DE69431531T2

DE69431531T2 - Immortalisierte menschliche fötale osteoblastenzellen

Info

Publication number: DE69431531T2
Application number: DE69431531T
Authority: DE
Inventors: Steven A. Harris; Thomas C. Spelsberg
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 1993-07-12
Filing date: 1994-07-12
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2014-07-13
Also published as: US5681701A; CA2166973A1; US5693511A; EP0743982A1; AU7327694A; ATE225848T1; CA2166973C; EP0743982B1; WO1995002687A1; DE69431531D1

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der USA durch die Zuschüsse Nrn. AR41652 und AG04875 des National Institute of Health gemacht. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an dieser Erfindung.

Hintergrund der Erfindung

Bei der postmenopausalen Osteoporose handelt es sich um einen Zustand, von dem Millionen von Frauen betroffen sind und der zu schwächenden Knochen- und Rückenmarksverletzungen führt. Dieser Zustand ist aufgrund eines Ungleichgewichts zwischen dem Aufbau von Knochen (durch Osteoblasten) und dem Abbau von Knochen (durch Osteoklasten) durch eine enorme Knochendegeneration gekennzeichnet. Osteoblasten sind Zellen, die aus Bindegewebe-Vorläuferzellen im Knochenmark entstehen und durch Heranreifung mit dem Wachstum der Knochen verbunden sind. Osteoklasten dagegen sind Zellen, die mit der Aufnahme und dem Abbau von Knochensubstanz zu tun haben. Bei normalem Knochen wird das Gleichgewicht zwischen Osteoblasten-vermittelter Knochenbildung und Osteoklasten-vermittelter Knochenresorption durch komplexe Zell-Zell-Wechselwirkungen aufrechterhalten. Um die Ursachen der mit Osteoporose einhergehenden Knochendegeneration zu bestimmen und wirksame Therapieformen für diesen Zustand zu entwickeln, bedürfen die Prozeße der Osteoblastendifferenzierung, Osteoblastenphysiologie, Osteoblasten-Osteoklasten-Kommunikation und Osteoklastenfunktion einer weiteren Untersuchung.
Eine Reihe von Modellsystemen unter Verwendung von Osteoblastenzellen in Kultur wurde entwickelt, um weiteren Einblick in den Knochenbildungsprozeß zu erhalten. Zu den am breitesten verwendeten kultivierten Osteoblastenzellen zählen Primärkulturen, also Zellkulturen, die durch direkte Übertragung von einer natürlichen Quelle in ein künstliches Medium erhalten werden. Diese Zellkulturen können aus normalem Menschen- und Nager-Knochengewebe stammen, ebenso wie aus Osteosarkomzellen, die aus adulten Human- und Nagertumoren erhalten werden. Siehe z. B. P. G. Robey et al., Calcif. Tissue Int., 37, 453 (1985; W. A. Peck et al., Endocrinology, 100, 1357 (1977); R. T. Franceschi et al., J. Cell. Physiol., 123, 401 (1985); C. H. Heldin et al., Nature, 319, 511 (1986); S. B. Rodan et al., Cancer Res., 47, 4961 (1987); M. Kirstein et al., J. Cell. Physiol., 134, 479 (1988); G. A. Rodan et al., in Bone and Mineral Research; W. A. Peck, Hrsg.; Elsevier: 244 (1984); und T. J. Martin et al., Methods Enzymol., 145, 324 (1987). Diese Modellsysteme haben, ebenso wie weitere Osteoblasten-Zellsysteme, in starkem Maße zum Verständnis der Osteoblasten-Biologie beigetragen. Allerdings stößt jedes dieser Modellsysteme bezüglich seiner Anwendbarkeit auf die Untersuchung der menschlichen Osteoblasten-Biologie und von Hormonen, wie Östrogen oder Wachstumsfaktoren, auf Grenzen. Weiterhin sind diese Modellsysteme nicht auf Behandlungsmethoden für den Verlust von Knochensubstanz beim Menschen anwendbar.
Von Nager-Spezies abstammende Osteoblasten-Kulturen sind darin problematisch, daß sie Spezies-spezifische phänotypische Eigenschaften zeigen können, die von denen menschlicher Osteoblastenkulturen abweichen. Osteosarkomzellen vermehren sich in Kultur rasch, sind jedoch ungeeignet, da sie einen von untransformierten Zellen verschiedenen Phänotyp und ein unbekanntes genetisches Transformations-Ereignis zeigen (G. A. Rodan et al., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr., 1, 85 (1991)). Daher können diese Zellen auf eine Behandlung mit Hormon oder Wachstumsfaktor abnormal reagieren. Von normalen adulten menschlichen Knochen stammende Primärkulturen weisen einen normalen Osteoblasten-Phänotyp auf, vermehren sich aber bei sehr niedriger Rate und altern nach relativ kurzer Zeit in Kultur. Als Folge des langsamen Wachstums und der begrenzten Lebensdauer in Kultur sind diese Zellen daher ebenfalls von begrenztem Nutzen.
Um die Grenzen dieser Zellsysteme abzubauen, wurden HOBIT- (human osteoblast-like initial transfectant)-Zellen entwickelt. Diese Zellen stammten von Primärkulturen adulter menschlicher Knochenzellen ab, die mit einem Gen transfiziert waren, das das große T-Protein-Artigen des SC40-Virus exprimiert (P. E. Keeting et al., J. Bone Min. Res., 7, 127 (1992)). Weitere Laboratorien haben von der Herstellung menschlicher Knochenzell-Primärkulturen berichtet, die mit SV40-Virus selbst infiziert waren (H. Chiba et al., Jpn. J. Cancer Res., 84, 290 (1993)). Obschon diese letzteren Zellen aus normalen fetalen Knochenzellen entwickelt wurden, stellen sie keine homogenen Populationen dar. Außerdem exprimieren diese adulten und fetalen SV40-transformierten Zellen zwar viele Osteoblasten-phänotypische Marker, doch ist die Expression des großen T-Antigens (T Ag) des SV40 konstitutiv und daher nicht manipulierbar. Der Nutzen der mit Wildtyp-SV40-Virus infizierten Osteoblastenzellen ist außerdem durch weitere Umstände beschränkt, wie etwa einer nicht-klonalen Abstammung und einer Expression anderer Virusproteine. Als Folge dessen können Abweichungen beim Phänotyp innerhalb von Zell-Subpopulationen vorliegen oder können durch Virusinfektion hervorgerufene phänotypische Veränderungen auftreten.
Die nutzbringenden Wirkungen von Östrogen in der Behandlung eines Knochenverlusts bei der postmenopausalen Osteoporose sind wohlbekannt. R. Lindsay, Osteoprososis: Recent Advances in Pathogenesis and Treatment; University Park Press: Baltimore, MD; 481 (1981); B. L. Riggs et al., J. Clin. Invest., 51, 1659-1663 (1972); und U.S. Barzel, Am. J. Med., 85, 847-850 (1988). Allerdings bleiben die an der direkten Wirkung von Östrogen auf menschliche Knochenzellen beteiligten Mechanismen unklar. Geringe Höhen der Östrogenrezeptor-Expression wurden sowohl bei kultivierten normalen menschlichen Osteoblastenzellen als auch bei bestimmten Menschen- und Ratten-Osteosarkom-Zelllinien nachgewiesen. Da jedoch bei Nagern kein Knochenumbau eintritt, ist unklar, ob die bei Nager-Modellsystemen beobachteten Östrogenwirkungen auf die Genexpression auf Menschen extrapoliert werden können. Außerdem können weitere Speziesspezifischen Unterschiede bezüglich der zellulären Reaktionen auf eine Östrogenbehandlung vorhanden sein. Menschliche Osteosarkomzellen vermehren sich in Kultur rasch, zeigen aber weder eine Kontakthemmung noch den vollen Umfang der mit normalen Osteoblastenzellen verbundenen phänotypischen Eigenschaften. Menschliche Osteoblastenzellen sind phänotypisch normal und zeigen eine Kontakthemmung, jedoch vermehren sie sich sehr langsam und können nur sehr kurze Zeit in Kultur gehalten werden. Die Untersuchbarkeit der Wirkungen einer Östrogenbehandlung direkt an menschlichen Osteoblastenzellen ist daher auch durch das Fehlen eines sich schnell vermehrenden, dennoch phänotypisch normalen Osteobelastenzellmodells eingeschränkt.
Daher besteht Bedarf an von normalen menschlichen Zellen abstammenden Osteoblastenzellen, die diese Nachteile nicht aufweisen. Spezifisch gesagt besteht Bedarf an phänotypisch normalen Osteoblastenzellen, die unendlich weiter gezüchtet werden könnten, sich schnell vermehren und unter Anwendung routinemäßiger Zellkultur-Techniken kontinuierlich fortgepflanzt werden könnten.

Zusammenfassung der Erfindung

Mit der vorliegenden Erfindung werden ich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblasten-(hFOB)- Zellen bereitgestellt. Wie hierin verwendet, bezieht "sich unbegrenzt vermehrende" oder "immortalisierte" Zellen auf eine im wesentlichen kontinuierliche und permanent eingerichtete Zellkultur mit praktisch unbegrenztem Zellteilungspotential. Das heißt, die Zellen können praktisch unendlich, d. h. mindestens etwa sechs Monate lang unter schnellen Wachstumsbedingungen, vorzugsweise viel länger unter langsameren Wachstumsbedingungen, gezüchtet und unter Anwendung routinemäßiger Zellkultur-Techniken schnell und häufig wiederholt vermehrt werden. Anders gesagt können die Zellen der vorliegenden Erfindung über mindestens etwa 100 Populationsverdopplungen kultiviert werden. Diese Zellen erzeugen ein Proteinkomplement, das für normale menschliche Osteoblastenzellen charakteristisch ist, und sind zur Osteoblastendifferenzierung fähig. Sie können bei Untersuchungen von Zellkulturen auf die Empfindlichkeit von Osteoblastenzellen gegenüber verschiedenen Agenzien, wie z. B. Hormonen, Cytokinen und Wachstumsfaktoren, oder in der Gewebetherapie verwendet werden.
Spezifisch gesagt werden mit der vorliegenden Erfindung sich unbegrenzt vermehrende menschliche fetale Osteoblastenzellen bereitgestellt, die eine temperaturempfindliche (ts) Mutante des großen T-Antigens (T Ag) von Simian Virus 40 (SV40) exprimieren. Diese Zellen sind Teil einer bestehenden "Zelllinie", jedoch im allgemeinen nicht tumorgen, d. h. sie erzeugen bei Säugern keine Tumoren. Sie sind vorzugsweise Teil einer homogenen Population. Bevorzugter ist die homogene Population eine klonale Population. Wie hierin verwendet, bezieht sich "klonale" Zellen auf eine homogene Population von Zellen, die von einer einzigen Vorläuferzelle abstammen.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden aus menschlichem fetalem Gewebe isolierte menschliche fetale Knochenzellen mit einem Gen transifiziert, das eine temperaturempfindliche Mutante des großen T-Antigens von SV40 codiert, um sich unbegrenzt vermehrende menschliche fetale Osteoblastenzellen zu erhalten, die hierin als hFOB 1.19 bezeichnet werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Transfektion" auf einen Prozeß, bei dem Fremd-DNA in eukaryontische Zellen eingeführt und exprimiert wird. Diese Fremd-DNA ist typischerweise in einem Expressionsvektor enthalten, z. B. einem zirkulären oder linearisierten Plasmidvektor. Bei der Herstellung einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden menschliche fetale Knochenzellen mittels Elektroporation mit dem Expressionsvektor pUCSVt- sA58 transfiziert. Zusätzlich können die menschlichen fetalen Gewebezellen mit einem wählbaren Markergen transfiziert werden, z. B. einem Gen, das für Resistenz gegenüber einem Agens codiert, das normalerweise für untransformierte Zellen toxisch ist, wie etwa ein Antibiotilcum, ein Antineoplastikum oder ein Herbizid. Bei der Herstellung einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden mit einem Gen für die ts-Mutante von SV40 T Ag transfizierte menschliche fetale Knochenzellen außerdem mit dem Expressionsvektor pSV2neo transfiziert.
Obschon die Zellen der vorliegenden Erfindung durch Transfizieren mit dem Gen hergestellt werden, das eine temperaturempfindliche Mutante des großen T-Antigens von SV40 codiert und das in den Expressionsvektor pUCSVtsA58 aufgenommen ist, können auch Genfragmente oder Mutationen dieses Gens verwendet werden, solange sie den resultierenden sich unbegrenzt vermehrenden Zellen eine Temperaturregulation verleihen, wie sie hier definiert ist. Außerdem können auch andere Gene, die den resultierenden Zellen eine Temperaturregulation verleihen, verwendet werden.
Obschon die Zellen der vorliegenden Erfindung als sich unbegrenzt vermehrend bezeichnet werden, könnten sie alternativ als transfiziert oder transformiert bezeichnet werden. Vorteilhafterweise sind sie normale Zellen, die bedingt immortalisiert sind. Damit ist gemeint, daß das große T- Antigen inaktivierbar ist. Obschon die Zellen nach wie vor lebensfähig sind und Proteine exprimieren, können sie in einen Zustand mit geringer Vermehrung gebracht werden. Das heißt, daß bevorzugte sich unbegrenzt vermehrende menschliche fetale Osteoblastenzellen der vorliegenden Erfindung eine schnelle Zellteilung vollziehen können, oder eine geringe oder keine Zellteilung als Folge der Inaktivierung des großen T-Antigens. Diese Inaktivierung kann durch Erhöhung der Inkubationstemperatur der Zellkulturen erfolgen. Zum Beispiel tritt bei einer Temperatur gleich oder kleiner etwa 37ºC, bevorzugt etwa 33 bis 36ºC, eine schnelle Zellteilung auf, wohingegen bei einer Temperatur über etwa 37ºC kaum oder keine Zellteilung auftritt. Die Differenzierung erfolgt vielmehr bei erhöhten Temperaturen. Vorzugsweise und vorteilhafterweise können die Zellen der vorliegenden Erfindung zwischen einem aktiven und einem inaktiven Zustand geführt werden, d. h. das große T-Antigen kann zyklisch aktiviert und inaktiviert werden. In dieser Weise lassen sich Zellen unterschiedlicher Phänotypen aus den sich unbegrenzt vermehrenden normalen menschlichen fetalen Zellen der vorliegenden Erfindung vermehren.
Die bevorzugten Zellen der vorliegenden Erfindung weisen die Identifikationseigenschaften von ATCC CRL 11372 auf. Das heißt, es handelt sich bei ihnen um klonale, sich bedingt unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Zellen, die eine Osteoblastendifferenzierung ausführen können. Sie weichen von transformierten Osteosarkomzellen darin ab, daß sie die Fähigkeit zur Differenzierung zu reifen Osteoblasten aufweisen, die den normalen Osteoblasten- Phänotyp exprimieren. Auf diese Weise stellen die Zellen der vorliegenden Erfindung ein homogenes, sich schnell vermehrendes Modellsystem zur Untersuchung der normalen menschlichen Osteoblastendifferenzierung, der Osteoblastenphysiologie und des hormonalen Wachstumsfaktors, ebenso wie anderer Cytokinwirkungen auf die Osteoblastenfunktion und Osteoblastendifferenzierung dar.
Die sich unbegrenzt vermehrenden Zellen der vorliegenden Erfindung exprimieren sehr geringe Höhen des Östrogenrezeptors, d. h. weniger als etwa 200 aktivierte Rezeptoren pro Kern. "Aktivierte Rezeptoren pro Kern" stellt ein Maß für die Anzahl der Östrogenrezeptoren dar, die zur Bindung des 17β-Östradiols und der Translokalisierung zum Zellkern fähig sind. Die Anzahl der aktivierten Rezeptoren pro Kern wird mittels des mikronuklearen Bindungsassays bestimmt. D. S. Colvard et al., Clin. Chem., 34, 363-369 (1988). Es wird angenommen, daß die Menge an bei diesem Assay nachgewiesenem gebundenem 17β-Östradiol der Anzahl der funktionellen Östrogenrezeptoren entspricht, d. h. die Liganden/Rezeptor-Stöchiometrie 1 : 1 beträgt. Die Zellen der vorliegenden Erfindung können mit einem Gen transfiziert werden, das den menschlichen Wildtyp-Östrogenrezeptor codiert. Transfizierte Zellen exprimieren den menschlichen Östrogenrezeptor in einer Höhe von mindestens etwa 400, vorzugsweise mindestens etwa 800, aktivierten Rezeptoren pro Kern.
Signifikanterweise sind diese Zellen für eine Östrogenbehandlung empfänglich. Die Herstellung dieser für Östrogen empfänglichen menschlichen fetalen Osteoblastenzellen schafft ein Modellsystem zur Untersuchung der Östrogenwirkung auf die Osteoblastenphysiologie, -differenzierung und -funktion, z. B. die Produktion von Cytokinen und Wachstumsfaktoren.
Die auf Östrogen ansprechenden menschlichen fetalen Osteoblastenzellen der vorliegenden Erfindung können aus den sich unbegrenzt vermehrenden normalen menschlichen fetalen Zellen der vorliegenden Erfindung und einem beliebigen replizierbaren Expressionsvektor hergestellt werden, der ein den menschlichen Östrogenrezeptor codierendes Gen enthält. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist dieser Expressionsvektor ein Plasmid, vorzugsweise ein Plasmid mit den Identifikationseigenschaften des Plamids pHEGO-HYG, das in den Beispielen ausführlicher beschrieben ist.
Demgemäß wird bei einer anderen Erscheinungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Prüfen eines Wirkstoffs bzw. Arzneimittels, d. h. einer biologischen oder chemischen Substanz, auf Wirkungen auf die Osteoblastenzellphysiologie bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt das Aussetzen einer Kultur von sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen fetalen Osteoblastenzellen, die eine temperaturempfindliche Mutante des großen T-Antigens von Simian Virus 40 exprimieren, dem Wirkstoff bzw. Arzneimittel und Überwachen mindestens einer der resultierenden Änderungen der Physiologie der kultivierten Zellen. Diese zellulären Änderungen können beliebige aus einer Vielzahl von interessierenden Änderungen sein. Hierzu zählen z. B. die Überwachung der Abscheidung von Wachstumsfaktoren und anderen Cytokinen, des Osteoblastenzellwachstums, der Expression von zu Osteoblasten gehörenden Genen, der Bildung von mineralisierten Knöllchen, der Mineralisierung einer extrazellulären Matrix oder der Bildung von Knochen. Wird der zu untersuchende Wirkstoff bzw. Arzneimittel einer Kultur von Zellen der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen Inkubationstemperaturen zugegeben, so kann seine Wirkung auf unterschiedliche Osteoblasten-Phänotypen untersucht werden. Werden die Zellen z. B. bei einer restriktiven Temperatur, d. h. größer etwa 37ºC, bevorzugt größer etwa 38ºC und noch bevorzugter größer etwa 39ºC inkubiert, so wird die Zellteilung verlangsamt, die Differenzierung erhöht sich und ein reiferer Osteoblasten-Phänotyp wird erzeugt. Daher umfassen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Zugeben eines auszuwertenden Wirkstoffs bzw. Arzneimittels zu einer Kultur von sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen fetalen undifferenzierten Osteoblastenzellen, wobei die Zellen bei einer Temperatur von nicht größer etwa 37ºC kultiviert werden. Alternativ kann ein Wirkstoff bzw. Arzneimittel einer Kultur von Zellen zugegeben werden, wobei die Zellen bei einer Temperatur größer etwa 37ºC zur Auswertung der Wirkung des Wirkstoffs bzw. Arzneimittels auf einen unterschiedlichen Phänotyp, z. B. einen reiferen Phänotyp, der Zellen kultiviert werden.
Weiterhin kann die vorliegende Erfindung bei einem Verfahren zur Behandlung von Knochenabbau bzw. Knochenverlust bei einem Säuger, z. B. einem Menschen, angewandt werden. Dieses Verfahren umfaßt das Einbringen bzw. Aufbringen sich unbegrenzt vermehrender menschlicher fetaler Osteoblastenzellen, die eine temperaturempfindliche Mutante des großen T- Antigens von Simian Virus 40 exprimieren, in oder auf einen beschädigten Knochen am Punkt der Beschädigung, Wie hierin verwendet, bezieht sich "beschädigter Knochen" auf einen solchen, der als Folge von Osteoporose, Knochenbruch, Knochendurchbruch oder Knochenverlust um ein chirurgisches Implantat beschädigt wurde. Die Zellen werden in den Knochen an den Punkt der Beschädigung, des Bruchs oder des Durchbruchs in einer wirksamen Menge eingeführt, um eine Knochenbildung/-ersetzung zu bewirken oder hervorzurufen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1. Thymidin-Einbau von bei verschiedenen Temperaturen kultivierten hFOB 1.19-Zellen. Subkonfluente hFOB-Kulturen wurden bei den angegebenen Temperaturen 24 Stunden lang kultiviert, dann mit ³H-markiertem Thymidin 24 Stunden lang an jedem Tag des Zeitverlaufs gepulst, außer bei der Bezeichnung 39,5/33,5, die anzeigt, daß die Zellen bei 39,5 ºC über 24 Stunden kultiviert wurden, dann für den restlichen Zeitverlauf auf 33,5ºC gehalten. Der Thymidin-Einbau wurde nach jeder Puls-Markierung gemessen. Fehlerbalken = 1 Standardabweichung, n = 4.
Fig. 2. Immunanfärbung postkonfluenter hFOB 1.19-Zellen für Osteoblasten-phänotypische Marker. Bei 33,5ºC kultivierte postkonfluente (Tag 8 nach Konfluenz) hFOB 1.19- Zellen wurden mittels einer Immunoperoxidase-Methode unter Verwendung primärer Antikörper (Ab) angefärbt, die spezifisch waren für: (A) Osteopontin (OP); (B) Osteonectin (ON); (C) Osteocalcin (OC); (D) Knochensialoprotein (BSP); (E) Kollagen Typ I; (F) kein primärer Ab; (G) SV40 T Ag; und (H) kein primärer Ab für T Ag. Dunkle (d. h. rote) Färbung zeigt Bereiche an, in denen jeweils Protein (gebunden durch Ab) lokalisiert ist (100-fache Vergrößerung).
Fig. 3. Induktion der cAMP-Gehalte in hFOB 1.19-Zellen durch verschiedene Agonisten. Konfluente hFOB 1.19-Zellen (bei 39,5ºC) wurden mit 1 mM Isobutylmethylxanthen (IBMX) 2 Minuten lang vorbehandelt, dann mit der angegebenen Dosis jedes Agonisten 10 Minuten lang behandelt. Die Quantifizierung der cAMP-Mengen wurde dann mittels Radioimmunoassay (RIA) vorgenommen und die Menge an cAMP (pmol/10&sup5; Zellen) für jede Agonistenbehandlung mit einer Kontrollbehandlung (nur IBMX) verglichen und als ein prozentualer Anteil ausgedrückt (wie angegeben). Fehlerbalken = SEM (Standardabweichung vom Mittelwert), n = Anzahl der Experimente (wie angegeben).
Fig. 4. Mineralisierung der extrazellulären Matrix durch hFOB 1.19-Zellen. Die hFOB-Zellen wurden bei 33,5ºC über die Konfluenz hinaus (Tag 0) kultiviert, dann mittels der modifizierten v. Kossa-Methode (Schenk et al., in Methods of Calcified Tissue Preparation; G. R. Dickson et al., Hrsg.; Elsevier; 1-4 (1984)) zur Sichtbarmachung einer Mineralisierung der extrazellulären Matrix an den folgenden Tagen angefärbt: (A) Tag 2; (B) Tag 4; (C) Tag 6; (D) Tag 8; und (E) Tag 20. Bei dunkel gefärbten Bereichen handelt es sich um Knöllchen mit mineralisierter Matrix (25-fache Vergrößerung).
Fig. 5. Regulierung der Aktivität von Alkalischer Phosphatase (AP) in hFOB 1.19-Zellen. Subkonfluente (A und C) oder konfluente (B und D) hFOB-Zellen wurden entweder bei 33,5 ºC (A und B) oder 39,5ºC (C und D) in Differenzierungsmedium inkubiert, dann fixiert und mit einem im Substrat basierenden Färbemittel auf die AP-Aktivität in situ inkubiert. Dunkle Flecken weisen auf eine hohe AP-Aktivität hin (200-fache Vergrößerung). (E) Konfluente hFOB-Zellen wurden bei den angegebenen Temperaturen in Differenzierungsmedium (DMEM/F12 mit 0,2% (Vol/Vol) Aktivkohle-adsorbiertem FBS (cFBS), 100 ug/ml Ascorbinsäure und 10&supmin;&sup8; Menadion) 24 Stunden lang inkubiert, dann 48 Stunden lang mit den angegebenen Dosen von 1,25-Dihydroxy-Vitamin D&sub3; (1,25-(OH)&sub2;D&sub3;) oder Ethanol-Vehikel (Kontrolle) bei den angegebenen Temperaturen behandelt. Die AP-Aktivität in den Zellextraken wurde dann unter Anwendung des p-Nitrophenolphosphatassays gemessen und auf das Gesamtprotein normalisiert. Einheiten = umol p-Nitrophenol/Stunde bei 37ºC. Fehlerbalken = 1 Standardabweichung, n = 6 Experimente. ** = P < 0,01 gegenüber Kontrolle, $ = P < 0,001 39,5ºC gegenüber 33,5ºC, zweiseitiger paarweiser Student-T-Test.
Fig. 6. Regulierung der Osteocalcin-(OC)-Expression in hFOB 1.19-Zellen. Konfluente hFOB 1.19-Zellen wurden bei den angegebenen Temperaturen in Differenzierungsmedium (DMEM/F12 mit 0,2% (Vol/Vol) Aktivkohle-adsorbiertes FBS, 100 ug/ml Ascorbinsäure und 10&supmin;&sup8; Menadion) 24 Stunden lang inkubiert, dann 48 Stunden lang mit den angegebenen Dosen an 1,25-Dihydroxy-Vitamin D&sub3; (1,25-(OH)&sub2;D&sub3;) oder Ethanol- Vehikel (Kontrolle) bei den angegebenen Temperaturen behandelt. Die OC-Mengen in hFOB-konditionierten Medien wurden mittels RIA unter Verwendung eines ¹²&sup5;I-markierten Antikörpers gegen humanes OC gemessen und auf das Gesamtprotein in den Zellextrakten normalisiert. Fehlerbalken = 1 Standardabweichung, n = 6 Experimente. * = P < 0,05 39,5ºC gegenüber 33,5ºC, ** = P < 0,01 39,5ºC gegenüber 33,5ºC; zweiseitiger paarweiser Student-T-Test.
Fig. 7. Konstruktion des pHEGO-HYG-Vektors. Die humane Östrogenrezeptor-(hER)-cDNA wurde stromaufwärts des CMV- Promotors und stromabwärts des SV40-Polyadenylierungssignals eingebaut. Die Transkriptionsrichtung für den ER und die Hygromycinresistenz-(HYGr)-Gene sind mit Pfeilen angegeben. Ausgewählte Restriktionsenzymstellen sind angegeben (Cla = ClaI, Sac = SacI, BamH = BamHI, Bcl = BclI, Kas = KasI, Nru = NruI), ebenso wie die Karten- Lokalisierung (in Kilobasen-Paaren von der CIaI-Stelle).
Fig. 8. Northern-Analyse der hFOB/ER-Subklone. Die aus den angegebenen hFOB/ER-Subklonen isolierte Gesamt-RNA (10 ug) wurde mittels Glyoxal-Agarose-Elektrophorese fraktioniert, auf einen Nylonfilter übertragen bzw. geblottet und mit den ER- und Glyceraldehyd-3-dehydrogenase-(GAPDH)-cDNA-Sonden hybridisiert. Die ER-mRNA-Mengen im steady state wurden mittels Densitometrie des Autoradiogramms bestimmt, auf die GAPDH-Mengen normalisiert und als ein Verhältnis (ER/GAPDH) der relativen mRNA-Mengen (REL. RNA-MENGE) ausgedrückt. * zeigt eine ER-mRNA von verkürzter Größe an.
Fig. 9. Analyse der 17β-Östradiol-(E&sub2;)-Wirkungen auf die Progesteronrezeptormengen in hFOB/ER9-Zellen. Der Umfang der spezifischen Progesteronbindung wurde in Kontroll- (KNT)- oder E&sub2;-behandelten hFOB/ER9-Zellen mittels des mikronuklearen Bindungsassays (Feld A) oder des Dextran- Kohle-Assays (Feld B) gemessen, wie im Abschnitt der Beispiele beschrieben ist. Die Kontroll- und E&sub2;-Behandlungen waren Ethanol-Vehikel bzw. 10&supmin;&sup9; M E&sub2; über 96 Stunden. Jeder Balken steht für den Mittelwert aus drei separaten Assays +/- SEM.
Fig. 10. Northern-Analyse der E&sub2;-Wirkungen auf c-fos-mRNA- Mengen. Die Gesamt-RNA (10 ug) wurde aus Kontroll-(KNT)- und E&sub2;-behandelten hFOB/ER-Zellen isoliert, die bei den angegebenen Temperaturen kultiviert wurden (33,5ºC und 39,5ºC). Die Kontrollzellen wurden mit Ethanol-Vehikel 30 Minuten lang behandelt, die E&sub2;-Behandlungen erfolgten dagegen über 30 bis 60 Minuten, wie angegeben. Im Anschluß an Gelelektrophorese und Northern-Blotting wurde die RNA an cfos- und ribosomale Protein-S14-(rpS14)-cDNA-Sonden hybridisiert. Die relative mRNA-Menge (REL. RNA-MENGE), wie mittels Densitometrie gemessen, wurde als ein Verhältnis ausgedrückt (FOS/S14).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft menschliche normale fetale Osteoblastenzellen, die mit einem Gen bedingt unbegrenzt vermehrbar gemacht wurden, das eine temperaturempfindliche (ts) Mutante (tsA58) des großen T-Antigens (T Ag) von SV40 codiert. Dieses Genprodukt, bezeichnet als frühes Gen oder großes T-Antigen, ist für die Immortalisierung von Zellen verantwortlich; der Mechanismus, durch den dies geschieht, ist allerdings unbekannt. Der Expressionsvektor alleine zeigt keine Wirkung. Die Expression von T Ag in menschlichen Zellen führt zu einer erhöhten und verlängerten Vermehrungsrate, was für das Ergebnis einer Wechselwirkung von T Ag mit dem Retinoblastom-Genprodukt Rb gehalten wird. Unter bedingter Immortalisierung ist die Mutante T Ag allerdings lediglich bei einer Temperatur aktiv (d. h. sind die Zellen unbegrenzt vermehrbar), die hierin als "permissive" Temperatur bezeichnet wird. Folglich ist die Rückkehr zu einem inaktiven (nicht unbegrenzt vermehrbaren) Zustand manipulierbar, indem die Inkubationtemperatur für die Zellen zu einer restriktiven (nicht-permissiven) Temperatur geändert wird. Diese Art von bedingter Immortalisierung wurde bei anderen Zelltypen erfolgreich angewendet. Siehe z. B. J. Y. Chou, Mol. Endocrinol., 3, 1511 (1989).
Thymidineinbau-Experimente zeigen, daß eine Expression dieses Gens bei der permissiven Temperatur, die gleich oder kleiner etwa 37ºC, bevorzugt etwa 33 bis 36ºC, und noch bevorzugter bei etwa 33,5ºC liegt, zu einer schnellen Zellvermehrung führt. Werden hFOB-Zellen bei einer erhöhten Temperatur, d. h. einer Temperatur größer etwa 37ºC, bevorzugt etwa 38ºC, kultiviert, so verlangsamt sich die Zellvermehrung beträchtlich. Typischerweise findet bei einer restriktiven Temperatur von 39,5ºC keine Vermehrung statt. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die bedingte Immortalisierung von einem funktionellen großen T-Antigen abhängt. Die Wiederaufnahme der schnellen Zellvermehrung nach einer Umkehrung von der restriktiven zur permissiven Temperatur stimmt mit dieser Hypothese überein.
Die Differenzierung von Osteoblastenzellen in Kultur bezieht eine programmierte Entwicklungssequenz ein. Diese Sequenz ist durch ein frühes Vermehrungsstadium, während dessen die Osteoblastenzellen relativ undifferenziert sind, und spätere postkonfluente Stadien, welche die Expression von Knochenzell-phänotypischen Markern und schließlich die extrazelluläre Matrix-Mineralisierung umfassen, gekennzeichnet. Siehe z. B. M. A. Aronow et al., J. Cell. Physiol., 143, 213 (1989); und G. S. Stein et al., FASEB J., 4, 3111 (1990).
Es existieren zahlreiche mit der Osteoblastendifferenzierung zusammenhängende phänotypische Marker und Eigenschaften. Zu diesen zählen: die Expression von Alkalischer Phosphatase (AP), Osteopontin (OP), Osteonectin (ON), Osteocalcin (OC), Knochensialoprotein (BSP) und Kollagen Typ I; ein Anstieg der zellulären cAMP-(cyclisches Adenosinmonophosphat)-Mengen als Reaktion auf das Nebenschilddrüsenhormon (PTH); ein Anstieg der OC-Mengen als Reaktion auf eine 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;-Behandlung; und die Bildung einer mineralisierten Matrix. hFOB-Zellen exprimieren hohe Mengen sämtlicher der vorstehend genannten, zu Osteoblasten gehörenden Proteine in postkonfluenten Kulturen. Die Expression dieser phänotypischen Marker ist indikativ für die Stadien der Osteoblastendifferenzierung, die der Konfluenz in Kultur folgen. Weiterhin steigen die OC-Mengen als Reaktion auf eine 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;-Behandlung, während die cAMP-Mengen als Reaktion auf eine PTH-Behandlung in postkonfluenten hFOB-Zellen steigen. Diese Daten legen nahe, daß hFOB- Zellen funktionelle Vitamin-D-Rezeptoren und PTH-Rezeptoren enthalten. Außerdem bilden hFOB-Zellen in postkonfluenten Kulturen mineralisierte Knöllchen, was charakteristisch für die Spätstadien der Osteoblastendifferenzierung in Kultur ist. Daher scheinen hFOB-Zellen relativ undifferenzierte Zellen zu sein, die darauf programmiert sind, sich bei Erreichen der Konfluenz zu Zellen zu differenzieren, die das volle Spektrum der mit Osteoblasten verbundenen Merkmale aufweisen.
Die Bedingtheit, mit der die hFOB-Zellen der vorliegenden Erfindung unbegrenzt vermehrbar gemacht werden, bewirkte eine weitere Untersuchung der Wirkung der Zellvermehrung auf die Expression von mit der Osteoblastendifferenzierung zusammenhängenden Genen. Sowohl die Alkalische Phosphatase- als auch die 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;-induzierte Osteocalcin-Expression in postkonfluenten hFOB-Zellen wird durch die Inkubationstemperatur wesentlich beeinflußt. Da die Inkubation von hFOB-Zellen bei einer restriktiven Temperatur von etwa 39,5 ºC zur Inaktivierung des temperaturempfindlichen SV40 T Ag und einer anschließenden Abnahme der Zellvermehrung führt, legt die Wirkung auf die AP- und OC-Genexpression nahe, daß Veränderungen der T-Antigen-Aktivität und nachfolgende Wirkungen auf die Zellvermehrung die Zelldifferenzierung beeinflussen. Für eine Zusammenfassung der hFOB-Eigenschaften siehe Tabelle 1. Es ist möglich, daß die AP- und OC- Expression durch nukleare Faktoren wie FOS und JUN reguliert wird, die mit der Zellvermehrung in Verbindung stehen. Allerdings ist auch möglich, daß Retinoblastome die OC- und AP-Genexpression direkt beeinflussen können, da die Inaktivierung des großen T Ag von SV40 die RB-Aktivität beeinflußt. Die Erfindung ist jedoch durch keinerlei spezielle Theorie zum Wirkmechanismus eingegrenzt. Tabelle 1
Wie oben angegeben, können die Zellen der vorliegenden Erfindung in Untersuchungen von Zellkulturen auf die Empfindlichkeit der Osteoblastenzellen gegenüber verschiedenen Substanzen, wie z. B. Hormone, Cytokine und Wachstumsfaktoren, oder in der Gewebetherapie verwendet werden. Zum Beispiel können sie beim Prüfen von Wirkstoffen bzw. Arzneimitteln eingesetzt werden, indem ein Wirkstoff bzw. Arzneimittel einer Kultur der Zellen der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen Inkubationstemperaturen zugegeben wird. Auf diese Weise kann die Wirkung des Wirkstoffs bzw. Arzneimittels auf verschiedene Osteoblasten-Phänotypen untersucht werden.
Spezifisch können die Zellen der vorliegenden Erfindung, unter anderen medizinisch wichtigen Genen, mit dem Gen für den humanen Wildtyp-Östrogenrezeptor (hER) unter Ausnutzung der nachstehend beschriebenen Kloniertechniken stabil transfiziert werden. Dies macht sie zur Anwendung in der medizinischen Forschung und Behandlung besonders vorteilhaft. Da untransfizierte hFOB 1.19-Zellen sehr geringe Mengen an ER (weniger als etwa 200 aktivierte Rezeptoren pro Kern) exprimieren, betrifft diese Erfindung auch die Konstruktion von Subklonen der hFOB 1.19, die mit einem ER- Expressionsvektor stabil transfiziert sind. Diese auf Östrogen ansprechenden menschlichen fetalen Osteoblasten- Subklone werden hierin als hFOB/ER-Subklone bezeichnet. Stabile hFOB/ER-Transfektanden exprimieren den Östrogenrezeptor in einer Menge von größer etwa 400 aktivierten Rezeptoren pro Kern, und vorzugsweise größer etwa 800 aktivierten Rezeptoren pro Kern. Es ist möglich, daß diese Zellen mehr als etwa 10.000 aktivierte Rezeptoren pro Kern exprimieren. Sie sprechen auf eine Behandlung mit 17- Östradiol an, bei dem es sich um ein klinisch wichtiges Östrogen handelt, wobei die Bezeichnung "auf Östrogen ansprechend" ihre Reaktionsfähigkeit auf eine Behandlung mit E&sub2; meint. Wird der Begriff Östrogen verwendet, so bezieht er sich generell auf 17β-Östradiol, obschon auch andere Östrogene ähnliche Reaktionen hervorrufen können. Diese Reaktionen, die bei Östrogen-Zielzellen erwartet werden, umfassen Anstiege der endogenen Progesteronrezeptor- und c-fos-mRNA- Mengen im steady state als Folge einer E&sub2;-Behandlung der hFOB/ER-Zellen. Die stabil transfizierten hFOB/ER-Zellen sind für Untersuchungen von Östrogenwirkungen auf die Osteoblasten-Genexpression und -Physiologie extrem nützlich, und folglich für die Diagnose und Behandlung der Osteoporose. Zum Beispiel können hFOB/ER-Zellen, die mäßige Mengen des Östrogenrezeptors (z. B. etwa 400 bis etwa 3.000 aktivierte Rezeptoren pro Kern) exprimieren, in vorteilhafter Weise als Modellsystem zur Untersuchung der physiologischen Wirkungen verschiedener Wirkstoffe bzw. Arzneimittel auf die Osteoblastenfunktion verwendet werden, da von kultivierten menschlichen Knochenzellen bekannt ist, daß sie etwa 1.600 ±400 aktivierte Rezeptormoleküle pro Kern exprimieren (E. F. Ericksen et al., Science, 241, 84-85 (1988)). Zellen, die höhere Mengen der ER (z. B. größer etwa 3.000) exprimieren, können ebenfalls in vorteilhafter Weise zur Untersuchung der Osteoblastenfunktion und Genreaktion, und zweckmäßigerweise für molekularbiologische Experimente verwendet werden.
Die Zellen der vorliegenden Erfindung können auch bei einem Verfahren zur Behandlung von Knochenabbau bzw. -verlust, etwa als Ergebnis einer Osteoporose, eines Bruchs oder Durchbruchs, und/oder von Knochenabbau bzw. -verlust um die Stelle eines chirurgischen Implantats herum eingesetzt werden. Dieses Verfahren umfaßt das Einbringen bzw. Aufbringen sich unbegrenzt vermehrender menschlicher fetaler Osteoblastenzellen, die eine temperaturempfindliche Mutante des großen T-Antigens von Simian Virus 40 exprimieren, in oder auf einen beschädigten Knochen am Punkt der Beschädigung. Die bei solch einem Gewebetherapieschema angewandten spezifischen Methoden und Techniken sind allgemein bei R. Langer et al., Science, 260, 920 (1993) beschrieben.
Klonierung, Transfektion, Transformation und Expression von Vektor-DNA in sich unbegrenzt vermehrenden hFOB-Zellen. Die sich bedingt unbegrenzt vermehrenden Zellen der vorliegenden Erfindung werden unter Anwendung standardmäßiger molekularbiologischer Techniken konstruiert, die die Verwendung replizierbarer Expressionsvektoren (nachstehend beschrieben) zur Exprimierung von interessierenden Genen in der Wirtszelle umfassen. Für die Konstruktion der geeigneter Vektoren werden im Fachgebiet bekannte standardmäßige Ligationstechniken angewendet. Isolierte Plasmide oder DNA- Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und wieder zur gewünschten Form zum Erhalt des erforderlichen Plasmids ligiert.
Die Plasmide werden in Wirtszellen, vorzugsweise menschliche fetale Knochenzellen oder die resultierenden sich bedingt unbegrenzt vermehrenden hFOB-Zellen der vorliegenden Erfindung transfiziert. Mit Transfektion ist die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle gemeint. Den Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet sind viele Transfektionsmethoden bekannt, z. B. eine Calciumphosphat- Behandlung, Nuklearinjektion, Protoblastenfusion oder Elektroporation. Vorzugsweise wird die Elektroporation angewandt. Eine erfolgreiche Transfektion ist allgemein daran zu erkennen, daß irgendeine Anzeige der Funktion dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt. Eine erfolgreiche Transformation findet dann statt, wenn die so in die Zelle eingeführte DNA entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. Die Wirtszellen werden mit den Expressionsvektoren dieser Erfindung transfiziert und vorzugsweise transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die entsprechend modifiziert sind, um Promotoren zu induzieren, Transformanden auszuwählen oder die Gene zu exprimieren, die die gewünschten Sequenzen codieren.
Die zur Herstellung des interessierenden Genprodukts verwendeten humanen Wirtszellen können in einer Vielzahl kommerziell verfügbarer Medien kultiviert werden. Bevorzugt wird Dulbecco's modifiziertes Eagles-Medium Ham F12 (DMEM/F12) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) verwendet. Außerdem können jegliche geeigneten kundenspezifisch hergestellten Medien, wie sie z. B. bei Ham et al., Methods Enzymol., 58, 44 (1979) oder Barnes et al., Anal. Biochem., 102, 255 (1980) beschrieben sind, als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann je nach Erfordernissen mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z. B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (z. B. Natrium-, Calcium- oder Magnesiumchlorid oder -phosphat), Puffern (z. B. HEPES), Nukleosiden (z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (z. B. dem GentamycinTM-Wirkstoff), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die gewöhnlich bei Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle angereichert werden. Jegliche anderen erforderlichen Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen, wie sie den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, enthalten sein. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und ähnliches, sind jene, die zuvor bei den zur Expression ausgewählten Wirtszellen verwendet wurden, und werden für einen Fachmann des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis erkennbar sein.
Die Plasmide aus den Transformanden werden isoliert, durch Restriktionsendonuklease-Verdau analysiert und/oder mittels im Fachgebiet bekannter Methoden sequenziert. Siehe z. B. J. Messing et al., Nucl. Acids Res., 9, 309 (1981) und Maxam et al., Methods Enzymol., 65, 499 (1980).
Konstruktion replizierbarer Expressionsvektoren. Nukleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die das interessierende Gen umfaßt, wird in einen replizierbaren Vektor, vorzugsweise einen zirkulären oder linearisierten Plasmidvektor, für die Expression des Genprodukts eingebaut. Vorzugsweise wird eine DNA, die ein Genprodukt codiert, das der Wirtszelle Immortalität, besonders bevorzugt bedingte Immortalität verleiht, in den Expressionsvektor inseriert. Am bevorzugtesten codiert diese DNA ein temperaturempfindliches großes T-Antigen von SV40. Darüber hinaus können andere Expressionsvektoren, die Proteine, z. B. Wachstumsfaktoren und Hormone, vorzugsweise den menschlichen Östrogenrezeptor codierende DNA enthalten, konstruiert und zur Veränderung des Zellphänotyps verwendet werden. Außerdem können zusätzliche Expressionsvektoren, die eine Antibiotikaresistenz, z. B. eine Neomycinresistenz, verleihende Gene oder andere Markergene enthalten, vorzugsweise in derselben Wirtszelle verwendet werden.
Es stehen viele Expressionsvektoren zur Verfügung, wobei die Auswahl des geeigneten Vektors von der Größe der in den Vektor einzubauenden Nukleinsäure und der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle abhängt. Bei den meisten Expressionsvektoren handelt es sich um "Shuttle"-Vektoren, d. h., sie sind in mindestens einer Klasse von Organismus replikationsfähig, doch können zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Zum Beispiel wird ein Vektor in E. coli kloniert und dann derselbe Vektor in Hefe oder Säugerzellen für die Expression transfiziert, obschon er nicht unabhängig vom Wirtszellchromosom zur Replikation fähig ist.
Zu replizierbaren Expressionsvektor-Komponenten zählen allgemein, ohne darauf beschränkt zu sein, ein oder mehrere der folgenden: eine Signalsequenz, ein Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, ein Promotor und eine Transkriptions-Terminationssequenz. Bei der Säugerzellexpression kann eine native Signalsequenz zufriedenstellend sein, obschon andere Säuger- Signalsequenzen geeignet sein können, wie etwa Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder verwandten Spezies, als auch virale sekretorische Leader, z. B. das Herpes-simplex-gD-Signal. Allgemein ist die Replikationsursprungskomponente für Säuger-Expressionsvektoren nicht erforderlich, obschon der SV40-Ursprung typischerweise verwendet wird, da er den früheren Promotor enthält (siehe unten).
Das Selektions- oder Markergen codiert ein Protein, das für das Überleben oder Wachstum der in einem selektiven Kulturmedium gezüchteten transformierten Wirtszellen notwendig ist. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, der das Selektions-Gen enthält, werden im Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektions-Gene codieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, (b) auxotrophe Mängel ergänzen oder (c) entscheidende Nährstoffe liefern, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind. Bei einem Beispiel eines Selektionsschemas wird ein Wirkstoff angewendet, um das Wachstum der Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, exprimieren ein Protein, das eine Wirkstoffresistenz verleiht und überleben so die Selektionsbedingungen. Bei Beispielen einer solchen dominanten Selektion werden die Wirkstoffe Neomycin, Mycophenolsäure oder vorzugsweise Hygromycin verwendet. In diesen drei Beispielen werden bakterielle Gene unter eukaryontischer Kontrolle verwendet, um eine Resistenz gegenüber dem entsprechenden Wirkstoff G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Expressionsvektoren enthalten gewöhnlich einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und funktionsfähig an das interessierende Gen geknüpft ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromaufwärts (5') zum Startcodon eines Strukturgens (allgemein innerhalb etwa 100 bis 1.000 bp) lokalisiert sind und die Transkription und Translation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz kontrollieren, an die sie funktionsfähig geknüpft sind. Solche Promotoren fallen typischerweise in eine von zwei Klassen, nämlich die induzierbaren oder die konstitutiven. Induzierbare Promotoren sind solche, die erhöhte Grade der Transkription von DNA unter ihrer Kontrolle als Reaktion auf eine bestimmte Veränderung der Kulturbedingungen, z. B. das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines Nährstoffs oder eine Temperaturveränderung, einleiten. Derzeit ist eine große Zahl von Promotoren, die durch eine Vielfalt potentieller Wirtszellen erkannt werden, im Fachgebiet wohlbekannt. Diese Promotoren sind funktionsfähig an das interessierende Gen geknüpft, indem der Promotor von der Ursprungs-DNA mittels Restriktionsenzym-Verdau entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor inseriert wird. Sowohl die native Promotorsequenz als auch viele heterologe Promotoren können zur direkten Amplifikation und/oder Expression des interessierenden Gens verwendet werden. Heterologe Promotoren sind bevorzugt, da sie generell eine höhere Transkription und Ausbeute an exprimiertem Protein im Vergleich zum nativen Promotor ermöglichen. Für Eukaryonten sind zahlreiche Promotorsequenzen bekannt. Nahezu alle eukaryontischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die etwa 25 bis 30 Basen stromaufwärts der Stelle des Transkriptionsbeginns lokalisiert ist. Eine andere, 70 bis 80 Basen stromaufwärts vom Transkriptionsstart vieler Gene zu findende Sequenz ist die CXCAAT-Region, wobei X ein beliebiges Nukleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryontischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die ein Signal für das Anhängen des Poly-A-Schwanzes an das 3-Ende der codierenden Sequenz sein kann. Jede dieser Sequenzen eignet sich zum Einbau in eukaryontische Expressionsvektoren. Die Transkription von Vektoren in Säuger-Wirtszellen wird z. B. durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren wie dem Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus, Adenovirus (z. B. Adenovirus 2), Rinderpapillom-Virus, Vogelsarkom-Virus, Simian Virus 40 (SV40), Hepatitis-B-Virus und, bevorzugt, dem Cytomegalovirus erhalten werden; aus heterologen Säuger-Promotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor; aus Hitzeschock-Promotoren; und aus den normalerweise zu dem interessierenden Gen gehörenden Promotor, vorausgesetzt, daß solche Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind. Die frühen und späten Promotoren des SV40 werden in zweckmäßigerweise als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen Replikationsursprung des SV40 enthält. Fiers et al., Nature, 273, 113 (1978); Mulligan et al., Science, 209, 1422- 1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7398-7402 (1981). Der unmittelbar frühe Promotor des humanen Cytomegalovirus wird zweckmäßigerweise als ein Hind III E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway et al., Gene, 18, 335-360 (1982).
Eine Transkription des interessierenden Gens durch höhere Eukaryonten wird oftmals durch Einbau einer Enhancer- Sequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, die gewöhnlich etwa. 10 bis 300 Basen lang sind und die auf einen Promotor zur Erhöhung seiner Transkription wirken. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und sind 5' zur Transkriptionseinheit, sowohl innerhalb eines Introns als auch innerhalb der codierenden Sequenz selbst vorzufinden. Viele Enhancer- Sequenzen aus Säugergenen (Globin, Elastase, Albumin, Alpha-Fetoprotein und Insulin) sind heutzutage bekannt. Typischerweise wird allerdings ein Enhancer aus einem eukaryontischen Zell-Virus verwendet. Zu Beispielen zählen der SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der Frühpromotor-Enhancer des Cytomegalovirus, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und der Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zum zu transfizierenden Gen gespleißt werden, ist aber vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors lokalisiert.
Die in eukaryontischen Wirtszellen verwendeten Expressionsvektoren werden auch Sequenzen enthalten, die zur Beendigung der Transkription und zur Stabilisierung der transkribierten mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen stehen häufig an den untranslatierten 5'-, und gelegentlich 3'- Regionen von eukaryontischen oder viralen DNAs oder cDNAs zur Verfügung. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der mRNA transkribiert sind. Vorzugsweise wird das SV40-Polyadenylierungssignal verwendet.
Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen beschrieben und wird im folgenden unter Bezugnahme auf die folgenden ausführlichen Beispiele weiter beschrieben.

Experimentelle Beispiele

Beispiel I

Konstruktion und Charakterisierung von hFOB 1.19-Zellen

A. Verwendete Materialien

Dulbecco's modifiziertes Eagles-Medium Ham F12 (DMEM/F12 1 : 1 Gew./Gew.)-Gemisch, Menadion (Vitamin K&sub3;), Ascorbinsäure (Vitamin C), menschliches Nebenschilddrüsenhormon- Fragment 1-34 (PTH 1-34), Prostaglandin Typ E&sub2; (PGE&sub2; 11,15- Dihydroxy-9-oxoprosta-5,13-dien-1-säure), Forskolin (7β- Acetoxy-1α,6ß,9α-trihydroxy-8,13-epoxy-labd-14-en-11-on), 10 · Trypsin-EDTA und der Alkalische Phosphatase- Enzymassay-Kit wurden bezogen von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Fetales Rinderserum (FBS) wurde bezogen von Flow Laboratories Inc. (Molean, VA), und 1,25-Dihydroxy- Vitamin D&sub3; (1,25-(OH)&sub2;D&sub3;) wurde bezogen von Biomol (Plymouth Meeting, PA). Neomycin G418 (Geneticin) wurde bezogen von Gibco Laboratories (Gaithersburg, MD), und Elektroporationsküvetten wurden bezogen von Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Der Anfärbe-Kit auf Substratbasis für Alkalische Phosphatase wurde bezogen von Vector Laboratories Inc. (Burlingham, CA), und der Humanosteocalcin-RIA-Kit wurde bezogen von Immutopics (San Clemente, CA). Der cAIMP-Assay- Kit wurde bezogen von Amersham Corp. (Arlington Heights, IL), und der Peroxidase-Immunanfärbungs-Kit wurde bezogen von Biomeda Corp. (Foster City, CA). Der SV40 T Ag- spezifische monoklonale Antikörper wurde bezogen von Oncogene Science (Uniondale, NY), und ³H-markiertes Thymidin wurde bezogen von New England Nuclear Research Products, DuPont Company (Boston, MA). Polyklonale Antikörper, die für menschliches Osteopontin (OP) LF-7, Osteonectin (ON) LF-BON, Osteocalcin (OC) LF-32, Knochensialoprotein (BSP) LF-100 und Kollagen Typ I LF-67 spezifisch waren, wurden erhalten von Dr. Larry W. Fisher am Bone Research Branch, National Institute of Dental Research, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892. Siehe auch L. W. Fisher et al., J. Biol. Chem., 262, 9702 (1987), wie hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen. Der T-Ag-Expressionsvektor pUCSVt- sA58 ist erhältlich von D. Wynford-Thomas ohne Anwendungsbeschränkung (Department of Pathology, CRC Thyroid Tumour Biology Research Group, University of Wales College of Medicine, Heath Park, Cardiff CF4 4XN, United Kingdom). Siehe auch D. Wynford-Thomas et al., Mol. Cell. Biol., 10, 5365 (1990); P. Tegtmeyer, J. Virology, 15, 613 (1975); und A. J. Ridley et al., EMBO J., 7, 1635 (1988). Der Neomycinresistenz-Expressionsvektor pSV2neo wurde bezogen von American Type Culture Collection (Rockville, MD).

B. Angewandte Methoden

1. Isolierung, Transfektion und Screening der hFOB-Zellen

Gliedmaßengewebe wurde von einer spontanen Fehlgeburt unter institutionell genehmigten Protokollen als eine Quelle für Primärkulturen erhalten. Das Gliedmaßengewebe wurde in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung eingebracht und mit Skalpellmessern homogenisiert, dann mit Kollagenase (0,5 mg/ml) über 30 Minuten und Trypsin (10 mg/ml) über 30 Minuten verdaut. Die Zellen wurden dann in 100 mm Gewebekulturplatten ausgesät, die Phenolrot-freies DMEM/F12-Medium mit 10% (Vol/Vol) FBS und 10% (Vol/Vol) Humanserum enthielten. Die Zellen wurden bei 37ºC in 5% CO&sub2;-befeuchteter Luft inkubiert und das Medium alle 48 Stunden ersetzt, bis ausreichende Zellzahlen für den Transfektionsvorgang vorhanden waren. Zellen, die nicht an den Kulturplatten haften blieben, wurden entfernt. Anhaftende Zellen wurden von den Kulturplatten durch Trypsin-EDTA-Behandlung entfernt. Die Zellen wurden kurz mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Dann wurde eine 10x-Stammlösung von Trypsin- EDTA 10-fach mit PBS verdünnt und ausreichend 1x-Lösung zugegeben, um die Oberfläche der Kulturplatte zu bedecken, und bei 37ºC inkubiert, bis die anhaftenden Zellen freigegeben waren. Die Zellen wurden dann mit Serum-haltigem Medium gespült und zentrifugiert (5 Minuten bei 900 · g), dann nochmals mit Serum-freiem Medium gespült und zentrifugiert (5 Minuten bei 900 · g).
Das Pellet der Zellen (enthaltend etwa 8 · 10&sup6;) wurde in 0,4 ml Serum-freiem Medium resuspendiert, das 10 ug linearisierten T-Ag-Expressionsvektor pUCSVtsA58 und 2 ug linearisierten Neomycinresistenz-Expressionsvektor pSV2neo enthielt (P. J. Southern et al., J. Mol. Appl. Gen., 1, 327 (1982). Die Zell/DNA-Suspension wurde in eine Elektroporationsküvette eingebracht und bei 4ºC 10 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden dann einem Puls von 900 V/cm bei 960 uFD unter Verwendung einer Biorad-Elektroporationsapparatur unterzogen und nach dem Puls weitere 10 Minuten lang bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden anschließend in Gewebekulturplatten ausgesät, die DMEM/F12-Medium mit 10% (Vol/Vol) FBS bei 37ºC enthielten. Nach 48 Stunden und danach alle 48 Stunden wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, das 600 ug/ml Neomycin G418 enthielt. Nach 7 bis 10 Tagen der Neomycin-Selektion waren die resistenten Kolonien sichtbar und wurden in Medium gehalten, das 300 ug/ml Neomycin G418 enthielt. Mehr als 50 Neomycin-resistente Kolonien wurden durch eine Trypsin-EDTA-Behandlung in Glaszylinder überführt und zum weiteren Züchten und Screening in separaten Gewebekulturschalen ausgesät.
Sobald ausreichende Zellzahlen von jeder Kolonie erhalten waren, wurden diese auf ihre Alkalische Phosphatase- Aktivität mittels einer Anfärbemethode auf Substratbasis gescreent, wie im Anfärbe-Kit auf Substratbasis für Alkalische Phosphatase, bezogen von Vector Laboratories, Inc., empfohlen. Kurz gesagt wurden konfluente Zellen zweimal mit PBS gespült und mit absolutem Ethanol fixiert. Dann wurde akalischer Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 9,5), der das Substrat enthielt, den Zellen zugegeben und bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert. Fünf der Kolonien, die gescreent wurden, wiesen hohe Grade an AP-Aktivität auf (waren stark gefärbt). Die höchste Aktivität wurde im Klon hFOB 1.19 festgestellt.

2. Thymidin-Einbau

Die hFOB-Zellen wurden bei geringer Dichte (5 · 10³ Zellen/Schale, Platte mit 48 Vertiefungen) im DMEM/F12-Medium mit 10% (Vol/Vol) FBS ausgesät und 16 bis 18 Stunden lang bei 33,5ºC kultiviert. Die Zellen wurden dann 24 Stunden lang bei der Testtemperatur (33,5ºC, 38,0ºC, 39,5ºC) kultiviert und dann mit 0,5 gi des ³H-markierten Thymidins 24 Stunden lang an jedem Tag des Zeitverlaufs gepulst. Nach jedem Thymidin-Puls wurden die Zellen dreimal mit 10% (Gew/Vol) Trichloressigsäure gespült, dann in 0,2% (Gew/Vol) Natriumhydroxid solubilisiert. Die gelöste Substanz wurde dann mit Szintillationscocktail zur Quantifizierung von ³H in einem Beckman-Szinillationszähler Modell LS2800 vermischt.

3. Karyotyp-Analyse

Die Karyotyp-Analyse wurde im Mayo Cytogenetics Laboratory mittels der bei J. L. Spurbeck et al., Cancer Genet. Cytogenet., 32, 59 (1988) beschriebenen Methode vorgenommen, wie für Fibroblastenkulturen ausgeführt und hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist. Kurz gesagt wurden die hFOB- Zellen bei geringer Dichte auf Glasdeckeln für Gewebekulturschalen ausgesät. Bei 10-30% Konfluenz wurden die Zellen mit 0,25 ug/ml Colcemid 30 bis 60 Minuten lang behandelt. Die Zellen wurden dann für Methaphasen-Abstriche unter Verwendung eines Tecan-Probenprozessor-Automats Modell 505 präpariert.

4. Immunozytochemie

Die Immunanfärbung für SV40 T Ag wurde durch Fixieren subkonfluenter hFOB-Zellen mit 100% Methanol über 10 Minuten bei 4ºC, dann Blockieren in 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS über 60 Minuten vorgenommen. Primärer Antikörper (in 1 % BSA in PBS) wurde zugegeben und auf den Zellen bei 25ºC über 60 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gespült und ein sekundärer Antikörper (Ziege-Anti-Maus-IgG) den Zellen zugegeben und 30 Minuten lang bei 25ºC inkubiert. Dann wurde Peroxidase-Reagenz und Chromogen-Reagenz gemäß den Anleitungen der Hersteller zugegeben. Die Immunanfärbung für OP, OC, ON, BSP und Kollagen Typ I wurde in derselben Weise vorgenommen, außer, daß die Tag-8- (postkonfluenten)-Zellen in absolutem Ethanol fixiert wurden, die Blockierung mit 10% (Vol/Vol) FBS in PBS vorgenommen wurde und der sekundäre Antikörper Ziege-Anti- Kaninchen-IgG war.

5. cAMP-Quantifizierung

Die hFOB-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen bis zur Konfluenz (etwa 5 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung) bei 33,5ºC in DMEM/F12-Medium mit 10% (Vol/Vol) FBS kultiviert, dann wurde das Kulturmedium ersetzt und die Zellen bei 39,5ºC 48 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 mM Isobutylmethylxanthen (IMBX) 2 Minuten lang vorbehandelt. Die Zellen wurden dann entweder mit 1-34 PTH (1-100 nM), PGE&sub2; oder Forskolin (10 uM) 10 Minuten lang behandelt. Die Medien wurden von den Zellen entfernt und die Zellen sofort mit kaltem (4ºC) PBS gespült, von den Gewebekulturplatten in kaltem (-20ºC) 70% (Vol/Vol) Ethanol abgeschabt, dann in 1,5-ml-Mikrozentrifugrierröhrchen transferiert und auf Eis beschallt. Das Zelllysat wurde in einer Evaporationszentrifuge lyophilisiert und in 0,25 ml Tris-EDTA-Puffer (50 mM Tris, pH 7,5, 4 mM EDTA) nochmals gelöst. Ein Anteil (20-50 ul) jedes Lysats wurde mit 50 ul ³H-cAMP und 100 ul cAMP-bindender Proteinlösung gemischt und bei 4ºC 120 Minuten lang inkubiert. Die Bindungsreaktion wurde dann mit 100 ul Dextran-Aktivkohle gemischt und bei 12.000 · g 5 Minuten lang zentrifugiert. Ein Anteil (200 ul) des Überstands wurde dann mit Szintillationscocktail zur Quantifizierung von ³H gemischt.

6. Anfärbung von mineralisierter Matrix

Postkonfluente hFOB-Zellen wurden in 1% (Gew/Vol) Paraformaldehyd in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS = 20 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl) fixiert und mit TBS gespült. Die Zellen wurden dann mittels des v.Kossa-Verfahrens angefärbt, modifiziert von R. K. Schenk et al., in Methods of Calcified Tissue Preparation; G. R. Dickson, Hrsg.; Elsevier; 1-4 (1984), welches hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist. Kurz gesagt wurden die Zellen mit 5% (Gew/Vol) Silbernitrat im Dunklen 15 Minuten lang behandelt. Die Zellen wurden dann mit destilliertem Wasser gespült, 5 Minuten lang einem Ultraviolettlicht ausgesetzt, mit Natriumcarbonat/Formaldehydlösung 2 Minuten lang behandelt und schließlich mit Farmer-Reduktionsmittel wie beschrieben 30 Sekunden lang behandelt.

7. Alkalische Phosphatase- und Osteocalcin-Assays

Die hFOB-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen bis zur Konfluenz in DMEM/F12-Medium mit 10% (Vol/Vol) FBS bei 33,5ºC kultiviert, dann mit etwa 3 ml Serum-freiem Medium zweimal gespült. Das Medium wurde durch Differenzierungsmedium (DMEM/F12 mit 0,2% (Vol/Vol) Aktivkohle-adsorbiertem FBS (csFBS), 100 ug/ml Ascorbinsäure und 10&supmin;&sup8; Menadion) ersetzt und die Zellen bei der gewünschten Temperatur 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde nochmals durch Differenzierungsmedium ersetzt und die Zellen mit verschiedenen Dosen 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;) oder Ethanol-Vehikel 48 Stunden lang behandelt. Das Medium wurde entfernt und für Osteocalcin-Assays verwendet, während die AP-Reaktion durch zweimaliges Spülen der Zellen mit PBS und Zugeben von 0,5 ml alkalischem Lysepuffer (0,75 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol, pH 10,3), der p-Nitrophenolphosphat-Substrat (2 mg/ml) enthielt, und Inkubieren bei 37ºC über 30 Minuten eingeleitet wurde. Der Reaktionsansatz wurde mit einem gleichen Volumen an 50 mM NaOH gemischt, dann 1 : 40 mit 20 mM NaOH verdünnt. Die Extinktion bei 410 nm wurde bestimmt und mit p- Nitrophenol-Standardwerten verglichen. Ein Teil der Reaktionslösung wurde zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration mittels der Bradford-Methode verwendet, wie beschrieben von M. M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976).
Ein Anteil des konditionierten Mediums (400 ul) oder Mediums plus bekannten OC-Standards (im Kit erhältlich) wurde mit einem ¹²&sup5;I-markierten Antikörper gegen Humanosteocalcin (Anti-OC) und einem mit dem Anti-OC-Antikörper beschichteten Plastikkügelchen gemischt. Diese Gemische wurden 18 bis 24 Stunden lang bei 25ºC inkubiert, dann die Kügelchen mit Waschpuffer gespült, wie durch den Hersteller im Osteocalcin-RIA-Kit, bezogen von Immutopics, spezifiziert. Kurz gesagt wurde der Bindungsreaktions-Puffer entfernt und dreimal mit jeweils 2 ml eines Waschpuffers gewaschen. Die gespülten Kügelchen wurden zur Quantifizierung von 1251 in Szintillationscocktail gegeben. Die Kontrollproben und die behandelten Proben wurden für die Quantifizierung von OC mit der Standardkurve verglichen.

C. Ergebnisse

1. Isolierung, Transfektion und Screening von hFOB-Zellen Aus fetalem Gewebe isolierte Primärkulturen wurden mit einem Gen transfiziert, das eine temperaturempfindliche Mutante (tsA58) des großen T-Antigens von SV40 codiert, zusammen mit einem die Neomycin-(G418)-Resistenz codierenden Gen. Einzelne Neomycin-resistente Kolonien wurden auf die Alkalische Phosphatase-(AP)-spezifische Färbung gescreent. Der Klon mit der höchsten AP-Menge, hFOB 1.19, wurde auf andere Osteoblasten-phänotypische Marker untersucht. Der experimentelle Thymidin-Einbau ergab, daß eine Inkubation von hFOB 1.19-Zellen bei einer permissiven Temperatur von 33,5ºC zu einer schnellen Zellteilung führte, wohingegen eine geringe oder keine Zellteilung bei einer restriktiven Temperatur von 39,5ºC auftrat. Die Messung der AP- Aktivität in hFOB-Zellextrakten ergab, daß bei 39,5ºC kultivierte Zellen 2- bis 3-fach höhere Mengen an AP aufwiesen als bei 33,5ºC kultivierte Zellen. Außerdem stieg die AP- Aktivität in einer dosisabhängigen Weise im Anschluß an die Behandlung mit 1,25-Dihydroxyvitamin D&sub3; (1,25-(OH)&sub2;D&sub3;) bei Kultivierung bei jeder der beiden Temperaturen an. In ähnlicher Weise zeigten die Radioimmunoassay-(RIA)-Analysen, daß die Menge an Osteocalcin, das aus 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;- behandelten hFOB 1.19-Zellen abgeschieden wurde, 10-mal höher bei Kultivierung der Zellen bei 39,5ºC im Vergleich zu bei 33,5ºC kultivierten Zellen war. Außerdem stiegen die Osteocalcinmengen in hFOB 1.19-konditionierten Medien in einer dosisabhängigen Weise in der Folge der 1,25-(OH)&sub2;D&sub3;- Behandlung bei Inkubationen sowohl bei 39,5ºC als auch 33,5ºC. Eine Behandlung der hFOB 1.19-Zellen mit 1-34- Nebenschilddrüsenhormon (PTH) bei 39,5ºC führte zu einem dreifachen Anstieg der cAMP-Mengen, wie mittels RIA gemessen. Bei Erreichen der Konfluenz vollzogen die hFOB 1.19- Kulturen die programmierte Differenzierung und bildeten mineralisierte Knöllchen, wie mittels der v.Kossa-Anfärbung beobachtet wurde. Ferner ergab die Immunanfärbung der postkonfluenten, differenzierten hFOB-Zellen, daß hohe Mengen an Osteocalcin, Osteopontin, Osteonectin, Knochensialoprotein und Kollagen Typ I exprimiert waren.

2. Temperaturkontrolle bei der hFOB-Zellvermehrung

Da die hFOB 1.19-Zellen mit einer temperaturempfindlichen Mutante tsA58 des großen T-Antigens von SV40 transfiziert wurden, wurde die Wirkung der Inkubationstemperatur auf die hFOB 1.19-Zellvermehrung untersucht. Die Rate des Thymidin- Einbaus durch die bei verschiedenen Temperaturen kultivierten hFOB 1.19-Zellen wurde gemessen, um so indirekt die Rate der hFOB 1.19-Zellteilung widergespiegelt zu bekommen. Diese Daten (Fig. 1) zeigen, daß bei der permissiven Temperatur von 33,5ºC kultivierte hFOB-Zellen sich bei einer Verdopplungszeit von etwa 36 Stunden schnell vermehrten. Ähnlich ergab eine mikroskopische Untersuchung einen Anstieg der Zellzahl von weniger als etwa 20% Konfluenz auf größer etwa 80% Konfluenz während des Zeitverlaufs. Im Gegensatz dazu schienen bei der restriktiven Temperatur von 39,5ºC kultivierte hFOB 1.19-Zellen sich während des Zeitverlaufs von vier Tagen nicht zu vermehren, wohingegen bei 38,0ºC kultivierte Zellen sich mit einer Verdopplungszeit von größer 96 Stunden sehr langsam vermehrten. Als die Zellen jedoch nach 24 Stunden bei 39,5ºC auf 33,5ºC heruntergeschaltet wurden, wurde die Vermehrung wieder aufgenommen und nahm eine Rate ähnlich der an, die bei Zellen beobachtet wurde, die kontinuierlich bei 33,5ºC gezüchtet wurden.

3. Karyotyp-Analyse

Um die chromosomale Zusammensetzung der hFOB 1.19-Zellen zu charakterisieren, wurde eine Karyotyp-Analyse bei Passage von 12 Zellen vorgenommen. Die Daten aus 100 Metaphasen zeigen, daß 43% der Zellen diploid und 57% tetraploid waren. Unter einer weiter analysierten Gruppe von 12 diploiden Metaphasen waren 7 normale 46,XX, und 5 waren 44- 46,XX mit einer 18q+-Translokation. Die Chromosomen- Polymorphismusmuster stimmten mit einer klonalen Zellpopulation überein. Der hFOB 1.19-Klon wurde bei 33,5ºC bis zu Passage 30 (etwa 100 Populationsverdopplungen) ohne Krisis kultiviert. Bei Passage 32 bis 34 gerieten die Zellen in eine Krisis und verlangsamte sich die Vermehrung beträchtlich.

4. Expression von Osteoblasten-phänotypischen Markern von SV40-T-Antigen

Um zu bestimmen, ob hFOB 1.19-Zellen Proteine exprimieren, die für den Osteoblasten-Phänotyp charakteristisch sind, und um zu bestätigen, daß das transfizierte große T- Antigen-(T Ag)-Gen von SV40 exprimiert war, wurde eine Immunanfärbung mit für Osteopontin (OP), Osteonectin (ON), Osteocalcin (OC), Knochensialoprotein (BSP), Kollagen Typ I und T Ag spezifischen Antikörpern vorgenommen. Die Ergebnisse dieser Immunanfärbungs-Experimente (Fig. 2) zeigten, daß hohe Mengen der Differenzierungsmarker OP, ON, OC, BSP und Kollagen Typ I in bei 33,5ºC kultivierten postkonfluenten hFOB-Zellen exprimiert waren. Außerdem wurden hohe Mengen an T Ag in den Kernen der hFOB-Zellen lokalisiert.

5. Induktion von cAMP-Mengen durch PTH und PEG&sub2;

Da zuvor gezeigt wurde, daß cAMP-Mengen durch PTH und PEG&sub2; in anderen Osteoblasten-Zelllinien beeinträchtigt waren, wurden diese cAMP-Agonisten auf ihre Aktivität in hFOB 1.19-Zellen mittels Radioimmunoassay untersucht. Die Daten (Fig. 3) zeigen, daß die cAMP-Mengen um über ein Dreifaches anstiegen, wenn die hFOB 1.19-Zellen mit 10 nM oder 100 nM PTH behandelt wurden, doch um weniger als das Zweifache anstiegen, wenn sie mit 1 nM PTH behandelt wurden. Enorme Anstiege der cAMP-Mengen wurden in der Folge einer Behandlung mit 100 nM PGE2 (> 50-facher Anstieg) oder mit dem bekannten Agonisten 10 uM Forskolin (> 80-facher Anstieg) beobachtet.

6. Bildung von mineralisierten Knöllchen

Von vielen Osteoblasten-Zelllinien wurde gezeigt, daß sie während der Prozeße der Zelldifferenzierung und Matrixmineralisierung mineralisierte Knöllchen bilden. Bei der Kultivierung von hFOB 1.19-Zellen über die Konfluenz hinaus (Tag 0) bei 33,5ºC trat nach und nach eine Bildung mineralisierter Knöllchen ein, bis die Knöllchen bis zum Tag 8 bis 10 deutlich sichtbar waren. Die Knöllchenbildung wurde auch in bei 39,5ºC kultivierten postkonfluenten Zellen beobachtet. Zur Sichtbarmachung der Calciumeinlagerung innerhalb der Knöllchen wurden die Zellen mittels des v.Kossa- Verfahrens angefärbt und unter Lichtmikroskopie untersucht. Diese Daten (Fig. 4) zeigten, daß die Calciumeinlagerung innerhalb der Knöllchen bis zum Tag 4 bis 6 ohne weiteres nachweisbar war und bis zum Tag 8 bis 10 nach Konfluenz umfangreich wurde. Interessanterweise war die Knöllchenbildung und Calciumeinlagerung sogar ohne Zugabe von β- Glycerophosphat oder hohen Dosen von Glucocorticoiden zum Kulturmedium umfangreich.

7. Regulierung der Alkalischen Phosphatase-Aktivität

Da die anfänglichen Screenings von Neomycin-resistenten Transfektanden ergab, daß die höchste Menge an AP in hFOB 1.19-Zellen vorlag, wurde die Regulierung von AP in diesem Klon unter Durchführung einer Anfärbung auf Substratbasis und standardmäßiger Enzymassays unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht. Um zu bestimmen, ob die AP- Aktivität innerhalb der hFOB 1.19-Zellen sich bei Erreichung der Konfluenz oder durch die Inkubationstemperatur verändert, wurde eine Anfärbung auf Substratbasis vorgenommen. Diese Daten (Fig. 5, Felder A-D) ergaben, daß die AP-Aktivität bei Erreichung der Konfluenz bei beiden Inkubationstemperaturen (33,5ºC oder 39,5ºC) enorm anstieg. Dies spiegelt eine Veränderung im Differenzierungsstadium der hFOB 1.19-Zellen zu einem reiferen Phänotyp wider. Die Menge der AP-spezifischen Färbung war bei konfluenten Zellen eindeutig viel höher (Fig. 5, Felder B und D) als bei subkonfluenten Zellen (Fig. 5, Felder A und C). Obschon eine geringfügig höhere Menge an AP-Aktivität in bei 39,5 ºC kultivierten hFOB 1.19-Zellen vorzuliegen schien (Fig. 5, Felder C und D) als in bei 33, 5ºC kultivierten Zellen (Fig. 5, Felder A und B), befindet sich diese Differenz möglicherweise an der Empfindlichkeitsgrenze dieses Assays. Um die Veränderungen bei der AP-Aktivität zu quantifizieren, die aus der Modifikation der Inkubationstemperatur oder durch Zugabe von 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; zum Medium resultieren, wurden standardmäßige Enzymassays mit hFOB 1.19- Zellextrakten durchgeführt. Diese Daten (Fig. 5, Feld E) zeigten, daß die AP-Aktivität in bei 39,5ºC kultivierten hFOB 1.19-Zellen zwei- bis dreimal höher war als in bei 33,5ºC kultivierten Zellen. Außerdem führte die Behandlung von hFOB 1.19-Zellen mit 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; zu einem dosisabhängigen Anstieg der AP-Aktivität in bei beiden Temperaturen (33,5ºC oder 39,5ºC) kultivierten Zellen. Diese Wirkung des 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; war relativ mäßig, da die höchste Dosis (100 nM) einen weniger als zweifachen Anstieg der AP- Aktivität erbrachte.

8. Regulierung der Osteocalcin-Expression

Um zu bestimmen, ob hFOB 1.19-Zellen das Osteoblastenspezifische Protein Osteocalcin (OC) abscheiden, und um festzustellen, ob die OC-Produktion durch 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; oder durch die Inkubationstemperatur reguliert wird, wurden Radioimmunoassays mit hFOB 1.19-konditioniertem Medium vorgenommen. Diese Daten (Fig. 6) zeigten, daß die OC-Mengen in hFOB 1.19-konditioniertem Medium nahe oder unter den nachgewiesenen Mengen ohne die Behandlung mit 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; bei Kultivierung der Zellen bei jeder der beiden Temperaturen (33,5ºC oder 39,5ºC) lagen. Allerdings führte die Behandlung von hFOB 1.19-Zellen mit 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; zu einem enormen Anstieg der OC-Mengen in einer dosisabhängigen Weise. Die Behandlung mit Dosen an 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; von lediglich 0,1 nM führte zu einem merklichen Anstieg der OC-Mengen, insbesondere dann, wenn die Zellen bei 39,5ºC kultiviert wurden. Ähnlich ergab die Behandlung mit höheren Dosen an 1,25- (OH)&sub2;D&sub3; entsprechend höhere Mengen an OC. Interessanterweise war die Wirkung von 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; auf die OC-Mengen ausgeprägter, wenn die hFOB 1.19-Zellen bei 39,5ºC kultiviert wurden. Tatsächlich war dann, wenn die Zellen mit 100 nM 1,25-(OH)&sub2;D&sub3; behandelt wurden, die Menge an OC, das durch bei 39,5ºC kultivierte Zellen abgeschieden wurde, 10-mal höher als bei den bei 33,5ºC kultivierten Zellen.

D. Hinterlegung von Zellen

Die sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen fetalen Zellen hFOB 1.19 wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA am 4. Juni 1993 hinterlegt und ihnen wurde die Zugriffsnummer ATCC CRL 11372 zugeteilt.

Beispiel II

Konstruktion und Charakterisierung von auf Östrogen ansprechenden, sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen Osteoblastenzellen

A. Verwendete Materialien

Die Phenol/Guanidinisothiocyanat-(TRI-Reagenz)-Lösung für die RNA-Isolierung wurde vom Molecular Research Center (Cincinnati, OH) bezogen, radiomarkierte Nukleotide und Steroide wie [α-³²P] -dCTP (Desoxycytidintriphosphat), [³H]- 17β-Östradiol, und [³H]-R5020 (Progesteronrezeptor-Agonist) wurden von DuPont-NEN (Boston, MA) bezogen. Der Kloniervektor pBluescript SK und Quickhyb-Puffer wurden von Stratagene (La Jolla, CA) und Geneticin von Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) bezogen. Gewebekulturmedium, 10 · Trypsin-EDTA- Reagenz und unmarkiertes 17β-Östradiol wurden von Sigma Chemical (St. Louis, MO) bezogen. Hygromycin B und fetales Rinderserum wurden von Flow-ICN (Costa Mesa, CA) bezogen. Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) bezogen.

B. Angewandte Methoden

1. Vektorkonstruktion

Eine Vektorkonstruktion erfolgte unter Anwendung von den Fachleuten des Gebiets bekannten standardmäßigen molekularbiologischen Verfahrensweisen. Siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology; F. M. Ausubel et al., Hrsg.; John Wiley & Sons; New York, NY; 1989. Kurz gesagt wurde die cDNA-Sequenz, die den menschlichen Wildtyp-Östrogenrezeptor (ER) codiert, unter Verwendung von EcoRI aus dem HEGO- Vektor ausgeschnitten (L. Tora et al., EMBO J., 8, 1981- 1986 (1989)). Dieses 1,9 Kb-Fragment wurde in die EcoRI- Stelle des pBluescript-SK-Vektors ligiert und nochmals unter Verwendung von EcoRV und BamHI ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in die EcoRV- und BamHI-Stellen des Expressionsvektors p636 ligiert, einem Derivat von pHYG (B. Sudgen et al., Mol. Cell. Biol., 5, 410-413 (1985)), enthaltend den CMV-Promotor (D. R. Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 659-663 (1984)), eingebaut in die ClaI/HindIII-Stellen, das in die BamHI-Stelle eingebaute SV40-Polyadenylierungssignal (BamHI/BclI-Fragment) und das durch den Thymidinkinase-Promotor gesteuerte Hygromycin-B- Resistenzgen. Der aus der Insertion der ER-cDNA in den p636-Vektor resultierende ER-Expressionsvektor wurde mit pHEGO-HYG bezeichnet (siehe Fig. 7 für Plasmidkarte).

2. Stabile Transfektion

Klonale hFOB 1.19-(Beispiel I)-Zellen wurden mit dem ER- Expressionsvektor pHEGO-HYG (ATCC Hinterlegungsnr. 79994) mittels Elektroporation transfiziert, wie in Beispiel I beschrieben ist. Kurz gesagt wurden 10 ug des pHEGO-HYG- Vektors (linearisiert mit NruI) dem Transfektionsgemisch vor der Elektroporation zugegeben. Die transfizierten Zellen wurden in Wachstumsmedium (Dulbecco's modifiziertes Eagles-Medium (DMEM)/Ham-F12-Medium (F12) 1 : 1 Vol/Vol. ergänzt mit 10% Vol/Vol Aktivkohle-adsorbiertem fetalem Rinderserum (csFBS)), ausplattiert und bei 33,5ºC über 48 Stunden inkubiert, dann in selektivem Medium, das 150 ug/ml Hygromycin B enthielt, über 7 bis 10 Tage inkubiert, bis resistente Kolonien klar erkennbar waren. Die resistenten Kolonien (~200-400 Zellen) wurden in Glasklonierzylindern trypsiniert, wie in Beispiel I beschrieben. Sie wurden passagiert und in selektivem Medium gehalten, das 100 ug/ml Hygromycin B enthielt, bis ausreichende Zellzahlen (~2 · 10&sup7;) für die Gefrierkonservierung erhalten waren. Zu den routinemäßigen Wachstumsbedingungen zählten ein Austausch des Mediums an jedem 2. Tag, wobei ein Wechsel zu selektivem Medium, das 300 ug/ml Geneticin (G418 Neomycin) anstelle des Hygromycin B enthielt, bei jedem alternierenden Medienaustausch zur Erhaltung der Neomycinresistenz vorgenommen wurde.

3. Steroid-Bindungsassays

Die spezifische 17 -Östradiol (E&sub2;)- und Progesteron (Pg)- Bindung in hFOB/ER-Zellen (d. h. Zellen, die mit pHEGO-HYG transfiziert wurden) wurde unter Anwendung des mikronuklearen Bindungs-(NB)-Assays (D. S. Colvard et al., Clin. Chem., 34, 363-369 (1988)) und des Dextran-Kohle-(DCC)-Assays (S. N. Thibobodeau, et al., Clin. Chem., 27, 687-691 (1981)) gemessen. Kurz gesagt wurden die hFOB/ER-Zellen bis zur Konfluenz in DMEM/F12 + 10% (Vol/Vol) csFBS gezüchtet. Die Zellen wurden dann dreimal mit Serum-freiem Medium (DMEM/F12 + 0,25% (Gew/Vol) BSA) gespült, mit 10&supmin;&sup9; M 17β- Östradiol oder Ethanol-Vehikel in Serum-freiem Medium 48 Stunden lang behandelt und dann nochmals in frischem Serumfreiem Medium weitere 48 Stunden lang behandelt. Im Anschluß an die 96-stündige Behandlungsperiode wurden die Zellen dreimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, aus den Gewebekulturkolben mittels Trypsin/EDTA-Behandlung entnommen, mit 10 Volumina DMEM/F12 + 10% (Vol/Vol) csFBS-Medium bei 4ºC gespült und bei 900 · g 10 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 10 ml PBS gespült und nochmals bei 900 · g 10 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Die resultierenden Zellpellets, enthaltend 4-8 · 10&sup6; Zellen für den nuklearen Bindungsassay oder 40-60 · 10&sup6; Zellen für den DCC-Assay wurden mit radiomarkierten Steroiden inkubiert, wie zuvor beschrieben (D. S. Colvard et al., Clin. Chem., 34, 363-369 (1988); S. N. Thibobodeau et al., Clin. Chem., 27, 687-691 (1981)).

4. Northern-Analysen

Die Gesamt-RNA wurde aus hFOB/ER-Zellen mittels der Phenol/Guanidinisothiocyanat-Methode von P. A. Chomczynski (Biotechniques, 15, 532-536 (1993)) isoliert, mit der Ausnahme, daß eine zusätzliche Extraktion mit einem Volumen Chloroform nach der Phenolextraktion erfolgte. Die gereinigten RNA-Proben wurden in Glyoxal/Dimethylsulfoxid-Puffer denaturiert und mittels Glyoxal-Agarosegelelektrophorese aufgetrennt (G. K. McMaster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4835-4838 (1977)). Die RNA wurde dann mittels Kapillardiffusion in 20X SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0) auf Nylonfilter aufgeblottet und durch Vakuum- Hitzebehandlung bei 80ºC über zwei Stunden an das Nylon gebunden. Die Hybridisierung wurde in einem Hybridisationsinkubator bei 65ºC über zwei Stunden in 10 ml Quickhyb- Puffer, der 100 ug/ml denaturierte Kälberthymus-DNA enthielt, vorgenommen. Jede Hybridisierung enthielt etwa 10&sup7; cpm (5-10 ng) ³²P-markierte cDNA. Eine Markierung der cDNAs wurde mit einem Random-Primer-Markierungs-Kit (Du- Pont-NEN, Boston, MA) gemäß den Anleitungen des Herstellers unter Verwendung von [³²P]-dCTP (3000 Ci/mmol) vorgenommen, und die markierten cDNAs wurden dann mittels Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Die Northern-Blots wurden mit einem Kodak X-OMAT AR5-Film mit Verstärkerschirmen bei -70ºC belichtet, dann in einem Kodax X-OMAT M20- Filmentwickler entwickelt. Die Quantifizierung der Bandenstärken wurde mit einem Shimadzu (Kyoto, Japan) CS 9000- Lichtpunktabtast-Laserdensitometer vorgenommen.

C. Ergebnisse

1. Expression des Östrogenrezeptors (ER) und E&sub2;-Bindungsaktivität in hFOB/ER-Subklonen

Auf die stabile Transfektion des ER-Expressionsvektors pHE- GO-HYG (Fig. 7) in hFOB 1.19-Zellen hin wurden die hFOB/ER-Subklone auf die Expression der ER-mRNA mittels Northern-Analyse gescreent. Fünf Subklone der hFOB/ER- Zellen wurden als signifikante Mengen der erwarteten 1,9 Kb ER-mRNA exprimierend befunden (Fig. 8). Ein breiter Bereich der ER-mRNA-Mengen im steady state war in den hFOB/ER-Subklonen exprimiert. Die höchste Menge der ERmRNA-Expression lag in hFOB/ER9 vor, die etwa 5-mal höher war als die ER-mRNA-Expression in hFOB/ER3, welche die geringste Menge aufwies. Der hFOB/ER6-Subklon exprimierte eine mRNA mit abweichender Größe, so daß dieser Subklon nicht weiter untersucht wurde.
Um zu bestimmen, ob die hFOB/ER-Zellen eine funktionelle Östrogenbindung zeigten, wurden nukleare Bindungsassays mit jedem Subklon vorgenommen. Diese Daten (Tabelle 2) zeigten, daß die Anzahl von Östrogen-Bindungsstellen, d. h. von aktivierten Östrogenrezeptoren, in jedem Subklon proportional zur Menge der in jedem Subklon exprimierten ER-mRNA war, wobei die höchste Anzahl von E&sub2;-Bindungsstellen, d. h. von Östrogenrezeptoren, (9.799) in hFOB/ER9 und die niedrigste Anzahl (825) in hFOB/ER3 vorlag. Untransfizierte Zellen wiesen weniger als 200 aktivierte Rezeptoren pro Kern auf. Da die hFOB/ER9-Zellen die höchste Anzahl an E&sub2;- Bindungsstellen aufwiesen, wurde dieser Subklon weiter auf seine Östrogen-Reaktivität untersucht. Die unter Verwendung von hFOB/ER9-Zellen durchgeführten DCC-Assays ergaben eine Messung des ER in einer Menge von 312 (±29 SEM aus drei separaten Assays) fmol/mg zystolischem Protein in diesem Subklon. Die basale Menge der ER-Expression in untransfizierten Zellen ist unter Anwendung des DCC-Assays nicht bestimmbar, da sie unterhalb der Empfindlichkeitsgrenze liegt. Die DCC-Assays wurden nicht an den Subklonen ER2, ER3 und ER4 vorgenommen. TABELLE 2

2. Wirkung von E&sub2; auf Progesteronrezeptor-(PR)-Mengen im Subklon hFOB/ER9

Von der E&sub2;-Behandlung von normalen menschlichen Osteoblasten-artigen (hOB)-Zellen ist bekannt, daß sie zu erhöhten Mengen der endogenen PR-Expression führt (E. F. Erickson et all, Science, 241, 84-86 (1988)). Um zu bestimmen, ob die endogene PR-Expression in E&sub2;-behandelten hFOB/ER-Zellen hochreguliert ist, wurden nukleare Bindungs- und DCC-Assays unter Verwendung des hFOB/ER9-Subklons durchgeführt. Diese Daten (Fig. 9) ergaben, daß die Anzahl der am Kern lokalisierten Progesteron-Bindungsstellen um das etwa 4-fache infolge der Behandlung mit 10&supmin;&sup9; M E&sub2; anstieg, wie mittels des nuklearen Bindungsassays gemessen wurde (Fig. 9, Feld A). In ähnlicher Weise stieg die Gesamtzahl der zellulären Progesteronrezeptoren um das etwa 2,5-fache, wie mittels des DCC-Assays gemessen wurde (Fig. 9, Feld B).

3. Wirkung von E&sub2; auf c-fos-mRNA-Mengen im Subklon hFOB/ER9

Von der E&sub2;-Behandlung von hOB-Zellen ist bekannt, daß sie zu einem schnellen Anstieg der endogenen c-fos-mRNA-Menge im steady state führt (S. A. Harris et al., J. Bone and Mineral Res., 7, 57 (1992)). Um zu untersuchen, ob die E&sub2;- Behandlung von hFOB/ER-Zellen eine ähnliche Wirkung auf die c-fos-Expression zeigt, wurden Northern Analysen unter Verwendung des hFOB/ER9-Subklons vorgenommen. Diese Daten ( Fig. 10) ergaben, daß die endogene c-fos-mRNA-Menge im steady state um das etwa 3-fache innerhalb von 30 bis 60 Minuten der E&sub2;-(10&supmin;&sup8; M)-Behandlung der bei 39,5ºC kultivierten ruhenden hFOB/ER9-Zellen stieg. Interessanterweise war die basale (Kontroll-) Menge der c-fos-mRNA bei den bei 33,5ºC gehaltenen hFOB/ER-Zellen etwa 4-mal höher als bei den Zellen bei 39,5ºC. Außerdem trat kein signifikanter Anstieg der Menge der c-fos-mRNA in den bei 33,5ºC kultivierten Zellen auf.

D. Vektorhinterlegung

Das ER-Plasmid pHEGO-HYG wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 20. April 1994 hinterlegt; zugeteilt wurden die Zugriffsnummern 79994 für das Plasmid in E. coli HB 101 und 79995 für die gereinigte Plasmid-DNA.

Claims

1. Eine sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle, die mit einem Gen transfiziert ist, das eine temperaturempfindliche Mutante des großen T- Protein-Antigens von Simian Virus 40 codiert, und die dieses Protein exprimiert.

2. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle ein Teil einer homogenen Population ist.

3. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach Anspruch 2, wobei die homogene Population eine Klonpopulation ist.

4. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die nicht tumorerzeugend ist.

5. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das T-Antigen inaktiviert werden kann.

6. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach Anspruch 5, wobei das T-Antigen zwischen einem inaktiven und einem aktiven Zustand geführt werden kann.

7. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die eine Osteoblastendifferenzierung ausführen kann.

8. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die weiterhin einen menschlichen Östrogenrezeptor in einer Höhe von mehr als etwa 400 aktivierten Rezeptoren pro Kern exprimiert.

9. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die die Identifikationseigenschaften von ATCC CRL 11372 aufweist.

10. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach Anspruch 1, die weiterhin mit einem Gen transfiziert ist, das einen wählbaren Marker codiert.

11. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die weiterhin mit einem Gen transfiziert ist, das einen menschlichen Östrogenrezeptor codiert.

12. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach Anspruch 11, wobei das den menschlichen Östrogenrezeptor codierende Gen auf einem replizierbaren Expressionsvektor lokalisiert ist.

13. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach Anspruch 12, wobei der replizierbare Expressionsvektor ein Plasmid ist.

14. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach Anspruch 13, wobei das Plasmid die Identifikationseigenschaften von Plasmid pHEGO-HYG (ATCC Nr. 79995) aufweist.

15. Sich unbegrenzt vermehrende normale fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14, die einen menschlichen Östrogenrezeptor in einer Höhe von mehr als etwa 400 aktivierten Rezeptoren pro Kern exprimiert.

16. Sich unbegrenzt vermehrende normale fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 oder 10 bis 15, die nach einem Verfahren hergestellt ist, das das Transfizieren einer menschlichen fetalen Knochenzelle mit Expressionsvektor pUCSVtsA58 umfaßt.

17. Sich unbegrenzt vermehrende normale menschliche fetale Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 oder 10 bis 16, die weiterhin mit Expressionsvektor pSV2neo transfiziert ist.

18. Verfahren zur Herstellung der sich unbegrenzt vermehrenden normalen menschlichen fetalen Osteoblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder 9, das das Transfizieren einer isolierten menschlichen fetalen Gewebezelle mit einem Expressionsvektor umfaßt, der ein Gen aufweist, das eine temperaturempfindliche Mutante des großen T-Antigens von Simian Virus 40 codiert, um die sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen fetalen Osteoblastenzellen zu ergeben, die dieses Antigen exprimeren.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Expressionsvektor ein Plasmidexpressionsvektor ist.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, das weiterhin einen Schritt des Transfizierens einer isolierten menschlichen fetalen Knochenzelle mit einem selektierbaren Markierungsgen und/oder mit einem Gen, das einen menschlichen Östrogenrezeptor codiert, umfaßt.

21. Verfahren zum Prüfen eines Wirkstoffs bzw. Arzneimittels auf Wirkungen auf die Osteoblastenzellphysiologie, das das Aussetzen einer Kultur der sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen fetalen Osteoblastenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 17 umfaßt, die eine temperaturempfindliche Mutante des großen T-Antigens von Simian Virus 40 exprimieren, einem Wirkstoff bzw. Arzneimittel, und Überwachen mindestens einer Änderung der Physiologie der kultivierten Zellen.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen fetalen Osteoblastenzellen bei einer Temperatur von nicht mehr als 37ºC kultiviert werden.

23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die sich unbegrenzt vermehrenden menschlichen fetalen Osteoblastenzellen bei einer Temperatur von mehr als 37ºC kultiviert werden.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Überwachungsschritt die Überwachung der Abscheidung von Wachstumsfaktoren und anderen Cytokinen, des Zellwachstums, der Expression von zu Osteoblasten gehörenden Genen, der Bildung von mineralisierten Knöllchen, der Mineralisierung von extrazellulärer Matrix oder der Bildung von Knochen umfaßt.

25. Menschliche fetale Osteoblastenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Verwendung bei einer Gewebetherapie.

26. Verwendung von menschlichen fetalen Osteoblastenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 17 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Knochenabbau bzw. Knochenverlust.

27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß eine wirksame knochenerzeugende Menge der Zellen in dem Medikament vorliegt, das in einen beschädigten Knochen an dem Punkt der Beschädigung eingeführt werden kann.

28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei der beschädigte Knochen ein gebrochener Knochen ist und der Punkt der Beschädigung ein Bruchpunkt oder Durchbruchpunkt ist.