreibung betrifft ganz allgemein die Reinigung
von Proteinen und insbesondere ein Verfahren zur Reinigung von α-1-
Proteinaseinhibitor aus Plasma-Fraktionen durch Kationaustausch unter
solchen Bedingungen, daß aktiver α-1-PI nicht an die Säule,
kontaminierende Proteine jedoch an diese gebunden werden.
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α-1-Proteinaseinhibitor (α-1-PI) ist ein Glycoprotein mit einem
Molekulargewicht von ca. 55000 Dalton. α-1-PI ist ein Inhibitor von
Proteasen wie Trypsin, Chymotrypsin, pankreatischer Elastase, Haut-
Kollagenase, Renin, Urokinase und von Proteasen polymorphonuklearer
Lymphozyten. Eine gängige therapeutische Verwendung von α-1-PI ist die
Inhibierung von Lymphozyt-Elastase in der Lunge. Diese Protease
funktioniert so, daß fremde Proteine gebrochen werden. Ist α-1-PI nicht
in ausreichenden Mengen vorhanden, um die Elastase-Aktivität zu steuern,
bricht die Elastase Lungengewebe. Mit der Zeit führt dieses
Ungleichgewicht zu einer chronischen Schädigung von Lungengewebe und zu
Emphysemen. Nachschub von α-1-PI ist in erfolgreicher Weise zur
Behandlung dieser Form von Emphysemen angewandt worden.
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Gegenwärtig übersteigt die Nachfrage nach α-1-PI das verfügbare
Angebot. Das α-1-PI-Gen ist auf Mikroorganismen, Zellinien und Schafe
übertragen und darin exprimiert worden. Allerdings muß ein
zufriedenstellendes rekombinantes Produkt noch hergestellt und erzeugt
werden. Humanplasma ist immer noch die einzige gesicherte und anerkannte
Quelle von therapeutischem α-1-PI. α-1-PI wird zur Nachschubtherapie
angewandt und an Patienten auf regelmäßiger Basis über verlängerte
Zeiträume verabreicht. Weil Verunreinigungen in Spurenmengen bereits eine
Immunreaktion bei Patienten stimulieren können, ist eine hohe Reinheit
des Produkts für eine erfolgreiche Behandlung entscheidend. Plasma, die
Quelle von α-1-PI, ist nur begrenzt verfügbar, weshalb ein
Reinigungsverfahren mit hoher Ausbeute an α-1-PI benötigt wird. Bisher
ist ein in der Praxis anwendbares Verfahren, das sowohl hohe Ausbeute als
auch hohe Reinheit des α-1-PI ergibt, nicht verfügbar gewesen.
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Es sind verschiedene Verfahren zur Reinigung von α-1-PI aus
Humanplasma beschrieben worden. Bollen et al., in US 4,629,567 (1986),
wandten fünf verschiedene Chromatografiestufen an, um den a-1-PI aus
Hefe, E. coli und Humanplasma zu reinigen. Die fünf Stufen beinhalteten
DEAE-Ionenaustausch, Thiol-Disulfid-Austausch, Heparin-Affinität, Zink-
Chelat-Chromatografie und Aminohexyl-Ionenaustausch. Es wurden keine
Daten bezüglich Reinheit und Ausbeute angegeben.
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Novika et al. berichteten in Gematol. Transfuziol. 34: 46 bis 50
(1989) über Gewinnungsverfahren aus den Nebenprodukten der Herstellung
von Blutprodukten. Sie wandten Affinitäts-, DEAE-Cellulose- und
Gelfiltrationschromatografieverfahren an. Daten bezüglich Reinheit und
Ausbeute waren nicht erhältlich.
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Podiarene et al. berichteten in Vopr. Med. Khim. 35: 96 bis 99
(1989) über eine einstufige Verfahrensweise zur Isolierung bzw. zur
Gewinnung von α-1-PI aus Humanplasma unter Anwendung von
Affinitätschromatografie mit monoklonalen Antikörpern. Die α-1-PI-
Aktivität wurde um das 61,1-Fache bei einer Ausbeute von 20% gesteigert.
Burnoufet al., in Vox. Sang. 52, 291 bis 297 (1987), wandten,
ausgehend von Plasma-Überstand A (äquivalent zu Cohn-Fraktion II + III),
DEAE-Chromatografie und Größenausschlußchromatografie an, um einen α-1-PI
herzustellen, der 80 bis 90% rein (gemäß SDS-PAGE) bei einem 36-fachen
Anstieg der Reinheit war. Die Gewinnungsmenge betrug 65 bis 70% aus dem
Überstand A.
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Hein et al. gaben in Eur. Respir. J. 9: 16 s bis 20 s (1990) ein
Verfahren an, wobei Cohn-Fraktion IV-1 als das Ausgangsmaterial angewandt
wird, worauf fraktionierte Ausfällung mit Polyethylenglycol und
anschließende Anion-Austauschchromatografie an DEAE-Sepharose ®
erfolgte. Das Endprodukt weist eine Reinheit von ca. 60% bei einer
Ausbeute von 45% auf.
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Dubin et al. haben in Prep. Biochem. 20: 63 bis 70 (1990) eine
zweistufige chromatografische Reinigung angegeben. Zuerst wurden α-1-PI,
CI-Inhibitor, α-1-Antichymotrypsin und Inter-α-1-Trypsininhibitor aus
Blue Sepharose ® eluiert und dann α-1-PI durch Gelfiltration gereinigt.
Daten bezüglich Reinheit und Ausbeute waren nicht erhältlich.
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Ballieux et al. reinigten einen α-1-PI- und Proteinase-3-Komplex
aus eitrigem Speichel unter Anwendung von 4-Phenylbutylamin-
Affinitätschromatografie, Kationenaustausch und einer
Immunoaffinitätsendstufe (Ballieux B. E. et al., J. Immunol. Methods 159:
63 bis 70 (1993)). Der pH-Wert des Puffers, der beim Kationaustausch
angewandt wurde, betrug 7,0. Unter den angewandten Bedingungen wurde das
meiste der Speichelproteine an das Harz gebunden, aber α-1-PI und
Proteinase-3 liefen ohne Bindung durch.
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Jordan et al. beschrieben in US 4,749,783 (1988) ein Verfahren,
wobei biologisch inaktive Proteine in einer Zubereitung durch
Affinitätschromatografie nach einer viralen Inaktivierungsstufe beseitigt
wurden. Die Grundlage der Trennung zwischen den nativen und denaturierten
Formen des Proteins war die biologische Aktivität des nativen Proteins
gegenüber dem Affinitätsharz, und sie beruhte nicht auf physikalischen
Unterschieden zwischen den nativen und denaturierten Proteinen.
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US 3,293,236 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung bzw. Gewinnung
von α&sub1;-anti-Trypsin durch starke Kation-Austausch-Harze.
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In keinem dieser Verfahren ist eine Durchflußchromatografie mit
starken Kation-Harzen bei niedrigem pH-Wert, niedriger Salz-Konzentration
und mittlerer Protein-Konzentration als Reinigungsstufe angewandt worden.
In unerwarteter Weise fließt, unter Bedingungen wie diesen, nur aktiver
α-1-PI durch die Säule. Das Verfahren läßt sich so ausgestalten, daß 90%
Ausbeute aus der Chromatografiesäule und ca. 95% Reinheit nach 2
Anwendungsläufen durch die Kationaustausch-Säule erreicht werden. Durch
die vorliegende Erfindung wird ein verbessertes Verfahren zur Reinigung
von α-1-PI aus Humanplasma in großem Maßstab mit sowohl hoher Reinheit
als auch hoher Ausbeute angegeben und zur Verfügung gestellt.
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Definition von Begriffen:
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"Aktiver α-1-PI" oder "nativer α-1-PI" bedeuten einen α-1-PI, der
eine Inhibierung der Elastase-Aktivität in einem in vitro-Elastase-Assay
zeigt und ergibt.
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"Inaktiver α-1-PI" oder "denaturierter α-1-PI" bedeuten einen α-1-
PI, der keinen Effekt auf die Elastase-Aktivität in einem in vitro-
Elastase-Assay ausübt.
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"Hoch gereinigt" bedeutet, daß weniger als 20% kontaminierendes
Protein enthalten sind.
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"Im wesentlichen frei von aktivem α-1-PI" bedeutet, daß weniger als
10% inaktiver α-1-PI enthalten sind.
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"Im wesentlichen frei von inaktiven Viren" bedeutet, daß ein
herabgesetzter Gehalt an aktivem Virus vorhanden ist, weil eine
anerkannte virale Inaktivierungsstufe angewandt worden ist (z. B.
Pasteurisierung oder chemische Behandlung). Im allgemeinen bedeutet dies
eine Verringerung eines Modell-Virus-Titer um mindestens ca. 4 logs.
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Alle Leitfähigkeitsmessungen wurden bei 25ºC bestimmt und
ermittelt.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von α-1-p1 aus
wässrigen Protein-haltigen Lösungen mit Durchflußchromatografie an
Kationaustausch-Chromatografiermedien unter Bedingungen von pH,
Ionenstärke und Proteinkonzentration, die hinreichen, um sicherzustellen,
daß aktiver α-1-PI nicht an die Medien (oder ein Ionenaustausch-Harz),
wogegen weitere Proteine, einschließlich von inaktivem (oder
denaturiertem) α-1-PI, an die Medien (oder ein Ionenaustausch-Harz)
gebunden werden. In bevorzugten Ausführungsformen schließt das Verfahren
die folgenden Stufen ein.
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(1) die Proteinlösung wird auf eine Ionenstärke von ca. < 10
mmho/cm dialysiert oder diafiltriert;
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(2) der pH-Wert der Lösung wird auf ca. < 6,0 eingestellt;
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(3) die Protein-Lösung wird auf ca. < 10 mg Protein/ml
eingestellt;
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(4) die Lösung wird durch ein Kationaustausch-Chromatografieharz
laufengelassen; und
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(5) die Durchflußfraktion der Chromatographie wird als gereiniger
α-1-PI gesammelt.
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Ferner betrifft die Erfindung eine Zubereitung eines hoch
gereinigten a-1-Proteinaseinhibitors, die einen aktiven α-1-
Proteinaseinhibitor, der im wesentlichen frei von aktiven Viren ist,
umfasst, im wesentlichen frei von inaktivem α-1-Proteinaseinhibitor ist
und eine Aktivität von mindestens ca. 0,9 mg
Elastase-Inibierungsaktivität pro mg Gesamtprotein aufweist, worin die Reinheit
des α-1-Proteinaseinhibitors vorzugsweise größer als 90% ist.
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Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, umfassend die
oben genannte hoch gereinigte α-1-Proteinaseinhibitor-Zubereitung und
einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
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Fig. 1 ist ein Fließschema, das das allgemeine Cohn-
Fraktionierungsverfahren, die aus den Fraktionen stammenden Proteine und
zwei Ausgangsmaterialien (Cohn-Fraktion IV-1 und Cohn-Effluens II & III)
zur Reinigung des α-1-PI gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
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Fig. 2 ist ein Fließschema, das die bevorzugten Stufen des
erfindungsgemäßen α-1-PI-Reinigungsverfahrens zeigt.
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Fig. 3 ist ein Blockdiagramm, das die Verbesserungen bei
Reinheit und spezifischer Aktivität mit dem in der vorliegenden Anmeldung
beschriebenen Verfahren im Vergleich zum Stand der Technik zeigt.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur
Reinigung von α-1-PI aus Humanplasma dar. Das Verfahren beinhaltet eine
Kationaustausch-Chromatografie bei einem pH-Wert < 6,0 in einem Puffer
niedriger Ionenstärke. Die Durchflußfraktion wird gesammelt und enthält
gereinigten α-1-PI. Die Kationaustausch-Chromatografie ist spezifisch für
α-1-PI und wird tatsächlich als ein zweistufiges Reinigungsverfahren
direkt aus Cohn-Fraktion IV-1-Suspension angewandt: eine Kationaustausch-
Säule, auf die eine zweite Kationaustausch-Säule folgt.
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Das Verfahren ist genügend vielfältig, so daß die Kation-
Chromatografie mit zahlreichen Ausgangsmaterialien funktioniert, welche
von Cohn-Fraktion-Effluens II + III, Cohn-Fraktion IV-1-Paste (ein derzeit
bevorzugtes Ausgangsmaterial) bis zu gereinigtem α-1-PI reichen, wobei
immer noch ein im wesentlichen gereinigtes Produkt erhalten wird.
Als Option zur Herstellung eines pharmazeutischen Produkts in
großem Maßstab kann eine Vielzahl zusätzlicher Stufen einschließlich
viraler Inaktivierung, zugefügt werden, um die Ausbeute zu optimieren,
die virale Sicherheit zu verbessern und einen geregelten Ablauf zu
gewährleisten. Diese Stufen können, ohne darauf eingeschränkt zu sein,
einschließen:
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(1) anfängliche Chromatografie an einem schwachen Ionenaustausch-
Harz (DEAE);
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(2) anfängliche Chromatografie an einem starken Anionaustausch-
Harz (QAE);
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(3) virale Inaktivierung unter Anwendung von entweder trockener
Hitze oder Pasteurisierung in Lösung;
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(4) virale Ausschlußfiltration zur Beseitigung möglicher viraler
Kontaminantien;
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(5) chemische Behandlung wie Lösemittel-Detergens-Behandlung zur
viralen Inaktivierung; und
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(6) Fällungsstufen zur teilweisen Reinigung von Ausgangsmaterial
vor der Kation-Chromatografie.
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Der pH-Wert spielt eine Schlüsselrolle bei der Ionenaustausch-
Chromatografie, und zwar durch Änderung der geladenen Gruppen auf den
Proteinen. Er verändert das Bindungsverhalten von Proteinan an das
Chromatografie-Harz, entweder vom ungebundenen zum gebundenen Zustand
oder umgekehrt. Der starke Kation-Harz-Ligand, der bevorzugt in der
vorliegenden Erfindung angewandt wird, ist eine Sulfonat-Gruppe (-SO&sub3;-),
die an die Harzperle entweder direkt oder über eine kurze Kette auf Basis
von Kohlenstoff gebunden ist. Der Ligand trägt eine negative Ladung über
einen pH-Bereich von 1 bis 14. Ist die effektive Netto-Oberflächenladung
eines 1?roteins negativ bei einem gegebenen pH-Wert, läuft bzw. fließt das
Protein durch die Säule ohne Verzögerung. Als herkömmliche Regel gilt,
daß das Protein eine negative Ladung aufweist, wenn der pH-Wert der
Lösung oberhalb seinem PI-Wert liegt.
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Zwei gut charakterisierte Proteine in Humanplasma sind α-1-PI und
Albumin die mittlere PI-Werte von 4,8 bzw. 5,3 aufweisen. Beide Proteine
sollten bei einem pH-Wert von 5,45 negativ geladen sein und durch die
Kationaustauschsäule fließen. In unerwarteter Weise zeigen die
vorliegenden Versuche, daß bei niedriger Salz-Konzentration und einem pH-
Wert von 5,45 Albumin und denaturierter (oder inaktiver) α-1-PI an das
Harz gebunden werden und nur nativer (oder aktiver) α-1-PI durch die
Säule fließt. Diese mit α-1-PI gemachte Beobachtung legt es nahe, daß
nicht nur der PI-Wert des Proteins, sondern auch seine Tertiärstruktur
wichtig beim Ionenaustausch sind. Die native Form von α-1-PI weist ganz
offensichtlich eine negativ geladene Oberfläche auf, wogegen die
Oberfläche der denaturierten Form sehr positiv geladen sein mag. Daher
wird das denaturierte Protein in zutreffender Weise an das Kation-Harz
gebunden. Die native Form von α-1-PI ist viel stabiler bei höhen pH-
Werten, Ein pH-Wert von 5,45 stellt den niedrigsten in der Praxis
anwendbaren pH-Wert dar, und zwar im Hinblick auf sowohl die Stabilität
als auch auf die Reinigung von α-1-PI durch Kationaustausch-
Chromatografie.
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Das Gleichgewicht zwischen Ionenaustausch-Harzen und Protein-
Lösungen wird durch die Ionenstärke der Lösungen, die Protein-
Konzentration, den pH-Wert und den spezifischen Ligand am Harz
beeinflußt. Yamamoto et al. stellten in Biotechnol. Bioeng. 25: 1373 bis
1391 (1983) semiempirische Gleichungen auf, welche den
Verteilungskoeffizient als eine Funktion der Ionenstärke der Lösung bei
niedriger Protein-Konzentration darstellten. Die Gleichung lautet:
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K = A(I)B + Kcrt
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worin K den Verteilungskoeffizent, A und B empirische Konstanten, I
die Ionenstärke der Lösung und Kcrt den Verteilungskoeffizient des
Proteins bei hoher Ionenstärke darstellen, bei der eine elektrostatische
Wechselwirkung vernachlässigt werden kann. Die Verteilungskoeffizienten
für unterschiedliche Proteine schwanken bei gegebener Ionenstärke. Daher
wandern verschiedene Proteine mit unterschiedlicher Geschwindigkeit unter
denselben Bedingungen. Dies bewirkt die Protein-Trennung in der
vorliegenden Chromatografie. Bei niedriger Salz-Konzentration
verlangsamen sich die Wanderungsgeschwindigkeiten der meisten Proteine
durch Bindung an das Harz während der Beladungsstufe. Nativer α-1-PI
läuft durch die Säule wegen seiner einzigartigen
Oberflächenladungseigenschaften. Wird die Ionenstärke des Flusses durch
Puffer erhöht, wird die Wechselwirkung weiterer Proteine mit dem Harz
modifiziert, und es fließt ein größerer Prozentsatz von Proteinen durch
die Säule. Daher erniedrigt ein Anstieg der Ionenstärke der Lösung die
Reinheit des α-1-PI-Fließstroms durch die Säule.
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Die Salz-Konzentration verändert auch den pH-Wert des Eluats durch
reversiblen Austausch des positiven Ions, z. B. von Na&spplus;, durch
Wasserstoffionen am Harz. Ein Anstieg der Salz-Konzentration verursacht
mehr H&spplus;-Transfer aus dem Harz zum Eluat, was ein Absinken des pH-Werts
des Eluens ergibt. Wird die anfängliche Protein-Lösung gegen
Gleichgewichtspuffer ultrafiltriert, sollte daher die Ionenstärke der
Beladungslösung gleich oder geringfügig oberhalb derjenigen des
Gleichgewichtspuffers sein bzw. liegen. Der pH-Wert sollte dann während
der Beladung derselbe bleiben oder nur geringfügig absinken. Wird
Gleichgewichtspuffer als eine Wäsche nach der Beladung angewandt, kann er
einen Anstieg des pH-wertes wegen dem Absinken der Ionenstärke
verursachen. Daher kann ein Puffer mit geringfügig höherer Tonenstärke in
der Waschstufe angewandt werden, um den pH-Wert beizubehalten.
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Wie vorher erwähnt, beeinflußt eine höhere Protein-Konzentration
auch das Gleichgewicht von gebundenem Protein zu Harz. Mit Anstieg der
Protein-Konzentration zeigt die Adsorptionsisotherme gewöhnlich eine
Sättigungskurve (Yamamoto et al., "Ion Exchange Chromatography of
Proteins", 1988, Chromatographic Science Series). Daher erreicht mit dem
Annähern an den Bindungs-Sättigungsgehalt die Nettomenge gebundener
Verunreinigungen ein Maximum. Nachdem dieses Maximum erreicht ist, steigt
der relative Prozentsatz von durch die Säule laufenden Verunreinigungen
mit dem Anstieg der Protein-Konzentration der Probe an. Daher ist die
Protein-Konzentration optimal, wenn sie niedrig genug ist, um in den
Linearbereich der Adsorptionskurve für Verunreinigungen zu fallen.
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Weil Proteine dazu neigen, den pH-Wert der Lösung zu puffern,
beeinflußt die Protein-Konzentration auch den pH-Wert des Eluats. Mit der
selektiven Entfernung der Proteine aus der Lösung durch Bindung an die
Chromatografiemedien wird die Netto-Pufferung der Lösung (d. h. der pH-
Wert) verändert. Der Effekt der Chromatografie ist komplex, weil die pH-
Änderung von den relativen Prozentsätzen von an die Säule adsorbierten
Proteinen abhängt. Die Adsorption wird vom Fließstrom der Säule, der
Pufferkapazität der Lösung, der veränderten Natur des Protein-Mix und
kompetitiver Bindung verschiedener Proteine beeinflußt.
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Die durchgeführten Versuche haben gezeigt, daß eine Beladung einer
Kationaustauschsäule mit höheren Protein-Konzentrationen zu einem
fortschreitenden Anstieg des pH-Wertes im Eluat bei fortschreitender
Beladung der Kationaustauschsäule führt. Der erhöhte pH-Wert ergibt eine
verringerte Reinheit des α-1-PI. Zur Maximierung der Beladung der
Kationaustauschsäule zur Reinigung in großem Maßstab können höhere
Konzentrationen innerhalb des akzeptablen Bereichs der
Verunreinigungskurve und des pH-Effekts angewandt werden, obwohl, als
allgemeines Prinzip, verdünntere Lösungen von Proteinen ein besseres
Ausgangsmaterial zur Reinigungschromatografie des α-1-PI darstellen.
Beispiel 1
Bevorzugte Ausführungsform
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In der derzeit bevorzugten Ausführungsform wird ein Anionaustausch-
Chromatografie angewandt, um den α-1-PI aus einer Cohn-Fraktion IV-1. (Fr.
IV-1)-Suspension teilweise zu reinigen, bevor er auf die starke
Kationaustauschsäule gegeben wird. Cohn-Fraktion IV-1-Suspension ist
annähernd 10% α-1-PI gemäß spezifischer Aktivität. Die IV-1-Suspension
enthält, wie auch weitere Plasmafraktionen, verschiedene Proteine:
Lipoprotein, Immunoglobuline, Globulin, Metaprotein usw.. Lipoproteine
stellen ein besonderes Problem dar. Werden sie an das Chromatografie-Harz
gebunden, sind sie nur schwer zu entfernen und können die Poren des
Harzes blockieren, was einen erhöhten Druck quer durch das Harzbett
verursacht. Auch geht, mit einem Aufbau von Protein-Rückstand auf dem
Harz, Bindungskapazität verloren. Zur Beseitigung von Lipoprotein und
weiteren Verunreinigungen aus der Fr. IV-1-Suspension wird DEAE-
Ionenaustausch-Chromatografie als die erste Stufe vor der starken Kation-
Chromatografie angewandt. Die DEAE-Beladungsbedingungen sind so, daß ein
größerer Teil der Lipoproteine durch die Säule ohne Bindung läuft. Die α-
1-PI-Elutionsbedingungen zur DEAE-Ionenaustauschchromatografie werden so
gewählt, daß eine 95 bis 100%-ige Gewinnung von α-1-PI erhalten wird.
Die IV-1-Suspension wird auf eine Leitfähigkeit > 5 mmho/cm und
einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Die Protein-Lösung wird dann auf das
DEAE-Harz gegeben. Der α-1-PI wird mit 20 mM dibasischem Natriumphosphat
und 95 mM Natriumchlorid bei pH 8,0 eluiert. Das DEAE-Eluat wird gegen 20
mM monobasisches Natriumphosphat und 5 mM Natriumchlorid bei pH 6,5
diafiltriert. Das diafiltrierte Eluens wird auf pH 5,45 eingestellt und
dann auf ein starkes Kation-Harz gegeben. α-1-PI fließt durch die Säule.
Der Durchfluß wird auf pH 7,0 eingestellt, und es wird 0,15 M
Natriumchlorid zugefügt.
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Zu diesem Zeitpunkt kann der α-1-PI, falls gewünscht, eingefroren
werden. Zur viralen Inaktivierung wird die α-1-PI-Lösung, falls
erforderlich, aufgetaut, auf pH 6,5 in 60 mM Histidin und 5 mM
Calciumchlorid eingestellt und dann lyophilisiert. Das Lyophilisat wird
dann bei 80ºC 72 h lang zur Inaktivierung von Viren erhitzt. Das
Lyophilisat wird dann in gereinigtem Wasser aufgelöst, und es werden 37%
(G/V) Sucrose und 0,38 M Zitrat als Stabilisiermittel zugefügt. 0,3%
Trin-butylphosphat (TNBP) und 0,2% Natriumcholat werden als eine Lösemittel-
Detergens-Behandlung zugefügt, die auf umhüllte Viren gerichtet ist. Nach
dreistündiger Inkubation bei 30ºC werden das TNBP und das Cholat durch
DiafiLtration beseitigt.
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Die viral inaktivierte Lösung wird gegen 20 mM monobasisches
Natriumphosphat und 5 mM Natriumchlorid bei pH 6,5 diafiltriert. Die
diafiltrierte Lösung wird auf pH 5,45 eingestellt und auf eine zweite
starke Kation-Harz-Säule gegeben, um jegliche verbliebene Kontaminantien
und durch die viralen Inaktivierungsstufen denaturierten α-1-PI zu
beseitigen. Die native Form von α-1-PI fließt durch die Säule. Der
gesammelte Durchfluß wird auf pH 7,0 eingestellt, es wird 0,15 M
Natriumchlorid zugefügt, und man läßt das Ganze durch einen 15 uM Filter
als zusätzliche virale Inaktivierungsstufe laufen. Hoch gereinigter α-1-
PI (> 95%), der im wesentlichen frei von weiteren Proteinen ist, ist auf
diese Weise hergestellt worden. Die DEAE-Chromatografie beseitigt die
Lipoproteine und erhöht die α-1-PI-Reinheit auf 20%. Die erste
Kationsäule ergibt ca. 60 bis 70% reinen α-1-PI, und zwar mit einer
Gewinnung von ca. 90%. Die zweite Kationsäule bewirkt eine Reinheit von
95% für das Endprodukt. Die Anionaustauschsäule wird mit 1 M NaCl und mit
1 M NaOH gewaschen, um gebundene Proteine zu entfernen. Die an die beiden
Kationaustauschsäulen gebundenen Proteine werden mit 1 M Natriumchlorid
und dann mit 1 M Natriumhydroxid beseitigt.
Beispiel 2
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In diesem Beispiel war Cohn-Fraktion II + III-Effluens das
Ausgangsmaterial. Es wurde gegen 20 mM monobasisches Natriumphosphat und
5 mM Natriumchlorid, pH = 6,5, bei 5ºC diafiltriert, um Alkohol zu
beseitigen und die Ionenstärke herabzusetzen. Die Lösung wurde dann auf
pH 5,45 eingestellt und auf eine vorher ins Gleichgewicht gebrachte
starke Kationaustauschsäule gegeben. Der Durchfluß wurde als eine
deutlich angereicherte α-1-PI-Fraktion gesammelt. Die kontaminierenden
Proteine des Ausgangsmaterial wurden auf der Kationaustauschsäule
zurückgehalten.
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Nach einem Einzeldurchlauf an der Kationaustauschsäule war α-1-PI
im wesentlichen von den weiteren Proteinen im Cohn-Fraktion-Effluens II +
III gereinigt. Die Reinheit des Durchflusses betrug 82% α-1-PI gemäß SDS-
PAGE. Die spezifische Aktivität wurde um das 20-Fache von 0,03 mg
Elastase-Inhibierungsaktivität pro mg Gesamtprotein auf 0,59 mg Elastase-
Inhibierungsaktivität pro mg Protein erhöht.
Beispiel 3
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In diesem Beispiel wurde partiell gereinigter, im Handel
erhältlicher α-1-PI (Prolastin ®, Miles, Inc.) als Ausgangsmaterial
eingesetzt. Prolastin ® ist in 0,1 M NaCl und 0,02 M Natriumphosphat bei
pH 7,0 gepuffert. Die Konzentration von α-1-PI beträgt annähernd 30 mg/ml
und die Protein-Konzentration beträgt annähernd 60 mg/ml. Albumin macht
in typischer Weise 12% des Gesamtproteins aus, und IgA ist in typischer
Weise mit annähernd 1 mg/ml (2,5% des Gesamtproteins) vorhanden. Das
Prolastin ® wurde mit 5 mM NaCl und 20 mM monobasischem Natriumphosphat
zur Erniedrigung der Ionenstärke diafiltriert. Der pH-Wert der Lösung
wurde auf 5,45 erniedrigt, die Protein-Konzentration wurde auf 5,3 mg/ml
herabgesetzt, und es wurde die Lösung durch eine starke
Kationaustauschsäule laufengelassen. Der Durchfluß wurde als gereinigter
α-1-PI gesammelt und zeigte nur monomeren und dimeren α-1-PI an SDS-PAGE,
95,4 bzw. 4,6% des Proteins. Die Lösung wurde dann bei pH 7,0 in 0,15 M
NaCl stabilisiert und konnte filtriert oder konzentriert und
lyophiiisiert werden, um ein stabiles Endprodukt zu ergeben.
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Die gebundene Protein-Fraktion wurde eluiert und an SDS-PAGE einer
Elektrophorese unterzogen. 44% des Proteins, sichtbar gemacht mit
Coomassie-Blau, lagen im α-1-PI-Molekulargewichtsbereich. Der Elastase-
Inhibierungsassay dieser Fraktion zeigte und ergab keine α-1-PI-
Aktivität. Dies zeigt an, daß das Protein in dieser Bande inaktivierter
α-1-PI ist.
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Die obigen Beispiele sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Zusammenfassung experimenteller Daten
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* PerSeptive HS-Harz, auch erfolgreich im Labor-Maßstab angewandt
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** Prozent-Reinheit, bestimmt gemäß mit Coomassie-Blau färbbarem Protein und als Kombination von Monomer und
Dimer, verifiziert gemäß Western-Blot
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*** Gesamtausbeute ist nach Diafiltration angegeben. Die α-1-PI-Aktivität stieg nach Diafiltration an.
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Im Lichte der vorstehend dargelegten Beschreibung ist davon
auszugehen, daß dem auf dem Gebiet der Proteinreinigung tätigen Fachmann
Variationen einfallen. Demzufolge sollen die obigen Beispiele lediglich
zur Verdeutlichung angegeben und der Umfang der vorliegend offenbarten
Erfindung nur auf die folgenden Ansprüche eingeschränkt sein.