DE69507123T2

DE69507123T2 - Prophylaktische verbindungen gegen aids und sle

Info

Publication number: DE69507123T2
Application number: DE69507123T
Authority: DE
Inventors: Rupert Donald London Holms
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 1999-05-27
Anticipated expiration: 2015-06-03
Also published as: GB2290293A; CA2168268C; NZ287510A; AU689266B2; US5773573A; CA2168268A1; WO1995033768A1; AU2624495A; ES2126899T3; EP0719282A1; GB9411534D0; DK0719282T3; RU2127599C1; GR3029425T3; DE69507123D1; ATE175423T1; EP0719282B1

Description

Die Erfindung betrifft die Prävention und die Behandlung des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS), von systemischem Lupus Erythematosus (SLE) und verwandten Krankheiten.
Während der letzten fünfzehn Jahre wurden wesentliche internationale Forschungsanstrengungen auf die Entwicklung wirksamer Vakzine und Therapien gegen AIDS gerichtet, die aber bisher nur sehr beschränkten Erfolg gezeigt haben. AIDS ist eine Krankheit, die durch eine chronische Infektion mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HTV) bewirkt wird. Weltweit sind zumindest 10 mio. Personen und zumindest 1 mio. Personen in den USA mit HIV infiziert. Es wird weithin anerkannt, daß AIDS durch HIV verursacht wird, aber auf welche Weise die HIV-Infektion zu AIDS führt, ist immer noch Gegenstand aktiver wissenschaftlicher Betätigung. Die aktuelle Forschung zur Entwicklung einer Vakzine zur Prävention von AIDS basiert auf dem Versuch, die Immunantwort gegenüber HIV zu steigern, wobei es aber bisher nicht gelungen ist, ein wirksames Produkt zu entwickeln. Es gibt mittlerweile viele tausend Publikationen, die Versuche zur Entwicklung von AIDS- Therapien und Vakzinen mit Hilfe einer Stimulierung des menschlichen Immunsystems beschreiben, um das Virus zu erkennen und zu zerstören. Das Hauptproblem scheint darin zu liegen, daß Antikörper und zytotoxische T- Zellantworten, die durch Prototypvakzine ausgelöst werden, keinen Erfolg beim Schutz gegen HIV-Infektionen oder gegen die Progression der AIDS-Krankheit aufgrund der schnellen Mutationsrate von HIV zeigen.
Eine gewisse Zahl an Substanzen ist zur Behandlung von AIDS entwickelt worden (hauptsächlich antivirale Substanzen mit einer dem 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT) - ähnlichen Wirkungsweisen), wobei aber keine Substanz sich als zur Prävention der Entwicklung von AIDS nach einer HIV-Infektion als geeignet erwiesen hat. Das Hauptproblem ist, daß HIV schnell mutiert; dies führt zu Veränderungen bei den viral-codierten Proteinen, die als Zielobjekt für antivirale Substanzen dienen, wobei sich dann eine Resistenz gegenüber diesen Substanzen schnell einstellt.
Systemischer Lupus Erythematosus (SLE) ist eine Krankheit, die normalerweise als von AIDS grundverschieden angesehen wird. SLE ist eine Autoimmunkrankheit und befällt im wesentlichen Frauen. Über eine halbe Million Frauen in den USA leiden unter schwachen bis schweren Formen von SLE. SLE ist eine Autoimmunkrankheit mit zahlreichen immunologischen Abnormalitäten, wie z. B. Lymphadenopathie, Hypergammaglobulinämie, Leukopänie, Ablagerungen von Antigen-Antikörper-Komplexen und Autoantikörpern, was zu chronischen allgemeinen Funktionsstörungen des Bindegewebes von schwacher bis schwerer Form führt, die durch Hautausschläge, Arthralgie, Arthritis, Anämie, Viszeralläsionen, neurologische Symptome, Fieber und andere Konstitutionssymptome gekennzeichnet sind. Die Symptome verändern sich in ihrer Intensität im Verlauf vieler Jahre. SLE wird normalerweise mit immunosuppressiven Substanzen behandelt, wobei die Substanzen von nichtsteroiden, anti-inflammatorischen Substanzen bis zu immunosuppressiven Steroiden reichen. Allerdings gibt es keine wirksame Behandlung. SLE könnte das Resultat einer Immunaktivierung, die durch ein Retrovirus ausgelöst ist, sein, aber bisher ist kein Retrovirus identifiziert worden, das sich als Ursache von SLE erwiesen hätte.
Ezrin, ein humanes Tubulin-bindendes Protein, wird im Cytoplasma von T-Zellen angetroffen und wird durch eine Tyrosinkinase während der T-Zellaktivierung phosphory liert. Ezrin, auch als P81, Cytovillin oder Villin-2 bekannt, ist ein Protein von 585 Aminosäuren. Die Homologie erstreckt sich über eine vorausgesagte α-helikale Region von Ezrin und ist der Phosphorylierungsstelle Tyrosin-353 benachbart. Ezrin ist Bestandteil einer Familie von verwandten Proteinen, die Ezrin, Radixin, Moesin und Merlin einschließt. Alle diese Proteine sind in dieser Region, die Ähnlichkeit mit gp120 zeigt, verwandt, wobei aber Ezrin die am stärksten signifikante Homologie mit 9/13 identischen Stellen, hat.
Obwohl Ezrin sich wie ein lösliches Protein in T-Zellen verhält, und diffus cytoplasmatisch zu sein scheint, wie durch Immunfluoreszenz-Markierung gezeigt, wird angenommen, daß die kritische Population von Ezrin jene ist, die mit dem submembranösen kortikalen Cytoskelett assoziiert ist (Egerton et al., J. Immunol. (1992) 149, 1847-52). Es könnte auch für die Autoimmunpathologie von AIDS wichtig sein, daß Ezrin auch an den mikrovillären Actin- Mikrofilamentkernen an der Bürstensaum des Intestinalepitheliums und ebenfalls in Neuronen lokalisiert nachgewiesen wird. Im Darmepithel ist Ezrin an Veränderungen in der Zellmembranmorphologie als Antwort auf Stimulationen beteiligt (Krieg und Hunter, J. Bio. Chem. (1992) 267, 19258-65).
Die WO-A-9205196 und Wo-A-9222572 offenbaren Peptide, die mit der Region (496-508) von gp120 verwandt sind. Sie können für die Prävention und die Therapie von AIDS verwendet werden, indem dagegen Toleranz induziert wird.
Die vorliegende Erfindung basiert darauf, daß selektiv gewisse Immunantworten gegenüber HIV vermindert werden, indem Peptide, die auf Humanproteinen, insbesondere Ezrin, basieren, verwendet werden, wodurch eine neue und nicht offensichtliche Lösung hinsichtlich des Problems der Prävention und der Behandlung von AIDS zur Verfügung gestellt wird. Eine Anzahl von Wissenschaftlern hat be schrieben, daß Autoimmunität mit einer HIV-Infektion einhergeht, aber sie haben nicht bestätigt, daß HIV- induzierte Autoimmunität unmittelbar AIDS verursacht. Die vorliegende Erfindung basiert auf meiner Entdeckung eines molekularen Mechanismus einer HIV-induzierten Autoimmunität, die zu AIDS führt, und stellt eine Verbindung zwischen der HIV-induzierten Krankheit und einer Autoimmunkrankheit, wie z. B. systemischem Lupus Erythematosus (SLE), her.
Genauer gesagt, besteht ein erfindungsgemäßes, neuartiges Peptid aus 14 bis 30 Aminosäuren und umfaßt die Aminosäuresequenz: ThrGluLysLysArgArgGluThrValGluArgGluLysGlu. Ein Peptid, das aus der gegebenen Aminosäuresequenz besteht, wird im folgenden als HEP1 beschrieben. Die neuartigen Peptide können als Vakzine formuliert werden und werden zur Prävention und zur Behandlung von AIDS, SLE und verwandten Störungen eingesetzt.
Die HIV-Sequenz (im folgenden "VHP1") ThrLysAlaLysArgArgValValGluArgGluLysArg ist an der Position 498 bis 510 (konservierte Region C4) am C-Terminus von HIV gp120 gelegen. Ich habe nachgewiesen, daß VHP1 70% Sequenzhomologie mit Ezrin hat, und zwar zwischen den Aminosäurepositionen 324-337 von Ezrin.
Ich habe die unerwartete Entdeckung gemacht, daß neun dieser vierzehn Aminosäuren identisch sind, wenn die HIV- Aminosäuresequenz zwischen den Positionen 498 und 510 von gp120 mit der humanen Aminosäuresequenz zwischen den Positionen 324 und 337 von Ezrin verglichen wird. Letztere entspricht der 14-Aminosäuresequenz von HEP1.
Ohne auf eine Theorie festgelegt zu sein, schlage ich vor, daß es einen positiven Selektionsmechanismus für Mutanten von HIV gibt, die die HIV-Sequenz VHP1 beibehalten. Diese Sequenz wird deshalb aufrechterhalten, weil sie, wenn sie durch gewisse MHC-Klasse-1-Moleküle (insbesondere MHC-Klasse-I-B8 und MHC-Klasse-I-B35) und die meisten MHC-Klasse-II-DR-Moleküle präsentiert wird, wichtig für die Induzierung großer Zahlen an aktivierten T-Zellen ist, in welchen die HIV-Infektion und - Replikation auftritt. Bedauerlicherweise gehen die aktivierten CD4+-T-Zellen unter oder werden nach einer VHP1- Aktivierung schnell abgetötet und eine Population von VHP1-aktivierten CD8+-T-Zellen erhöht das Maß an autoreaktiven Antworten. Möglicherweise führt die Kombination von beiden immunologischen Vorgängen zu AIDS.
Eine chronische HIV-Infektion führt zu beständiger Präsentation von VHP1, produziert durch HIV, und zu beständiger Stimulierung des Immunsystems. Obwohl die Gegenwart von aktivierten T-Zellen für die HIV-Replikation wesentlich ist, infiziert und tötet HIV nur einen geringen Anteil der VHP1-aktivierten T-Zellen. Die Mehrzahl der aktivierten T-Zellen geht als Folge einer VHP1- Überstimulierung unter oder wird durch negative Feedback- Mechanismen im Immunsystem, wobei autoreaktive T-Zellen beteiligt sind, zerstört. T-Zellen werden kontinuierlich durch den Körper produziert, um diese Verluste beim chronisch infizierten HIV-Patienten zu kompensieren, aber das Nettoresultat ist eine progressive Abnahme von CD4+-T- Zellen im Verlaufe einer gewissen Anzahl von Jahren.
Ich schlage auch vor, daß die beständige Präsentation von VHP-Peptid durch gewisse MHC-Klasse-I-Moleküle von HIV- infizierten Zellen die Toleranz des Wirtsimmunsystems gegenüber Eigenpeptiden, wie z. B. jene, die von Ezrin oder anderen HEPs, die auf aktivierten T- und B-Zellen präsentiert werden, durchbricht. Das allgemeine Aktivierungsniveau führt zu der Stimulierung von autoreaktiven cytotoxischen T-Zellen und einer chronischen B- Zellaktivierung, mit der Überproduktion eines Spektrums von Antikörpermolekülen, einschließlich autoreaktiver Antikörper. Ein Schlüsselschritt in der Aktivierung des Autoimmungeschehens in HIV-infizierten Individuen ist, die Stimulierung von autoreaktiven CD8+-Zellen, die kreuzreaktive T-Zell-Rezeptor-Moleküle (TCR) tragen, die sowohl VHP als auch HEP erkennen.
Die starke Ähnlichkeit zwischen fremdem VHP1 und eigenem HEP1, sobald sie durch gewisse MHC-Moleküle präsentiert werden, und die mögliche immunregulatorische Funktion von HEP1 im gesunden Immunsystem führt zu starkten stimulativen Signalen, die durch das Immunsystem während der HIV- Infektion übertragen werden. Die Verabreichung von HEP1 oberhalb der Schwelle für immunologische Toleranzinduktion blockiert wahrscheinlich die VHP1-vermittelte Aktivierung des Immunsystems durch HIV-infizierte T-Zellen. Das klinische Resultat der HEP1-Verabreichung, vorhergesagt nach dem obigen Modell der HIV-induzierten Autoimmunität, besteht in niedrigeren Immunaktivierungsniveaus, einer Erhöhung der CD4-T-Zellzahlen und einem Abfall im Ausmaß chronischer HIV-Infektion.
Beispielsweise aktiviert eine HIV-infizierte CD4+-Zelle andere CD4+- und CD8+-Zellen durch die Präsentierung von VHP auf MHC-Molekülen. Eine Minderheit von CD4+-ZeIlen, die durch dieses Geschehen aktiviert wird, wird dann durch HIV infiziert, während die Mehrzahl der CD4+-T- Zellen überstimuliert wird und untergeht. Einige der aktivierten CD8+-T-Zellen sind autoreaktiv und aktivieren einen Autoimmunprozeß, der aktivierte T-Zellen, die HEP exprimieren, abtötet oder supprimiert. Die Verabreichung von HEP1 blockiert den HIV-induzierten T-Zell- Aktivierungsprozeß und inhibiert die chronische HIV- Infektion.
Der bevorzugte Verabreichungsweg einer Vakzine nach dieser Erfindung ist oral, auch wenn es gleichermaßen möglich ist, die Toleranz durch subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung zu bewirken, durch Standardmethoden. Eine Peptidvakzine, die auf HEP1 basiert, kann verabreicht werden, um AIDS in HIV-infizierten Personen zu verhindern und zu behandeln, indem Tolerenz gegenüber VHP-Sequenzen induziert wird. Sie kann verabreicht werden, um SLE in Personen zu verhindern und zu behandeln, indem Toleranz gegenüber anderen HEP-Sequenzen induziert wird.
Die Peptide können synthetisiert werden, beispielsweise indem eine Festphasenmethode eingesetzt wird. Hierbei wird entweder die Boc- oder Fmoc-Chemie oder irgendein anderer praktikabler Weg zur Peptidsynthese, der dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese wohlbekannt ist, verwendet. Nach der Synthese werden die Peptide vom Harz getrennt (bei den Festphasenmethoden) und die Schutzgruppe unter Verwendung von Trifluoromethansulfonsäure oder Fluorwasserstoff oder anderen Agentien beseitigt. Die Peptide können durch Säulenchromatographie vom Salz befreit werden und durch HPLC gereinigt werden. Die Reinheit der Peptide kann durch "reverse-phase" HPLC oder durch automatisches Sequenzieren nachgewiesen werden. Ohne die möglichen Formulierungen einer Vakzine oder einer Therapie beschränken zu wollen, umfaßt die bevorzugte Zusammensetzung ein Peptid oder Peptide, entweder gelöst in einer sterilen pharmazeutischen Salzlösung oder in destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration zwischen 1 und 1000 mg/ml. Die Zubereitung wird für jede Verabreichung frisch hergestellt oder kann eingefroren für eine Dauer von bis zu 30 Tagen bei -20ºC aufbewahrt werden.
Die Induktion der immunologischen Toleranz durch orale Verabreichung oder subkutane Verabreichung von Peptidlösungen ist erfolgreich in zahlreichen Tierversuchen bestätigt worden. Die immunologische Toleranz, die durch die Peptide induziert wird, kann entweder durch die Induktion von T-Zellanergie (direkte Inhibierung) oder durch die Induktion von Suppressor-T-Zellpopulationen (indirekte Inhibierung) mit Hilfe der Peptide auftreten. Fachleute auf dem Gebiet der Induktion immunologischer Toleranz sind sich der Verfahren zur Toleranzinduktion in Tieren durch orale, subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung von kleinen Peptiden, die von kreuzreaktiven Antigenen abgeleitet sind, bewußt. Beispiele für derartige Verfahren sind durch Stephen et al. Immunol. Today (1990) 11, 396-399; Sayegh et al., PNAS USA (1992) 89, 7762-7766; Whitacre et al., J. Immunol. (1991) 147, 2155-2163; Araga et al., PNAS USA (1993) 90, 8747-8751; und Briner et al., PNAS USA (1993) 90, 7608- 7612 offenbart worden.
Zwei Faktoren sind für die Induktion der Toleranz wesentlich: eine hohe Dosierung des löslichen Peptidantigens und die Abwesenheit von irgendwelchen co-stimulatorischen Partikeln oder von Adjuvans. Im allgemeinen tritt die immunologische Aktivierung bei sehr viel geringeren Dosen von Peptidantigen als jener Schwellendosis auf, oberhalb welcher das Peptidantigen Toleranz oder Inhibierung von Immunantworten induziert (z. B. kann in einem Menschen eine sehr geringe Dosis, 10 ng eines kleinen Fremdpeptidantigens eine sehr starke Immunantwort auslösen, währenddessen 10 mg Dosis die Immunantwort inhibieren kann). Die Dosisbandbreite für die Induktion der Toleranz variiert zwischen Peptiden, aber die Menge oder Konzentration kann experimentell bestimmt werden. Subkutane Verabreichung von Peptiden ergibt Endserumkonzentrationen von Peptid, die zwischen 50 bis 100 mal höher als durch orale Gabe sind, weswegen Toleranz mit weniger Peptid als auf dem oralen Weg erreicht werden kann. Die Peptidlösung sollte filtersteriliert werden, um Partikelchen und irgendwelche mikrobiologischen Verunreinigungen zu entfernen, wenn eine Peptidlösung durch Injektion verabreicht werden soll. Bevorzugte Dosen liegen zwischen 1 und 5000 mg von nach pharmazeutischen Graden gereinigtem Peptid oder einer Mischung von zwei oder mehr verschiedenen Peptiden.
Obwohl es theoretisch möglich ist, zu versuchen, immunologische Toleranz mit Peptiden, die auf einer beliebigen HIV-Aminosäuresequenz beruhen, zu induzieren, besteht das allgemeine Risiko, daß eine schützende Immunantwort gegen HIV inhibiert werden könnte. Es besteht auch ein spezifische Risiko, daß mit der Verabreichung von Peptiden, die auf VHP1 zur Induktion immunologischer Toleranz basieren, verbunden sein könnte, nämlich daß eine falsche Dosis eines auf VHP1 basierenden Peptids die Krankheit verschlimmern könnte, indem die Immunaktivierung verstärkt wird. Es ist ein Vorteil dieser Erfindung, daß die Verabreichung von Peptiden, die auf humanen Aminosäurensequenzen beruhen, wahrscheinlich signifikant sicherer sein sollte als die Verwendung von Peptiden, die auf HIV- Aminosäuresequenzen beruhen.
Das Folgende dient zur Illustration der Erfindung.
Es wurde eine Studie ausgeführt, um zu bestimmen, ob in einem HIV-infizierten Patienten die Induktion von immunologischer Toleranz gegenüber HEP1 die Immunaktivierung und HIV-Infektion verringern könnte. Der Entwurf des ersten klinischen Experiments bestand darin, HEP1 oral an den Patienten in täglichen Dosierungen von 10 mg zu verabreichen (am unteren Ende des bevorzugten Dosierungsbereichs). Dies wurde dann ungefähr drei Monate später mit einer subkutanen Verabreichung von HEP1 bei einer höheren Dosierung von 140 mg fortgesetzt. Um den therapeutischen Nutzen von HEP1 zu testen, wurden die folgenden Marker für die Krankheitsprogression durch die Entnahme von Blutproben vor, während und nach jedem Versuch gemessen und bestimmt: HIV-Level durch einen p24-Antigenassay, HIV-Infektiösität durch einen zellulären TCID-Assay und Immunaktivierung durch die Quantifizierung der Level verschiedener Lymphozyten.

Der Patient

Patient PP stellte sich freiwillig zur Verfügung, um das Peptid HEP1 oral aufzunehmen, während er die HIV-Klinik beim Ealing Hospital NHS Trust aufsuchte. Patient PP ist ein 32 Jahre alter, weißer, männlicher Patient und ist seit acht Jahren HIV-infiziert. Er begann die Versuchsreihe mit einer T-Zellmenge von 80 Zellen/mm³. Er hatte keine, wie auch immer geartete antivirale Therapie (z. B. AZT) in dem dem Versuch vorangegangenen Zeitraum von fünf Jahren erhalten. Während des Versuchszeitraums war der Patient HCV-negativ (Abbott 2. Generation), HepB-negativ und Blutgruppe A Rhesus (D) positiv.

Die Synthese des HEP1-Peptids

Abkürzungen
DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
DIC: Diisopropylcarbodiimid
DCM: Dichloromethan
DMF: Dimethylformamid
TFA: Trifluoroessigsäure
Boc: t-Butyloxycarbonyl
HOBT: Hydroxybenzotriazol
DIEA: Diisopropylethylamin
DCU: Dicyclohexylharnstoff
HF: Fluorwasserstoff
370 mg HEP1 wurden durch Boc-Synthese synthetisiert.
0,05 mNol Resin (Boc-Aminosäure-OCH&sub2;-pamresin) und ein dreifacher Überschuß von aktivierter Boc-Aminosäurelösung (aktiviert mit 0, 5 M HBTU in DMF und 2, 5 mMol DIEA) wurden in den folgenden Schritten angekoppelt. Das Resin wurde mit DMF gewaschen, Boc-Schutzgruppen mit 100 %iger TFA beseitigt, die Reaktion wurde drainiert, im Fluß mit DMF für die Dauer von einer Minute gewaschen, drainiert, aktivierte Aminosäurelösung wurde hinzugefügt, geschüttelt für 10 Minuten bei Raumtemperatur, dann gewaschen und die Reihenfolge der Schritte mit der nächsten Aminosäure wiederholt. Nach Beendigung der Synthese wurde die Reaktionsmischung im Fluß mit DMF, dann mit DCM gewaschen und getrocknet. Das Peptid wurde dann vom Resin mit HF abgespalten (-5ºC für die Dauer von 1,5 Stunden), das HF wurde abgedampft, die Mischung mit 50 ml Ether gewaschen und abgedampft, dann das Peptid in 6 M Guanidin 0,1 M TRIS für die präparative HPLC-Trennung gelöst. Nach der Auftrennung wurde die Reinheit des Peptids durch HPLC analysiert und eine Reinheit des HEP1 von mehr als 99% bestimmt. Die Peptidlösung wurde dann bis zum Erhalt eines reinen, weißen, flockigen Feststoffs unter Vakuum abgedampft.

Zubereitung von HEP1-Peptid für die orale Verabreichung

Zu einem Röhrchen, das 221 mg eines reinen, gefriergetrockneten HEP1-Peptids enthält, wurden näherungsweise 5 ml von sterilem, destilliertem Wasser hinzugefügt, um das Peptid aufzulösen, und die Lösung wurde in einen 50 ml Meßkolben gewaschen und auf genau 50 ml im Meßkolben mit sterilerem destilliertem Wasser aufgefüllt, um eine Endkonzentration von 4,42 mg/ml HEP1 zu erhalten. 2,26 ml Volumina dieser Lösung wurden als zweiundzwanzig getrennte Partien in 5 ml Plastikgefäße transferiert und bei - 20ºC (10 mg des Peptids pro Gefäß) aufbewahrt. Zwei Röhrchen wurden bei -70% als Referenzlösungen in der Klinik aufbewahrt und die übrigen 20 Röhrchen wurden dem Patienten auf Trockeneis in einem Vakuumkolben zur Verfügung gestellt. Die Röhrchen wurden in einer Gefriertruhe bei -20ºC bis zu ihrem Gebrauch durch den Patienten aufbewahrt. Der Patient hat ein Gefäß an jedem Morgen aufgetaut (die übrigen Gefäße gefroren in der Gefriertruhe gelassen) und die Lösung eine Stunde vor dem Frühstück geschluckt. Dieses Vorgehen wurde für die Dauer von zwanzig Tagen wiederholt.

Zubereitung von HEP1-Peptid für die subkutane Verabreichung

HEP1 wurde subkutan dem Patient PP drei Monate nach dem Ende der oralen Verabreichungsstudie verabreicht.

Zubereitung

Zu einem Röhrchen, das 147 mg des reinen gefriergetrockneten HEP1-Peptids (anorganische Salze wurden nicht hinzugefügt) enthält, wurde 1 ml steriles destilliertes Wasser hinzugefügt, um das Peptid aufzulösen, das schließlich eine Endkonzentration von 147 mg/ml HEP1 ergeben hat. Die Lösung wurde durch einen 0,2 um Sartoriusfilter filtersterilisiert, an einer sterilen 5 ml Spritze befestigt, und dann in einen sterilen 5 ml Behälter transferiert.

Zellulärer TCID-Assay

Der zelluläre TCID ist eine Technik, die die relative Menge der viralen Last innerhalb von Zellen mißt. Innerhalb von vier Stunden, nachdem eine Probe aus dem HIV- infizierten Patienten entnommen wurde, wurden 10&sup6; lebensfähige PBMC aus der Probe durch Zentrifugation des antikoagulierten Blutes über dem Ficoll-Hypaque- Lymphozytenauftrennungsmedium erhalten. Eine serielle Verdünnung der Patientenzellen wurde in einer 24 "well"- Platte in abnehmenden Mengen angesetzt (1 : 1, 1 : 4, 1 : 16, 1 : 64 und 1 : 256 und eine Negativkontrolle), indem 0,9 ml Spezialmedium (RPMI-1640), ergänzt durch 15% fötales Kälberserum und 10% Interleukin 2 eingesetzt wurden. Infizierte Zellen wurden dann mit 106 PBMC cokultiviert, die aus einem nichtinfizierten menschlichen Donor stammen und für die Dauer von 24-48 Stunden mit Phytohämagglutin (PHA) stimuliert worden waren, um die Zellen für die Infektion mit HIV empfänglich zu machen. Die Cokulturen wurden daraufhin auf die Anwesenheit von p24-Antigen in dem flüssigen Überstand zweimal wöchentlich für die Dauer von bis zu 14 Tagen überprüft. Während dieser Zeit wurden die Platten an den Tagen 4, 7, 11 und 14 gedreht und dann ein 50%iger Mediumwechsel vorgenommen. Das Medium wurde an den Tagen 7 und 14 entfernt und zweifach in 0,5 ml Eppendorff-Gefäßen (Minimum 250 ul/Gefäß) für zukünftige p24-Antigentests gesichert. Das Medium wurde am Tag 11 entfernt und irgendwelches übriges Medium vom Tag 14 (nach dem Sichern für p24-Antigentests) gepooled und in flüssigem Stickstoff für eine zukünftige Viruskultur aufbewahrt. Eine Kultur wurde als positiv bewertet, wenn die Konzentration von p24-Antigen in dem Überstand am Tag 7 und Tag 14 30 picogramm/ml (ein typischer Schwellenwert) überschritten hat. Die niedrigste Anzahl von peripheren mononukleären Zellen, die für die Produktion einer Positivkultur erforderlich ist, wurde als Endpunkt gewählt, und die reziproke Größe der Endpunktverdünnung zeigte die relative Anzahl von infizierten Zellen in dem Patienten an.

p24-Antigenassay

p24-Antigen ist ein Marker der HIV-Infektion genauso wie auch eine Prognosegröße für die Progression der HIV- Krankheit. Der p24-Antigentest mißt p24-Antigen aus dem Kern von HIV und ist ein Immunoassay, bei dem monoklonale Mäuseantikörper, die auf Microwell-Streifen aufgetragen sind, eingesetzt werden. Der Test detektiert HIV im Plasma, Serum oder im Gewebekulturmedium. Wenn vorhanden, bindet das Antigen an die mit Antikörpern beschichteten Microwells. Das gebundene Antigen wird durch biotinylierte Antikörper gegen HIV erkannt, wobei die biotinylierten Antikörper mit konjugierter Strepavidin-Meerettich- Peroxidase reagieren. Eine Farbe entwickelt sich nach der Reaktion der Peroxidase mit Wasserstoff-Peroxidase in Gegenwart von Tetramethylbenzidin(TMB)Substrat. Proben, die HIV p24-Antigen positiv sind, können durch das Festlegen einer Standardkurve quantifiziert werden, indem serielle Verdünnungen des Antigenreagentiums eingesetzt werden. Dieser Test ist unterhalb von 30 Picogramm pro ml nicht aussagekräftig.

CD4, CD8, NK

T-Zell-Untergruppen wurden gemessen, indem eine vollständige Blutprobe in ein 4,5 ml-Gefäß, das EDTA enthält, gegeben und mit monoklonalen Antikörpern gegenüber CD3, CD4 und CD8 markiert wurde. Der Prozentsatz von T-Zellen in peripheren Blutlymphozyten wurde durch flußzytometrische Verfahren bestimmt. Die Anzahl der CD4 und CD8-T-Zellen wurde durch Gesamt- und Differentialmessungen weißer Zellen und durch das Multiplizieren mit einem geeigneten Faktor, der auf der Basis der Flußzytometrie erhalten wird, bestimmt.

Ergebnisse: Orale Verabreichung von HEP1

Blutproben wurden dem Patienten 69 Tage vor dem Versuch und am ersten Tag des Versuchs vor der ersten Gabe von HEP1 entnommen, um die Hintergrundniveaus dieser Marker für die Krankheitsprogression zu bestimmen. Die orale Verabreichung von HEP1-Lösung, die 10 mg HEP1 enthält, wurde am Tag 2 des Versuchs begonnen und bis zum Tag 22 fortgesetzt. Weitere Blutproben wurden für die Analyse am Tag 7, Tag 14, Tag 21 und Tag 28 des Versuchs (7 Tage nach der letzten Gabe von HEP1) entnommen. Der Patient war keinen Gegenreaktionen ausgesetzt und fühlte sich auch im Verlauf der Verabreichung von HEP1 weiterhin wohl.
Die folgenden Marker der HIV-Krankheitsprogression wurden ermittelt: p24-Antigen (die Konzentration von HIV p24- Protein in Picogramm/ml im Blut), TCID (die Infektiösität von HIV in den Zellen der Blutprobe, gemessen durch einen in vitro-Zellkulturtest, bei welchem eine serielle Verdünnung der Probe mit aktivierten, nichtinfizierten PBMC gemischt wurde und der Level der HIV-Infektion, bestimmt durch den p24-Antigentest), die Gesamtzahl weißer Zellen (Immunaktivierung gemessen durch die Zahl der weißen Zellen pro mm³), CD4 (die Zahl der CD4-positiven Zellen pro mm³), CD8 (die Zahl der CD8-positiven Zellen pro mm³), NK (die Zahl der natürlichen Killerzellen pro mm³), die Lym phozyten (die Zahl der Zellen pro mm³), die Monozyten (die Zahl der Zellen pro mm³), und die Granulozyten (die Zahl der Zellen pro mm³). Normalisierte Daten wurden berechnet, indem jeder Datenpunkt durch den Wert der entsprechenden Datenreihe am Tag 1 der Testreihe geteilt und mit 100 multipliziert wurde. Normalisierte Daten - Tag 1 = 100
Diese vorläufigen klinischen Resultate zeigen, daß das oral verabreichte HEP1 eine um 46% verminderte virale Last, gemessen durch p24-Antigen, und eine um das 16fache reduzierte Infektiösität von HIV, wie durch TCID bestimmt, aufweist und daß dieser Effekt auch 7 Tage nach der Behandlung anhält. Es ist wichtig zu bemerken, daß der p24-Antigen-Level nur gerade oberhalb des Hintergrunds bei 38 Picogramm/ml lag, da 30 Picogramm/ml als typischer cut-off-Wert betrachtet wird. Die Gesamtzahl der weißen Zellen stieg vor der Behandlung, fiel aber während und nach der Behandlung, was nahelegt, daß eine Reduktion bei der Immunaktivierung während der Behandlung erreicht worden ist. Die Dauer dieser Effekte über einen Zeitraum von sieben Tagen nach der Behandlung legt gleichfalls nahe, daß eine T-Suppressorzellpopulation im Patienten induziert worden ist, die die Infektiösität von HIV und die Immunaktivierung reduziert hat. CD8 stieg während der Behandlung, aber es hat sich keine signifikante Vergrößerung der CD4-Zahl ergeben (bei dieser Konzentration von HEP1).

Ergebnisse: Subkutane Verabreichung von HEP1

0,95 ml (das Volumen ist äquivalent mit 140 mg HEP1) der sterilen Lösung wurden subkutan in die Bauchwand in einer Gabe am Tag 1 des Subkutan-HEP1-Versuchs injiziert. Patient PP nahm ein stechendes Gefühl wahr, das ungefähr 15 Minuten andauerte, aber es ergaben keine weiteren Gegenreaktionen. Blutproben wurden am Tag -92, Tag -57, Tag -8 und Tag 1 vor der HEP1-Injektion und am Tag 1* vier Stunden nach der Injektion und dann 6 Tage und 13 Tage nach der HEP1-Injektion entnommen. Die Proben wurden auf p24, TCID, CD4, CD8, die Gesamtzahl weißer Zellen, Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten untersucht und die Daten sind in der folgenden Tabelle dargestellt (die normalisierten Daten wurden, wie oben beschrieben, berechnet). Normalisierte Daten - Tag 1 = 100
Die subkutane Verabreichung einer größeren Dosis von HEP1 führte zu einer markanten Erhöhung in der CD4-T-Zellzahl (+50%) und der CD8-T-Zellzahl (+28%) nach der HEP1- Injektion, gefolgt von einem Rückfall auf die entsprechenden Niveaus vor der Injektion sechs Tage später.

Claims

1. Peptid, das aus 14 bis 30 Aminosäuren besteht und die Aminosäuresequenz:

ThrGluLysLysArgArgGluThrValGluArgGluLysGlu

umfaßt.

2. Peptid nach Anspruch 1, das aus der angegebenen Aminosäuresequenz besteht.

3. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von AIDS und verwandten Störungen.

4. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von systemischem Lupus Erythematosus und verwandten Störungen.

5. Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei das Medikament geeignet ist, oral oder subkutan verabreicht zu werden.