DE69434126T3

DE69434126T3 - Verfahren zum Entfärben von menschlichemn Serum-Albumin

Info

Publication number: DE69434126T3
Application number: DE69434126T
Authority: DE
Inventors: Wataru Hirakata-shi Ohtani; Naoto Hirakata-shi Furuhata; Akinori Hirakata-shi Sumi; Munehiro Hirakata-shi Noda; Takao Hirakata-shi Ohmura
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-16
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2014-12-17
Also published as: KR950018452A; DK0658569T3; US5710253A; EP0658569B2; TW324721B; EP0658569B1; EP0658569A1; DE69434126D1; CA2138349A1; KR100381982B1; DE69434126T2

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfärbung von rekombinantem Humanserumalbumin erhalten durch gentechnische Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Albumin, insbesondere Humanserumalbumin (HSA), ist ein wichtiges Protein des Kreislaufsystems. Das Protein wird in der Leber hergestellt und hat eine wesentliche Rolle bei der Beibehaltung des normalen osmotischen Drucks von Körperflüssigkeiten, wie Blut. Es dient auch als Träger für verschiedene Moleküle.
HSA wird bei verschiedenen klinischen Zuständen verabreicht. Zum Beispiel ist es im Fall von Schock oder Verbrennungsverletzung im allgemeinen notwendig, HSA häufig zu verabreichen, um das Blutvolumen wiederherzustellen und um andere verletzungsbedingte Symptome zu erleichtern. Patienten, welche unter Hypoproteinämie und fötaler Erythroblastose leiden, benötigen manchmal HSA-Behandlung. In anderen Worten ist der Verlust von Körperflüssigkeiten, wie während einer Operation, Schock, Verbrennungsverletzung oder Hypoproteinämie, welche Ödem verursacht, eine häufige Indikation zur Verabreichung von HSA.
Gegenwärtig wird HSA vor allem als ein fraktioniertes Produkt von gesammeltem Blut hergestellt. Ein derartiges Herstellungsverfahren hat jedoch Nachteile, indem es nicht ökonomisch ist und der Nachschub an Blut sporadisch ist.
Außerdem enthält gesammeltes Blut manchmal unerwünschte Substanzen, wie Hepatitisvirus. Daher ist es profitabel, ein Material zu entwickeln, welches als ein Substitut für aus gesammeltem Blut erhaltenem HSA verwendet werden kann.
Rezente Fortschritte in rekombinanter DNA-Technologie haben die mikrobielle Herstellung von verschiedenen Arten von nützlichen Polypeptiden möglich gemacht und daher wurde eine Anzahl von Säugerpolypeptiden in verschiedenen Mikroorganismen hergestellt. Hinsichtlich HSA werden zur Zeit Verfahren für die Herstellung von HSA in großem Maßstab durch rekombinante Verfahren und die anschließende hochgradige Reinigung entwickelt.
Jedoch ist es im Fall der Herstellung von HSA durch gentechnische Verfahren hochwahrscheinlich, daß die HSA-Präparation von Interesse mit verschiedenen färbenden Komponenten kontaminiert sein wird, welche in den Ausgangsmaterialien enthalten sind, oder von einem Mikroorganismus während der Kultivierung des Wirtsmikroorganismus sekretiert werden oder welche während der Reinigung des resultierenden HSA eingebracht werden, und daß diese Kontaminanten an HSA binden, um die Färbung von HSA selbst zu verursachen. Darüber hinaus können solche Kontaminanten nicht ausreichend durch dem Fachmann bekannte Verfahren zur Reinigung von HSA aus Plasma entfernt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der gegenwärtigen Erfindung ist es, Humanserumalbumin zur Verfügung zu stellen, welches durch gentechnische Verfahren hergestellt wurde und dessen Färbung ausreichend unterdrückt werden kann, durch die Entfernung der oben beschriebenen färbenden Komponenten und Kontaminanten, welche durch irgendwelche dem Fachmann bekannten Verfahren zur Reinigung von HSA aus Plasma nicht vollständig entfernt wurden.
Die Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Entfärbung von rekombinantem Humanserumalbumin (HSA), das umfaßt:

(a2) Durchführen einer Reinigungsbehandlung, umfassend die Behandlung mit einem Kationenaustauscher, und dann
(b) Durchführen einer Wärmebehandlung des besagten Albumins in der Gegenwart eines Reduktionsmittels.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete rekombinante Ausgangs-HSA kann durch Kultivierung von HSA-produzierenden Wirtszellen, wie Escherichia coli, verschiedenen Hefearten, Bacillus subtilis, Aspergillus und tierischen Zellen, hergestellt werden, um die extrazelluläre Expression (sekretorische Expression) des HSA zu bewirken.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung zur Entfärbung zu behandelnde rekombinante HSA kann wie nachstehend beschrieben isoliert und gereinigt werden.
(1) Herstellung und Kultivierung der HSA-produzierenden Wirtszellen und Isolierung und Gewinnung von HSA
Die Herkunft des rekombinanten Ausgangs-HSA, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht limitiert, sofern das HSA durch gentechnische Verfahren hergestellt wird. Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende HSA-produzierende Wirt ist nicht limitiert, sofern er durch gentechnische Verfahren hergestellt wird. Somit kann der Wirt aus bereits in Veröffentlichungen beschriebenen Wirten ausgewählt werden, sowie jenen Wirten, welche in der Zukunft entwickelt werden. Illustrative Beispiele des Wirts umfassen mikrobielle Zellen, wie Escherichia coli, verschiedene Hefearten, Bacillus subtilis und tierische Zellen, welche zu HSA-Produzierern gemacht wurden. Besonders bevorzugte Wirte sind Hefearten, insbesondere zum Genus Saccharomyces gehörende, wie Saccharomyces cerevisiae, dem Genus Pichia, wie Pichia pastoris, oder dem Genus Kluyveromyces, wie Kluyveromyces lactis. Auch können auxotrophe Stämme oder Antibiotika-sensitive Stämme verwendet werden. Vorzugsweise wird Saccharomyces cerevisiae AH22 (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GTS115 (his 4) und Kluyveromyces lactis MW-98-8C (α, uraA, arg, lysK⁺, pKD1⁰) verwendet. Vorzugsweise wird das in der vorliegenden Erfindung verwendete HSA unter Verwendung dieser Wirte hergestellt.
Die Herstellung des HSA-herstellenden Wirts, Herstellung des HSA durch Kultivierung des Wirts und Isolierung und Gewinnung von HSA aus der resultierenden Kulturflüssigkeit können durch die Verwendung von bekannten Techniken oder davon abgeleiteten Prozeduren bewirkt werden.
Zum Beispiel kann die Herstellung eines HSA-produzierenden Wirts (oder eines HSA-produzierenden Stamms) unter Verwendung eines Verfahrens bewirkt werden, in welchem ein natürliches Humanserumalbumin-Gen verwendet wird ( JP-A-58-56684 korrespondierend zu EP-A-73646 , JP-A-58-90515 korrespondierend zu EP-A-79739 und JP-A-58-150517 korrespondierend zu EP-A-91527 ), eines Verfahrens, in welchem modifiziertes Humanserumalbumin-Gen verwendet wird ( JP-A-62-29985 und JP-A-1-98486 korrespondierend zu EP-A-206733 ), eines Verfahrens, in welchem eine synthetische Signalsequenz verwendet wird ( JP-A-1-240191 korrespondierend zu EP-A-329127 ), eines Verfahrens, in welchem eine Serumalbumin-Signalsequenz verwendet wird ( JP-A-2-167095 korrespondierend zu EP-A-319641 ), eines Verfahrens, in welchem ein rekombinantes Plasmid in ein Chromosom eingefügt wird ( JP-A-3-72889 korrespondierend zu EP-A-399455 ), eines Verfahrens, in welchem Wirte verschmolzen werden ( JP-A-3-53877 korrespondierend zu EP-A-409156 ), eines Verfahrens, in welchem eine Mutation in einem Methanol enthaltenden Medium generiert wird, eines Verfahrens, in welchem eine mutierter AOX₂-Promotor verwendet wird ( EP-A-506040 ), eines Verfahrens, in welchem HSA in B. subtilis exprimiert wird ( JP-A-62-215393 korrespondierend zu EP-A-229712 ), eines Verfahrens, in welchem HSA in Hefe exprimiert wird ( JP-A-60-41487 korrespondierend zu EP-A-123544 , JP-A-63-39576 korrespondierend zu EP-A-248657 und JP-A-63-74493 korrespondierend zu EP-A-251744 ) und eines Verfahrens, in welchem HSA in Pichia exprimiert wird ( JP-A-2-104290 korrespondierend zu EP-A-344459 ) (der hierin verwendete Begriff "JP-A" bedeutet eine nicht geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung).
Kultivierung eines HSA-produzierenden Wirts (ein HSA-Herstellungsverfahren) kann unter Verwendung von bekannten Verfahren, die in den oben genannten Referenzen offenbart sind, durchgeführt werden oder entsprechend dem Verfahren, welches in JP-A-3-83595 offenbart wird, in welchem Inhibition der HSA-produzierenden Zellen durch hohe Konzentrationen von Substrat durch die graduelle Zusetzung einer hochkonzentrierten Glucoselösung zu dem Medium im Zuge einer Batch-Feed-Fermentation vermieden wird, wodurch die Produktion sowohl der produzierenden Zellen als auch des Produkts in hohen Konzentrationen ermöglicht wird, oder gemäß eines anderen in JP-A-4-293495 (korrespondierend zu EP-A-504823 ) offenbarten Verfahrens, in welchem die Produktivität von HSA durch das Hinzufügen von Fettsäuren zu dem Medium verbessert wird.
Isolierung und Gewinnung von HSA kann unter Verwendung von bekannten Verfahren, die in den oben bezeichneten Referenzen offenbart sind, durchgeführt werden oder gemäß einem Verfahren, welches in JP-A-3-103188 (korrespondierend zu EP-A-420007 ) beschrieben ist, in welchem Proteasen durch eine Wärmebehandlung inaktiviert werden, oder einem Verfahren zur Inhibierung von Färbung offenbart in JP-A-4-54198 (korrespondierend zu US 5,132,404 oder EP-A-464590 ), in welchem HSA von färbenden Substanzen unter Verwendung zumindest eines adsorbierenden Materials, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anionenaustauschern, hydrophoben Trägern und aktivierter Holzkohle, getrennt wird.
(2) Anfangsreinigung von HSA
Das HSA kann zunächst durch bekannte Verfahren aufgereinigt werden, wie Fraktionierung, Adsorptionschromatographie, Gelfiltration, Dichtegradientenzentrifugation oder Dialyse.
Ein geeignetes anfängliches Reinigungsverfahren enthält die folgenden Schritte:

(i) Filtrieren des Kulturüberstands eines Wirts, welcher HSA exprimiert, durch eine erste Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 100.000 bis 500.000 und dann durch eine zweite Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 1.000 bis 50.000, um ein erstes Filtrat zu erhalten;
(ii) Wärmebehandlung des ersten Filtrats bei 50 bis 70°C für 30 Minuten bis 5 Stunden, um eine erhitzte Probe zu erhalten;
(iii) Säurebehandlung der erhitzten Probe bei einem pH von 3 bis 5, um eine säurebehandelte Probe zu erhalten;
(iv) Filtrieren der säurebehandelten Probe durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 100.000 bis 500.000, um ein zweites Filtrat zu erhalten;
(v) Inkontaktbringen des zweiten Filtrats mit einem Kationenaustauscher bei einem pH von 3 bis 3 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,2 M und dann Inkontaktbringen jenes Kationenaustauschers mit einem pH von 8 bis 10 und einer Salzkonzentration von 0,2 bis 0,5 M, um ein erstes Eluat zu ergeben;
(vi) Inkontaktbringen des ersten Eluats mit einem Träger für hydrophobe Chromatographie bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,5 M und Gewinnung von nichtadsorbierten Fraktionen, um ein zweites Eluat zu erhalten; und
(vii) Inkontaktbringen des zweiten Eluats mit einem Anionenaustauscher bei einem pH von 6 bis 8 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,1 M und Gewinnung von nichtadsorbierten Fraktionen, um besagtes Albumin zu gewinnen.

Alternativ kann anstelle des zuvor genannten Schritts (vi) ein anderer Schritt verwendet werden, in welchem die korrespondierende Probe mit einem Träger für hydrophobe Chromatographie bei einem pH von 6 bis 8 mit einer Salzkonzentration von 1 bis 3 M in Kontakt gebracht wird und anschließend bei pH 6 bis 8 mit einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,5 M eluiert wird, anstelle des zuvor genannten Schritts (vii) kann ein anderer Schritt verwendet werden, in welchem die korrespondierende Probe mit einem Anionenaustauscher bei pH 6 bis 8 mit einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,05 M in Kontakt gebracht wird und anschließend bei pH 6 bis 8 mit einer Salzkonzentration von 0,05 bis 1 M eluiert wird, oder einem zusätzlichen Schritt, in welchem Aussalzung bei einem pH von 3 bis 5 mit einer Salzkonzentration von 0,5 bis 3 M bewirkt wird und die gewonnene ausgefällte Fraktion zwischen den zuvor genannten Schritten (v) und (vi), oder (vi) und (vii), oder nach (vii) eingeführt wird.
(3) Hochgradige Reinigung
Die folgenden Behandlungen können durchgeführt werden, um HSA zu einem hohen Grad zu reinigen.
(i) Chelatharzbehandlung
Die Chelatharzbehandlung soll zur Entfärbung des HSA dienen. Diese Behandlung kann Teil des obigen Reinigungsverfahrens sein, vorzugsweise als letzter Schritt, welcher durchgeführt wird durch Kontaktieren des HSA mit einem Chelatharz, welches eine bestimmte Ligandengruppe hat. Vorzugsweise wird die Trägereinheit des Chelatharzes hydrophobe Eigenschaften haben. Beispiele dieser Art Trägereinheit umfassen ein Copolymer von Styrol und Divinylbenzol und ein Copolymer von Acrylsäure und Methacrylsäure.
Beispiele der Ligandeneinheit umfassen eine Thioharnstoffgruppe sowie eine Polyamingruppe (inklusive einer Polyalkylenpolyamingruppe, wie ein Polyethylenpolyamin), welche in einem Molekül eine Mehrzahl von Untergruppen bestehend aus einer Polyolgruppe enthält, wie einer N-Methylglucamingruppe, einer Iminogruppe, einer Aminogruppe und einer Ethyleniminogruppe. Illustrative Beispiele von bevorzugten kommerziell erhältlichen Chelatharzen mit den oben genannten Träger- und Ligandeneinheiten umfassen DIAION CRB02 (Ligandeneinheit, N-Methylglucamingruppe, erhältlich von Mitsubishi Kasei Corp.), DIAION CR20 (Ligandeneinheit, -NH(CH₂CH₂NH)_nH, erhältlich von Mitsubishi Kasei Corp.), LEWATIT TP214 (Ligandeneinheit, -NHCSNH₂, erhältlich von Bayer) und AMBERLITE CG4000, welche alle als Trägereinheit ein Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol haben.
Bevorzugte Bedingungen für die Behandlung mit dem Chelatharz sind wie folgt:
pH: sauer oder etwa neutral (pH 3 bis 9, vorzugsweise 4 bis 7)
Dauer: zumindest 1 Std., vorzugsweise 6 Std. oder mehr
Ionenstärke: 50 mmho oder weniger, vorzugsweise 1 bis 10 mmho
Mischungsverhältnis: 0,1 bis 100 g, vorzugsweise 1 bis 10 g, des Harzes basierend auf 250 mg HSA (auf nasser Basis).
(ii) Hydrophobe Chromatographie
Freie nichtantigenische Kontaminanten, welche durch die Phenol-Schwefelsäure-Methode nachgewiesen werden können, werden aus dem durch die oben beschriebenen Reinigungsschritte (i) bis (vii) und die Chelatharzbehandlung erhaltenen HSA nicht vollständig entfernt.
Das durch die oben beschriebenen Behandlungen erhaltene HSA wird mit einem Träger für hydrophobe Chromatographie bei pH 2 bis 5, vorzugsweise 3 bis 4, und einer Salzkonzentration von 0,4 bis 1 M, vorzugsweise 0,4 bis 0,7 M, in Kontakt gebracht. Die Elution kann bei einem pH von 6 bis 8, vorzugsweise 6,5 bis 7, und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,3 M, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 M, bewirkt werden. Der oben beschriebene Schritt (vi) kann durch diesen hydrophoben Chromatographieschritt ersetzt werden. Somit kann HSA, welches keine freien nichtantigenen Kontaminanten, welche durch die sSchwefelsäure-Methode nachgewiesen werden können, gewonnen werden.
Der Begriff "Phenol-Schwefelsäure-Behandlung" wie hierin verwendet bedeutet die kolorimetrische Bestimmung von Kohlenwasserstoffen, umfassend das Hinzufügen einer Phenollösung zu einer Kohlenwasserstoffprobenlösung, das dazu Hinzufügen von konzentrierter Schwefelsäure, Schütteln der Mischung um einem Furfuralderivativ, abgeleitet von dem Kohlenwasserstoff unter Verwendung der Verdünnungshitze, zu erlauben, mit Phenol zu reagieren, und das resultierende gefärbte Reaktionsprodukt kolorimetrisch zu bestimmen. Die freien nichtantigenen Kontaminanten, welche durch die Phenol-Schwefelsäure-Methode nachweisbar sind, umfassen neutrale Kohlenwasserstoffe, wie Pentose oder Hexose, Monokohlenwasserstoffglycoside, wie Oligosaccharide, komplexe Kohlenwasserstoffe und Uronsäure und methylierte Kohlenwasserstoffe. Diese Kontaminanten verursachen keine Antigen-Antikörper-Reaktionen mit Antikörpern gegen von den produzierenden Wirtszellen abgeleiteten Substanzen.
Träger zur Verwendung in der hydrophoben Chromatographie umfassen solche, die eine Alkylgruppe enthalten (Butylgruppe, Octylgruppe, Octyldecylgruppe und dergleichen), jede Gruppe mit 4 bis 18 Kohlenstoffatomen, und solche, welche eine Phenylgruppe enthalten. Illustrative Beispiele der Butylgruppen enthaltenden Träger umfassen Butylagarose, Butylpolyvinyl (Handelsname Butyl Toyopearl, erhältlich von Tosoh Corp.), jene der Octylgruppen enthaltenden und Octyldecylgruppen enthaltenden Träger umfassen Octylagarose bzw. Octyldecylagarose, und jene der Phenylgruppe enthaltenden Träger umfassen Phenylcellulose (Handelsname Phenyl Cellulofine, erhältlich von Seikagaku Corp.).
(iii) Behandlung mit Borsäure oder einem Salz davon
HSA kann mit Borsäure oder einem Salz davon behandelt werden, um antigene von der produzierenden Wirtszelle stammende Kontaminanten zu entfernen sowie freie nichtantigene Kontaminanten, welche durch die Phenol-Schwefelsäure-Methode nachgewiesen werden können.
Beispiele für die Borsäure umfassen Orthoborsäure, Metaborsäure und Tetraborsäure. Die Salze davon umfassen Alkalimetallsalze, wie Natriumsalz und Kaliumsalz, und Erdalkalimetallsalze, wie Calciumsalz. Vorzugsweise wird Calciumtetraborat verwendet. Borsäure oder ein Salz davon werden zu einer Endkonzentration von etwa 0,01 bis 1 M zugesetzt, vorzugsweise etwa 0,05 bis 0,2 M. Diese Behandlung kann bei einem pH von etwa 8 bis 11 durchgeführt werden, vorzugsweise etwa 9 bis 10, für etwa 1 bis 10 Stunden. Diese Behandlung wird vorzugsweise bei einer niedrigen elektrischen Konduktivität durchgeführt, z. B. 1 mS oder weniger. Die HSA-Konzentration ist vorzugsweise niedrig, z. B. 5% oder weniger, noch bevorzugter etwa 0,1 bis 3%.
Nach der Behandlung mit Borsäure oder einem Salz davon wird das gebildete Präzipitat entfernt, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration, und der Überstand wird gewonnen, konzentriert und entsalzt.
(iv) Ultrafiltration
Das nach den obigen Reinigungsschritten gewonnene HSA wird vorzugsweise einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von etwa 100.000 unterworfen. Durch diese Ultrafiltrationsbehandlung kann Pyrogen entfernt werden.
(4) Entfärbung
(i) Behandlung mit einem Reduzierungsmittel
Die Behandlung mit einem Reduzierungsmittel kann entweder während des Reinigungsverfahrens des obigen Punkts (2) oder während des hochgradigen Reinigungsverfahrens des obigen Punkts (3) durchgeführt werden. Diese Behandlung kann zusammen mit oder unmittelbar nach einem der oben beschriebenen Reinigungsschritte durchgeführt werden.
Das Reduzierungsmittel zur Verwendung in dieser Behandlung ist nicht besonders limitiert, solange es eine Substanz mit reduzierender Aktivität ist. Illustrative Beispiele davon umfassen eine niedermolekulare Substanz, die eine SH-Gruppe enthalten, wie Cystein, Cysteamin, Cystamin, Aminopropanthiol, Methionin, Ethionin oder Glutathion, schweflige Säure, Dithionigsäure, Pyroschwefligsäure, phosphorige Säure-schweflige Säure, phosphorige Säure-Pyroschwefligsäure, schweflige Säure-pyrophosphorige Säure, Ascorbinsäure oder ein Salz davon. Die Salze umfassen ein Alkalimetallsalz, wie Natriumsalz oder Kaliumsalz, und ein Erdalkalimetallsalz, wie Calciumsalz.
Die HSA-Konzentration während der Behandlung beträgt von 0,01 bis 25 G/V%, vorzugsweise 0,1 bis 5 G/V%. Das Reduzierungsmittel wird in einer Menge von etwa 1 bis 100 mM im Fall von Cystein und ungefähr 0,001 bis 10% im Fall von schwefliger Säure verwendet. Die Behandlung kann bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 100°C, vorzugsweise 20 bis 80°C, für 10 Minuten bis 240 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 120 Stunden, durchgeführt werden.
Aminverbindungen, welche bekannt sind, Färbung zu unterdrücken ( JP-A-5-260980 ) können in Kombination mit dem Reduzierungsmittel verwendet werden. Beispiele der Aminsubstanzen umfassen Alkylamine, Diamine, Guanidine, Benzamidine, basische Aminosäuren und Aminophenylessigsäure. Die Alkylamine enthalten vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome. Beispiele davon umfassen Methylamin, Ethylamin, Propylamin, Isopropylamin und Butylamin. Beispiele von Diaminen umfassen Alkylendiamine, insbesondere jene mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Methylendiamin, Ethylendiamin oder Propylendiamin, N,N-Dialkylalkylendiamin, insbesondere jene enthaltend eine Alkyleinheit und eine Alkyleneinheit jeweils mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie N,N-Dimethylethylendiamin oder N,N-Diethylethylendiamin. Beispiele der Guanidine umfassen Guanidin, Aminoguanidin und Phenylguanidin. Beispiele der Benzamidine umfassen Benzamidin und p-Aminobenzamidin. Die basischen Aminosäuren umfassen Lysin oder Arginin.
Die Aminverbindung wird in einer Menge von etwa 0,01 bis 10 G/V%, vorzugsweise 0,1 bis 1 G/V% verwendet.
Wenn die SH-Verbindung verwendet wird, kann die Behandlung bei einem pH von 6 bis 8, vorzugsweise pH 6,5 bis 7,5, durchgeführt werden, insbesondere mit einer begleitenden Wärmebehandlung bei 50 bis 100°C. Wenn die Wärmebehandlung nicht in Kombination durchgeführt wird, nämlich die Behandlung bei 40°C oder weniger durchgeführt wird, befindet sich der pH-Wert im Bereich von 3 bis 6, vorzugsweise 4 bis 5. Wenn Ascorbinsäure verwendet wird, befindet sich der pH-Wert im Bereich von 3 bis 6, vorzugsweise 4 bis 5. Die anderen Reduzierungsmittel können bei einem pH von 6 bis 10, vorzugsweise 8 bis 9, verwendet werden.
Die Entfärbungsbehandlung unter Verwendung des Reduzierungsmittels gemäß der vorliegenden Erfindung macht es möglich, den Färbungsgrad von HSA um 10 bis 70%, im Vergleich zu dem HSA unmittelbar vor der Behandlung, zu verringern.
(ii) Wärmebehandlung nach Kationenaustauscherbehandlung
Diese Wärmebehandlung kann entweder direkt nach der Kationenaustauscherbehandlung (v) während des Reinigungsverfahrens (2), während des darauffolgenden Reinigungsverfahrens umfassend ein Verfahren zur hochgradigen Reinigung oder als ein letzter Schritt durchgeführt werden, unter der jeweiligen Bedingung, daß freie Polysaccharide durch die Kationenaustauscherbehandlung (v) entfernt worden sind. Spezifisch wird der Gehalt an freien Polysacchariden auf etwa 5 mg/ml oder geringer reduziert, wenn die HSA-Konzentration 250 mg/ml beträgt.
Die Wärmebehandlung kann bei 50 bis 100°C durchgeführt werden, vorzugsweise 60 bis 80°C, für 10 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 5 Stunden. Die HSA- Konzentration während der Behandlung ist im Bereich von 0,01 bis 25 G/V%, vorzugsweise 0,1 bis 5 G/V%. Zur vollständigen Stabilisierung von HSA wird die Wärmebehandlung vorzugsweise in Gegenwart eines bekannten Stabilisators durchgeführt, wie Acetyltryptophan oder einem Salz davon (z. B. Natriumsalz), oder einer Fettsäure mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einem Salz davon (z. B. Natriumsalz) ( JP-A-3-103188 ).
Die Wärmebehandlung wird in Gegenwart des oben beschriebenen Reduzierungsmittels durchgeführt.
Die oben beschriebenen Aminverbindungen können ebenfalls während der Wärmebehandlung verwendet werden.
Unmittelbar nach der Wärmebehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Grad an Färbung des HSA um 30 bis 70% reduziert im Vergleich zu dem unmittelbar vor der Behandlung.
(5) Pharmazeutische Zusammensetzung
Das so erhaltene rHSA (oder eine Zusammensetzung, welche dieses enthält) kann zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß bekannten Verfahren, wie Ultrafiltration, Sterilfiltration, Dispension und Lyophilisierung, gemacht werden. Es können auch Acetyltryptophan oder ein Salz davon (z. B. Natriumsalz) und Natriumcaprylat als Stabilisierungsmittel beigemengt werden, um die Stabilität während der Herstellungsschritte und die Lagerstabilität nach seiner Produktion zu gewährleisten, wie es die Umstände erfordern. Diese Stabilisierungsmittel können in einer ungefähren Menge von 0,01 bis 0,2 M, vorzugsweise von 0,02 bis 0,05 M, verwendet werden. Der Natriumgehalt kann 3,7 mg/ml oder weniger sein. Diese Stabilisierungsmittel können vor den Schritten der Ultrafiltration, Sterilfiltration, Dispension und/oder Lyophilisierung hinzugefügt werden.
Die so durch Ultrafiltration und Sterilfiltration erhaltene pharmazeutische Zusammensetzung von rHSA wird aseptisch in einen Behälter in einer Anwendungseinheit verpackt. Der Begriff "verpackt in einen Behälter in einer Anwendungseinheit" wie hier verwendet bedeutet, daß eine Anwendungseinheit der pharmazeutischen Zusammensetzung von rHSA, z. B. eine flüssige Zusammensetzung mit 25% rHSA mit einem ungefähren pH-Wert von 6,4 bis 7,4 und einem osmotischen Druckverhältnis von etwa 1, in Behälter in 20 bis 50 ml (5 bis 12,5 g rHSA) Portionen verpackt wird; oder bedeutet, daß eine flüssige Zusammensetzung mit 5% rHSA in Behälter in 100 bis 250 ml (5 bis 12,5 g rHSA) Portionen verpackt wird. Beispiele der Behälter zur Verwendung in der Verpackung der pharmazeutischen Präparation von rHSA umfassen Glasbehälter, Polyethylenbehälter, dealkalinisierte Weichglascontainer ( JP-A-4-210646 ) mit jeweils einer Kapazität von 10 bis 250 ml.
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinantes HSA bereit, welches frei von Färbung verursacht durch das Binden von bestimmten färbenden Komponenten (welche in den Ausgangsmaterialien enthalten sind oder welche von einem Mikroorganismus sekretierte Kontaminanten sind) an HSA ist.
Die folgenden Beispiele beschreiben die vorliegende Erfindung näher. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die Beispiele nur der näheren Erläuterung dienen und nicht als Beschreibung der Grenzen der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
Referenzbeispiel 1
Kultivierung eines HSA-produzierenden Wirts
(1) Verwendeter Stamm: Pichia pastoris GCP101
Um das HSA-Expressionsplasmid pPGP1 herzustellen, wurde eine 5' nichtkodierende Region des HSA-Gens von dem Plasmid pHSA113, beschrieben in JP-A-2-104290 (korrespondierend zu EP-A-344459 ), welches eine Transkriptionseinheit enthält, die so konstruiert ist, daß sie HSA unter der Kontrolle eines AOX₁-Promotors exprimiert, entfernt. pPGP1 enthält cDNA kodierend für die Aminosäuresequenz von normalem HSA (die Aminosäuresequenz von normalem HSA und die Basensequenz der genomischen DNA kodierend für normales HSA sind in J. Biol. Chem., 261, 6747–6757 (1986) beschrieben). Dann wurde gemäß einem in JP-A-2-104290 (korrespondierend zu EP-A-344459 ) offenbarten Verfahren das HSA-Expressionsplasmid pPGP1 mit NotI verdaut und das resultierende NotI-verdaute Fragment wurde gegen die AOX₁-Genregion eines Pichia pastoris Stamms GTS115 (his4) (NRRL Hinterlegungsnr. Y-15851) ausgetauscht, um die Transformante PC4130 herzustellen. Der Stamm wächst in einem Medium enthaltend Methanol als Kohlenstoffquelle infolge der Deletion des AOX₁-Gens nicht gut (Mut^– Stamm).
Der Stamm PC4130 wurde in 3 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton und 2% Glucose) inokuliert. Nach 24 Stunden Kultivierung wurden die Zellen in 50 ml YPD-Medium inokuliert, so daß die Zelldichte auf eine anfängliche Turbidität bei einer OD₅₄₀ von 0,1 eingestellt werden konnte. Nach 3 Tagen Kultivierung bei 30°C wurden die resultierenden Zellen wieder auf 50 ml YPD-Medium inokuliert bei einer anfängliche Zellturbidität von 0,1 bei OD₅₄₀. Danach wurde in der gleichen Weise alle 3 Tage eine Subkultivierung wiederholt. Nach jeder Subkultivierung wurden Zellen mit sterilem Wasser verdünnt und auf eine 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte (0,7% Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 2% Methanol und 1,5% Agarpulver) geschüttet bei einer Inokulierungsgröße von 10⁷ Zellen/Platte, gefolgt von 5 Tagen Kultivierung bei 30°C, um die Gegenwart/Abwesenheit von Kolonien zu beurteilen. 20 Kolonien wurden auf der 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte nach 12 Tagen der sukzessiven Subkultivierung gefunden. Mut^– Stämme können auf dem 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Medium kaum wachsen, während Mut⁺ Stämme gut wachsen können. Somit bedeutet das Auftreten einer Kolonie, daß der Stamm die Möglichkeit der erhöhten Methanolassimilierung erworben hat und so ein Mut⁺ Stamm erhalten wurde. Eine der so erhaltenen Kolonien wurde mit sterilem Wasser angemessen verdünnt und auf eine 2% MeOH-YNBw/oa.a.-Platte verteilt, um einzelne Kolonien zu isolieren. Eine der resultierenden einzelnen Kolonien wurde GCP101 genannt.
(2) Kultivierung des Stamms
(Erste Anzuchtkultur)
Eine 1 ml Portion des Stamms, welcher mit Glycerin eingefroren worden war, wurde in einen 1.000 ml gedämpften Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 200 ml YPD-Medium (siehe Tabelle 1) inokuliert und bei 30°C für 24 Stunden unter Schütteln kultiviert. Tabelle 1 Zusammensetzung des YPD-Mediums

Komponenten Konzentration g/l

Hefeextrakt 10

Pepton 20

Glucose 20
(Zweite Anzuchtkultur)
Die erste Anzuchtkultur wurde in einen 10 l Topffermenter enthaltend 5 l YPD-Medium inokuliert, und die zweite Anzuchtkultivierung wurde bei 30°C für 24 Stunden unter Bewegen durchgeführt. Die Bewegungsrate wurde kontrolliert, so daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Medium bei ungefähr 50% der gesättigten gelösten Sauerstoffkonzentration gehalten wurde. In der Anzuchtkultivierung wurde der pH des Mediums nicht kontrolliert.
(Hauptkultur)
Die zweite Anzuchtkultur wurde in einen 1.200 l Fermenter enthaltend 250 l des Batchkulturmediums (siehe Tabelle 2) überführt, und Batchkultivierung wurde unter Bewegen und Belüften durchgeführt. Die Bewegungsrate wurde kontrolliert, so daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Medium bei ungefähr 50 bis 30% der gesättigten gelösten Sauerstoffkonzentration gehalten wurde. Sobald das Glycerin im Batchkulturmedium konsumiert war, wurde das Hinzufügen eines Fütterungsmediums (siehe Tabelle 3) begonnen. Der pH des Mediums wurde auf einem festgelegten Niveau von 5,85 kontrolliert. Ein Antischaummittel wurde zum Entschäumen dem Kulturmedium je nach Bedarf beigefügt. Tabelle 2 Zusammensetzung des Batchkulturmediums

Komponenten Gehalt pro Liter

Glycerin 50,0 g

H₃PO₄ (85%) 14,0 ml

CaSo₄·2H₂O 0,6 g

K₂SO₄ 9,5 g

MgSO₄·7H₂O 7,8 g

KOH 2,6 g

Biotinlösung^*1 1,6 ml

YTM-Lösung^*2 4,4 ml

*1 Biotinlösung: 0,2 g/l
*2 YTM-Lösung hat die folgende Zusammensetzung:

Komponenten	Gehalt pro Liter
FeSO₄·7H₂O	65,0 g
CuSO₄·5H₂O	6,0 g
ZnSO₄·7H₂O	20,0 g
MnSO₄·4–5H₂O	3,0 g
H₂SO₄	5,0 ml

Komponenten	Menge
YTM-Lösung	2 ml
Methanol	1.000 ml

Referenzbeispiel 2
Ein HSA-Expressionsplasmid pMM042 wurde unter Verwendung eines AOX₂-Promotors (eine Mutante des natürlichen AOX₂-Promotors (Yeast, 5, 167–177, 1988; Mol. Cell. Biol., 9, 1316–1323, 1989), in welchem die 255. Base upstream des Startkodons von besagtem Promotor von T nach C verändert ist), isoliert aus dem in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Stamm GCP101, konstruiert. Das so konstruierte Plasmid wurde in Pichia pastoris GTS115 eingefügt, um die Transformante UHG42-3 ( JP-A-4-299984 oder EP-A-506040 ) zu erhalten. Danach wurde die so erhaltene Transformante gemäß der oben in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Methode kultiviert, wodurch die Transformante HSA herstellen konnte.
Referenzbeispiel 3
(1) Isolierung von Kulturüberstand – Membranfraktionen (I) und (II) –
Eine etwa 800 l Portion des Kulturmediums erhalten in Referenzbeispielen 1 oder 2 wurde mit einer Filterpresse behandelt, um Kulturüberstand zu isolieren. Der resultierende Überstand wurde anschließend durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000 filtriert. Dann wurde das resultierende Filtrat auf ein Volumen von etwa 80 l unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 30.000 (Membranfraktion (I)) konzentriert. Danach wurde die Membranfraktion (I) bei 60°C für 3 Stunden in Gegenwart von 5 mM Natriumcaprylat, 10 mM Cystein und 100 mM Aminoguanidin bei pH 7,5 wärmebehandelt. Die so wärmebehandelte Lösung wurde rasch auf etwa 15°C abgekühlt, auf pH 4,5 eingestellt und dann mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000 behandelt (Membranfraktion (II)). Danach wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 30.000 der Puffer in der resultierenden Albuminlösung durch einen 50 mM Acetatpuffer (pH 4,5), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, ersetzt.
(2) Kationenaustauscherbehandlung
Die Albuminlösung, die im obigen Schritt (1) erhalten wurde, wurde auf eine mit S-Sepharose gepackte Säule, welche zuvor mit 50 mM Acetatpuffer (pH 4,5), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, äquilibriert worden war, aufgebracht, die Säure wurde gründlich mit demselben Puffer gewaschen und dann wurde mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 9), enthaltend 0,3 M Natriumchlorid, eluiert.
(3) Hydrophobe Chromatographie
Die von der S-Sepharosesäule eluierte HSA-Lösung wurde auf eine Säule, gepackt mit Phenyl Cellulofine, welche zuvor mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), enthaltend 0,15 M Natriumchlorid, äquilibriert worden war, aufgebracht. Da HSA unter solchen Bedingungen nicht an Phenyl Cellulofine bindet, wurden die HSA-Fraktionen, welche durch die Säule hindurchtraten, gesammelt. Die so erhalten HSA-Lösung wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 30.000 auf ein Volumen von etwa 50 l konzentriert, und zur selben Zeit wurde der Puffer in der HSA-Lösung durch einen 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,8) ersetzt.
(4) Anionenaustauscherbehandlung
Die HSA-Lösung, die so mit hydrophober Chromatographie behandelt, konzentriert und der Puffer ausgetauscht war, wurde auf eine Säule, gepackt mit DEAE-Sepharose, welche zuvor mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,8) äquilibriert worden war, aufgebracht. Unter diesen Bedingungen wurde HSA nicht an die DEAE-Sepharose adsorbiert, sondern floß durch die Säule.
(5) Chelatharzbehandlung
Eine 1 ml Portion der 25 G/V% Lösung von gereinigtem HSA wurde mit 1 g DIAION CRB02 (ein Chelatharz mit Styrol-Divinylbenzol-Copolymer als Trägeranteil und einer N-Methylglucamingruppe als Ligandenanteil, hergestellt von Mitsubishi Kasei Corp.) gemischt, und die resultierende Mischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur bei pH 6,8 und einer Ionenstärke von 5 mmho gerührt. Das Harz wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um die nichtabsorbierte HSA enthaltende Fraktion zu erhalten.
(6) Boratbehandlung
Die HSA-Konzentration wurde auf 2,5 G/V% eingestellt, so daß die elektrische Leitfähigkeit 1 mS oder weniger wurde. Calciumtetraborat wurde zu der resultierenden Lösung zu einer Endkonzentration von 100 mM hinzugefügt, und der pH-Wert der Lösung wurde auf 9,5 eingestellt. Nachdem die Lösung 10 Stunden stehengelassen worden war, wurde das gebildete Präzipitat entfernt, um den Überstand zu erhalten, welcher dann konzentriert und entsalzt wurde. Danach wurde die resultierende Lösung durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von etwa 100.000 durchgeleitet.
Referenzbeispiel 4
Eine etwa 800 l Portion der in Referenzbeispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturlösung wurde mit einer Filterpresse behandelt, um den Kulturüberstand zu isolieren. Anschließend wurde der resultierende Überstand durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekülargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000 filtriert. Dann wurde das resultierende Filtrat unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 30.000 auf ein Volumen von etwa 80 l konzentriert (Membranfraktion (I)).
Als nächstes wurde das resultierende Konzentrat bei 60°C für 3 Stunden in Gegenwart von 5 mM Natriumcaprylat, 5 mM Acetyltryptophan, 100 mM Aminoguanidin und 10 mM Cystein bei pH 7,5 wärmebehandelt. Der Grad an Färbung (ein Verhältnis von Absorption bei 350 nm zu Absorption bei 280 nm, nachfolgend als A₃₅₀/A₂₈₀ bezeichnet), der nach der Behandlung mit Cystein gemessen wurde, war im Vergleich zu dem vor der Behandlung gemessenen um 23% vermindert.
Referenzbeispiel 5

Die in der Anionenaustauscherbehandlung (4) in Referenzbeispiel 3 erhaltene Fraktion wurde verwendet. Ein in Tabelle 4 aufgeführtes Reduzierungsmittel wurde zu der Fraktion hinzugefügt, so daß es eine Endkonzentration von 1% ergab. Die HSA-Konzentration wurde auf 0,5% eingestellt und der pH wurde auf 9 eingestellt. Danach wurde die resultierende Lösung bei 37°C für 24 Stunden stehengelassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

Reduktionsmittel (1%)	Grad der Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀)
Natriumsulfit	0,0296
Natriumhyposulfit	0,0283
Phosphorsäure-Natriumsulfit	0,0269
Phosphorsäure-Kaliumpyrosulfit	0,0249
schweflige Säure-Natriumpyrophosphat	0,0272
vor Behandlung	0,0359

Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde im Fall der Verwendung eines der Reduzierungsmittel der Grad an Färbung um 20 bis 30% verringert.
Referenzbeispiel 6
Die in der Anionenaustauscherbehandlung (4) in Referenzbeispiel 3 erhaltene Fraktion wurde verwendet. Ascorbinsäure wurde zu der Fraktion hinzugefügt, so daß sich eine Endkonzentration von 1% ergab. Die HSA-Konzentration wurde auf 0,5% eingestellt und der pH wurde auf 4,5 eingestellt. Danach wurde die resultierende Lösung für 24 Stunden bei 15°C stehengelassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

Reduktionsmittel (1%) Grad der Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀)

nach Behandlung 0,0288

vor Behandlung 0,0359
Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurde der Grad an Färbung im Fall der Verwendung von Ascorbinsäure um 20% verringert.
Referenzbeispiel 7
Einfluß des pH
Die in der Anionenaustauscherbehandlung (4) in Referenzbeispiel 3 erhaltene Fraktion wurde verwendet. Ein Reduktionsmittel (Natriumsulfit) wurde zu der Fraktion hinzugefügt, so daß sich eine Endkonzentration von 1% ergab. Die HSA-Konzentration wurde auf 0,5% eingestellt und der pH wurde auf 7, 8, 9 und 10 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde dann für 12 Stunden bei 37°C stehengelassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6

^pH Grad der Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀)

7 0,0302

8 0,0278

9 0,0272

10 0,0282

vor Behandlung 0,0359
Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurde der Grad der Färbung bei jedem pH (pH 7 bis 10) verringert. Insbesondere können exzellente Effekte der Reduktionsbehandlung bei pH 8 und pH 9 erzielt werden. In diesem Fall wurde der Grad an Färbung um 23 bis 24% verringert.
Referenzbeispiel 8

Die in der Anionenaustauscherbehandlung (4) in Referenzbeispiel 3 erhaltene Fraktion wurde verwendet. Ein Reduktionsmittel (Natriumsulfit und phosphorige Säure-Kaliumpyrosulfit) wurde zu der Fraktion zu einer Konzentration von 1, 2 und 3% hinzugefügt. Die HSA-Konzentration wurde auf 0,3 und 5% eingestellt und der pH wurde auf 9 eingestellt. Danach wurde die resultierende Lösung bei 15°C für 2 Tage und 5 Tage stehengelassen. Nach der Behandlung wurde die Lösung gegen 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 0,3% Natriumchlorid, dialysiert, um das Reduktionsmittel zu entfernen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7

Reduktionsmittel	Konzentration von HSA (%)	Behandlungsdauer (Tage)	Grad der Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀)
vor Behandlung keine Hinzufügung	0,3	5	0,0359 0,0305
Natriumsulfit 1% 1% 2% 2% 3%	0,3 0,3 5 5 0,3	2 5 2 5 5	0,0243 0,0230 0,0231 0,0208 0,0230
phosphorige Säure-Kaliumpyrosulfit 1% 1% 2% 2% 3%	0,3 0,3 5 5 0,3	2 5 2 5 5	0,0230 0,0215 0,0286 0,0206 0,0199

Wie in Tabelle 7 gezeigt, wurde der Grad an Färbung in jedem der Testläufe um 30 bis 45% verringert.
Referenzbeispiel 9
Effekt der Behandlung mit einem Reduktionsmittel in jedem Reinigungsschritt

Die Auswirkung der Behandlung mit dem Reduktionsmittel wurde in jedem Reinigungsschritt untersucht. Die HSA-Fraktionen, die in der Kationenaustauscherbehandlung (2), der hydrophoben Chromatographiebehandlung (3) und der Anionenaustauscherbehandlung (4) in Referenzbeispiel 3 erhalten wurden, wurden auf eine HSA-Konzentration von 0,3% eingestellt. Ein Reduktionsmittel (phosphorige Säure-Kaliumpyrosulfit) wurde zu jeder Fraktion zu einer Konzentration von 2% hinzugefügt und der pH wurde auf 9 eingestellt. Danach wurde die resultierende Lösung bei 15°C für 5 Tage stehengelassen. Nach der Behandlung wurde die Lösung gegen 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 0,3% Natriumchlorid, dialysiert, um das Reduktionsmittel zu entfernen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8

HSA-Fraktion	Reduktionsbehandlung	Grad der Färbung
HSA-Fraktion	Reduktionsbehandlung	(A₃₅₀/A₂₈₀)	(A₄₀₀/A₂₈₀)	(A₄₅₀/A₂₈₀)	(A₅₀₀/A₂₈₀)
nach Kationenaustauscherbehandlung	vorher	0,0232	0,0176	0,0106	0,0081
nach Kationenaustauscherbehandlung	nachher	0,0232	0,0160	0,0076	0,0059
nach hydrophober Chromatographiebehandlung	vorher	0,0300	0,0184	0,0110	0,0075
nach hydrophober Chromatographiebehandlung	nachher	0,0242	0,0145	0,0065	0,0042
nach Anionenaustauscherbehandlung	vorher	0,0166	0,0088	0,0051	0,0046
nach Anionenaustauscherbehandlung	nachher	0,0161	0,0085	0,0049	0,0039

Wie in Tabelle 8 gezeigt, können gute Entfärbungseffekte in jedem Reinigungsschritt erzielt werden. Insbesondere ist der Entfärbungseffekt im langwelligen Bereich bemerkenswert.
Referenzbeispiel 10
Reinigungsbehandlung zusammen mit Reduktionsmittelbehandlung
Der Entfärbungseffekt wurde untersucht, wenn der Reinigungsschritt (Anionenaustauscherbehandlung (4) in Referenzbeispiel 3) in Gegenwart eines Reduktionsmittels durchgeführt wurde. So wurde die HSA-Lösung in Kontakt mit Q-Sepharose (Pharmacia) unter Verwendung eines 50 mM Trishydrochloridpuffers (pH 9), enthaltend ein Reduktionsmittel (Natriumsulfit und phosphorige Säure-Kaliumpyrosulfit), in Berührung gebracht, und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Waschen mit 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 9), um das Reduktionsmittel zu entfernen, wurde HSA mit 50 mM Tris-hydrochloridpuffer (pH 9), enthaltend 1 M Natriumchlorid, eluiert. Tabelle 9 zeigt den Grad an Färbung des so gereinigten HSA. Tabelle 9

Reduktionsmittel Grad der Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀)

Natriumsulfit 0,5% 0,0319

0,1% 0,0324

phosphorige Säure-Kaliumpyrosulfit 0,1% 0,0339

keine Hinzufügung 0,0390
Wenn die Anionenaustauscherbehandlung in der Gegenwart des Reduktionsmittels durchgeführt wird, kann ein guter Entfärbungseffekt bei einer Konzentration des Reduktionsmittels im Bereich von 0,1 bis 0,5% erzielt werden.
Referenzbeispiel 11
Die aus der Wärmebehandlung der Membranfraktion (I) bei 60°C für 3 Stunden in Referenzbeispiel 3 (1) resultierende HSA-Lösung wurde gegen einen Puffer (pH 4), enthaltend 10 mM Cystein, bei 15°C dialysiert und danach für 16 Stunden stehengelassen. Als Ergebnis war der Grad an Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀) nach der Wärmebehandlung 0,1, während er auf 0,066 nach der Behandlung mit dem Reduktionsmittel abnahm.
Beispiel 1
Eine etwa 800 l Portion der in Referenzbeispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturlösung wurde mit einer Filterpresse behandelt, um den Kulturüberstand zu isolieren. Der resultierende Überstand wurde anschließend durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000 filtriert. Danach wurde das resultierende Filtrat unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 30.000 auf ein Volumen von etwa 80 l konzentriert (Membranfraktion (I)).
Das resultierende Konzentrat wurde auf pH 4,5 eingestellt und dann mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000 behandelt (Membranfraktion (II)). Danach wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 30.000 der Puffer in der resultierenden Albuminlösung durch einen 50 mM Acetatpuffer (pH 4,5), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, ersetzt. Die so erhaltene Albuminlösung wurde auf eine mit S-Sepharose gepackte Säule aufgebracht, welche zuvor mit einem 50 mM Acetatpuffer (pH 4,5), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, äquilibriert worden war, die Säule wurde gründlich mit demselben Puffer gewaschen, und dann wurde die Elution mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 9), enthaltend 0,3 M Natriumchlorid, durchgeführt. Vor und nach der Behandlung mit S-Sepharose wurde die HSA-Fraktion auf den freien Polysaccharidgehalt durch die Phenol-Schwefelsäure-Methode untersucht. Als Ergebnis war nach der Behandlung der freie Polysaccharidgehalt auf 1/20 verringert. Die von der S-Sepharosesäule eluierte HSA-Lösung wurde bei 60°C für 1 Stunde in der Gegenwart von 5 mM Natriumcaprylat, 5 mM Acetyltryptophan, 100 mM Aminoguanidin und 10 mM Cystein bei pH 7,5 wärmebehandelt. Der A₃₅₀/A₂₈₀-Wert, der nach der Behandlung mit Cystein gemessen wurde, war im Vergleich zu dem vor der Behandlung gemessenen um 50% verringert.
Beispiel 2
Verhältnis zwischen Entfärbungseffekt und der Reihenfolge von Kationenaustauscherbehandlung und Wärmebehandlung Eine etwa 800 1 Portion der in Referenzbeispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturlösung wurde mit einer Filterpresse behandelt, um den Kulturüberstand zu isolieren. Der resultierende Überstand wurde anschließend durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000 filtriert. Danach wurde das resultierende Filtrat unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 30.000 auf ein Volumen von etwa 80 l konzentriert (Membranfraktion (I)). Das resultierende Konzentrat wurde auf pH 4,5 eingestellt und dann mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 300.000 behandelt (Membranfraktion (II)). Die so erhaltene Fraktion wurde in den folgenden Experimenten verwendet.

(1) Die Fraktion wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 mit dem Kationenaustauscher behandelt, gefolgt von Wärmebehandlung. Der freie Polysaccharidgehalt in der Membranfraktion (II) war ungefähr 110 mg/ml und jener in dem Eluat resultierend aus der Kationenaustauscherbehandlung war 5 mg/ml bei einer HSA-Konzentration von 250 mg/ml.
(2) Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, abgesehen davon, daß die Wärmebehandlung von der Kationenaustauscherbehandlung gefolgt wurde.

In jedem Experiment wurde der Grad der Färbung der in jedem Schritt erhaltenen HSA-Fraktion gemessen und verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10

Behandlung	Grad der Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀)
Kationenaustauscherbehandlung	0,0688
Kationenaustauscherbehandlung	0,0309
gefolgt von Wärmebehandlung
Wärmebehandlung	0,0674
Wärmebehandlung gefolgt von	0,0428
Kationenaustauscherbehandlung
Membranfraktion (II)	0,0700

Wie in Tabelle 10 gezeigt, wurde der Grad an Färbung vor der Behandlung nach der Behandlung um 55% verringert, wenn die Wärmebehandlung auf die Kationenaustauscherbehandlung folgte. Im Gegensatz dazu wurde der Grad an Färbung um 36% verringert, wenn die Kationenaustauscherbehandlung auf die Wärmebehandlung folgte. Somit kann das erstere Verfahren den Grad an Färbung im Vergleich mit dem letzteren Verfahren unterdrücken. Es wird davon ausgegangen, daß dieser Unterschied auf die Entfernung einer beträchtlichen Menge freier Polysaccharide in der HSA-Fraktion durch die Kationenaustauscherbehandlung zurückzuführen ist.
Beispiel 3
Verhältnis zwischen Entfärbungseffekt und Zeitpunkt der Wärmebehandlung während des Reinigungsverfahrens

Basierend auf dem Reinigungsverfahren von HSA gemäß Referenzbeispiel 3 wurde das Verhältnis zwischen dem Zeitpunkt der Wärmebehandlung und dem Entfärbungseffekt untersucht. In Referenzbeispiel 3 wurde die Wärmebehandlung unmittelbar vor der Kationenaustauscherbehandlung durchgeführt. Der Grad an Färbung wurde verglichen, wenn die Wärmebehandlung als letzter Schritt durchgeführt wurde, wenn die Wärmebehandlung unmittelbar nach der Kationenaustauscherbehandlung durchgeführt wurde und wenn die Wärmebehandlung zusätzlich auch als letzter Schritt durchgeführt wurde. Die Wärmebehandlungsbedingungen in Beispiel 1 wurden befolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11

Zeitpunkt der Wärmebehandlung	Behandlungsverfahren*	Grad der Färbung (A₃₅₀/A₂₈₀)
Filterpresse (Anfangsschritt)	(1)	0,0078
keine Wärmebehandlung	(1)-(2)-(3)-(4)-(5)-(6)	0,0025
unmittelbar vor Kationen austauscherbehandlung	(1)-o-(2)-(3)-(4)-(5)-(6)
letzter Schritt	(1)-(2)-(3)-(4)-(5)-(6)-o	0,0016
unmittelbar vor Kationen austauscherbehandlung und als letzter Schritt	(1)-o-(2)-(3)-(4)-(5)-(6)-o	0,0015
unmittelbar nach Kationen austauscherbehandlung	(1)-(2)-o-(3)-(4)-(5)-(6)	0,0016

Anmerkung:

* in Behandlungsverfahren stehen (1) bis (6) und o für die folgenden Behandlungen: (1) Filterpresse (2) Kationenaustauscherbehandlung (3) hydrophobe Chromatographie (4) Anionenaustauscherbehandlung (5) Chelatharzbehandlung (6) Calciumboratbehandlung o Wärmebehandlung

Claims

Verfahren zum Entfärben von rekombinantem Humanserumalbumin (HSA), das umfaßt: (a) Durchführen einer Reinigungsbehandlung, die die Behandlung mit einem Kationenaustauscher umfaßt, und dann (b) Durchführen einer Wärmebehandlung des Albumins in der Gegenwart eines Reduktionsmittels.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Reduktionsmittel von (b) unabhängig ausgewählt ist aus einer Verbindung mit geringem Molekulargewicht enthaltend eine SH-Gruppe, schweflige Säure, Dithionigsäure, Pyroschwefligsäure, phosphorige Säure-schweflige Säure, phosphorige Säure-Pyroschwefligsäure, schweflige Säure-pyrophosphorige Säure, Ascorbinsäure, und einem Salz davon.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin eine Aminverbindung, von der bekannt ist, daß sie Verfärbung von Humanserumalbumin unterdrücken kann, während der Wärmebehandlung (b) vorhanden ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das der Wärmebehandlung (b) unterworfene rekombinante Humanserumalbumin einen freien Polysaccharidgehalt von nicht mehr als 5 mg/ml aufweist, wenn die HSA-Konzentration 250 mg/ml ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Wärmbehandlung (b) in der Gegenwart eines Stabilisators durchgeführt wird.