DE69431718T2

DE69431718T2 - Thrombin-inhibitoren

Info

Publication number: DE69431718T2
Application number: DE69431718T
Authority: DE
Inventors: F. Brady; Dong-Mei Feng; S. Dale Lewis; Ruth F. Nutt; Jules A. Shafer; Daniel F. Veber
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-25
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2014-04-26
Also published as: EP0699074A1; EP0699074A4; EP0699074B1; JP3486412B2; DE69431718D1; ATE227581T1; AU670381B2; JPH08509735A; CA2159834A1; WO1994025051A1; AU6773894A; ES2184763T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Thrombin ist eine Serin-Protease, die in Blutplasma in der Form eines Vorläufers, Prothrombin, vorliegt. Thrombin spielt eine zentrale Rolle beim Mechanismus der Blutkoagulation durch Umwandlung des Lösungsplasmaproteins, Fibrinogen, in unlösliches Fibrin.
Edwards et al., J. Amer. Chem. Soc., (1992), Band 114, S. 1854-1863, beschreiben Peptidyl-α-ketobenzoxazole, die reversible Inhibitoren der Serin-Proteasen humane Leukozytenelastase und Schweinepankreaselastase sind.
Die Europäische Veröffentlichung 363 284 beschreibt Analoga von Peptidase-Substraten, bei denen das Stickstoffatom der abspaltbaren Amidgruppe des Substratpeptids durch Wasserstoff oder einen substituierten Carbonylrest ersetzt worden ist.
Die Australische Veröffentlichung 86245677 beschreibt ebenfalls Peptidase-Inhibitoren mit einem aktivierten elektrophilen Ketonrest, wie z. B. Fluormethylenketon oder α-Ketocarboxylderivate.
Die in den früheren Publikationen beschriebenen Thrombin- Inhibitoren enthalten Arginin- und Lysin-Seitenketten. Diese Strukturen zeigen eine niedrige Selektivität für Thrombin gegenüber anderen trypsinartigen Enzymen. Einige von ihnen zeigen Hypotension-Toxizität und Lebertoxizität.
Die Verbindungen der Erfindung ersetzen Arginin- und Lysindurch Aminocyclohexylreste. Diese Verbindungen zeigen eine Selektivität für Thrombin gegenüber anderen trypsinartigen Enzymen und haben eine orale Bioverfügbarkeit.

ZUSAMMENSETZUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung umfaßt 4-substituierte Cyclohexylaminderivate, welche Inhibitoren der katalytischen Bindungsstelle des Thrombins sind und sich als Antikoagulantien eignen. Diese Verbindungen zeigen eine Selektivität für Thrombin gegenüber Trypsin und anderen trypsinartigen Enzymen und haben eine orale Bioverfügbarkeit. Trypsinartige Enzyme (wie z. B. Trypsin, Thrombin, Faktor xa, Kallikrein, Plasmin, Urokinase und Plasminogenaktivator) sind serinabhängige Enzyme, die die Hydrolyse an Arginyl- und Lysyl- Peptidbindungen katalysieren.
Die Erfindung umfaßt eine Zusammensetzung zur Inhibierung des Verlusts von Blutplättchen, zur Inhibierung der Bildung von Blutplättchenaggregaten, zur Inhibierung von Fibrinbildung, zur Inhibierung von Thrombusbildung und zur Inhibierung von Embolusbildung bei einem Säugetier, welche eine Verbindung der Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Diese Zusammensetzungen können gegebenenfalls Antikoagulantien, Antiblutplättchenmittel und Thrombolytika enthalten. Die Zusammensetzungen können zu Blut, Blutprodukten oder Säugetierorganen hinzugegeben werden, um die erwünschten Inhibierungen zu bewirken. Die Erfindung umfaßt auch eine Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung von instabiler Angina, refraktärer Angina, Myokardinfarkt, transienten ischämischen Attacken, Kammerflimmern, thrombotischem Infarkt, embolischem Infarkt, tiefer Venenthrombose, Verbrauchskoagulopathie und Reokklusion oder Restenose von rekanalisierten Gefäßen bei einem Säugetier, welche eine Verbindung der Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Diese Zusammensetzungen können gegebenenfalls Antikoagulantien, Antiblutplättchenmittel und Thrombolytika enthalten.
Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Verringerung der Thrombogenizität einer Oberfläche bei einem Säugetier durch Binden einer Verbindung der Erfindung, entweder kovalent oder nichtkovalent, an die Oberfläche.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel
wobei:
m = 0 oder 1,
n = 0, 1 oder 2,
X = 0 oder H&sub2;,
R = Arylsulfonyl, Aminoacyl, Acylaminoacyl, N-C&sub1;&submin;&sub3;-Alkylaminoacyl, Acyl-N-C&sub1;&submin;&sub3;-alkylaminoacyl, Arylacyl, Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkanoyl, Hydroxyacyl, Aryloxycarbonyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyloxycarbonyl oder
R" = Aryl, Heteroaryl, C&sub5;&submin;&sub1;&sub1;-carbomonocyclisch oder C&sub5;&submin;&sub1;&sub1;-carbobicyclisch,
R¹ = H oder CH&sub3;,
R² = H oder CH&sub3;,
R³ = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, Hydroxy-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Carboxy-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Amino-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Guanido-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Aryl oder substituiertes Aryl, Arylmethyl, C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkylmethyl oder C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl, Y = CHO, COCF&sub3;, BO&sub2;R&sup7;R&sup8;, CO&sub2;R&sub4;, COOH, CONR&sup5;R&sup6;, COCO&sub2;R&sup4;, COCO&sub2;H, COCO-Q oder CO-W,
wobei
Q = eine natürliche Aminosäure, Cyclohexylaminosäure, NR&sup5;R&sup6; oder
oder ein Derivat davon, und
W = 5-10gliedrige heterocyclische Gruppen oder substituierte heterocyclische Gruppen, einschließlich zum Beispiel Tetrazol, Furan, Oxazol, Benzoxazol und Imidazol,
R&sup4; = C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,
R&sup5; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,
R&sup6; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,
R&sup7; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl und
R&sup8; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,
und pharmazeutische annehmbare Salze davon.
Vorzugsweise haben die Verbindungen der Erfindung die Formel
wobei:
n = 0, 1 oder 2,
m = 0 oder 1,
R = D-Phenylalanin, D-Nal1, D-Nal2, D-Cyclohexylalanin, D- Tyrosin, β-3-Benzothienyl-D-alanin oder D-3,4-Cl&sub2;-Phenylalanin oder N-Methylderivate davon oder
R¹ = H,
R³ = H oder Cyclohexyl,
X = O oder H und
Y = CONH&sub2;, COCO&sub2;H, COCONHCH&sub3;, COCONHCH&sub2;Ph,
und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Besonders bevorzugt haben die Verbindungen der Erfindung die Formel
wobei:
R = N-Methyl-D-Phenylalanin, N-Methyl-2-naphthyl-D-alanin,
N-Methyl-1-naphthyl-D-alanin, N-Methyl-D-cyclohexylalanin, N- Methyl-D-3,4-Cl&sub2;-D-phenylalanin oder
R¹ = H,
R³ = H, Cyclohexyl und
Y = CONH&sub2;, COCO&sub2;H, COCONHCH&sub3;,
und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt. TABELLE 1 TABELLE 1 (Forts.) TABELLE 1 (Forts.)

Assay zur Bestimmung der Proteinaseinhibierung

Assays von menschlichem a-Thrombin und bovinem Trypsin wurden bei 25ºC in 0,05 M TRIS-Puffer pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,1% PEG durchgeführt. Trypsin-Assays enthielten auch 1 mM CaCl&sub2;.
Bei den Assays, bei denen die Hydrolysegeschwindigkeiten eines p-Nitroanilid(pna)-Substrats bestimmt wurden, wurde ein Thermomax-Plattenlesegerät mit 96 Vertiefungen verwendet, um (bei 405 nm) das zeitabhängige Auftauchen von p-Nitroanilin zu messen. sar-PR-pna wurde verwendet, um menschliches α-Thrombin (Km = 125 uM) und bovines Trypsin (Km = 125 uM) zu untersuchen. Die p- Nitroanilidsubstratkonzentration wurde durch Messungen der Extinktion bei 342 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 8270 cm&supmin;¹M&supmin;¹ ermittelt.
Bei bestimmten Untersuchungen mit wirksamen Inhibitoren (Ki < 10 nM), wo der Thrombininhibierungsgrad hoch war, wurde ein empfindlicheres Aktivitäts-Assay verwendet. Bei diesem Assay wurde die Geschwindigkeit der thrombinkatalysierten Hydrolyse des fluorgenen Substrats Z-GPR-afc (Km = 27 uM) aus der Zunahme der Fluoreszenz bei 500 nm (Anregung bei 400 nm) in Verbindung mit der 7-Amino-4-trifluormethylcumann-Erzeugung bestimmt. Die Konzentrationen der Stammlösungen von Z-GPR-afc wurden durch Messungen der Extinktion bei 380 nm des 7-Amino-4-trifluormethylcumarins, das am Ende der Hydrolyse eines Aliquots der Stammlösung durch Thrombin erzeugt wird, ermittelt.
Aktivitäts-Assays wurden durch wenigstens zehnfaches Verdünnen einer Stammlösung des Substrats bis zu einer Endkonzentration von ≤ 0,1 Km, in einer Lösung, die Enzym oder mit Inhibitor äquilibriertes Enzym enthielt, durchgeführt. Die Zeiten, die nötig waren, um eine Äquilibrierung zwischen dem Enzym und dem Inhibitor zu erreichen, wurden in Kontrollversuchen ermittelt. Die Anfangsgeschwindigkeiten der Produktbildung in Abwesenheit (V&sub0;) oder Anwesenheit (Vi) von Inhibitor wurden gemessen. Wenn von einer kompetitiven Inhibierung ausgegangen wird und angenommen wird, daß die Einheit vernachlässigbar ist, verglichen mit Km/[S], [I]/e und [I]/e (wobei [S], [I] und e die jeweiligen Gesamtkonzentrationen von Substrat, Inhibitor und Enzym sind), kann die Gleichgewichtskonstante (Ki) für die Dissoziation des Inhibitors von dem Enzym aus der Abhängigkeit von V&sub0;/V&sub1; von [I], die in Gleichung 1 gezeigt ist, erhalten werden.
V&sub0;/Vi = 1 + [I]/Ki (1)
Die in diesem Assay gezeigten Aktivitäten zeigen, daß die Verbindungen der Erfindung therapeutischen Nutzen bei der Behandlung verschiedener Zustände bei Patienten, die an instabiler Angina, refraktärer Angina, Myokardinfarkt, flüchtigen Ischämieattacken, Kammerflimmern, thrombotischem Infarkt, embolischem Infarkt, tiefer Venenthrombose, Verbrauchskoagulopathie und Reokklusion oder Restenose von rekanalisierten Gefäßen leiden, haben. Formulierungs- und Verabreichungsverfahren sind in dem nachstehenden Beispieleabschnitt beschrieben.
Die zur Beschreibung der Peptidverbindungen der Erfindung verwendete Nomenklatur richtet sich nach der herkömmlichen Praxis, wobei davon ausgegangen wird, daß die N-terminale Aminogruppe links und die Carboxygruppe rechts von jedem Aminosäurerest in dem Peptid steht. Bei den Formeln, die ausgewählte spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bedeuten, versteht es sich, daß, sofern nichts anderes angegeben ist, die amino- und carboxyterminalen Gruppen, obwohl oft nicht speziell gezeigt, in der Form vorliegen, die sie bei physiologischen pH-Werten einnehmen würden. Somit versteht es sich, daß das N-terminale H&spplus;&sub2;- und das C-terminale O&supmin; bei physiologischen pH-Werten vorliegen, obgleich es nicht notwendigerweise entweder in den speziellen Beispielen oder in den allgemeinen Formeln angegeben und gezeigt ist. Freie funktionelle Gruppen an den Seitenketten der Aminosäurereste können auch durch Amidierung, Acylierung oder andere Substitution modifiziert werden, welche zum Beispiel die Löslichkeit der Verbindungen ändern kann, ohne ihre Wirkung zu beeinflussen.
Bei den gezeigten Peptiden wird, wo passend, jeder Rest durch seine Kennzeichnung aus drei Buchstaben dargestellt, welche dem Trivialnamen der Aminosäure entspricht. Zusätzlich zu den üblicherweise verwendeten Abkürzungen zur Darstellung von natürlichen Aminosäuren wird auch die Abkürzung für Naphthylalanin, Nal, verwendet, z. B. D-Nal1, D-Nal2. Nail bezieht sich auf die Aminosäure, bei der der beta-Kohlenstoff von Alanin an die 1-Naphthylposition gebunden ist, und Nal2 bezieht sich auf die Aminosäure, bei der der beta-Kohlenstoff von Alanin an die 2-Naphthylposition gebunden ist.
Bei den in der vorliegenden Anmeldung gezeigten speziellen Peptiden ist die L-Form eines jeden Aminosäurerestes mit einem optischen Isomer gemeint, sofern nicht die D-Form ausdrücklich angegeben ist.

BEISPIEL 1

Boc-NMe-D-Phe-Pro-OBz (1-1)

Zu einer Lösung von Boc-NMe-D-Phe-OH (7,0 g, 25 mmol) und H-Pro- OBzl·HCl (6,66 g, 27,5 mmol) in 200 ml DMF wurden 4,6 g (30 mmol) HOBt·H&sub2;O zugegeben, der pH-Wert der Lösung wurde auf 8 eingestellt (angefeuchtetes schmales pH-Papier), und unter magnetischem Rühren wurde EDC (6,47 g, 33,8 mmol) zugegeben. Nach 3,5 Stunden wurde die Reaktion durch die Zugabe von 50 ml Wasser gequencht. Nachdem die Mischung 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten wurde, wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand in EtOAc-H&sub2;O gelöst. Zu dieser zweiphasigen Mischung wurde wäßriges KHSO&sub4; zugegeben, und die Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit NaHCO&sub3;, gesättigtem NaCl extrahiert und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, um das Produkt als einen weißen Feststoff zu ergeben, der durch Chromatographie unter Verwendung von zwei Säulen mit jeweils 600 g Kieselgel 60 (E. Merck) und Elution mit EtOAc-Hexan (3 : 7) weiter gereinigt wurde. Die Fraktionen, die Produkt enthielten, wurden vereint, um 11,3 g (97%ige Ausbeute) an 1-1 zu ergeben.
DC: Rf = 0,65, Kieselgel, EtOAc-Hexan (2 : 3)

Boc-NMe-D-Phe-Pro-OH (1-2)

Eine Lösung von Boc-NMe-D-Phe-Pro-OBz (1-1) (11,3 g) in 600 ml 95%igem EtOH wurde dreimal mit N2 gespült und mit 1,8 g 10% Pd/C unter N&sub2; versetzt. Die Mischung wurde evakuiert, Hz wurde eingebracht und die Reaktionsmischung 50 Minuten lang unter einer H&sub2;- Atmosphäre (mit H&sub2; gefüllter Ballon) gehalten. Die Mischung wurde mit N&sub2; gespült, durch Celite filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Das viskose Öl wurde mehrere Male mit CHCl&sub3; gespült, um einen schaumigen weißen Feststoff 1-2 zu ergeben (9,13 g, 100%ige Ausbeute).
DC: Rf = 0, Kieselgel, EtOAc-Hexan (2 : 3); Rf = 0,3, CHCl&sub3;-MeOH-H&sub2;O (90-10-1) BEISPIEL 2
In der folgenden Beschreibung bedeutet "Acg" 4-Aminocyclohexylglycin.

Boc-trans-DL-Acg-OH (2-1)

Gemäß Nutt et al., Peptides: Structure and Function, Proceed, of the 9th Amer. Pept. Symp., Hrsg. C. Deber et al., Pierce Chemical Co. Rockford, IL, 441-444 (1985), wurde 2-1 erhalten. Banfi et al., Syn. Commun. 19 (9&10), 1787-1799 (1989) beschreibt ebenfalls die Synthese der ungeschützten Aminosäure trans-DL-Acg-OH.

Boc-trans-DL-Acg(Cbz)-OH (2-2)

2-1 wurde gemäß dem Verfahren von Nutt et al. Cbz-geschützt, um Boc-trans-DL-Acg(Cbz)-OH (2-2) zu ergeben.

Boc-trans-DL-Acg(Cbz)-NMeOMe (2-3)

Zu einer Suspension von Boc-trans-Acg(Cbz)-OH (2-2) (794 mg, 1,94 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde N-Methylmorpholin (NMM, 0,22 ml) zugegeben. Nach 15minütigem magnetischem Rühren war das gesamte Ausgangsmaterial in Lösung gegangen. Die Temperatur wurde auf -15ºC gesenkt, und i-Butylchlorformiat (0,25 ml, 0,27 g) wurde zugegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang gerührt und mit vorgetrocknetem HNMeOMe·HCl (0,22 g) versetzt, gefolgt von NMM (zunächst 0,15 ml, innerhalb der nächsten 40 Minuten 0,17 ml in Inkrementen). Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmen und 18 Stunden lang rühren. Wasser wurde zu der Reaktion hinzugegeben, und nach 30minütigem Rühren wurde CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben und die organische Schicht 1mal mit KHSO-Lösung, 1mal mit H&sub2;O, 1mal mit NaHCO&sub3;-Lösung und 2mal mit 50%igem gesättigtem NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft, um 2-3 (746 mg, 85%ige Ausbeute) zu ergeben. Aus dem NaHCO&sub3;-Extrakt wurde Ausgangsmaterial (101 mg, 12,7%) wiedergewonnen.
DC: Rf = 0,75, Kieselgel, CHCl&sub3;-MeOH-H&sub2;O (95-5-0,5)
HPLC: Retentionszeiten = 19,43 Minuten, (Vydac C&sub1;&sub8;, Gradient von 95% A/B auf 5% A/B innerhalb von 30 Minuten, A = 0,1% TFA-H&sub2;O, B = 0,1% TFA-CH&sub3;CN
NMR: CD&sub3;OD, δ 7,4 (m, 5), 5,1 (s, 2), 4, 5 (br. m, 1), 3,0 (s, 3), 3,3 (MeOH), 3,2 (s, 3), 1,95 (m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,62 (m, 2H), 1,45 (s, 9), 1,1-1,3 (m, 4).

Boc-trans-DL-Acg(Cbz)ψ[CHO] (2-4)

In einen getrockneten Kolben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Thermometer und einem Septum ausgestattet war, wurden 616 mg (1,37 mmol) Boc-t-Acg(Cbz)-NMeOMe (2-3) und 18 ml trockenes THF gegeben. Die Suspension wurde auf -40ºC abgekühlt und die LAH- Lösung (1,78 ml 1M LAH in THF) tropfenweise mit einer derartigen Geschwindigkeit zugegeben, daß die Reaktionstemperatur unterhalb -30ºC gehalten wurde. Die resultierende Lösung wurde bei -5ºC 50 Minuten lang gerührt, dann auf -35ºC abgekühlt. Ether (15 ml) und eine wäßrige Lösung von KHSO&sub4; wurden zugegeben, wobei die Temperatur bei -15ºC gehalten wurde. Die zweischichtige Mischung wurde 30 Minuten lang Raumtemperatur gerührt, die Schichten wurden getrennt und die wäßrige Schicht zweimal mit Ether extrahiert. Die kombinierten Etherschichten wurden einmal mit kalter IN HCl (3 ml), kalter 5%iger NaHCO&sub3;-Losung (3 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (3 ml) extrahiert. Die Etherschicht wurde über wasserfreiem MgSC getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, um 477 mg (89%ige Ausbeute) an (2-4) zu ergeben.
DC: Rf = 0,7, Kieselgel, EtOAc-Hexan (3 : 2)
HPLC: Retentionszeit 18,8 Minuten; C&sub1;&sub8;, 100% A auf 70% A/B innerhalb von 30 Minuten, A = 0,1% TFA-H&sub2;O, B = 0,1% TFA-CH&sub3;CN
NMR: CDCl&sub3;, δ 9,62 (s, 1), 7,4 (m, 5), 5,1 (m, 3), 4,58 (d, 1), 4,25 (t, 1), 3,42 (m, 1), 2,1 (m, 2), 1,9 (m, 2), 1,62 (m, 1), 1,58 (breit, H&sub2;O), 1,42 (s, 9), 1,25 (m, 2), 1,18 (m, 2).

Boc-trans-DL-Acg(Cbz)ψ[CHOHC(SEt)&sub3;] (2-5)

Zu einem trockenen 100-ml-3-Halskolben, der mit einem Thermometer, einem Magnetrührer und einem Zugabetrichter ausgestattet war, wurde unter N&sub2; Triethylthioorthoformiat (1,65 ml, 8,43 mmol) in trockenem THF (15 ml) zugegeben. Die Lösung wurde auf -65ºC abgekühlt und tropfenweise mit BuLi in THF (2,89 ml, 7,23 mmol) mit einer derartigen Geschwindigkeit versetzt, daß die Temperatur unter -50ºC blieb. Die Reaktionslösung wurde 30 Minuten lang bei -60ºC gerührt, und eine Lösung von Boc-trans-Acg(Cbz)ψ[CHO) (2-4) (470 mg, 1,2 mmol) in THF (4 ml) wurde tropfenweise zugegeben, wobei die Reaktionslösung bei -55ºC gehalten wurde. Der Zugabetrichter wurde mit zwei 1-ml-Portionen THF gewaschen. Nach 2stündigem Rühren bei -40ºC wurde eine Lösung von NHCl (0,6 g) in H&sub2;O (13/5 ml) und Ether (27 ml) zugegeben, und man ließ die Reaktionsmischung auf 10ºC erwärmen. Die zwei Schichten wurden getrennt und die wäßrige Schicht zweimal mit Ether extrahiert. Die vereinten Etherschichten wurden einmal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt, um einen öligen Rückstand zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie unter Verwendung von 90 g Kieselgel (E. Merck 230-400 Mesh) und EtOAc- Hexan (3 : 9) als Elutions-Lösungsmittel gereinigt. Die Fraktionen, die Produkt (Rf = 0,3, EtOAc-Hexan 3 : 7) enthielten, wurden vereint und das Lösungsmittel durch Eindampfen entfernt, um 2-5 (317 mg, 45%ige Ausbeute) zu ergeben.
DC: Rf = 0,3, Kieselgel, EtOAc-Hexan (3 : 7)
HPLC: Retentionszeiten = 25,25 Minuten und 25,72 Minuten, Verhältnis 1 : 4 (Vydac C&sub1;&sub8;, Gradient von 80% A/B auf 10% A/B innerhalb von 30 Minuten, A = 0,1% TFA-H&sub2;O, B = 0,1% TFa-CH&sub3;CN.
Retentionszeiten = 26,95 Minuten und 27,36 Minuten, Verhältnis 1 : 4 (Vydac C&sub1;&sub8;, Gradient von 95% A/B auf 5% A/B innerhalb von 30 Minuten.

Boc-trans-DL-Acg(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe (2-6)

Zu einer Lösung von Boc-trans-Acg (Cbz)ψ[CHOHC (SEt&sub3;] (2-5) (310 mg, 0,528 mmol) in MeOH-H&sub2;O (18 ml, 17 : 1) wurde unter N&sub2; und magnetischem Rühren mit HgO (183 mg, 0,845 mmol) und HgCl&sub2; (674 mg, 2,48 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur und 30 Minuten lang bei 60ºC gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung durch Celite filtriert, das Celite wurde mit zwei 1-ml-Portionen MeOH und drei 5-ml-Portionen CHzCl gewaschen. Zu dem Filtrat wurden H&sub2;O (20 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) zugegeben, die Schichten wurden getrennt und die wäßrige Schicht zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) extrahiert. Zu den vereinten organischen Schichten wurde 70%iges NH&sub4;OAc in H&sub2;O zugegeben, die CH&sub2;Cl&sub2;-Schicht wurde von der dreiphasigen Mischung entfernt, die verbleibende Mischung wurde zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, die vereinten organischen Schichten wurden einmal mit gesättigter NH&sub4;Cl-Lösung gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, um 2-6 (215 mg, 90,4%ige Ausbeute) zu ergeben.
DC: Rf = 0,4 (Haupt), 0,35 (Neben), Kieselgel, EtOAc-Hexan (1 : 1).
HPLC: Retentionszeiten = 18,67 Minuten und 19,02 Minuten, Verhältnis 1 : 4 (Vydac C&sub1;&sub8;, Gradient von 95% A/B auf 5% A/B innerhalb von 30 Minuten, A = 0,1% TFA-H&sub2;O, B = 0,1% TFA-CH&sub3;CN. BEISPIEL 3

Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe (3-1)

Herstellung des HCl-Salzes von t-DL-Acg(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe: Eine Lösung von Boc-trans-Acg(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe (202 mg, 0,448 mmol) in EtOAc (20 ml) wurde unter N&sub2; auf -25ºC abgekühlt, und gasförmiges HCl wurde bis zur Sättigung eingeleitet, wobei die Reaktionstemperatur unterhalb -5ºC gehalten wurde. Nach 10 Minuten bei Sättigung wurde die Lösung 45 Minuten lang mit N&sub2; gespült, anschließend wurden überschüssiges HCl und Lösungsmittel durch Eindampfen im Vakuum entfernt, um das ölige HCl-Salz zu ergeben.

Herstellung von Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe (3 : 1)

Während das Entfernen der Schutzgruppe durchgeführt wurde, wurde eine Lösung von Boc-NMe-D-Phe-Pro-OH (1-2) (187 mg, 0,493 mmol) in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 3 ml EtOAc, zu der 54 ul NMM zugegeben worden war, unter N&sub2; auf -15ºC abgekühlt und mit 64 ul i-Butylchlorformiat behandelt. Nach 10 Minuten bei -15ºC wurde eine Lösung des oben hergestellten HCl-Salzes in 4 ml CH&sub2;Cl&sub2; portionsweise zugegeben, abwechselnd mit NMM (50 ul), gefolgt von der NMM-Zugabe (35 ul), um den pH-Wert auf 7 (angefeuchtetes schmales pH-Papier) zu bringen. Der Kupplung schloß sich die DC (85-15-1,5, CHCl&sub3;-MeOH-H&sub2;O) bis zum Verschwinden des Nukleophils an. Nach 2 Stunden bei -10ºC wurde H&sub2;O zugegeben, die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt, die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht 1mal mit verdünnter KHSO&sub4;-Lösung, 1mal mit H&sub2;O, 1mal mit NaHCO&sub3;-Lösung und 2mal mit 50%igem gesättigtem NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde über Nasser getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie auf Kieselgel mit 99-1-0,1 (CHCl&sub3;-MeOH-H&sub2;O) als Elutionsmittel gereinigt, und die vereinten produkthaltigen Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft, um 3-1 als einen weißen Feststoff zu ergeben (275 mg, 87%ige Ausbeute).
DC: Rf = 0,45, 0,5 (2 Isomere), Kieselgel, CHCl&sub3;-MeOH-H&sub2;O (95-5- 0,5).
HPLC: Retentionszeiten = 17,2 Minuten und 17,5 Minuten, Verhältnis 46 : 43, (Vydac C&sub1;&sub8;, Gradient von 75% A/B auf 20% A/B innerhalb von 30 Minuten, A = 0,1% TFA-H&sub2;O, B = 0,1% TFA-CH&sub3;CN.

Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)Ψ[CHOHCO]-OH (3-2)

Eine Probe von Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)Ψ[CHOHCO]-OMe (3-1) (270 mg, 0,38 mmol), gelöst in 17 ml 1 : 1 (Vol./Vol.) THF/H&sub2;O, wurde mit 2,2 N LiOH (0,22 ml) innerhalb von 1,5 Stunden portionsweise behandelt, wobei der pH-Wert bei 12-13 gehalten wurde. Nach 2,5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit verdünnter KHSO-Lösung auf pH 7 eingestellt, 50 ml EtOAc und 25 ml H&sub2;O wurden zugegeben und die wäßrige Schicht wurde weiter mit KHSO&sub4;-Lösung auf pH 2 eingestellt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und zweimal mit 50%iger gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingedampft, um 3-2 (251 mg, 95%ige Ausbeute) zu ergeben.
DC: Rf = 0,4, Kieselgel, obere Schicht aus EtOAc-AcOH-i-Octan-H&sub2;O (12-2-2-10).
3-2 wurde oxidiert und die Schutzgruppe entfernt, wobei die in dem nachstehenden Beispiel 4 beschriebenen Verfahren nachgearbeitet wurden, um 3-3 zu ergeben. BEISPIEL 4

Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)Ψ[CHOHCO]-NHMe (4-1)

Zu einer Lösung von Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg (Cbz)Ψ[CHOHCO]-OH (3- 2) (125 mg, 0,18 mmol) in 6,5 ml Dimethylacetamid wurden 34 mg 1- Hydroxybenzotriazolhydrat (HOBt), 35 ul NMM und 29 mg Methylamin- Hydrochlorid zugegeben und die Mischung 15 Minuten lang gerührt, um eine vollständige Auflösung zu erreichen. Zu dieser Lösung wurde 1- (3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC, 51 mg) zugegeben und die resultierende Mischung 20 Stunden lang magnetisch gerührt. Wasser (30 ml) und EtOAc (75 ml) wurden zugegeben und die organische Schicht mit verdünnter KHSO&sub4;-Lösung, H&sub2;O, NaHCO&sub3;-Lösung und 50%igem gesättigtem NaCl gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, um 4-1 (117 mg, 92%ige Ausbeute) zu ergeben.
DC: Rf = 0,3, Kieselgel, CHCl&sub3;-MeOH-H&sub2;O (95-5-0,5).

Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)Ψ[COCO]-NHMe (4-2)

Zu einer Lösung von Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)Ψ[CHOHCO]-NHMe (4-1) (115 mg, 0,16 mmol) in 9 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurden unter magnetischem Rühren 0,46 g Periodinan (Dess-Martin-Reagenz) zugegeben. Nach 1 Stunde wurde Ether (45 ml) zugegeben, gefolgt von der Zugabe einer Natriumthiosulfatlösung (2,0 g in 25 ml gesättigtem NaHCO&sub3;). Nach 5 Minuten waren beide Schichten klar, und die Etherschicht wurde abgetrennt und mit verdünntem NaHCO&sub3;, 50%igem gesättigtem NaCl gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum eingedampft, um rohes Ketoamid 4-2 zu ergeben.
DC: Rf = 0,50, Kieselgel, CHCl&sub3;-MeOH-H&sub2;O (95-5-0,5).

H-NMe-D-Phe-Pro-t-D-AcgΨ[COCO]-NHMe (4-3) und H-NMe-D-Phe-Pro-t-L-AcgΨ[COCO]-NHMe (4-4)

Eine Lösung von Boc-NMe-D-Phe-Pro-t-DL-Acg(Cbz)Ψ[COCO]-NHMe (4-2) (125 mg) in 4 ml CH&sub2;Cl&sub2; in einem HF-Reaktorgefäß (Kel-F) wurde durch N&sub2;-Spülung vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand in 1,2 ml Anisol evakuiert, um restliches CH&sub2;Cl&sub2; zu entfernen. Etwa 12 ml HF wurden bei -70ºC in das Reaktionsgefäß einkondensiert. Nach 1,25 Stunden langem Rühren bei 0-5ºC wurde das HF im Vakuum entfernt, und 20 ml Ether, gefolgt von 20 ml Petrolether, wurden zu dem Rückstand hinzugegeben. Der Überstand wurde in einen Sinterglastrichter dekantiert, und der klebrige Rückstand wurde mit 3 Portionen 1 : 1 (Vol./Vol.) Ether/Petrolether gewaschen, wobei jedesmal wie oben abdekantiert wurde. Nach dem Trocknen in einem N&sub2;-Strom wurde der Rückstand in dem Gefäß in 25 ml H&sub2;O gelöst, wobei die Lösung durch den obigen Sinterglastrichter gegossen wurde, um eine vollständige Wiedergewinnung des Produkts sicherzustellen. Das Filtrat, das die beiden diastereomeren Produkte enthielt, wurde direkt auf die präparative HPLC-Waters-Prep-Pak-C&sub1;&sub8;-Säule geladen, wobei ein Gradientenelutionssystem von 100% A auf 60% A/B innerhalb von 120 mm bei einer Fließrate von 80 ml/Minute verwendet wurde. Der spätere Elutionspeak der beiden Isomere war der wirksamere Thrombi ninhibitor und hatte die L-Konfiguration (4-4) am Acg-Zentrum.
HPLC: Retentionszeiten = 16,7 Minuten (D) und 18,5 Minuten (L), Vydac C&sub1;&sub8;, Gradient von 100% A auf 65% A/B innerhalb von 30 Minuten, A = 0,1% TFA-HzO, B = 0,1% TFA-CiCN.
FABMS für beide Isomere: 472 (M+H), 504 (M+MeOH), berechn. Mol.- Gew. = 472.

Thrombininhibitoren - Therapeutische Anwendungen

Eine Antikoagulantientherapie ist für die Behandlung und Prävention einer Reihe von thrombotischen Zuständen, insbesondere Koronararterien- und zerebrovaskulärer Erkrankung, indiziert. Diejenigen, die auf diesem Gebiet Erfahrung haben, sind sich den Umständen, die eine Antikoagulantientherapie erfordern, klar bewußt. Die Bezeichnung "Patient", die hier verwendet wird, soll Säugetiere, wie z. B. Primaten, einschließlich Menschen, Schafe, Pferde, Rinder, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse, bedeuten.
Die Thrombin-Inhibierung ist nicht nur bei der Antikoagulantientherapie von Personen mit thrombotischen Zuständen geeignet, sondern eignet sich auch, wann immer die Inhibierung der Blutkoagulation erforderlich ist, wie z. B. um die Koagulation von gelagertem Vollblut zu verhindert und die Koagulation bei anderen biologischen Proben zum Test oder zur Lagerung zu verhindern. Somit können die Thrombin-Inhibitoren zu jedem beliebigen Medium hinzugegeben oder damit in Kontakt gebracht werden, das Thrombin enthält oder von dem vermutet wird, daß es Thrombin enthält, und bei dem es erwünscht ist, daß die Blutkoagulation inhibiert wird, z. B. wenn das Säugetierblut mit Material, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gefäßtransplantaten, Gefäßstützen, orthopädischen Prothesen, Herzprothesen und extrakorporalen Kreislaufsystemen, in Kontakt gebracht wird.
Die Thrombin-Inhibitoren der Erfindung können in solchen oralen Formen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen mit verzögerter und zeitlich festgelegter Abgabe), Pillen, Pulvern, Granulaten, Elixieren, Tinkturen, Suspensionen, Sirupen und Emulsionen verabreicht werden. Ebenso können sie in intravenöser (sowohl als Bolus als auch als Infusion), intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei jeweils Formen verwendet werden, die den Durchschnittsfachleuten auf pharmazeutischem Gebiet gut bekannt sind. Eine wirksame, jedoch nichttoxische Menge der erwünschten Verbindung kann als ein Antiaggregationsmittel eingesetzt werden.
Die Thrombininhibitoren können in Form einer Depotinjektion oder eines Implantatpräparats verabreicht werden, welches derart formuliert sein kann, daß eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffes ermöglicht wird. Der Wirkstoff kann zu Pellets oder kleinen Zylindern gepreßt werden und subkutan oder intramuskulär als Depotinjektionen oder -implantate implantiert werden. Die Implantate können inerte Materialien, wie z. B. biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silicone, zum Beispiel Silastic, Siliconkautschuk oder andere Polymere, die von der Dow-Corning Corporation hergestellt werden, einsetzen.
Die Thrombin-Inhibitoren können auch in Form von Liposomabgabesystemen, wie z. B. kleinen einlamellaren Vesikeln, großen einlamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln, verabreicht werden. Liposome können aus einer Vielzahl von Phospholipiden, wie z. B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Die Thrombin-Inhibitoren können auch durch die Verwendung monoklonaler Antikörper als einzelne Träger, an die die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind, zugeführt werden. Die Thrombin- Inhibitoren können auch mit löslichen Polymeren als auf ein Ziel ausrichtbare Arzneistoffträger gekoppelt sein. Solche Polymere können u. a. Polyvinylpyrrolidon, Pyrancopolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder mit Palmitoylresten substituiertes Polyethylenoxidpolylysin sein. Darüber hinaus können die Thrombin-Inhibitoren an eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt sein, die geeignet sind, eine gesteuerte Arzneistoffabgabe zu erzielen, zum Beispiel Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymere aus Polymilch- und Polyglycolsäure, Poly-epsilon-caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipatische Blockcopolymere von Hydrogelen.
Das Dosisregime bei der Verwendung der Thrombin-Inhibitoren wird gemäß einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, der Schwere des zu behandelnden Zustandes, des Verabreichungsweges, der Nieren- und Leber-Funktion des Patienten und der verwendeten speziellen Verbindung oder des verwendeten speziellen Salzes davon. Ein Arzt oder Tierarzt mit durchschnittlichen fachlichen Fähigkeiten kann leicht die wirksame Menge des Arzneistoffes, die benötigt wird, um das Fortschreiten des Zustandes zu verhindern, zu bekämpfen oder aufzuhalten, ermitteln und verschreiben.
Orale Dosen der Thrombin-Inhibitoren werden, wenn sie für die angegebenen Wirkungen eingesetzt werden, zwischen etwa 0,2 mg pro kg Körpergewicht pro Tag (mg/kg/Tag) bis etwa 100 mg/kg/Tag und vorzugsweise 1,0-100 mg/kg/Tag und besonders bevorzugt 1-20 mg/kg/Tag liegen. Intravenös werden die bevorzugtesten Dosen von etwa 0,01 bis etwa 10 mg/kg/Minute bei einer Infusion mit konstanter Rate reichen. Vorteilhafterweise können die Thrombin- Inhibitoren in Teildosen zwei-, drei- oder viermal am Tag verabreicht werden. Ferner können sie auch in intranasaler Form durch topische Verwendung geeigneter Intranasalvehikel oder auf transdermalen Wegen verabreicht werden, wobei jene Formen transdermaler Hautpflaster verwendet werden, die den Durchschnittsfachleuten gut bekannt sind. Zur Verabreichung in der Form eines transdermalen Abgabesystems wird die Dosisverabreichung während der Dosistherapie natürlich kontinuierlich anstatt intermittierend sein.
Die Thrombin-Inhibitoren werden typischerweise als Wirkstoffe mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen oder Trägern (hierin gemeinsam als "Träger"-Materialen bezeichnet) vermischt verabreicht, welche im Hinblick auf die vorgesehene Verabreichungsform, d. h. Oraltabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dergleichen, und in Übereinstimmung mit herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken geeignet ausgewählt werden.
Zum Beispiel kann zur oralen Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die wirksame Arzneistoffkomponente mit einem oralen, nichttoxischen pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z. B. Lactose, Stärke, Saccharose, Glucose, Methylcellulose, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat, Calciumsulfat, Mannit, Sorbit und dergleichen, kombiniert werden; zur oralen Verabreichung in flüssiger Form können die oralen Arzneistoffkomponenten mit einem beliebigen oralen nichttoxischen pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z. B. Ethanol, Glycerin, Wasser und dergleichen, kombiniert werden. Darüber hinaus können, falls erwünscht oder notwendig, auch geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Sprengmittel und Färbemittel in die Mischung eingebracht werden. Geeignete Bindemittel sind u. a. Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie z. B. Glukose oder beta-Lactose, Maissüßmittel, natürliche und synthetische Gummen, wie z. B. Akazien-, Tragantgummi oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol. Wachse und dergleichen. Gleitmittel, die in diesen Dosisformen verwendet werden, sind u. a. Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dergleichen. Sprengmittel sind u. a., ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dergleichen.
Die Thrombin-Inhibitoren können auch zusammen mit geeigneten Antikoagulationsmitteln oder Thrombolytika, wie z. B. Plasminogenaktivatoren oder Streptokinase, verabreicht werden, um synergistische Wirkungen bei der Behandlung verschiedener Gefäßpathologien zu erzielen. Zum Beispiel steigern Thrombininhibitoren die Wirkung von gewebeplasminogenaktivator-vermittelter thrombolytischer Reperfusion. Thrombininhibitoren können zuerst im Anschluß an die Thrombusbildung verabreicht werden, und anschließend wird der Gewebeplasminogenaktivator oder ein anderer Plasminogenaktivator verabreicht. Sie können auch mit Heparin, Aspirin oder Warfarin kombiniert werden.

Claims

1. Verbindungen der Formel

wobei:

m = 0 oder 1,

n = 0,1 oder 2,

X = 0 oder H&sub2;,

R = Arylsulfonyl, Aminoacyl, Acylaminoacyl, N-C&sub1;&submin;&sub3;-Alkylaminoacyl, Acyl-N-C&sub1;&submin;&sub3;-alkylaminoacyl, Arylacyl, Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkanoyl, Hydroxyacyl, Aryloxycarbonyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyloxycarbonyl oder

R" = Aryl, Heteroaryl, C&sub5;&submin;&sub1;&sub1;-carbomonocyclisch oder C&sub5;&submin;&sub1;&sub1;-carbobicyclisch,

R¹ = H oder CH&sub3;,

R² = H oder CH&sub3;,

R³ = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, Hydroxy-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Carboxy-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Amino-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Guanido-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl, Aryl oder substituiertes Aryl, Arylmethyl, C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkylmethyl oder C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl,

Y = CHO, COCF&sub3;, BO&sub2;R&sup7;R&sup8;, CO&sub2;R&sup4;, COOH, CONR&sup5;R&sup6;, COCO&sub2;R&sup4;, COCO&sub2;H, COCO-Q oder CO-W,

wobei

Q = eine natürliche Aminosäure, Cyclohexylaminosäure, NR&sup5;R&sup6; oder

oder ein Derivat davon, und

W = 5-10gliedrige heterocyclische Gruppen oder substituierte heterocyclische Gruppen,

R&sup4; = C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,

R&sup5; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,

R&sup6; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,

R&sup7; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl und

R&sup8; = H, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl,

und pharmazeutische annehmbare Salze davon.

2. Verbindungen nach Anspruch 1 mit der Formel

wobei:

n = 0, 1 oder 2,

m = 0 oder 1,

R = D-Phenylalanin, D-Nal1, D-Nal2, D-Cyclohexylalanin, D- Tyrosin, β-3-Benzothienyl-D-alanin oder D-3,4-Cl&sub2;-Phenylalanin oder N-Methylderivate davon oder

R¹ = H,

R³ = H oder Cyclohexyl,

X = 0 oder H&sub2; und

Y = CONH&sub2;, COCO&sub2;H, COCONHCH&sub3;, COCONHCH&sub2;Ph,

und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.

3. Verbindungen nach Anspruch 2 mit der Formel:

wobei:

R = N-Methyl-D-Phenylalanin, N-Methyl-2-naphthyl-D-alanin, N-Methyl-1-naphthyl-D-alanin, N-Methyl-D-cyclohexylalanin, N- Methyl-D-3, 4-Cl&sub2;-D-phenylalanin oder

R¹ = H,

R³ = H, Cyclohexyl und

Y = CONH&sub2;, COCO&sub2;H, COCONHCH&sub3;,

und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.

4. Verbindungen nach Anspruch 3, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

5. Eine Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Inhibierung von Thrombin oder Prävention von Thrombus- oder Embolusbildung bei einem Säugetier.

6. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

7. Die Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung von Thrombin oder Prävention von Thrombus- oder Embolusbildung bei einem Säugetier.

8. Die Verwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Prävention der Koagulation von gelagertem Vollblut oder der Koagulation anderer biologischer Proben, die Thrombin enthalten.