CN112638488A - 灭菌的层析树脂及其在制造工艺中的用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了减少层析树脂的生物负载的方法，所述方法包括：将包含含有(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物的容器暴露于足以减少所述容器和所述层析树脂的生物负载的剂量的γ‑照射，其中所述至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ‑照射之后/之时结合能力的损失。还提供了包含所述生物负载减少的层析树脂的生物负载减少的层析柱；包含层析树脂和含至少一种醇的液体的组合物；使用这些生物负载减少的层析柱中的一个执行生物负载减少的柱层析的方法；以及用于以减少生物负载的方式制备纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法。
Description
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2018年8月31日提交的美国临时专利申请序列号62/726,043的优先权；其全部内容通过引用并入本文中。
【技术领域】
本发明涉及重组蛋白的生物技术和生物制造的方法。
【背景技术】
通常使用包括编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞来生产治疗上或商业上重要的蛋白质。在当前不同产品管线的环境中，生物技术公司越来越多地致力于开发创新的解决方案来高度灵活且成本有效地制造治疗性蛋白药物。有效分离重组蛋白的策略之一是通过包括连续层析(例如，使用封闭系统)的方法进行。连续层析的一个已知限制是系统中存在污染物(例如，增加的生物负载)，这导致系统中产物被污染的、产率降低、以及流速降低(或压力增加)。例如，系统内增加的生物负载可能导致系统完全停工。
【发明内容】
本发明至少部分地基于以下发现：γ-照射层析树脂降低了层析树脂的结合能力，并且在至少一种醇存在下照射可以有助于防止这种由γ-照射引起的层析树脂结合能力的降低。鉴于这个发现，本文提供了减少层析树脂的生物负载的方法，所述方法包括：将包含含有(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物的容器暴露于足以减少所述容器和所述层析树脂的生物负载的剂量的γ-照射，其中至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后/之时结合能力的损失。还提供了含有通过本文所述的任何方法制备的生物负载减少的层析树脂的生物负载减少的层析柱；包含(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物；使用这些生物负载减少的层析柱中的至少一个执行生物负载减少的柱层析的方法；以及用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭或基本上封闭且连续的方法，所述方法包括使用这些生物负载减少的层析柱中的至少一个。通过本文所述的任何方法生产的任何层析树脂、通过本文所述的任何方法生产的任何填充层析柱、执行柱层析的任何方法和本文所述的任何方法都可以是灭菌的，绝对灭菌的，无菌的或生物负载减少的。通过本文所述的任何方法生产的任何层析树脂、通过本文所述的任何方法生产的任何层析柱和本文所述的任何方法都可以是无菌的和灭菌的，绝对灭菌的，无菌的或生物负载减少的。
本文提供了减少层析树脂的生物负载的方法，所述方法包括：将包含含有(i)层析树脂和(ii)包含至少一种醇的液体的组合物的容器暴露于足以减少所述容器和所述层析树脂的生物负载的剂量的γ-照射，其中至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括在暴露之前将组合物布置于容器中。
在一些实施方案中，容器是储存器皿。
在一些实施方案中，容器是层析柱。
在一些实施方案中，容器是填充层析柱。
在一些实施方案中，组合物是沉降的层析树脂的浆液。
在一些实施方案中，组合物是润湿的固体混合物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，至少一种醇选自：苯甲醇、环己醇、异丁醇、2-甲基-2-丁醇、甲醇、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、丁-1-醇、戊-1-醇、十六烷-1-醇、2-苯基乙醇、仲苯基乙醇、3-苯基-1-丙醇、1-苯基-1-丙醇、2-苯基-1-丙醇、2-苯基-2-丙醇、1-苯基-2-丁醇、2-苯基-1-丁醇、3-苯基-1-丁醇、4-苯基-2-丁醇、dl-1-苯基-2-戊醇、5-苯基-1-戊醇和4-苯基-1-丁醇。
在一些实施方案中，至少一种醇包括苯甲醇。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，液体中一种或多种醇的总和浓度为约0.01v/v％至约10v/v％。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，液体还可以包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂。
在一些实施方案中，液体包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂，其量足以改善层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑激素、西红柿红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、酚丙酸(phenolpropanoid acid)、利多卡因(lidocaine)、柚皮素、富勒烯、葡萄糖、甘露糖醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基呱啶-1-氧基和二甲基甲氧基色原烷醇。
在一些实施方案中，液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
在一些实施方案中，液体包含甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，液体包含：(i)75mM与约125mM之间的甘露糖醇；(ii)75mM与约125mM之间的甲硫氨酸；(iii)75mM与约125mM之间的抗坏血酸钠；(iv)75mM与约125mM之间的组氨酸；(v)30mM与约70mM之间的甲硫氨酸和约30mM与约70mM之间的组氨酸；(vi)约10mM与约50mM之间的甲硫氨酸、约10mM与约50mM之间的组氨酸和约10mM与约50mM之间的抗坏血酸钠；或(vii)约5mM与约45mM之间的抗坏血酸钠、约5mM与约45mM之间的甲硫氨酸、约5mM与约45mM之间的甘露糖醇和约5mM与约45mM之间的组氨酸。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，液体是缓冲溶液。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，液体包含至少一种选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基丁二酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，层析树脂选自：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
在一些实施方案中，组合物包括含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
在一些实施方案中，蛋白质配位体是蛋白A。
在一些实施方案中，组合物包括阴离子交换层析树脂。
在一些实施方案中，阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，剂量为约15kGy至约45kGy之间。
在一些实施方案中，剂量为约20kGy至约30kGy之间。
在一些实施方案中，剂量为约23kGy与约27kGy之间。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，暴露是在如下温度下执行：约-25℃与约0℃之间，包括端点。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，暴露是在如下温度下执行：约0℃与约25℃之间，包括端点。
本文提供了通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的层析树脂。
在一些实施方案中，树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x 10-8至约1x 10-5之间。
在一些实施方案中，树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x 10-7至约1x 10-6之间。
在本文所述的任何树脂的一些实施方案中，其中层析树脂包括至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
在一些实施方案中，层析树脂包括含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
在一些实施方案中，蛋白质配位体是蛋白A。
在一些实施方案中，层析树脂包括阴离子交换层析树脂。
在一些实施方案中，阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
本文提供了制备生物负载减少的填充层析柱的方法，所述方法包括：提供本文所述的任何生物负载减少的层析树脂；和在无菌环境中将层析树脂填充到生物负载减少的柱中。
本文提供了通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的填充层析柱。
本文提供了通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的填充层析柱。
在一些实施方案中，填充树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x 10-8至约1x 10-5之间。
在一些实施方案中，树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x 10-7至约1x 10-6之间。
在本文所述的任何树脂的一些实施方案中，填充柱中的树脂包括至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
在一些实施方案中，树脂包括含有蛋白质配位体的亲和或假亲和层析树脂。
在一些实施方案中，配位体是蛋白A。
在一些实施方案中，树脂包括阴离子交换层析树脂。
在一些实施方案中，阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
本文提供了如下组合物，所述组合物包含(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体，其中至少一种醇的存在量足以改善层析树脂在用足以减少组合物的生物负载的剂量的γ-照射处理时结合能力的损失。
在一些实施方案中，组合物是沉降的层析树脂的浆液。
在一些实施方案中，组合物是润湿的固体混合物。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，至少一种醇选自：苯甲醇、环己醇、异丁醇、2-甲基-2-丁醇、甲醇、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、丁-1-醇、戊-1-醇、十六烷-1-醇、2-苯基乙醇、仲苯基乙醇、3-苯基-1-丙醇、1-苯基-1-丙醇、2-苯基-1-丙醇、2-苯基-2-丙醇、1-苯基-2-丁醇、2-苯基-1-丁醇、3-苯基-1-丁醇、4-苯基-2-丁醇、dl-1-苯基-2-戊醇、5-苯基-1-戊醇和4-苯基-1-丁醇。
在一些实施方案中，至少一种醇包括苯甲醇。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，液体中一种或多种醇的总和浓度为约0.01v/v％至约10v/v％。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，液体还包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂。
在一些实施方案中，液体还包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂，其量足以改善层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑激素、西红柿红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、酚丙酸、利多卡因、柚皮素、富勒烯、葡萄糖、甘露糖醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基呱啶-1-氧基和二甲基甲氧基色原烷醇。
在一些实施方案中，液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
在一些实施方案中，液体包含甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，液体包含：(i)75mM与约125mM之间的甘露糖醇；(ii)75mM与约125mM之间的甲硫氨酸；(iii)75mM与约125mM之间的抗坏血酸钠；(iv)75mM与约125mM之间的组氨酸；(v)30mM与约70mM之间的甲硫氨酸和约30mM与约70mM组之间的氨酸；(vi)约10mM与约50mM之间的甲硫氨酸、约10mM与约50mM之间的组氨酸和约10mM与约50mM之间的抗坏血酸钠；或(vii)约5mM至约45mM之间的抗坏血酸钠、约5mM与约45mM之间的甲硫氨酸、约5mM与约45mM之间的甘露糖醇和约5mM与约45mM之间的组氨酸。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，液体是缓冲溶液。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，组合物包含至少一种选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基丁二酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，层析树脂包括至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，树脂包括含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
在一些实施方案中，蛋白质配位体是蛋白A。
本文提供了执行生物负载减少的柱层析的方法，所述方法包括：(a)提供本文所述的任何生物负载减少的填充层析柱；和(b)在封闭系统中使用生物负载减少的填充层析柱和生物负载减少的缓冲液执行柱层析。
在一些实施方案中，使用生物负载减少的填充层析柱连续执行生物负载减少的柱层析持续至少4天的时间段。
在一些实施方案中，使用生物负载减少的填充层析柱连续执行生物负载减少的柱层析持续至少5天的时间段。
在一些实施方案中，使用生物负载减少的填充层析柱连续执行生物负载减少的柱层析持续至少7天的时间段。
在一些实施方案中，使用生物负载减少的填充层析柱连续执行生物负载减少的柱层析持续至少14天的时间段。
在一些实施方案中，使用生物负载减少的填充层析柱连续执行生物负载减少的柱层析持续至少28天的时间段。
在一些实施方案中，与未用γ-照射处理的相同树脂相比，(a)中生物负载减少的填充层析柱中的树脂具有约75％与约100％之间的结合能力百分比。
在一些实施方案中，生物负载减少的填充层析柱中的树脂包括至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
在一些实施方案中，树脂包括含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
在一些实施方案中，蛋白质配位体是蛋白A。
在一些实施方案中，树脂包括阴离子交换层析树脂。
本文提供了用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法，所述方法包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；和(b)将液体培养基连续馈送到包含本文所述的任何生物负载减少的填充层析柱中的至少一个的多柱层析系统(MCCS)中；其中所述方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从液体培养基连续运行至来自MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白。
在一些实施方案中，MCCS执行至少两个不同的单元操作。
在一些实施方案中，所述方法包括柱切换。
在一些实施方案中，MCCS执行捕获重组蛋白和灭活病毒的单元操作。
在一些实施方案中，MCCS执行捕获和纯化重组蛋白的单元操作。
在一些实施方案中，MCCS包括至少两个生物负载减少的填充层析柱。
在一些实施方案中，MCCS是周期性逆流层析系统。
在一些实施方案中，MCCS包括用于亲和或假亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合的多个柱。
在一些实施方案中，MCCS包括用于亲和层析的柱，并且在所述方法中用选自以下的捕获机制执行亲和层析：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
在一些实施方案中，在所述方法中用蛋白A结合捕获机制执行亲和层析，并且重组蛋白是抗体或抗体片段。
本文提供了用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法，所述方法包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；(b)将液体培养基连续馈送到第一多柱层析系统(MCCS1)中；(c)使用MCCS1捕获液体培养基中的重组蛋白；(d)从MCCS1产生包含重组蛋白的洗脱物，并将洗脱物连续馈送到第二多柱层析系统(MCCS2)中；(e)将来自洗脱物的重组蛋白连续馈送到MCCS2中，并且随后洗脱重组蛋白，从而产生纯化的重组蛋白，其中：所述方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从液体培养基连续运行至纯化的重组蛋白，并且MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱含有本文所述的任何生物负载减少的填充层析柱。
在一些实施方案中，MCCS1和/或MCCS2执行至少两个不同的单元操作。
在一些实施方案中，所述方法涉及柱切换。
在一些实施方案中，MCCS1执行捕获重组治疗性蛋白和灭活病毒的单元操作。
在一些实施方案中，MCCS2执行纯化和精制重组蛋白的单元操作。
在一些实施方案中，MCCS1和/或MCCS2包括至少两个层析柱。
在一些实施方案中，MCCS1是第一周期性逆流层析系统(PCCS1)。
在一些实施方案中，使用亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合执行捕获。
在一些实施方案中，用选自以下的捕获机制执行亲和层析：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
在一些实施方案中，用蛋白A结合捕获机制执行亲和层析，并且重组蛋白是抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，MCCS2是第二周期性逆流(PCCS2)层析系统。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，重组蛋白是治疗性重组蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法还包括将纯化的治疗性重组蛋白配制成医药组合物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，连续执行所述方法持续至少4天的时间段。
在一些实施方案中，连续执行所述方法持续至少5天的时间段。
在一些实施方案中，连续执行所述方法持续至少7天的时间段。
在一些实施方案中，连续执行所述方法持续至少14天的时间段。
在一些实施方案中，连续执行所述方法持续至少28天的时间段。
如本文所用，名词前的词语“一个”表示一个或多个所述特定名词。例如，短语“生物负载减少的层析柱”表示“一个或多个生物负载减少的层析柱”。
术语“生物负载”是本领域已知的并且是指组合物(例如，固体或液体)和/或一个或多个物品的表面(例如，外部和/或内部表面)上存在的自复制的生物污染物的水平。例如，生物负载可以指存在于含有层析树脂或填充层析树脂的组合物中的自复制生物污染物(例如，填充层析柱中填充层析树脂中存在的自复制生物污染物)。在其他例子中，生物负载可以指层析柱的内表面上和/或层析柱内层析树脂内的自复制生物污染物(例如，层析柱内表面上的生物污染物和层析柱内填充层析树脂中的生物污染物)。生物负载还可以指存在于液体(例如，在本文所述的任何方法或过程中使用的缓冲液)中的自复制生物污染物。自复制生物污染物的非限制性例子可以是细菌(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，或细菌孢子)、分枝杆菌、病毒(例如，囊泡状病毒、卡奇谷病毒(Cache Valley virus)、细小病毒、疱疹病毒和布尼亚病毒(bunyavirus))、寄生虫、真菌、酵母和原生动物。本文描述了用于测定生物负载的示例性方法。用于测定生物负载的其他方法是业内已知的。
术语“减少生物负载”是本领域已知的，并且是指组合物(例如，固体或液体)和/或一个或多个物品的表面(例如，外部和/或内部表面)上存在的自复制生物污染物水平的降低(例如，可侦检的降低)。本文描述了用于减少层析树脂(例如，填充层析树脂)、缓冲液和/或层析柱(例如填充层析柱)的生物负载的方法的非限制性例子。用于减少本文所述的任何组合物的生物负载的其他方法是业内已知的。
术语“生物负载减少的层析树脂”意指如下层析树脂，其经处理以降低层析树脂中存在的自复制生物污染物的水平(例如，含有层析树脂的组合物(例如浆液)中存在的自复制生物污染物水平可侦检的降低)。例如，生物负载减少的层析树脂可以是暴露于足以降低层析树脂中自复制生物污染物的水平的剂量的γ-照射的树脂(例如，含有层析树脂的组合物，所述层析树脂暴露于足以降低层析树脂中自复制生物污染物的水平的剂量的γ-照射)。例如，生物负载减少的层析树脂可以是如下树脂，其暴露于约1kGy至约15kGy之间的γ-照射、约1kGy与约20kGy之间的剂量的γ-照射、约1kGy与约25kGy之间的剂量的γ-照射、约1kGy与约30kGy之间的剂量的γ-照射或约1kGy与约35kGy之间的剂量的γ-照射。本文描述了用于减少层析树脂的生物负载的示例性方法。用于减少层析树脂的生物负载的其他方法是业内已知的。
术语“生物负载减少的层析柱”意指如下层析柱(例如，填充层析柱)，其包含经处理的层析树脂(例如，γ-照射的层析树脂)，所述层析树脂具有的自复制生物污染物的水平少于包含未处理的层析树脂的相同层析柱中存在的自复制生物污染物的水平。例如，生物负载减少的层析柱可以包含灭菌保证水平为至少或约1x 10-6、1x 10-7、1x 10-8、1x 10-9或1x 10-10的经处理层析树脂。
术语“生物负载减少的缓冲液”是本领域已知的，并且意指如下经处理(例如，过滤、高压处理和/或γ-照射)液体(例如，经处理的缓冲溶液)，其自复制污染物水平少于相同的未处理液体中发现的自复制污染物水平。例如，生物负载减少的缓冲液的灭菌保证水平可以是至少或约1x 10-6、1x 10-7、1x 10-8、1x 10-9或1x 10-10。
“绝对灭菌”或“绝对灭菌的”是用于描述完全不含自复制生物污染物的组合物或过程的术语。例如，所述术语可以应用于γ-照射的层析树脂，层析柱的内表面和内含物(例如，层析树脂)和/或缓冲液。绝对灭菌的组合物或过程可以是洁净的(当该术语是业内已知时)。
“灭菌的”或“灭菌”是用于描述灭菌保证水平为约或小于1.0x 10-6(例如，约或小于1.0x 10-7，约或小于1.0x 10-8，约或小于1.0x 10-9或1x 10-10)的组合物或过程的术语。可以使用业内已知的许多经验证生产方法判定组合物或过程是否是灭菌的。例如，灭菌的组合物或过程可以完全不含活的自复制生物污染物(例如，本文所述的任何自复制生物污染物)。灭菌的组合物或过程也可以是洁净的(如同该术语在业内已知的)。
术语“灭菌”意指用于将组合物灭菌(如本文所定义)的经验证的方法。可以测量处理过程期间抗性指示物自复制生物污染物(例如，细菌)的灭活率，以判定组合物是否已达到灭菌(如本文所定义)。
术语“灭菌保证水平”或“SAL”是本领域已知的并且意指在一批处理单元内实现绝对灭菌的置信水平。所述概率通常基于验证期间执行的灭活研究的结果计算，并以1x 10-n的形式表示。
术语“无菌”用于描述不含引起疾病或引起症状的自复制生物污染物(例如，本文所述的任何自复制生物污染物)的组合物或过程。无菌组合物或过程也可以是洁净的(当该术语是业内已知时)。
术语“单元操作”是本领域的术语，并且意指可以在从液体培养基纯化重组蛋白的方法中执行的功能步骤。例如，操作单元可以是过滤(例如，从含重组蛋白的流体中去除污染细菌、酵母、病毒和/或分枝杆菌和/或颗粒物质)、捕获、去除表位标签、纯化、保持或储存、精制、病毒灭活、调节含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH和去除不需要的盐。
术语“捕获”意指执行来从液体培养基或稀释的液体培养基中存在的一种或多种其他组分(例如培养基蛋白或哺乳动物细胞中存在或从哺乳动物细胞分泌的一种或多种其他组分(例如，DNA、RNA或其他蛋白质))部分纯化或分离(例如，按重量计至少或约5％(例如，至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或约95％)纯)并浓缩重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的步骤。典型地，使用结合重组蛋白的层析树脂(例如，通过使用亲和层析)执行捕获。本文描述了用于从液体培养基或稀释的液体培养基捕获重组蛋白的非限制性方法，并且其他方法是业内已知的。可以使用至少一个层析柱和/或层析膜(例如，本文所述的任何层析柱和/或层析膜)从液体培养基捕获重组蛋白。
术语“纯化”意指执行来使重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)与含重组蛋白的流体中存在的一种或多种其他杂质(例如，主要杂质)或组分(例如液体培养基蛋白或哺乳动物细胞中存在或从哺乳动物细胞分泌的一种或多种其他组分(例如，DNA、RNA或其他蛋白质、内毒素、病毒等))分离的步骤。例如，可以在初始捕获步骤期间或之后执行纯化。可以使用层析树脂、膜或结合重组蛋白或污染物的任何其他固体支持物(例如，通过使用亲和层析、疏水相互作用层析、阴离子或阳离子交换层析或分子筛层析)执行纯化。可以使用至少一个层析柱和/或层析膜(例如，本文所述的任何层析柱或层析膜)从含重组蛋白的流体纯化重组蛋白。
术语“精制”是本领域的术语，并且意指执行来从接近最终所需纯度的含重组蛋白(例如重组治疗性蛋白)的流体去除残留的痕量或少量污染物或杂质的步骤。例如，可以通过使含重组蛋白的流体通过一个或多个层析柱或一个或多个膜吸收器来执行精制，所述层析柱或膜吸收器选择性地结合含重组蛋白的流体中存在的靶重组蛋白或少量的污染物或杂质。在此种例子中，一个或多个层析柱或一个或多个膜吸收器的洗脱物/滤液包含重组蛋白。
术语“过滤”意指从液体(例如，本文所述的任何方法中的液体培养基或流体)去除至少部分(例如，至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)不期望的生物污染物(例如，哺乳动物细胞、细菌、酵母细胞、病毒或分枝杆菌)和/或颗粒物质(例如，沉淀的蛋白质)。
术语“洗脱物/滤液”是本领域的术语，并且意指从层析柱或层析膜释放出的流体，所述流体包含可检测量的重组蛋白(例如重组治疗性蛋白)。
术语“整合方法”意指使用结构组件执行的方法，所述结构组件协作地起作用以实现特定结果(例如，从液体培养基纯化重组蛋白)。
术语“连续方法”意指将流体连续馈送通过系统的至少一部分的方法。例如，连续方法是将来自生物反应器的包含重组蛋白的液体培养基连续馈送通过MCCS的方法。连续方法的另一个例子是将来自生物反应器的包含重组蛋白的液体培养基连续馈送通过第一和第二MCCS(MCCS1和MCCS2)的方法。其他例子包括将包含重组蛋白的液体培养基连续馈送通过MCCS的方法、将包含重组蛋白的液体培养基连续馈送通过MCCS1和MCCS2的方法或将含重组蛋白的流体连续馈送通过MCCS2的方法。
术语“封闭方法”是本领域的术语，并且意指如下方法，其经执行以使得方法中与重组蛋白或含重组蛋白的液体接触的的组分(例如，层析树脂和/或缓冲液)不故意暴露于污染物很长的时间段(例如，不故意暴露在空气中很长的时间段)。
术语“治疗性蛋白药物”意指如下重组蛋白(例如，免疫球蛋白、蛋白质片段、工程化蛋白或酶)，其已经从污染性蛋白、脂质和核酸(例如，液体培养基中存在的或来自主体细胞(例如，来自哺乳动物、酵母或细菌主体细胞)的污染性蛋白、脂质和核酸)以及生物污染物(例如，病毒和细菌污染物)充分纯化或分离，并且可以在不进行任何其他一个或多个实质性纯化和/或净化步骤下被配制成药剂。
术语“多柱层析系统”或“MCCS”意指具有总共两个或更多个互连或切换的层析柱和/或层析膜的系统。多柱层析系统的非限制性例子是周期性逆流层析系统(PCC)，其包括总共两个或更多个互连或切换的层析柱和/或层析膜。本文描述了多柱层析系统的其他例子，并且其是业内已知的。
术语“基本上不含”意指组合物(例如，液体培养基)至少或约90％不含(例如，至少或约95％、96％、97％、98％或者至少或约99％不含，或约100％不含)指定物质(例如，哺乳动物细胞或来自哺乳动物细胞的污染性蛋白、核酸、碳水化合物或脂质)。
术语“哺乳动物细胞”意指来自或源自任何哺乳动物(例如，人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、母牛或兔)的任何细胞。例如，哺乳动物细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是分化细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是未分化细胞。本文描述了哺乳动物细胞的非限制性例子。哺乳动物细胞的其他例子是业内已知的。
术语“培养”或“细胞培养”意指哺乳动物细胞在受控的一组物理条件下维持或增生。
术语“哺乳动物细胞的培养物”意指包含在受控的一组物理条件下维持或增生的多个哺乳动物细胞的液体培养基。
术语“液体培养基”意指包含足够营养物以允许细胞(例如，哺乳动物细胞)在体外生长或增生的流体。例如，液体培养基可以包含以下中的一种或多种：氨基酸(例如，20种氨基酸)、嘌呤(例如，次黄嘌呤)、嘧啶(例如，胸苷)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸，生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺、丙酮酸盐、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、铁、铜、锌和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可以包含来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基不包含来自哺乳动物的血清或另一种提取物(确定成分的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可以包含痕量金属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的另一个例子是基本培养基(例如，仅包含无机盐、碳源和水的培养基)。本文描述了液体培养基的非限制性例子。液体培养基的其他例子是本领域已知的并且是可商购的。液体培养基可以包含任何密度的哺乳动物细胞。例如，如本文所用，从生物反应器取出的一定体积的液体培养基可以基本上不含哺乳动物细胞。
术语“无动物源性组分的液体培养基”意指不包含任何源自哺乳动物的组分(例如，蛋白质或血清)的液体培养基。
术语“无血清液体培养基”意指不包含哺乳动物血清的液体培养基。
术语“含血清的液体培养基”意指包含哺乳动物血清的液体培养基。
术语“化学成分确定的液体培养基”是本领域的术语，并且意指其中所有化学组分都是已知的液体培养基。例如，化学成分确定的液体培养基不包括胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，因为这些制剂典型地包含白蛋白和脂质的复杂混合物。
术语“无蛋白质的液体培养基”意指不包含任何蛋白质(例如，任何可侦检的蛋白质)的液体培养基。
术语“免疫球蛋白”意指包括具有至少15个氨基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的氨基酸序列(例如，可变结构域序列、框架序列和/或恒定结构域序列)的免疫球蛋白的多肽。免疫球蛋白可以例如包括至少15个氨基酸的轻链免疫球蛋白，例如至少15个氨基酸的重链免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是分离的抗体(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)，例如IgG的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗体片段，例如Fab片段、F(ab')2片段或scFv片段。免疫球蛋白还可以是双特异性抗体或三特异性抗体，或二聚体、三聚体或多聚体抗体，或双抗体，
或
免疫球蛋白还可以是包括至少一个免疫球蛋白结构域的经工程化蛋白质(例如融合蛋白)。本文描述了免疫球蛋白的非限制性例子，并且免疫球蛋白的其他例子是业内已知的。
术语“蛋白质片段”或“多肽片段”意指多肽序列的一部分，其长度为至少或约4个氨基酸、至少或约5个氨基酸、至少或约6个氨基酸、至少或约7个氨基酸、至少或约8个氨基酸、至少或约9个氨基酸、至少或约10个氨基酸、至少或约11个氨基酸、至少或约12个氨基酸、至少或约13个氨基酸、至少或约14个氨基酸、至少或约15个氨基酸、至少或约16个氨基酸、至少或约17个氨基酸、至少或约18个氨基酸、至少或约19个氨基酸或至少或约20个氨基酸，或长度为超过20个氨基酸。可以使用本文描述的任何方法生产重组蛋白片段。
术语“工程化蛋白”意指不是由生物体(例如哺乳动物)内存在的内源性核酸天然编码的多肽。工程化蛋白的例子包括酶(例如，具有一个或多个使工程化酶的稳定性和/或催化活性增加的氨基酸取代、缺失、插入或添加)、融合蛋白、抗体(例如，二价抗体、三价抗体或双抗体)和包括至少一个重组支架序列的抗原结合蛋白。
术语“分泌的蛋白质”或“分泌的重组蛋白”意指如下蛋白质(例如，重组蛋白)，其在哺乳动物细胞内翻译时最初包括至少一个分泌信号序列，并且在哺乳动物细胞中至少部分通过酶促切割分泌信号序列而至少部分分泌到细胞外空间(例如，液体培养基)中。本领域技术人员将理解“分泌的”蛋白质不需要完全从细胞中解离以被认为是分泌的蛋白质。
术语“灌注生物反应器”意指在第一液体培养基中包含多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的生物反应器，其中存在于所述生物反应器中的细胞的培养包括周期性或连续去除所述第一液体培养基并且同时或此后不久将基本上相同体积的第二液体培养基添加至所述生物反应器中。在一些例子中，在培养时间段内经递增的时间段(例如，约24小时的时间段、约1分钟与约24小时之间的时间段或大于24小时的时间段)去除和添加的第一液体培养基的体积存在递增变化(例如，增加或减少)(例如，培养基的每天再馈送速率)。每天去除和更换的培养基分数可以根据培养的特定细胞、初始接种密度和特定时间的细胞密度而变化。“RV”或“反应器体积”意指培养过程开始时存在的培养基的体积(例如，接种后存在的培养基的总体积)。
术语“补料分批生物反应器”是本领域的术语，并且意指在第一液体培养基中包含多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的生物反应器，其中存在于所述生物反应器中的细胞的培养包括在不从所述细胞培养物大量或显著地去除所述第一液体培养基或第二液体培养基的情况下将第二液体培养基周期性或连续添加至所述第一液体培养基中。所述第二液体培养基可以与所述第一液体培养基相同。在补料分批培养的一些例子中，所述第二液体培养基是所述第一液体培养基的浓缩形式。在补料分批培养的一些例子中，将所述第二液体培养基作为干粉添加。
术语“澄清的液体培养基”意指从细菌或酵母细胞培养物获得的基本上不含(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％不含)细菌或酵母细胞的液体培养基。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与业内本领域技术人员通常所理解相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和例子仅是说明性的而非旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据条目和其他参考文献都通过引用以其整体并入。在矛盾的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。
从以下具体实施方式和附图以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得清楚。
【附图说明】
图1是显示MabSelectTM SuReTM(蛋白A层析树脂)在以下缓冲液之一存在下，在40-49kGy照射后，在多个层析循环中的结合能力百分比(与载有相同物质的未照射层析树脂相比)的图：(i)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸和25mM甘露糖醇(“SMM’H”)；(ii)2v/v％苯甲醇(“2％BA”)；和(iii)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸、25mM甘露糖醇和2v/v％苯甲醇(“SMM’H+2％BA”)。
图2是显示Capto Adhere层析树脂在以下缓冲液之一存在下，在28-34kGy或40-49kGy照射(如实施例2中所述)后，在多个层析循环中的结合能力百分比(与载有相同物质的未照射层析树脂相比)的图：(i)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸和25mM甘露糖醇(“SMM’H”)；或(ii)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸、25mM甘露糖醇和2v/v％苯甲醇(“SMM’H+2％BA”)。
【发明详述】
本文提供了减少层析树脂的生物负载的方法，所述方法包括：将包含含有(i)层析树脂和(ii)含至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)醇的液体的组合物的容器暴露于足以减少所述容器和所述层析树脂的生物负载的剂量的γ-照射，其中至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后/之时结合能力的损失。还提供了含有通过本文所述的任何方法制备的生物负载减少的层析树脂的生物负载减少的层析柱；包含(i)层析树脂和(ii)含至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)醇的液体的组合物；使用这些生物负载减少的层析柱中的至少一个执行生物负载减少的柱层析的方法；以及用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭或基本上封闭且连续的方法，所述方法包括使用这些生物负载减少的层析柱中的至少一个。下文描述这些方法和过程的非限制性方面。如业内可以理解的，下文描述的各个方面可以以任何组合使用而没有限制。
含有层析树脂和至少一种醇的组合物
本文提供了如下组合物，所述组合物包含(i)层析树脂(例如，本文所述或业内已知的任何层析树脂)和(ii)含至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)醇(例如，本文所述或业内已知的任何示例性醇)的液体，其中至少一种醇的存在量足以改善层析树脂在用足以减少组合物的生物负载的剂量的γ-照射处理时结合能力的损失。例如，层析树脂可以是以下中的至少一种：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和或假亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂，或其任何组合。在一些例子中，层析树脂是包含蛋白质或肽配位体的树脂(例如，具有蛋白质或肽配位体的亲和层析树脂，例如，蛋白A或蛋白G层析树脂)。
组合物例如可以是沉降的层析树脂的浆液。在一些例子中，组合物可以是润湿或潮湿的固体混合物。在一些例子中，组合物是填充在液体中的层析树脂。
在任何组合物的一些例子中，至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)醇可以选自：苯甲醇、环己醇、异丁醇、2-甲基-2-丁醇、甲醇、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、丁-1-醇、戊-1-醇、十六烷-1-醇、2-苯基乙醇、仲苯基乙醇、3-苯基-1-丙醇、1-苯基-1-丙醇、2-苯基-1-丙醇、2-苯基-2-丙醇、1-苯基-2-丁醇、2-苯基-1-丁醇、3-苯基-1-丁醇、4-苯基-2-丁醇、dl-1-苯基-2-戊醇、5-苯基-1-戊醇和4-苯基-1-丁醇。在一些例子中，至少一种醇可以是苯甲醇。
在任何组合物的一些例子中，液体或组合物中一种或多种醇的总和浓度为约0.01v/v％至约20v/v％、约0.01v/v％至约19v/v％、约0.01v/v％至约18v/v％、约0.01v/v％至约17v/v％、约0.01v/v％至约16v/v％、约0.01v/v％至约15v/v％、约0.01v/v％至约14v/v％、约0.01v/v％至约13v/v％、约0.01v/v％至约12v/v％、约0.01v/v％至约11v/v％、约0.01v/v％至约10v/v％、约0.01v/v％至约9v/v％、约0.01v/v％至约8v/v％、约0.01v/v％至约7v/v％、约0.01v/v％至约6v/v％、约0.01v/v％至约5v/v％、约0.01v/v％至约4.5v/v％、约0.01v/v％至约4.0v/v％、约0.01v/v％至约3.5v/v％、约0.01v/v％至约3.0v/v％、约0.01v/v％至约2.5v/v％、约0.01v/v％至约2.2v/v％、约0.01v/v％至约2.0v/v％、约0.01v/v％至约1.8v/v％、约0.01v/v％至约1.6v/v％、约0.01v/v％至约1.4v/v％、约0.01v/v％至约1.2v/v％、约0.01v/v％至约1.0v/v％、约0.01v/v％至约0.8v/v％、约0.01v/v％至约0.6v/v％、约0.01v/v％至约0.4v/v％、约0.01v/v％至约0.2v/v％、约0.01v/v％至约0.1v/v％、约0.01v/v％至约0.05v/v％、约0.05v/v％至约20v/v％、约0.05v/v％至约19v/v％、约0.05v/v％至约18v/v％、约0.05v/v％至约17v/v％、约0.05v/v％至约16v/v％、约0.05v/v％至约15v/v％、约0.05v/v％至约14v/v％、约0.05v/v％至约13v/v％、约0.05v/v％至约12v/v％、约0.05v/v％至约11v/v％、约0.05v/v％至约10v/v％、约0.05v/v％至约9v/v％、约0.05v/v％至约8v/v％、约0.05v/v％至约7v/v％、约0.05v/v％至约6v/v％、约0.05v/v％至约5v/v％、约0.05v/v％至约4.5v/v％、约0.05v/v％至约4.0v/v％、约0.05v/v％至约3.5v/v％、约0.05v/v％至约3.0v/v％、约0.05v/v％至约2.5v/v％、约0.05v/v％至约2.2v/v％、约0.05v/v％至约2.0v/v％、约0.05v/v％至约1.8v/v％、约0.05v/v％至约1.6v/v％、约0.05v/v％至约1.4v/v％、约0.05v/v％至约1.2v/v％、约0.05v/v％至约1.0v/v％、约0.05v/v％至约0.8v/v％、约0.05v/v％至约0.6v/v％、约0.05v/v％至约0.4v/v％、约0.05v/v％至约0.2v/v％、约0.05v/v％至约0.1v/v％、约0.1v/v％至约20v/v％、约0.1v/v％至约19v/v％、约0.1v/v％至约18v/v％、约0.1v/v％至约17v/v％、约0.1v/v％至约16v/v％、约0.1v/v％至约15v/v％、约0.1v/v％至约14v/v％、约0.1v/v％至约13v/v％、约0.1v/v％至约12v/v％、约0.1v/v％至约11v/v％、约0.1v/v％至约10v/v％、约0.1v/v％至约9v/v％、约0.1v/v％至约8v/v％、约0.1v/v％至约7v/v％、约0.1v/v％至约6v/v％、约0.1v/v％至约5v/v％、约0.1v/v％至约4.5v/v％、约0.1v/v％至约4.0v/v％、约0.1v/v％至约3.5v/v％、约0.1v/v％至约3.0v/v％、约0.1v/v％至约2.5v/v％、约0.1v/v％至约2.2v/v％、约0.1v/v％至约2.0v/v％、约0.1v/v％至约1.8v/v％、约0.1v/v％至约1.6v/v％、约0.1v/v％至约1.4v/v％、约0.1v/v％至约1.2v/v％、约0.1v/v％至约1.0v/v％、约0.1v/v％至约0.8v/v％、约0.1v/v％至约0.6v/v％、约0.1v/v％至约0.4v/v％、约0.1v/v％至约0.2v/v％、约0.2v/v％至约20v/v％、约0.2v/v％至约19v/v％、约0.2v/v％至约18v/v％、约0.2v/v％至约17v/v％、约0.2v/v％至约16v/v％、约0.2v/v％至约15v/v％、约0.2v/v％至约14v/v％、约0.2v/v％至约13v/v％、约0.2v/v％至约12v/v％、约0.2v/v％至约11v/v％、约0.2v/v％至约10v/v％、约0.2v/v％至约9v/v％、约0.2v/v％至约8v/v％、约0.2v/v％至约7v/v％、约0.2v/v％至约6v/v％、约0.2v/v％至约5v/v％、约0.2v/v％至约4.5v/v％、约0.2v/v％至约4.0v/v％、约0.2v/v％至约3.5v/v％、约0.2v/v％至约3.0v/v％、约0.2v/v％至约2.5v/v％、约0.2v/v％至约2.2v/v％、约0.2v/v％至约2.0v/v％、约0.2v/v％至约1.8v/v％、约0.2v/v％至约1.6v/v％、约0.2v/v％至约1.4v/v％、约0.2v/v％至约1.2v/v％、约0.2v/v％至约1.0v/v％、约0.2v/v％至约0.8v/v％、约0.2v/v％至约0.6v/v％、约0.2v/v％至约0.4v/v％、约0.4v/v％至约20v/v％、约0.4v/v％至约19v/v％、约0.4v/v％至约18v/v％、约0.4v/v％至约17v/v％、约0.4v/v％至约16v/v％、约0.4v/v％至约15v/v％、约0.4v/v％至约14v/v％、约0.4v/v％至约13v/v％、约0.4v/v％至约12v/v％、约0.4v/v％至约11v/v％、约0.4v/v％至约10v/v％、约0.4v/v％至约9v/v％、约0.4v/v％至约8v/v％、约0.4v/v％至约7v/v％、约0.4v/v％至约6v/v％、约0.4v/v％至约5v/v％、约0.4v/v％至约4.5v/v％、约0.4v/v％至约4.0v/v％、约0.4v/v％至约3.5v/v％、约0.4v/v％至约3.0v/v％、约0.4v/v％至约2.5v/v％、约0.4v/v％至约2.2v/v％、约0.4v/v％至约2.0v/v％、约0.4v/v％至约1.8v/v％、约0.4v/v％至约1.6v/v％、约0.4v/v％至约1.4v/v％、约0.4v/v％至约1.2v/v％、约0.4v/v％至约1.0v/v％、约0.4v/v％至约0.8v/v％、约0.4v/v％至约0.6v/v％、约0.6v/v％至约20v/v％、约0.6v/v％至约19v/v％、约0.6v/v％至约18v/v％、约0.6v/v％至约17v/v％、约0.6v/v％至约16v/v％、约0.6v/v％至约15v/v％、约0.6v/v％至约14v/v％、约0.6v/v％至约13v/v％、约0.6v/v％至约12v/v％、约0.6v/v％至约11v/v％、约0.6v/v％至约10v/v％、约0.6v/v％至约9v/v％、约0.6v/v％至约8v/v％、约0.6v/v％至约7v/v％、约0.6v/v％至约6v/v％、约0.6v/v％至约5v/v％、约0.6v/v％至约4.5v/v％、约0.6v/v％至约4.0v/v％、约0.6v/v％至约3.5v/v％、约0.6v/v％至约3.0v/v％、约0.6v/v％至约2.5v/v％、约0.6v/v％至约2.2v/v％、约0.6v/v％至约2.0v/v％、约0.6v/v％至约1.8v/v％、约0.6v/v％至约1.6v/v％、约0.6v/v％至约1.4v/v％、约0.6v/v％至约1.2v/v％、约0.6v/v％至约1.0v/v％、约0.6v/v％至约0.8v/v％、约0.8v/v％至约20v/v％、约0.8v/v％至约19v/v％、约0.8v/v％至约18v/v％、约0.8v/v％至约17v/v％、约0.8v/v％至约16v/v％、约0.8v/v％至约15v/v％、约0.8v/v％至约14v/v％、约0.8v/v％至约13v/v％、约0.8v/v％至约12v/v％、约0.8v/v％至约11v/v％、约0.8v/v％至约10v/v％、约0.8v/v％至约9v/v％、约0.8v/v％至约8v/v％、约0.8v/v％至约7v/v％、约0.8v/v％至约6v/v％、约0.8v/v％至约5v/v％、约0.8v/v％至约4.5v/v％、约0.8v/v％至约4.0v/v％、约0.8v/v％至约3.5v/v％、约0.8v/v％至约3.0v/v％、约0.8v/v％至约2.5v/v％、约0.8v/v％至约2.2v/v％、约0.8v/v％至约2.0v/v％、约0.8v/v％至约1.8v/v％、约0.8v/v％至约1.6v/v％、约0.8v/v％至约1.4v/v％、约0.8v/v％至约1.2v/v％、约0.8v/v％至约1.0v/v％、约1.0v/v％至约20v/v％、约1.0v/v％至约19v/v％、约1.0v/v％至约18v/v％、约1.0v/v％至约17v/v％、约1.0v/v％至约16v/v％、约1.0v/v％至约15v/v％、约1.0v/v％至约14v/v％、约1.0v/v％至约13v/v％、约1.0v/v％至约12v/v％、约1.0v/v％至约11v/v％、约1.0v/v％至约10v/v％、约1.0v/v％至约9v/v％、约1.0v/v％至约8v/v％、约1.0v/v％至约7v/v％、约1.0v/v％至约6v/v％、约1.0v/v％至约5v/v％、约1.0v/v％至约4.5v/v％、约1.0v/v％至约4.0v/v％、约1.0v/v％至约3.5v/v％、约1.0v/v％至约3.0v/v％、约1.0v/v％至约2.5v/v％、约1.0v/v％至约2.2v/v％、约1.0v/v％至约2.0v/v％、约1.0v/v％至约1.8v/v％、约1.0v/v％至约1.6v/v％、约1.0v/v％至约1.4v/v％、约1.0v/v％至约1.2v/v％、约1.2v/v％至约20v/v％、约1.2v/v％至约19v/v％、约1.2v/v％至约18v/v％、约1.2v/v％至约17v/v％、约1.2v/v％至约16v/v％、约1.2v/v％至约15v/v％、约1.2v/v％至约14v/v％、约1.2v/v％至约13v/v％、约1.2v/v％至约12v/v％、约1.2v/v％至约11v/v％、约1.2v/v％至约10v/v％、约1.2v/v％至约9v/v％、约1.2v/v％至约8v/v％、约1.2v/v％至约7v/v％、约1.2v/v％至约6v/v％、约1.2v/v％至约5v/v％、约1.2v/v％至约4.5v/v％、约1.2v/v％至约4.0v/v％、约1.2v/v％至约3.5v/v％、约1.2v/v％至约3.0v/v％、约1.2v/v％至约2.5v/v％、约1.2v/v％至约2.2v/v％、约1.2v/v％至约2.0v/v％、约1.2v/v％至约1.8v/v％、约1.2v/v％至约1.6v/v％、约1.2v/v％至约1.4v/v％、约1.4v/v％至约20v/v％、约1.4v/v％至约19v/v％、约1.4v/v％至约18v/v％、约1.4v/v％至约17v/v％、约1.4v/v％至约16v/v％、约1.4v/v％至约15v/v％、约1.4v/v％至约14v/v％、约1.4v/v％至约13v/v％、约1.4v/v％至约12v/v％、约1.4v/v％至约11v/v％、约1.4v/v％至约10v/v％、约1.4v/v％至约9v/v％、约1.4v/v％至约8v/v％、约1.4v/v％至约7v/v％、约1.4v/v％至约6v/v％、约1.4v/v％至约5v/v％、约1.4v/v％至约4.5v/v％、约1.4v/v％至约4.0v/v％、约1.4v/v％至约3.5v/v％、约1.4v/v％至约3.0v/v％、约1.4v/v％至约2.5v/v％、约1.4v/v％至约2.2v/v％、约1.4v/v％至约2.0v/v％、约1.4v/v％至约1.8v/v％、约1.4v/v％至约1.6v/v％、约1.6v/v％至约20v/v％、约1.6v/v％至约19v/v％、约1.6v/v％至约18v/v％、约1.6v/v％至约17v/v％、约1.6v/v％至约16v/v％、约1.6v/v％至约15v/v％、约1.6v/v％至约14v/v％、约1.6v/v％至约13v/v％、约1.6v/v％至约12v/v％、约1.6v/v％至约11v/v％、约1.6v/v％至约10v/v％、约1.6v/v％至约9v/v％、约1.6v/v％至约8v/v％、约1.6v/v％至约7v/v％、约1.6v/v％至约6v/v％、约1.6v/v％至约5v/v％、约1.6v/v％至约4.5v/v％、约1.6v/v％至约4.0v/v％、约1.6v/v％至约3.5v/v％、约1.6v/v％至约3.0v/v％、约1.6v/v％至约2.5v/v％、约1.6v/v％至约2.2v/v％、约1.6v/v％至约2.0v/v％、约1.6v/v％至约1.8v/v％、约1.8v/v％至约20v/v％、约1.8v/v％至约19v/v％、约1.8v/v％至约18v/v％、约1.8v/v％至约17v/v％、约1.8v/v％至约16v/v％、约1.8v/v％至约15v/v％、约1.8v/v％至约14v/v％、约1.8v/v％至约13v/v％、约1.8v/v％至约12v/v％、约1.8v/v％至约11v/v％、约1.8v/v％至约10v/v％、约1.8v/v％至约9v/v％、约1.8v/v％至约8v/v％、约1.8v/v％至约7v/v％、约1.8v/v％至约6v/v％、约1.8v/v％至约5v/v％、约1.8v/v％至约4.5v/v％、约1.8v/v％至约4.0v/v％、约1.8v/v％至约3.5v/v％、约1.8v/v％至约3.0v/v％、约1.8v/v％至约2.5v/v％、约1.8v/v％至约2.2v/v％、约1.8v/v％至约2.0v/v％、约2.0v/v％至约20v/v％、约2.0v/v％至约19v/v％、约2.0v/v％至约18v/v％、约2.0v/v％至约17v/v％、约2.0v/v％至约16v/v％、约2.0v/v％至约15v/v％、约2.0v/v％至约14v/v％、约2.0v/v％至约13v/v％、约2.0v/v％至约12v/v％、约2.0v/v％至约11v/v％、约2.0v/v％至约10v/v％、约2.0v/v％至约9v/v％、约2.0v/v％至约8v/v％、约2.0v/v％至约7v/v％、约2.0v/v％至约6v/v％、约2.0v/v％至约5v/v％、约2.0v/v％至约4.5v/v％、约2.0v/v％至约4.0v/v％、约2.0v/v％至约3.5v/v％、约2.0v/v％至约3.0v/v％、约2.0v/v％至约2.5v/v％、约2.0v/v％至约2.2v/v％、约2.2v/v％至约20v/v％、约2.2v/v％至约19v/v％、约2.2v/v％至约18v/v％、约2.2v/v％至约17v/v％、约2.2v/v％至约16v/v％、约2.2v/v％至约15v/v％、约2.2v/v％至约14v/v％、约2.2v/v％至约13v/v％、约2.2v/v％至约12v/v％、约2.2v/v％至约11v/v％、约2.2v/v％至约10v/v％、约2.2v/v％至约9v/v％、约2.2v/v％至约8v/v％、约2.2v/v％至约7v/v％、约2.2v/v％至约6v/v％、约2.2v/v％至约5v/v％、约2.2v/v％至约4.5v/v％、约2.2v/v％至约4.0v/v％、约2.2v/v％至约3.5v/v％、约2.2v/v％至约3.0v/v％、约2.2v/v％至约2.5v/v％、约2.5v/v％至约20v/v％、约2.5v/v％至约19v/v％、约2.5v/v％至约18v/v％、约2.5v/v％至约17v/v％、约2.5v/v％至约16v/v％、约2.5v/v％至约15v/v％、约2.5v/v％至约14v/v％、约2.5v/v％至约13v/v％、约2.5v/v％至约12v/v％、约2.5v/v％至约11v/v％、约2.5v/v％至约10v/v％、约2.5v/v％至约9v/v％、约2.5v/v％至约8v/v％、约2.5v/v％至约7v/v％、约2.5v/v％至约6v/v％、约2.5v/v％至约5v/v％、约2.5v/v％至约4.5v/v％、约2.5v/v％至约4.0v/v％、约2.5v/v％至约3.5v/v％、约2.5v/v％至约3.0v/v％、约3.0v/v％至约20v/v％、约3.0v/v％至约19v/v％、约3.0v/v％至约18v/v％、约3.0v/v％至约17v/v％、约3.0v/v％至约16v/v％、约3.0v/v％至约15v/v％、约3.0v/v％至约14v/v％、约3.0v/v％至约13v/v％、约3.0v/v％至约12v/v％、约3.0v/v％至约11v/v％、约3.0v/v％至约10v/v％、约3.0v/v％至约9v/v％、约3.0v/v％至约8v/v％、约3.0v/v％至约7v/v％、约3.0v/v％至约6v/v％、约3.0v/v％至约5v/v％、约3.0v/v％至约4.5v/v％、约3.0v/v％至约4.0v/v％、约3.0v/v％至约3.5v/v％、约3.5v/v％至约20v/v％、约3.5v/v％至约19v/v％、约3.5v/v％至约18v/v％、约3.5v/v％至约17v/v％、约3.5v/v％至约16v/v％、约3.5v/v％至约15v/v％、约3.5v/v％至约14v/v％、约3.5v/v％至约13v/v％、约3.5v/v％至约12v/v％、约3.5v/v％至约11v/v％、约3.5v/v％至约10v/v％、约3.5v/v％至约9v/v％、约3.5v/v％至约8v/v％、约3.5v/v％至约7v/v％、约3.5v/v％至约6v/v％、约3.5v/v％至约5v/v％、约3.5v/v％至约4.5v/v％、约3.5v/v％至约4.0v/v％、约4.0v/v％至约20v/v％、约4.0v/v％至约19v/v％、约4.0v/v％至约18v/v％、约4.0v/v％至约17v/v％、约4.0v/v％至约16v/v％、约4.0v/v％至约15v/v％、约4.0v/v％至约14v/v％、约4.0v/v％至约13v/v％、约4.0v/v％至约12v/v％、约4.0v/v％至约11v/v％、约4.0v/v％至约10v/v％、约4.0v/v％至约9v/v％、约4.0v/v％至约8v/v％、约4.0v/v％至约7v/v％、约4.0v/v％至约6v/v％、约4.0v/v％至约5v/v％、约4.0v/v％至约4.5v/v％、约4.5v/v％至约20v/v％、约4.5v/v％至约19v/v％、约4.5v/v％至约18v/v％、约4.5v/v％至约17v/v％、约4.5v/v％至约16v/v％、约4.5v/v％至约15v/v％、约4.5v/v％至约14v/v％、约4.5v/v％至约13v/v％、约4.5v/v％至约12v/v％、约4.5v/v％至约11v/v％、约4.5v/v％至约10v/v％、约4.5v/v％至约9v/v％、约4.5v/v％至约8v/v％、约4.5v/v％至约7v/v％、约4.5v/v％至约6v/v％、约4.5v/v％至约5v/v％、约5v/v％至约20v/v％、约5v/v％至约19v/v％、约5v/v％至约18v/v％、约5v/v％至约17v/v％、约5v/v％至约16v/v％、约5v/v％至约15v/v％、约5v/v％至约14v/v％、约5v/v％至约13v/v％、约5v/v％至约12v/v％、约5v/v％至约11v/v％、约5v/v％至约10v/v％、约5v/v％至约9v/v％、约5v/v％至约8v/v％、约5v/v％至约7v/v％、约5v/v％至约6v/v％、约6v/v％至约20v/v％、约6v/v％至约19v/v％、约6v/v％至约18v/v％、约6v/v％至约17v/v％、约6v/v％至约16v/v％、约6v/v％至约15v/v％、约6v/v％至约14v/v％、约6v/v％至约13v/v％、约6v/v％至约12v/v％、约6v/v％至约11v/v％、约6v/v％至约10v/v％、约6v/v％至约9v/v％、约6v/v％至约8v/v％、约6v/v％至约7v/v％、约7v/v％至约20v/v％、约7v/v％至约19v/v％、约7v/v％至约18v/v％、约7v/v％至约17v/v％、约7v/v％至约16v/v％、约7v/v％至约15v/v％、约7v/v％至约14v/v％、约7v/v％至约13v/v％、约7v/v％至约12v/v％、约7v/v％至约11v/v％、约7v/v％至约10v/v％、约7v/v％至约9v/v％、约7v/v％至约8v/v％、约8v/v％至约20v/v％、约8v/v％至约19v/v％、约8v/v％至约18v/v％、约8v/v％至约17v/v％、约8v/v％至约16v/v％、约8v/v％至约15v/v％、约8v/v％至约14v/v％、约8v/v％至约13v/v％、约8v/v％至约12v/v％、约8v/v％至约11v/v％、约8v/v％至约10v/v％、约8v/v％至约9v/v％、约9v/v％至约20v/v％、约9v/v％至约19v/v％、约9v/v％至约18v/v％、约9v/v％至约17v/v％、约9v/v％至约16v/v％、约9v/v％至约15v/v％、约9v/v％至约14v/v％、约9v/v％至约13v/v％、约9v/v％至约12v/v％、约9v/v％至约11v/v％、约9v/v％至约10v/v％、约10v/v％至约20v/v％、约10v/v％至约19v/v％、约10v/v％至约18v/v％、约10v/v％至约17v/v％、约10v/v％至约16v/v％、约10v/v％至约15v/v％、约10v/v％至约14v/v％、约10v/v％至约13v/v％、约10v/v％至约12v/v％、约10v/v％至约11v/v％、约11v/v％至约20v/v％、约11v/v％至约19v/v％、约11v/v％至约18v/v％、约11v/v％至约17v/v％、约11v/v％至约16v/v％、约11v/v％至约15v/v％、约11v/v％至约14v/v％、约11v/v％至约13v/v％、约11v/v％至约12v/v％、约12v/v％至约20v/v％、约12v/v％至约19v/v％、约12v/v％至约18v/v％、约12v/v％至约17v/v％、约12v/v％至约16v/v％、约12v/v％至约15v/v％、约12v/v％至约14v/v％、约12v/v％至约13v/v％、约13v/v％至约20v/v％、约13v/v％至约19v/v％、约13v/v％至约18v/v％、约13v/v％至约17v/v％、约13v/v％至约16v/v％、约13v/v％至约15v/v％、约13v/v％至约14v/v％、约14v/v％至约20v/v％、约14v/v％至约19v/v％、约14v/v％至约18v/v％、约14v/v％至约17v/v％、约14v/v％至约16v/v％、约14v/v％至约15v/v％、约15v/v％至约20v/v％、约15v/v％至约19v/v％、约15v/v％至约18v/v％、约15v/v％至约17v/v％、约15v/v％至约16v/v％、约16v/v％至约20v/v％、约16v/v％至约19v/v％、约16v/v％至约18v/v％、约16v/v％至约17v/v％、约17v/v％至约20v/v％、约17v/v％至约19v/v％、约17v/v％至约18v/v％、约18v/v％至约20v/v％、约18v/v％至约19v/v％或约19v/v％至约20v/v％。
在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体还可以包含至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)抗氧化剂和/或螯合剂。在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体还可以包含至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)抗氧化剂和/或螯合剂，其量足以改善层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体可以包含至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)选自以下的抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑激素、西红柿红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、酚丙酸、利多卡因、柚皮素、富勒烯、葡萄糖、甘露糖醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基呱啶-1-氧基和二甲基甲氧基色原烷醇。在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体可以包含至少一种(例如，两种、三种或四种)选自下组的抗氧化剂：甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体可以含有至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)、抗坏血酸钠、组氨酸和甘露糖醇。在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体可以含有甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)、抗坏血酸钠、组氨酸和甘露糖醇。在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体可以包含：(i)75mM与约125mM之间(例如，80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的甘露糖醇；(ii)75mM与约125mM之间(例如，约80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)；(iii)75mM与约125mM之间(例如，约80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的抗坏血酸钠；(iv)75mM与约125mM之间(例如，约80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的组氨酸；(v)约30mM与约70mM之间(例如，约35mM与约65mM之间、约40mM与约60mM之间或约45mM与约55mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)和约30mM与约70mM之间(例如，约35mM与约65mM之间、约40mM与约60mM之间或约45mM与约55mM之间)的组氨酸；(vi)约10mM与约50mM之间(例如，约15mM与约45mM之间、约20mM与约40mM之间或约25mM与约35mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)、约10mM与约50mM之间(例如，约15mM与约45mM之间、约20mM与约40mM之间或约25mM与约35mM之间)的组氨酸和约10mM与约50mM之间(例如，约15mM与约45mM之间、约20mM与约40mM之间或约25mM与约35mM之间)的抗坏血酸钠；或(vii)约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间或约20mM与约30mM之间)的抗坏血酸钠、约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间或约20mM与约30mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)、约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间或约20mM与约30mM之间)的甘露糖醇和约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间或约20mM与约30mM之间)的组氨酸。在本文所述的任何组合物的一些例子中，液体可以是缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲溶液，例如磷酸钠缓冲溶液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，液体还可以包含至少一种(例如，两种、三种、四种或五种)螯合剂(例如，至少一种选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基丁二酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺)。
本文还提供了包含如下组合物(例如，本文所述的任何示例性组合物)的容器(例如，储存器皿，例如塑料容器或层析柱)，所述组合物包含(i)层析树脂(例如，本文所述或业内已知的任何层析树脂)和(ii)含至少一种醇(例如，本文所述或业内已知的任何示例性醇)的液体，其中至少一种醇的存在量足以改善层析树脂在用足以减少组合物的生物负载的剂量的γ-照射处理时结合能力的损失。例如，容器(例如，储存容器，例如塑料容器或层析柱)的内部体积可以是例如至少约1mL、5mL、至少约10mL、至少约20mL、至少约30mL、至少约40mL、至少约50mL、至少约60mL、至少约70mL、至少约80mL、至少约90mL、至少约100mL、至少约110mL、至少约120mL、至少约130mL、至少约140mL、至少约150mL、至少约160mL、至少约170mL、至少约180mL、至少约190mL、至少约200mL、至少约210mL、至少约220mL、至少约230mL、至少约240mL、至少约250mL、至少300mL、至少350mL、至少400mL或至少500mL。例如，容器的内部体积可以是例如约1mL与约500mL之间、约1mL与约50mL之间、约5mL与约500mL之间、约5mL与约400mL之间、约5mL与约350mL之间、约5mL与约300mL之间、约5mL与约250mL之间、约5mL与约200mL之间、约5mL与约150mL之间、约5mL与约100mL之间或约5mL与约50mL之间。在一些例子中，容器中的层析树脂是沉降的层析树脂在液体中的浆液。在一些例子中，容器包含填充层析树脂(例如，填充在液体中)。
在本文提供的任何组合物中，液体还可以含有至少一种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)抗氧化剂和/或至少一种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)螯合剂。可以包含在本文提供的任何组合物中的任何抗氧化剂可以具有淬灭一种或多种以下活性氧和/或氮物质的能力：羟基自由基、碳酸根自由基、超氧阴离子、过氧自由基、过氧亚硝酸盐、二氧化氮和一氧化氮。可以包含在本文提供的任何组合物中的抗氧化剂的非限制性例子包括：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑激素、西红柿红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、酚丙酸、利多卡因、柚皮素、富勒烯、葡萄糖、甘露糖醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基呱啶-1-氧基和二甲基甲氧基色原烷醇。抗氧化剂的其他非限制性例子包括抗氧化酶(例如，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白还原酶)。可以包含在本文提供的任何组合物中的抗氧化剂的其他例子包括甘露糖醇、抗坏血酸钠、甲硫氨酸和组氨酸。抗氧化剂的其他例子包括半胱氨酸、牛磺酸、巯基丙酰甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸、大蒜油、二烯丙基硫醚、二氢硫辛酸和二烯丙基三硫化物。包含抗氧化酶作为抗氧化剂的一些实施方案还可以包括酶的一种或多种底物。可以使用本领域已知的许多方法鉴别抗氧化剂，所述方法包括例如自旋捕获、氧化还原敏感染料和化学发光测定。
可以包含在本文提供的任何组合物中的一或多种螯合剂中的任一者可以具有以高亲和力(例如，约或小于1μM、约或小于800nM、约或小于700nM、约或小于600nM、约或小于500nM、约或小于400nM、约或小于300nM、约或小于250nM、约或小于200nM、约或小于150nM、约或小于100nM、约或小于80nM、约或小于60nM、约或小于40nM、约或小于20nM或约或小于1nm)结合氧化还原活性金属(例如，Cu2+和Fe2+)的能力。可以包含在本文提供的任何组合物中的一种或多种螯合剂的非限制性例子包括乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基琥珀酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺。
可以包含在本文提供的任何组合物中的一种或多种螯合剂和/或一种或多种抗氧化剂中的每一种的浓度可以是约0.1mM与约150mM之间(例如，约0.1mM与约150mM之间、约0.1mM与约125mM之间、约0.1mM与约100mM之间、约0.1mM与约80mM之间、约0.1mM与约60mM之间、约0.1mM与约50mM之间、约0.1mM与约40mM之间、约0.1mM与约30mM之间、约0.1mM与约25mM之间、约0.1mM与约20mM之间、约0.1mM与约10mM之间、约0.1mM与约5.0mM之间、约0.5mM与约150mM之间、约0.5mM与约100mM之间、约0.5mM与约50mM之间、约0.5mM与约25mM之间、约0.5mM与约15mM之间、约0.5mM与约10mM之间、约0.5mM与约5mM之间、约1mM与约125mM之间、约1mM与约120mM之间、约1mM与约100mM之间、约1mM与约80mM之间、约1mM与约60mM之间、约1mM与约50mM之间、约1mM与约40mM之间、约1mM与约30mM之间、约1mM与约25mM之间、约5mM与约150mM之间、约5mM与约125mM之间、约5mM与约100mM之间、约5mM与约80mM之间、约5mM与约60mM之间、约5mM与约50mM之间、约5mM与约40mM之间、约5mM与约30mM之间、约5mM与约25mM之间、约10mM与约150mM之间、约10mM与约125mM之间、约1mM与约100mM之间、约10mM与约80mM之间、约10mM与约60mM之间、约10mM与约50mM之间、约10mM与约40mM之间、约10mM与约30mM之间、约10mM与约25mM之间、约20mM与约150mM之间、约20mM与约125mM之间、约20mM与约100mM之间、约20mM与约80mM之间、约20mM与约60mM之间、约20mM与约50mM之间、约20mM与约40mM之间、约20mM与约30mM之间、约30mM与约150mM之间、约30mM与约125mM之间、约30mM与约100mM之间、约30mM与约80mM之间、约30mM与约60mM之间、约30mM与约50mM之间、约30mM与约40mM之间、约40mM与约150mM之间、约40mM与约125mM之间、约40mM与约100mM之间、约40mM与约90mM之间、约40mM与约80mM之间、约40mM与约70mM之间、约40mM与约60mM之间、约50mM与约150mM之间、约50mM与约125mM之间、约50mM与约100mM之间、约50mM与约80mM之间、约50mM与约60mM之间、约80mM与约150mM之间、约80mM与约125mM之间、约80mM与约100mM之间、约100mM与约150mM之间或约100mM与约125mM之间)。
在一些例子中，本文提供的组合物可以含有以下中的一种或多种：5mM至约150mM之间的甘露糖醇(例如，约10mM与约150mM之间、约20mM与约150mM之间、约30mM与约150mM之间、约40mM与约150mM之间、约50mM与约150mM之间、约60mM与约140mM之间、约70mM与约130mM之间、约80mM与约120mM之间、约90mM与约110mM之间、约95mM与约105mM之间、约5mM与约50mM之间、约5mM与约45mM之间、约5mM与约40mM之间、约5mM与约35mM之间、约10mM与约35mM之间、约15mM与约35mM之间或约20mM与约30mM之间的甘露糖醇)；5mM与约150mM之间(例如，约10mM与约150mM之间、约20mM与约150mM之间、约30mM与约150mM之间、约40mM与约150mM之间、约50mM与约150mM之间、约60mM与约140mM之间、约70mM与约130mM之间、约80mM与约120mM之间、约90mM与约110mM之间、约95mM与约105mM之间、约30mM与约70mM之间、约35mM与约65mM之间、约40mM与约60mM之间、约45mM与约55mM之间、约20mM与约50mM之间、约25mM与约45mM之间、约30mM与约40mM之间、约30mM与约35mM之间、约5mM与约45mM之间、约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间、约20mM与约30mM之间或约20mM与约25mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)；5mM与150mM之间的抗坏血酸钠(例如，约10mM与约150mM之间、约20mM与约150mM之间、约30mM与约150mM之间、约40mM与约150mM之间、约50mM与约150mM之间、约60mM与约140mM之间、约70mM与约130mM之间、约80mM与约120mM之间、约90mM与约110mM之间、约95mM与约105mM之间、约10mM与约50mM之间、约15mM与约45mM之间、约20mM与约40mM之间、约25mM与约35mM之间、约30mM与约35mM之间、约5mM与约45mM之间、约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间、约20mM与约30mM之间、约20mM与约25mM之间的抗坏血酸钠)；和5mM与约150mM之间(例如，约10mM与约150mM之间、约20mM与约150mM之间、约30mM与约150mM之间、约40mM与约150mM之间、约50mM与约150mM之间、约60mM与约140mM之间、约70mM与约130mM之间、约80mM与约120mM之间、约90mM与约110mM之间、约95mM与约105mM之间、约30mM与约70mM之间、约35mM与约65mM之间、约40mM与约60mM之间、约45mM与约55mM之间、约20mM与约50mM之间、约25mM与约45mM之间、约30mM与约40mM之间、约30mM与约35mM之间、约5mM与约45mM之间、约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间、约20mM与约30mM之间或约20mM与约25mM之间)的组氨酸。
任何组合物的非限制性例子可以含有(i)约75mM与约125mM之间(例如，约80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的甘露糖醇(例如，在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(ii)约75mM与约125mM之间(例如，约80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)(例如，在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(iii)约75mM与约125mM之间(例如，约80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的抗坏血酸钠(例如，在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(iv)约75mM与约125mM之间(例如，约80mM与约120mM之间、约85mM与约115mM之间、约90mM与约110mM之间或约95mM与约105mM之间)的组氨酸(例如，在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(v)约30mM与约70mM之间(例如，约35mM与约65mM之间、约40mM与约60mM之间或约45mM与约55mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)和约30mM与约70mM之间(例如，约35mM与约65mM之间、约40mM与约60mM之间或约45mM与约55mM之间)的组氨酸(例如，在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(vi)约10mM与约50mM之间(例如，约15mM与约45mM之间、约20mM与约40mM之间、约25mM与约35mM之间或约30mM与约35mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)、约10mM与约50mM之间(例如，约15mM与约45mM之间、约20mM与约40mM之间、约25mM与约35mM之间或约30mM与约35mM之间)的组氨酸和约10mM与约50mM之间(例如，约15mM与约45mM之间、约20mM与约40mM之间、约25mM与约35mM之间或约30mM与约35mM之间)的抗坏血酸钠(例如，在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)；或(vii)约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间、约20mM与约30mM之间或约23mM与约27mM之间)的抗坏血酸钠、约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间、约20mM与约30mM之间或约23mM与约27mM之间)的甲硫氨酸(或者可替代地半胱氨酸或谷胱甘肽)、约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间、约20mM与约30mM之间或约23mM与约27mM之间)的甘露糖醇和约5mM与约45mM之间(例如，约10mM与约40mM之间、约15mM与约35mM之间、约20mM与约30mM之间或约23mM与约27mM之间)的组氨酸(例如，在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲液，诸如50mM磷酸钠，pH 6.0)。
足以减少本文提供的任何组合物的生物负载的γ-照射的非限制性剂量如下所述。足以减少本文提供的任何组合物的生物负载的γ-照射的其他剂量是业内已知的。例如，本文所述的任何组合物可以以任何剂量，以任何γ-照射速率和/或在用于执行本文所述的γ-照射的任何温度下(以任何组合)进行γ-照射。组合物的生物负载可以例如通过如下方法来测定：例如通过洗胃，超声处理，摇动，涡旋混合，冲洗，掺合或者擦拭从组合物中取出含有组合物中存在的一种或多种自复制生物污染物的样品，将样品中存在的一种或多种自复制生物污染物的水平定性或定量(例如，通过将样品置于允许生物污染物自复制的生长培养基中，例如，将样品铺板在皮氏培养皿(petri dish)上，或使样品运行通过膜)。
可以例如使用实施例中描述的方法测定足以改善层析树脂在用足以减少组合物的生物负载的剂量的γ-照射处理时结合能力的损失的至少一种醇、至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂的量。例如，可以将在一定量的至少一种醇存在下(并且任选地，另外在至少一种抗氧化剂和/或螯合剂存在下)用γ-照射处理的层析树脂的结合能力的降低水平与所述至少一种醇(并且任选地，至少一种抗氧化剂和/或螯合剂)不存在下用相同剂量的γ-照射处理的层析树脂的结合能力的降低水平进行比较，其中与在所述至少一种醇(并且任选地，至少一种抗氧化剂和/或螯合剂)不存在下经γ-照射的层析树脂相比，在所述至少一种醇存在下(并且任选地，另外在至少一种抗氧化剂和/或螯合剂存在下)经γ-照射的层析树脂结合能力的降低水平降低指示所述至少一种醇(和任选地抗氧化剂和/或螯合剂)的存在量足以改善层析树脂在用γ-照射处理时结合能力的损失。用于测定层析树脂的结合能力的示例性方法描述于实施例中。用于测定层析树脂的结合能力的方法的其他例子是业内已知的。
减少层析树脂生物负载的方法
本文提供了减少层析树脂的生物负载的方法。这些方法包括如下步骤：将包含含有(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的包含层析树脂和含至少一种醇的液体的任何示例性组合物)的容器暴露于足以减少所述容器和所述层析树脂的生物负载的剂量的γ-照射，其中至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后(或时)结合能力的损失。
还提供了减少层析树脂的生物负载的方法，所述方法包括将包含含有(i)层析树脂和(ii)含足以改善所述层析树脂在暴露于γ-照射之后/之时结合能力的损失的量的至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的包含层析树脂和含至少一种醇的液体的任何组合物)的容器，以约0.1kGy/小时至约6kGy/小时之间(例如，约0.1kGy/小时至约5.5kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约5.0kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约4.5kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约4.0kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约3.5kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约3.0kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约2.5kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约2.0kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约1.5kGy/小时之间、约0.1kGy/小时至约1.0kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约6kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约5.5kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约5.0kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约4.5kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约4.0kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约3.5kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约3.0kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约2.5kGy/小时之间、约0.5kGy/小时至约2.0kGy/小时之间)的速率，和/或在约4℃至约25℃之间(例如，约4℃至约20℃之间、约4℃至约15℃之间、约4℃至约10℃之间、约10℃至约25℃之间、约10℃至约20℃之间、约10℃至约15℃之间或约15℃至约25℃之间)的温度下，暴露于γ-照射剂量足以减少容器和层析树脂的生物负载的γ-照射。
任何这些方法的一些实施方案可以包括，在暴露步骤之前和/或之后，将容器或包含层析树脂和含至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的任何容器或包含层析树脂和含至少一种醇的液体的任何组合物)例如在约4℃至约40℃、约4℃至约35℃、约4℃至约30℃、约4℃至约28℃、约4℃至约26℃、约4℃至约24℃、约4℃至约22℃、约4℃至约20℃、约4℃至约18℃、约4℃至约16℃、约4℃至约14℃、约4℃至约12℃、约4℃至约10℃、约4℃至约8℃、约4℃至约6℃、约6℃至约40℃、约6℃至约35℃、约6℃至约30℃、约6℃至约28℃、约6℃至约26℃、约6℃至约24℃、约6℃至约22℃、约6℃至约20℃、约6℃至约18℃、约6℃至约16℃、约6℃至约14℃、约6℃至约12℃、约6℃至约10℃、约6℃至约8℃、约8℃至约40℃、约8℃至约35℃、约8℃至约30℃、约8℃至约28℃、约8℃至约26℃、约8℃至约24℃、约8℃至约22℃、约8℃至约20℃、约8℃至约18℃、约8℃至约16℃、约8℃至约14℃、约8℃至约12℃、约8℃至约10℃、约10℃至约40℃、约10℃至约35℃、约10℃至约30℃、约10℃至约28℃、约10℃至约26℃、约10℃至约24℃、约10℃至约22℃、约10℃至约20℃、约10℃至约18℃、约10℃至约16℃、约10℃至约14℃、约10℃至约12℃、约12℃至约40℃、约12℃至约35℃、约12℃至约30℃、约12℃至约28℃、约12℃至约26℃、约12℃至约24℃、约12℃至约22℃、约12℃至约20℃、约12℃至约18℃、约12℃至约16℃、约12℃至约14℃、约14℃至约40℃、约14℃至约35℃、约14℃至约30℃、约14℃至约28℃、约14℃至约26℃、约14℃至约24℃、约14℃至约22℃、约14℃至约20℃、约14℃至约18℃、约14℃至约16℃、约16℃至约40℃、约16℃至约35℃、约16℃至约30℃、约16℃至约28℃、约16℃至约26℃、约16℃至约24℃、约16℃至约22℃、约16℃至约20℃、约16℃至约18℃、约18℃至约40℃、约18℃至约35℃、约18℃至约30℃、约18℃至约28℃、约18℃至约26℃、约18℃至约24℃、约18℃至约22℃、约18℃至约20℃、约20℃至约40℃、约20℃至约35℃、约20℃至约30℃、约20℃至约28℃、约20℃至约26℃、约20℃至约24℃、约20℃至约22℃、约22℃至约40℃、约22℃至约35℃、约22℃至约30℃、约22℃至约28℃、约22℃至约26℃、约22℃至约24℃、约24℃至约40℃、约24℃至约35℃、约24℃至约30℃、约24℃至约28℃、约24℃至约26℃、约26℃至约40℃、约26℃至约35℃、约26℃至约30℃、约26℃至约28℃、约28℃至约40℃、约28℃至约35℃、约28℃至约30℃、约30℃至约40℃、约30℃至约35℃或约35℃至约40℃的温度下储存约1小时至约1年、约1小时至约11个月、约1小时至约10个月、约1小时至约9个月、约1小时至约8个月、约1小时至约7个月、约1小时至约6个月、约1小时至约5个月、约1小时至约4个月、约1小时至约3个月、约1小时至约2个月、约1小时至约1个月、约1小时至约2周、约1小时至约1周、约1小时至约5天、约1小时至约2天、约1小时至约1天、约1小时至约12小时、约1小时至约6小时、约6小时至约1年、约6小时至约11个月、约6小时至约10个月、约6小时至约9个月、约6小时至约8个月、约6小时至约7个月、约6小时至约6个月、约6小时至约5个月、约6小时至约4个月、约6小时至约3个月、约6小时至约2个月、约6小时至约1个月、约6小时至约2周、约6小时至约1周、约6小时至约5天、约6小时至约2天、约6小时至约1天、约6小时至约12小时、约12小时至约1年、约12小时至约11个月、约12小时至约10个月、约12小时至约9个月、约12小时至约8个月、约12小时至约7个月、约12小时至约6个月、约12小时至约5个月、约12小时至约4个月、约12小时至约3个月、约12小时至约2个月、约12小时至约1个月、约12小时至约2周、约12小时至约1周、约12小时至约5天、约12小时至约2天、约12小时至约1天、约1天至约1年、约1天至约11个月、约1天至约10个月、约1天至约9个月、约1天至约8个月、约1天至约7个月、约1天至约6个月、约1天至约5个月、约1天至约4个月、约1天至约3个月、约1天至约2个月、约1天至约1个月、约1天至约2周、约1天至约1周、约1天至约5天、约1天至约2天、约2天至约1年、约2天至约11个月、约2天至约10个月、约2天至约9个月、约2天至约8个月、约2天至约7个月、约2天至约6个月、约2天至约5个月、约2天至约4个月、约2天至约3个月、约2天至约2个月、约2天至约1个月、约2天至约2周、约2天至约1周、约2天至约5天、约5天至约1年、约5天至约11个月、约5天至约10个月、约5天至约9个月、约5天至约8个月、约5天至约7个月、约5天至约6个月、约5天至约5个月、约5天至约4个月、约5天至约3个月、约5天至约2个月、约5天至约1个月、约5天至约2周、约5天至约1周、约1周至约1年、约1周至约11个月、约1周至约10个月、约1周至约9个月、约1周至约8个月、约1周至约7个月、约1周至约6个月、约1周至约5个月、约1周至约4个月、约1周至约3个月、约1周至约2个月、约1周至约1个月、约1周至约2周、约2周至约1年、约2周至约11个月、约2周至约10个月、约2周至约9个月、约2周至约8个月、约2周至约7个月、约2周至约6个月、约2周至约5个月、约2周至约4个月、约2周至约3个月、约2周至约2个月、约2周至约1个月、约1个月至约1年、约1个月至约11个月、约1个月至约10个月、约1个月至约9个月、约1个月至约8个月、约1个月至约7个月、约1个月至约6个月、约1个月至约5个月、约1个月至约4个月、约1个月至约3个月、约1个月至约2个月、约2个月至约1年、约2个月至约11个月、约2个月至约10个月、约2个月至约9个月、约2个月至约8个月、约2个月至约7个月、约2个月至约6个月、约2个月至约5个月、约2个月至约4个月、约2个月至约3个月、约3个月至约1年、约3个月至约11个月、约3个月至约10个月、约3个月至约9个月、约3个月至约8个月、约3个月至约7个月、约3个月至约6个月、约3个月至约5个月、约3个月至约4个月、约4个月至约1年、约4个月至约11个月、约4个月至约10个月、约4个月至约9个月、约4个月至约8个月、约4个月至约7个月、约4个月至约6个月、约4个月至约5个月、约5个月至约1年、约5个月至约11个月、约5个月至约10个月、约5个月至约9个月、约5个月至约8个月、约5个月至约7个月、约5个月至约6个月、约6个月至约1年、约6个月至约11个月、约6个月至约10个月、约6个月至约9个月、约6个月至约8个月、约6个月至约7个月、约7个月至约1年、约7个月至约11个月、约7个月至约10个月、约7个月至约9个月、约7个月至约8个月、约8个月至约1年、约8个月至约11个月、约8个月至约10个月、约8个月至约9个月、约9个月至约1年、约9个月至约11个月、约9个月至约10个月、约10个月至约1年、约10个月至约11个月或约11个月至约1年的时间段。
在本段描述的方法中，通过这些方法生产的经γ-照射的层析树脂的结合能力水平大于以大于6.1kGy/小时的速率中的一个或两个和/或在大于25℃的温度下进行γ-照射的层析树脂的结合能力水平。
可以使用业内已知的方法将层析树脂暴露于γ-照射。例如，可以使用同位素诸如钴-60或铯-137作为γ射线的来源。可以在约-25℃与约0℃之间(包括端点)或约0℃与约25℃之间(包括端点)的温度下使层析树脂暴露于γ-照射。可以使层析树脂暴露于以下剂量的γ-照射：约0.1kGy至约100kGy之间、约1kGy至约100kGy之间、约1kGy至约90kGy之间、约1kGy至约80kGy之间、约1kGy至约70kGy之间、约1kGy至约65kGy之间、约5kGy至约65kGy之间、约10kGy至约60kGy之间、约10kGy至约55kGy之间、约10kGy至约50kGy之间、约10kGy至约45kGy之间、约10kGy至约40kGy之间、约10kGy至约35kGy之间、约10kGy至约30kGy之间、约15kGy至约50kGy之间、约15kGy至约45kGy之间、约15kGy至约40kGy之间、约15kGy至约35kGy之间、约20kGy至约30kGy之间或约23kGy至约27kGy之间。可以使层析树脂暴露于足以使层析树脂的灭菌保证水平为以下的剂量的γ-照射：约或小于1x 10-6、约或小于1x 10-7、约或小于10x 10-8、约或小于1x 10-11或约或小于1x 10-12或约1x 10-6与约1x 10-12之间、约1x10-6与约1x 10-11之间、约1x10-6与约1x 10-10之间、约1x 10-6与约1x 10-9之间、约1x 10-6与约1x 10-8之间、1x 10-6与约1x 10-7之间、约1x 10-7与约1x 10-12之间、约1x 10-7与约1x 10-11之间、约1x 10-7与约1x 10-10之间、约1x 10-7与约1x 10-9之间、约1x 10-7与约1x 10-8之间、约1x 10-8与约1x 10-12之间、约1x 10-8与约1x 10-11之间、约1x 10-8与约1x 10-10之间或约1x 10-8与约1x 10-9之间。
可以使用业内已知的方法测定足以减少层析树脂的生物负载的γ-照射的剂量。例如，可以将用一定剂量的γ-照射处理的层析树脂的生物负载水平与未处理(例如，对照，非γ-照射)层析树脂的生物负载水平进行比较，并且与未处理的层析树脂相比，经γ-照射的层析树脂中的生物负载水平降低指示所述剂量的γ-照射足以减少层析树脂的生物负载。本文描述了用于测定组合物(例如，层析树脂)中生物负载水平的示例性方法。用于测定组合物(例如层析树脂)中生物负载水平的其他方法是业内已知的。
这些方法中的任一种中的层析树脂可以是阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、尺寸排阻层析树脂、疏水相互作用层析树脂或亲和层析树脂，或其任何组合。亲和层析树脂的非限制性例子可以包含蛋白质或肽配位体(例如，约5个氨基酸与约100个氨基酸之间、约5个氨基酸与约90个氨基酸之间、约5个氨基酸与约80个氨基酸之间、约5个氨基酸与约70个氨基酸之间、约5个氨基酸与约60个氨基酸之间、约5个氨基酸与约50个氨基酸之间、约5个氨基酸与约40个氨基酸之间、约5个氨基酸与约30个氨基酸之间、约5个氨基酸与约25个氨基酸之间或约5个氨基酸与约20个氨基酸之间)、酶的小分子底物或辅因子、适体、抑制剂(例如竞争性蛋白质抑制剂)或金属。在一些实施方案中，亲和层析树脂包含蛋白质配位体(例如，蛋白A)。亲和层析树脂的其他例子包含辅因子配位体、底物配位体、金属配位体、产物配位体或适体配位体。在一些例子中，层析树脂是双模态层析树脂(例如，阴离子交换层析树脂和疏水相互作用层析树脂)。层析树脂可以是阴离子交换层析树脂(例如，包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。
包含层析树脂的容器可以是塑料容器(例如，圆柱形管、密封或夹合式盒或密封袋)。在这些方法中使用的容器的非限制性例子包括储存器皿或层析柱。例如，包含(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的任何示例性组合物)可以存在于密封容器中(例如，密封容器中的浆液或密封容器(例如，层析柱)中的填充层析树脂)。用于本文所述方法的容器可以是一次性层析柱。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的容器是布置于泡罩包装中的一次性层析柱。容器(例如，储存器皿或层析柱)的内部总体积可以为约1mL至约1L之间(例如，约1mL与约900mL之间、约1mL与约800mL之间、约1mL与约700mL之间、约1mL与约600mL之间、约1mL与约500mL之间、约1mL与约450mL之间、约1mL与约400mL之间、约1mL与约350mL之间、约1mL与约300mL之间、约1mL与约250mL之间、约1mL与约200mL之间、约1mL与约150mL之间、约1mL与约100mL之间、约1mL与约75mL之间、约1mL与约50mL之间、约1mL与约40mL之间、约1mL与约30mL之间或约1mL与约20mL之间)。
容器中包含的含有(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的任何示例性组合物)可以以润湿或潮湿的固体混合物形式存在。例如，容器可以包含沉降的层析树脂在液体中的浆液。在一些实施方案中，容器可以包含填充层析树脂。例如，包含含有(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的任何组合物)的容器是填充层析柱(例如，其中树脂被填充在含至少一种醇的液体中)。一些实施方案包括，在暴露之前，将包含(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的任何组合物)布置于容器中。
本文所述的醇、抗氧化剂和/或螯合剂中的任一者可以使用本文所述的示例性浓度的任何组合以任何组合形式使用。例如，液体可以包含至少一种选自以下的醇：苯甲醇、环己醇、异丁醇、2-甲基-2-丁醇、甲醇、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、丁-1-醇、戊-1-醇、十六烷-1-醇、2-苯基乙醇、仲苯基乙醇、3-苯基-1-丙醇、1-苯基-1-丙醇、2-苯基-1-丙醇、2-苯基-2-丙醇、1-苯基-2-丁醇、2-苯基-1-丁醇、3-苯基-1-丁醇、4-苯基-2-丁醇、dl-1-苯基-2-戊醇、5-苯基-1-戊醇和4-苯基-1-丁醇。在一些例子中，液体还可以包含至少一种抗氧化剂(例如，至少一种选自以下的抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑激素、西红柿红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、酚丙酸、利多卡因、柚皮素、富勒烯、葡萄糖、甘露糖醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基呱啶-1-氧基和二甲基甲氧基色原烷醇)和/或至少一种螯合剂(例如，至少一种选自EDTA、DMPS、DMSA、金属硫蛋白和去铁胺的螯合剂)。
本文描述了用于确定/鉴别足以改善层析树脂在用足以减少组合物的生物负载的剂量的γ-照射处理时结合能力的损失的至少一种醇、至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂的一种或多种量的方法。用于确定/鉴别足以改善层析树脂在用足以减少组合物的生物负载的剂量的γ-照射处理时结合能力的损失的至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的一种或多种量的其他方法是业内已知的。
本文还提供了通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的层析树脂(例如，在储存容器，例如密封的储存容器中提供的生物负载减少的层析树脂)。使用本文所述的任何方法产生的生物负载减少的层析树脂的灭菌保证水平可以是约或小于1x 10-6、约或小于1x 10-7、约或小于10x 10-8、约或小于1x 10-11或约或小于1x 10-12或约1x 10-6与约1x 10-12之间、约1x 10-6与约1x 10-11之间、约1x 10-6与约1x 10-10之间、约1x 10-6与约1x 10-9之间、约1x10-6与约1x 10-8之间、1x 10-6与约1x 10-7之间、约1x 10-7与约1x 10-12之间、约1x 10-7与约1x 10-11之间、约1x 10-7与约1x 10-10之间、约1x 10-7与约1x10-9之间、约1x 10-7与约1x10-8之间、约1x 10-8与约1x 10-12之间、约1x 10-8与约1x 10-11之间、约1x 10-8与约1x 10-10之间或约1x 10-8与约1x 10-9之间。当使用相同蛋白质测试通过本文所述方法生产的层析树脂和对照未处理层析树脂两者的结合能力时，通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的层析树脂的结合能力可以是未经处理以减少生物负载(例如，未进行γ-照射)的相同层析树脂的结合能力的至少74％(例如，至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)，或约74％与95％之间、约74％与约95％之间、约76％与约95％之间、至少约78％与约95％之间、约80％与约95％或约74％与约90％之间、约76％与约90％之间、约78％与约90％之间或约80％与约90％之间。
制备生物负载减少的填充层析柱的方法
本文还提供了制备生物负载减少的填充层析柱的方法，所述方法包括提供通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的层析树脂，以及在无菌或生物负载减少的环境中将层析树脂填充到生物负载减少的柱中。在一些实施方案中，可以通过以下方法生产生物负载减少的填充层析柱：将包含填充层析树脂和含至少一种醇的液体(例如，本文所述的任何示例性液体，例如，所述液体任选地还包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂)的柱暴露于足以减少柱和填充层析树脂的生物负载的剂量的γ-照射，其中至少一种醇的存在量足以改善填充层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
还提供了通过本文所述的方法生产的一个或多个生物负载减少的填充层析柱。通过本文所述方法生产的一个或多个生物负载减少的填充层析柱中的任一个的灭菌保证水平可以是约或小于1x 10-6、约或小于1x 10-7、约或小于10x 10-8、约或小于1x 10-11或约或小于1x 10-12或约1x 10-6与约1x 10-12之间、约1x 10-6与约1x 10-11之间、约1x 10-6与约1x10-10之间、约1x 10-6与约1x 10-9之间、约1x 10-6与约1x 10-8之间、1x 10-6与约1x 10-7之间、约1x 10-7与约1x 10-12之间、约1x 10-7与约1x 10-11之间、约1x 10-7与约1x 10-10之间、约1x 10-7与约1x 10-9之间、约1x 10-7与约1x 10-8之间、约1x 10-8与约1x 10-12之间、约1x10-8与约1x 10-11之间、约1x 10-8与约1x 10-10之间或约1x 10-8与约1x 10-9之间。通过本文所述方法生产的一个或多个生物负载减少的填充层析柱可以含有至少一种选自以下的层析树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂(例如，本文所述或业内已知的任何亲和层析树脂)、亲水性相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。例如，本文所述的任何生物负载减少的填充层析柱可以包含含有蛋白质配位体(例如蛋白A)的亲和层析树脂。本文所述的生物负载减少的填充层析柱可以包含阴离子交换层析树脂(例如，包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。
执行生物负载减少的层析的方法
本文所述的方法包括使用本文提供的生物负载减少的填充层析柱，并且本文所述的方法包括使用一个或两个MCCS，所述MCCS包括至少一个本文提供的生物负载减少的填充层析柱。经γ-照射的层析树脂可以是本文所述的任何类型的树脂(或本领域已知的任何类型的层析树脂)。
可以使用本文描述的任何方法制备生物负载减少的填充层析柱。例如，可以通过如下方法生产生物负载减少的填充层析柱：用包含一种或多种层析树脂和含至少一种醇的液体的组合物(例如，本文所述的任何此类组合物)填充层析柱，并且使填充柱暴露于γ-照射(例如，使用本文所述的任何暴露和条件)。在其他例子中，可以通过如下方法来生产生物负载减少的填充层析柱：将包含层析树脂和含至少一种醇的液体(例如，本文所述的任何示例性液体，例如任选地还包含至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂)的容器暴露于一定剂量的γ-照射，并且用得到的生物负载减少的层析树脂填充层析柱，得到生物负载减少的层析树脂。在此类方法中，层析树脂(在暴露于γ-照射期间存在于容器中)可以以浆液形式存在于容器中，并且在生物负载减少的橱中填充层析柱。在其他方法中，可以在容器中将与至少含醇的液体(例如，本文所述的任何液体，例如，所述液体任选地还包含至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂)一起存在于容器中的层析树脂以润湿或潮湿的固体混合物形式暴露于γ-照射，可以使用生物负载减少的缓冲液制备所得的生物负载减少的层析树脂的浆液(例如，在生物负载减少的橱中制备)，并且在生物负载减少的橱中使用得到的浆液填充层析柱。在这些例子中的一些中，可以在填充之前处理层析柱以减少生物负载(例如，高压处理、γ-照射或暴露于环氧乙烷)。
用于本文所述的任何方法的生物负载减少的填充层析柱的灭菌保证水平(SAL)可以是约1x 10-3与约1x 10-12之间、约1x 10-4与约1x 10-12之间、1x 10-5与约1x 10-11之间、约1x 10-5与约1x 10-10之间、约1x 10-5与约1x 10-9之间、约1x 10-6与约1x 10-9之间或约1x10-6与约1x 10-8之间(包括端点)。
生物负载减少的缓冲液
可以使用一种或多种生物负载减少的缓冲液执行本文所述的方法和过程。如业内可以理解的，生物负载减少的缓冲液可以是层析循环中使用的任何类型的缓冲液(例如，在层析循环中的任何步骤中或在本文所述的任何单元操作中使用的缓冲液)。用于减少缓冲液的生物负载的示例性方法包括过滤(0.2μm孔径过滤)、高压处理和γ-照射。用于减少缓冲液的生物负载的其他方法是业内已知的。生物负载减少的缓冲液的灭菌保证水平可以是约1x10-3与约1x 10-12之间、约1x 10-4与约1x 10-12之间、1x 10-5与约1x 10-11之间、约1x10-5与约1x 10-10之间、约1x 10-5与约1x 10-9之间、约1x 10-6与约1x 10-9之间或约1x 10-6与约1x 10-8之间(包括端点)。
重组治疗性蛋白
如本文所述的重组蛋白可以是重组治疗性蛋白。可以通过本文提供的方法生产的重组治疗性蛋白的非限制性例子包括免疫球蛋白(包括轻链和重链免疫球蛋白、抗体或抗体片段(例如，本文所述的任何抗体片段))、酶(例如，半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶)、
或
)、蛋白质(例如，人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)或干扰素α或β)或免疫原性或抗原性蛋白或蛋白质片段(例如，用于疫苗的蛋白质)。重组治疗性蛋白可以是包括至少一种多功能重组蛋白支架的工程化抗原结合多肽，所述多肽(参见，例如，Gebauer等人,Current Opin.Chem.Biol.13:245-255,2009；和美国专利申请公布号2012/0164066(通过引用以其整体并入本文中)中所述的重组抗原结合蛋白)。作为抗体的重组治疗性蛋白的非限制性例子包括：帕尼单抗(panitumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿克托单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、阿拉赛珠单抗(alacizumab)、阿拉赛珠单抗(alacizumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛妥昔单抗(amatuximab)、安那莫单抗(anatumomab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿替努单抗(atinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、巴西利单抗(basilizimab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比西单抗(biciromab)、康纳单抗(canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、登苏单抗(densumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)和曲妥珠单抗(trastuzumab)。可通过本文所述方法生产的重组治疗性抗体的其他例子是业内已知的。可以通过本发明方法生产/纯化的重组治疗性蛋白的其他非限制性例子包括：阿糖苷酶α、拉罗尼酶、阿巴西普、加硫酶、促黄体素α、抗血友病因子、半乳糖苷酶β(agalsidase beta)、干扰素β-1a、达贝泊汀α(darbepoetinalfa)、替奈普酶、依那西普(etanercept)、凝血因子IX、促卵泡激素、干扰素β-1a、伊米苷酶、阿法链道酶(dornase alfa)、阿法依泊汀(epoetin alfa)和阿替普酶。
可以通过从细胞(例如，哺乳动物细胞)去除或以其他方式物理分离液体培养基，从液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)回收分泌的可溶性重组治疗性蛋白。用于从细胞(例如，哺乳动物细胞)去除液体培养基的多种不同方法是本领域已知的，包括例如离心、过滤、移液和/或抽吸。然后可以使用多种生物化学技术从液体培养基回收分泌的重组治疗性蛋白并进一步纯化，所述技术包括各种类型的层析(例如，亲和层析、分子筛层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或疏水相互作用层析或其任何组合)和/或过滤(例如，分子量截留过滤)。
层析循环
如业内所熟知的，层析循环中的步骤可以根据层析树脂、用于执行循环中每个步骤的缓冲液和靶重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的生物物理特征而不同。例如，亲和层析柱可以包括以下步骤：用包含靶重组蛋白的流体装载亲和层析柱，洗涤柱以去除不需要的生物物质(例如，污染性蛋白和/或小分子)，洗脱与柱结合的靶重组蛋白，并使柱再平衡。使用阳离子和/或阴离子交换层析柱进行的层析循环，其中靶重组蛋白在装载步骤中与层析树脂结合，可以包括如下步骤：用包含靶蛋白的流体装载柱，洗涤柱以去除不需要的生物物质，洗脱与柱结合的靶重组蛋白，并使柱再平衡。在其他例子中，使用阳离子和/或阴离子交换层析柱进行的层析循环，其中不需要的生物物质在装载步骤期间与层析树脂结合，而靶重组蛋白不结合，可以包括如下步骤：用包含靶蛋白的流体装载柱，在流过物中收集靶重组蛋白，并使柱再平衡。如业内所熟知的，层析循环中的任何单个步骤都可以包括单一缓冲液或多种缓冲液(例如，两种或更多种缓冲液)，并且层析循环中的任何单个步骤中的一个或多个可以包括缓冲液梯度。单个层析循环的各种熟知方面的任何组合可以以任何组合形式用于这些方法中，例如，一种或多种不同层析树脂、一种或多种流速、一种或多种缓冲液、柱的一种或多种空隙体积、柱的一种或多种床体积、每个步骤中使用的缓冲液的一种或多种体积、包含靶蛋白的流体的一种或多种体积以及每个步骤中使用的一种或多种缓冲液的数量和类型。
执行生物负载减少的柱层析的方法
本文提供了执行生物负载减少的层析的方法。这些方法包括提供使用本文所述的任何方法生产的生物负载减少的填充层析柱，以及使用生物负载减少的填充层析柱执行柱层析。生物负载减少的填充层析柱可以以任何组合形式包含本文所述的任何层析树脂中的至少一种。例如，存在于生物负载减少的填充层析柱中的层析树脂可以是包含蛋白质配位体(例如蛋白A)的亲和树脂，或者可以包括阴离子交换层析树脂。生物负载减少的填充层析柱可以具有本文所述的任何示例性内部体积。生物负载减少的填充层析柱可以具有本文所述或业内已知的任何形状(例如，圆柱形、近圆柱形或椭圆形)。可以使用这些方法中执行的柱层析纯化或分离重组蛋白(例如，本文所述或业内已知的任何重组治疗性蛋白)。在一些例子中，生物负载减少的填充层析柱是多柱层析系统(MCCS)的一部分，例如，可以是周期性逆流层析系统(PCCS)的一部分。
所执行的柱层析可以包括本文所述或业内已知的至少一个层析循环。例如，至少一个层析循环可以包括以下步骤：通过将层析树脂暴露于含重组蛋白的液体来捕获重组蛋白；通过将层析树脂暴露于洗涤缓冲液来洗涤层析树脂，通过将层析树脂暴露于洗脱缓冲液来洗脱重组蛋白；和通过将层析树脂暴露于再生缓冲液来使层析树脂再生。在一些例子中，含重组蛋白的液体是液体培养基(例如，从灌注或分批培养收集的液体培养基)或稀释的液体培养基(例如，用缓冲液稀释的培养基)。
可以使用封闭且整合的系统(例如，本文所述或业内已知的任何示例性封闭和整合系统)执行柱层析。例如，可以使用封闭且整合的系统执行柱层析，其中缓冲液是生物负载减少的缓冲液。如业内熟知的，可以使用各种不同的方法(例如，通过过滤，通过高压处理或热处理制备)来产生生物负载减少的缓冲液。
柱层析可以包括两个或更多个(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、45个或更多个、50个或更多个、55个或更多个、60个或更多个、65个或更多个、70个或更多个、75个或更多个、80个或更多个、85个或更多个、90个或更多个、95个或更多个或100个或更多个)层析循环。在一些例子中，在至少3天(例如，至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天、至少80天、至少85天、至少90天、至少95天或至少100天)的时间段内连续执行柱层析。
在一些实施方案中，与未用γ-照射处理的相同树脂相比(当使用相同蛋白质测试两种树脂的结合能力时)，生物负载减少的填充层析柱中的层析树脂的结合能力百分比为约75％至约100％之间(例如，约76％与约98％之间、约76％与约96％之间、约76％与约94％之间、约76％与约92％之间、约76％与约90％之间、约78％与约100％之间、约78％与约98％之间、约78％与约96％之间、约78％与约94％之间、约78％与约92％之间、约78％与约90％之间、约80％与约100％之间、约80％与约98％之间、约80％与约96％之间、约80％与约94％之间、约80％与约92％之间、约80％与约90％之间、约82％与约100％之间、约82％与约98％之间、约82％与约96％之间、约82％与约94％之间、约82％与约92％之间、约82％与约90％之间、约84％与约100％之间、约84％与约98％之间、约84％与约96％之间、约84％与约94％之间、约84％与约92％之间、约84％与约90％之间、约86％与约100％之间、约86％与约98％之间、约86％与约96％之间、约86％与约94％之间、约86％与约92％之间、约88％与约100％之间、约88％与约98％之间、约88％与约96％之间、约88％与约94％之间、约90％与约100％之间、约90％与约98％之间、约90％与约96％之间、约92％与约100％之间或约92％与约98％之间)(例如，在暴露于γ-照射之后立即评估)。
用于制造重组蛋白的整合、封闭或基本上闭合且连续的方法
本文提供了用于制造纯化的重组蛋白(例如重组治疗性蛋白)的整合、封闭或基本上封闭且连续的方法。这些方法包括提供基本上不含细胞的包含重组蛋白(例如重组治疗性蛋白)的液体培养基。
一些方法包括将液体培养基连续馈送到多柱层析系统(MCCS)中，所述系统包括至少一个本文提供的生物负载减少的填充层析柱，其中这些方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从液体培养基连续运行至来自MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物)。
一些方法包括将液体培养基连续馈送到第一MCCS(MCCS1)中，使用MCCS1捕获来自液体培养基中的重组蛋白，从MCCS1产生包含重组蛋白的洗脱物并将洗脱物连续馈送到第二MCCS(MCCS2)中，并且将来自洗脱物的重组蛋白连续馈送到MCCS2中，并且随后洗脱重组蛋白，从而产生纯化的重组蛋白，其中MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱是本文提供的生物负载减少的填充层析柱，所述方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从液体培养基连续运行至纯化的重组蛋白。
在一些例子中，MCCS、MCCS1和/或MCCS2中使用的每个层析柱是本文提供的生物负载减少的填充层析柱。一些实施方案还包括将纯化的重组蛋白配制成医药组合物的步骤。
本文所述的方法从包含重组蛋白的液体培养基提供连续且时间有效的纯化重组蛋白的产生。例如，分别地将包含治疗性蛋白的液体培养基馈送到MCCS或MCCS1中与从MCCS或MCCS2洗脱重组蛋白之间经过的时间可以是例如约4小时与约48小时之间(包括端点)，例如约4小时与约40小时之间、约4小时与约35小时之间、约4小时与约30小时之间、约4小时与约28小时之间、约4小时与约26小时之间、约4小时与约24小时之间、约4小时与约22小时之间、约4小时与约20小时之间、约4小时与约18小时之间、约4小时与约16小时之间、约4小时与约14小时之间、约4小时与约12小时之间、约6小时与约12小时之间、约8小时与约12小时之间、约6小时与约20小时之间、约6小时与约18小时之间、约6小时与约14小时之间、约8小时与约16小时之间、约8小时与约14小时之间、约8小时与约12小时之间、约10小时与20小时之间、约10小时与18小时之间、约10小时与16小时之间、约10小时与14小时之间、约12小时与约14小时之间、约10小时与约40小时之间、约10小时与约35小时之间、约10小时与约30小时之间、约10小时与约25小时之间、约15小时与约40小时之间、约15小时与约35小时之间、约15小时与约30小时之间、约20小时与约40小时之间、约20小时与约35小时之间或约20小时与约30小时之间(包括端点)。在其他例子中，分别地将包含重组蛋白的液体培养基馈送到MCCS或MCCS1中与从MCCS或MCCS2洗脱重组蛋白之间经过的时间是例如大于约4小时与少于约40小时之间(包括端点)，例如大于约4小时与少于约39小时之间、约38小时、约37小时、约36小时、约35小时、约34小时、约33小时、约32小时、约31小时、约30小时、约29小时、约28小时、约27小时、约26小时、约25小时、约24小时、约23小时、约22小时、约21小时、约20小时、约19小时、约18小时、约17小时、约16小时、约15小时、约14小时、约13小时、约12小时、约11小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时或约4.5小时(包括端点)。
可以用于这些方法(MCCS、MCCS1和/或MCCS2)的任一种中的MCCS的非限制性方面描述于美国临时专利申请序列号61/775,060和61/856,390(各自通过引用并入本文中)中。
一些示例性方法不利用保持步骤(例如，在整个方法中不使用储器(例如，断流罐))。其他方法可以在整个方法中使用最多1、2、3、4或5个储器(例如，断流罐)。本文所述的任何方法可以在整个方法中利用最多1、2、3、4或5个储器(例如，一个或多个断流罐)，其中每个断流罐仅保持重组蛋白总共例如约5分钟与少于约6小时之间(包括端点)，例如约5分钟与约5小时之间、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时或约30分钟(包括端点)的时间段。
一些方法利用一个、两个、三个、四个、五个或六个储器(例如，一个或多个断流罐)，并且容量可以是例如1mL与约300mL之间(包括端点)，例如1mL与约280mL之间、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(包括端点)。(在本文所述的任何方法中)用于在将流体馈送到MCCS或MCCS1之前进行保持的任何一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)的容量可以是例如1mL与MCCS或MCCS1中第一柱装载量的约100％之间(包括端点)，例如1mL与约90％之间、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(包括端点)。一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)可以用于在来自MCCS1的洗脱物进入MCCS2之前保持所述洗脱物，并且容量可以是例如1mL与MCCS2中第一柱装载量的约100％之间(包括端点)，例如1mL与约90％之间、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(包括端点)。
下文详细描述了这些方法的各种其他方面，这些方面可以以任何组合形式用于(但不限于)本文提供的方法中。下文描述了所提供方法的示例性方面；然而，业内本领域技术人员将理解，可以在本文所述的方法中加入其他步骤，并且可以使用其他材料来进行本文所述方法的任何步骤。
液体培养基
基本上不含细胞的包含重组蛋白(例如重组治疗性蛋白)的液体培养基可以源自任何来源。例如，可以从重组细胞培养物(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞培养物)获得液体培养基。可以从补料分批细胞(例如，哺乳动物细胞)培养物(例如，包含分泌重组蛋白的哺乳动物细胞的培养物的补料分批生物反应器)或灌注细胞(例如哺乳动物细胞)培养物(例如，包含分泌重组蛋白的哺乳动物细胞的培养物的灌注生物反应器)获得液体培养基。液体培养基也可以是来自分泌重组蛋白的细菌或酵母细胞的培养物的澄清液体培养基。
可以将从重组细胞培养物获得的液体培养基过滤或使其澄清，以获得基本上不含细胞和/或病毒的液体培养基。用于过滤液体培养基或使其澄清以去除细胞的方法是业内已知的(例如，0.2-μm过滤和使用交替切向流(ATFTM)系统过滤)。还可以通过如下方法来从液体培养基去除重组细胞：使用离心并且取出作为基本上不含细胞的液体培养基的上清液，或者使细胞沉降到包含液体培养基的容器(例如，生物反应器)的重力底部，并且取出远离沉降的重组细胞的液体培养基(基本上不含细胞的液体培养基)。
可以从产生本文所述或业内已知的任何重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的重组细胞(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞)的培养物获得液体培养基。本文所述的任何方法的一些例子还可以包括培养产生重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的重组细胞(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞)的步骤。
液体培养基可以是本文所述或业内已知的任何类型的液体培养基。例如，液体培养基可以选自：无动物源性组分的液体培养基、无血清液体培养基、含血清的液体培养基、化学成分确定的液体培养基和不含蛋白质的液体培养基。在本文所述的任何方法中，可以将从培养物获得的液体培养基在馈送到MCCS或MCCS1中之前通过添加第二流体(例如，缓冲液)进行稀释。
在将基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基馈送到MCCS或MCCS1中之前，可以储存所述液体培养基(例如在低于约15℃(例如，低于约10℃、低于约4℃、低于约0℃、低于约-20℃、低于约-50℃、低于约-70℃或低于约-80℃)的温度下至少1天(例如，至少约2天、至少约5天、至少约10天、至少约15天、至少约20天或至少约30天))。可替代地，在一些例子中，将液体培养基直接从生物反应器馈送到MCCS或MCCS1中(例如，在过滤或澄清步骤之后直接从生物反应器馈送到MCCS或MCCS1中)。
多柱层析系统
本文所述的方法包括使用MCCS或两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)多柱层析系统(MCCS)(例如，MCCS1和MCCS2)。MCCS可以包括两个或更多个层析柱，两个或更多个层析膜，或者至少一个层析柱与至少一个层析膜的组合。在非限制性例子中，MCCS(例如，本文任何方法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)可以包括四个层析柱、三个层析柱和一个层析膜、三个层析柱、两个层析柱、两个层析膜以及两个层析柱和一个层析膜。可以设想将层析柱和/或层析膜的组合的其他例子用于(但不限于)业内本领域技术人员所述的MCCS(例如，本文所述的任何方法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)。存在于MCCS中的单个层析柱和/或层析膜可以是相同的(例如，具有相同的形状、体积、树脂、捕获机制和单元操作)，或者可以是不同的(例如，具有不同形状、体积、树脂、捕获机制和/或单元操作中的一个或多个)。存在于MCCS(例如，本文所述的任何方法中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个单个层析柱和/或层析膜可以执行相同的单元操作(例如，捕获、纯化或精制的单元操作)或不同的单元操作(例如，选自例如捕获、纯化、精制、灭活病毒、调节含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH以及过滤的不同单元操作)。例如，在本文所述方法的例子中，MCCS或MCCS1中至少一个层析柱和/或层析膜执行捕获重组蛋白的单元操作。
可以存在于MCCS中(例如，存在于MCCS、MCCS1和/或MCCS2中)的一个或多个层析柱的树脂体积可以是例如约1mL与约2mL之间、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL、约25mL、约30mL、约35mL、约40mL、约45mL、约50mL、约55mL、约60mL、约65mL、约70mL、约75mL、约80mL、约85mL、约90mL、约95mL或约100mL(包括端点)。可以存在于MCCS中(例如，存在于MCCS、MCCS1和/或MCCS2中)的一个或多个层析柱的树脂体积可以是约2mL至约100mL之间、约2mL与约90mL之间、约2mL与约80mL之间、约2mL与约70mL之间、约2mL与约60mL之间、约2mL与约50mL之间、约5mL与约50mL之间、约2mL与约45mL之间、约5mL与约45mL之间、约2mL与约40mL之间、约5mL与约40mL之间、约2mL与约35mL之间、约5mL与约35mL之间、约2mL与约30mL之间、约5mL与约30mL之间、约2mL与约25mL之间、约5mL与约25mL之间、约15mL与约60mL之间、约10mL与约60mL之间、约10mL与约50mL之间和约15mL与约50mL之间。在本文所述的任何方法中使用的MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱可以具有基本上相同的树脂体积或可以具有不同的树脂体积。用于MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱的流速可以是例如约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟与约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约25.0mL/分钟之间或约1.0mL/分钟与约15.0mL/分钟之间)。
MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱可以具有基本上相同的形状或可以具有基本上不同的形状。例如，MCCS中(例如，在MCCS、MCCS1和/或MCCS2中)的一个或多个层析柱可以具有基本上圆柱形状或可以具有基本上相同的椭圆柱形状。
可以存在于MCCS中(例如，存在于MCCS、MCCS1和/或MCCS2中)的一个或多个层析膜的床体积可以是例如约1mL至约500mL之间(例如，约1mL至约475mL之间、约1mL至约450mL之间、约1mL至约425mL之间、约1mL至约400mL之间、约1mL至约375mL之间、约1mL至约350mL之间、约1mL至约325mL之间、约1mL至约300mL之间、约1mL至约275mL之间、约1mL至约250mL之间、约1mL至约225mL之间、约1mL至约200mL之间、约1mL至约175mL之间、约1mL至约150mL之间、约1mL至约125mL之间、约1mL至约100mL之间、约2mL至约100mL之间、约5mL至约100mL之间、约1mL至约80mL之间、约2mL至约80mL之间、约5mL至约80mL之间、约1mL至约60mL之间、约2mL至约60mL之间、约5mL至约60mL之间、约1mL至约40mL之间、约2mL至约40mL之间、约5mL至约40mL之间、约1mL至约30mL之间、约2mL至约30mL之间、约5mL至约30mL之间、约1mL与约25mL之间、约2mL与约25mL之间、约1mL与约20mL之间、约2mL与约20mL之间、约1mL与约15mL之间、约2mL与约15mL之间、约1mL与约10mL之间或约2mL与约10mL之间)。
在本文所述的任何方法中使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2期间，可以采用一个或多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个)不同类型的生物负载减少的缓冲液。如业内所已知，在本文所述的方法中用于MCCS、MCCS1和/或MCCS2的一种或多种类型的生物负载减少的缓冲液将取决于MCCS、MCCS1和/或MCCS2的层析柱和/或层析膜中存在的树脂、重组蛋白的生物物理特性，以及由MCCS、MCCS1和/或MCCS2的一个或多个特定层析柱和/或层析膜执行的单元操作(例如，本文所述的任何示例性单元操作)。在本文所述的任何方法中使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2期间，所采用的缓冲液的体积和类型也可以由业内本领域技术人员确定(例如，在下文中更详细地讨论)。例如，可以选择在本文所述的任何方法中使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2期间所采用的缓冲液的体积和一个或多个类型，以优化纯化的重组蛋白(例如，重组蛋白药物产品)中的以下中的一个或多个：重组蛋白的总产量、重组蛋白的活性、重组蛋白的纯度水平、以及含重组蛋白的流体(例如液体培养基)中生物污染物的去除(例如，不存在活性病毒、分枝杆菌、酵母菌、细菌或哺乳动物细胞)。
MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以是周期性逆流层析系统(PCCS)。PCCS可以例如包括两个或更多个层析柱(例如，三个柱或四个柱)，将所述层析柱切换以允许从两个或更多个层析柱连续洗脱重组蛋白。PCCS可包括两个或更多个层析柱，两个或更多个层析膜，或者至少一个层析柱与至少一个层析膜。柱操作(循环)通常由装载、洗涤、洗脱和再生步骤组成。在PCCS中，将多个柱用于以循环方式离散地且连续地运行相同的步骤。由于柱是串联操作的，因此经过一个柱的流和来自该柱的洗液由另一个柱捕获。PCCS的该独特特征允许树脂的装载接近其静态结合能力而不是动态结合能力，这在分批模式层析过程中是典型的。由于连续循环和洗脱，进入PCCS的流体被连续地处理，并且连续产生包含重组蛋白的洗脱物。
采用柱切换策略在PCCS循环中从一个步骤前进到另一个步骤。可以在PCCS中使用的柱切换的例子如美国临时专利申请序列号61/775,060和61/856,390中所描述。例如，柱切换方法可以采用每个柱两个自动切换操作：其中第一个与初始产物通过物有关，而第二个与柱饱和一致。确定应在何时进行柱切换操作可以通过监测来自PCCS中存在的每个层析柱的洗脱物中的重组蛋白浓度(例如，通过UV监测执行的监测)来确定。例如，柱切换可以通过能够通过反馈控制在线测量重组蛋白浓度的任何PAT工具来确定。PAT工具能够通过反馈控制实时在线测量重组蛋白浓度。如业内所已知，还可以基于时间或通过MCCS、MCCS1和/或MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜的流体(例如，缓冲液)的量来设计柱开关。
在PCCS中，重组蛋白在PCCS中存在的每个层析柱和/或层析膜上的停留时间(RT)可以在不增加柱/膜尺寸的情况下减少，因为可以在PCCS中的另一个柱/膜上捕获来自第一柱/膜的通过物。可以设计连续处理系统来通过使用以下等式改变柱/膜体积(V)和RT来以任何灌注速率(D)处理液体培养基：V＝D*RT。
可以由本发明所述的方法中使用的MCCS或MCC1和/或MCCS2执行的一个或多个单元操作包括，例如，捕获重组蛋白，灭活含重组蛋白的流体中存在的病毒，纯化重组蛋白，精制重组蛋白，保持含重组蛋白的流体(例如，使用本文所述的一个或多个示例性断流罐中的任一个)，从含重组蛋白的流体中过滤或去除颗粒物质和/或细胞，以及调节含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH。
在一些实施方案中，MCCS或MCCS1包括至少一个执行捕获重组蛋白的单元操作的层析柱和/或层析膜。捕获的单元操作可以使用至少一种例如利用捕获机制的层析柱和/或层析树脂执行。捕获机制的非限制性例子包括蛋白A结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、底物结合捕获机制、适体结合捕获机制、标签结合捕获机制(例如，基于poly-His标签的捕获机制)和辅因子结合捕获机制。还可以使用可以用于执行阳离子交换或阴离子交换层析、分子筛层析或疏水相互作用层析的树脂执行捕获。本文描述了可以用于捕获重组蛋白的非限制性树脂。可以用于捕获重组蛋白的树脂的其他例子是业内已知的。
可以使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2(例如，其包括能够在约3.0至5.0之间(例如，约3.5至约4.5之间、约3.5至约4.25之间、约3.5至约4.0之间、约3.5至约3.8之间或约3.75)的pH下孵育含重组蛋白的流体持续至少30分钟的时间段(例如约30分钟至1.5小时之间的时间段、约30分钟至1.25小时之间的时间段、约0.75小时至1.25小时之间的时间段或约1小时的时间段)的层析柱、层析膜或保持罐)执行灭活含重组蛋白的流体中存在的病毒的单元操作。
可以使用一个或多个MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)执行纯化重组蛋白的单元操作，所述MCCS包括例如包含例如利用捕获系统的树脂的层析柱或层析膜。捕获机制的非限制性例子包括蛋白A结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、底物结合捕获机制、适体结合捕获机制、标签结合捕获机制(例如，基于poly-His标签的捕获机制)和辅因子结合捕获机制。还可以使用可以用于执行阳离子交换或阴离子交换层析，分子筛层析或疏水相互作用层析的树脂执行纯化。本文描述了可以用于纯化重组蛋白的非限制性树脂。可以用于纯化重组蛋白的树脂的其他例子是业内已知的。
可以使用一个或多个MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)执行精制重组蛋白的单元操作，所述MCCS包括例如包含树脂的层析柱或层析膜，所述树脂例如可以用于执行阳离子交换、阴离子交换、分子筛层析或疏水相互作用层析。本文描述了可以用于精制重组蛋白的非限制性树脂。可以用于精制重组蛋白的树脂的其他例子是业内已知的。
可以使用MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)执行保持含重组蛋白的流体的单元操作，所述MCCS在MCCS或组合的MCCS1和MCCS2中包括至少一个储器(例如，断流罐)或最多1、2、3、4或5个储器(例如，一个或多个断流罐)。例如，可以用于实现该单元操作的一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)的体积可以各自为约1mL至约1L之间(例如，约1mL至约800mL之间、约1mL至约600mL之间、约1mL至约500mL之间、约1mL至约400mL之间、约1mL至约350mL之间、约1mL至约300mL之间、约10mL与约250mL之间、约10mL与约200mL之间、约10mL与约150mL之间或约10mL与约100mL之间)。本文所述的方法中使用的一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)的容量可以是例如1mL与约300mL之间(包括端点)，例如1mL与约280mL之间、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(包括端点)。(本文所述的任何方法中)用于在流体进入MCCS或MCCS1之前保持所述流体的一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)中任一个的容量可以是例如1mL与MCCS或MCCS1中第一柱装载量的约100％之间(包括端点)，约1mL与约90％之间、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(包括端点)。用于在来自MCCS1的洗脱物(包含重组蛋白)进入MCCS2之前保持所述洗脱物的一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)中任一个的容量可以是例如1mL与MCCS2中第一柱装载量的约100％之间(包括端点)，例如约1mL与约90％之间、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(包括端点)。
一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)可以各自保持含重组蛋白的流体至少10分钟(例如，至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时或至少6小时)。在其他例子中，一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)仅保持重组蛋白总共例如约5分钟与少于约6小时之间(包括端点)，例如约5分钟与约5小时之间、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时或约30分钟(包括端点)的时间段。一个或多个储器(例如，一个或多个断流罐)可以用于保持和冷藏(例如，在低于25℃、低于15℃或低于10℃的温度下)含重组蛋白的流体。储器可以具有任何形状，包括圆柱形、椭圆圆柱形或近似矩形的密封且不可渗透袋。
可以使用MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)执行过滤含重组蛋白的流体的单元操作，所述MCCS包括例如过滤器或包含分子筛树脂的层析柱或层析膜。如业内所已知，业内可获得各种亚微米过滤器(例如，孔径为小于1μm、小于0.5μm、小于0.3μm、约0.2μm、小于0.2μm、小于100nm、小于80nm、小于60nm、小于40nm、小于20nm或小于10nm的过滤器)，所述过滤器能够去除任何沉淀的物质和/或细胞(例如，沉淀的未折迭蛋白质；沉淀的不需要的主体细胞蛋白；沉淀的脂质；细菌；酵母细胞；真菌细胞；分枝杆菌；和/或哺乳动物细胞)。已知孔径为约0.2μm或小于0.2μm的过滤器可有效地从含重组蛋白的流体中去除细菌。如业内所已知，包含分子筛树脂的层析柱或层析膜也可以用于MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中来执行过滤含重组蛋白的流体的单元操作。
可以使用MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)来执行调节含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH的单元操作，所述MCCS包括并且利用缓冲液调节储器(例如，在线缓冲液调节储器)以将新缓冲溶液添加到含重组蛋白的流体中(例如，在MCCS、MCCS1和/或MCCS2内的柱之间，或在倒数第二个MCCS(例如，MCCS1)中的最后一个柱之后并且在将含重组蛋白的流体馈送到下一个MCCS(例如MCCS2)的第一个柱中之前)。如业内可以理解的，在线缓冲液调节储器可以具有任何尺寸(例如，大于100mL)，并且可以包含任何缓冲溶液(例如具有以下中的一个或多个的缓冲溶液：与含重组蛋白的流体相比升高或降低的pH；与含重组蛋白的流体相比增加或减少的离子(例如，盐)浓度；和/或增加或减少的如下试剂的浓度，该试剂与重组蛋白竞争地结合于存在于MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)的至少一个层析柱或至少一个层析膜中的树脂)。
MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以执行两个或更多个单元操作。例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2各自可以至少执行以下单元操作：捕获重组蛋白并灭活含重组蛋白的流体中存在的病毒；捕获重组蛋白，灭活含重组蛋白的流体中存在的病毒，并调节含重组蛋白的液体的离子浓度和/或pH；纯化重组蛋白并精制重组蛋白；纯化重组蛋白，精制重组蛋白，并过滤含重组蛋白的流体或从含重组蛋白的流体去除沉淀物和/或特定物质；以及纯化重组蛋白，精制重组蛋白，过滤含重组蛋白的流体或从含重组蛋白的流体去除沉淀物和/或颗粒物，并调节含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH。
捕获重组蛋白
本发明方法包括使用MCCS或MCCS1捕获重组蛋白的步骤。如本领域可以理解的，可以使用各种不同方式将包含重组蛋白的液体培养基连续馈送到MCCS或MCCS1上。例如，可以将液体培养基主动泵入MCCS或MCCS1中，或者可以将液体培养基使用重力馈送到MCCS或MCCS1中。可以将液体培养基在馈送到MCCS或MCCS1中之前储存在储器(例如，保持罐)中，或者可以将液体培养基从包含细胞(例如，向培养基中分泌重组蛋白的哺乳动物细胞)培养物的生物反应器主动泵送到MCCS或MCCS1中。
可以将液体培养基以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟与约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约25.0mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约15.0mL/分钟之间)的流速馈送(装载)到MCCS或MCCS1中。包含重组蛋白的液体培养基可以来自本文所述或业内已知的任何示例性来源。
一些例子还包括将液体培养基在馈送到MCCS或MCCS1中之前进行过滤的任选步骤。可以使用本文所述的过滤包含重组蛋白的液体培养基或流体的任何示例性方式或业内已知的任何过滤方式将包含重组蛋白的液体培养基在馈送到MCCS或MCCS1中之前进行过滤。
在本文所述的方法中，使用MCCS或MCCS1从液体培养基捕获重组蛋白。如业内可以理解的，为了实现重组蛋白的捕获，MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱或至少一个层析膜必须包含利用捕获机制(例如，本文所述的任何示例性捕获机制)的树脂，或包含能够执行阳离子交换、阴离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂。例如，如果重组蛋白是抗体或抗体片段，则捕获系统可以是蛋白A结合捕获机制或抗原结合捕获机制(其中捕获抗原被重组抗体或抗体片段特异性识别)。如果重组蛋白是酶，则捕获机制可以使用特异性结合酶的抗体或抗体片段来捕获重组酶，使用酶的底物来捕获重组酶，使用酶的辅因子来捕获重组蛋酶，或者，如果重组酶包括标签，则使用特异性结合重组酶中存在的标签的蛋白质、金属螯合物或抗体(或抗体片段)。本文描述了可以用于捕获重组蛋白的非限制性树脂，并且可以用于捕获重组蛋白的其他树脂是业内已知的。利用蛋白A结合捕获机制的树脂的一个非限制性例子是Mab Select SuReTM树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、JSRLifeSciences Amsphere ProA JWT203(Sunnyvale,CA)和Kaneka KanCap A(Osaka,Japan)。
本文描述了可以用于捕获重组蛋白的MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱或层析膜的示例性非限制性尺寸和形状。馈送(装载)到MCCS或MCCS1中的液体培养基可以包含例如约0.05mg/mL至约100mg/mL之间的重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL之间、约0.1mg/mL至约80mg/mL之间、约0.1mg/mL至约70mg/mL之间、约0.1mg/mL至约60mg/mL之间、约0.1mg/mL至约50mg/mL之间、约0.1mg/mL至约40mg/mL之间、约0.1mg/mL至约30mg/mL之间、约0.1mg/mL至约20mg/mL之间、0.5mg/mL至约20mg/mL之间、约0.1mg/mL至约15mg/mL之间、约0.5mg/mL至约15mg/mL之间、约0.1mg/mL至约10mg/mL之间或约0.5mg/mL至约10mg/mL之间的重组蛋白)。重组蛋白与用于执行捕获的单元操作的树脂结合所需的平均时间可以是例如约5秒至约10分钟之间(例如，约10秒至约8分钟之间、约10秒至约7分钟之间、约10秒至约6分钟之间、约10秒至约5分钟之间、约30秒至约5分钟之间、约1分钟至约5分钟之间、约10秒至约4分钟之间、约30秒至约4分钟之间或约1分钟至约4分钟之间)。
如业内可以理解的，为了使用MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱或层析膜捕获重组蛋白，必须执行装载、洗涤、洗脱和再生MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱或层析膜的连续层析步骤。为本文所述的每个连续层析步骤分配的示例性流速、缓冲液体积和/或时间长度中的任一个可以用于这些不同连续层析步骤中的一个或多个(例如，装载、洗涤、洗脱和再生用于捕获重组蛋白的MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱或层析膜的连续层析步骤中的一个或多个)。下文提供为可用于捕获MCCS或MCCS1(例如，PCCS或PCCS1)中的一个或多个层析柱和/或层析膜的每个连续层析步骤分配的非限制流速、缓冲液体积和/或时间长度。另外，下文描述了可以在MCCS和/或MCCS1中使用的示例性缓冲液。
可以使用上文所述的任何装载流速(馈送速率)向包括至少一个层析柱和/或层析膜的MCCS或MCCS1装载包含重组蛋白的液体培养基，所述层析柱和/或层析膜包含可以执行捕获的单元操作的树脂(例如，本文所述的可以用于捕获的任何示例性树脂)。在一些例子中，在例如约10分钟至约90分钟之间(例如，约15分钟与约90分钟之间、约20分钟与80分钟之间、约30分钟与80分钟之间、约40分钟与约80分钟之间、约50分钟与约80分钟之间和约60分钟与80分钟之间)内装载包含能够执行捕获的单元操作的树脂的单个层析柱或单个层析膜。在一些例子中，其中MCCS或MCCS1包括至少两个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的串联层析柱，装载两个串联层析柱所要的时间为例如约50分钟至约180分钟之间(例如，约60分钟与约180分钟之间、约70分钟与约180分钟之间、约80分钟与约180分钟之间、约90分钟与约180分钟之间、约100分钟与约180分钟之间、约110分钟与150分钟之间和约125分钟与约145分钟之间)。
在将重组蛋白装载到MCCS或MCCS1中至少一个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的层析柱或层析膜上后，用至少一种洗涤缓冲液洗涤所述至少一个层析柱或层析膜。如业内可以理解的，至少一种(例如，两种、三种或四种)洗涤缓冲液旨在从至少一个层析柱或层析膜洗脱不是重组蛋白的蛋白质中的全部或大多数，而不干扰重组蛋白与树脂的相互作用。
洗涤缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL分钟与约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约25.0mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个层析柱或层析膜。使用的洗涤缓冲液的体积(例如，当使用超过一种洗涤缓冲液时使用的洗涤缓冲液的组合总体积)可以是例如约1X柱体积(CV)至约15X CV之间(例如，约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12X CV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11X CV、约4X CV至约11X CV、约5X CV至约11XCV或约5X CV至约10X CV)。洗涤的总时间可以是例如例如约2分钟至约3小时之间(例如，约2分钟至约2.5小时之间、约2分钟至约2.0小时之间、约5分钟至约1.5小时之间、约10分钟至约1.5小时之间、约10分钟至约1.25小时之间、约20分钟至约1.25小时之间或约30分钟至约1小时之间)。
在洗涤MCCS或MCCS1中至少一个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的层析柱或层析膜之后，通过使洗脱缓冲液通过MCCS或MCCS1中至少一个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的层析柱或层析膜来从至少一个层析柱或层析膜洗脱重组蛋白。洗脱缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约5.0mL/分钟之间、约0.5mL分钟至约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟之间或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的层析柱或层析膜。用于从至少一个包含能够执行纯化的单元操作的树脂的层析柱或层析膜中的每一个洗脱重组蛋白的洗脱缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约15X CV之间(例如，约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12XCV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11X CV、约4X CV至约11X CV、约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。洗脱的总时间可以是例如约2分钟至约3小时之间(例如，约2分钟至约2.5小时之间、约2分钟至约2.0小时之间、约2分钟至约1.5小时之间、约2分钟至约1.5小时之间、约2分钟至约1.25小时之间、约2分钟至约1.25小时之间、约2分钟至约1小时之间、约2分钟至约40分钟之间、约10分钟至约40分钟之间或约20分钟至约40分钟之间)。可以用于这些方法的洗脱缓冲液的非限制性例子取决于捕获机制和/或重组蛋白。例如，洗脱缓冲液可以包含不同浓度的盐(例如，增加的盐浓度)，不同pH(例如，增加或减少的盐浓度)，或将与重组蛋白竞争结合能够执行捕获的单元操作的树脂的分子。本文所述的用于每种示例性捕获机制的此类洗脱缓冲液的例子是业内熟知的。
从MCCS或MCCS1中至少一个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的层析柱或层析膜洗脱重组蛋白后，并且在可以将下一体积的液体培养基装载到至少一个层析柱或层析膜上之前，必须使用再生缓冲液平衡所述至少一个层析柱或层析膜。可以使再生缓冲液以例如约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约5.0mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟之间、约5.0mL/分钟至约15.0mL/分钟之间或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的层析柱或层析膜。用于平衡至少一个包含能够执行捕获的单元操作的树脂的层析柱或层析膜的再生缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约15X CV之间(例如，约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12X CV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11X CV、约2X CV至约5X CV、约4X CV至约11X CV、约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。
在本文所述的一些方法中，MCCS或MCCS1包括如下储器，其在低pH(例如，低于4.6、低于4.4、低于4.2、低于4.0、低于3.8、低于3.6、低于3.4、低于3.2或低于3.0的pH)下保持含重组蛋白的流体例如约1分钟至1.5小时(例如，约1小时)，并灭活含重组蛋白的流体中存在的病毒。可以用于执行灭活病毒的单元操作的储器的例子是能够将含重组蛋白的流体例如在馈送到MCCS2中之前保持例如约1分钟至1.5小时的搅拌瓶(例如，500-mL搅拌瓶，例如具有程序化搅拌板的500-mL搅拌瓶)。用于执行灭活病毒的单元操作的储器可以是具有程序化搅拌板(例如，经程序化以例如每4小时一次混合(例如，周期性混合)储器内的流体的搅拌板)的500-mL搅拌瓶。可以用于执行灭活病毒的单元操作的储器的另一个例子是能够将含重组蛋白的流体例如在馈送到MCCS2中之前保持例如约1分钟至1.5小时的塑料袋(例如，500-mL塑料袋)。在一些例子中，含重组蛋白的流体在馈送到用于执行病毒灭活的单元操作的储器中时可能已经具有低pH(例如，低于4.6、低于4.4、低于4.2、低于4.0、低于3.8、低于3.6、低于3.4、低于3.2或低于3.0的pH)。如业内本领域技术人员可以理解的，可以使用各种其他方式来执行灭活病毒的单元操作。例如，还可以使用含重组蛋白的流体的UV照射来进行灭活病毒的单元操作。本文描述了可以用于执行灭活含重组蛋白的流体中存在的病毒的单元操作的储器的非限制性例子。
MCCS或MCCS1可以包括具有四个层析柱的PCCS，其中四个层析柱中的至少三个执行从液体培养基捕获重组蛋白的单元操作(例如，使用包括如下至少一个层析柱中的任一个的MCCS，所述层析柱包含能够执行捕获的单元操作的树脂(例如，本文所述的任何树脂))。在这些例子中，PCC的第四个柱可以执行灭活含重组蛋白的流体中的病毒的单元操作(例如，本文所述的可以用于实现含重组蛋白的流体的病毒灭活的任何示例性柱)。
在一些例子中，从MCCS1(例如，PCCS1)连续洗脱含重组蛋白的流体，并连续馈送到MCCS2(例如，PCCS2)中。在MCCS或MCCS1(例如，PCCS或PCCS1)的洗脱物中回收的重组蛋白的百分比可以是例如至少70％、至少72％、至少74％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％。可以使用本领域已知的各种方法(例如使用管)将来自MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物馈送到MCCS2(例如，PCCS2)中。可以将MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物以例如约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约5.0mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟之间、约5.0mL/分钟至约15.0mL/分钟之间、约15mL/分钟至约25mL/分钟之间或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟之间)的流速馈送到MCCS2(例如，PCCS2)中。
本文所述的一些方法还可以包括在将来自MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物馈送到MCCS2(例如，PCCS2)之前调节其离子浓度和/或pH的步骤。如本文所述，可以通过向来自MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物中添加缓冲液(例如，通过使用在线缓冲液调节储器)来调节所述洗脱物的离子浓度和/或pH(在将其馈送到MCCS2中之前)。可以将缓冲液以例如约0.1mL/分钟至约15mL/分钟之间(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约6mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至4mL/分钟之间或约0.5mL/分钟至约5mL/分钟之间)的流速添加至来自MCCS1的洗脱物中。
本文所述的方法还可以包括在将来自MCCS1的洗脱物馈送到MCCS2中之前保持或储存(并任选地冷藏)所述来自MCCS1的洗脱物的步骤。如本文所述，该保持或储存步骤可以使用本文所述的任何储器(例如，备用罐)来执行。
本文所述的方法还可以包括在将来自MCCS1的洗脱物馈送到MCCS2中之前对该洗脱物进行过滤的步骤。可以使用本文所述的示例性过滤器或过滤方法中的任一个将来自MCCS1的洗脱物在馈送到MCCS2中之前过滤。
精制和纯化重组蛋白
可以使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2来执行纯化和精制重组蛋白的单元操作。例如，可以使用MCCS2来执行纯化和精制重组蛋白的操作，并且来自MCCS2的洗脱物是蛋白药物。MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以包括至少一个(例如，两个、三个或四个)可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜和至少一个(例如，两个、三个或四个)可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜。
至少一个可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜可以包含利用捕获机制(例如，本文所述或业内已知的任何捕获机制)的树脂，或可以用于执行阴离子交换、阳离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂。至少一个可以用于执行精制重组蛋白的操作单元的层析柱或层析膜可以包含可以用于执行阴离子交换、阳离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂(例如，用于执行本文所述或业内已知的阴离子交换、阳离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的任何示例性树脂)。
至少一个可以用于执行纯化重组蛋白的操作单元的层析柱或层析膜的尺寸、形状和体积和/或至少一个可以用于执行精制重组蛋白的操作单元的层析膜的尺寸和形状可以是本文所述的层析柱或层析膜的示例性尺寸、形状和体积的任何组合。如业内本领域技术人员可以理解的，纯化或精制重组蛋白的步骤可以例如包括装载、洗涤、洗脱和平衡至少一个用于执行纯化或精制重组蛋白的操作单元的层析柱或层析膜的步骤。典型地，来自用于执行纯化的单元操作的层析柱或层析膜的洗脱缓冲液包含重组蛋白。典型地，来自用于执行精制的单元操作的层析柱或层析膜的装载和/或洗涤缓冲液包含重组蛋白。
例如，至少一个可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜的尺寸的体积可以是例如约2.0mL至约200mL之间(例如，约2.0mL至约180mL之间、约2.0mL至约160mL之间、约2.0mL至约140mL之间、约2.0mL至约120mL之间、约2.0mL至约100mL之间、约2.0mL至约80mL之间、约2.0mL至约60mL之间、约2.0mL至约40mL之间、约5.0mL至约40mL之间、约2.0mL至约30mL之间、约5.0mL至约30mL之间或约2.0mL至约25mL之间)。含重组蛋白的流体在装载到可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或至少一个层析膜上时的流速可以是例如约0.1mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约6mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至4mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约3mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约2mL/分钟之间或约0.2mL/分钟至约4mL/分钟)。装载到至少一个可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜上的流体中的重组蛋白的浓度可以是例如约0.05mg/mL至约100mg/mL之间的重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL之间、约0.1mg/mL至约80mg/mL之间、约0.1mg/mL至约70mg/mL之间、约0.1mg/mL至约60mg/mL之间、约0.1mg/mL至约50mg/mL之间、约0.1mg/mL至约40mg/mL之间、约0.1mg/mL至约30mg/mL之间、约0.1mg/mL至约20mg/mL之间、0.5mg/mL至约20mg/mL之间、约0.1mg/mL至约15mg/mL之间、约0.5mg/mL至约15mg/mL之间、约0.1mg/mL至约10mg/mL之间或约0.5mg/mL至约10mg/mL之间的重组蛋白)。至少一个用于执行纯化的单元操作的层析柱或层析膜中的树脂可以是可以用于执行阴离子交换或阳离子交换层析的树脂。至少一个用于执行纯化的单元操作的层析柱或层析膜中的树脂可以是阳离子交换树脂(例如，Capto-S树脂，GEHealthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)。
在将重组蛋白装载到至少一个可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜上后，用至少一种洗涤缓冲液洗涤至少一个层析柱或层析膜。如业内可以理解的，至少一种(例如，两种、三种或四种)洗涤缓冲液旨在从至少一个层析柱或层析膜洗脱不是重组蛋白的全部蛋白质，而不干扰重组蛋白与树脂的相互作用或者洗脱重组蛋白。
洗涤缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟与约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约25.0mL/分钟或约1.0mL/分钟与约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个层析柱或层析膜。使用的洗涤缓冲液的体积(例如，当使用超过一种洗涤缓冲液时使用的洗涤缓冲液的组合总体积)可以是例如约1X柱体积(CV)至约15X CV之间(例如，约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12X CV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11X CV、约4X CV至约11X CV、约2.5X CV至约5.0X CV、约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。洗涤的总时间可以是例如约2分钟至约3小时之间(例如，约2分钟至约2.5小时之间、约2分钟至约2.0小时之间、约5分钟至约1.5小时之间、约10分钟至约1.5小时之间、约10分钟至约1.25小时之间、约20分钟至约1.25小时之间、约30分钟至约1小时之间、约2分钟与10分钟之间、约2分钟与15分钟或约2分钟与30分钟之间)。
在洗涤至少一个用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜之后，通过使洗脱缓冲液通过至少一个用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜，从所述至少一个层析柱或层析膜洗脱重组蛋白。洗脱缓冲液可以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟与约6.0mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约5.0mL/分钟之间、约0.5mL/分钟与约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约25.0mL/分钟之间或约1.0mL/分钟与约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜。用于从至少一个可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜中的每一个洗脱重组蛋白的洗脱缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约25X CV之间(例如，约1X CV至约20X CV之间、约15X CV至约25X CV之间、约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12X CV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11XCV、约4X CV至约11X CV、约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。洗脱的总时间可以是例如约2分钟至约3小时之间(例如，约2分钟至约2.5小时之间、约2分钟至约2.0小时之间、约2分钟至约1.5小时之间、约2分钟至约1.5小时之间、约2分钟至约1.25小时之间、约2分钟至约1.25小时之间、约2分钟至约1小时之间、约2分钟与约40分钟之间、约10分钟与约40分钟之间、约20分钟与约40分钟之间或约30分钟与1.0小时之间)。可以用于这些方法的洗脱缓冲液的非限制性例子取决于重组蛋白的树脂和/或生物物理特性。例如，洗脱缓冲液可以包括不同浓度的盐(例如，增加的盐浓度)、不同pH(例如，增加或减少的盐浓度)或者将与重组蛋白竞争结合树脂的分子。用于本文所述的示例性捕获机制中的每一种的此类洗脱缓冲液的例子是业内熟知的。
从至少一个用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜洗脱重组蛋白后，并且在可以将下一体积的含重组蛋白的流体装载到至少一个层析柱或层析膜上之前，必须使用再生缓冲液平衡所述至少一个层析柱或层析膜。可以使再生缓冲液以例如约0.2mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约5.0mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟之间、约5.0mL/分钟至约15.0mL/分钟之间或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜。用于平衡至少一个包含可以用于执行纯化重组蛋白的单元操作的树脂的层析柱或层析膜的再生缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约15X CV之间(例如，约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV之间、约1X CV至约12X CV之间、约1X CV至约11X CV之间、约2X CV至约11X CV之间、约3XCV至约11X CV之间、约2X CV至约5X CV之间、约2.5X CV至约7.5X CV、约4X CV至约11X CV之间、约5X CV至约11X CV之间或约5X CV至约10X CV之间)。至少一个用于执行纯化重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜的洗脱物中重组蛋白的浓度可以是例如约0.05mg/mL至约100mg/mL之间的重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL之间、约0.1mg/mL至约80mg/mL之间、约0.1mg/mL至约70mg/mL之间、约0.1mg/mL至约60mg/mL之间、约0.1mg/mL至约50mg/mL之间、约0.1mg/mL至约40mg/mL之间、约2.5mg/mL至约7.5mg/mL之间、约0.1mg/mL至约30mg/mL之间、约0.1mg/mL至约20mg/mL之间、0.5mg/mL至约20mg/mL之间、约0.1mg/mL至约15mg/mL之间、约0.5mg/mL至约15mg/mL之间、约0.1mg/mL至约10mg/mL之间或约0.5mg/mL至约10mg/mL之间的重组蛋白)。
至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜可以包含可以用于执行阳离子交换、阴离子交换或分子筛层析的树脂。如业内可以理解的，使用至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜精制重组蛋白可以包括例如装载、追踪和再生至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜的步骤。例如，当使用装载、追踪和再生的步骤执行精制时，重组蛋白不与至少一个用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜中的树脂结合，并且在装载和追踪步骤中从至少一个层析柱或层析膜洗脱重组蛋白，并且在可以将其他含重组蛋白的流体装载到至少一个层析柱或层析膜上之前使用再生步骤从至少一个层析柱或层析膜去除任何杂质。下文描述了在装载、追踪和再生步骤中的每一个中使用的示例性流速和缓冲液体积。
至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜的尺寸、形状和体积和/或至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析膜的尺寸和体积可以是本文所述的层析柱或层析膜的示例性尺寸、形状和体积的任何组合。例如，至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜的尺寸的体积可以是例如约0.5mL至约200mL之间(例如，约0.5mL至约180mL之间、约0.5mL至约160mL之间、约0.5mL至约140mL之间、约0.5mL至约120mL之间、约0.5mL至约100mL之间、约0.5mL至约80mL之间、约0.5mL至约60mL之间、约0.5mL至约40mL之间、约5.0mL至约40mL之间、约0.5mL至约30mL之间、约5.0mL至约30mL之间、约0.5mL至约25mL之间、约0.2mL至约10mL之间或约0.2mL至约5mL之间)。含重组蛋白的流体在装载到至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜上时的流速可以是例如约0.1mL/分钟至约25mL/分钟之间(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约6mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至4mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约3mL/分钟之间、约2mL/分钟至约6mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约2mL/分钟之间或约0.2mL/分钟至约4mL/分钟之间)。装载到至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜上的含重组蛋白的流体的总体积可以是例如约1.0mL至约250mL之间(例如，约1.0mL至约225mL之间、约1.0mL至约200mL之间、约1.0mL至约175mL之间、约1.0mL至约150mL之间、约100mL至约125mL之间、约100mL至约150mL之间、约1.0mL至约150mL之间、约1.0mL至约125mL之间、约1.0mL至约100mL之间、约1.0mL至约75mL之间、约1.0mL至约50mL之间或约1.0mL至约25mL之间)。至少一个用于执行精制的层析柱或层析膜中的树脂可以是阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。至少一个用于执行精制的单元操作的层析柱或层析膜中的树脂可以是阳离子交换树脂(例如，
Q树脂，Sartorius,Goettingen,Germany)。
在装载步骤之后，执行追踪步骤(例如，使追踪缓冲液通过至少一个层析柱或层析膜以收集基本上不与至少一个层析柱或层析膜结合的重组蛋白)。在这些例子中，可以使追踪缓冲液以约0.2mL/分钟至约50mL/分钟之间(例如，约1mL/分钟至约40mL/分钟之间、约1mL/分钟至约30mL/分钟之间、约5mL/分钟至约45mL/分钟之间、约10mL/分钟至约40mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟与约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约25.0mL/分钟之间或约1.0mL/分钟与约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个层析柱或层析膜。所使用的追踪缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约100X CV之间(例如，约1X CV至约90X CV之间、约1X CV至约80X CV之间、约1X CV至约70X CV之间、约1X CV至约60X CV之间、约1X至约50X CV之间、约1X CV至约40X CV之间、约1X CV至约30X CV之间、约1X CV至约20X CV之间、约1X CV至约15X CV之间、约5X CV至约20X CV之间、约5X CV至约30X CV之间、约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12X CV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11X CV、约4X CV至约11X CV、约2.5X CV至约5.0X CV、约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。追踪的总时间可以是例如约1分钟至约3小时之间(例如，约1分钟至约2.5小时之间、约1分钟至约2.0小时之间、约1分钟至约1.5小时之间、约2分钟至约1.5小时之间、约1分钟至约1.25小时之间、约2分钟至约1.25小时之间、约1分钟至约5分钟之间、约1分钟至约10分钟之间、约2分钟至约4分钟之间、约30分钟至约1小时之间、约2分钟至约10分钟之间、约2分钟至约15分钟之间或约2分钟至约30分钟之间)。在装载步骤和追踪步骤中通过柱的洗脱物中存在的重组蛋白的组合浓度可以是例如约0.1mg/mL至约100mg/mL之间的重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL之间、约0.1mg/mL至约80mg/mL之间、约0.1mg/mL至约70mg/mL之间、约0.1mg/mL至约60mg/mL之间、约0.1mg/mL至约50mg/mL之间、约0.1mg/mL至约40mg/mL之间、约2.5mg/mL至约7.5mg/mL之间、约0.1mg/mL至约30mg/mL之间、约0.1mg/mL至约20mg/mL之间、0.5mg/mL至约20mg/mL之间、约0.1mg/mL至约15mg/mL之间、约0.5mg/mL至约15mg/mL之间、约0.1mg/mL至约10mg/mL之间、约0.5mg/mL至约10mg/mL之间或约1mg/mL至约5mg/mL之间的重组蛋白)。
在追踪步骤之后并且在可以将下一体积的含重组蛋白的流体装载到至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜上之前，至少一个层析柱或层析膜必须使用再生缓冲液再生。可以使再生缓冲液以例如约0.2mL/分钟至约50mL/分钟之间(例如，约1mL/分钟至约40mL/分钟之间、约1mL/分钟至约30mL/分钟之间、约5mL/分钟至约45mL/分钟之间、约10mL/分钟至约40mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟之间、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟之间、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟之间、约0.5mL/分钟与约14mL/分钟之间、约1.0mL/分钟与约25.0mL/分钟之间或约1.0mL/分钟与约15.0mL/分钟之间)的流速通过至少一个可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析柱或层析膜。用于再生至少一个可以用于执行精制的单元操作的层析柱或层析膜的再生缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约500X CV之间(例如，约1X CV至约450X CV之间、约1X CV至约400X CV之间、约1XCV至约350X CV之间、约1X CV至约300X CV之间、约1X CV至约250X CV之间、约1X CV至约200X CV之间、约1X CV至约150X CV之间、约1X CV至约100X CV之间、约1X CV至约90X CV之间、约1X CV至约80X CV之间、约1X CV至约70X CV之间、约1X CV至约60X CV之间、约1X至约50X CV之间、约1X CV至约40X CV之间、约1X CV至约30X CV之间、约1X CV至约20X CV之间、约1X CV至约15X CV之间、约5X CV至约20X CV之间、约5X CV至约30X CV之间、约1X CV至约14X CV之间、约1X CV至约13X CV之间、约1X CV至约12X CV之间、约1X CV至约11X CV之间、约2X CV至约11X CV之间、约3X CV至约11X CV之间、约4X CV至约11X CV之间、约2.5X CV至约5.0X CV之间、约5X CV至约11X CV之间或约5X CV至约10X CV之间)。
在其他例子中，一个或多个用于执行精制的单元操作的层析柱和/或层析膜包含选择性地结合或保留含重组蛋白的流体中存在的杂质的树脂，并且一旦达到或基本接近达到一个或多个柱和/或膜中树脂的结合能力，则将所述一个或多个柱和/或膜替换(例如，用基本上类似的一个或多个柱和/或膜替换)，而不是再生一个或多个柱和/或膜。
在本文所述的这些方法的一些例子中，MCCS2包括具有三个层析柱和一个层析膜的PCCS，例如，其中PCCS中的三个层析柱执行纯化重组蛋白的单元操作(例如，使用一或多个可以用于执行纯化蛋白质的操作单元的层析柱中的至少一个)，并且PCCS中的层析膜执行精制重组蛋白的单元操作。在这些例子中，PCCS中可以用于执行精制治疗性蛋白的单元操作的层析膜可以是本文所述的可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的任何示例性层析膜。可以使用本文所述的任何柱切换方法来确定何时可以切换PCCS中的所述前三个层析柱和所述层析膜。
该例子的一些实施方案还可以包括在将来自PCCS中三个层析柱的洗脱物馈送到PCCS中的层析膜中之前调节洗脱物的离子浓度和/或pH的步骤。如本文所述，可以通过向PCCS中的三个层析柱的洗脱物中添加缓冲液(例如，通过使用在线缓冲液调节储器)来调节来自PCCS中三个层析柱的洗脱物的离子浓度和/或pH(在该例子中，在将所述洗脱物馈送到PCCS中的层析膜中之前)。可以将缓冲液以例如约0.1mL/分钟至约15mL/分钟之间(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至约6mL/分钟之间、约0.1mL/分钟至4mL/分钟之间或约0.5mL/分钟至约5mL/分钟之间)的流速添加至洗脱物中。
这些例子还可以包括在将来自该例子中的PCCS中三个层析柱的洗脱物馈送到层析膜(可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析膜)中之前保持或储存洗脱物的步骤。如本文所述，该保持或储存步骤可以使用本文所述的任何储器(例如，备用罐)来执行。
这些例子还可以包括过滤来自示例性PCCS系统中的层析膜的洗脱物(可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析膜的洗脱物)的步骤。可以使用本文所述的示例性过滤器或过滤方法中的任一个过滤来自该示例性PCCS中的层析膜的洗脱物(可以用于执行精制重组蛋白的单元操作的层析膜的洗脱物)。
如业内本领域技术人员可以理解的，可以使用本文所述的任何方法从MCCS或MCCS2周期性洗脱纯化的重组蛋白。例如，根据例如MCCS或MCCS1和MCCS2中所用的一个或多个层析柱和/或层析膜，本文所述的任何方法可以以例如，约1分钟至与约6小时之间(例如，约1分钟与约5小时之间、约1分钟与约4小时之间、约1分钟与约3小时之间、约1分钟与2小时之间、约1分钟与1小时之间或约1分钟与30分钟之间)的频率洗脱纯化的重组蛋白，持续时间是例如约30秒与约5小时之间(例如，约1分钟与约4小时之间、约1分钟与约3小时之间、约1分钟与约2小时之间、约1分钟或1.5小时之间、约1分钟与约1小时之间或约1分钟与约30分钟之间)。
培养方法
本文所述的一些方法还包括在包含液体培养基的生物反应器(例如，灌注或补料分批生物反应器)中培养分泌重组蛋白的细胞(例如，重组哺乳动物细胞)的步骤，其中从生物反应器(例如，灌注生物反应器)连续或周期性取出基本上不含细胞(例如，哺乳动物细胞)的液体培养基，并将其馈送到MCCS或MCCS1中。生物反应器的体积可以是例如约1L至约10,000L之间(例如，约1L至约50L之间、约50L至约500L之间、约500L至约1000L之间、500L至约5000L之间、约500L至约10,000L之间、约5000L至约10,000L之间、约1L与约10,000L之间、约1L与约8,000L之间、约1L与约6,000L之间、约1L与约5,000L之间、约100L与约5,000L之间、约10L与约100L之间、约10L与约4,000L之间、约10L与约3,000L之间、约10L与约2,000L之间或约10L与约1,000L之间)。存在于生物反应器中的液体培养基的量可以是例如约0.5L至约5,000L之间(例如，约0.5L至约25L之间、约25L至约250L之间、约250L至约500L之间、250L至约2500L之间、约250L至约5,000L之间、约2500L至约5,000L之间、约0.5L与约5,000L之间、约0.5L与约4,000L之间、约0.5L与约3,000L之间、约0.5L与约2、500L之间、约50L与约2、500L之间、约5L与约50L之间、约5L与约2,000L之间、约5L与约1,500L之间、约5L与约1,000L之间或约5L与约500L之间)。可以例如使用补料分批生物反应器或灌注生物反应器执行培养细胞。下文描述了培养细胞(例如，培养哺乳动物细胞)的非限制性例子和不同方面，并且其可以以任何组合形式使用。
细胞
在本文所述的一些方法中培养的细胞可以是细菌(例如，革兰氏阴性细菌)、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans))，或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是悬浮生长的细胞或贴壁细胞。可以在本文所述的任何方法中培养的哺乳动物细胞的非限制性例子包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，CHO DG44细胞或CHO-K1细胞)、Sp2.0、骨髓瘤细胞(例如NS/0)、B细胞、杂交瘤细胞、T细胞、人胚肾(HEK)细胞(例如，HEK 293E和HEK 293F)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)细胞和马丁达比犬(Madin-Darby Canine)(可卡犬(Cocker Spaniel))肾上皮细胞(MDCK)。在培养贴壁细胞的一些例子中，培养物还可以包含多种微载剂(例如，包括一个或多个孔的微载剂)。可以在本文所述的任何方法中培养的其他哺乳动物细胞是业内已知的。
哺乳动物细胞可以包含编码重组蛋白(例如重组蛋白)的重组核酸(例如，稳定地整合在哺乳动物细胞基因组中的核酸)。编码示例性重组蛋白的重组核酸的非限制性例子如下所述，所述重组蛋白是可以使用本文所述方法产生的重组蛋白。在一些情况下，在生物反应器(例如，本文所述的任何生物反应器)中培养的哺乳动物细胞来自较大的培养物。
可以使用分子生物学和分子遗传学中已知的多种方法将编码重组蛋白的核酸引入哺乳动物细胞中。非限制性例子包括转染(例如，脂质转染)、转导(例如慢病毒、腺病毒或逆转录病毒感染)和电穿孔。在一些情况下，编码重组蛋白的核酸不能稳定地整合到哺乳动物细胞的染色体中(瞬时转染)，而在其他情况下，核酸是整合的。可替代地或另外，编码重组蛋白的核酸可以存在于质体和/或哺乳动物人工染色体(例如人人工染色体)中。可替代地或另外，可以使用病毒载体(例如慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体)将核酸引入细胞中。核酸可以与启动子序列(例如，强启动子，诸如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子，或诱导型启动子)可操作地连接。如果需要，包括核酸的载体还可以包括选择性标记(例如，赋予哺乳动物细胞潮霉素、嘌呤霉素或新霉素抗性的基因)。
在一些情况下，重组蛋白是分泌型蛋白，并且由哺乳动物细胞释放到细胞外培养基(例如第一和/或第二液体培养基)中。例如，编码可溶性重组蛋白的核酸序列可以包括编码重组蛋白的N或C末端的分泌信号肽的序列，该信号肽被哺乳动物细胞中存在的酶切割，随后释放到细胞外培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)中。
培养基
液体培养基是业内已知的。液体培养基(例如，第一和/或第二组织培养基)可以补充有哺乳动物血清(例如，胎牛血清和牛血清)和/或生长激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子)。可替代地或另外，液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)可以是化学成分确定的液体培养基、无动物源性组分的液体培养基、无血清液体培养基或含血清的液体培养基。化学成分确定的液体培养基、无动物源性组分的液体培养基、无血清液体培养基和含血清的液体培养基的非限制性例子是可商购的。
液体培养基典型地包含能源(例如，碳水化合物，诸如葡萄糖)、必需氨基酸(例如，二十种氨基酸加上半胱氨酸的基本集合)、维生素和/或所需的低浓度的其他有机化合物、游离脂肪酸和/或痕量元素。如果需要的话，所述液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)可以补充有例如哺乳动物激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐和缓冲液(例如，钙、镁和磷酸盐)、核苷和碱基(例如，腺苷、胸苷和次黄嘌呤)、蛋白质和组织水解产物和/或这些添加剂的任何组合。
可以用于在本文所述的任何方法中培养细胞(例如哺乳动物细胞)的多种不同的液体培养基是业内已知的。也可用于本发明方法的培养基组分包括但不限于化学成分确定的(CD)水解产物，例如CD蛋白胨、CD多肽(两种或更多种氨基酸)和CD生长因子。液体组织培养基和培养基组分的其他例子是业内已知的。
本领域技术人员将理解，本文所述的第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基或不同的培养基。
示例性生物反应器的其他特征
本文所述的任何生物反应器的内表面可以具有至少一个涂层(例如，至少一个明胶、胶原、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的涂层)，以及如业内所已知，一个或多个用于将O2、CO2和N2鼓泡到液体培养基中的端口，和用于搅拌液体培养基的搅拌机构。生物反应器可以在受控的潮湿气氛(例如，在大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的湿度或100％的湿度下)中孵育细胞培养物。生物反应器还可以配备能够从生物反应器中取出一定体积的液体培养基的机械装置，以及任选的机械装置内的过滤器，该过滤器在将液体培养基转移出生物反应器的过程中从液体培养基去除细胞(例如，美国临时专利申请序列号61/878,502中描述的ATF系统或细胞过滤系统)。
温度
培养哺乳动物细胞的步骤可以在约31℃至约40℃的温度下执行。本领域技术人员将理解，可以在培养步骤期间的一个或多个特定时间点(例如，每小时或每天)改变温度。例如，温度可以在用细胞(例如，哺乳动物细胞)初始接种生物反应器之后约一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天或约二十天或更长时间改变或移动(例如，提高或降低)。例如，温度可以上移(例如，改变高达或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19℃或高达或约20℃)。例如，温度可以下移(例如，改变高达或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或高达或约20℃)。
CO2
本文所述的培养步骤还可以包括将生物反应器中的液体培养基暴露于包含至多或约15％CO2的气氛(例如，至多或约14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2或至多或约1％CO2)。
灌注生物反应器
可以使用灌注生物反应器执行本文所述的培养步骤。在灌注生物反应器中培养细胞(例如，哺乳动物细胞)包括从生物反应器取出第一体积的第一液体培养基(例如，包含任何浓度的哺乳动物细胞，例如基本上不含细胞的第一体积的第一液体培养基)，并向第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基。取出和添加可以同时或依序地执行，或者二者组合地执行。此外，取出和添加可以连续地(例如，以如下速率：经任何给定的时间段(例如，经24小时的时间段、经约1小时至约24小时的递增时间段或经大于24小时的递增时间段)取出和替换生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至800％之间(例如，1％与700％之间、1％与600％之间、1％与500％之间、1％与400％之间、1％与350％之间、1％与300％之间、1％与250％之间、1％与100％之间、100％与200％之间、5％与150％之间、10％与50％之间、15％与40％之间、8％与80％之间或4％与30％之间)的体积)或周期性地(例如，每三天一次、每隔一天一次、每天一次、每天两次、每天三次、每天四次或每天五次)执行，或其任何组合。在周期性执行的情况下，取出或替换的体积(例如，在约24小时的时间段内、在约1小时至约24小时的递增时间段内或在大于24小时的递增时间段内)可以是例如生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至800％之间(例如，1％与700％之间、1％与600％之间、1％与500％之间、1％与400％之间、1％与300％之间、1％与200％之间、1％与100％之间、100％与200％之间、5％与150％之间、10％与50％之间、15％与40％之间、8％与80％之间或4％与30％之间)。在一些情况下，在整个或部分培养时间段内经每24小时的时间段(或者可替代地，约1小时至约24小时的递增时间段或大于24小时的递增时间段)取出的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积可以保存大约相同。如业内已知的，取出第一体积的第一液体培养基的速率(体积/时间单位)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/时间单位)可以变化。取出第一体积的第一液体培养基的速率(体积/时间单位)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/时间单位)可以大致相同或者可以不同。
可替代地，在培养时间段内经每24小时的时间段(或者可替代地，1小时与约24小时之间的递增时间段或大于24小时的递增时间段)取出和添加的体积可以变化(例如，逐步增加)。例如，在培养时间段内每24小时的时间段(或者可替代地，约1小时与约24小时之间的递增时间段或大于24小时的递增时间段)内取出的第一液体培养基的体积和添加的第二液体培养基的体积可以从生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.5％与约20％之间的体积增加(例如，逐步地或通过交错的增量)至生物反应器体积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。
本领域技术人员将理解，第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基。在其他情况下，第一液体培养基和第二液体培养基可以不同。
可以例如通过机械系统取出第一体积的第一液体培养基，所述机械系统可以从生物反应器取出第一体积的第一液体培养基(例如，基本上不含来自生物反应器的细胞的第一体积的第一液体培养基)。可替代地或另外，第一体积的第一液体培养基可以通过使第一体积的第一液体培养基通过具有排除所述细胞(例如，哺乳动物细胞)的分子量截留的灭菌膜渗出或重力流动而取出。
第二体积的第二液体培养基可以按自动化方式(例如，通过灌注泵)添加至所述第一液体培养基中。
在一些情况下，取出第一体积的第一液体培养基(例如，基本上不含哺乳动物细胞的第一体积的第一液体培养基)并向第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基不会在用哺乳动物细胞接种生物反应器的至少1小时内(例如，2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内或96小时后)发生。
补料分批生物反应器
可以使用补料分批生物反应器执行本文所述的培养步骤。在补料分批生物反应器中培养细胞包括经大部分培养时间段向第一液体培养基中添加(例如，周期性或连续添加)第二体积的第二液体培养基。第二液体培养基的添加可以连续地(例如，以如下速率：经任何给定时间段(例如，经24小时的时间段、经约1小时至约24小时的递增时间段或经大于24小时的递增时间段)添加生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至300％之间(例如，1％与250％之间、1％与100％之间、100％与200％之间、5％与150％之间、10％与50％之间、15％与40％之间、8％与80％之间或4％与30％之间)的体积)或周期性地(例如，每三天一次、每隔一天一次、每天一次、每天两次、每天三次、每天四次或每天五次)执行，或其任何组合。在周期性执行的情况下，添加的体积(例如，在约24小时的时间段内、在约1小时至约24小时的递增时间段内或在大于24小时的递增时间段内)可以是例如生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至300％之间(例如，1％与200％之间、1％与100％之间、100％与200％之间、5％与150％之间、10％与50％之间、15％与40％之间、8％与80％之间或4％与30％之间)。在一些情况下，在整个或部分培养时间段内经每24小时的时间段(或者可替代地，约1小时至约24小时的递增时间段或大于24小时的递增时间段)添加的第二液体培养基的第二体积可以保存大约相同。如业内所已知，添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/时间单位)可以在整个或部分培养时间段内改变。例如，在培养时间段内经每24小时的时间段(或者可替代地，1小时与约24小时之间的递增时间段或大于24小时的递增时间段)添加的第二液体培养基的体积可以改变(例如，逐步增加)。例如，在培养时间段内每24小时的时间段(或者可替代地，约1小时与约24小时之间的递增时间段或大于24小时的递增时间段)内添加的第二液体培养基的体积可以从生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.5％至约20％之间的体积增加(例如，逐步地或通过交错的增量)至生物反应器体积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/时间单位)可以在整个或部分培养时间段内大致相同。
本领域技术人员将理解，第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基。在其他情况下，第一液体培养基和第二液体培养基可以不同。第二液体培养基的体积可以按自动化方式(例如，通过灌注泵)添加至第一液体培养基中。
在一些情况下，向第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基不会在用哺乳动物细胞接种生物反应器的至少1小时内(例如，2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内或96小时后)发生。补料分批培养中的细胞培养基典型地在培养时间段结束时收获并用于本文所述的任何方法中，然而，补料分批培养中的细胞培养基也可以在培养时间段中的一个或多个时间点收获并用于本文所述的任何方法中。
本领域技术人员将理解，各种培养参数(例如，容器、体积、更换培养物体积的速度或频率、搅拌频率、温度、培养基和CO2浓度)中的任何一种能以任何组合用于执行这些方法。此外，可以使用本文所述或业内已知的任何哺乳动物细胞产生重组蛋白。
示例性生物制造系统
可用于执行本文所述方法并且包括MCCS或MCCS1和MCCS2的生物制造系统的例子描述于美国临时专利申请序列号61/775,060和61/856,390(通过引用并入)中。在这些示例性系统中，至少一个(例如，至少两个、三个、四个、五个或六个)本文提供的生物负载减少的填充层析柱存在于MCCS中或MCCS1和/或MCCS2中。例如，整个系统可以包括总共二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十个本文提供的生物负载减少的填充层析柱。例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以包括(或可以各自包括)二、三、四、五、六、七、八、九、十个本文提供的生物负载减少的填充层析柱。
例如，有用的系统可以包括具有入口的MCCS1和具有出口的MCCS2，或具有入口和出口的MCCS。在一些实施方案中，MCCS1和MCCS2彼此流体连通。这些系统还被配置为使得流体可以被传送进入入口，穿过MCCS1和MCCS2，并通过出口离开制造系统。这些系统可以从液体培养基连续且时间有效地生产治疗性药物。例如，将含治疗性蛋白的流体(例如，液体培养基)馈送到MCCS1中与从MCCS2的出口洗脱纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物)之间经过的时间可以是例如约4小时与约48小时之间(包括端点)。
一些示例性系统不包括断流罐。在其他情况下，系统可以在整个系统中包括最多1、2、3、4或5个断流罐(例如，其中每个断流罐仅保持治疗性蛋白总共例如约5分钟与约6小时之间的时间段(包括端点))。一个或多个断流罐的容量可以是1mL与约300mL之间(包括端点))。任何一个或多个如下断流罐的容量可以是1mL与MCCS1或MCCS各自的第一柱的装载体积的约100％之间(包括端点)，所述断流罐布置在系统中以使得流体在进入MCCS1或MCCS之前进入所述一个或多个断流罐。任何一个或多个如下断流罐的容量可以是例如1mL与MCCS2的第一柱的装载体积的约100％之间(包括端点)，所述断流罐布置在系统中以使得流体在进入MCCS2之前(并且在离开MCCS1之后)进入所述一个或多个断流罐。
其他示例性系统结构和特征
MCCS或MCCS1可以包括入口，流体(例如，基本上不含细胞的液体培养基)可以通过该入口分别进入MCCS或MCCS1。该入口可以是本领域已知的用于此类目的的任何结构。其可以包括，例如，允许插入流体导管的螺纹、肋材或密封件，以使得在将流体导管插到入口中之后，流体将通过入口进入MCCS或MCCS1而没有大量流体从入口渗出。可以用于本系统的非限制性入口是业内本领域技术人员所已知并且将理解的。
MCCS或MCCS1可以包括至少两个层析柱、至少两个层析膜或至少一个层析柱和至少一个层析膜以及入口。MCCS或MCCS1可以是本文所述的任何示例性MCCS，或者具有本文所述MCCS的任何示例性特征(任何组合)中的一种或多种。存在于MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以具有任何以下项中的一种或多种：本文所述的示例性形状、尺寸、体积(床体积)和/或一个或多个单元操作。
存在于MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以包含本文所述或业内已知的任何示例性树脂中的一种或多种。例如，包含在存在于MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜中的树脂可以是利用捕获机制(例如，蛋白A结合捕获机制、蛋白G结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、底物结合捕获机制、辅因子结合捕获机制、适体结合捕获机制和/或标签结合捕获机制)的树脂。包含在MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜中的树脂可以是阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、分子筛树脂或疏水相互作用树脂或其任意组合。可以用于纯化重组蛋白的树脂的其他例子是业内已知的，并且可以包含在存在于MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜中。存在于MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以包含相同和/或不同的树脂(例如，本文所述或业内已知用于重组蛋白纯化的任何树脂)。
存在于MCCS或MCCS1中的两个或更多个层析柱和/或层析树脂可以执行一个或多个单元操作(例如，捕获重组蛋白、纯化重组蛋白、精制重组蛋白、灭活病毒、调节含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH或过滤含重组蛋白的流体)。在非限制性例子中，MCCS或MCCS1可以执行从流体(例如，液体培养基)捕获重组蛋白并灭活存在于含重组蛋白的流体中的病毒的单元操作。MCCS或MCCS1可以执行本文所述或业内已知的两个或更多个单元操作的任何组合。
存在于MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以通过切换机制(例如，柱切换机制)相对于彼此连接或移动。MCCS或MCCS1还可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)泵(例如，自动，例如自动蠕动泵)。柱切换事件可以通过侦检通过UV吸亮度侦检的重组蛋白水平来触发，所述UV吸亮度对应于通过MCCS或MCCS1的流体(例如，MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜中的输入液和/或洗脱物)中重组蛋白的某个水平、液体(例如，缓冲液)的特定体积或特定的经过时间。柱切换通常意指允许MCCS或MCCS1中的至少两个不同层析柱和/或层析膜(例如存在于MCCS1或MCCS2中的两个或更多个不同层析柱和/或层析膜)在方法的至少部分期间基本上同时地通过不同步骤(例如，平衡、装载、洗脱或洗涤)的机制。
MCCS或MCCS1可以是周期性逆流层析系统(PCCS)。例如，作为MCCS或MCCS1的PCCS(即，分别是PCCS或PCCS1)可以包括四个层析柱，其中前三个柱执行从流体(例如，液体培养基)捕获重组蛋白的单元操作，并且PCCS的第四柱执行灭活含重组蛋白的流体中的病毒的单元操作。作为MCCS或MCCS1的PCCS可以利用柱切换机制。PCC系统可以利用能够运行多至例如四个、五个、六个、七个或八个柱、或者更多柱的改良的
系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
MCCS或MCCS1可以配备有：一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV监视器、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)阀、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、或十个)pH计和/或一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)电导率计。MCCS或MCCS1还可以配备有利用软件(例如，基于Unicorn的软件，GE Healthcare,Piscataway,NJ)来感测何时应进行柱切换(例如，基于UV吸亮度、液体体积或经过的时间)并影响(触发)柱切换事件的操作系统。
MCCS或MCCS1还可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个)在线缓冲液调节储器和/或缓冲液储器。在其他例子中，MCCS或MCCS1可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)断流罐，所述断流罐可以保持不能容易地进入MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜中的流体。本文所述的系统可以在MCCS、MCCS1和/或MCCS2中包括一个或多个断流罐(例如，本文所述的断流罐)。本文所述的系统的其他例子在MCCS、MCCS1或MCCS2中包括断流罐，或不在整个系统中包括断流罐。本文所述系统的其他例子在整个系统中包括最多一个、两个、三个、四个或五个断流罐(例如，本文所述的任何一个或多个断流罐)。
第二MCCS
示例性系统中的第二MCCS(MCCS2)包括至少两个层析柱、至少两个层析膜或者至少一个层析柱和至少一个层析膜以及出口。MCCS2可以是本文所述的任何示例性MCCS，或者可以具有本文所述的MCCS(任何组合)的任何示例性特征中的一个或多个。存在于MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以具有以下的一种或多种：本文所述的形状、尺寸、体积(床体积)和/或单元操作中的任一种。一个或多个层析柱和/或层析膜可以包含本文所述或业内已知的任何示例性树脂。例如，包含在存在于MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜中的树脂可以是利用捕获机制(例如，蛋白A结合捕获机制、蛋白G结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、底物结合捕获机制、辅因子结合捕获机制、标签结合捕获机制和/或适体结合捕获机制)的树脂。有用的树脂包括，例如，阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、分子筛树脂和疏水相互作用树脂。树脂的其他例子是业内已知的。存在于MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以包含相同和/或不同的树脂(例如，本文所述或业内已知用于重组蛋白纯化的任何树脂)。
存在于MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以执行一个或多个单元操作(例如，本文所述的任何单元操作或本文所述的单元操作的任何组合)。在非限制性例子中，MCCS2可以执行从流体纯化重组蛋白并且精制含重组蛋白的流体中存在的重组蛋白的单元操作。在其他非限制性例子中，MCCS2可以执行纯化流体中存在的重组蛋白、精制流体中存在的重组蛋白和过滤含重组蛋白的流体的单元操作。在另一个例子中，MCCS2可以执行纯化流体中存在的重组蛋白、精制流体中存在的重组蛋白、过滤含重组蛋白的流体以及调节含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH的单元操作。MCCS2可以执行本文所述或业内已知的两个或更多个单元操作的任何组合。
存在于MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜可以通过切换机制(例如，柱切换机制)相对于彼此连接或移动。MCCS2还可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)泵(例如，自动，例如自动蠕动泵)。柱切换事件可以通过侦检通过UV吸亮度侦检的重组蛋白水平来触发，所述UV吸亮度对应于通过MCCS2的流体(例如，MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜中的输入液和/或洗脱物)中重组蛋白的某个水平、液体(例如，缓冲液)的特定体积或特定的经过时间。
MCCS2可以是周期性逆流层析系统(即PCCS2)。例如，PCCS2可包括三个柱，其执行从流体中纯化重组蛋白的单元操作，和层析膜，其执行精制流体中存在的重组蛋白的单元操作。例如，执行从流体纯化重组蛋白的单元操作的三个柱可以包含例如阳离子交换树脂，并且执行精制的单元操作的层析膜可以包含阳离子交换树脂。PCCS2可以利用柱切换机制。PCCS2可以利用能够运行多至例如四个、五个、六个、七个或八个柱、或者更多柱的改良的
系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
MCCS2可以配备有：一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV监视器、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)阀、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、或十个)pH计和/或一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)电导率计。MCCS2还可以配备有利用软件(例如，基于Unicorn的软件，GE Healthcare,Piscataway,NJ)来感测何时应进行柱切换事件(例如，基于UV吸亮度、液体体积或经过的时间)并影响柱切换事件的操作系统。
MCCS2还可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个)在线缓冲液调节储器和/或缓冲液储器。在其他例子中，MCCS2可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)断流罐(例如，本文所述的任何断流罐)，所述断流罐可以保持不能容易地进入MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜中的流体。
MCCS2包括出口，治疗性蛋白药物可以通过所述出口离开系统。出口可以包括，例如，允许插入流体导管的螺纹、肋材或密封件，或设计用于保持或储存纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物)的小瓶。出口可以包括可用于将生物负载减少的小瓶或其他此类储存容器密封到出口上的表面，以允许纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物)直接流入生物负载减少的小瓶或储存容器中。可以用于本发明系统的非限制性出口是业内本领域技术人员所已知并且将理解的。
本文所述的系统还可以包括布置在MCCS1与MCCS2之间的流体导管。本文所述的任何流体导管可以是例如由例如聚乙烯、聚碳酸酯或塑料制成的管。布置在MCCS1与MCCS2之间的流体导管还可以包括以下中任何组合形式的一个或多个：一个或多个在线缓冲液调节储器，其与流体导管处于流体连通并且被定位为使得储存在一个或多个在线缓冲液调节储器中的缓冲液被添加到存在于流体导管中的流体中；断流罐(例如，本文所述的一个或多个断流罐中的任一个)，其与流体导管流体连通并且被定位为使得其可以保持存在于流体导管中不能容易地馈送到MCCS2的任何多余流体；以及一个或多个过滤器，其被布置于流体导管中使得其能够过滤(例如，去除细菌)存在于流体导管中的流体。任何在线缓冲液调节储器可以包含例如体积是约0.5L至50L之间的缓冲液(例如，在25℃、15℃或10℃或低于25℃、15℃或10℃的温度下)。
本文所述的系统可以任选地包括布置在MCCS2中的最终层析柱或层析膜与出口之间的流体导管。本文所述的系统还可以包括一个或多个过滤器，其与布置在MCCS2中的最终层析柱或层析膜与出口之间的流体导管是流体连接的，使得过滤器可以去除例如沉淀材料、颗粒物或者来自存在于流体导管中的流体中的细菌，该流体导管布置在MCCS2中的最终层析柱或层析膜与出口之间。
本文提供的系统的一些例子还包括与MCCS或MCCS1的入口为流体连接的生物反应器。本文所述或业内已知的任何示例性生物反应器都可以用于本发明的系统中。
本文提供的系统的一些例子还包括泵系统。泵系统可以包括以下中的一个或多个：一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)泵(例如，本文所述或业内已知的任何泵)，一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)过滤器(例如，本文所述或业内已知的任何过滤器)，一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV侦检器，以及一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)断流罐(例如，本文所述的任何断流罐)。本文提供的系统的一些例子还包括布置在泵与MCCS或MCCS1的入口之间的流体导管(例如，本文所述或业内已知的任何示例性流体导管)。在一些例子中，该特定流体导管可以包括一个或多个(例如，两个、三个或四个)泵(例如，本文所述或业内已知的任何泵)和/或一个或多个(例如，两个、三个或四个)断流罐(例如，本文所述的任何示例性断流罐)，其中这些泵和/或断流罐与存在于流体导管中的流体是流体连接的。
本文所述的系统的一些例子还包括连接到泵与入口之间的流体导管的另一个流体导管，其中另一个流体导管的一端流体连接到生物反应器，并且另一端流体连接到泵与入口之间的流体导管。该另一个流体导管可以包括过滤器，该过滤器能够从取自生物反应器(例如，ATF细胞保留系统)的液体培养基中去除细胞。
本文提供的系统允许连续产生纯化的重组蛋白(例如治疗性蛋白药物)。如业内所已知，所述系统可以提供纯化的重组蛋白(例如治疗性蛋白药物物质)的周期性洗脱。本文所述的系统还可以经至少约5天、至少约10天、至少约15天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、至少约50天、至少约60天、至少约70天、至少约80天、至少约90天或至少约100天的连续时间段产生纯化重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物)的如下净产量：至少约5克/天、至少约10克/天、至少约15克/天、至少约20克/天、至少约30克/天或至少约40克/天。
减少层析树脂生物负载的方法，所述方法包括使用基本上干燥的层析树脂
本文还提供了减少层析树脂的生物负载的方法，所述方法包括(a)将包含基本上干燥的层析树脂的容器暴露于足以减少所述容器和所述层析树脂的生物负载的剂量的γ-照射，其中基本上干燥的层析树脂包含含至少一种醇的液体，其中至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。这些方法的一些实施方案还包括在步骤(a)之前干燥层析树脂以基本上从层析树脂去除液体(但不是所有液体)。可以使用热处理(例如烘箱)或干燥器执行层析树脂的干燥。用于干燥层析树脂的其他方法是业内已知的。
本文所述γ-照射的条件和剂量中的任一种都可以用于这些方法中。例如，γ-照射的剂量可以是约15kGy至约45kGy之间(例如，约20kGy至约30kGy之间)。本文所述的容器、层析树脂和含至少一种醇的液体中的任一种都可以用于这些方法中。例如，容器可以是储存器皿或层析柱。这些方法中的层析树脂可以包含蛋白质配位体(例如，蛋白A或蛋白G)。在一些例子中，层析树脂可以包括阴离子交换层析树脂(例如，包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的层析树脂)。在一些例子中，层析树脂共价附接到制品(例如，芯片、膜或盒)的表面。在一些实施方案中，基本上干燥的层析树脂不含显著量的抗氧化剂或显著量的螯合剂。还提供了通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的层析树脂。
在一些例子中，所生产的生物负载减少的层析树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x10-8至约1x 10-5之间(例如，SAL为约1x 10-7至约1x 10-6之间)。所生产的生物负载减少的层析树脂可以包括选自以下的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。在一些例子中，所生产的生物负载减少的层析树脂包括包含蛋白质配位体(例如蛋白A)的亲和层析树脂。在一些例子中，所生产的生物负载减少的层析树脂包括阴离子交换层析树脂(例如，包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。还提供了制备生物负载减少的填充层析柱的方法，所述方法包括提供通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的层析树脂；和在无菌环境中将层析树脂填充到生物负载减少的柱中。还提供了通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的层析柱。
本文还提供了用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法，所述方法包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；和(b)将液体培养基连续馈送到包含至少一个通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的填充层析柱的多柱层析系统(MCCS)中；其中所述方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从液体培养基连续运行至来自MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白。本文还提供了用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法，所述方法包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；(b)将液体培养基连续馈送到第一多柱层析系统(MCCS1)中；(c)使用MCCS1捕获液体培养基中的重组蛋白；(d)从MCCS1产生包含重组蛋白的洗脱物，并将洗脱物连续馈送到第二多柱层析系统(MCCS2)中；(e)将来自洗脱物的重组蛋白连续馈送到MCCS2中，并且随后洗脱重组蛋白，从而产生纯化的重组蛋白，其中：所述方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从液体培养基连续运行至纯化的重组蛋白，并且MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱含有通过本文所述的任何方法生产的生物负载减少的填充层析柱。本文所述的用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法的任何示例性方面可以用于这些方法中。
生产生物负载减少的膜、树脂、涂布材料、芯片和盒的方法
本文还提供了用于生产生物负载减少的膜、树脂、涂布材料、芯片或盒的方法，所述方法包括：将包含含有(i)膜、树脂、涂布材料、芯片或盒(例如，纤维素、琼脂糖或糖基膜、树脂、涂布材料、芯片或盒)；和(ii)含至少一种醇(例如，和任选地，至少一种抗氧化剂和/或螯合剂)的液体的组合物的容器暴露于足以减少所述容器和膜、树脂、涂布材料、芯片或盒的生物负载的剂量的γ-照射，其中所述至少一种醇的存在量足以改善在暴露于所述剂量的γ-照射之后对所述膜、树脂、涂布材料、芯片或盒的损害。在一些例子中，盒是含有树脂的盒(例如，本文所述或业内已知的任何示例性树脂)。在一些实施方案中，膜、树脂、涂布材料、芯片或盒包含共价附接于其表面的至少一个或一部分的蛋白A或蛋白G配位体。在一些实施方案中，组合物包含膜、树脂、涂布材料、芯片或盒以及含至少醇(例如，和任选地，至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂)的液体。本文所述的醇、一种或多种抗氧化剂和/或一种或多种螯合剂的任何示例性组合和浓度均可用于这些方法中的任一种中。本文所述的任何示例性液体均可用于这些方法中的任一种中。在一些实施方案中，组合物是润湿或潮湿的干燥材料。本文还提供了使用本文所述的任何方法生产的生物负载减少的膜、树脂、涂布材料、芯片或盒。在一些例子中，容器是密封的储存容器或器皿。
本文还提供了用于生产生物负载减少的膜、树脂、涂布材料、芯片和盒的方法，所述方法包括：将包含基本上干燥的膜、树脂、涂布材料、芯片或盒(例如，纤维素、琼脂糖或糖基膜、树脂、涂布材料、芯片或盒)的容器暴露于足以减少所述容器和膜、树脂、涂布材料、芯片或盒的生物负载的剂量的γ-照射。一些例子还包括在暴露步骤之前干燥膜、树脂、涂布材料、芯片或盒的步骤。在一些实施方案中，膜、树脂、涂布材料、芯片或盒包含共价附接于其表面的蛋白A或蛋白G配位体。在一些例子中，盒是含有树脂的盒(例如，本文所述或业内已知的任何示例性树脂)。本文还提供了使用本文所述的任何方法生产的生物负载减少的膜、树脂、涂布材料、芯片或盒。
在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例
实施例1.醇对γ-照射的亲和层析树脂的保护作用
在第一组实验中，将MabSelectTM SuReTM(蛋白A亲和层析树脂)在三种不同缓冲液中以40-49kGy的剂量以标准给予速率照射：
(1)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸、25mM甘露糖醇(40-49kGy照射，给予速率>7.5kGy/小时)；
(2)2v/v％苯甲醇(40-49kGy照射，给予速率>7.5kGy/小时)；以及
(3)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸、25mM甘露糖醇、2％苯甲醇(40-49kGy，>7.5kGy/小时的更高给予速率)。
照射后，将层析树脂填充到单独的层析柱中，并使用细胞培养物收获物和6分钟的停留时间进行循环。记录经照射树脂的通过物结合能力，并与初始(未照射)MabSelectTMSuReTM(蛋白A层析)树脂比较。
该实验显示的数据如图1所示。
图1中的数据显示缓冲液(3)提供缓冲液(1)和(2)两者的组合保持结合能力的累加作用。在这种情况下，缓冲液中的2v/v％苯甲醇用作防腐剂，并且当与缓冲液(1)组合时，还提供一些保护特性。
表1显示，所测量的所有产物质量属性并非十分显著地基于缓冲液(1)-(3)的使用，并且与初始(未照射)MabSelectTM SuReTM(蛋白A层析树脂)的预期值类似。
表1.
该数据显示，在含醇(例如苯甲醇)的液体中照射层析树脂可以保护树脂免于随后在多个层析循环中损失结合能力。
实施例2.醇对γ-照射的CaptoTM Adhere层析树脂的保护作用
将GE CaptoTM adhere(具有多模态功能性的阴离子交换层析树脂)在三种不同缓冲液中以28-49kGy的剂量以标准给予速率进行γ-照射：
(A)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸和25mM甘露糖醇(28-34kGy，给予速率是2-3kGy/小时)；
(B)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸、25mM甘露糖醇(40-49kGy，给予速率>7.5kGy/小时)；以及
(C)50mM磷酸钠缓冲液中的25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM组氨酸、25mM甘露糖醇、2v/v％苯甲醇(40-49kGy，>7.5kGy/小时的更高给予速率)。
照射后，将层析树脂填充到单独的层析柱中，并使用细胞培养物收获物和6分钟的停留时间进行循环。记录经照射树脂的通过物结合能力，并与初始(未照射)GE CaptoTMadhere(具有多模态功能的阴离子交换层析树脂)比较。
该实验的数据如图2所示。图2中的数据显示，当在苯甲醇存在下照射树脂时，没有观察到结合能力的明显变化，并且苯甲醇的存在提供了延长γ照射之前的储存时间的益处。
下表2显示在苯甲醇存在下照射树脂不会对树脂在蛋白质纯化中的性能的其他质量属性产生任何明显的影响。
表2.
其他实施方案
应理解，虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
Claims (102)
1.一种减少层析树脂的生物负载的方法，所述方法包括：
将包含含有(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体的组合物的容器暴露于足以减少所述容器和所述层析树脂的生物负载的剂量的γ-照射，其中所述至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
2.如权利要求1的方法，所述方法还包括在暴露之前将所述组合物布置于所述容器中。
3.如权利要求1的方法，其中所述容器是储存器皿。
4.如权利要求1的方法，其中所述容器是层析柱。
5.如权利要求1的方法，其中所述容器是填充层析柱。
6.如权利要求1的方法，其中所述组合物是沉降的层析树脂的浆液。
7.如权利要求1的方法，其中所述组合物是润湿的固体混合物。
8.如权利要求1-7中任一项的方法，其中所述至少一种醇选自：苯甲醇、环己醇、异丁醇、2-甲基-2-丁醇、甲醇、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、丁-1-醇、戊-1-醇、十六烷-1-醇、2-苯基乙醇、仲苯基乙醇、3-苯基-1-丙醇、1-苯基-1-丙醇、2-苯基-1-丙醇、2-苯基-2-丙醇、1-苯基-2-丁醇、2-苯基-1-丁醇、3-苯基-1-丁醇、4-苯基-2-丁醇、dl-1-苯基-2-戊醇、5-苯基-1-戊醇和4-苯基-1-丁醇。
9.如权利要求8的方法，其中所述至少一种醇包括苯甲醇。
10.如权利要求1-9中任一项的方法，其中所述液体中一种或多种醇的总和浓度为约0.01v/v％至约10v/v％。
11.如权利要求1-10中任一项的方法，其中所述液体还包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂。
12.如权利要求11的方法，其中所述液体包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂，其量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
13.如权利要求11或12的方法，其中所述液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑激素、西红柿红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、酚丙酸、利多卡因、柚皮素、富勒烯、葡萄糖、甘露糖醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基呱啶-1-氧基和二甲基甲氧基色原烷醇。
14.如权利要求13的方法，其中所述液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
15.如权利要求14的方法，其中所述液体包含甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
16.如权利要求11或12的方法，其中所述液体包含：
(i)75mM与约125mM之间的甘露糖醇；
(ii)75mM与约125mM之间的甲硫氨酸；
(iii)75mM与约125mM之间的抗坏血酸钠；
(iv)75mM与约125mM之间的组氨酸；
(v)30mM与约70mM之间的甲硫氨酸和约30mM与约70mM之间的组氨酸；
(vi)约10mM与约50mM之间的甲硫氨酸、约10mM与约50mM之间的组氨酸和约10mM与约50mM之间的抗坏血酸钠；或
(vii)约5mM与约45mM之间的抗坏血酸钠、约5mM与约45mM之间的甲硫氨酸、约5mM与约45mM之间的甘露糖醇和约5mM与约45mM之间的组氨酸。
17.如权利要求1-16中任一项的方法，其中所述液体是缓冲溶液。
18.如权利要求11或12的方法，其中所述液体包含至少一种选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基丁二酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺。
19.如权利要求1-18中任一项的方法，其中所述层析树脂选自阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
20.如权利要求19的方法，其中所述组合物包含含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
21.如权利要求20的方法，其中所述蛋白质配位体是蛋白A。
22.如权利要求19的方法，其中所述组合物包含阴离子交换层析树脂。
23.如权利要求22的方法，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
24.如权利要求1-23中任一项的方法，其中所述剂量为约15kGy与约45kGy之间。
25.如权利要求24的方法，其中所述剂量为约20kGy与约30kGy之间。
26.如权利要求25的方法，其中所述剂量为约23kGy与约27kGy之间。
27.如权利要求1-26中任一项的方法，其中暴露是在如下温度下执行：约-25℃与约0℃之间，包括端点。
28.如权利要求1-26中任一项的方法，其中暴露是在如下温度下执行：约0℃与约25℃之间，包括端点。
29.一种生物负载减少的层析树脂，其通过如权利要求3的方法生产。
30.如权利要求29的生物负载减少的层析树脂，其中所述树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x10-8与约1x10-5之间。
31.如权利要求30的生物负载减少的层析树脂，其中所述树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x10-7与约1x10-6之间。
32.如权利要求29-31中任一项的生物负载减少的层析树脂，其中所述层析树脂包含至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
33.如权利要求32的生物负载减少的层析树脂，其中所述层析树脂包含含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
34.如权利要求33的生物负载减少的层析树脂，其中所述蛋白质配位体是蛋白A。
35.如权利要求32的生物负载减少的层析树脂，其中所述层析树脂包含阴离子交换层析树脂。
36.如权利要求35的生物负载减少的层析树脂，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
37.一种制备生物负载减少的填充层析柱的方法，所述方法包括：
提供如权利要求29的生物负载减少的层析树脂；和
在无菌环境中将所述层析树脂填充到生物负载减少的柱中。
38.一种生物负载减少的填充层析柱，其通过如权利要求37的方法生产。
39.一种生物负载减少的填充层析柱，其通过如权利要求5的方法生产。
40.如权利要求39的生物负载减少的填充层析柱，其中所述填充柱中的树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x10-8与约1x10-5之间。
41.如权利要求40的生物负载减少的填充层析柱，其中所述树脂的灭菌保证水平(SAL)为约1x10-7与约1x10-6之间。
42.如权利要求39-41中任一项的生物负载减少的填充层析柱，其中所述填充柱中的树脂包含至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
43.如权利要求42的生物负载减少的填充层析柱，其中所述树脂包含含有蛋白质配位体的亲和或假亲和层析树脂。
44.如权利要求43的生物负载减少的填充层析柱，其中所述配位体是蛋白A。
45.如权利要求42的生物负载减少的填充层析柱，其中所述树脂包含阴离子交换层析树脂。
46.如权利要求45的生物负载减少的填充层析柱，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
47.一种组合物，其包含(i)层析树脂和(ii)含至少一种醇的液体，其中所述至少一种醇的存在量足以改善所述层析树脂在用足以减少所述组合物的生物负载的剂量的γ-照射处理时结合能力的损失。
48.如权利要求47的组合物，其中所述组合物是沉降的层析树脂的浆液。
49.如权利要求47的组合物，其中所述组合物是润湿的固体混合物。
50.如权利要求47-49中任一项的组合物，其中所述至少一种醇选自：苯甲醇、环己醇、异丁醇、2-甲基-2-丁醇、甲醇、乙醇、丙-2-醇、丙-1-醇、丁-1-醇、戊-1-醇、十六烷-1-醇、2-苯基乙醇、仲苯基乙醇、3-苯基-1-丙醇、1-苯基-1-丙醇、2-苯基-1-丙醇、2-苯基-2-丙醇、1-苯基-2-丁醇、2-苯基-1-丁醇、3-苯基-1-丁醇、4-苯基-2-丁醇、dl-1-苯基-2-戊醇、5-苯基-1-戊醇和4-苯基-1-丁醇。
51.如权利要求50的组合物，其中所述至少一种醇包含苯甲醇。
52.如权利要求47-51中任一项的组合物，其中所述液体中一种或多种醇的总和浓度为约0.01v/v％至约10v/v％。
53.如权利要求47-52中任一项的组合物，其中所述液体还包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂。
54.如权利要求53的组合物，其中所述液体还包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂，其量足以改善所述层析树脂在暴露于所述剂量的γ-照射之后结合能力的损失。
55.如权利要求53或54的组合物，其中所述液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑激素、西红柿红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、酚丙酸、利多卡因、柚皮素、富勒烯、葡萄糖、甘露糖醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基呱啶-1-氧基和二甲基甲氧基色原烷醇。
56.如权利要求55的组合物，其中所述液体包含至少一种选自以下的抗氧化剂：甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
57.如权利要求56的组合物，其中所述液体包含甘露糖醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
58.如权利要求53或54的组合物，其中所述液体包含：
(i)75mM与约125mM之间的甘露糖醇；
(ii)75mM与约125mM之间的甲硫氨酸；
(iii)75mM与约125mM之间的抗坏血酸钠；
(iv)75mM与约125mM之间的组氨酸；
(v)30mM与约70mM之间的甲硫氨酸和约30mM与约70mM之间的组氨酸；
(vi)约10mM与约50mM之间的甲硫氨酸、约10mM与约50mM之间的组氨酸和约10mM与约50mM之间的抗坏血酸钠；或
(vii)约5mM与约45mM之间的抗坏血酸钠、约5mM与约45mM之间的甲硫氨酸、约5mM与约45mM之间的甘露糖醇和约5mM与约45mM之间的组氨酸。
59.如权利要求47-58中任一项的组合物，其中所述液体是缓冲溶液。
60.如权利要求53或54的组合物，其中所述组合物包含至少一种选自以下的螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基丁二酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺。
61.如权利要求47-60中任一项的组合物，其中所述层析树脂包含至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
62.如权利要求61的组合物，其中所述树脂包含含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
63.如权利要求62的组合物，其中所述蛋白质配位体是蛋白A。
64.一种执行生物负载减少的柱层析的方法，所述方法包括：
(a)提供如权利要求38或39的生物负载减少的填充层析柱；和
(b)在封闭的系统中使用所述生物负载减少的填充层析柱和生物负载减少的缓冲液进行柱层析。
65.如权利要求64的方法，其中使用所述生物负载减少的填充层析柱连续执行生物负载减少的柱层析持续至少4天的时间段。
66.如权利要求65的方法，其中使用所述生物负载减少的填充层析柱连续执行生物负载减少的柱层析持续至少5天的时间段。
67.如权利要求66的方法，其中使用所述生物负载减少的填充层析柱连续执行所述生物负载减少的柱层析持续至少7天的时间段。
68.如权利要求67的方法，其中使用所述生物负载减少的填充层析柱连续执行所述生物负载减少的柱层析持续至少14天的时间段。
69.如权利要求68的方法，其中使用所述生物负载减少的填充层析柱连续执行所述生物负载减少的柱层析持续至少28天的时间段。
70.如权利要求64的方法，其中与未用γ-照射处理的相同树脂相比，(a)中所述生物负载减少的填充层析柱中的树脂具有约75％与约100％之间的结合能力百分比。
71.如权利要求64的方法，其中所述生物负载减少的填充层析柱中的树脂包含至少一种选自以下的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
72.如权利要求71的方法，其中所述树脂包含含有蛋白质配位体的亲和层析树脂。
73.如权利要求72的方法，其中所述蛋白质配位体是蛋白A。
74.如权利要求71的方法，其中所述树脂包含阴离子交换层析树脂。
75.一种用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法，所述方法包括：
(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；和
(b)将所述液体培养基连续馈送到包含至少一个如权利要求38或39的生物负载减少的填充层析柱的多柱层析系统(MCCS)中；
其中所述方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从所述液体培养基连续运行至来自所述MCCS的洗脱物，所述洗脱物是所述纯化的重组蛋白。
76.如权利要求75的方法，其中所述MCCS执行至少两个不同的单元操作。
77.如权利要求75的方法，其中所述方法包括柱切换。
78.如权利要求75的方法，其中所述MCCS执行捕获所述重组蛋白和灭活病毒的单元操作。
79.如权利要求75的方法，其中所述MCCS执行捕获和纯化所述重组蛋白的单元操作。
80.如权利要求75的方法，其中所述MCCS包含至少两个生物负载减少的填充层析柱。
81.如权利要求75的方法，其中所述MCCS是周期性逆流层析系统。
82.如权利要求75的方法，其中所述MCCS包括用于亲和或假亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合的多个柱。
83.如权利要求82的方法，其中所述MCCS包括用于亲和层析的柱，并且在所述方法中用选自以下的捕获机制执行亲和层析：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
84.如权利要求83的方法，其中在所述方法中用蛋白A结合捕获机制执行所述亲和层析，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
85.一种用于以减少生物负载的方式制造纯化的重组蛋白的整合、封闭且连续的方法，所述方法包括：
(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；
(b)将所述液体培养基连续馈送到第一多柱层析系统(MCCS1)中；
(c)使用所述MCCS1捕获所述液体培养基中的重组蛋白；
(d)从所述MCCS1产生包含所述重组蛋白的洗脱物，并将所述洗脱物连续馈送到第二多柱层析系统(MCCS2)中；
(e)将来自所述洗脱物的重组蛋白连续馈送到所述MCCS2中，并且随后洗脱所述重组蛋白，从而产生所述纯化的重组蛋白，其中：
所述方法利用生物负载减少的缓冲液，是整合的，并且从所述液体培养基连续运行至所述纯化的重组蛋白，并且
所述MCCS1和/或所述MCCS2中的至少一个柱含有如权利要求38或39的生物负载减少的填充层析柱。
86.如权利要求85的方法，其中所述MCCS1和/或所述MCCS2执行至少两个不同的单元操作。
87.如权利要求85的方法，其中所述方法涉及柱切换。
88.如权利要求85的方法，其中所述MCCS1执行捕获所述重组治疗性蛋白和灭活病毒的单元操作。
89.如权利要求85的方法，其中所述MCCS2执行纯化和精制所述重组蛋白的单元操作。
90.如权利要求85的方法，其中所述MCCS1和/或MCCS2包含至少两个层析柱。
91.如权利要求85的方法，其中所述MCCS1是第一周期性逆流层析系统(PCCS1)。
92.如权利要求85的方法，其中使用亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合执行所述捕获。
93.如权利要求92的方法，其中用选自以下的捕获机制执行所述亲和层析：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
94.如权利要求93的方法，其中用蛋白A结合捕获机制执行所述亲和层析，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
95.如权利要求85的方法，其中所述MCCS2是第二周期性逆流(PCCS2)层析系统。
96.如权利要求75或85的方法，其中所述重组蛋白是治疗性重组蛋白。
97.如权利要求96的方法，所述方法还包括：将所述纯化的治疗性重组蛋白配制成医药组合物。
98.如权利要求75或85的方法，其中连续执行所述方法持续至少4天的时间段。
99.如权利要求98的方法，其中连续执行所述方法持续至少5天的时间段。
100.如权利要求99的方法，其中连续执行所述方法持续至少7天的时间段。
101.如权利要求100的方法，其中连续执行所述方法持续至少14天的时间段。
102.如权利要求101的方法，其中连续执行所述方法持续至少28天的时间段。
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