DE69433934T2

DE69433934T2 - Verfahren und Zusammensetzungen zur erhöhten Proteinproduktion von rekombinanter DNA

Info

Publication number: DE69433934T2
Application number: DE69433934T
Authority: DE
Inventors: Hermann Oppermann; Haimanti Dorai; Paul Kaplan
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1993-10-25
Filing date: 1994-10-21
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2014-10-22
Also published as: WO1995011983A1; US5614385A; CA2171759C; EP0725829A1; EP0725829B1; DE69433934D1; US5585237A; JPH09504175A; US5712119A; JP3570721B2; AU685188B2; CA2171759A1; AU8085994A; JP2004194681A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Anmeldung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der rekombinanten Gen-Expression.
Hintergrund der Erfindung
Verbesserte Methoden zum Maximieren der Protein-Produktion durch rekombinante Gen-Expression ist ein anhaltendes Bestreben in der Technik. Von speziellem Interesse ist die Entwicklung von Methodologien, die die rekombinante Expression biologisch aktiver Proteine zur Produktion kommerziell nützlicher Mengen dieser Proteine maximieren. Während prokaryontische, typischerweise bakterielle Wirtszellsysteme, sich als dazu in der Lage erwiesen haben, große Mengen an rekombinanten Proteinen zu erzeugen, leiden diese Wirte unter mehreren Nachteilen, einschließlich eines Unvermögens, Proteine zu glykosylieren, „Prä"- oder „Präpro"-Sequenzen von Proteinen ineffizient abzuspalten (beispielsweise eine ineffiziente posttranslationale Modifikation) und einer allgemeinen Unfähigkeit, Proteine zu sezernieren. Folglich wurde in der Technik nach eukaryontischen Wirtssystemen gesucht, typischerweise Säugetier-Wirtssystemen, für die Produktion von Säugetier-Protein. Ein Merkmal dieser Systeme besteht darin, dass das Protein, das produziert wird, eine Struktur aufweist, die derjenigen der natürlichen Proteinspezies am meisten ähnlich ist, und die Aufreinigung ist oftmals einfacher, weil das Protein in das Zellkulturmedium in einer biologisch aktiven Form sezerniert werden kann.
Mehrere Probleme existieren jedoch nach wie vor in Säugetier-Kultursystemen. Insbesondere sind hohe Konzentrationen an Produktion typischerweise in Säugetiersystemen nicht einfach gewinnbar. Zusätzlich weisen eukaryontische Wirtszellen typischerweise stringentere Anforderungen an das Kultivieren und geringere Wachstumsgeschwindigkeiten auf. Somit erfordert die Erzeugung großer Mengen eines rekombinanten Proteins mehr als nur einfach ein Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionvektor transfiziert wurde. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn das interessierende Gen ein Protein kodiert, das schlecht exprimiert wird, beispielsweise das nicht reichlich erzeugt wird und/oder nur vorübergehend unter natürlichen, physiologischen Bedingungen erzeugt wird. Typischerweise weisen die Gene für diese Proteine vielfache Regulierungsebenen auf, oftmals auf einer oder mehreren Ebenen des Expressionssystems, beispielsweise auf der Ebene der Transkription, Translation, der Post-Translations-Modifikation, Sekretion und/oder Aktivierung. Typischerweise produzieren diese Gene, wenn sie stabil in nicht-amplifizierte, immortalisierte Zellen integriert sind, weniger als ungefähr 10 bis 100 ng Protein/10⁶ Zellen/ml. Das Maximieren der Produktion dieser Proteine bedeutet das Identifizieren von Mitteln zur Umgehung dieser Regulationsebenen.
Ein Ansatz zum Erreichen einer verbesserten Proteinproduktion besteht in der Verwendung von transienten bzw. vorübergehenden Zellexpressionssystemen, wobei die Zellen mit hohen Kopienanzahlen von Plasmiden transfiziert werden, von denen erwartet wird, dass sie sich nicht in das Wirtszell-Genom integrieren. Die Plasmide, die in transienten Zellexpressionssystemen verwendet werden, können so modifiziert werden, dass ihre Kopienanzahlen während der Replikation nach der Transfektion erhöht werden. Während das Transfektionsereignis typischerweise die Lebenszeit dieser Zellen auf nur mehrere Generationen beschränkt, können vernünftige Mengen des erwünschten Proteins erzeugt werden, während die Zellen lebend bleiben. Weil solche transienten Zellsysteme eine kurze Lebenszeit aufweisen, waren sie nicht die Zellsysteme der Wahl für kommerzielle Produktionssysteme. Transiente Zellsysteme werden oftmals dazu verwendet, ein Kandidaten-Plasmid oder eine andere Vektorkonstruktion zu screenen als Teil der Entwicklung einer immortalisierten, konstitutiven Zelllinie. Weil jedoch transiente Expressionssysteme kurzlebig sind, kann die Langzeitproduktivität spezieller Vektorkonstruktionen (oder ihre Wirkungen, wenn sie einmal integriert sind, auf die Lebensfähigkeit einer Zelle nach vielen Generationen) nicht mit Gewissheit bestimmt werden. Demgemäß wurden mehrere Plasmidkonstruktionen in etablierten Zelllinien als nicht nützlich bestimmt, während sie in transienten Zellsystemen produktiv waren, ein Ereignis, das im Allgemeinen nicht bestimmt werden kann, bis eine etablierte Zelllinie erzeugt wird.
Zwei alternative Wege, auf die sich die Technik zur Verbesserung der rekombinanten Gen-Expressionen eukaryontischer Wirtssysteme konzentriert, besteht in der Steigerung der Gen-Kopienzahl, typischerweise durch Gen-Amplifikation, und in der Steigerung der Leistungsfähigkeit der Expression jeder Gen-Kopie. Die üblichste Methode zur Steigerung der Gen- Kopiezahl besteht im Selektieren nach einer Gen-Amplifikation, wobei die Wirtszelle mit zwei Genen transformiert wird, gebunden oder ungebunden, von denen eines das erwünschte Protein kodiert und das andere einen amplifizierbaren selektierbaren Marker kodiert, beispielsweise die Hydrofolatreduktase (DHFR). Transformierte Zellen werden dann in Gegenwart zunehmender Konzentrationen eines toxischen Mittels (Methotrexat, wobei der amplifizierbare Marke DHFR ist) kultiviert, dessen Wirkungen durch Expression des selektierbaren Marker-Gens aufgehoben werden können. In Reaktion auf hohe Konzentrationen des toxischen Mittels überleben Zellen, weil sie die Kopienzahl des selektierbaren Marker-Gens amplifiziert haben und zufälligerweise, des erwünschten Protein-Gens. Unter Verwendung dieser Methodologie wurden Kopienzahlen in Hunderten und Tausenden/Zelle erreicht.
Während die Gen-Amplifikation sich als nützlich erwiesen hat, leidet die Methodologie unter mehreren Nachteilen, die auf die kommerzielle Produktion bezogen sind. Beispielsweise ist die Produktion einer hoch produktiven Zelllinie durch Gen-Amplifikation alleine, die, beispielsweise tausende Kopien des interessierenden Gens aufweist, ein zeitraubender Prozess, der oftmals zwischen 6 bis 10 Monaten bis zu seinem Abschluss erfordert. Überdies ist die Verifikation der Nukleotidsequenz-Integrität für jede Gen-Kopie in einer Zelle bei einer sehr hohen Kopienanzahl schwierig oder nicht möglich. Demgemäß können Punktmutationen und andere Sequenzmodifikationen, die biologische Aktivität des Proteinproduktes zu ändern, nicht nachgewiesen werden und können weiterhin Probleme mit der Befolgung von Regierungsvorschriften (beispielsweise FDA) mit sich bringen. Überdies erfordert die Maintenance bzw. Aufrechterhaltung einer solch hohen Kopienzahl die Aufrechterhaltung des selektiven Drucks durch Aufrechterhaltung hoher Konzentrationen des toxischen Mittels im Kulturmedium. Dies ist sowohl teuer und stellt auch zusätzliche regulatorische Angelegenheiten dar, wenn das Protein von Interesse aus dem Kulturmedium aufgereinigt wird. Zuletzt und vielleicht am bedeutendsten mag lediglich die Erhöhung der Kopienanzahl der DNA nicht ausreichend sein, um die Proteinproduktion signifikant zu erhöhen, wenn ein Gen multiple Ebenen einer Expressionsregulierung aufweist.
Ein Verfahren zur Steigerung der rekombinanten DNA-Expression besteht in ein oder mehr Genen, die Expressions-Effektormoleküle kodieren. Zu diesen Effektormolekülen, die in der Technik bekannt sind, zählen trans-wirkende Transkriptionsaktivatoren, die die Transkription heterologer Gene stimulieren können. Beispiele schließen das Simian-Virus (SV40)-T-Antigen und die Adenovirus-E1A- und -E1B-Proteine ein, die auf bestimmte virale Proteine oder heterologe Gene einwirken können, einschließlich des Zytomegalie-Virus (CMV) Major Intermediate Early (MIE) Promotors. Andere Moleküle, von denen berichtet wurde, dass sie eine trans-wirkende Aktivität aufweisen, schließen die sehr frühen (Immediate Early = IE) Proteine von Herpesviren, C-myc und Gene des humanen und Affen- erworbenen Immundefizienz-Virus ein.
Weitere virale Gene, die die Säugetier-Proteinproduktion beeinträchtigen können, sind virale translationale Kontrolleffektoren. Beispiele schließen RNA-Sequenzen ein, die durch den Adenovirus kodiert sind, beispielsweise die VA-Gene (Va1 und VA2). Es wird angenommen, dass solche Sequenzen die Proteinproduktion unterstützen, indem der Translationsstart unterstützt wird, vermutlich durch Bindung mit ein oder mehreren Translationsstartfaktoren. Weitere Sequenzen schließen RNA-Sequenzen ein, die die Stabilität des mRNA-Transkriptes verbessern.
Cockett et al. ((1990) Nucleic Acids Research 19: 319–325 und EP-Anmeldung 378382) beschreiben die Verwendung der Adenovirus-E1A-Gene als Alternative zur Gen-Amplifikation für die rekombinante Proteinexpression in chinesischen Hamster-Ovar (CHO)-Zellen, wobei das Gen von Interesse unter der Kontrolle des CMV-Promotors steht. Es wird behauptet, dass die Proteinkonzentration, die erzeugt wird, die Konzentrationen erreicht, die durch Gen-Amplifikation erreichbar sind, wodurch der Bedarf nach einer Gen-Amplifikation umgangen wird. Darüber hinaus sehen die Autoren keine beträchtliche Zunahme der Proteinproduktivität, wenn das E1A-Gen in eine amplifizierte Zelllinie eingebracht wird, die das Gen von Interesse exprimiert.
US-Patent Nr. 5 024 939 beschreibt ein unamplifiziertes transientes Zellexpressionssystem, das „nützliche" Mengen eines erwünschten Genproduktes in 1 bis 14 Tagen produziert, ohne ein kontinuierliches Produktionszell-System zu etablieren. Die Autoren transfizieren E1A-exprimierende Zellen („293"-Zellen) mit einer großen Vielzahl von Plasmiden, die das Gen von Interesse unter CMV-Promotorkontrolle tragen und zeigen eine erhöhte Proteinproduktion in diesen Zellen für die kurze Lebenszeit der Zellen. Eine Kotransfektion der 293-Zellen mit dem Adenovirus-VA1-Gen scheint die Menge des Proteins, die in diesen Zellen produziert wird, zu verdoppeln.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der Proteinproduktion von schlecht exprimierten Genen durch DNA-Rekombinations-Technologie bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, immortalisierte Zelllinien bereitzustellen, die zur kommerziellen Ausbeutung geeignet sind, wobei die Zellen stabil mit dem Gen von Interesse transfiziert sind und dazu in der Lage sind, das Gen von Interesse konstitutiv zu exprimieren, und Verfahren zur Erzeugung dieser Zelllinien bereitzustellen. Es ist eine noch weitere Aufgabe der Erfindung, Zelllinien und Verfahren zu deren Erzeugung bereitzustellen, die eine hohe Produktivität an rekombinantem Protein zeigen wohingegen sie eine niedrige Kopienzahl pro Zelle der rekombinanten DNA-Sequenzen, die das Protein kodieren, aufrechterhalten. Es ist eine noch weitere Aufgabe, Zelllinien bereitzustellen, die so angepasst sind, dass sie in Serum-armen oder Serum-freiem Medium wachsen.
Es ist bedeutenderweise eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Erzeugung kommerziell brauchbarer Mengen morphogener bzw. morphogenetischer Proteine aus Kulturen immortalisierter, stabil transfizierter CHO-Zelllinien bereitzustellen.
Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung, den Zeichnungen und den folgenden Ansprüchen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nunmehr eine Verbesserung der Produktions-Methoden rekombinanter Proteine entdeckt, die spezielle Anwendung für die Expression von „Niedrigexprimierungs"- oder „schlecht exprimierenden" Genen hat. Als Folge dieser Erfindung können Produktionsmengen schwer herzustellender Proteine in kommerziellem Maßstab aus stabil transfizierten konstitutiv exprimierenden eukaryontischen Zellen gewonnen werden. Darüber hinaus zeigen die von dieser Erfindung gelehrten Zelllinien eine hohe Produktivität von rekombinantem Protein, während eine niedrige Kopienanzahl pro Zelle der rekombinanten DNA-Sequenzen, die das Protein kodieren, aufrechterhalten wird. Die Zelllinien der Erfindung können ebenfalls dazu angepasst werden, in Serum-armen oder sogar Serum-freiem Medium ohne signifikante Verschlechterung des Zellwachstums oder der Proteinproduktivität zu wachsen.
Die Erfindung schließt multiple Transfektionen einer immortalisierten eukaryontischen Zelle mit einem Gen von Interesse und zumindest ein und vorzugsweise zwei Expressionseffektor gene viralen Ursprungs ein, die dazu in der Lage sind, die Expression des Gens von Interesse zu bewirken, die transfizierte Zelle unter geeigneten Selektionsbedingungen zu kultivieren, so dass die transfizierte DNA stabil in das Zellgenom integriert ist, und einen Klon auszuwählen, der zumindest 1 μg Protein/10⁶ Zellen/ml in der postlogarithmischen Phase exprimiert, für Zellen, die in einem „Batch" oder einer „Terminal"-Zellkultur gezüchtet wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform exprimiert der Klon zumindest 5 μg Protein/10⁶ Zellen/ml oder zumindest 10 μg Protein/10⁶ Zellen/ml. Wie der Fachmann auf dem Gebiet erkennen wird, kann eine höhere Proteinproduktivität durch Modifizieren der Kultivierungsbedingungen erzielt werden, um beispielsweise das Zellwachstum oder die Zellanzahl zu steigern. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Gen von Interesse mit Mitteln zum Amplifizieren des Gens kotransfiziert und die Zelle unter Selektionsbedingungen kultiviert, die eine Gen-Amplifikation induzieren. Während irgendwelche Mittel zur Gen-Amplifikation als nützlich betrachtet werden, ist das gegenwärtig bevorzugte Mittel zur Gen-Amplifikation die Kotransfektion eines Gens, das einen amplifizierbaren Selektionsmarker kodiert, wie beispielsweise DHFR oder Adenosindeaminase, in operativer Verbindung mit einer Transkriptionseinheit. Am meisten bevorzugt ist das amplifizierbare Selektionsmarker-Gen auf derselben Nukleinsäure oder Vektor vorliegend, die (der) das Gen von Interesse trägt.
Während das Verfahren der Erfindung bezüglich einer einzigen Zelle beschrieben wird, ist es für den Fachmann auf dem Gebiet klar, dass dies nur zur Vereinfachung der Beschreibung erfolgt und das Verfahren unter Verwendung einer Vielzahl von Zellen äußerst effizient durchgeführt werden kann.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Vektor" jede Nukleinsäure, die eine Nukleotid-Sequenz von Interesse umfasst und dazu in der Lage ist, in die Wirtszelle integriert zu werden und sich mit dem Wirtszellgenom zu rekombinieren und sich in dieses zu integrieren. Solche Vektoren schließen lineare Nukleinsäuren, Plasmide, Phagemide, Cosmide und dergleichen ein.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Gen-Expression" die Produktion des Proteinproduktes betreffen, das durch eine DNA-Sequenz von Interesse kodiert wird, einschließlich der Transkription der DNA-Sequenz und der Translation des mRNA-Transkripts.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „schlecht exprimierte Gene" Gen-Sequenzen beschreiben, beispielsweise DNA-Sequenzen, auf die durch eine RNA-Polymerase eingewirkt werden kann, um ein mRNA-Transkript zu erzeugen, und die nicht leicht exprimiert werden und für nur geringe Konzentrationen, beispielsweise weniger als 10 bis 100 ng Protein (10⁶ Zellen/ml) in einem unamplifizierten, stabil integrierten immortalisierten eukaryontischen Wirtszellsystem erzeugt werden, und für die weniger als 100 bis 1000 ng Protein/10⁶/ml in einer amplifizierten Zelle erzeugt werden. Beispielsweise ist eine hoch amplifizierte eukaryontische Zelle eine transfizierte Zelle, die so ausreichend subkloniert wurde, dass sie ungefähr 1000 oder mehr Kopien des Gens von Interesse stabil in das Wirtszellgenom integriert und in operativer Verbindung mit einer starken Promotor/Enhancer-Einheit aufweist.
Typischerweise sind Beispiele für schlecht exprimierte Gene solche Gene, deren Expression unter natürlich vorkommenden Bedingungen hoch reguliert ist. Beispiele für solche Gene schließen Proteinhormone, Faktor VIII, TPA (Gewebsplaminogenaktivator) und die Klasse der Proteine ein, die Gewebsmorphogene oder morphogene Proteine genannt werden (s. beispielsweise PCT/US92/07432 (WO 93/05751); oder PCT/US93/08808). Schlecht exprimierte Gene sind dadurch gekennzeichnet, dass sie auf einer oder mehreren Expressionsebenen hoch reguliert sind, beispielsweise auf der Ebene der Transkription, der Translation, der posttranslationalen Modifikation, der Sekretion und/oder der Proteinaktivierung.
Eine weitere Klasse von Genen, für die eine beträchtliche Proteinproduktion schwierig durchzuführen ist, schließen nicht-native, biosynthetische oder in anderer Weise künstliche Gene ein, beispielsweise Gene, die durch rationelles Design erzeugt wurden und die ein oder mehrere nicht-native DNA- und/oder RNA-Sequenzen oder Strukturen enthalten, mit denen das Wirtsexpressionssystem nicht verwandt ist und die die effiziente Proteinproduktion beschränken oder in anderer Weise stören können. Ein Beispiel für eine solche künstliche Sequenz, die in der Natur nicht auftritt, ist das einkettige Bindungsstellenmolekül (in der Technik auch als „BABS", „biosynthetische Antikörper-Bindungsstellen"-Moleküle), bei denen eine leichte und schwere Kette in einer einzigen DNA-Sequenz kodiert sind, verbunden durch eine Sequenz, die einen Polypeptidlinker kodiert (s. beispielsweise US-Patent Nr. 5 132 405 und 5 091 513). Es ist bis heute nicht sicher, welche der limitierende Schritt oder die Schritte in der effizienten Expression dieser Gene sein kann; solche Einschränkungen können eine nicht-ausreichende Sekretion einschließen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert das Gen von Interesse ein Element der Klasse von Proteinen, die als morphogenetische Proteine bezeichnet werden, wie sie in PCT/US92/01968 (WO 92/15323) oder PCT/US92/07432 (WO 93/05751) oder PCT/US93/08808 definiert sind. Diese morphogenetischen Proteine, die in der Erfindung in Betrachtung gezogen werden, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Gruppe, die aus OP1, OP2, OP3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, DPP, Vgl, Vgr, 60A-Protein, GDF-1, GDNF, Dorsalin-1 und Aminosäuresequenzvarianten hiervon besteht, die die morphogenetische Aktivität dieser Proteine in vivo im Wesentlichen nicht verändern. Wie in diesen Spezifikationen definiert, sind die Elemente dieser Klasse von Proteinen dadurch charakterisiert, dass sie zur Induktion der Entwicklungskaskade zellulärer und molekularer Ereignisse in der Lage sind, die in der Bildung neuen Organ-spezifischen Gewebes kulminieren, einschließlich irgendeiner vaskulären oder Bindegewebsbildung, wie sie durch das natürlich vorkommende Gewebe erfordert werden. Insbesondere sind die Morphogene dazu in der Lage, alle der nachfolgenden biologischen Funktionen in einer morphogenetisch permissiven Umgebung zu induzieren: (1) Stimulieren der Proliferation von Vorläuferzellen; (2) Stimulieren der Differenzierung von Vorläuferzellen; (3) Stimulieren der Proliferation von differenzierten Zellen und (4) Unterstützen des Wachstums und der Aufrechterhaltung differenzierter Zellen. In einer besonderen Ausführungsform können die Proteine die volle Entwicklungskaskade von Knochengewebs-Morphogenen induzieren, einschließlich der Migration und Proliferation von mesenchymalen Zellen, der Proliferation und Differentiation von Knorpelzellen bzw. Chondrozyten, der Knorpelmatrix-Bildung und der Calzifizierung, der vaskulären Invasion, der Osteoblasten-Proliferation, der Knochenbildung, der Knochenumformung und der hämatopoietischen Knochenmarks-Differentiation.
Die Gensequenzen, die diese Proteine kodieren und Beschreibungen für ihre Isolation aus verschiedenen Genomen sind in der Technik wie folgt offenbart: OP1 ( US 5 011 691 ; Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9: 2085–2093 und USSN 07/841 646, Februar 21, 1992; OP2 (Ozkaynak (1992), J. Biol. Chem. 267: 25220–25227 und USSN 07/841646); BMP2, 3, 4 (Wozney et al. (1988), Science 242: 1528–1534); BMP5, 6 (Celeste et al. (1991), PNAS 87: 9842–9847); BMP9 (WO 93/00432, veröffentlicht 7. Januar 1993); GDF-1 (Lee (1991), PNAS 88: 4250–4254); DPP (Padgett et al. (1987), Nature 325: 81–84); Vg-1 (Weeks (1987), Cell 51: 861–867); vgr-1 (Lyons et al. (1989), PNAS 86: 4554–4558); 60A (Wharton et al. (1991), PNAS 88: 9214–9218); GDNF (Lin et al. (1993), Science 260: 1130–1132) und Dsl-1 (Dorsalin-1, Basler et al. (1993), Cell 73: 687–702).
Die Gensequenzen kodieren Proteine, deren unreife Translationsprodukte eine Sekretionssignalsequenz und eine „Pro"-Domäne umfassen, die beide zur Freisetzung der Polypeptidketten von ungefähr 135 bis 145 Aminosäuren, abhängig von der Protein-Spezies, gespalten werden. Die Mitglieder der Klasse werden teilweise durch eine signifikante Aminosäurehomologie gekennzeichnet (beispielsweise zumindest 70% Homologie) innerhalb der C-terminalen 102 bis 106 Aminosäuren, einschließlich 7-Cysteinen, im Wesentlichen konserviert in ihrer linearen Anordnung in der C-terminalen Sequenz.
Die Proteine werden typischerweise als Disulfid-verbundene Dimere sezerniert und werden unter physiologischen Bedingungen durch nicht-kovalente Bindung mit einer oder mehreren Kopien der gespaltenen Pro-Domäne löslich gemacht.
Die Morphogene sind, wenn sie reduziert sind, inaktiv, sind jedoch als oxidierte Homodimere aktiv und wenn sie in Kombination mit anderen Morphogenen der Erfindung oxidiert werden. Somit ist, wie hierin definiert, ein Morphogen ein dimeres Protein, das zwei Polypeptidketten umfasst, wobei jede Polypeptidkette zumindest das C-terminale 6-Cystein-Skelett umfasst, das durch die C-terminalen 96 Aminosäuren der reifen OP1-Polypeptidsequenz definiert ist, einschließlich funktionell äquivalenter Anordnungen dieser Cysteine (beispielsweise Aminosäure-Insertionen oder -Deletionen, die die lineare Anordnung der Cysteine in der Sequenz, jedoch nicht ihr Verhältnis in der gefalteten Struktur verändern), so dass, wenn die Polypeptidketten gefaltet werden, die dimere Proteinspezies, die das Paar der Polypeptidketten umfasst, die geeignete dreidimensionale Struktur aufweist, einschließlich der geeigneten Intra- oder Interketten-Disulfid-Brücken, so dass das Protein in vivo morphogenetisch kompetent ist.
Besonders nützliche Sequenzen zur Verwendung als Morphogene schließen die C-terminalen Domänen der Klasse morphogenetischer Proteine ein, beispielsweise die C-terminalen 96 oder 102 bis 106 Aminosäurereste von Vgl, Vgr-1, DPP, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, GDF-1, GDNF, Dsl-1, 60A-Protein, BMP3, BMP5, BMP6 und BMP9, die alle zumindest das konservierte 6- oder 7-Cystein-Skelett jeweils einschließen. Zusätzlich sind biosynthetische Konstrukte, die aus den generischen Sequenzen entwickelt wurden, beispielsweise COP-1, 3–5, 7, 16, im US-Patent Nr. 5 011 691 offenbart, ebenfalls von Nutzen. Weitere Sequenzen schließen die Inhibin/Aktivin-Proteine ein (s. beispielsweise US-Patent Nr. 4 961 590 und 5 011 691).
Demgemäß sind andere nützliche Sequenzen solche, die zumindest 70% Aminosäuresequenz-Homologie oder -„Ähnlichkeit" teilen und die vorzugsweise 80% Homologie oder Ähnlichkeit mit irgendeiner der obigen Sequenzen aufweisen. Es wird angenommen, dass diese Allel-Speziesvarianten und andere Aminosäuresequenzvarianten einschließen (beispielsweise einschließlich von „Muteinen" oder „mutierten Proteinen"), gleichgültig ob natürlich vorkommend oder biosynthetisch produziert, ebenso wie neue Mitglieder dieser morphogenetischen Familie von Proteinen. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Aminosäuresequenz-Homologie" eine Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit bedeuten und homologe Sequenzen teilen identische oder ähnliche Aminosäuren, wobei ähnliche Aminosäuren konservierte Aminosäuren sind, wie sie durch Dayoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure; Bd. 5, Ergänzungsband 3, Seiten 345–362 definiert sind (M. O. Dayoff Hsg., Natl. BioMed. Research Fdn., Washington D. C., 1978). Somit erfordert eine Kandidatensequenz, die eine 70%ige Aminosäuresequenz-Homologie mit einer Referenzsequenz aufweist, dass, im Anschluss an ein Alignment der Kandidatensequenz mit der Referenzsequenz, 70% der Aminosäuren in der Kandidatensequenz zur entsprechenden Aminosäure in der Referenzsequenz identisch sind, oder einen konservativen Aminosäureaustausch hierfür darstellen. „Aminsäuresequenz-Identität" erfordert identische Aminosäuren zwischen zwei aneinander ausgerichteten Sequenzen. Somit erfordert eine Kandidatensequenz, die 60% Aminosäure-Identität mit einer Referenzsequenz teilt, dass, folgend der Ausrichtung bzw. dem Alignment der Kandidatensequenz mit der Referenzsequenz, 60% der Aminosäuren in der Kandidatensequenz zur entsprechenden Aminosäuresequenz in der Referenzsequenz identisch sind.
Wie hierin verwendet, verwenden alle Homologien und Identitäten, die berechnet wurden, OP-1 als Referenzsequenz. Ebenfalls, wie hierin verwendet, werden die Sequenzen für Homologie- und Identitätsberechnungen unter Verwendung des Verfahrens von Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453 ausgerichtet und die Identitäten werden durch das Align-Program (DNAstar, Inc.) berechnet. In allen Fällen werden innere Lücken und Aminosäureinsertionen in der Kandidatensequenz wie ausgerichtet ignoriert, während die Homologie-Identitätsberechnung durchgeführt wird.
Die gegenwärtig bevorzugten Proteinsequenzen, die als Morphogene von Nutzen sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, solche, die mehr als 60% Identität, vorzugsweise mehr als 65% Identität mit der Aminosäuresequenz aufweisen, die das konservierte 6- Cystein-Skelett von humanem OP-1 (beispielsweise die C-terminale 96 Aminosäuren) definieren. Diese am meisten bevorzugten Sequenzen schließen sowohl Allel- als auch Speziesvarianten ein, beispielsweise natürlich vorkommenden Sequenzvarianten der OP-1 und OP-2-Proteine, einschließlich des Drosophila-60A-Proteins.
Die Expressionseffektormoleküle, die in den Verfahren und Zelllinien der Erfindung von Nutzen sind, sind vorzugsweise viralen Ursprungs und sind dazu in der Lage, die Transkription und Translation zu stimulieren. In einer Ausführungsform werden die Expressionseffektormoleküle viralen Ursprungs in der bovinen Papillomavirus-Early-Region-DNA (s. Maat, J. et al. (1979), Gene 6: 75 und ff. und Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Sambrook et al., Hsg., cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989), Kap. 16, für eine Beschreibung dieser Region des Virus).
In einer weiteren Ausführungsform schließen die Expressionseffektormoleküle viralen Ursprungs trans-wirkende Transkriptionsaktivatoren („Transkriptions-Transaktivatoren") ein, die dazu in der Lage sind, auf den Promotor einzuwirken und diesen zu stimulieren, der die Transkription des Gens von Interesse induziert. Typischerweise sind diese Transaktivatoren viralen Ursprungs und können auf ihre eigenen oder auf andere spezielle virale Promotoren einwirken. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das transaktivierende Protein durch das Adenovirus E1A- oder E1B-Gen kodiert, das Herpesvirus-IE-Gen, C-myc, oder TAT-Gen des humanen Immundefizienzvirus (HIV) kodiert. Wenn beispielsweise das transaktivierende Protein E1A ist, schließen die bevorzugten Promotoren den konstitutiven CMV-MIE-Promotor ein und den Adenovirus-E1A- und Late-Region-Promotor. Wenn der Transaktivator durch das TAT-Gen kodiert ist, ist der bevorzugte Promotor das HIV-LTR. Weitere Transaktivator-Promotorkombinationen sind in der Technik beschrieben und werden hierin ins Auge gefasst. Wie ausführlicher unten beschrieben wird, muss das virale Transkriptionsaktivator-Gen nicht unter der Kontrolle eines Promotors stehen, der seine Expression limitiert, jedoch kann ein solcher Promotor verwendet werden.
Die Expressionseffektormoleküle viralen Ursprungs schließen ebenfalls RNA-Sequenzen ein, die operativ zur Förderung bzw. Steuerung der Translation des Transkriptes verwendet werden, das durch das Gen von Interesse kodiert wird. Diese Sequenzen können mRNA-stabilisierende Sequenzen oder Segmente einschließen, die auf die Translationsmaschinerie selbst einwirken. Beispielsweise sind gegenwärtig am meisten bevorzugte Sequenzen solche, die durch den Adenovirus kodiert sind, insbesondere die Adenovirus-VA-Gene, einschließlich VA1 und VA2. Diese Gene kodieren RNAs, von denen angenommen wird, dass sie zumindest teilweise durch Interaktion mit einem oder mehreren Translationsstartfaktoren wirken. Die bovine Papillomavirus-Early-Region-DNA schließt angenommenerweise eine oder mehrere dieser stabilisierenden Sequenzen ein.
Vorzugsweise umfasst das Transfektionssystem sowohl ein Gen, das eine Transkriptionstransaktivierende Sequenz kodiert als auch ein Gen, das eine RNA-stabilisierende Sequenz kodiert, die die Translation stimuliert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die transfizierten Zellen unter selektivem Druck subkloniert, um eine Amplifikation des Gens von Interesse zu induzieren. Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren schließt die Verwendung eines Gens ein, das einen amplifizierbaren Selektionsmarker kodiert. Ein Beispiel für ein solches Marker-Gen, das erfolgreich im Verfahren der Erfindung verwendet wird, schließt das DHFR-Gen ein und eine Selektion mit Methotrexat. Jedoch sind andere amplifizierbare Gene in der Technik bekannt und werden hierin ins Auge gefasst, einschließlich, ohne Beschränkung, Adenosindeaminase und Glutaminsynthetase. Eine allgemeine Beschreibung der Gen-Amplifikation und nützlicher selektierbarer Marker-Gene wird in einer Anzahl von Texten beschrieben, die in der Technik verfügbar sind, einschließlich R. E. Kellems, Gene Amplification in Mammalian Cells, Marcel Dekker, New York (1993). Wo das amplifizierbare Selektions-Gen nicht dominant wirkt, ist die zu transfizierende Wirtszelle vorzugsweise genotypisch bezüglich des Selektions-Gens defizient.
Wirtszelllinien, von denen im Verfahren der Erfindung erwägt wird, dass sie von Nutzen sind, schließen irgendwelche eukaryontischen Zelllinien ein, die immortalisiert werden können, d. h. die für vielfache Passagen lebensfähig sind (beispielsweise mehr als 50 Generationen), ohne signifikante Reduktion der Wachstumsgeschwindigkeit oder Proteinproduktion. Wenn die zu verwendenden Zellen biologische Materialien produzieren sollen, die zur Verabreichung an Menschen vorgesehen sind, ist die Wirtszelle vorzugsweise nicht eine humane Zelle. Gegenwärtig bevorzugte Zelllinien sind solche, die einfache Medienbestandteils-Anforderungen aufweisen und die an die Suspensionskultivierung angepasst werden können. Am meisten bevorzugt sind Säugetierzelllinien, die an das Wachstum in Serum-armen oder Serum-freiem Medium angepasst werden können. Insbesondere dort, wo das Gen von Interesse ein morpho genetisches Protein kodiert, ist die bevorzugte Wirtszelllinie eine Säugetiergewebszelllinie, beispielsweise eine urogenitale Zelllinie, die eine Nieren- oder Blasenzelllinie, Leber-, Lunge-, Ovar-, Herzmuskel- oder eine andere Zelllinie der glatten Muskulatur, einschließlich einer glatten Muskulaturzelllinie des Gastrointestinaltrakts. Repräsentative Zelllinien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, chinesische Hamster-Ovarzellen (CHO); Hundenieren (MDCK)-Zellen oder Rattenblasen (NBT-2)-Zellen und dergleichen. Nützliche Zelllinien können aus der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD oder von der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salsbury SP40JG, UK gewonnen werden.
In den Fällen, in denen das Gen von Interesse ein Gen mit „geringe Expression" oder „schlecht exprimiert" ist, schließt die gegenwärtig am meisten bevorzugte Methodologie eine Kotransfektion des Gens von Interesse, des trans-aktivierenden Gens und der RNA-stabilisierenden Sequenz und ein Subklonieren von Kandidatenzellen unter Amplifikationsbedingungen, um eine Zelllinie zu erzeugen, die zumindest 1 μg Protein/10⁶ Zellen/ml, besonders bevorzugt zumindest 5 μg Protein/10⁶ Zellen/ml oder zumindest 10 μg/10⁶ Zellen/ml in einer „Batch" oder „terminalen" Zellkultur ein, wobei das Protein aus dem Kulturmedium geerntet wird, wenn sich die Zellen in der post-logarithmischen Phase befinden.
Ein bedeutendes Merkmal der Erfindung besteht darin, dass das Verfahren zur Herstellung einer transfizierten Wirtszelllinie eine niedere Kopienanzahl des Gens von Interesse bereitstellt, während hohe Konzentrationen des Proteinproduktes erzeugt werden. Dieses Merkmal stattet die Erfindung mit einer regulatorischen Anwendbarkeit aus, indem die Bürde der Compliance mit den Bundesvorschriften der Good Manufacturing Practice erleichtert wird. Beispielsweise erlaubt die niedrige Kopienanzahl in der transfizierten Zelllinie, die hierin ausführbar dargestellt und offenbart wurde, die Erleichterung der Dokumentation und Standardisierung der Produktionsmethodologien gemäß U. S. Food and Drug Administration Regeln und Richtlinien.
Bezüglich des Transfektionsprozesses, der in der Ausübung der Erfindung verwendet wird, werden alle Mittel zur Einbringung von Nukleinsäuren in einer Zelle in Erwägung gezogen, einschließlich, ohne Beschränkung, CaPO₄-Co-Präzipitation, Elektroporation, DEAE-Dextran-vermittelte Aufnahme, Protoplastenfusion, Mikroinjektion und Lipofusion. Ein Schlüssel zur Erfindung ist die Vervollständigung von Vektoren, mit denen die Zelle transfi ziert wird, eher als der mechanische oder der chemische Prozess, durch den der DNA-Einbau erreicht wird.
Darüber hinaus fasst die Erfindung entweder eine simultane und sequentielle Transfektion der Wirtszelle mit Vektoren ins Auge, die in das Genom zur integrierenden DNA-Sequenzen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Wirtszellen gleichzeitig mit zumindest zwei unverbundenen Vektoren transfiziert, von denen einer das Gen von Interesse enthält (ebenfalls als „Reportergen" bezeichnet) und das andere ein Gen enthält, das einen Transkriptionstransaktivator kodiert. Jene, die ein amplifizierbares Selektionsgen kodieren und eine die Translation stimulierende Sequenz werden ebenfalls kotransfiziert, entweder durch Einbau dieser Sequenzen an einem der beiden der ungebundenen Vektoren oder durch simultane Transfektion mit einem dritten Vektor, gefolgt von einer frühen Transfektionsselektion auf Grundlage des Zellwachstums und der gesteigerten Proteinproduktion. Eine simultane Transfektion ermöglicht die zufallsbedingte Zuordnung der Gene, die in die Wirtszellen eingebaut werden sollen, und ermöglicht, dass die Zellen, die Kopien und die Expressionsstärke der Transfektor-Sequenz unabhängig regulieren. Somit wird die letztendlich optimale Kombination empirisch für jede Zelle, essentiell von jeder Zelle, dadurch bestimmt, dass nach Zellen mit hoher Proteinproduktion selektiert wird, die ebenfalls gesunde, stabile Transfektanten sind. Die exakte Kopienanzahl der Genelemente und/oder Expressionskontrollelemente für die Expression jedes Genes kann zwischen den ausgewählten Klonen variieren, jedoch sind alle durch die Erzeugung zumindest von 1 μg Protein pro ml pro 10⁶ Zellen in der postlogarithmischen Phase in einer terminalen Zellkultur gekennzeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen ebenfalls dadurch charakterisiert, dass sie eine niedrige Kopienanzahl des Gens von Interesse aufweisen, das zumindest teilweise auf die Gegenwart des Transkriptionstransaktivators zurückzuführen sein mag.
Während a priori kein Grund besteht, warum nicht alle Elemente auf einem einzigen Vektor transfiziert werden können, beschränkt, wie der Fachmann auf dem Gebiet zu würdigen weiß, ein einzelner Vektor die möglichen Konstellationen der Elemente auf dem Vektor und deswegen in der Zelle, eher als er deren zufällige Auswahl in den Zellen ermöglicht. Wo alle Elemente, beispielsweise das Gen von Interesse, der amplifizierbare Marker und die Expressionseffektorsequenzen auf einem einzigen Vektor transfiziert werden, befindet sich das transaktivierende Transkriptionseffektorgen vorzugsweise unter der Kontrolle eines abgeschwächten Promotors, um die Expression dieser Gensequenz zu beschränken. Alternativ können die DNA-Sequenzen sequentiell transfiziert werden. Beispielsweise kann der Vektor, der den Transkriptionsaktivator enthält, beispielsweise E1A, zuerst transfiziert werden und es seiner DNA ermöglicht werden, sich stabil in das Wirtszellgenom vor einer anschließenden Transfektion mit der verbleibenden Sequenzen) zu integrieren. Ebenfalls in der Erfindung betrachtet wird die Verwendung von Expressionseffektorgenen unter schwachen oder starken Promotor/Enhancer-Einheiten.
Ein Schlüssel zur Realisierung des Vorteils der erhöhten Produktion schlecht exprimierter Gene der vorliegenden Erfindung ist die Kultivierung der oben beschriebenen transfizierten Zelllinien in Serum-armem oder Serum-freiem Medium. Das gegenwärtig bevorzugte Serum-freie Medium ist ein Lipid-modifiziertes Medium, wobei die Modifikation ein Lipidmembran-Phosphoglyceridester-Abbauprodukt umfasst. Andere Medien, einschließlich anderer Serum-freier Medien, wurden in der Technik beschrieben.
Somit kann in Hinblick auf diese Offenbarung der Fachmann auf dem Gebiet der Gentechnik Transfektanten konstruieren, die die Produktionsprobleme überwinden, die mit bestimmten Genen mit geringer Expression verbunden sind. Insbesondere können solche, die Fachkenntnisse auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik aufweisen, geeignete DNA-Vektoren entwickeln, die für das Protein von Interesse kodieren, ein amplifizierbares Markergen, Transkriptionstransaktivatoren und Translationssimulatoren und darauf die Verfahren zur Herstellung von Transfektanten, die hierin offenbart sind, dazu verwenden, große Mengen an Proteinen zu gewinnen. Derartige Proteine können in ihren nativen Formen oder in trunkierten Analoga vorliegen, ebenso wie als Muteine, Fusionsproteine oder andere Konstrukte, die dazu in der Lage sind, die biologische Aktivität des Proteins von Interesse in vivo nachzuahmen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das Vorhergehende und weitere Aufgaben und Merkmkale der Erfindung, ebenso wie die Erfindung selbst, werden aus der nachfolgenden Beschreibung vollständiger verständlich, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen werden, bei denen:
1(A u. B) eine schematische Darstellung eines Selektionsprotokolls der Erfindung ist, wobei 1A eine Zeitlinie darstellt, die der in 1B dargestellten Vorschrift entspricht;
2(A–C) Restriktionskarten dreier beispielhafter Vektoren zum Transfizieren von Zellen mit den Adenovirus E1A oder VA1-Genen sind;
3(A–C) Restriktionskarten beispielhafter Vektoren sind, die OP-1 als Reportergen unter der Kontrolle eines CMV-MIE-konstitutiven „kurzen" Promotors tragen;
4 eine Restriktionskarte eines beispielhaften Vektors ist, der die Papillomavirus-Early-Region-DNA trägt;
5 eine Restriktionskarte eines beispielhaften Vektors ist, der eine Nukleotidsequenz trägt, die eine einkettige Bindungsstelle als Reportergen unter Kontrolle des konstitutiven CMV-MIE „Kurz"-Promotors kodiert;
Ausführliche Beschreibung
Eine Methodologie und eine Zelllinie, die für die Produktion von rekombinanten Säugetiergen-Expressionsprodukten von Nutzen ist, wurde entdeckt. Das Verfahren weist insbesondere bei der Bereitstellung nützlicher Mengen eines Proteins Nutzen auf, das durch „schwer zu exprimierende" Gene kodiert wird. Das Verfahren der Erfindung kann stabile, immortalisierte Säugetierzelllinien produzieren, die konstitutiv ein Gen von Interesse exprimieren, um ein Protein in einer Konzentration von zumindest 1 μg/10⁶ Zellen/ml zu erzeugen, ohne auf einer hohen Kopienzahl des Gens von Interesse zu beruhen. Überdies erfordert das Verfahren der Erfindung wesentlich kürzere Zeiten zur Erzeugung hoch exprimierender, vollständig amplifizierter Zellen.
Ein allgemeines Selektionsprotokoll, das im Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist in 1 dargestellt. Wie in Schritt I der Vorschrift ersichtlich ist, wird eine immortalisierte eukaryontische Wirtszelle, typischerweise eine Säugetierzelle, mit Nukleinsäuren transfiziert, die 3 DNA-Sequenzen tragen. Die erste DNA-Sequenz trägt das Reportergen (Gen von Inte resse), das operativ mit einer Transkriptionspromotor/Enhancer-Einheit viralen Ursprungs assoziiert ist. Die zweite DNA trägt ein virales Gen, das ein transaktivierendes Protein trägt, das dazu geeignet ist, auf die Transkription aus der viralen Promotoreinheit einzuwirken und diese zu stimulieren, die die Transkription des Reportergenes induziert. Die dritte DNA trägt ein virales Gen, das eine RNA-stabilisierende Sequenz kodiert, die dazu dient, die Translation des Reportergen-Transkriptes zu fördern. In 1 werden diese DNA-Sequenzen auf getrennten Vektoren getragen und die Vektoren werden simultan bzw. gleichzeitig transfiziert. Wie es jedoch vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet erkannt wird, können die DNA-Sequenzen auch sequentiell transfiziert werden. Beispielsweise kann die Zelle zunächst mit einer oder mehreren Nukleinsäuren transfiziert werden, die die Translationspromotorsequenz und/oder die Transkriptionstransaktivatorsequenzen tragen, und es können stabile Integranten erzielt werden und die Zelle kann anschließend mit dem Reportergen transfiziert werden. Zusätzlich können zwei oder drei DNA-Sequenzen auf einer einzigen Nukleinsäure getragen werden. Wenn zwei der drei Sequenzen auf einem einzigen Vektor getragen werden, schließen Kombinationen, die besonders nützlich sind, die viralen Effektorsequenzen oder das Reportergen und die Translationseffektorsequenz ein. Wenn alle drei Sequenzen auf einem einzigen Vektor getragen werden, können Mittel zum Modulieren der Expression des Transkriptionstransaktivators notwendigerweise bereitgestellt werden. Es wird beispielsweise angenommen, dass das Adenovirus E1A-Gen im Allgemeinen das Zellwachstum bei hoher Expressionsstärke stört. Wenn das E1A-Gen auf einer getrennten Nukleinsäure transfiziert wird, als derjenigen der Reportergene, können beispielsweise die Sequenzen in einer gegebenen Zelle zufällig ausgewählt werden, wodurch die Möglichkeit des Selektierens nach einem Klon erhöht wird, der optimale Proteinkonzentrationen beider Gene produziert. Weil der Bereich von Ausfallereignissen reduziert wird, wo die Gene auf einer einzigen Nukleinsäure auftreten, können Mittel zum Modulieren, beispielsweise dem Beschränken der E1A-Genexpression mittels eines abgeschwächten Promotors erforderlich sein.
In Schritt II von 1 werden die transfizierten Zellen erneut beispielsweise in individuellen Wells und in selektiven Medien ausplattiert, bis zur Konfluenz gezüchtet und die Konzentration des erzeugten Reporterproteins (das Protein von Interesse) aus Teilmengen von Kulturmedium bestimmt, die aus jedem Well entnommen wurden, typischerweise durch ELISA oder Western Blot (Schritt III). Kandidatenzellen werden dann durch multiple Passagen in limitierten Verdünnungsreihen in Gegenwart zunehmender Konzentrationen an Amplifikationsmedium kloniert/amplifiziert, bis hoch exprimierende, vollständig amplifizierte Zelle gewon nen werden (Schritt IV von 1). Ohne an eine spezielle Theorie gebunden sein zu wollen, scheint die Transfektion mit dem viralen Transkriptionstransaktivierungsgen den Grad der in einer Zelle ermöglichten Amplifikation zu beschränken, so dass Klone mit maximaler Amplifikation in einer größeren Geschwindigkeit erreicht werden können und, in Gegenwart geringerer Konzentrationen an toxischem Mittel als in Zellen, die in Abwesenheit der viralen Effektorgene amplifiziert werden. Darüber hinaus dient die Gegenwart der Transkriptions- und Translationseffektorgene synergistisch dazu, die Expression aus jeder Genkopie zu erhöhen. Im Verfahren der Erfindung tritt Schritt IV in kleineren Schritten als in Zellen auf, die in Abwesenheit der viralen Effektorgene amplifiziert werden (die typischerweise nur ungefähr ein Monat gegen sechs Monate erfordern). Wenn einmal Klone erhalten werden, die die erwünschte Proteinproduktions-Konzentration zeigen (Schritt V), können klonierte Zellen in einem Produktionsprotokoll mit großem Maßstab (Schritt VI) kultiviert werden, um große (zumindest zwei Liter) Mengen des erwünschten Proteins zu erzeugen, das dann aus dem Kulturmedium unter Verwendung einer erwünschten Standardmethodologie (Schritt VII) aufgereinigt werden kann.
Unter Befolgung des hierin beschriebenen Verfahrens können stabile, stark bzw. hoch produzierende Klone erzielt werden. Die Kombination viraler Effektorgene weist eine synergistische Wirkung auf die Proteinproduktion auf und erhöht die Konzentrationen über solche hinaus, die in Gegenwart von nur einem der beiden Effektorgene oder durch Genamplifikation alleine nach schlecht exprimierten Zellen erreichbar sind. Darüber hinaus können das Verfahren und die Zelllinie der Erfindung, die die Schritte der Kotransfektion mit viralen Effektoren und den Schritt der Amplifikation des Reportergens kombinieren, unerwarteterweise die Konzentration an Protein, das über die Konzentration hinaus erzeugt wird, die unter Verwendung eines Schrittes alleine gewonnen wird, erhöhen, wenn das Reportergen ein schlecht exprimiertes Gen ist, das dazu in der Lage ist, ein Protein bei weniger als 100 bis 1000 ng/10⁶Zellen/ml in einer hoch amplifizierten Zelllinie zu produzieren.
Unten bereitgestellt sind ausführliche Beschreibungen der verschiedenen Elemente, die die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen, ebenso wie Verfahren zu ihrer Anwendung und zahlreich nicht einschränkende Beispiele, die 1) nützliche, beispielhafte Vektorkonstrukte, Transfektionsvorschriften, nützliche Zelllinienquellen und die Kultivierung, Selektion und Subklonierungsvorschriften darstellen; die 2) Assays zum Testen von Kandidatszelllinien bezüglich ihrer Proteinproduktivität und Zellwachstumsfähigkeiten be reitstellen; und die 3) Verfahren zur Kultivierung von Zellen in Serum-armen oder Serum-freien Medien bereitstellen. Ebenfalls bereitgestellt werden Beispiele, die die Verfahren der Erfindung mit zwei Genen demonstrieren, von denen bekannt ist, dass sie schwach exprimierende Gene sind: ein morphogenetisches bzw. morphogenes Protein, das für die Klasse der Gewebsmorphogene, wie sie hierin definiert sind (OP-1) repräsentativ ist und ein Gen, das eine einkettige Bindungsstelle (eine nicht-native DNA-Sequenz) kodiert.
I. Nützliche Zellen
Irgendeine immortalisierte eukaryontische Zelllinie, die für Langzeitkultivierungsbedingungen geeignet ist, wird im Verfahren und den Zusammensetzungen der Erfindung als nützlich betrachtet. Nützliche Zelllinien sollten einfachste Transfizierer sein, sollten dazu in der Lage sein, stabil Fremd-DNA in einer nicht-umgeordneten Sequenz aufrechtzuerhalten und sollten die notwendigen zellulären Bestandteile zur effizienten Transkription, Translation, Post-Translationsmodifikation und Sekretion der Proteine aufweisen. Wo die Zelle mit einem nicht-dominierenden Selektionsgen zu transfizieren ist, ist der Zellgenotyp vorzugsweise bezüglich des endogenen Selektionsgenes defizient. Vorzugsweise weist die Zelllinie ebenfalls einfache Anforderungen an die Medien-Zusammensetzung, rasche Generationszeiten auf und kann dazu angepasst werden, in einer Suspensionskultur zu wachsen. Besonders nützliche Zelllinien sind Säugetierzelllinien, einschließlich Myeloma, HeLa, Fibroblasten-, embryonale und verschiedene Gewebszelllinien, beispielsweise Nieren, Leber, Lunge und dergleichen. Eine große Anzahl von Zelllinien ist nunmehr durch die American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md) oder durch die European Collection of Animal Cell Cultures (E-CACC) (Porton Down, Salsbury, SP40JG, U. K.) erhältlich.
Wenn das Reportergen ein morphogenetisches Protein kodiert, wie hierin definiert, sind besonders nützliche Zelllinien Säugetierzelllinien, einschließlich ohne Beschränkung urogenitaler Zelllinien, einschließlich Nieren- und Blasenzellen, Lungen-, Leber-, Herzmuskel- oder andere glatte Muskulatur-Zelllinien oder andere Zelllinen, von denen bekannt ist, dass sie endogene Gene exprimieren, die morphogentische Proteine kodieren.
II. Nützliche Promotoreinheiten für Reportergene
Das Reportergen sollte operativ mit einer Promotoreinheit assoziiert sein, die dazu in der Lage ist, durch einen viralen transaktivierenden Transkriptionsaktivator, wie er hierin beschrieben ist, stimuliert zu werden. Nützliche Promotoren schließen den humanen Zytomegalievirus Major Intermediate Early Promotor (hCMV-MIE) oder den Adenovirus Early Promotor (E1A, E1B Promotor) oder den Adenovirus Late Region Promotor ein. Vorzugsweise ist der CMV-MIE-Promotor eine Intron-freie Form des Promotors, die als solches als der CMV-MIE-„Kurz"-Promotor bezeichnet wird. CMV-Promotorsequenzen oder Plasmide, die diese enthalten, können kommerziell erworben werden, beispielsweise von Invitrogen, Inc., San Diego (pCDM8) und von Clontech, Inc., Palo Alto. Vorzugsweise wird die Transkription weiter durch Einschluss einer cis-wirkenden Enhancer-Sequenz stimuliert, beispielsweise den Mausbrusttumorvirus Long Terminal Repeat (MMTV-LTR) oder den Rous Sarcoma Virus Long Terminal Repeat (RSV-LTR). Enhancer-Sequenzen oder Plasmide, die diese enthalten, sind ebenfalls kommerziell erhältlich (beispielsweise von Invitrogen Inc., San Diego oder Clontech Inc., Palo Alto) und/oder sind ebenfalls durch die ATCC und ECACC erhältlich.
III. Nützliche virale Expressionseffektorgene
Die viralen Expressionseffektorgene, die in den Verfahren und Zelllinien der Erfindung von Nutzen sind, dienen dazu, auf den Promotor einzuwirken, der die Transkription des Reportergenes induziert und/oder auf das Transkript des Reportergenes oder die Translationsmaschinerie einzuwirken.
Zumindest eines der Expressionseffektorgene ist ein viraler trans-wirkender Transkriptions-Aktivator. Nützliche Sequenzen schließen solche ein, die durch die Adenovirus-2-E1A- und -E1B-Gene kodiert sind, ebenso wie durch die bovine Papillomavirus Early Region DNA. Details über diese Sequenzen und Vektoren, die diese Sequenzen tragen, sind in Maat, J. et al. (1979), Gene 6: 75, und in EP 0 378 382 und Cockett (1990), Nucleic Acids Research 19: 319–325 zu finden. Wohingegen bovines Papilloma-DNA-Virus kommerziell erhältlich ist, beispielsweise von IBI-New Haven (Katalog Nr. 33040).
Die Autoren von EP 0 378 382 stellen fest, dass geeignete Konzentrationen des Transkriptionsaktivators durch Auswahl einer geeigneten Promotor/Enhancer-Einheit für dessen Transkription erreicht werden können (beispielsweise wird ein schwacher Promotor bevorzugt und eine stabile Transkriptionsaktivator-exprimierende Zelle wird vor der Transfektion mit dem Reportergen erzeugt). Alternativ und wie gegenwärtig hierin bevorzugt, wird das Aktivatorgen zusammen mit dem Reportergen kotransfiziert und die transfizierten Zellen individuell ausgewertet, um die geeigneten, kombinierten Konzentration aller rekombinanten exprimierten Gene zu bestimmen, einschließlich der optimalen Konzentration des Aktivatorgen-Produktes für diese Zelle, wenn es in der Zelle in Kombination mit dem Reportergen und dem Genprodukt vorliegt.
Der zweite virale Effektor ist vorzugsweise ein Translationsaktivator, vorzugsweise eine RNA-Sequenz, die dazu in der Lage ist, die Translation des Reportergenes zu steigern. Bevorzugt wird die RNA-Sequenz durch ein Adenovirus-VA-Gen, vorzugsweise zumindest VA1, kodiert. Weitere nützliche Sequenzen schließen einen Teil der bovinen Papillomavirus Early Region DNA ein. Details dieser Sequenzen sind ebenfalls in Maat, J. et al. (1979), Gene 6: 75, EPO 3 378 382 und Cockett et al. (1990), Nucleic Acid Research 19: 219–325; in Scheinder et al. (1984), Cell 37: 291 und ff. und in Thimmappaya et al. (1982), Cell 31: 543–551 zu finden. Wie die Transkriptionsaktivatorsequenz kann die Translationsaktivatorsequenz unter der Kontrolle ihrer eigenen Promotor/Enhancer-Einheit transfiziert werden oder unter einer stärkeren oder schwächeren Promotoreinheit. Die Auswahl der Promotor/Enhancer-Einheit ist weniger entscheidend, weil Klone mit hoher Expression, die die optimale Kombination an Aktivator- und Reportergensequenzen aufweisen, empirisch durch Screenen und Selektionsvorschriften in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bestimmt werden.
Durch Screenen nach gutem Zellwachstum und Selektieren für eine hohe Reportergenexpression werden optimale Konzentrationen aller Elemente zur maximalen Expression eines vorgegebenen Reportergenes einfacher als durch artifizielle Vorherbestimmung der Konzentration irgendeines Elementes, das in der Zelle vorliegen sollte, erreicht.
IV. Vektorkonstruktionserwägungen
Das optimale Vektordesign zur Transfektion in eukaryontische Zellen sollte geeignete Sequenzen zur Förderung der Expression des Gens von Interesse wie oben beschrieben einschließen, einschließlich von geeigneten Transkriptionsstart-, Terminations- und Enhancer-Sequenzen ebenso wie Sequenzen, die die Translationsleistungsfähigkeit steigern, wie beispielsweise Kozak-Konsensus-Sequenzen. Bevorzugte DNA-Vektoren schließen ebenfalls ein Markergen ein als Mittel zum Selektieren auf das Vorhandensein der Vektor-DNA in einer Zelle. Das Markergen kann ebenfalls Mittel zum Amplifizieren der Kopienanzahl des Gens von Interesse bereitstellen und kann ebenfalls ein zweites Gen zur Resistenz gegenüber Zytotoxinen einschließen.
Ein beträchtlicher Fortschritt in der Entwicklung von Säugetierzellexpressionssystemen wurde in den letzten 10 Jahren vollbracht und viele Aspekte der Systemmerkmale sind gut charakterisiert. Ein ausführlicher Überblick über den Stand der Technik der Produktion von Fremdproteinen in Säugetierzellen, einschließlich nützlicher Zelllinien, Proteinexpressionfördernder Sequenzen, Markergene und Genamplifikationsmethoden ist in Bendig, Mary M. (1988), Genetic Engineering 7: 91–127, offenbart.
V. Transfektionserwägungen
Irgendein Verfahren zum Einbau von Nukleinsäuren in Zellen von Interesse wird im Verfahren der Erfindung in Erwägung gezogen. Kalziumphosphat (CaPO₄), gefolgt von Glycerol-Schock ist ein Standardmittel, das in der Technik zur Einbringung von Vektoren verwendet wird, insbesondere von Plasmid-DNA in Säugetierzellen. Ein repräsentatives Verfahren ist in Cockett et al. (1990), Biotechnology 8: 662–667, offenbart. Weitere Verfahren, die verwendet werden können, schließen Elektroporation, Protoplastenfusion, insbesondere nützlich bei Myeloma-Transfektionen, Miroinjektionen, Lipofektionen und DEAE-Dextran-vermittelte Aufnahme, ein. Verfahren für diese Prozeduren sind in F. M. Ausubel, Hsg., Current Protocols in Molecular, John Wiley & Sons, New York (1989), beschrieben.
Im Allgemeinen werden Plasmide in äquimolaren Konzentrationen transfiziert und die Zellen werden in einer Dichte von ungefähr 1 bis 2 × 10⁶ Zellen/Schale ausplattiert. Wie vom Fachmann auf dem Gebiet erkannt werden wird, variieren optimale DNA-Konzentrationen pro Transfektion abhängig von der Transfektionsvorschrift. Für eine Kalziumphosphat-Transfektion beispielsweise wird vorzugsweise 5–10 μg Plasmid-DNA pro Plasmid-Typ transfiziert. So werden, wenn eine simultane Dreifachtransfektion ins Auge gefasst wird, 15–30 μg insgesamt transfiziert. Zusätzlich ist die zu transfizierende DNA vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kontaminanten, die den DNA-Einbau stören können. Ein in der Technik zur Aufreinigung von DNA verwendetes Standardmittel ist die Ethidiumbromid-Bandenbildung.
VI. Amplifikationserwägungen
Eines der besser charakterisierten Verfahren der Genamplifikation in Säugetierzellsystemen ist die Verwendung des selektierbaren DHFR-Genes in einer DHFR-Zelllinie. Im Allgemeinen wird das DHFR-Gen auf dem Vektor bereitgestellt, der das Gen von Interesse trägt und der Zusatz zunehmender Konzentrationen des zytotoxischen Arzneistoffs Methotrexat führt zur Amplifikation der DHFR-Genkopienzahl, ebenso wie derjenigen des assoziierten Gens von Interesse. DHFR als selektierbares, amplifizierbares Markergen in transfizierten Hamster-Ovarzelllinien (CHO-Zellen) ist in der Technik ebenfalls gut charakterisiert. Die vorliegende Erfindung kann unter Verwendung dieses speziellen Amplifikationsmarkers ausgeübt werden. Weitere nützliche amplifizierbare Markergene schließen die Adenosindeaminase (ADA)- und Glutaminsynthetase(GS)-Gene ein. (Siehe R. E. Kellems, Gene Amplification in Mammalian Cells, Marcel Decker (1992).
VII. Beispielhafte Kulturproduktionsvorschriften in großem Maßstab
Irgendwelche Mittel, die in der Technik verfügbar sind oder von denen bekannt ist, dass sie zum Kultivieren eukaryontischer Zellen in großem Maßstab verwendbar sind (beispielsweise zumindest 2 Liter) werden zum Kultivieren der von dieser Erfindung gelehrten Zelllinien als nützlich erachtet. Zwei allgemeine Kultivierungsmethodologien, die in der Technik praktiziert werden sind „kontinuierliche Strömungs"-Systeme, wobei die Zellen frischem Medium in regulären Zeitspannen ausgesetzt werden, um verbrauchte Nährmittel aufzufrischen und das „terminale" oder Batch-Kultursystem, bei dem die Zellen bis zur Konfluenz unter einem defininierten Satz von Kulturparametern gezüchtet werden, und das Produktionsmedium, das geerntet wird, wenn Zellen die post-logarithmische Phase erreicht haben. Zusätzlich können Zellen als Suspensionskultur oder als angelagerte Monolayers von Zellen gezüchtet werden.
Der Typ von Kultursystemen, der verwendet wird, und die Medienwiederauffrischungsvorschriften, die ausgewählt werden, werden von den Anforderungen der Wirtszelllinie bestimmt. Beispielsweise sind einige Säugetierzelllinien nicht an Suspensionskulturen anpassbar, während andere nicht dazu in der Lage sind, an einem Substrat sicher befestigt zu bleiben. Zusätzlich sind einige Zelllinien gegenüber Scherkräften sehr stark verwundbar, die mit der Suspension und/oder Bioreaktorkulturbedingungen assoziiert sind. Im Falle dieser Zelllinien kann der Zusatz von Mitteln wie beispielsweise Anti-Schaum- und/oder Scherminimie rungsmitteln die Verwendung von Suspensionskulturen ermöglichen. Ein anderer Faktor, der bei der Auswahl eines Kultursystems entscheidend ist, sind die Gaserfordernisse der Wirtszelllinie, wobei Gastransfer und Gaszusammensetzung zwei bedeutende Erwägungen für das optimale Zellwachstum in vitro sind. Zahlreiche Referenzen bzw. Literaturstellen sind verfügbar, die Mittel zur Erzeugung von Kulturbedingungen in großem Maßstab und allgemeine Erwägungen beschreiben. Beispielhafte Referenzen schließen R. J. Freshney, Animal Cell Culture: A Practical Approach, 2. Ausgabe, Oxford University Press, New York, 1992, und M. Butler, Mammalian Cell, Cell Culture: A Practical Approach, 2. Ausgabe, Oxford University Press, New York, 1992 und M. Butler, Mammalian Cell, Biotechnology: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, 1991 ein.
VIII. Erwägungen bezüglich des Mediums
Transfektanten, die mit der oben beschriebenen bevorzugten Vorschrift gewonnen wurden, werden initial in Medien konditioniert, die Serumproteine enthalten. Vorzugsweise werden die Zellen unter Produktionsbedingungen an das Wachstum in Serum-armen oder Serumfreien Bedingungen angepasst, um die Störung bei der Proteinaufreinigung zu beschränken. Nützliche Medien schließen Medien ein, die 0,1% bis 0,5% dialysiertes fetales Kalbsserum enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Serum-arme oder Serum-freie Medium mit einem oder mehreren Lipidmembranphosphoglyceridester-Abbauprodukten ergänzt. Weitere Medienbestandteile, die in den Produktionsvorschriften von Nutzen sind, schließen Proteaseinhibitoren ein. Eine repräsentative Referenz, die Wachstumsträgermedienerwägungen für Säugetierzellkulturen ausführlich beschreibt, schließt das ATCC Media Handbook, Cote et al., Hsg. American Type Culture Collection, Rockville, MD (1984) ein.
Wie oben angezeigt und wie von dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet erkannt wird, sind spezielle Details herkömmlicher Mittel zur Transfektion, Expression und Aufreinigung rekombinanter Proteine in der Technik wohl dokumentiert und werden von solchen mit Durchschnittsfähigkeiten auf dem Gebiet wohl dokumentiert. Die vorliegende Erfindung ermöglicht und offenbart Verbesserungen gegenüber diesen konventionellen Mitteln, die eine Kombination von Transfektionsvektoren umfassen, die eine bemerkenswert erhöhte rekombinante Expression von schlecht exprimierenden Genen erreicht, einschließlich von Genen, die morphogenetische Proteine kodieren, unter Verwendung von immortalisierten, eukaryontischen Zellen.
Weitere Details bezüglich der verschiedenen technischen Aspekte von jedem der in der rekombinanten Produktion von Fremdgenen in Säugetierzell-Expressionssystemen verwendeten Schritte sind in mehreren Texten und Laborhandbüchern in der Technik zu finden, beispielsweise S. M. Ausubel et al., Hsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989).
Beispiel 1: Konstruktion von repräsentativen Expressionseffektor-Vektoren
Der pH1176-Vektor (2A) verwendet das Adenovirus E1A-Gen (Seq. ID Nr. 1) unter der Kontrolle des Thymidinkinase-Promotors als trans-aktivierenden Transkriptionsaktivator. Die E1A-kodierende Region wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Adenovirus-DNA als Matrize isoliert und durch Primen der Reaktion mit synthetischen Oligonukleotid-Primern gegen die terminalen Gensequenzen an den oberen und unteren Strängen (Seq. ID Nr. 2 und 3) mit einem im Handel erhältlichen Thermal Cycler und Reagenzkit (beispielsweise GeneAmp, Perkins Elmer Corp., Norwalk) und folgend den Instruktionen des Herstellers in einem Standardprotokoll (s. beispielsweise Saiki et al. (1985), Science 230: 1350–1354). Das Fragment wurde in einen kommerziell verfügbaren Standard-pUC-Klonierungsvektor kloniert, beispielsweise SK-Bluescript, Stratagene, Inc., Palo Alto. Der Herpes-simplex-Virus Thymidinkinase-Promotor wurde als 5' SalI zu 3' HindII-Fragment aus einem anderen Plasmid (pTK-HGH, Allegro Systems, San Juan Capistrano) isoliert und an eine StuI-Stelle stromaufwärts der E1A-kodierenden Region fusioniert. Das Fragment, das den TK-Promotor und E1A trug, wurde in ein pUC-Plasmid kloniert, was Plasmid pH1176 (2A) ergab. Seq. ID Nr. 1 beschreibt die Nukleotidsequenz des PstI-ECORI-Fragmentes von pH1176. Die Aufrechterhaltung einer niedrigen Kopienanzahl in transfizierten Zellen unter selektivem Druck kann verifiziert werden, um den Einbau und die Aufrechterhaltung des E1A-Gens, beispielsweise durch Southern Blot oder Gel-Assay sicherzustellen, wobei die Konzentration an nachgewiesener Target-DNA mit einer bekannten Menge verglichen wird.
Die pH989 (2B) und pH1130 (2C) Vektoren verwenden das Adenovirus VA1-Gen (Seq. ID Nr. 4) als Translationsstimulator (beispielsweise eine RNA-Sequenz, die kompetent ist, um die Translation des Transkriptes, das durch das Gen von Interesse kodiert wird, zu fördern. Das Klonieren des Adenovirus VA1/VA2-Genkomplexes wurde wie folgt erreicht: der VA1- und VA2-Komplex wurde aus Adenovirus-DNA durch PCR unter Verwendung zweier synthetischer Oligonukleotide gegen terminale Gensequenzen isoliert (obere und untere Stränge) (Seq. ID Nr. 5 und 6) und unter Verwendung von Standardbedingungen für die PCR. Die Primer fügten eine neue stromaufwärts PstI-Stelle und eine stromabwärts PvuII-Stelle hinzu. Das PstI- zu PvuII-Fragment wurde in die PstI- und EcoRV-Stellen des SK (–) Bluescript-Klonierungsvektors (Stratagene, Inc., Palo Alto, CA) kloniert, was das Plasmid pJ13 zur Folge hatte. Plasmid pJ13 wurde darauf in die finalen Vektoren pH989 und pH1130 wie folgt eingebaut.
Im Falle von pH989 wurde das Neo-Expressionselement aus dem pMamneo-Expressionsvektor (Clontech, Inc.) in die BamHI-Stelle eines pUC-Standardklonierungsvektors subkloniert, was das Plasmid pH989 zur Folge hatte. Die Plasmidorientierung (bezüglich des BamHI-Inserts), in dem das Neo-Gen mit dem Lac-Promotor von pUC ko-linear war, wurde für den nächsten Schritt ausgewählt, dem Zusatz des VA1-Gens. Die VA1-DNA wurde aus pJ13 an flankierenden Polylinker-Stellen ausgeschnitten, SpeI und ClaI, und das Fragment wurde zwischen den XbaI- und ClaI-Stellen des Plasmids pH988 eingefügt, was pH989 zur Folge hatte.
Im Falle von pH1130 wurde ein modifiziertes dhfr-Gen, das eine minimale stromaufwärts gelegene untranslatierte Region enthielt, durch ortsgerichtete Mutagenese konstruiert und eine 5'PvuII-Stelle wurde nur einige Nukleotide stromaufwärts des ATG-Startcodons eingeführt. An dem 3'-Ende wurde ein SalI-Ort neben der natürlichen BgIII-Stelle eingefügt. Seq. ID Nr. 4 beschreibt die Nukleotidsequenz des Pst12-EcoRI-Fragmentes des pH1130-Vektors und schließt sowohl die die VA-Gensequenz (beispielsweise Nukleotid 1 bis 1330) als auch die DHFR-Gensequenz ein.
Das maßgeschneiderte dhfr-Gen wurde in Plasmid pH989 anstelle des Neo-Gens eingefügt. Zu diesem Zwecke wurde pH989 an der einmal vorkommenden StuI-Stelle geöffnet, die sich zwischen dem SV40-Promotor und dem Neo-Gen befindet und an eine einmal vorkommende SalI-Stelle stromabwärts oder 3' des Neo-Gens und dhfr, als PvuII an SalI-Fragment wurde eingefügt. Das Ende der PuvII- und StuI-Stellen sind zur Ligation geeignet und beide Stellen werden in dem Verfahren verlorengehen. Das sich ergebende Plasmid, pH1130, enthält VA1 und dhfr.
Beispiel 2: Morphogen-DNA-Vektoren
3(A–D) offenbart Restriktionskarten verschiedener beispielhafter Expressionsvektoren, die zur OP1-Expression in Säugetierzellen entwickelt wurden. Jeder dieser Vektor-Konstrukte verwendet hOP1-cDNA-Sequenz in voller Länge, die ursprünglich aus einer humanen cDNA-Bibliothek (humanes OP1, s. Ozkaynak et al. (1990), EMBO, hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit aufgenommen) und die anschließend in einem herkömmlichen pUC-Vektor (pUC-18) unter Verwendung einer pUC-Polylinker-Sequenz an den Insertionsstellen kloniert wurde. Das hOP1-cDNA-Fragment, das in jedes dieser Konstrukte kloniert wurde, ist entweder das intakte SmaI-BamHI-hOP1-cDNA-Fragment (Nukleotide 26–1385 von Seq. ID Nr. 1, wie in US 5 863 758 , Ozkaynak (1990), EMBO J. 9: 2085–2093 offenbart) oder Modifikationen dieses Fragments, wobei die flankierenden nicht-kodierenden 5'- und/oder 3'-Sequenzen zurückgeschnitten wurden, unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden. Jeder Vektor verwendet ebenfalls einen SV40-Replikationsursprung (ori). Zusätzlich wird der frühe SV40-Promotor zum Antrieb der Transkription von Markergenen auf dem Vektor (beispielsweise Neo und DHFR) verwendet. Es wird vom Fachmann auf dem Gebiet gewürdigt werden, dass DNA-Sequenzen, die trunkierte Formen morphogenetischer Proteine kodieren, ebenfalls verwendet werden können, vorausgesetzt, dass der Expressionsvektor oder die Wirtszelle dann die Sequenzen bereitstellt, die dazu notwendig sind, die Prozessierung und Sekretion des exprimierten Proteins zu richten bzw. zu leiten.
Der pH717-Expressionvektor (3A) enthält das Neomycin (Neo)-Gen als Selektionsmarker. Dieses Markergen ist in der Technik wohl charakterisiert und kommerziell erhältlich. Alternativ können andere selektierbare Marker verwendet werden. Der spezielle Vektor, der verwendet wird, um das Neo-Gen-DNA-Fragment für pH717 bereitzustellen, kann von Clontech, Inc., Palo Alto, CA (pMAM-neo-blue) bezogen werden. Dieser Vektor kann als Grundgerüst verwendet werden. In pH717 wird die hOP1-DNA-Transkription durch den CMV-Promotor vorangetrieben, durch RSV-LTR und MMTV-LTR (Mouse Mammary Tumor Virus) Enhancer-Sequenzen verstärkt. Diese Sequenzen sind in der Technik bekannt und kommerziell erhältlich. Beispielsweise können Vektoren, die die CMV-Promotor-Sequenz enthalten von Invitrogen Inc., San Diego, CA, bezogen werden (beispielsweise pCDM8).
Die pH752- und pH754-Expressionvektoren enthalten das DHFR-Gen unter der Kontrolle eines SV40-Early-Promotors als beides, ein Selektionsmarker als auch ein induzierbarer Genamplifikator. Die DNA-Sequenz für DHFR ist in der Technik wohl charakterisiert und kommerziell erhältlich. Beispielsweise kann pH754 aus pMAM-neo (Clontech, Inc., Palo Alto, CA) durch ersetzten des Neo-Gens (BamHI Digest) mit einem SphI-BamHI- oder einem PvuII-BamHI-Fragment aus pSV5-DHFR (ATCC Nr. 37148) erhalten werden, das das DHFR-Gen unter einer SV40-Early-Promotor-Kontrolle enthält. Ein BamHI-Stelle kann am SphI- oder PvuII-Ort unter Verwendung von Standardtechnologien gentechnisch eingefügt werden (beispielsweise durch Linker-Insertion oder ortsgerichtete Mutagenese), um die Insertion des Fragmentes in das Vektorgrundgerüst zu ermöglichen. hOP1-DNA kann in die Polylinker-Stelle stromabwärts der MMTV-LTR-Sequenz eingefügt werden (Mouse Mammary Tumor Virus LTR), wodurch sich pH752 (3B) ergibt. Die CMV-Promotor-Sequenz kann dann in pH752 (beispielsweise aus pCDM8, Invitrogen, Inc.) eingefügt werden, wodurch sich pH754 (3C) ergibt. Der SV40-Early-Promotor, der die DHFR-Expression antreibt, wird in diesen Vektoren modifiziert, um die Konzentration an DHFR-mRNA, die erzeugt wird, zu reduzieren. Insbesondere wurden Enhancer-Sequenzen und Teile der Promotor-Sequenzen deletiert, und ließen ungefähr nur 200 Basen der Promotor-Sequenz stromaufwärts des DHFR-Gens zurück.
Der pW24-Vektor (3D) ist im Wesentlichen in seiner Reihenfolge mit p754 identisch, außer dass Neo als das Markergen verwendet wird (s. pH717), anstelle von DHFR.
Das pW24-Plasmid enthält OP-1-cDNA unter Transkriptionskontrolle des CMV(Zytomegalie-Virus)-Immediate-Early-Promotors. Dieser Promotor wird von pCDM8 gewonnen und ist viel kürzer als die der CMV-Promotor, der durch andere auf dem Gebiet Praktizierende verwendet wird. Der Letztere enthält Introns und ebenfalls zusätzliche stromaufwärts gelegene Sequenzen. Der selektive Marker auf pW24 ist das Neo-Gen, das eine Resistenz gegenüber dem zytostatischen Arzneistoff G418 zur Verfügung stellt. Zusätzlich enthält das Plasmid den LTR vom Rous-sarcoma-Virus und vom Maus-Brusttumor-Virus und den SV40-Replikationsursprung. Die letzteren viralen Enhancer-Elemente (LTR und SV40 ori) sind nicht essentiell, obwohl sie einige vorteilhafte Wirkungen auf die Expression aufweisen können.
Plasmid pW24 wurde durch einen dreiteiligen Zusammenbau konstruiert, der im Wesentlichen Folgendes enthält: der pMam-neo-Vektor (Clontech Inc., Palo Alto, CA) wurde an seiner Polylinker/Klonierungs-Stelle durch Restriktionsverdau mit NheI und SalI geöffnet. Der CMV-Promotor aus pCDM8 und das humane OP-1-Gen wurde darauf auf ein SpeI- an SalI- Fragment eingefügt. Während dieser Ligierung gingen die NheI- und SpeI-Stellen, die kompatible Enden aufweisen, beide verloren.
Vor diesem wurde der CMV-Promotor mit der OP-1-cDNA durch Fusion der 3'XbaI-Stelle, die den CMV-Promotor flankiert, mit einer 5'NheI-Stelle, die stromaufwärts der OP-1-cDNA angeordnet war, in einem früheren Schritt verbunden. Während dieser Ligation gingen die XbaI-Stelle und die NheI-Stelle, die kompatible Enden aufwiesen, ebenfalls verloren. Die NheI-Stelle, die OP-1-cDNA flankiert, wurde kürzlich gewonnen, wenn OP-1-cDNA auf einem Fragment, das dessen natürliche 5'SmaI-Stelle überspannt, ungefähr 20 Nukleotide stromaufwärts des ATG, bis zur natürlichen BamHI-Stelle, ungefähr 40 Nukleotide stromabwärts des Stop-Codons, mit einem SalI-Ort, der unmittelbar benachbart hierzu angeordnet war, in den pMAMneo-Vektor zwischen den SmaI- und SalI-Orten seiner Polylinker-Einfügungsstelle eingefügt wurden.
Beispiel 3: Transfektionen
In allen Beispielen wurden Transfektionen durch Kalziumphosphat-Kopräzipitation unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. CHO-Zellen von Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, NY, wurden in αMEM kultiviert, das 5% oder 10% fötales Rinderserum (FBS), nicht-essentielle Aminosäuren, Glutamin und Antibiotika enthielt: Penicillin und Streptomycin, die alle von GIBCO, New York, bezogen wurden. CHO-Zellen, die mit Vektoren transfiziert wurden, die ein Neo-Gen enthielten, wurden im selben Wachstumsmedium kultiviert, das das Toxin G418 (0,4 mg/ml) enthielt. CHO-Zellen, die mit Vektoren transfiziert wurden, die das DHFR selektierbar amplifizierbare Gen enthielten, wurden in α-MEM (αMEM, dem Thymidin, Glycin und Hypxanthin fehlt), 10% dialysiertem FBS und Methotrexat (MTX) bei 0,02–0,1 μM kultiviert.
Stabile Zelllinien-Transfektionen wurden durch Aussäen von 1–2 × 10⁶-Zellen in einer 9 cm Petri-Schale durchgeführt. Nach einer 24-stündigen Inkubation in Wachstumsmedium wurde jede Petri-Schale mit 10–30 μg Gesamtvektor-DNA in äquimolaren Mengen transfiziert durch Kalziumphosphat-Kopräzipitation, gefolgt von Glycerol-Schock unter Verwendung einer Standardmethodologie. Die Zellen wurden bei 37°C in Wachstumsmedium für 24 Stunden inkubiert, darauf auf Selektionsmedium transferiert. Alle Kulturen wurden einmal oder zwei mal wöchentlich mit frischem Selektionsmedium versorgt. Nach 10 bis 21 Tagen wurden resistente Kolonien aufgepickt und bezüglich ihrer Proteinproduktion untersucht.
Tabelle I fasst die tatsächlichen experimentellen Transfektionen zusammen, die durchgeführt wurden, um die Wirkung der oben beschriebenen Vektoren (alleine und in Kombination) auf die OP1-Produktion zu bestimmen. Die Vektoren und Kombinationen, die in Tabelle I präsentiert sind wurden teilweise ausgewählt, um die optimale Konfiguration der OP1-, VA1- und E1A-Vektoren zu bestimmen und teilweise, um zu bestimmen, ob die E1A- und/oder VA1-Gene für die optimale OP1-Expression entscheidend sind. In Tabelle I werden die Transfektionen Nr. 1, 2 und 3 als „Doppel"-Transfektionen betrachtet, weil zwei unterschiedliche Gene (nicht notwendigerweise Vektoren) in die CHO-Wirtszelle eingebracht wurden; in ähnlicher Weise werden die Transfektionen Nr. 4 und 5 als „Dreifach"-Transfektionen betrachtet, weil drei unterschiedliche Gene (nicht notwendigerweise Vektoren) eingebracht wurden. „Einfach"-Transfektionen betreffen CHO-Zellen, die nur mit einem OP1-kodierenden Vektor transfiziert wurden.
Tabelle I
Beispiel 4: Selektionsscreening für Kandidaten-Zelllinien
Im Anschluss an die Transfektion und Wachstum in Selektionsmedium wurden die Zellen für Kandidaten, die subkloniert werden sollen, im Wesentlichen wie in 1 beschrieben gescreent.
Unter Verwendung der in Tabelle I oben zusammengefassten Transfektionsschemata wurden ungefähr 30 individuelle Klone aus jeder Transfektion in Tabelle I ausgewählt, auf eine 24-Well Petri-Schale übertragen und bis zur Konfluenz in Serum-enthaltenden Medien wachsen gelassen. Die konditionierten Medien von allen überlebenden Klonen wurden auf ihre Proteinproduktion unter Verwendung eines Standard-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent As say) oder durch Western Blot gescreent. Die Methodologien für diese Assay-Vorschriften ebenso wie zur Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung in diesen Assays sind in der Technik wohl beschrieben. Eine Zusammenfassung dieser primären ELISA-Screeningdaten für OP1 ist in Tabelle II zu finden.
Tabelle II
Die Daten in Tabelle II legen nahe, dass die VA1- und E1A-Gene synergistisch zur Erhöhung der OP1-Expression in nicht-amplifizierten transfizierten CHO-Zellen fungieren. Transfektanten, die sich aus der Transfektion Nr. 1, 2 oder 3 ergeben, erzeugen vernachlässigbare Mengen an OP1, während die Transfektions-Nr. 4 und 5 ungefähr 57% bzw. 64% der Transfektanten ergab, die erhöhte Konzentrationen an OP1 produzieren.
Beispiel 5: Amplifikation Sub-Klonierungs/Klonierungs-Verfahren
Kandidaten-Zelllinien, die durch das Screening-Protokoll von Beispiel 4 identifiziert wurden, wurden darauf auf zehn 100-mm-Petri-Schalen in einer Zelldichte von entweder 50 oder 100 Zellen pro Platte ausgesät und mit einer höheren MTX-Konzentration (beispielsweise 1,0–5 μm).
Nach 10–21 Tagen Wachstum wurden die Klone unter Verwendung von Klonierungszylindern und Standardverfahren isoliert und in 24-Well-Platten kultiviert. Die Klone wurden darauf bezüglich der OP1-Expression durch Western Immunoblots unter Verwendung von Standardverfahren gescreent und die OP1-Expressionsstärken bzw. -Konzentrationen mit den Stammlinien verglichen. Kandidatenzellen, die eine höhere Proteinproduktion als Zellen der Stammlinien zeigen, wurden darauf erneut ausplattiert und in Gegenwart einer noch höheren MTX-Konzentration (beispielsweise 5–20 μm) gezüchtet. Im Allgemeinen sind nicht mehr als 2–3 Umläufe dieser „Amplifikations"-Klonierungsschritte notwendig, um Zelllinien mit einer höheren Proteinproduktivität zu erzielen. Nützliche hoch produzierende Zelllinien können weiter subkloniert werden, um die Zelllinienhomogenität und Produktstabilität zu verbessern.
Beispiel 6: Charakterisierung transfizierter Klone
a) Kopienanzahl
Southern Blots können unter Verwendung von Standardmethoden dazu verwendet werden, den Zustand integrierter Sequenzen und den Umfang ihrer Kopienanzahl-Amplifikation im Wirtsgenom zu bestimmen. Kopienanzahl-Experimente auf verschiedenen Transfektionen zeigen an, dass die Triple- bzw. Dreifach-Transfektanten, voll amplifiziert, ungefähr 10 Kopien des Reportergenes aufweisen, das Doppel-Transfektanten des Reportergens mit VA1 eine ein wenig höhere Kopienanzahl aufweisen (in der Größenordnung von 100 Kopien/Zelle), die beide signifikant kleiner als die Kopienanzahl für Einfach-Transfektanten, voll amplifiziert, sind (s. Tabelle III, unten).
b) mRNA-Messungen
Die Transkriptionsstärke transfizierter OP1-Sequenzen kann in unterschiedlichen Expressionssystemen durch Analyse von mRNA-Konzentrationen (Northern Blots) gemessen werden, unter Verwendung von zellulärer Gesamt-RNA und herkömmlicher Hybridisierungsmethodologie. Northern Blots bezüglich verschiedener Transfektionen zeigen, dass die OP1-Transkriptproduktion in Doppel-Transfektanten von OP1/VA1 im Vergleich mit Einfach-Transfektanten erhöht ist, in Doppel-Transfektanten von OP1/E1A erhöhter ist und noch mehr in Dreifach-Transfektanten erhöht ist.
c) Proteinmessungen
Proteinkonzentrationen können durch Western Blots (Immunoblots) unter Verwendung von Kaninchen-Antiseren gegen das Proteinprodukt von Interesse gemessen werden. Die Western-Blot-Methodik ist dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt und kann unter Verwendung kommerziell verfügbarer Reagenzien durchgeführt werden. Die in Tabelle III präsentierten Proteindaten sind für eine „terminale" oder „Batch"-Kultur angegeben, wobei Protein geerntet wird, wenn die Zellen die post-logarithmische Phase erreicht haben.
Interessanterweise wird die Proteinproduktion in den Dreifach-Transfektanten in synergistischer Weise im Vergleich entweder mit Einfach- oder Doppel-Transfektanten erhöht, obwohl die Kopienzahl signifikant in diesen Zellen gesenkt ist und die Transkriptionsniveaus nur moderat erhöht sind.
Tabelle III
Diese Daten zeigen, dass die Kombination der Erfindung, DNA-Sequenzen zu transfizieren, die Produktion von OP1 beträchtlich erhöhte. Wie in Tabelle III dargestellt ist, erzeugen Dreifach-Transfektanten Konzentrationen von OP1, die beträchtlich größer als diejenigen sind, die durch Einzel-Transfektanten erzeugt werden, unter Verwendung von signifikant weniger Kopien des Gens, wohingegen beide Kategorien von Doppel-Transfektanten ungefähr dazwischenliegende Konzentrationen des OP1 erzeugen, das von Dreifach-Transfektanten erzeugt wird. Auf der Grundlage dieser Daten scheint, dass der Transkriptionsaktivator E1A und der Translations-Enhancer VA1 synergistisch wirken, was eine hohe Expression des OP1-Gens zur Folge hat.
Beispiel 7: Proteinproduktion in Vorschriften mit großem Maßstab
Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren der Proteinproduktion in großem Maßstab, von beispielsweise zumindest 2 Litern, besteht im Suspensionskultivieren der Wirts-CHO-Zellen. Chinesische Hamster-Ovarzellen bevorzugten die Anlagerung, können jedoch auch so angepasst werden, dass sie im Suspensions-Modus der Kultivierung wachsen. Die Zellen werden aus der Schale trypsinisiert, in Wachstumsmedium eingebracht, das 10% FBS enthält, unter Verwendung einer Pipette, werden vollständig suspendiert, um idealerweise eine Einzell- Suspension zu erhalten. Dies wird in einen Drehkolben eingebracht und in einen befeuchteten Inkubator bei 37°C mit 95% Luft/5% CO₂ angeordnet. Über eine Zeitspanne werden die Zellen im Medium mit abnehmenden Konzentrationen an Serum subkultiviert. Innerhalb der Schüttelkolben entsteht ein Gleichgewicht zwischen einer ausreichenden Schüttelgeschwindigkeit, um eine Einzell-Wirtsfunktion aufrechtzuerhalten, und der Schwerkraft, die mit dem Rührgerät der Rührvorrichtung assoziiert ist. Aufgrund der Art des 95% Luft/5% CO₂ Inkubators entsteht ein Gleichgewicht zwischen der Sauerstoffabsorption/CO₂-Desorption im Medium und der Rührgeschwindigkeit ebenso wie der Oberfläche zu Volumen-Verhältnisse.
Beispielsweise wurde die Produktion von CHO-konditionierten Medien in Suspensionskulturen wie folgt durchgeführt: Die adaptierten Zellen wurden in einen 3-l-Schüttelkolben bei einer anfänglichen lebensfähigen Zelldichte von ungefähr 2 × 10⁵ Zellen/ml eingebracht. Das Kulturmedium war DMEM/F-12 (1 : 1) (GIBCO, New York), ergänzt mit 2% FBS. Das Rühren war ungefähr 50–60 upm mit einem Schaufelrührgerät. Das Kulturvolumen betrug 1500 ml (halbmaximal), um das relative Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis zu erhöhen. Nach 7 Tagen wurden die Kulturmedien geerntet, bei 1500 upm zentrifugiert und die geklärten konditionierten Medien bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 8: Charakterisierung von OP1, das durch bevorzugte Klone exprimiert wurde
Biochemische Standardverfahren, einschließlich des apparenten Molekulargewichts, das durch Gelelektrophorese bestimmt wurde und/oder eines N-terminalen und C-terminalen Sequenzierens (durch CNBr-Analyse) kann verwendet werden, um die Form und Struktur des produzierten Proteines zu verifizieren. Unter Verwendung dieser Methodologien (beschrieben in zahlreichen Texten, die in der Technik verfügbar sind) wurde das OP1-Protein als gleiche Form wie in den Zellen von Einfach-Transfektanten gefunden, beispielsweise in der reifen, Volle-Länge-Form (139 Aminosäuren) ebenso wie verschiedene N-terminal trunkierte Formen, die für die Expression in CHO-Zellen charakteristisch sind.
Überdies wurde unter Verwendung von Standard-Bioassay-Methodologien zum Verifizieren der biologischen Aktivität der osteogenetischen (morphogenetischen Proteine) beispielsweise in einem ektopischen Rattenknochen-Bildungsassay (s. US 5 011 691 ) die biologische Aktivität des erzeugten Proteines durch das Verfahren der Erfindung als im Wesentlichen dieselbe halbmaximale spezifische Aktivität wie diejenige des Proteins, das durch Einfach- Transfektanten erzeugt wurde, bestimmt. Überdies zeigen in allen Fällen erfolgreiche Implantate einen kontrollierten Fortschritt durch die Stadien der Matrix-induzierten endochondralen Knochen- bzw. Ersatzknochenentwicklung, einschließlich: vorübergehender Infiltration durch polymorphkernige Leukozyten am Tag 1; mesenchymale Zellmigration und Proliferation an den Tagen 2 und 3; Knorpelzell-Auftreten an den Tagen 5 und 6; Knorpelmatrix-Bildung am Tag 7; Knorpelkalzifizierung am Tag 8; vaskuläre Invasion, Auftreten von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an den Tagen 9 und 10; Auftreten einer osteoplastischen und Knochenumformung und Auflösung der implantatierten Matrix an den Tagen 12 bis 18; und hämatopoietische Knochenmarksdifferenzierung im Ossikel am Tag 21.
Beispiel 9: allgemeine Isolierungs-/Aufreinigungs-Schemen für die Morphogene
Ein repräsentatives Aufreinigungsschema zur Aufreinigung der rekombinanten morphogenen Proteine, das schnell und hoch effizient ist, ist unten bereitgestellt. Die unten beschriebene Vorschrift schließt drei chromatographische Schritte 1 (S-Sepharose, Phenyl-Sepharose und C-18-HPLC) ein und erzeugt OP1 in einer Reinheit von ungefähr 90%. Die Aufreinigungsvorschrift der Wahl variiert mit dem zu exprimierenden Gen.
Eine alternative Vorschrift, die ebenfalls Protein mit hoher Reinheit erzeugt, ist eine Variante des dreistufigen Chromatographie-Protokolls unter Verwendung von Zn/IMAC (Metallaffinitätschelierungs-Chromatographie), hydrophobe Interaktionschromatographie (beispielsweise Phenyl-Toyopearl) und Umkehrphasen (C-18)-Chromatographie. Noch weitere nützliche verwandte Chromatographieverfahren schließen Heparin-Sepharose ein, verwendet in Kombination mit der S-Sepharose-Säule.
Für eine typische 2-l-Präparation transfizierter CHO-Zellen, die in 0,5% FCS konditioniert wurden, ist die Menge an OP1 in den Medien, geschätzt durch Western Blot, ungefähr 10–20 mg/l.
Kurz gesagt, werden die OP1-enthaltenden Kulturmedien auf 6 M Urea, 0,05 M NaCl, 13 mM HEPES, pH 7,0 verdünnt und auf eine S-Sepharosesäule geladen, die als starker Kationenaustauscher dient. OP1 bindet an die Säule in wenig Salz und die Serumproteine werden entfernt. Die Säule wird anschließend mit Zweischritt-Salzelutionen entwickelt. Die erste Elution (0,1 M NaCl) entfernt Kontaminanten und ungefähr 10% des gebundenen OP1. Das verbleibende 90% von OP1 wird darauf in 6 M Urea, 0,3 M NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,0 eluiert.
Ammoniumsulfat wird der 0,3-M-NaCl-Fraktion zugesetzt, um die endgültigen Lösungsbedingungen von 6 M Urea, 1 M (NH₄)₂SO₄) 0,3 M NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,0 zu erreichen. Die Probe wird dann auf eine Phenyl-Sepharose-Säule (hydrophobe Interaktionschromatographie) aufgeladen. OP1 bindet Phenyl-Sepharose in Gegenwart hoher Konzentrationen eines schwachen chaotropen Salzes (beispielsweise 1 M (NH₄)₂SO₄). Wenn OP1 einmal gebunden ist, wird die Säule mit Zweischritt-Elutionen unter Verwendung abnehmender Konzentrationen an Ammoniumsulfat entwickelt. Die erste Elution (die 0,6 M (NH₄)₂SO₄) enthält) entfernt in erster Linie Kontaminanten. Das gebundene OP1 wird dann mit einer 6 M Urea, 0,3 M NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,0 Puffer eluiert, der kein Ammoniumsulfat enthält.
Das aus der Phenyl-Sepharose-Säule eluierte OP1 wird gegen Wasser, gefolgt von 30% Acetonitril (0,1% TFA) dialysiert und darauf auf eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgebracht. Die Gelauftrennung oxidierter und reduzierter OP1-Proben zeigt, dass die reduzierten und oxidierten Untereinheiten mit denjenigen des OP1 aus natürlicher Quelle, das aus Knochen aufgereinigt wurde, identisch zu sein scheinen.
Ein alternatives Chromatographie-Protokoll besteht darin, die S-Sepharose-Chromatographie in Abwesenheit von 6 M Urea durchzuführen. Die gebundenen Proteine werden dann mit Salzschritt-Elutionen (beispielsweise 100–400 mM NaCl) eluiert. Der größte Teil des OP1 wird mit ungefähr 300 mM NaCl eluiert. Zusätzliches OP1 kann dann mit 300 mM NaCl in Gegenwart von 6 M Urea eluiert werden. Die 6-M-Urea-Elution kann ebenfalls anstelle der Nicht-Urea-Elution verwendet werden, um eine maximale Wiedergewinnung in einem Schritt zu erreichen. Zusätzlich kann OP1 aus der Phenyl-Sepharose-Säule in 38% Ethanol-0,01% TFA eluiert werden, wodurch der Bedarf eliminiert wird, den Eluenten vor dessen Aufbringung auf die C18-Säule zu dialysieren. Zuletzt können multiple C18-Säulen verwendet werden (beispielsweise drei), um die Aufreinigung und Konzentration des Proteins weiter zu erhöhen.
OP1 wird ebenfalls Hydroxyapatit effizient binden, jedoch nur in Abwesenheit von 6 M Urea und bei niedrigen Phosphat-Konzentrationen (weniger als 5 mM Phosphat). Gebundenes OP1 kann aus der Säule mit einer Schrittelution von 1 mM bis 0,5 M Phosphat (in 0,5 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,0) entfernt werden. OP1 eluiert bei ungefähr 250 mM Phosphat. Zusätzlich kann Urea (6 M) während des Elutionsschrittes zugesetzt werden.
Beispiel 10: BPV-Early-Region-DNA-Kotransfektion
Unter Verwendung der in 1 und in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen Transfektions- und Screening-Vorschriften wurde die Wirkung von boviner Papillomavirus-Early-DNA auf rekombinante OP-1-DNA-Expression getestet. Hier wurde ein Vektor, der BPV-Early-Region-DNA trügt (BPV-1/pML2d-Vektor, 4, bezogen von IBI, New Haven) in eine stabile, unamplifizierte OP-1-produzierende Zelle transfiziert, in der das OP-1-Gen in niedriger Kopienanzahl vorlag (in der Größenordnung von 1–10 Kopien). Alternativ wurde ein EIA-produzierender Vektor (beispielsweise pH1176) in dieselbe OP-1-produzierende Zelllinie transfiziert. Kandidaten, die nach der initialen Transfektion gescreent wurden, demonstrierten eine 5 bis 8fache Erhöhung der „Doppel"-Transfektante (BPV/OP1) über die Konzentrationen des durch die Zelle allein produzierten Proteins (OP1) und eine 10fache Erhöhung in der alternativen „Doppel"-Transfektante (E1A/OP1) im Vergleich zur Zelle alleine (OP1). Noch höhere vergleichsweise Proteinkonzentrationen werden angenommenerweise nachgewiesen, wenn die Kandidatenzelle eine Amplifikation, Klonierungs- und Subklonierungs-Vorschriften wie in den Beispielen 5 und 6 beschrieben unterworfen werden, um Klone zu erzeugen, die zur Erzeugung des Reportergens in Konzentrationen von zumindest 1 und vorzugsweise zumindest 5 μg Protein/10⁶ Zellen/ml erzeugen, wobei das Protein aus dem Medium in einer Batch-Kultur geerntet werden, wenn die Zellen in der post-logarithmischen Phase vorliegen. Es wird ebenfalls angenommen, dass Dreifach-Transfektanten die Proteinproduktion weiter erhöhen werden. Ein möglicher Vorteil der Verwendung von BPV gegenüber einer transaktivierenden Sequenz wie E1A liegt in den möglichen sekundären Effekten der Wachstumsgeschwindigkeiten oder Medienerfordernissen, die auf die Wirtszelle übertragen werden.
Beispiel 11: rekombinante Einketten-Fv
Unter Verwendung des in 1 und in den Beispielen 3–5 beschriebenen Protokolls wurden die Verfahren und Konstrukte der Erfindung an zwei unterschiedlichen artifiziellen Gensequenzen getestet, die Einketten-Fvs („sFv") kodieren. Diese Proteine werden ebenfalls in der Technik als biosynthetische Antikörper Bindungsstellen-Moleküle (Biosynthetic Antibody Binding Site Molecules = „BABS") bezeichnet. Die beiden Konstrukte, 741F8 und MOPC315, sind in der Technik wohl beschrieben. Das 7417F8-Konstrukt interagiert spezifisch mit dem c-erb2-Antigen, einem bekannten Marker, der mit Brustkrebs assoziiert ist. MOPC315 erkennt Dinitrophenol. Ein exemplarisches Plasmid, pH1512, das die 741F8-Sequenz unter Kontrolle des CMV-MIE-„Kurz"-Promotors trägt und das eine Sekretionssignalsequenz enthält, gewonnen aus der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers 520C9-DNA-Sequenz, ist in 5 dargestellt. Die MOPC315-DNA-Sequenz, die verwendet wurde, befand sich unter Kontrolle des CMV-MIE-Promotors und wies seine eigene (native) Sekretionssignalsequenz auf.
Folgend den in den Beispielen 3–5 beschriebenen Vorschriften wurden Dreifach-Transfektionen von CHO-Zellen mit einem E1A-enthaltenden Plasmid (beispielsweise pH1176), einem VA1-enthaltenden Plasmid (pH1130) und entweder dem MOPC315 oder dem 741F8-Vektor durchgeführt. In allen Fällen produzierten Hochproduktions-Klone zumindest zwischen 1–6 pg Protein pro 10⁶ Zellen/ml in Chargenkulturen, wobei das Protein aus dem Medium geerntet wurde, wenn die Zellen sich in der post-logarithmischen Phase befanden.
Sequenzprotokoll

Claims

Immortalisierte eukaryotische Zelle zur verbesserten Herstellung eines Proteins, wobei die genannte Zelle transfizierte DNA-Sequenzen operativ integriert in ihr Genom umfasst, wobei die genannten transfizierten DNA-Sequenzen kodieren für: (a) einen viralen Transkriptionspromotor, der operativ mit einer das Protein kodierenden DNA-Sequenz assoziiert ist, wobei genannter viraler Transkriptionsaktivatorprotein stimuliert wird, das auf die Transkription von genannter DNA-Sequenz einwirkt oder sie induziert, kodierend genanntes Protein zur Herstellung eines RNA-Transkripts, das – wenn translatiert – genanntes Protein produziert; (b) ein Transkriptionsaktivatorprotein, das auf genannten Transkriptionspromotor wirkt und ihn stimuliert; und (c) eine RNA-Sequenz, die zur Promotion der Translation von genanntem RNA-Transkript aus Schritt (a) vorstehend operativ ist.
Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie zur verbesserten Produktion eines Proteins, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von: (a) Transfektion einer immortalisierten eukaryotischen Zelle mit einer Nukleinsäure, umfassend eine DNA-Sequenz, kodierend ein virales Transkriptionsaktivatorprotein, das auf einen viralen Promotor wirkt und ihn stimuliert; (b) Transfektion genannter immortalisierter eukaryotischer Zelle mit Nukleinsäuren umfassend; (1) eine DNA-Sequenz, definierend einen viralen Transkriptionspromotor, der operativ mit einer DNA-Sequenz assoziiert ist, kodierend ein Protein, wobei genannter viraler Transkriptionspromotor durch genanntes virales Transkriptionsaktivatorprotein stimuliert wird, das auf die Transkription von genannter DNA-Sequenz wirkt und sie induziert, kodierend genanntes Protein zur Produktion eines RNA-Transkripts, wobei genanntes Transkript, wenn translatiert, genanntes Protein produziert; und (2) eine DNA-Sequenz, kodierend eine RNA-Sequenz, wobei genannte RNA-Sequenz zur Promotion der Translation von genanntem RNA-Transkript aus Schritt (b) (1) vorstehend operativ ist; (c) Kultivieren genannter transfizierter Zelle unter Bedingungen, die genannter transfizierter Zelle ermöglichen, genannte DNA-Sequenzen dergestalt in ihr Genom zu integrieren, dass genannte Integration das Wachstum von genannter Zelle und die Produktion von genanntem Protein erlaubt, wobei genanntes Protein bei einer höheren Konzentration produziert wird, als wenn genannte Zelle mit genannter DNA-Sequenz transfiziert wird, kodierend genanntes Protein allein oder in Kombination mit nur einer der DNA-Sequenzen von Schritt (a) oder (b) (2) vorstehend; und (d) Identifizieren eines Klons von genannter kultivierter transfizierter Zelle von Schritt (c), die mindestens 1 μg von genanntem Protein/10⁶ Zellen/ml exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Transfektionsschritte (a) und (b) simultan oder sequenziell durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, worin genannte DNA-Sequenz, kodierend genanntes virales Transkriptionsaktivatorprotein, vor dem Transfektionsschritt von Schritt (b) stabil in das Genom von genannter Zelle integriert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin genannte DNA-Sequenz, kodierend genannte RNA-Sequen, einen Teil einer Nukleinsäure getrennt und unabhängig von einer Nukleinsäure umfasst, umfassend genannte DNA-Sequenz, definierend genannten viralen Promotor, der operativ mit genannter DNA-Sequenz, kodierend genanntes Protein, assoziiert ist.
Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 5, worin genannte Nukleinsäuren unabhängige Vektoren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin in Schritten (a) und (b) transfizierte genannte DNA-Sequenzen in das Genom des in Schritt (d) identifizierten Klons stabil integriert sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin genannte DNA-Sequenzen, kodierend genanntes Transkriptionsaktivatorprotein und genannte RNA-Sequenz an einer einzelnen Nukleinsäure vorkommen.
Zelle nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, worin genanntes Protein ein Morphogen ist und worin genannte DNA-Sequenz, kodierend ein Protein, genanntes Morphogen kodiert.
Zelle oder Verfahren nach Anspruch 9, worin genanntes Morphogen, wenn vorschriftsmäßig gefaltet, eine strukturelle Konformation aufweist, die zur Induktion einer morphogenetischen Aktivität in einem Säuger fähig ist.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Kopienzahl von genannter DNA-Sequenz, kodierend genanntes Protein und integriert in das Genom von genannter Zelle wie folgt ist: (a) weniger als 20 Kopien pro Zelle oder (b) weniger als 10 Kopien pro Zelle oder (c) weniger als 5 Kopien pro Zelle.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannter viraler Transkriptionspromotor: (a) aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Promotoren, die sich vom Adenovirus, Rous-Sarkom-Virus und Cytomegalovirus herleiten; oder (b) den konstitutiven bedeutenden intermediären frühen Promotor des Cytomegalovirus umfasst.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genanntes Transkriptionsaktivatorprotein ein virales Transaktivationsprotein ist, das auf die Transkription eines nicht homologen Genes wirkt und es stimuliert, wobei das Aktivatorprotein zum Beispiel aus dem T-Antigen des Simian-Virus, den E1A- oder E1B-Proteinen des Adenovirus, einem Protein, kodiert durch die frühe Region der DNA-Sequenz des bovinen Papillomavirus und den IE-Proteinen des Herpesvirus ausgewählt ist.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannte DNA-Sequenz, kodierend das genannte virale Transkriptionsaktivatorprotein, operativ mit einer DNA-Sequenz assoziiert ist, definierend eine Transkriptionspromotorsequenz, die zum Wirken auf und zur Induktion der Transkription von genannter DNA-Sequenz des Transkriptionsaktivators kompetent ist, wobei genannte DNA-Sequenz des Transkriptionspromotor zur Einschränkung der Transkription von genannter DNA-Sequenz des viralen Transkriptionsaktivators ausgewählt ist.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannte DNA-Sequenz eine transaktivierende RNA-Sequenz von viraler Herkunft ist, die auf die Translation eines durch ein heterologes Gen kodierten RNA-Transkripts wirkt und sie verbessert, wobei die RNA-Sequenz zum Beispiel aus der VA1-RNA des Adenovirus und einer RNA-Sequenz, die durch eine DNA-Sequenz der frühen Region des bovinen Papillomavirus kodiert ist, ausgewählt ist.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genanntes Protein: (a) ein morphogenetisches Protein ist, das aus OP1, OP2, OP3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, DPP, Vgl, Vgr, 60A-Protein, GDF-1, Ds1-1, GDNF und Aminosäuresequenz-Varianten davon ausgewählt ist, worin genannte Aminosäuresequenz-Varianten morphogenetisch aktiv sind; oder (b) ein morphogenetisches Protein ist, umfassend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70%iger Ähnlichkeit innerhalb der C-terminalen 102–106 Aminosäuren, einschließlich der konservierten Domäne aus sieben Cysteinen oder innerhalb der C-terminalen 96 Aminosäuren, einschließlich der konservierten Domäne aus sechs Cysteinen des humanen OP1; oder (c) ein morphogenetisches Protein ist, umfassend ein Paar Polypeptidketten, die zur Bildung einer dimeren Spezies assoziiert sind.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannte DNA-Sequenz, kodierend genanntes Morphogen, OP1 oder eine Aminosäuresequenz-Variante davon kodiert, worin genannte Aminosäuresequenz-Variante morphogenetisch ist.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend DNA-Sequenzen, kodierend mindestens zwei Morphogene, wobei jede genannte DNA-Sequenz ein Morphogen kodiert, das operativ mit genanntem viralem Transkriptionspromotor assoziiert ist.
Zelle oder Verfahren nach Anspruch 18, worin genannte DNA-Sequenzen unabhängig aus DNA-Sequenzen ausgewählt sind, kodierend OP1, OP2, OP3, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9 und Aminosäuresequenz-Varianten davon, worin genannte Aminosäuresequenz-Varianten morphogenetisch aktiv sind.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genanntes Protein eine chimäre Aminosäuresequenz aus zwei oder mehreren Morphogenen umfasst.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannte Zelle eine Säugerzelle ist, die gegebenenfalls eine Nieren-, Blasen-, Leber-, Lungen-, Herzmuskel- oder Glattmuskelzelle oder jedwede von einer Ovarialzelle vom chinesichen Hamster, einer Nierenzelle vom Hund oder eine Blasenzelle von der Ratte ist.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiter umfassend ein Mittel zum Amplifizieren der Kopienzahl von genannter DNA-Sequenz, kodierend genanntes Protein, wobei das Mittel gegebenenfalls eine DNA-Sequenz umfasst, kodierend Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) in operativer Assoziation mit einer Promotorsequenz, die auf die Transkription von genannter DHFR-DNA wirkt und sie induziert.
Zelle oder Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin genannte Zelle Folgendes produziert: (a) mindestens 1 μg Protein pro 10⁶ Zellen pro ml Kulturmedium; oder (b) mindestens 5 μg Protein pro 10⁶ Zellen pro ml Kulturmedium; oder (c) mindestens 10 μg Protein pro 10⁶ Zellen pro ml Kulturmedium.
Immortalisierte Zelle nach Anspruch 23, worin genanntes Protein geerntet wird, wenn sich genannte Zelle in der postlogarithmischen Phase befindet.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins (z. B. eines Morphogens), wobei genanntes Verfahren die Schritte umfasst von: (a) Kultivieren der immortalisierten eukaryotischen Zelle nach einem der vorangehenden Ansprüche unter Bedingungen, die zur Produktion einer Population genannter Zellen, die genanntes Protein exprimieren, ausreichend sind, und (b) Isolieren des durch genannte Zellen hergestellten Proteins, worin der Schritt des Kultivierens genannter Zelle gegebenenfalls den Schritt des Züchtens genannter Zelle in einem serumfreien Medium, umfassend ein Abbauprodukt des Phosphoglyceridesters der Lipidmembram, umfasst.