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DE69430369T2 - Rekombinanter alphavirus vektor - Google Patents

Rekombinanter alphavirus vektor

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DE69430369T2
DE69430369T2 DE69430369T DE69430369T DE69430369T2 DE 69430369 T2 DE69430369 T2 DE 69430369T2 DE 69430369 T DE69430369 T DE 69430369T DE 69430369 T DE69430369 T DE 69430369T DE 69430369 T2 DE69430369 T2 DE 69430369T2
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DE
Germany
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vector
sindbis
alphavirus
viral
sequence
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Application number
DE69430369T
Other languages
English (en)
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DE69430369D1 (de
Inventor
Stephen M.W. Chang
David A. Driver
Dubensky, Jr.
Carlos E. Ibanez
Douglas J. Jolly
John M. Polo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of DE69430369D1 publication Critical patent/DE69430369D1/de
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Publication of DE69430369T2 publication Critical patent/DE69430369T2/de
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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von rekombinanten Viren als Vektoren, und noch spezifischer, rekombinante Alphaviren, wie das Sindbis-Virus, welche zur Expression einer heterologen Sequenz in Zielzellen bzw. Targetzellen befähigt sind.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Alphaviren umfassen eine Reihe von serologisch-verwandten aus Arthropoden entstandenen Viren der Togavirus-Familie. Kurz gesagt, Alphaviren sind weltweit verbreitet und persistieren in der Natur durch einen Moskito-zu-Vertebraten-Zyklus. Vögel, Nagetiere, Pferde, Primaten und Menschen sind unter den definierten Alphavirus-Vertebraten-Reservoiren/-Wirten.
  • Sechsundzwanzig bekannte Viren und Virus-Subtypen sind innerhalb der Alphavirus- Gattung unter Verwendung der Hemagglutinations-(HI)-Untersuchung klassifiziert worden. Kurz gesagt, der HI-Test trennt die 26 Alphaviren in drei Hauptkomplexe: den Venezuelian-Encephalitis-(VE)-Komplex, den Semliki-Forest-(SF)-Komplex und den Western-Encephalitis-(WE)-Komplex. Zusätzlich erhalten vier weitere Viren, der Eastern-Encephalitis (EE), der Barmah Forest, der Middelburg und der Ndumu, basierend auf dem HI-serologischen Test, eine individuelle Klassifizierung.
  • Die Mitglieder der Alphavirus-Gattung werden ebenso, basierend auf ihren relativen klinischen Merkmalen, in den Menschen klassifiziert: Alphaviren, welche primär mit Encephalitis assoziiert sind, und Alphaviren, welche primär mit Fieber, Hautausschlag und Polyarthritis assoziiert sind. In der vorherigen Gruppe sind die VE- und WE-Komplexe und EE eingeschlossen. Im allgemeinen kann die Infektion mit dieser Gruppe andauernde Folgen, einschließlich Verhaltensänderungen und Lernunfähigkeit oder Tod, haben. Zu der letzteren Gruppe gehört der SF-Komplex, umfassend die individuellen Alphaviren, Chikungunya, O'nyong-nyong, Sindbis, Ross River und Mayaro. Obwohl über schwere Epidemien berichtet worden ist, gilt bezüglich dieser Gruppe die Infektion allgemein als selbstlimitierend, ohne dauerhafte Folgen.
  • Das Sindbis-Virus ist das Prototypmitglied der Alphavirus-Gattung der Togavirus- Familie. Obwohl gewöhnlich nicht offensichtlich, schließen die klinischen Symptome der Sindbisvirus-Infektion Fieber, Arthritis und Hautausschlag ein. Das Sindbis-Virus ist über Europa, Afrika, Asien und Australien verbreitet, wobei die besten epidemiologischen Daten aus Südafrika kommen, wo 20% der Bevölkerung seropositiv sind. (Zur Übersicht, siehe Peters und Dalrymple, Fields Virology (2. Auflage), Fields et al. (Herausgeber), B.N. Raven Press, New York, NY, Kapitel 26, Seiten 713-762). Das infektiöse Sindbis-Virus ist aus menschlichem Serum nur während eines Ausbruchs in Uganda und aus einem Einzelfall in Zentralafrika isoliert worden.
  • Die Morphologie und Morphogenese der Alphavirus-Gattung ist allgemein völlig einheitlich. Insbesondere die umhüllten 60-65 nm Partikel infizieren die meisten Vertebraten-Zellen, wo die produktive Infektion zytopathisch ist. Auf der anderen Seite haben Infektionen von Invertebraten-Zellen, welche zum Beispiel aus Moskitos stammen, keine offenkundige Zytopathologie zur Folge. Typischerweise werden Alphaviren in schnell wachsenden BHK-21- oder Sero-Zellen vermehrt, wobei eine maximale Ausbeute innerhalb 24 Stunden nach der Infektion erreicht wird. Freilandstämme werden gewöhnlich aus primären Vogelembryonen, beispielsweise Hühnerfibroblasten-Kulturen, isoliert.
  • Die genomische RNA (49S-RNA) der Alphaviren ist nicht segmentiert, von positiver Polarität, mit einer Länge von ungefähr 11-12 kb und enthält eine 5'-Capstruktur und einen 3'-polyadenylierten Schwanz. Infektiöse umhüllte Viren werden durch Assembly bzw. Zusammenlagern bzw. Zusammenfügen der viralen Nukleokapsid- Proteine an die virale genomische RNA im Zytoplasma und Knospung durch die Zellmembran, in welcher viral-kodierte Glykoproteine eingebettet sind, erzeugt. Der Eintritt des Virus in die Zelle findet durch Endozytose durch Clatherin-bedeckte Vertiefungen, Fusion der viralen Membran mit dem Endosom, Freisetzung des Nukleocapsids und Enthüllen bzw. Freisetzung des viralen Genoms statt. Während der viralen Replikation dient die genomische 49S-RNA als Matritze für die Synthese des komplementären Negativ-Stranges. Der Negativstrang dient wiederum als Matritze für die genomische RNA und für eine intern iniziierte 26S-subgenomische RNA. Die Nicht-Strukturproteine werden von der genomischen RNA translatiert. Alphavirale Strukturproteine werden von der subgenomischen 26S-RNA translatiert. Alle viralen Gene werden als ein Polyprotein exprimiert und in einzelne Proteine durch protolytische Spaltung nach Translation prozessiert.
  • Die Verwendung von rekombinanten Alphavirus-Vektoren zur Behandlung von Individuen erfordert, daß sie zum Transport und für die Lagerung über lange Zeiträume bei einer gewünschten Temperatur befähigt sind, so daß die Infektiösität und die Lebensfähigkeit des rekombinanten Virus erhalten bleibt. Gegenwärtige Verfahren zur Lagerung rekombinanter Viren umfassen allgemein die Lagerung als Flüssigkeiten und bei niedrigen Temperaturen. Solche Verfahren bringen Probleme in Dritte Welt-Ländern mit sich, welche typischerweise keine angemessenen Kühlkapazitäten aufweisen. Beispielsweise sterben jedes Jahr in Afrika Millionen von Kindern an infektiösen Krankheiten, wie Masern. Vakzinen, welche zur Vorbeugung gegen diese Krankheiten notwendig sind, können nicht an die Mehrheit dieser Länder verteilt werden, weil Kühlung nicht ohne weiteres zugänglich ist.
  • Zusätzlich zur Lagerung als Flüssigkeiten und bei niedrigen Temperaturen enthalten die gegenwärtigen viralen Formulierungen oft Mediumkomponenten, welche nicht für die Injektion in den Patienten wünschenswert sind. Daher gibt es die Notwendigkeit in der Technik für ein Verfahren zur Konservierung des gereinigten rekombinanten viralen Vektors (und insbesondere Alphavirus-Vektoren) in einer lyophilisierten Form bei erhöhten Temperaturen und für diese für die Injektion in die Patienten geeignete Form.
  • Xiong et al., Science (1989) 312: 1188-1191 und WO 92/10578 schlagen DNA- Transkriptions-Vektorkonstrukte vor, welche verwendet werden können, um in vitro Alphavirus-Expressionsvektor-RNA-Moleküle, aber nicht innerhalb eukaryotischer Zellen, zu transkribieren.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart rekombinante Alphavirus-Vektoren, welche zur Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen geeignet sind, einschließlich beispielsweise Gentherapie, und stellt weitere andere damit in Beziehung stehende Vorteile bereit.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Kurz erklärt, stellt die vorliegende Erfindung Alphavirus-Vektorkonstrukte, wie in den anhängenden Ansprüchen definiert, bereit.
  • In einer Ausführungsform enthält das Vektorkonstrukt eine heterologe Sequenz. Typischerweise enthält solch ein Vektorkonstrukt eine heterologe Nukleotidsequenz, welche größer als 100 Basen ist, wobei allgemein die heterologe Nukleotidsequenz größer als 3 kb ist, und vorzugsweise die heterologe Nukleotidsequenz größer als 5 kb ist, und noch mehr bevorzugt die heterologe Nukleotidsequenz größer als 8 kb ist. In verschiedenen Ausführungsformen ist die heterologe Sequenz eine Sequenz, welche ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, α-, β- und γ-IFN, G- CSF und GM-CSF, kodiert.
  • In einer anderen Ausführungsform enthalten die Vektorkonstrukte keine Alphavirus- Strukturproteine. In anderen Ausführungsformen ist die ausgewählte heterologe Sequenz stromabwärts zu der viralen Verbindungsregion lokalisiert. In den Vektorkonstrukten mit einer zweiten viralen Verbindung kann die ausgewählte heterologe Sequenz in bestimmten Ausführungsformen stromabwärts zu der zweiten viralen Verbindungsregion lokalisiert sein. Wo die heterologe Sequenz stromabwärts von der viralen Verbindungsregion lokalisiert ist, kann das Vektorkonstrukt weiter einen Polylinker umfassen, welcher anschließend an die virale Verbindungsregion lokalisiert ist. In den bevorzugten Ausführungsformen enthalten solche Polylinker keine Wildtyp-Alphavirus-Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenz.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann in den Vektorkonstrukten die ausgewählte heterologe Sequenz innerhalb der Nukleotidsequenz lokalisiert sein, welche Alphavirus-Nicht-Strukturproteine kodiert.
  • In besonderen Ausführungsformen schließen die Vektorkonstrukte eine virale Bindungsregion ein, welche aus einer Nukleotidsequenz, wie in Fig. 1 gezeigt, von Nukleotidnummer 7.579 bis Nukleotidnummer 7.597 (SEQ. ID Nr. 1) besteht. In anderen Ausführungsformen, wo das Vektorkonstrukt eine zweite virale Bindung einschließt, schließen die Vektorkonstrukte ein E3-Adenovirus-Gen ein, welches stromabwärts von der zweiten viralen Verbindungsregion lokalisiert ist und können auch weiter eine retrovirale Verpackungssequenz umfassen, welche zwischen der ersten viralen Verbindungsregion und der zweiten viralen Verbindungsregion lokalisiert ist.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Alphaviruspartikel bereit, welcher durch Einführen in eine Targetzelle bzw. Zielzelle eine infizierte Zelle liefert, welche für mindestens 72 Stunden nach Infektion lebensfähig ist. Ebenso werden Targetzellen bereit gestellt, welche nach Infektion mit einem Alphaviruspartikel der vorliegenden Erfindung für mindestens 72 Stunden nach Infektion lebensfähig sind.
  • Der oben beschriebene Alphaviruspartikel führt zur. Expression eines Palliativum, noch spezifischer zur Expression eines Genprodukts, welches befähigt ist, einen sonst inaktiven Precursor bzw. Vorläufer in einen aktiven Hemmstoff eines pathogenen Agens zu aktivieren, beispielsweise das Herpes-Thymidinkinase- Genprodukt, ein Tumor-Suppressorgen oder ein Protein, welches eine Verbindung mit geringer oder keiner Zytotoxizität in ein toxisches Produkt in Anwesenheit eines pathogenen Agens aktiviert, wodurch eine lokale Therapie gegen das pathogene Agens bewirkt wird.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist in der oben beschriebenen Alphaviruspartikel das Protein die Herpes-Thymidinkinase.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Hemmung eines pathogenen Agens bereit gestellt, welches das Infizieren empfänglicher Targetzellen mit einem Alphaviruspartikel umfasst, welcher zur Expression eines Palliativums in den Alphaviruspartikel-infizierten Zellen führt, wobei das Palliativum zur Hemmung einer Funktion eines pathogenen Agens befähigt ist, welches für die Pathogenität notwendig ist.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein oben beschriebenes Alphavirus-RNA-Vektormolekül bereit, welches befähigt ist, die Expression eines Palliativums in einer Targetzelle herbeizuführen. Das Palliativum in dieser Alphavirus-RNA-Expressionsvektor-Konfiguration hat, wenn es exprimiert wird, den gleichen Effekt wie die oben für ein Alphaviruspartikel beschriebenen Aspekte. Der Alphavirus-RNA-Expressionsvektor schließt der Reihe nach eine 5'- Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Alphavirus befähigt ist, eine Alphavirus-Nicht-Strukturproteine kodierende Nukleotidsequenz, eine virale Verbindungsregion, eine heterologe Sequenz, eine Alphavirus-RNA-Polymerase- Erkennungssequenz und einen Abschnitt von 25 aufeinanderfolgenden polyadenylierten Resten ein, und wird direkt in die Zielzellen durch physikalische Mittel als ein RNA-Molekül, als ein Komplex mit verschiedenen Liposomenformulierungen oder als ein RNA-Ligand-Komplex, einschließlich dem Alphavirus-RNA-Vektormolekül, einer Polykationverbindung wie Polylysin, einem Rezeptor-spezifischen Liganden und gegebenenfalls einem Psoralen-inaktivierten Virus, wie Sendai oder Adenovirus, eingeführt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Verpackungszellinien und Erzeuger- bzw. Herstellerzellinien, welche zur Erzeugung bzw. Herstellung rekombinanter Alphaviruspartikel geeignet sind, bereit. Solche Verpackungs- oder Herstellerzellinien können entweder aus Säugern oder Nicht-Säugern stammen (z. B. Insektenzellen wie Moskitozellen).
  • Eine breite Vielzahl von Alphaviren kann innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Charakteristische Beispiele schließen Aura, Venezelan Equine Encephalitis, Fort Morgan, Ross River, Semliki Forest Virus und Mayaro ein.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen offensichtlich werden. Zusätzlich werden verschiedene Zitate unten dargestellt, welche detaillierter bestimmte Verfahren und Zusammensetzungen beschreiben (z. B. Plasmide, etc.).
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Sindbis-Virus-Genomorganisation.
  • Fig. 2 ist eine Darstellung, welche ein Verfahren zur Amplifikation eines Sindbis- RNA-Genoms durch RT-PCR beschreibt.
  • Fig. 3A-H stellen die Sequenz eines typischen eukaryotischen "Layered Vektor Initiation System", abgeleitet aus Sindbis (siehe auch SEQ. ID Nr. 89), dar.
  • Fig. 4 ist eine schematische Darstellung eines Sindbis-Basisvektors und eines Sindbis-Luziferasevektors.
  • Fig. 5 ist eine Darstellung der Sindbis-Helfervektor-Konstruction.
  • Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Expression und Isolierung eines Sindbis-Luziferasevektors erläutert.
  • Fig. 7 ist eine Darstellung einer Methode zur Modifikation einer Sindbis- Verbindungsregion.
  • Fig. 8 ist eine schematische Darstellung der Sindbis-Verpackungs- Expressionskassetten.
  • Fig. 9 ist ein Balkendiagramm, welches die Sindbis-Luziferase-Vektorverpackung in LTR/Sind/BspE-Zellen darstellt.
  • Fig. 10 ist eine schematische Darstellung, wie Astroviren oder andere heterologe Viren verwendet werden können, um Sindbis-Strukturproteine zu exprimieren.
  • Fig. 11 ist eine schematische Darstellung des Mechanismus zur Aktivierung einer funktionsunfähigen viralen Verbindungsregion bzw. viralen Verbindungsregion mit verminderter Funktion durch "RNA loop-out" bzw. RNA-Entwindung.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Vor der weiteren Beschreibung der Erfindung kann es für deren Verständnis hilfreich sein, Definitionen von bestimmten Begriffen zuerst darzustellen, welche hierin später verwendet werden.
  • "Alphavirus-Vektorkonstrukt bezieht sich auf ein Assembly, welches befähigt ist, zur Expression einer Sequenz(en) oder eines Gens(en) von Interesse zu führen. Das Vektorkonstrukt sollte einen 5'-Promotor einschließen, welcher zur Initiation der viralen RNA-Synthese in vitro aus cDNA befähigt ist, eine 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Alphavirus befähigt ist, wie auch eine Sequenz(en), welche, wenn sie exprimiert werden, biologisch aktive Alphavirus-Nicht- Strukturproteine kodieren (d. h., NSP1, NSP2, NSP3 und NSP4). Zusätzlich sollte das Vektorkonstrukt eine virale Verbindungsregion einschließen, welche in bestimmten Ausführungsformen modifiziert werden kann, um die virale Transkription des subgenomischen Fragments und einer Alphavirus-RNA-Polymerase- Erkennungssequenz zu verhindern, zu inhibieren oder zu reduzieren. Das Vektorkonstrukt kann ebenso (ein) Nukleinsäuremolekül(e), welche(s) eine Größe aufweisen (aufweist), welche ausreicht, um die Produktion von lebensfähigem Virus zu erlauben, sowie eine oder mehrere Restriktionssequenzen einschließen. Wenn das Alphavirus-Vektorkonstrukt ein cDNA-Vektorkonstrukt ist, sollte es zusätzlich einen 5'-Promotor, welcher zur Initiation der viralen RNA-Synthese von cDNA befähigt ist und eine 3'-Sequenz, welche die Termination der Transkription und Spleißerkennung kontrolliert, einschließen.
  • "Expressionskassette" bezieht sich auf ein rekombinant hergestelltes Molekül, welches zur Expression von Alphavirus-Strukturprotein(en) befähigt ist. Die Expressionskassette muß einen Promotor und eine Sequenz, welche (ein) Alphavirus-Strukturprotein(e) kodiert, einschließen. Gegebenenfalls kann die Expressionskassette Transkriptionsterminations-, Spleißerkennungs-, und Polyadenylierungszusatz-Sequenzen einschließen. Bevorzugte Promotoren schließen die CMV- und Adenovirus-VA1-RNA-Promotoren ein. Zusätzlich kann die Expressionskassette selektierbare Marker, wie Neo, SV2-Neo, Hygromycin, Phleomycin, Histidinol und DHFR, enthalten.
  • "Alphaviruspartikel" bezieht sich auf ein Capsid, welches einen Alphavirus-Vektor enthält. Eine Vielzahl von Vektoren kann innerhalb des Alphaviruspartikel, einschließlich der Alphavirus-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung, enthalten sein. Vorzugsweise ist das Alphaviruscapsid in einer Lipid-Doppelschicht, wie eine Zellmembran, in welcher viral-kodierte Proteine eingebettet sind, enthalten.
    • A. QUELLEN FÜR ALPHAVIREN
  • Wie oben angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung Alphavirus-Vektorkonstrukte, Alphaviruspartikel, welche solche Konstrukte enthalten, sowie Verfahren zur Verwendung solcher Vektorkonstrukte und -partikel bereit. Kurz gesagt, Sequenzen, welche das Wildtyp-Alphavirus kodieren, welches zur Verwendung in der Herstellung der oben beschriebenen Vektorkonstrukte geeignet ist, und Partikel können leicht bezüglich der hier bereitgestellten Offenbarung aus natürlich vorkommenden Quellen oder Hinterlegungsstellen (z. B. die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) erhalten werden.
  • Typische Beispiele von geeigneten Alphaviren schließen Aura (ATCC VR-368), Bebaru-Virus (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), Chikungunya-Virus (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), Eastern Equine Enzephalomyelitis-Virus (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR- 924), Getah-Virus (ATCC VR 369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), Mayaro-Virus (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), Mucambo-Virus (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), Pixung- Virus (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), Ross River-Virus (ATCC VR-373, ATCC VR- 1246), Semliki Forest-Virus (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Sindbis-Virus (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), Venezuelan Equine Enzephalomyelitis (ATCC VR-69), Venezuelan Equine Enzephalomyelitis-Virus (ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532), Western Equine Encephalomyelitis (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926) und Y-62-33 (ATCC VR- 375) ein.
    • B. SEQUENZEN, WELCHE DEN WILDTYP-SINDBISVIRUS KODIEREN
  • In einem besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Sequenzen, welche das Wildtyp-Alphavirus kodieren, aus dem Sindbisvirus erhalten werden. Insbesondere in einer Ausführungsform der Erfindung (und wie detaillierter unten in Beispiel 1 beschrieben) kann ein Sindbis-cDNA-Klon durch Verknüpfen des 5'-Endes eines Sindbisvirus-cDNA-Klons mit einem Bakteriophagen-RNA- Polymerasepromotor, und des 3'-Endes des cDNA-Klons mit einem Poly- Adenosin/(Poly-A)-Abschnitt von mindestens 25 Oligonukleotiden erhalten werden. Insbesondere kann die Synthese des ersten cDNA-Stranges von der viralen RNA- Matritze mit einem 3'-Oligonukleotid-Primer mit einer darauffolgenden Sequenz, umfassend eine Enzym-Erkennungssequenz, eine Sequenz von 25 Desoxythymidinnukleotiden und einen Abschnitt von annähernd 18 Nukleotiden, welcher zum 3'-viralen Ende komplementär ist, und mit einem 5'-Primer, welcher Puffernukleotide, eine Enzymerkennungssequenz, einen Bakteriophagen-Promotor und eine Sequenz, welche zum viralen 5'-Ende komplementär ist, enthält, durchgeführt werden. Die Enzym-Erkennungssequenzen, welche auf jedem dieser Primer vorliegen, sollten voneinander unterschiedlich sein und nicht im Sindbisvirus auftreten. Ferner sollte das erste mit dem 3'-Ende des Bakteriophagen-RNA- Polymerasepromotors verknüpfte Nukleotid das erste authentische Nukleotid des RNA-Virus sein. In vitro-transkribierte RNA von dem viralen cDNA-Klon, welcher die oben beschriebene Konstruktion aufweist und durch Verdau mit dem einzigen dT:dA- 3'-distalem Restriktionsenzym linearisiert wird, initiiert nach Einführung in die geeignete eukaryotische Zelle den gleichen Infektionszyklus, welcher für die Infektion mit dem Wildtyp-Virus, aus welchem die cDNA kloniert wurde, charakteristisch ist. Dieser virale cDNA-Klon, welcher RNA ergibt, welche zur Initiation einer Infektion nach in vitro-Transkription befähigt ist, wird unten als "infektiöser cDNA-Klon" bezeichnet.
    • C. HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN ALPHAVIRUS- VEKTORKONSTRUKTEN MIT INAKTIVIERTEN VIRALEN VERBINDUNGSREGIONEN
  • Ein, wie oben beschrieben (oder unter Verwendung von Sequenzen, welche ein aus anderen Quellen erhaltenes Alphavirus kodieren) hergestellter, infektiöser cDNA- Klon kann schnell verwendet werden, um Alphavirus-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung herzustellen. Kurz gesagt, in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Alphavirus-Vektorkonstrukte bereit gestellt, umfassend eine 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Alphavirus befähigt ist, eine Nukleotidsequenz, welche Alphavirus-Nicht-Strukturproteine kodiert, eine virale Verbindungsregion, welche inaktiviert worden ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragmentes verhindert wird und eine Alphavirus- RNA-Polymerase-Erkennungssequenz. Wie es später unten detailierter diskutiert werden wird, transkribieren Alphavirus-Vektorkonstrukte, welche eine inaktivierte virale Verbindungsregion aufweisen, nicht das subgenomische Fragment, was diese für eine große Vielzahl von Anwendungen geeignet macht.
    • 1. RNA-Polymerasepromotor
  • Wie oben angemerkt, werden in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung Alphavirus-Vektorkonstrukte bereit gestellt, welche einen 5'-Promotor enthalten, welcher zur Initiation der viralen RNA-Synthese in vitro von cDNA befähigt ist. Besonders bevorzugte 5'-Promotoren schließen RNA-Polymerasepromotoren, wie T7, T3 und SP6, ein.
    • 2. Sequenzen, welche die Transkription initiieren
  • Wie oben angemerkt, enthalten in den bevorzugten Ausführungsformen die Alphavirus-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung eine 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Alphavirus befähigt ist. Typische Beispiele solcher Sequenzen schließen die Nukleotide 1-60 des Wildtyp-Sindbisvirus (siehe Fig. 3), Nukleotide 10-75 für tRNA-Asparagin (Schlesinger et al., US-Patent Nr. 5,091,309) und 5'-Sequenzen von anderen Togaviren, welche die Transkription initiieren, ein.
    • 3. Alphavirus-Nicht-Strukturproteine
  • Alphavirus-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung sollten ebenso Sequenzen enthalten, welche Alphavirus-Nicht-Strukturproteine (NSP) kodieren. Als ein Beispiel für den Sindbis-Virus gibt es vier Sindbis-Nicht-Strukturproteine, NSP1, NSP2, NSP3 und NSP4, welche Proteine kodieren, welche es dem Virus ermöglichen, selbst zu replizieren. Nicht-Strukturproteine 1 bis 3 (NSP1-NSP3) werden in einer Ausführungsform der Erfindung durch die Nukleotide 60 bis 5.750 des Wildtyp- Sindbisvirus (siehe Fig. 3) kodiert. Diese Proteine werden als ein Polyprotein hergestellt und später in die Nicht-Strukturproteine NSP1, NSP2 und NSP3 gespalten. NSP4 wird in einer Ausführungsform durch die Nukleotide 5.928 bis 7.579 (siehe Fig. 3) kodiert.
  • Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß eine große Vielzahl der Sequenzen, welche Alphavirus-Nicht-Strukturproteine kodieren, zusätzlich zu den oben diskutierten in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können und daher, als in den Bereich der Bezeichnung "Alphavirus-Nicht-Strukturproteine" fallend, betrachtet werden können. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform der Erfindung wegen der Degeneration des genetischen Kodes mehr als ein Codon eine angegebene Aminosäure kodieren. Daher können eine große Vielzahl von Nukleinsäuresequenzen, welche Alphavirus-Nicht-Strukturproteine kodieren, erzeugt werden. In anderen Ausführungsformen der Erfindung kann eine Vielzahl von anderen Nicht-Strukturprotein-Derivaten, einschließlich zum Beispiel, verschiedene Substitutionen, Insertionen oder Deletionen, hergestellt werden, deren Reinergebnis nicht die biologische Aktivität der Alphavirus-Nicht-Strukturproteine verändert. Innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus- Nicht-Strukturproteine in toto als biolgisch aktiv betrachtet, falls sie die Selbstreplikation des Vektorkonstrukts fördern. Selbstreplikation, welche sich auf die Replikation der viralen Nukleinsäuren und nicht auf die Produktion von infektiösem Virus bezieht, kann leicht durch eine RNase-Schutz-Untersuchung bestimmt werden, die im Laufe der Zeit ausgeführt wird. Verfahren zur Herstellung solcher Derivate können von einem Fachmann leicht mit der hierin bereit gestellten Offenbarung durchgeführt werden (siehe auch Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
    • 4. Virale Verbindungsregionen
  • In diesem Aspekt der Erfindung schließen die Alphavirus-Vektorkonstrukte ebenso eine virale Verbindungsregion ein, welche inaktiviert worden ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragments verhindert wird. Kurz gesagt, die Alphavirus-virale-Verbindungsregion kontrolliert normalerweise die Transkriptioninitiation des subgenomischen Fragments. Im Falle des Sindbis-Virus beginnt die normale virale Verbindungsregion typischerweise bei ungefähr Nukleotidnummer 7.579 und dehnt sich bis mindestens Nukleotidnummer 7.612 (und möglicherweise darüberhinaus) aus. Als ein Minimum werden die Nukleotide 7.579 bis 7.602 (5'-ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT AGT - SEQ. ID Nr. 1) für die Transkription des subgenomischen Fragments für notwendig gehalten. Diese Region (Nukleotide 7.579 bis 7.602) wird hier später als "minimal junction region core" bzw. "minimaler Verbindungsregionkern" bezeichnet.
  • In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung (und wie unten ausführlicher beschrieben) wird die virale Verbindungsregion inaktiviert, um die virale Transkription des subgenomischen Fragments zu verhindern. Wie innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung verwendet, meint "inaktiviert", daß das Fragment, welches dem Initiationspunkt des subgenomischen Fragments entspricht, wie durch einen RNase-Schutz-Untersuchung gemessen, nicht nachweisbar ist (Typische Tests werden von Melton et al., Nuc. Acids Res. 12: 7.035-7.056, 1984; Calzon et al., Methods in Enz. 152: 611-632, 1987; und Kekule et al., Nature 343: 457-461, 1990 beschrieben).
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird die virale Verbindungsregion durch Verkürzen der viralen Verbindungsregion an Nukleotid 7.597 inaktiviert (d. h., die virale Verbindungsregion wird dann aus der Sequenz, wie in Fig. 3 gezeigt, von Nukleotid 7.579 bis Nukleotid 7.597 bestehen). Diese Verkürzung verhindert die Transkription des subgenomischen Fragments und erlaubt zusätzlich die Synthese der vollständigen NSP1-Region (welche durch die Nukleotide 5.928 bis 7.579 kodiert wird).
  • Wie es für einen Fachmann mit der hierin bereit gestellten Offenbarung offensichtlich sein wird, können ebenso eine große Vielzahl von anderen Deletionen, Substitutionen oder Insertionen gemacht werden, um die virale Verbindungsregion zu inaktivieren. Beispielsweise kann die virale Verbindungsregion in anderen Ausführungsformen der Erfindung weiter in der Region verkürzt werden, welche NSP4 kodiert, wobei die virale Transkription vom subgenomischen Fragment verhindert wird, während die biologische Aktivität von NSP4 aufrechterhalten wird. Alternativ können in anderen Ausführungsformen wegen der Redundanz des genetischen Kodes Nukleotidsubstitutionen in der Sequenz gemacht werden, welche NSP4 kodiert, deren Reineffekt auch nicht die biologische Aktivität von NSP4 verändert, jedoch die Transkription des subgenomischen Fragments verhindert.
    • 5. Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und Poly-A-Schwanz
  • Wie oben anmerkt, sollten Alphavirus-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung auch eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz (ebenso als "Alphavirus-Replikase-Erkennungssequenz" bezeichnet) einschließen. Kurz gesagt, die Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz stellt eine Erkennungssequenz bereit, an welcher der Virus mit der Replikation des Negativstranges beginnt. Eine große Vielzahl von Sequenzen kann als eine Alphavirus-RNA-Polymerase- Erkennungssequenz verwendet werden. Beispielsweise schließen in einer Ausführungsform die Sindbis-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung eine Sindbis-Polymerase-Erkennungssequenz ein, welche durch die Nukleotide 11.647 bis 11.703 (siehe Fig. 3) kodiert wird. In anderen Ausführungsformen ist die Sindbis-Polymerase-Erkennung bis auf die kleinste Region verkürzt, welche immer noch als Erkennungssequenz funktionieren kann (z. B. Nukleotide 11.684 bis 11.703 von Fig. 3).
  • In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann das Vektorkonstrukt zusätzlich einen Poly-A-Schwanz enthalten. Kurz gesagt, der Poly-A-Schwanz kann von jeder Größe sein, welche ausreicht, um die Stabilität im Zytoplasma zu fördern, wodurch die Effizienz der Initiation des viralen Lebenszyklus gesteigert wird. Innerhalb verschiedener Ausführungsformen der Erfindung umfaßt der Poly-A- Schwanz mindestens 10 Adenosinnukleotide und am meisten bevorzugt mindestens 25 Adenosinnukleotide.
    • D. ANDERE ALPHA VIRUS-VEKTORKONSTRUKTE
  • Zusätzlich zu den Vektorkonstrukten, welche allgemein oben beschrieben wurden, kann eine große Vielzahl von anderen Alphavirus-Vektorkonstrukten, unter Verwendung der hierin bereit gestellten Offenbarung, hergestellt werden.
    • 1. Modifizierte virale Verbindungsregionen
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte bereit gestellt, wobei die virale Verbindungsregion modifiziert worden ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragments reduziert ist. Kurz gesagt, die Infektion von Zellen mit Wildtyp-Alphavirus hat normalerweise den Zelltod als ein Ergebnis der reichlichen Viralen Transkription des subgenomischen Fragments, welches von der viralen Verbindungsregion initiiert wird, zur Folge. Dieser große Überschuß von RNA-Molekülen kann die Transkriptionsmaschinerie der infizierten Zelle überschütten, was letztendlich den Tod der Zelle zur Folge hat. In Anwendungen, wo es erwünscht ist, daß die Infektion der Zielzelle eher einen therapeutischen Effekt (z. B. Strangspaltung der Zielnukleinsäure oder verlängerte Expression eines heterologen Proteins) als Zelltod ergeben sollte, können verschiedene Modifikationen des Alphaviruskonstrukts (zusätzlich zur Inaktivierung des Vektorkonstrukts, wie oben beschrieben) gemacht werden, um den Spiegel der viralen Transkription des subgenomischen Fragments zu reduzieren und hierdurch das Leben der Vektor infizierten Targetzelle zu verlängern. Innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung wird die virale Transkription des subgenomischen Fragments als "reduziert" betrachtet, wenn sie weniger subgenomisches Fragment als ein Standard-Wildtyp-Alphavirus (z. B. Sindbis-Virus ATCC Nr. VR-1248), wie durch einen "RNase-Schutztest" bestimmt, liefert.
  • Virale Verbindungsregionen können durch eine Vielzahl von Verfahren modifiziert werden, um den Spiegel der viralen Transkription des subgenomischen Fragments zu reduzieren. Beispielsweise können in einer Ausführungsform der Erfindung wegen der Redundanz des genetischen Kodes Nukleotidsubstitutionen in der viralen Verbindungsregion 7579 bis 7597 gemacht werden, deren Reineffekt nicht die Aminosäuresequenz NSP4 (oder in anderen Ausführungsformen die biologische Aktivität von NSP4) verändert und dennoch den Spiegel der viralen Transkription des subgenomischen Fragments reduziert. Wenn das modifizierte Vektorkonstrukt Nukleotide nach 7597 (z. B. bis 7602 oder 7612) einschließt, können ebenso auch weitere Nukleotidsubstitutionen durchgeführt werden, obwohl, da NSP1 bei 7597 endet, solche Substitutionen nicht auf der genetischen Redundanz basieren müssen. Typische Beispiele der modifizierten viralen Verbindungsregionen werden unten detaillierter in Beispiel 3 beschrieben.
    • 2. Tandem-virale-Verbindungsregionen
  • In anderen Aspekten der Erfindung werden Alphavirus-Vektorkonstrukte bereit gestellt, welche eine 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Alphavirus befähigt ist, eine Nukleotidsequenz, welche Alphavirus-nicht-strukturelle- Proteine kodiert, eine erste virale Verbindungsregion, welche inaktiviert worden ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragments verhindert ist, eine zweite virale Verbindungsregion, welche modifiziert worden ist, so daß die virale Transkription des genomischen Fragmentes reduziert ist, und eine Alphavirus-RNA- Polymerase-Erkennungssequenz umfassen. Solche Vektorkonstrukte werden als "Tandem"-Vektorkonstrukte bezeichnet, weil sie sowohl eine erste inaktivierte (oder "funktionsunfähige") virale Verbindungsregion als auch eine zweite modifizierte (oder "synthetische") virale Verbindungsregion umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung folgt der inaktivierten Verbindungsregion direkt die zweite modifizierte virale Verbindungsregion.
  • In Anwendungen, wo ein niedriger Spiegel der subgenomischen Transkription benötigt wird, kann ein minimaler Verbindungsregion-Kern stromabwärts im Tandem zu der inaktivierten Verbindungsregion insertiert sein. Um stufenweise den Spiegel der subgenomischen Transkription für den gewünschten Effekt zu steigern, können die Sequenzen, welche zu der gesamten Verbindungsregion korrespondieren, an die Tandem-Verbindungsregion in Inkrementen angefügt werden.
    • 3. Das Adenovirus-E3-Gen
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Adenovirus-E3-Gen in ein Tandem- Vektorkonstrukt, welches der zweiten viralen Verbindungsregion folgt, insertiert, um die HLA-Expression in Alphavirus-infizierten Zellen herunter zu regulieren. Kurz gesagt sind in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung wiederholte Impfungen eines Gentherapeutikums in dasselbe Individuum erwünscht. Wiederholte Impfungen mit Alphaviren, wie das Sindbis-Virus, können jedoch zur Entwicklung von spezifischen Antikörpern oder zellvermittelter Immunantwort gegen virale Sindbis- Nicht-Strukturproteine (NSP) führen. Somit kann es notwendig sein, die Wirts- Immunantwort, welche gegen Vektor-spezifische Proteine gerichtet ist, zu mildern, um wiederholte Dosen an das gleiche Individuum zu verabreichen.
  • Daher werden innerhalb einer Ausführungsform der Erfindung Produkte des Adenovirustyp 2-"early region"-Gens 3 verwendet, um die Expression der gesamten Histokompatibilitäts-Antigene, welche auf der Oberfläche der infizierten Zellen exprimiert werden, herunter zu regulieren. Kurz gesagt, das E3 19.000 Dalton (E3/19K) Protein bindet an und bildet einen molekularen Komplex mit Klasse I-H- 2/HLA-Antigenen im endoplasmatischen Reticulum, wobei terminale Glykolisierungswege, welche für die volle Reifung und den anschließenden Transport der Klasse I-H-2/HLA-Antigene an die Zelloberfläche notwendig sind, verhindert werden. In Zielzellen, welche mit einem Alphavirus-Vektor infiziert wurden, welcher das Ad 2 E3-Protein kodiert, findet keine Koexpression der viralen Nicht- Struktur-Proteine in Zusammenhang mit den Klasse 1-Antigenen statt. Somit ist es möglich, wiederholte Dosierungen eines Alphavirus-Vektor, welcher das Ad 2 E3- Protein als eine Komponente seines therapeutischen Palliativum exprimiert, an das gleiche Individuum zu verabreichen. Ein typisches Beispiel für die Verwendung des Adenovirus E3 Gens wird unten in Beispiel 4A detaillierter dargestellt.
    • 4. Das CMV-H301-Gen
  • Andere Methoden können auch verwendet werden, um eine Wirts-Immunantwort gegen virale NSPs zu mildern. Beispielsweise wird in einem anderen Aspekt der Erfindung das humane Cytomegalivirus ("HCMV")-H301-Gen in ein Alphavirus- Vektorkonstrukt, vorzugsweise direkt der zweiten viralen Verbindungsregion in einen Tandem-Vektor folgend, kloniert, um die Wirts-CTL-Antwort, welche gegen virale spezifische Proteine gerichtet ist, welche in Vektor infizierten Zellen exprimiert werden, zu inhibieren.
  • Kurz gesagt, das β2-Microglobulin (β2m)-Protein bindet an die α1-, α2- und α3- Domänen der a-Kette der Klasse I-Haupthistokompatibilitätsmoleküle von höheren Eukaryoten. Das Verhindern der Interaktion zwischen β2m und MHC Klasse I- Produkten macht die infizierten Zellen für zytotoxische T-Zellen nicht erkennbar. Daher, wie unten in Beispiel 4B ausführlicher beschrieben, kann die Expression des HCMV-H301-Genprodukts als eine Komponente eines therapeutischen Palliativum verwendet werden, um die Wirts-Immunantwort gegen virale NSP zu mildern.
    • 5. Retrovirale Verpackungssequenz
  • Innerhalb eines anderen Aspektes der Erfindung wird eine retrovirale Verpackungssequenz in einen Tandem-Vektor insertiert und zwischen der ersten (inaktivierten) viralen Verbindungsregion und der zweiten, modifizierten viralen Verbindungsregion positioniert. Kurz gesagt signalisieren retrovirale Verpackungssequenzen die Verpackung eines RNA-Genoms in einen retroviralen Partikel. Wie unten ausführlicher beschrieben, kann die retrovirale Verpackungssequenz verwendet werden, um einen Alphavirus-Vektor in einen retroviralen Partikel unter Verwendung einer retroviralen Verpackungszellinie zu verpacken. Dies wird ausgeführt, um die Effizienz des Alphavirus-Vektortransfers in eine Alphavirus-Verpackungszellinie zu steigern.
    • 6. Expression verschiedener heterologer Gene
  • Die genomische Länge und subgenomische Länge der mRNAs, welche in Wildtyp- Alphavirus-infizierten Zellen transkribiert werden, sind polycistronisch, kodierend für die vier viralen Nicht-Struktur-Proteine (NSPs) und vier Struktur-Proteine (SPs). Die genomischen und subgenomischen mRNAs werden als Polyproteine translatiert, und die Prozessierung in die individuellen Nicht-Struktur und Struktur-Proteine wird durch posttranslationale proteolytische Spaltung, katalysiert durch Virus-kodierte NSP- und SP-spezifische Proteasen, erreicht.
  • In bestimmten Anwendungen des hierin beschriebenen Alphavirusvektors ist die Expression von mehr als einem heterologen Gen erwünscht. Um beispielsweise metabolische Krankheiten, wie das Gaucher's Syndrom, zu behandeln, können mehrfache Verabreichungen von Alphavirus-Vektoren oder -Partikeln benötigt werden, weil die Lebensdauer des therapeutischen Palliativum begrenzt sein kann. Deshalb kann es bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung erwünscht sein, in einer Zielzelle das Ad2 E3-Gen (siehe Beispiel 4) neben einem therapeutischen Palliativum, wie das Glukocerbrocidase-Gen (siehe Beispiel 11), kozuexprimieren. Im Wildtyp-Virus wird jedoch die polycystronische Botschaft des Strukturproteins ("SP") in ein einzelnes Polyprotein translatiert, welches anschließend in individuelle Proteine durch Spaltung mit SP-kodierten Proteasen prozessiert wird. Somit benötigt die Expression von verschiedenen heterologen Genen aus einer polycistronischen Botschaft einen vom Wildtyp-Virus unterschiedlichen Mechanismus, da das SP- Proteasegen oder die Peptide, welche bei der Spaltung erkannt werden, nicht in der Ersetzungsregion des Alphavirus-Vektors vorliegen.
  • Deshalb können in einer Ausführungsform der Erfindung Alphavirus-Vektoren durch Anordnen von geeigneten Signalen zwischen den Cistronen entweder des Ribosomen-Hindurchlesens oder des internen Ribosomen-Eintritts konstruiert werden. Ein solches typisches Verfahren zur Expression verschiedener heterologer Gene ist unten in Beispiel 5 dargestellt.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Anordnen von Signalen, welche entweder das Ribosomen-Hindurchlesen oder den internen Ribosomeneintritt direkt stromabwärts zu der funktionsunfähigen Vektorverbindungsregion bzw. Vektorverbindungsregion mit verminderter Funktion pKSSINBVdlJR fördern, beschrieben (siehe Beispiel 3). In dieser Vektorkonfiguration kann die Synthese von subgenomischer Botschaft nicht stattfinden; die heterologen Proteine werden jedoch von genomisch langer mRNA entweder durch ribosomales Durchlesen (Scannen) oder internen Ribosomeneintritt exprimiert. Relativ zum Wildtyp würde der niedrige Spiegel der viralen Transkription mit diesem Alphavirus- Vektor das Leben der infizierten Targetzelle verlängern.
  • In einer noch anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Anordnen von Signalen, welche entweder das Ribosomen-Hindurchlesen oder den internen Ribosomen-Eintritt fördern, direkt stromabwärts zu den pKSSDINBVdlJRsjr- oder pKSSINBV-Vektoren beschrieben. Kurz gesagt, weil die Synthese der subgenomischen mRNA in Zellen stattfindet, welche mit pKSSINBVdlJRsjr und pKSSINBV-Vektoren infiziert sind, erlaubt das Anordnen von entweder einer Ribosomen-Hindurchlesen-Sequenz oder einer internen Ribosomen-Eintritts- Sequenz zwischen die zwei heterologen Genen die Translation von beiden Proteinen, welche durch die subgenomische mRNA-polycistronische Botschaft kodiert werden. Weiter können zusätzliche heterologe Gene in der subgenomischen mRNA-Region angeordnet werden, vorausgesetzt, daß ein geeignetes Translations- Initationssignal am 5'-Ende des translationalen AUG-Startcodons liegt. Die Zahl der heterologen Gen(e), welche, wie hier beschrieben, in die subgenomische mRNA- Region insertiert werden können, wird nur durch die Verpackungsbeschränkung des Vektors begrenzt.
  • Verschiedene Sequenzen, welche entweder das Ribosomen-Hindurchlesen, Capunabhängige Translation oder internen Ribosomeneintritt erlauben, können in Sindbis-Vektoren pKSSINBVdlJR, pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc in die, wie oben diskutierten, Konfigurationen angeordnet werden. Die Quelle für diese translationalen Kontrollsequenzen sind die Picornaviren, Polio und EMCV, die 5'- nicht-kodierende Region des humanen Immunglobulinschwere-Ketten-bindenden Proteins und eine synthetische Sequenz von mindestens 15 Basenpaaren, welche zum Teil mit der Kozak-Konsensussequenz für effiziente Translationsinitiation korrespondiert. Obwohl hier nicht im Detail beschrieben, können diese Signale, welche die Translationsinitiation beeinflussen, ebenso stromabwärts zu der Verbindungsregion und zwischen heterologenen Gene in allen modifizierten Verbindungsregion-Vektoren, wie in Beispiel 3 beschrieben, angeordnet werden.
    • 7. Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukte
  • Wie oben angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung auch Alphavirus-cDNA- Vektorkonstrukte bereit. Beispielsweise werden in einem Aspekt der Erfindung Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukte bereit gestellt, welche einen 5'-Promotor, welcher zur Initiation der Synthese von viraler RNA von cDNA befähigt ist, gefolgt durch eine 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Alphavirus befähigt ist, eine Nukleotidsequenz, welche Alphavirus-Nicht-Struktur-Proteine kodiert, eine virale Verbindungsregion, welche entweder aktiv ist oder welche inaktiviert worden ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragments verhindert ist, eine Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und eine 3'-Sequenz, welche die Transkriptionsterminierung kontrolliert, umfassen. In verschiedenen Ausführungsformen kann die virale Verbindungsregion modifiziert werden, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragments eher nur reduziert als inaktiviert ist. In anderen Ausführungsformen kann eine zweite virale Verbindungsregion, welche der ersten inaktivierten viralen Verbindungsregion folgt, insertiert werden, wobei die zweite virale Verbindungsregion modifiziert ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragments reduziert ist.
  • Verschiedene Aspekte der Alphavirus-cDNA-Konstrukte sind oben diskutiert worden, einschließlich der 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Alphavirus befähigt ist, die Nukleotidsequenz, welche Alphavirus-Nicht- Strukturproteine kodiert, die virale Verbindungsregion, welche inaktiviert worden ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragments verhindert ist, und die Alphavirus-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz. Zusätzlich sind oben auch modifizierte Verbindungsregionen und Tandem-Verbindungsregionen diskutiert worden. Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukte unterscheiden sich jedoch durch das Hinzufügen eines 5'-Promotors, welcher zur Initiation der viralen RNA-Synthese von cDNA befähigt ist. Typische Beispiele von geeigneten Promotoren schließen den lac- Promotor, Metallthion-Promotor, CMV-Promotor und Hitzeschock-Promotor ein.
  • Wie oben anmerkt, schließt das Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukt ebenso eine 3'- Sequenz ein, welche die Transkriptionstermination kontrolliert. Ein typisches Beispiel einer solchen Sequenz ist unten in Beispiel 2 detaillierter dargestellt.
    • 8. Gewebespezifische Expression
  • Innerhalb eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus- Vektorkonstrukte bereit gestellt, welche zur Expression einer gewünschten heterologen Sequenz nur in einem ausgewählten Gewebe befähigt sind. Ein solches typisches Beispiel wird in Fig. 11 gezeigt. Kurz gesagt, wie in Fig. 11A gezeigt, wird ein rekombinanter Alphavirus-Vektor derart konstruiert, daß nach Einführung des Vektors (Fig. 11A) in die Targetzelle interne invertierte Wiederholungssequenzen, welche die transkriptionalen Kontrollregionen (z. B. modifizierte Verbindungsregion) begrenzen, sich entwinden (siehe Fig. 11B), wodurch die virale Transkription der subgenomischen Sequenzen ("G.O.I.") von der synthetischen Verbindungsregion verhindert wird.
  • Andererseits kann die Aktivierung des Vektors erreicht werden, wenn die invertierten Wiederholungen entworfen sind, auch an eine spezifische RNA-Sequenz zu hybridisieren, welche charakteristisch für ein ausgewähltes Gewebe oder Zelltyp ist. So eine zelluläre RNA unterbricht die funktionsunfähige Stammschleifenstruktur bzw. Stammschleifenstruktur mit verminderter Funktion, wodurch die Bildung einer mehr stabileren sekundären Stammschleifenstruktur (Fig. 11C und 11D) erlaubt wird. Diese sekundäre Stammschleifenstruktur erlaubt die Transkription der subgenomischen Botschaft durch Anordnen der Verbindungsregion hinter ihre korrekte Positionskonfiguration.
  • Alphavirus-Vektoren mit voller Länge können auch unter Verwendung der sekundären Stammschleifenstruktur, unter Vorteilsnahme der Fähigkeit der viralen Polymerase Matrizen zu wechseln, während der Synthese des Negativstranges, unter Verwendung von einem Stranghoppingmechanismus, welcher als Kopienwahl bzw. "copy choice" (King, RNA genetics 11, CRC Press, Inc., Boca Raton Fla., Domingo et al. (Editors), Seiten 150-185, 1988) bezeichnet wird, transkribiert werden. Wenn eine einzelne erfolgreiche Runde der Transkription stattgefunden hat, enthält das resultierende RNA-Transkript keine invertierten Wiederholungen, weil sie als ein Ergebnis des Polymerase-"copy choice"-Ereignisses deletiert sind. Dieses neu synthetisierte RNA-Molekül fungiert jetzt als primäres RNA-Vektortranskript, welches wie jeder andere, vorher beschriebene, funktionsunfähige genomische Alphavirus-Vektor bzw. genomischer Alphavirus-Vektor mit verminderter Funktion transkribiert und exprimiert wird. In dieser RNA-Vektorkonfiguration kann gewebe- oder zellspezifische Aktivierung des funktionsunfähigen Sindbis-Vektors bzw. Sindbis-Vektors mit verminderter Funktion erreicht werden, wenn spezifische RNA- Sequenzen, welche nur in der Targetzelle oder den Gewebetypen vorliegen, für den Entwurf der invertierten Wiederholungen verwendet werden. Auf diese Weise können Alphaviren, wie Sindbis, unter Verwendung ähnlicher invertierter, wie oben beschriebene, Sequenzen konstruiert werden, gewebespezifische Expressionsvektoren zu sein.
  • Die Verwendung dieses Vektorsystems, um gewebespezifische Expression zu erreichen, ermöglicht es, einen therapeutischen Alphavirus-Vektor oder -Partikel systemisch in einem Patienten zu verteilen. Wenn der Vektor eine Zelle infizieren sollte, welche nicht die geeigneten RNA-Spezies exprimiert, ist der Vektor nur zur Expression von Nicht-Strukturproteinen und nicht der Gene von Interesse befähigt. Eventuell wird der Vektor ungefährlich degradiert werden.
  • Die Verwendung der oben beschriebenen Vektoren ermöglicht tatsächlich die gewebespezifische Expression für eine Vielzahl von möglichen therapeutischen Anwendungen, einschließlich zum Beispiel Zielorientierung der Vektoren zur Behandlung von verschiedenen Typen von Krebs. Dieses Grundprinzip beruht auf der spezifischen Expression von tumorspezifischen Markern, wie das karcinoembryogene Tumor-spezifische Antigen (CEA) und der Alpha-Fetoprotein- Tumormarker. Kurz gesagt, die Verwendung solcher Tumor-spezifischer RNA, um spezifische Tumoren zu treffen, erlaubt die, unten diskutierte, Tumor-spezifische Expression von toxischen Molekülen, Lymphokinen oder Arzneimittelvorstufen. Solche Verfahren können für eine breite Vielzahl von Tumoren, einschließlich zum Beispiel Darm-, Lungen-, Brust-, Eierstock-, Blasen- und Prostatakrebs, verwendet werden, weil all diese Tumoren CEA exprimieren. Eine typische Beschreibung dieser Vektoren, welche zur Verwendung in diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wird unten in Beispiel 15 ausführlicher dargestellt.
  • Kurz gesagt, war CEA einer der ersten Tumor-spezifischen Marker, der zusammen mit dem Alpha-Fetoproteinmarker beschrieben wurde. CEA ist ein normales Glykoprotein im Embryogewebe der Eingeweide, Pankreas und Leber während der ersten zwei Trimester der fötalen Entwicklung (Pathologic Basis od Disease, 3. Auflage 1984, Robbins et al., Autor). Bis vor kurzem wurde angenommen, daß CEA spezifisch für Adenokarzinome des Darms ist. Mit der darauffolgenden Entwicklung von sensitiveren Radioimmuno-Untersuchungen wurde jedoch deutlich, daß CEA im Plasma von vielen endodermal abgeleiteten Krebsen, insbesonders pankreatische, gastritische und bronchogene, vorliegt.
  • In den verwandten Aspekten der vorliegenden Erfindung können Alphaviruszellspezifische Expressionsvektoren konstruiert werden, um virale Antigene, Ribozyme, Antisense-Sequenzen oder immunstimulierende Faktoren wie gamma- Interferon (γ-IFN) oder IL-2 zur zielorientierten Behandlung von Virus-infizierten Zelltypen zu exprimieren. Insbesondere, um Alphavirus-Vektoren auf fremde Organismen oder pathogen-infizierte Zellen zu richten, können invertierte Wiederholungen des Alphavirus-Vektors ausgewählt werden, um an jede Pathogenspezifische RNA, zum Beispiel Zielzellen, welche mit Pathogenen wie HIV, CMV, HBV, HPV und HSV infiziert sind, zu hybridisieren.
  • In einem noch anderen Aspekt der Erfindung können spezifische Organgewebe für die Behandlung von gewebespezifischen metabolischen Krankheiten unter Verwendung von Genersatztherapien getroffen werden. Beispielsweise ist die Leber ein wichtiges Zielgewebe, weil sie für viele metabolische Körperfunktionen verantwortlich ist und mit vielen metabolischen genetischen Krankheiten assoziiert ist. Solche Krankheiten umfassen viele Glykogen-Speicherkrankheiten, Phenylketonurie, Gaucher's Krankheit und familiäre Hypercholesterinämie. Gegenwärtig gibt es viele leberspezifische Enzyme und Marker, welche sequenziert worden sind, welche verwendet werden können, um angemessene invertierte Wiederholungen der alphaviralen Vektoren zu konstruieren. Solche leberspezifischen cDNAs schließen Sequenzen ein, welche kodieren: S- Adenosylmethioninsynthetase (Horikawa et al., Biochem. Int. 25: 81, 1991), Lecithin: Cholesterinacyltransferase (Rogne et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148: 161, 1987); ebenso wie andere leberspezifische cDNAs (Chin et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 478: 120, 1986). Solche leberspezifischen Alphavirus-Vektoren können verwendet werden, um Low Density- bzw. Niedrigdichte-Lipoproteinrezeptoren (Yamamoto et al., Cell 39: 27, 1984) auf Leberzellen zur Behandlung von familiärer Hypercholesterolemie (Wilson et al., Mol. Biol. Med. 7: 223, 1990) zu übertragen.
    • E. HETEROLOGE SEQUENZEN
  • Wie oben anmerkt, können eine große Vielzahl von Nukleotidsequenzen durch die Alphavirus-Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung getragen werden. Vorzugsweise sollten die Nukleotidsequenzen eine Größe aufweisen, welche ausreicht, um die Produktion von lebensfähigem Virus zu erlauben. Innerhalb des Zusammenhanges der vorliegenden Erfindung wird die Herstellung jedes meßbaren Titers von infektiösem Virus auf empfänglichen Monolayern als "Herstellung von lebensfähigem Virus" betrachtet. Dies kann als ein Minimum ein Alphavirus- Vektorkonstrukt sein, welches keine zusätzliche heterologe Sequenz enthält. In anderen Ausführungsformen kann das Vektorkonstrukt jedoch zusätzlich heterologe oder fremde Sequenzen enthalten. In den bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die heterologe Sequenz eine heterologe Sequenz von mindestens etwa 100 Basen, 2 kb, 3,5 kb, 5 kb, 7 kb oder sogar eine heterologe Sequenz von mindestens über 8 kb.
  • Wie es für einen Fachmann mit der hierin bereit gestellten Offenbarung offensichtlich sein wird, ist die Effizienz der Verpackung und daher der Virustiter bis zu einem gewissen Ausmaß von der Größe der Sequenz, die verpackt wird, abhängig. Daher können, um die Effizienz der Verpackung und die Herstellung von lebensfähigem Virus zu vergrößern, zusätzliche nicht-kodierende Sequenzen zu dem Vektorkonstrukt hinzugefügt werden. Darüber hinaus kann es in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung erwünscht sein, den Virustiter zu steigern oder zu verringern. Diese Steigerung oder Verringerung kann durch Vergrößern oder Verringern der Größe der heterologen Sequenz, und daher der Effizienz der Verpackung, erreicht werden.
  • Eine große Vielzahl von heterologen Sequenzen kann in das Vektorkonstrukt, einschließlich zum Beispiel Sequenzen, welche Palliativa, wie Lymphokine, Toxine, Arzneimittelvorstufen, Antigene, welche eine Immunantwort stimulieren, Ribozyme und Proteine, welche eine Immunantwort fördern oder hemmen, kodieren, ebenso wie Antisense-Sequenzen (oder Sense-Sequenzen für "Antisense"-Anwendungen"), eingefügt werden. Wie oben angemerkt, können in den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung die hierin bereit gestellten Alphavirus- Vektorkonstrukte zwei oder mehrere heterologe Sequenzen enthalten (und in bestimmten Ausführungsformen exprimieren).
    • 1. Lymphokine
  • In einer Ausführungsform der Erfindung kodiert die heterologe Sequenz ein Lymphokin. Kurz gesagt, wirken Lymphokine, um Immuneffektorzellen zu vermehren, zu aktivieren oder zu differenzieren. Typische Beispiele von Lymphokinen schließen gamma-Interferon, Tumornekrose Faktor, IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF, CSF-1 und G-CSF ein.
  • In verwandten Ausführungsformen der Erfindung kodiert die heterologe Sequenz einen immunmodulierenden Cofaktor. Kurz gesagt, wie innerhalb des Zusammenhanges der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich "immunmodulierender Cofaktor" auf Faktoren, welche, wenn sie durch eine oder mehrere der Zellen hergestellt werden, welche an einer Immunantwort teilnehmen, oder wenn sie exogen zu den Zellen hinzugefügt werden, eine Immunantwort verursachen, welche unterschiedlich in Qualität oder Stärke von der, welche in Abwesenheit des Cofaktors stattfinden würde, ist. Die Qualität oder Stärke der Antwort kann durch eine Vielzahl von Tests gemessen werden, welche jemandem mit Stand der Technik bekannt sind, einschließlich zum Beispiel in vitro-Tests, welche die zelluläre Proliferation messen (z. B. ³H-Thymidin-Aufnahme) und in vitro- zytotoxische Tests (welche z. B. &sup5;¹Cr-Freisetzung messen) (siehe Warner et al., AIDS Res. And Human Retroviruses 7: 645-655, 1991).
  • Typische Beispiele der immunmodulierenden Cofaktoren schließen ein: alpha- Interferon (Finter et al., Drugs 42(5): 749-765, 1991; U.S. Patent Nr. 4,892,743; U.S. Patent Nr. 4,966,843; WO 85/02862; Nagata et al., Nature 284: 316-320, 1980; Familetti et al., Methods in Enz. 78 : 387-394, 1981; Twu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2046-2050, 1989; Faktor et al., Onkogene 5: 867-872, 1990), beta-Interferon (Seif et al., J. Virol. 65: 664-671, 1991), gamma-Interferone (Radford et al., American Society of Hepatology: 2008-2015, 1991; Watanabe et al., PNAS 86: 9456-9460, 1989; Gansbacher et al., Cancer Research 50: 7820-7825, 1990; Maio et al., Can. Immunol. Immunother. 30: 34-42, 1989; U.S. Patent Nummern 4,762,791 und 4,727,138), G-CSF (U.S. Patent Nummern 4,999,291 und 4,810,643), GM-CSF (WO 85/04188), TNFs (Jayaraman et al., J. Immunology 144: 942-951, 1990), Interleukin- 2 (IL-2) (Karupiah et al., J. Immunology 144: 290-298, 1990; Weber et al., J. Exp. Med. 166: 1716-1733, 1987; Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172: 1217-1224, 1990; U.S. Patent Nr. 4,738,927), IL-4 (Tepper et al., Cell 57: 503-512, 1989; Golumbek et al., Science 254: 713-716, 1991; U.S. Patent Nr. 5,017,691), IL-6 (Brakenhofet al., J. Immunol. 139: 4116-4121, 1987; WO 90/06370), IL-12, IL-15, ICAM-1 (Altman et al., Nature 338: 512-514, 1989), ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHC Klasse 1 Moleküle, MHC Klasse 2 Moleküle, β-&sub2;Microglobulin, Chaperone, CD3, B7/BB1, MHC-verknüpfte Transporterproteine oder deren Analoge.
  • Die Wahl, welchen immunmodulierenden Cofaktor innerhalb des Alphavirus- Vektorkonstruktes zu enthalten, kann auf bekannten therapeutischen Effekten dieses Cofaktors basieren oder experimentell bestimmt werden. Beispielsweise ist in chronischen Hepatitis-B-Infektionen alpha-Interferon gefunden worden, welches sehr effektiv in der Kompensation eines immunologischen Defizits eines Patienten sein soll und hierdurch die Genesung von der Krankheit fördern soll. Alternativ kann ein geeigneter immunmodulierender Cofaktor experimentell bestimmt werden. Kurz gesagt, werden zuerst Blutproben aus Patienten mit einer Hepatitiskrankheit entnommen. Periphere Blutlymphocyten (PBLs) werden in vitro mit autologen oder zu HLA-passenden Zellen (z. B. EBV-transformierte Zellen) restimuliert und mit einem Alphavirus-Vektorkonstrukt transduziert, welches zur Expression eines immunogenen Teils eines Hepatitis-Antigens und des immunmodulierenden Cofaktors führt. Stimulierte PBLs werden als Effektoren in einem CTL-Assay mit HLA-passenden, transduzierten Zellen als Ziele verwendet. Eine Steigerung der CTL-Antwort, welche in demselben Assay, ausgeführt unter Verwendung eines HLA- passenden Stimulators und Zielzellen, welche mit einem Vektor transduziert sind, welcher das Antigen allein kodiert, gesehen wird, weist auf einen nützlichen immunmodulierenden Cofaktor hin. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der immunmodulierende Cofaktor gamma-Interferon besonders bevorzugt.
  • Ein anderes Beispiel für einen immunmodulierenden Cofaktor ist der B7/BB1 costimulierende Faktor. Kurz gesagt, benötigt die Aktivierung der vollen funktionellen Aktivität der T-Zellen zwei Signale. Ein Signal wird durch die Interaktion des Antigen- spezifischen T-Zell-Rezeptors mit Peptiden, welche an Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Moleküle gebunden sind, bereit gestellt, und das zweite Signal wird, bezogen auf die Costimulation, auf die T-Zellen durch Antigen- präsentierende Zellen übertragen. Kurz gesagt, das zweite Signal wird für die Interleukin-2 (IL-2)-Herstellung durch T-Zellen benötigt und scheint in die Wechselwirkung von B7/BB1-Molekülen auf Antigen-präsentierende Zellen mit CD28- und CTLA-4-Rezeptoren auf T-Lymphozyten involviert zu sein (Linsley et al., J. Exp. Med., 173: 721-730, 1991a und J. Exp. Med., 174: 561-570, 1991). In einer Ausführungsform der Erfindung kann B7/BB1 in die Tumorzellen eingeführt werden, um eine Costimulation von CD8&spplus;-T-Zellen zu verursachen, so daß die CD8&spplus;-T-Zellen genug IL-2 herstellen, um zu expandieren und voll aktiviert zu werden. Diese CD8&spplus;- T-Zellen können Tumorzellen töten, welche kein B7 exprimieren, da die Costimulation nicht länger für die weitere CTL-Funktion benötigt wird. Vektoren, welche sowohl den costimulierenden B7/BB1-Faktor als auch zum Beispiel ein immunogenes HBV-Kernprotein exprimieren, können unter Verwendung von Verfahren, welche hierin beschrieben sind, hergestellt werden. Zellen, welche mit diesen Vektoren transduziert sind, werden noch effektivere Antigen-präsentierende Zellen sein. Die HBV-kernspezifische CTL-Antwort wird durch die voll aktivierten CD8&spplus;-T-Zellen über den costimulierenden Liganden B7/BB1 verstärkt werden.
    • 2. Toxine
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kodiert die heterologe Sequenz ein Toxin. Kürz gesagt, wirken Toxine, um direkt das Zellwachstum zu hemmen. Typische Beispiele von Toxinen schließen ein: Ricin (Lamb et al., Eur. J. Biochem. 148: 265-270, 1985); Abrin (Wood et al., Eut. J. Biochem. 198: 723-732, 1991; Evenson et al., J. of Biol. Chem. 266: 6848-6852, 1991; Collins et al., J. of Biol. Chem. 265: 8665-8669, 1990; Chen et al., Fed. of Eur. Biochem. Soc. 309: 115-118, 1992); Diphteritoxin (Tweten et al., J. Biol. Chem. 260 : 10392-10394, 1985), Choleratoxin (Mekalanos et al., Nature 306: 551-557, 1983; Sanchez und Holmgren, PNAS 86: 481-485, 1989), Gelonin (Stirpe et al., J. Biol. Chem. 255: 6947-6953, 1980), Pokeweed (Irwin, Pharmac. Ther. 21: 371-387, 1983), antivirales Protein (Barbieri et al., Biochem. J. 203: 55-59, 1982; Irvin et al., Arch. Biochem. & Biophys. 200: 418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem. & Biophys. 169: 522-528, 1975), Tritin, Shigella Toxin (Calderwood et al. PNAS 84: 4364-4368, 1987; Jackson et al., Microb. Path. 2: 147-153, 1987), Pseudomonas Exotoxin A (Carroll und Collier, J. Biol. Chem. 262: 8707-8711, 1987), Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVTK) (Field et al., J. Gen. Virol. 49: 115-124, 1980) und E. coli. Guaninphosphoribosyl-Transferase.
    • 3. Arzneimittelvorstufen bzw. Prodrugs
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung kodiert die heterologe Sequenz eine "Prodrug". Kurz gesagt, wie innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich "Arzneimittelvorstufen" auf ein Genprodukt, welches eine Verbindung mit geringer oder keiner Zytotoxizität in ein toxisches Produkt aktiviert. Typische Beispiele solcher Genprodukte schließen HSVTK und VZVTK ein, welche selektiv bestimmte Purin-Arabinoside und substituierte Pyrimidinverbindungen monophosphorylieren, wobei diese in zytotoxische oder zytostatische Metaboliten überführt werden. Noch spezifischer phosphoryliert die Exposition der Arneimittel Ganciclovir, Acyclovir oder jeder ihrer Analoge (z. B. FIAU, FIAC, DHPG) gegenüber HSVTK das Arzneimittel in seine korrespondierende aktive Nukleotidtriphosphat-Form.
  • Typische Beispiele von anderen Arzneimittelvorstufen, welche innerhalb des Zusammenhangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein: E. coli-Guaninphosphoribosyl-Transferase, welche Thioxanthin in das toxische Thioxanthin-Monophosphat umwandelt (Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987); alkalische Phosphatase, welche inaktive phosphorylierte Verbindungen, wie Mitomycin-Phosphat und Doxorubicin-Phosphat, in toxische dephosphorylierte Verbindungen umwandelt, fungale (z. B. Fusarium oxysporum) oder bakterielle Cytosin-Desaminase, welche 5-Fluorcytosin in die toxische Verbindung 5-Fluoruracil umwandelt (Mullen, PNAS 89: 33, 1992); Carboxypeptidase G2, welche Glutaminsäure von para-N-bis-(2-Chloroethyl)-Aminobenzoylglutaminsäure abspaltet, wodurch ein toxischer Benzoesäuresenf (engl. "benzoic acid mustard" erzeugt wird; und Penicillin-V-Amidase, welche Phenoxyacetabid-Derivate von Doxorubicin und Melphalan in toxische Verbindungen umwandelt (siehe allgemein, Vrudhula et al., J. of Med. Chem. 36(7): 919-923, 1993; Kern et al., Canc. Immun. Immunther. 31 (4): 202-206, 1990).
    • 7. Quellen für heterologe Sequenzen
  • Sequenzen, welche die oben beschriebenen Proteine kodieren, können schnell von einer Vielzahl von Quellen, einschließlich zum Beispiel Hinterlegungsstellen, wie die American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), oder aus kommerziellen Quellen, wie die British Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, England), erhalten werden. Typische Beispiele schließen ein: BBG 12 (enthaltend das GM-CSF-Gen, welches das reife Protein von 127 Aminosäuren kodiert); BBG 6 (welches gamma-Interferon-kodierende Sequenzen enthält), ATCC Nr. 39656 (welches TNF-kodierende Sequenzen enthält), ATCC Nr. 20663 (welches alpha- Interferon-kodierende Sequenzen enthält), ATCC Nummern 31902, 31902 und 39517 (welche beta-Interferon-kodierende Sequenzen enthalten), ATCC Nr. 67024 (welches eine Sequenz enthält, welche Interleukin-1b kodiert); ATCC Nummern 39405, 39452, 39516, 39626 und 39673 (welche Interleukin-2-kodierende Sequenzen enthalten); ATCC Nummern 59399, 59398 und 67326 (welche Interleukin-3-kodierende Sequenzen enthalten); ATCC Nr. 57592 (welches Interleukin-4-kodierende Sequenzen enthält), ATCC Nummern 59394 und 59395 (welche Interleukin-5-kodierende Sequenzen enthalten) und ATCC Nr. 67153 (welche Interleukin-6-kodierende Sequenzen enthält).
  • Sequenzen, welche wie oben beschrieben veränderte zelluläre Komponenten kodieren, können schnell aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden. Beispielsweise können Plasmide, welche Sequenzen enthalten, die ein verändertes zelluläres Produkt kodieren, aus einer Hinterlegungsstelle, wie die American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), oder aus kommerziellen Quellen, so wie Advanced Biotechnologies (Columbia, Maryland), erhalten werden. Typische Beispiele von Plasmiden, welche irgendeine der oben beschriebenen Sequenzen enthalten, schließen ATCC Nr. 41000 (welches eine G nach T Mutation in dem 12. Codon von ras enthält) und ATCC Nr. 41049 (welches eine G nach A Mutation in dem 12. Codon enthält) ein.
  • Alternativ können Plasmide, welche normale zelluläre Komponenten kodieren, ebenso aus Hinterlegungssstellen, wie die ATCC, erhalten werden (siehe zum Beispiel ATCC Nr. 41001, welches eine Sequenz enthält, welche das normale ras- Protein kodiert; ATCC Nr. 57103, welches abl kodiert; und ATCC Nummern 59120 oder 59121, welche den bcr-Locus kodieren) und mutiert werden, um veränderte zelluläre Komponenten auszubilden. Verfahren zur Mutagenese bestimmter Sequenzen können schnell durch Verwenden von im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden (siehe Sambrook et al., supra., 15.3 et seq.). Insbesondere Punktmutationen von normalen zellulären Komponenten wie ras können leicht durch ortsspezifische Mutagenese eines bestimmten Codons, zum Beispiel Codons 12, 13 oder 61, durchgeführt werden.
  • Sequenzen, welche die oben beschriebenen viralen Antigene kodieren, können ebenso aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden. Beispielsweise können molekular geklonte Genome, welche das Hepatitis-B-Virus kodieren, aus Quellen, wie American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), erhalten werden. Beispielsweise enthält ATCC Nr. 45020 die gesamte genomische DNA von Hepatitis B (extrahiert aus gereinigten Dane-Partikeln) (siehe Fig. 3 von Blum et al., TIG 5(5): 154-158, 1989) in der Bam HI-Stelle des pBR322 (Moriarty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2606-2610, 1981).
  • Alternativ können cDNA-Sequenzen, welche die oben beschriebenen heterologen Sequenzen kodieren, aus Zellen erhalten werden, welche die Sequenzen exprimieren oder enthalten. Kurz gesagt, in einer Ausführungsform wird die mRNA von einer Zelle, welche das Gen von Interesse exprimiert, mit reverser Transkriptase unter Verwendung von Oligonukleotid-dT- oder Random-Primern revers transkribiert. Die Einzelstrang-cDNA kann dann durch PCR (siehe U.S. Patent Nummern 4,683,202; 4,683,195 und 4,800,159) amplifiziert werden. Siehe ebenso PCR Technologie: Principles and Applications for DNA Amplifikation, Erlich (Ed.), Stockton Press, 1989) unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, welche komplementär zu irgendeiner Stelle der gewünschten Sequenzen sind. Insbesondere wird eine doppelsträngige DNA durch Erhitzen in Gegenwart von hitzestabiler Taq- Polymerase, Sequenzspezifischen DNA-Primern, dATP, dCTP, dGTP und dTTP denaturiert. Doppelsträngige DNA ist hergestellt, wenn die Synthese vollständig ist. Dieser Zyklus kann mehrere Male wiederholt werden, wobei sich eine faktorielle Amplifikation der gewünschten DNA ergibt.
  • Sequenzen, welche die oben beschriebenen Proteine kodieren, können auch, zum Beispiel in einem Applied Biosystems Inc. DNA Synthesizer (z. B. APB DNA- Synthesizer Modell 392 (Foster City, CA)), synthetisiert werden.
    • G. SIND BIS-VERPACKUNGSZELLINIEN
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden Alphavirus- Verpackungszellinien bereit gestellt. Insbesondere in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Alphavirus-Verpackungszellinien bereit gestellt, wobei die viralen Strukturproteine in trans aus einem stabil integrierten Expressionsvektor bereit gestellt werden. Anschließende Transfektion oder Infektion von Alphavirus-Vektor- RNA-Transkripten erzeugt eine Alphavirus-Vektor-herstellende Zellinie. Beispielsweise werden in einer Ausführungsform der Erfindung ursprünglich Alphavirus-RNA-Vektormoleküle unter Verwendung eines T6-in vitro-RNA- Polymerasesystems hergestellt, um von einem cDNA-Klon, welcher das Gen von Interesse und die Alphavirus-Nicht-Strukturproteine kodiert, zu transkribieren. Die Vektor-RNA kann dann in eine Alphavirus-Verpackungszellinie transfiziert werden, wo die Vektor-RNA-Transkripte mit hohen Spiegeln replizieren und anschließend durch die viralen Strukturproteine verpackt werden, um infektiöse virale Partikel zu ergeben. Durch die Natur der ausgedehnten Länge des Alphavirus-cDNA-Moleküls ist der in vitro-Transkriptionsprozeß ineffizient. Zusätzlich können nur 1%-10% der Zellen, welche auf einer Petrischale enthalten sind, erfolgreich transfiziert werden. Folglich können, um die Ausführung und den Titer der Vektor-Herstellungszellinie zu optimieren, zwei aufeinanderfolgende Zyklen des Gentransfer ausgeführt werden.
  • Um dies durchzuführen, kann der Vektor zuerst in eine primäre Alphavirus- Verpackungszellinie transfiziert werden. Diese transfizierte Zellinie produziert dann niedrige Titer der infektiösen viralen Partikel in den Kulturüberständen. Diese infektiösen Überstände werden dann verwendet, um eine frische Monoschicht aus Alphavirus-Verpackungszellen zu transduzieren. Die Infektion des Alphavirus-Vektor in die Verpackungszellinie wird vor der Transfektion wegen ihrer höheren RNA- Transfereffizienz in die Zellen und der optimierten biologischen Plazierung des Vektors in der Zelle bevorzugt. Dieser zweistufige Weg führt zu einer höheren Expression und höheren Titern des verpackten infektiösen rekombinanten Sindbis- Vektors.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können die Alphavirus-Partikel scheitern, die gleiche Verpackungszellinie zu transduzieren, weil die Zellinie vergrößerte zelluläre Hüllproteine herstellt, welche zelluläre Rezeptoren für das Anheften von Alphavirus-Vektoren blockieren. In solchen Fällen kann ein zweiter Typ der Alphavirus-viralen-Partikel erzeugt werden, welcher fähig ist, die Alphavirus- Verpackungszellen zu infizieren. Dieser zweite Typ der viralen Partikel muß durch eine Verpackungszellinie hergestellt werden, welche als "Hopping-Zellinie" bekannt ist, welche transiente Vektorpartikel als Ergebnis der Transfektion mit in vitro transkribierten Alphavirus-RNA-Vektortranskripten herstellt. Diese Hopping-Zellinie wird konstruiert, um den Hüllentropismus des transient hergestellten Vektorpartikels durch Bereitstellen von alternativen viralen Hüllproteinen umzustellen, welche die Alphavirus-Vektoren in einem Verfahren, welches als Pseudotypisierung bezeichnet wird, auf unterschiedliche zelluläre Rezeptoren umstellen. Kürzlich sind zwei Ansätze für Alphavirus-Vektorpartikel-Pseudotypisierung gefunden worden. Der erste Ansatz besteht aus einer Alphavirus-Verpackungszellinie (oben beschrieben), welcher das vesikuläre Stomatitisvirus-G-Protein (VSV-G) koexprimiert. Für die VSV-G- Pseudotypisierung ist gezeigt worden, daß sie eine große Vielzahl von Zelltypen infiziert (Marsh, Adv. Virus Res. 36: 107-151, 1989). Der zweite Ansatz zur Herstellung von pseudotypisierten Alphavirus-Vektorpartikeln ist, retrovirale Verpackungszellinien zu verwenden (z. B. WO 92/05266), welche retrovirale gag/pol- und env-Sequenzen enthalten, welche befähigt sind, einen Alphavirus-RNA-Vektor, welcher eine retrovirale Verpackungssequenz enthält, zu verpacken.
  • In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden stabil integrierte Alphavirus- DNA-Expressionsvektoren verwendet, um das Alphavirus-Vektor-RNA-Molekül herzustellen, welches die Fähigkeit zur Selbstreplikation beibehält. Dieser Ansatz kann sich als nützlich erweisen, um hohe Spiegel der Expression über lange Zeiträume der Kultivierung beizubehalten, weil der integrierte DNA-Vektor konstitutiv unveränderte RNA-Vektoren exprimiert. Bei dieser Konfiguration werden die kürzlich von einem Plasmid, welches die SP6-RNA-Polymerase-Erkennungssquenz enthält, transkribierten Vektoren durch eine angemessene Promotorsequenz, welche durch die verwendete Elternzellinie definiert wird, ersetzt. Diese Plasmidsequenz kann auch einen auswählbaren Marker enthalten, welcher unterschiedlich zu diesen ist, welche verwendet werden, um die Verpackungszellinie zu erzeugen. In dieser Konfiguration werden die DNA-basierten Alphavirus-Vektoren durch Transfektion, wie kürzlich beschrieben, in die Verpackungszellinie eingeführt, gefolgt durch Verdünnungsklonierung, um Zellinien mit der höchsten Titer-Produktion zu finden.
    • H. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON ALPHAVIRUS-VEKTOREN 1. Immunstimulation
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren können zum Verabreichen eines Alphavirus-Vektorkonstrukts verwendet werden, welches befähigt ist, infektiöse, krebsartige, autoimmune oder Immunkrankheiten zu verhindern, zu hemmen, zu stabilisieren oder aufzuheben. Typische Beispiele solcher Krankheiten schließen virale Infektionen, wie HIV, HBV, HTLV I, HTLV II, CMV, EBV und HPV, Melanome, Diabetes, Abstoßungsreaktion, Alzheimer und Herzkrankheiten ein.
  • Noch spezifischer können die Zusammensetzungen und Verfahren zur Stimulation einer Immunantwort (entweder humoral oder zellvermittelt) gegen ein pathogenes Agens verwendet werden, so daß das pathogene Agens entweder getötet oder gehemmt wird. Typische Beispiele von pathogenen Agentien schließen Bakterien, Pilze, Parasiten, Viren und Krebszellen ein.
  • Wenn das pathogene Agens ein Virus ist, können Verfahren zur Stimulation einer spezifischen Immunantwort und Hemmung der viralen Ausbreitung durch Verwendung von rekombinanten Alphaviruspartikeln verwendet werden, welche entworfen wurden, um ein Vektorkonstrukt zu liefern, welches zu der Expression eines Antigens oder einer modifizierten Form davon in empfindlichen Zielzellen führt, welches entweder befähigt ist, (1) eine Immunantwort gegen das virale Antigen zu initiieren oder (2) die virale Ausbreitung durch Besetzen der zellulären Rezeptoren, welche für virale Wechselwirkung benötigt werden, zu verhindern. Die Expression des Vektor-Nukleinsäure-kodierten Proteins kann transient oder über die Zeit stabil sein. Wo eine Immunantwort gegenüber einem pathogenen Antigen zu stimulieren ist, wird das rekombinante Alphavirus vorzugsweise so entworfen, daß es eine modifizierte Form des Antigens exprimiert, welche eine Immunantwort stimuliert und welche eine verminderte Pathogenizität relativ zu dem nativen Antigen aufweist. Diese Immunantwort wird erreicht, wenn die Zellen Antigene in korrekter Art und Weise präsentieren, d. h. im Zusammenhang mit den MHC-Klasse-I- und/oder -II- Molekülen zusammen mit den zusätzlichen bzw. Hilfsmolekülen, wie CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1 oder Analoge davon (z. B. Altmann et al., Nature 338: 512, 1989). Von mit Alphavirus-Vektoren infizierten Zellen wird erwartet, dies effizient zu tun, weil sie eng die echte virale Infektion nachahmen, und weil sie: (a) befähigt sind, nicht replizierende Zellen zu infizieren, (b) nicht in das Wirtszellgenom integrieren, (c) nicht mit irgendwelchen lebensbedrohenden Erkrankungen assoziiert sind und (d) hohe Spiegel von heterologem Protein exprimieren. Wegen dieser Unterschiede können Alphavirus-Vektoren leicht als sichere virale Vektoren angenommen werden, welche in gesunden Individuen zur Verwendung als Vakzine verwendet werden können.
  • Dieser Aspekt weist einen weiteren Vorteil über anderen Systemen auf, von denen erwartet wird, daß sie in ähnlicher Weise derart funktionieren, daß die vorhandenen Zellen voll lebensfähig und gesund sind und niedrige Spiegel von viralen Antigenen, relativ zu heterologen Genen, welche exprimiert werden, aufweisen. Dies bietet einen deutlichen Vorteil, weil die exprimierten antigenen Epitope durch selektive Klonierung der Subfragmente des Gens für das Antigen in dem rekombinanten Alphavirus verändert werden können, was zu Antworten gegen die immunogenen Epitope führt, welche anderenfalls durch immundominante Epitope überschattet werden können. Ein solcher Ansatz kann auf die Expression eines Peptids mit verschiedenen Epitopen, einem oder mehreren von verschiedenen Proteinen abgeleiteten Epitopen ausgedehnt werden. Darüber hinaus erlaubt dieser Aspekt die effiziente Stimulierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), welche gegen antigene Epitope und Peptidfragmente von Antigenen, welche durch Subfragmente von Genen kodiert werden, gerichtet sind, durch intrazelluläre Synthese und Assoziation dieser Peptidfragmente mit MHC-Klasse-I-Molekülen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um hauptimmundominante Epitope für die CTL-Induktion zu kartieren.
  • Eine Immunantwort kann auch durch Transfer auf eine geeignete Immunzelle (so wie ein T-Lymphozyt) des Gens für einen spezifischen T-Zell-Rezeptor, welcher das Antigen von Interesse (im Zusammenhang mit einem geeigneten MHC-Molekül, falls notwendig) erkennt, für ein Immunglobulin, welches ein Antigen von Interesse erkennt oder für ein Hybrid aus den zweien, welches eine CTL-Antwort in Abwesenheit des MHC-Zusammenhanges liefert, erreicht werden. Daher können rekombinante Alphavirus-infizierte Zellen als ein Immunstimulans, Immunmodulator oder Vakzine verwendet werden.
  • Die Verfahren zur Herstellung von Hemmungspalliativa können verwendet werden, wobei die Alphavirus-Vektoren defekte interferierende virale Strukturproteine liefern und exprimieren, welche den viralen Zusammenbau hemmen. Solche Vektoren können defekte gag-, pol-, vnv- oder andere virale Partikelproteine oder Peptide kodieren, und diese würden in dominanter Weise den Zusammenbau von viralen Partikeln hemmen. Dies findet statt, da die Wechselwirkung von normalen Untereinheiten des viralen Partikels durch die Wechselwirkung mit defekten Untereinheiten gestört ist. Verfahren für die Expression von hemmenden Peptiden oder Proteinen, welche für virale Protease spezifisch sind, können verwendet werden. Kurz gesagt, spaltet die virale Protease die viralen gag und gag/pol-Proteine in eine Reihe von kleineren Peptiden. Das Fehlen dieser Spaltung führt in allen Fällen zu einer kompletten Hemmung der Herstellung von infektiösen retroviralen Partikeln. Als ein Beispiel ist von der HIV-Protease bekannt, eine Aspartylprotease zu sein, und diese sind dafür bekannt, durch Peptide, hergestellt aus Aminosäuren von Proteinen oder Analogen, gehemmt zu werden. Vektoren, um HIV zu hemmen, werden eine oder mehrere fusionierte Kopien von solchen Peptidinhibitoren exprimieren.
  • Eine andere Ausführungsform schließt das Liefern von Tumor-Suppressorgenen ein, welche, wenn sie deletiert, mutiert sind oder nicht in einem Zelltyp exprimiert werden, zur Tumorgenese in diesem Zelltyp führen. Wiedereinführung des deletierten Gens mit Hilfe eines viralen Vektors führt zur Regression des Tumorphenotyps in diesen Zellen. Beispiele solcher Krebse sind das Retinoplastom und der Wilms-Tumor. Da Bösartigkeit als eine Hemmung der zellulären terminalen Differenzierung, verglichen mit normalem Zellwachstum, betrachtet werden kann, führt die Übertragung des Alphavirus-Vektors und die Expression der Genprodukte, welche auch zur Differenzierung eines Tumors führten sollten, im allgemeinen zur Regression.
  • In noch einer anderen Ausführungsform stellt der Alphavirus-Vektor einen therapeutischen Effekt durch Kodierung eines Ribozyms (ein RNA-Enzym) bereit (Haseloff und Gerlach, Nature 334: 585, 1989), welches RNA-Moleküle, welche mit einer pathogenen Funktion korrespondieren, spaltet und daher inaktiviert. Da Ribozyme durch Erkennung einer spezifischen Sequenz in der Ziel-RNA funktionieren und diese Sequenz normalerweise 12 bis 17 Basenpaare aufweist, erlaubt dies die spezifische Erkennung von bestimmten RNA-Spezies wie einer RNA oder eines retroviralen Genomes. Zusätzliche Spezifität kann in einigen Fällen durch Herstellen dieses, bedingt toxischen Palliativum (siehe unten), erreicht werden.
  • Ein Weg zur Steigerung der Effektivität von hemmenden Palliativas ist, virale hemmende Gene in Verbindung mit der Expression von Genen zu exprimieren, welche die Wahrscheinlichkeit der Infektion der resistenten Zelle durch ein infrage kommendes Virus steigern. Das Ergebnis ist ein nicht-produktives "Sackgassen"- Ereignis, welches um produktive Infektionsereignisse konkurrieren würde. Im spezifischen Fall von HIV, können Vektoren geliefert werden, welche die HIV- Replikation (durch Expression von Antisense tat, etc., wie oben beschrieben) hemmen und auch Proteine wie CD4 überexprimieren, welche für die Infektion benötigt werden. Auf diese Weise wirkt eine relativ kleine Zahl von Vektor infizierten HIV-resistenten Zellen als ein "Ausguß" oder "Magnet" für zahlreiche, nicht produktive Fusionsereignisse mit freiem Virus oder viral infizierten Zellen.
    • 2. Blockierende Agentien
  • Viele Infektionskrankheiten, Krebs, Autoimmunerkrankungen und andere Krankheiten schließen die Wechselwirkung von viralen Partikeln mit Zellen, Zellen mit Zellen oder Zellen mit Faktoren ein. In viralen Infektionen treten die Viren gewöhnlicherweise in die Zellen über Rezeptoren auf der Oberfläche der empfänglichen Zellen ein. Bei Krebserkrankungen können die Zellen nicht angemessen oder nicht auf alle Signale von anderen Zellen oder Faktoren antworten. Bei Autoimmunerkrankungen gibt es eine unangemessene Erkennung der "Selbst"-Marker. In der vorliegenden Erfindung können solche Wechselwirkungen durch Herstellung eines Analogs oder irgendeines Partners in einer Interaktion in vivo blockiert werden.
  • Diese Blockierungshandlung kann intrazellulär, auf der Zellmembran oder extrazellulär stattfinden. Die Blockierungswirkung auf einen viralen, oder insbesondere einen Alphavirus-Vektor, welcher ein Gen zur Blockierung eines Agens trägt, kann entweder vom Inneren einer empfänglichen Zelle oder durch Sekretion einer Version eines blockierenden Proteins vermittelt werden, um lokal die pathogene Wirkung zu blockieren.
  • Im Fall von HIV sind die zwei Agentien der Wechselwirkung gp120/gp41-Hüllproteine und das CD4-Rezeptormolekül. Deshalb würde ein geeigneter Blocker ein Vektorkonstrukt, welches entweder ein HIV-env Analog exprimiert, das den HIV- Eintritt ohne Verursachen von pathogenen Effekten blockiert, oder ein CD4- Rezeptor-Analoges sein. Das CD4-Analoge würde ausgeschieden werden und fungieren, um Nachbarzellen zu schützen, während das gp 120/gp 41 ausgeschieden wird oder nur intrazellulär hergestellt wird, um so nur die Vektorenthaltenden Zellen zu schützen. Es kann vorteilhaft sein, humane Immunglobulinschwere Ketten oder andere Komponenten zu CD4 hinzuzufügen, um die Stabilität oder die Komplementlyse zu vergrößern. Übertragen eines Alphavirus-Vektors, welcher solch ein Hybrid-lösliches CD4 kodiert, auf einen Wirt, ergibt eine kontinuierliche Versorgung mit einem stabilen Hybridmolekül. Die Effizienz der Behandlung kann durch Messung von gewöhnlichen Indikatoren des Fortschreitens der Krankheit, einschließlich Antikörperspiegel, virale Antigenproduktion, infektiöse HIV-Spiegel oder Spiegel von nicht-spezifischen Infektionen untersucht werden.
    • 3. Expression von Palliativa
  • Techniken, ähnlich zu den oben beschriebenen, können verwendet werden, um rekombinante Alphaviren mit Vektorkonstrukten herzustellen, welche die Expression eines Agens (oder "Palliativums") herbeiführen, welches zur Hemmung einer Funktion eines pathogenen Agens oder Gen befähigt ist. In der vorliegenden Erfindung meint "befähigt zur Hemmung einer Funktion", daß das Palliativum entweder direkt die Funktion hemmt oder es indirekt tut, zum Beispiel durch Überführen eines Agens, welches in den Zellen vorliegt, welches normalerweise nicht eine Funktion des pathogenen Agens hemmen würde, in eines, welches es tut. Beispiele solcher Funktionen für virale Krankheiten schließen Adsorption, Replikation, Genexpression, Zusammenbau und Austritt des Viruses aus infizierten Zellen ein. Beispiele für solche Funktionen für Krebszellen oder krebsfördernde Wachstumsfaktoren schließen Überlebensfähigkeit, Zellreplikation, veränderte Empfänglichkeit zu externen Signalen (zum Beispiel Kontaktinhibition) und Fehlen der Herstellung oder Herstellung von mutierten Formen von Anti-Onkogenproteinen ein.
    • (a) Inhibierende Palliativa
  • Das Alphavirus-Vektorkonstrukt kann verwendet werden, um die Expression eines Gens herbeizuführen, welches mit der Funktion eines pathogenen Agens, zum Beispiel in viralen oder malignen Erkrankungen, wechselwirken kann. Eine solche Expression kann entweder im wesentlichen kontinuierlich oder eine Antwort auf das Vorliegen in der Zelle eines anderen Agens sein, welches entweder mit der pathogenen Bedingung oder mit einem spezifischen Zelltyp (ein "identifizierendes Agens") assoziiert ist. Zusätzlich kann die Vektorübertragung durch zielorientierten Vektoreintritt kontrolliert werden, welcher, wie oben beschrieben, spezifisch für den gewünschten Zelltyp (zum Beispiel eine Virus-infizierte oder maligne Zelle) ist.
  • Ein Verfahren zur Verabreichung ist die Leukophorese, bei welcher ungefähr 20% der PBLs eines Individuums zu irgendeiner Zeit entfernt werden und in vitro manipuliert werden. Daher können etwa 2 · 10&sup9; Zellen behandelt werden und ersetzt werden. Wiederholte Behandlungen können ebenso ausgeführt werden. Alternativ kann das Knochenmark behandelt und erlaubt werden, den wie oben beschriebenen Effekt, zu vervielfachen. Zusätzlich können Verpackungszellinien, welche einen Vektor herstellen, direkt in ein Subjekt injiziert werden, wobei eine kontinuierliche Produktion des rekombinanten Virions erlaubt wird.
  • In einer Ausführungsform können Alphavirus-Vektoren, welche RNA komplementär zu den pathogenen Schlüssel-Gentranskripten exprimieren (zum Beispiel ein virales Genprodukt oder ein aktiviertes zelluläres Onkogen), verwendet werden, um in einem Protein die Translation von diesem Transkript, wie die Hemmung der Translation des HIV-tat-Proteins, zu hemmen. Da die Expression dieses Proteins für die virale Replikation erforderlich ist, wären Zellen, welche den Vektor enthalten, gegenüber HIV-Replikation resistent sind.
  • In einer zweiten Ausführungsform, wo das pathogene Agens ein einzelsträngiger Virus mit einem Verpackungssignal ist, wird RNA komplementär zu dem viralen Verpackungssignal (z. B. ein HIV-Verpackungssignal, wenn das Palliativum gegen HIV gerichtet ist) exprimiert, so daß die Assoziation dieser Moleküle mit dem viralen Verpackungssignal im Falle von Retroviren die Stammschleifenbildung oder die tRNA-Primerbindung, welche für eine geeignete Einkapselung oder Replikation des Alphavirus-RNA-Genom benötigt wird, hemmt.
  • In einer dritten Ausführungsform kann ein Alphavirus-Vektor eingeführt werden, welcher ein Palliativum exprimiert, welches zur selektiven Hemmung der Expression eines pathogenen Gens oder eines Palliativum befähigt ist, welches zur Hemmung der Aktivität eines Proteins befähigt ist, welches durch das pathogene Agens hergestellt wird. Im Fall von HIV ist ein Beispiel ein mutiertes tat-Protein, welchem die Fähigkeit fehlt, die Expression von der HIV-LTR zu trans-aktivieren und (in einer transdominanten Weise) mit der normalen Funktion des tat-Proteins zu interferieren. Eine solche Mutante ist für das HTLV-II-tat-Protein ("XII Leu&sup5;"-Mutant, siehe Wachsman et al., Science 235: 674, 1987) identifiziert worden. Ein mutierter Trans- Repressor tat sollte die Replikation mehr hemmen als für einen mutierten Repressor in HSV-1 gezeigt worden ist (Friedmann et al., Nature 335: 452, 1988).
  • Ein solches transkriptionelles Repressorprotein kann in der Gewebekultur unter Verwendung beliebiger Virus-spezifischer transkriptioneller Promotoren, deren Expression durch ein Virus-spezifisches transaktivierendes Protein (wie oben beschrieben) stimuliert wird, ausgewählt werden. Im speziellen Fall von HIV wird die Zellinie, welche das HIV-tat-Protein und das HSVTK-Gen exprimiert, welche durch den HIV-Promotor angetrieben werden, in Anwesenheit von ACV sterben. Wenn jedoch eine Reihe von mutierten tat-Genen in das System eingeführt wird, wird eine Mutante mit angemessenen Eigenschaften (d. h. der die Transkription durch den HIV- Promotor in Anwesenheit des Wildtyp-tats unterdrückt) wachsen und ausgewählt werden. Das mutierte Gen kann dann aus diesen Zellen reisoliert werden. Eine Zellinie, welche mehrere Kopien des bedingt letalen Vektor/tat-Systems enthält, kann verwendet werden, um sicherzustellen, daß die überlebenden Zellklone nicht durch endogene Mutationen in diesen Genen verursacht werden. Eine Serie von zufällig mutierten tat-Genen wird dann in diese Zellen unter Verwendung eines "rettungsfähigen" Alphavirus-Vektors (d. h. einer, der das mutierte tat-Protein exprimiert und einen bakteriellen Ursprung der Replikation und Drogenresistenzmarker für das Wachstum und die Selektion in Bakterien enthält) eingeführt. Dies erlaubt, eine große Reihe von zufälligen Mutationen zu bewerten und erlaubt ein leichtes anschließendes molekulares Klonieren der gewünschten mutierten Zellinie. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Mutationen in einer Vielzahl von viralen transkriptionellen Aktivator/viralen Promotor-Systemen für potentielle antivirale Therapien zu identifizieren und zu verwenden.
    • 4. Bedingt toxische Palliativa
  • Ein anderer Ansatz zur Hemmung eines pathogenen Agens ist, ein Palliativum zu exprimieren, welches toxisch für die Zelle ist, die den pathogenen Zustand exprimiert. In diesem Fall sollte die Expression des Palliativum vom Vektor durch die Gegenwart einer Wesenheit begrenzt werden, welche mit dem pathogenen Agens, wie eine spezifische virale RNA-Sequenz, verknüpft ist, welche den pathogenen Status identifiziert, um eine Zerstörung der nicht-pathogenen Zellen zu verhindern.
  • In einer Ausführungsform dieser Verfahrens trägt ein rekombinanter Alphavirus- Vektor ein Vektorkonstrukt, welches (wie oben diskutiert) ein toxisches Gen enthält, welches von einem zellspezifisch-reagierenden Vektor exprimiert wird. Auf diese Weise werden schnell replizierende Zellen, welche RNA-Sequenzen enthalten, welche zur Aktivierung des zellspezifischen reagierenden Vektors befähigt sind, bevorzugt durch das toxische Agens, zerstört, welches durch das Alphavirus- Vektorkonstrukt hergestellt wird.
  • In ähnlicher Weise zu der vorherigen Ausführungsform kann das Alphavirus- Vektorkonstrukt ein Gen für Phosphorylierung, Phosphoribosylierung, Ribosylierung oder einen anderen Metabolimus des Purin- oder Pyrimidin-basierten Arzneimittels tragen. Dieses Gen darf kein Äquivalent in Säugerzellen aufweisen und könnte aus einem Organismus, wie ein Virus, Bakterie, Pilz oder Protozoe stammen. Ein Beispiel für dies würde das E. coli-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-Genprodukt sein, welches in Anwesenheit von Thioxanthin tödlich ist (siehe Besnard et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987). Bedingt tödliche Genprodukte dieses Typs (oben auch als "Arzneimittelvorstufen" bezeichnet) finden Anwendung in vielen gegenwärtig bekannten Purin- oder Pyrimidin-basierten Antikrebs-Arzneimitteln, welche häufig die intrazelluläre Ribosylierung oder Phosphorylierung benötigen, um wirksame toxische Mittel zu werden. Das bedingt tödliche Genprodukt könnte auch ein nicht-toxischer Arzneistoff, welcher kein Purin- oder Pyrimidin-Analog ist, in eine zytotoxische Form metabolisieren (siehe Searle et al., Brit. J. Cancer 53: 377-384, 1986).
  • Säugerviren neigen im allgemeinen dazu, "immediate early"-Gene aufzuweisen, welche für die anschließende transkriptionelle Aktivierung von anderen viralen Promotorelementen notwendig sind. RNA-Sequenzen von dieser Natur sind ausgezeichnete Kandidaten zur Aktivierung von Alphavirus-Vektor-intrazellulären Signalen (oder "identifizierenden Agentien") der viralen Infektion. Deshalb könnten bedingt tödliche Gene, welche von Alphavirus-zellspezifischen Vektoren exprimiert werden, welche auf diese viralen "immediate early" Genprodukte reagieren, spezifisch Zellen töten, welche mit einem beliebigen speziellen Virus infiziert sind. Zusätzlich, da die humanen α- und β-Interferon Promotorelemente transkriptionell als Antwort auf die Infektion mit einer breiten Vielzahl von nicht-vermrandten Viren aktiviert sind, könnte die Einführung von Vektoren, welche ein bedingt letales Genprodukt, wie HSVTK beispielsweise, als Antwort auf die Interferonherstellung exprimieren, die Zerstörung der Zellen ergeben, welche mit einer Vielzahl von verschieden Viren infiziert sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen rekombinanten Alphavirus-Vektor bereit, welcher ein Vektorkonstrukt trägt, das zur Expression eines Genprodukts führt, welches zur Aktivierung eines auf andere Weise inaktiven Vorläufers in einen aktiven Hemmstoff des pathogenen Agens befähigt ist. Beispielsweise kann das HSVTK- Genprodukt verwendet werden, um noch effektiver mögliche antivirale Nukleosidanaloge, wie AZT oder ddC, zu metabolisieren. Das HSVTK-Gen kann unter der Kontrolle eines zellspezifisch reagierenden Vektors exprimiert werden und in diese Zelltypen eingeführt werden. AZT (und andere nukleosidische antivirale Substanzen) müssen durch den zellulären Mechanismus in die Nukleotidtriphosphatform metabolisiert werden, um spezifisch die retrovirale reverse Transkriptase und deshalb die HIV-Replikation zu hemmen (Furman et al., Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 83: 8333-8337, 1986). Die konstitutive Expression von HSVTK (ein Nukleosid und Nukleosidkinase mit sehr breiter Substratspezifität) ergibt einen effektiveren Metabolismus dieser Arzneimittel in ihre biologisch aktive Nukleotidtriphosphatform. Die AZT- oder ddC-Therapie wird hierdurch effektiver, was niedrigere Dosierungen, geringere allgemeine Toxizität und höhere Wirksamkeit gegen die produktive Infektion erlaubt. Zusätzlich werden Nukleosidanaloge, deren Nukleotidtriphosphatform eine Selektivität für retrovirale Transkriptase zeigt, aber als ein Ergebnis der Substratspezifität der zellulären Nukleosid- und Nukleotidkinase nicht phosphoryliert werden, wirksamer gemacht.
  • Verabreichung dieser Alphavirus-Vektoren an humane T-Zellen und Makrophagen/Monozytenzellinien kann ihre Resistenz gegen HIV in Anwesenheit von AZT und ddC, verglichen mit derselben Zelle ohne retrovirale Vektorbehandlung, vergrößern. Behandlung mit AZT würde bei niedrigeren als normalen Spiegeln toxische Nebenwirkungen vermeiden, aber noch immer wirksam die Ausbreitung von HIV verhindern. Der Behandlungsverlauf würde wie für den Hemmstoff bzw. Blocker beschrieben sein.
  • Der rekombinante Alphavirus-Vektor kann ein Gen tragen, welches ein Produkt spezifiziert, welches selbst nicht toxisch ist, aber wenn es prozessiert oder durch ein Protein, wie eine Protease, welche für ein virales oder anderes Pathogen spezifisch ist, modifiziert wird, in eine toxische Form überführt wird. Beispielsweise könnte der rekombinante Alphavirus ein Gen tragen, welches ein Pro-Protein für die Ricin-A- Kette kodiert, welches durch Prozessierung durch die HIV-Protease toxisch wird. Noch spezifischer könnte eine synthetische inaktive Pro-Proteinform des Toxins Ricin oder der Diphtherie-A-Kette in die aktive Form durch Anordnung der HIV viralkodierten Protease gespalten werden, sodaß sie ein angemessenes "Pro"-Element erkennt und abspaltet.
  • Das Alphavirus-Konstrukt kann ein "Reporter"-Produkt auf der Oberfläche von Targetzellen als Antwort auf die Anwesenheit eines identifizierenden Agens in den Zellen (wie die Expression eines viralen Gens) exprimieren. Dieses Oberflächenprotein kann durch ein zytotoxisches Agens, wie Antikörper gegen das Reporter-Protein, oder durch zytotoxische T-Zellen erkannt werden. In ähnlicher Weise kann ein solches System als ein Detektionssystem verwendet werden (siehe unten), um einfach diese Zellen mit einem bestimmten Gen zu identifizieren, welches ein identifizierendes Protein exprimiert.
  • Ähnlich kann in einer anderen Ausführungsform ein Oberflächenprotein exprimiert werden, welches selbst therapeutisch vorteilhaft ist. In dem besonderen Fall von HIV kann die Expression des humanen CD4-Protein, speziell in HIV-infizierten Zellen, auf zwei Weisen vorteilhaft sein:
  • 1. Das Binden von CD4 an HIV-env könnte intrazellulär die Bildung von lebensfähigen viralen Partikeln hemmen, etwa wie es für lösliches CD4 gezeigt worden ist, auf den freien Virus zu wirken, aber ohne das Problem der systemischen "Clearance" bzw. "Klärung" und möglicher Immunogenität, weil das Protein membrangebunden bleiben wird und strukturell identisch zu endogenem CD4 ist (zu welchem der Patient immunologisch tolerant sein sollte).
  • 2. Da der CD4/HIV-env-Kompelx als ein Grund für Zelltod angenommen wird, führt die zusätzliche Expression von CD4 (in Anwesenheit eines Überschuß von HIV-env, vorliegend in HIV-infizierten Zellen) zu einem schnelleren Zelltod und hemmt daher die virale Verbreitung. Dies kann besonders für Monozyten und Makrophagen verwendbar sein, welche als Reservoir für die Virusproduktion als ein Ergebnis ihrer relativen Anfälligkeit auf HIV-induzierte Zytotoxizität wirken (welche wiederum offensichtlich wegen des relativen Fehlens von CD4 auf ihren Zelloberflächen ist).
  • In einer anderen Ausführungsform kodiert der Alphavirus-Vektor ein Riboenzym, welches RNA-Moleküle, welche für die Überlebensfähigkeit der Vektor infizierten Zelle essentiell sind, spalten und inaktivieren wird. Durch Abhängigmachen der Ribozymproduktion von einer spezifischen RNA-Sequenz, welche mit einem pathogenen Status, wie HIV-tat, korrespondiert, ist die Zytotoxizität für den pathogenen Status spezifisch.
    • 5. Expression von Markern
  • Die oben beschriebene Technik zur Expression eines Palliativum in einer Zelle als Antwort auf eine spezifische RNA-Sequenz kann auch modifiziert werden, um den Nachweis eines bestimmten Gens in einer Zelle zu ermöglichen, welche ein zu identifizierendes Protein exprimiert (z. B. ein Gen, welches durch einen bestimmten Virusgetargen getragen wird) und folglich den Nachweis von Zellen, die dieses Virus tragen, ermöglicht. Zusätzlich ermöglicht diese Technik den Nachweis von Viren (wie HIV) in einer klinischen Probe von Zellen, welche ein identifizierendes Protein, welches mit dem Virus assoziiert ist, tragen.
  • Diese Modifikation kann durch Bereitstellen eines Genoms, welches ein Produkt kodiert, dessen Gegenwart schnell identifiziert werden kann (das "Markerprodukt"), in einem Alphavirus-Vektor durchgeführt werden, welcher auf die Anwesenheit des zu identifizierenden Proteins in den infizierten Zellen reagiert bzw. antwortet. Beispielsweise stellt HIV, wenn es geeignete Zellen infiziert, tat und rev her. Die Indikator-Zellen können daher mit einem Genom (wie durch Infektion mit einem geeigneten rekombinanten Alphavirus) bereit gestellt werden, welches ein Markergen, wie das alkalische Phosphatasegen, β-Galactosidasegen oder Luziferasegen, kodiert, welches durch das rekombinante Alphavirus nach Aktivierung durch das tat- und/oder rev-RNA-Transkript exprimiert wird. Im Falle der β- Galactosidase oder alkalischen Phosphatase ergibt das Aussetzen der Zellen gegenüber Substratanalogen eine Farb- oder Fluoreszenzänderung, falls die Probe HIV-positiv ist. Im Falle der Luziferase ergibt das Aussetzen der Probe gegenüber Luciferin eine Lumineszenz, wenn die Probe HIV-positiv ist. Für intrazelluläre Enzyme wie β-Galactosidase kann der Virustiter direkt durch Zählen der gefärbten oder fluoreszierenden Zellen oder durch Herstellen von Zellextrakten und Ausführen einer geeigneten Untersuchung gemessen werden. Für die membrangebundene Form der alkalischen Phosphatase kann der Virustiter ebenso durch Durchführen einer Enzymuntersuchung auf der Zelloberfläche unter Verwendung eines Fluoreszenzsubstrats gemessen werden. Für sezernierte Enzyme, wie eine konstruierte Form, der alkalischen Phosphatase werden kleine Proben der Kulturüberstände auf ihre Aktivität untersucht, was eine kontinuierliche Überwachung einer einzelnen Kultur über die Zeit erlaubt. Daher können verschiedene Formen dieses Markersystems für verschiedene Zwecke verwendet werden. Diese schließen ein Zählen des aktiven Virus oder empfindliches und einfaches Messen der viralen Ausbreitung in einer Kultur und die Hemmung dieser Ausbreitung durch verschiedene Arzneimittel ein.
  • Weitere Spezifität kann in das vorherige System durch Prüfen auf Anwesenheit des Virus, entweder mit oder ohne neutralisierende Antikörpern gegen dieses Virus, eingeführt werden. Beispielsweise können in einem Teil der klinischen getesteten Probe neutralisierende Antikörper gegen HIV vorliegen, während in einem anderen Teil keine neutralisierenden Antikörper vorliegen würden. Falls die Tests in dem System negativ waren, wo Antikörper vorlagen, und positiv, wo keine Antikörper vorlagen, würde dies helfen, die Anwesenheit von HIV zu bestätigen.
  • In einem analogen System für eine in-vitro-Untersuchung kann die Anwehsenheit eines bestimmten Gens, wie ein virales Gen, in einer Zellprobe bestimmt werden. In diesem Fall werden die Zellen in der Probe mit einem geeigneten Alphavirus-Vektor infiziert, welcher ein Reportergen trägt, welches nur in Gegenwart eines geeigneten viralen RNA-Transkriptes exprimiert wird. Das Reportergen wird, nach Eintreten in die Probenzellen, sein Reporterprodukt (wie β-Galactosidase oder Luziferase) nur exprimieren, wenn die Wirtszelle das geeignete virale Protein exprimiert.
  • Diese Untersuchungen sind schneller und sensitiver, weil das Reportergen eine größere Menge des Reporterprodukts als das vorliegende zu identifizierende Agens exprimieren kann, was einen Amplifikationseffekt ergibt.
    • 6. Immunherrunterregulation
  • Wie oben kurz beschrieben, kann das rekombinante Alphavirus verwendet werden, um ein Vektorkonstrukt zu tragen, welches zur Suppression eines oder mehrerer Elemente des Immunsystems in Targetzellen befähigt ist, welche mit dem Alphavirus infiziert sind.
  • Kurz gesagt, spezifische Herrunterregulation einer ungeeigneten oder unerwünschten Immunantwort, wie bei chronischer Hepatitis oder in Transplantaten von heterologen Geweben wie Knochenmark, kann unter Verwendung von immunsuppressiven viralen Genprodukten konstruiert werden, welche die Oberflächenexpression des Transplantations(MHC)-Antigens unterdrücken. Gruppe- C Adenoviren Ad2 und Ad5 besitzen ein 19 kd Glykoprotein (gp 19), welches in der E3-Region des Virus kodiert ist. Dieses gp-19-Molekül bindet an Klasse I-MHC- Moleküle im endosplasmatischen Reticulum der Zellen und verhindert terminale Glykolisierung und Translokation der Klassel-MHC an die Zelloberfläche. Beispielsweise können vor der Knochenmarkstransplantation Spender- Knochenmarkszellen mit gp 19-kodierenden Vektorkonstrukten infiziert werden, welche nach Expression des gp 19 die Oberflächenexpression des MHC-Klasse I- Transplantationsantigens hemmen. Diese Spenderzellen können mit einem geringen Risiko der Abstoßungsreaktion transplantiert werden und können eine minimale immunsuppressive Lebensweise für den transplantierten Patienten erfordern. Dies kann einem akzeptablen Spender-Empfänger-chimären Status mit dem Auftreten von weniger Komplikationen ermöglichen. Ähnliche Behandlungsweisen können verwendet werden, um eine Reihe von sogenannten Autoimmunkrankheiten zu behandeln, einschließlich Lupus Erythematodes, Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis oder chronisches Hepatitis-B-Infektion.
  • Eine alternative Methode schließt die Verwendung einer Antisense-Botschaft, eines Ribozyms oder anderer spezifischer Genexpressionshemmer, welche für T-Zellklone spezifisch sind, welche in der Natur autoreaktiv sind, ein. Diese blockieren die Expression von T-Zellrezeptoren auf bestimmten unerwünschten Klonen, welche für eine Autoimmunantwort verantwortlich sind. Die Antisense-, Ribozym- oder andere Gene können unter Verwendung des viralen Vektor-Übertragungssystems eingeführt werden.
    • 7. Ersetzende oder vergrößernde Gentherapie
  • Tierzellen können mit rekombinanten Alphavirus-Vektoren transformiert werden, welche als Gentransfervehikel dienen, um genetische Sequenzen zu liefern, welche befähigt sind, ein therapeutisches Protein zu exprimieren. In einer Ausführungsform wird das virale Vektorkonstrukt entworfen, ein therapeutisches Protein zu exprimieren, welches zur Verhinderung, Hemmung, Stabilisierung oder Umkehrung eines ererbten oder nicht-ererbten genetischen Defekts im Metabolismus, Immunregulation, Hormonregulation, enzymatischer oder Membran-assoziierter strukturellen Funktion befähigt ist. Diese Ausführungsform beschreibt auch einen viralen Vektor, welcher zur Transduktion individueller Zellen befähigt ist, wobei das therapeutische Protein befähigt ist, systemisch oder lokal von einer spezifischen Zelle oder Gewebe exprimiert zu werden, wodurch das therapeutische Protein (a) zum Ersetzen eines abwesenden oder beschädigten zellulären Proteins oder Enzym oder (b) zur ergänzenden Herstellung eines beschädigten oder wenig exprimierten zellulären Proteins oder Enzym befähigt ist. Solche Krankheiten können zystische Fibrose, Parkinsonerkrankung, Hypercholesterolämie, Adenosindesaminasedeffizienz, β-Globulinkrankheiten, Hämophilie A & B, Gaucher's Erkrankung, Diabetes und Leukämie einschließen.
  • Als ein Beispiel kann ein rekombinanter Alphavirus-viraler-Vektor verwendet werden, um die Gaucher's Erkrankung zu behandeln. Kurz gesagt, ist die Gaucher's Erkrankung eine genetische Störung, welche durch einen Mangel des Enzyms Glukocerebrosidase gekennzeichnet ist. Dieser Therapietyp ist ein Beispiel einer Einzelgen-Ersatztherapie durch Bereitstellen eines funktionellen zellulären Enzyms. Dieser Enzymmangel führt zur Akkumulation von Glukocerebrosid in den Lysosomen aller Zellen im Körper. Der Krankheitsphenotyp manifestiert sich jedoch nur in den Makrophagen, außer in der sehr seltenen Neuronen-pathogenen Form der Krankheit. Diese Krankheit führt gewöhnlich zu einer Vergrößerung der Leber und Milz und zu Schädigungen in den Knochen (zur Übersicht, siehe Science 256: 794, 1992 und The Mefabolic Basis of Inherited Disease, 6. Aufl., Scriver et al., Bd. 2, S. 1677).
    • 8. Verabreichung der Alphavirus-Partikel
  • Kurz gesagt, die letzte Art der viralen Vektorverabreichung vertraut gewöhnlicherweise auf die spezifische therapeutische Anwendung, die beste Art, die Vektorwirkung zu steigern, und den wirksamsten Verabreichungsweg. Allgemein schließt diese Ausführungsform rekombinante Alphavirus-Vektoren ein, welche entworfen werden können, durch zum Beispiel (1) direkte Injektion in den Blutstrom, (2) direkte Injektion in ein spezifisches Gewebe oder Tumor, (3) orale Verabreichung, (4) nasale Inhalation, (5) direkte Anwendung auf Schleimhautgewebe oder (6) ex vivo-Verabreichung der transduzierten autologen Zellen in das Lebewesen verabreicht zu werden. Deshalb kann der therapeutische Alphavirus-Vektor in solch einer Weise verabreicht werden, so daß der Vektor (a) eine normale gesunde Zelle transduzieren und die Zelle in einen Hersteller eines therapeutischen Proteins oder Agens transformieren kann, welches systemisch oder lokal sezerniert wird, (b) eine anomalen oder geschädigten Zelle transformieren kann, wobei die Zelle in einen normalen funktionierenden Phenotyp transformiert wird, (c) eine anomalen Zelle transformieren kann, so daß sie zerstört wird und/oder (d) Zellen transduzieren kann, um die Immunantwort zu beeinflussen.
    • 1. MODULATION DER AKTIVITÄT VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
  • Alphavirus-Vektoren können verwendet werden, um die Wachstumskontrollaktivität von Transkriptionsfaktoren in der infizierten Zelle zu regulieren. Kurz gesagt, beeinflussen Transduktionsfaktoren direkt das Muster der Genexpression durch sequenzspezifische Transaktivierung oder Repression (Karin, New Blologist 21: 126- 131, 1990). Daher ist es nicht überraschend, daß die mutierten Transkriptionsfaktoren eine Familie von Onkogenen darstellen. Alphavirus- Gentransfertherapie kann verwendet werden, um beispielsweise die Kontrolle von Tumorzellen wieder umzukehren, deren unreguliertes Wachstum durch onkogene Transkriptionsfaktoren und Proteine aktiviert ist, welche die Bindung kooperativ in der Bildung von homo- oder heterodimeren, trans-aktivierenden oder - reprimierenden Transkriptionsfaktorkomplexen fördern oder hemmen.
  • Ein Verfahren zum Umkehren der Zellproliferation würde sein, das trans-aktivierende Potential des c-myc/Max heterodimeren Transkriptionsfaktorkomplexes zu hemmen. Kurz gesagt, das nukleäre Onkogen c-myc wird von proliferierenden Zellen exprimiert und kann durch verschiedene unterschiedliche Mechanismen, einschließlich retrovirale Insertion, Amplifikation und chromosomale Translokation, aktiviert werden. Das Max-Protein wird in ruhenden Zellen und, unabhängig von c- myc, entweder allein oder in Verbindung mit einem nicht-identifizierten Faktor exprimiert, welcher fungiert, um die Expression derselben Gene, welche durch das myc/Max-Heteromer aktiviert werden, zu unterdrücken (Cole, Cell 65: 715-716, 1991).
  • Die Hemmung der c-myc oder c-myc/Max-Proliferation von Tumorzellen kann durch die Überexpression von Max in Targetzellen, kontrolliert durch Alphavirus-Vektoren, durchgeführt werden. Das Max-Protein weist nur 160 Aminosäuren (korrespondierend zu 480 Nukleotiden RNA-Länge) auf und wird leicht in einen Alphavirus-Vektor entweder unabhängig oder in Verbindung mit anderen Genen und/oder Antisense-/Ribozymkomponenten aufgenommen, welche auf Faktoren gerichtet sind, welche die Wachstumskontrolle der Zellen aufheben.
  • Modulierung von Homo/Hetero-Komplexverbindung ist ein anderer Ansatz, die Transkriptionsfaktor-aktivierte Genexpression zu kontrollieren. Beispielsweise wird der Transport vom Zytoplasma in den Kern des transaktivierenden Transkriptionsfaktors NF-κB durch einen Heterodimerkomplex mit dem Inhibitorprotein IκB verhindert. Nach Induktion durch eine Vielzahl von Agentien, einschließlich bestimmter Zytokine, wird IKB phosphoryliert und NF-κB freigesetzt und in den Kern transportiert, wo es seine sequenzspezifische transaktivierende Funktion ausüben kann (Baeuerle und Baltimore, Science 242: 540-546, 1988). Die Dissoziation des NF-κB/IκB-Komplexes kann durch Maskieren der Phosphorylisierungsstelle von IκB durch einen Antikörper verhindert werden. Dieser Ansatz würde effizient die Trans-aktivierungsaktivität des NF-IκB- Transkriptionsfaktors durch Verhindern seines Transports in den Kern hemmen. Die Expression des IκB-Phosphorylierungs-Sequenzspezifischen Antikörpers oder Proteins in Targetzellen kann mit einem Alphavirus-Gentransfervektor durchgeführt werden. Ein ähnlicher zu dem hier beschriebenen Ansatz könnte verwendet werden, um die Bildung des trans-aktivierenden Transkriptions-Heterodimer-Faktors AP-1 (Turner und Tijan, Science 243: 1689, 1989) durch Hemmung der Bindung zwischen den jun- und fos-Proteinen zu verhindern.
    • J. PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Wie oben angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche einen rekombinanten Sindbis-Partikel oder Virus oder Sindbis-Vektorkonstrukt, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Empfänger, umfassen.
  • Kurz gesagt kann der infektiöse rekombinante Virus (oben auch als Partikel bezeichnet) entweder in rohen oder gereinigten Formen aufbewahrt werden. Um ein Virus in roher Form herzustellen, können die Virus-herstellenden Zellen erst in einem Bioreaktor gezüchtet werden, wobei die viralen Partikel aus den Zellen in das Kulturmedium freigesetzt werden. Das Virus kann dann in roher Form durch zuerst Hinzufügen einer ausreichenden Menge einer Pufferformulierung zu dem Kulturmedium, welches das rekombinante Virus enthält, aufbewahrt werden, um eine wäßrige Suspension zu bilden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Pufferformulierung eine wäßrige Lösung, welche ein Saccharid, einen Strukturzusatz mit hohem Molekulargewicht und eine Pufferverbindung in Wasser enthält. Die wäßrige Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren enthalten.
  • Der rekombinante Virus kann auch in gereinigter Form aufbewahrt werden. Noch spezifischer kann vor dem Hinzufügen der Pufferformulierung, der rohe, oben beschriebene, rekombinante Virus durch Durchlaufen durch einen Filter und anschließendes Konzentrieren, wie durch ein Kreuzflußkonzentrierungssystem (Filtron Technology Cor., Nortborough, Mass.), gereinigt werden. In einer Ausführungsform wird DNase zu dem Konzentrat hinzugefügt, um die exogene DNA zu verdauen. Der Verdau wird dann diafiltriert, um einen Überschuß an Mediumkomponenten zu entfernen und den rekombinanten Virus in einer gewünschteren gepufferten Lösung zu etablieren. Das Diafiltrat wird dann über eine Sephadex S-500-Gel-Säule gegeben und ein gereinigter rekombinanter Virus wird eluiert. Eine ausreichende Menge des Formulierungspuffers wird dann hinzugefügt, um dies zu eluieren, um eine gewünschte Endkonzentration der Komponenten zu erreichen und um das rekombinante Virus minimal zu verdünnen. Die wäßrige Suspension kann dann, vorzugsweise bei -70ºC, gelagert werden oder sofort getrocknet werden. Wie oben kann der Formulierungspuffer eine wäßrige Lösung sein, welche ein Saccharid, einen Strukturzusatz mit hohem Molekulargewicht und eine Pufferkomponente in Wasser enthält. Die wäßrige Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren enthalten.
  • Rohe rekombinante Viren können auch durch Ionenaustausch- Säulenchromatographie gereinigt werden. Kurz gesagt, kann das rohe rekombinante Virus zuerst durch Durchleiten durch einen Filter, gefolgt von Beladen des Filtrats auf eine Säule, welche eine hochsulfonierte Zellulosematrix enthält, gereinigt werden. Das rekombinante Virus kann dann von der Säule in gereinigter Form durch Verwendung eines Hochsalzpuffers eluiert werden, und der Hochsalzpuffer kann gegen einen erwünschteren Puffer durch Durchleiten des Eluates durch eine molekulare Ausschlußsäule ausgetauscht werden. Eine ausreichende Menge des Formulierungspuffers wird dann, wie oben diskutiert, zu dem gereinigten rekombinanten Virus hinzugefügt, und die wäßrige Lösung wird entweder sofort getrocknet oder vorzugsweise bei -70ºC gelagert.
  • Die wäßrige Suspension, in roher oder gereinigter Form, kann durch Gefriertrocknung oder Verdampfung bei Umgebungstemperatur getrocknet werden. Kurz gesagt, schließt die Gefriertrocknung die Schritte des Kühlens der wäßrigen Suspension unter die Glasübergangstemperatur oder unter die eutektische Punkt- Temperatur der wäßrigen Suspension und Entfernung des Wassers von der gekühlten Suspension durch Sublimation ein, um das lyophilisierte Virus zu bilden. In einer Ausführungsform werden Aliquots des formulierten rekombinanten Virus in eine Edwards-Gefrierkammer (3 shelf RC3S unit), verbunden mit einem Gefriertrockner (Supermodulyo 12K), plaziert. Ein Mehrstufen-Gefriertrocknungsverfahren, wie durch Phillips et al. beschrieben (Cryobiology 18: 414, 1981), wird verwendet, um das formulierte rekombinante Virus, vorzugsweise bei einer Temperatur von -40º6 bis -45ºC zu lyophilisieren. Die sich ergebende Zusammensetzung enthält, bezögen auf das Gewicht des lyophilisierten Virus, weniger als 10% Wasser. Sobald es lyophilisiert ist, ist das rekombinante Virus stabil und kann bei -20ºC bis 25ºC, wie unten detaillierter diskutiert, gelagert werden.
  • In dem Verdampfungsverfahren wird das Wasser aus der wäßrigen Suspension bei Umgebungstemperatur durch Verdampfung entfernt. In einer Ausführungsform wird das Wasser durch Sprühtrocknung (EP 520,748) entfernt. In dem Sprühtrocknungsverfahren wird die wäßrige Suspension auf einen Fluß vorgeheizten Gases, gewöhnlich Luft, verteilt, woraus das Wasser schnell aus den Tropfen der Suspension verdampft. Sprühtrocknungsgeräte sind von einer Zahl von Herstellern erhältlich (z. B. Drytec, Ltd., Tonbridge, England; Lab-Plant, Ltd., Huddersfield, England). Sobald es hydratisiert ist, ist das rekombinante Virus stabil und kann bei - 20ºC bis 25ºC gelagert werden. In dem hierin beschriebenen Verfahren kann der sich ergebende Feuchtigkeitsgehalt des getrockneten oder gefriergetrockneten Virus durch die Verwendung eines Karl-Fischer-Gerätes (EM Science AquastarTM V1B volumetric titrator, Cherry Hill, NJ) oder durch ein gravimetrisches Verfahren bestimmt werden.
  • Die wäßrigen Lösungen, welche für die Formulierung, wie kürzlich beschrieben, verwendet werden, sind vorzugsweise aus einem Saccharid, einem Strukturzusatzstoff mit hohem Molekulargewicht, einer Pufferkomponente und Wasser zusammengesetzt. Die Lösung kann auch eine oder mehrere Aminosäuren einschließen. Die Kombination dieser Komponenten wirkt, um die Aktivität des rekombinanten Virus nach Gefrieren und Gefriertrocknen oder Trocknen durch Verdampfung zu konservieren. Obwohl ein bevorzugtes Saccharid Lactose ist, können andere Saccharide, wie Sacharose, Mannitol, Glukose, Trehalose, Inositol, Fructose, Maltose oder Galactose, verwendet werden. Zusätzlich können Kombinationen von Sacchariden, zum Beispiel Lactose und Mannitol oder Sacharose und Mannitol, verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Konzentration der Lactose ist 3 Gew.-% bis 4 Gew.-%. Vorzugsweise liegt die Konzentration des Saccharids von 1 Gew.-% bis 12 Gew.-%.
  • Der Strukturzusatzstoff mit hohem Molekulargewicht hilft, die virale Aggregation während des Gefrierens zu verhindern und stellt strukturelle Unterstützung im gefriergetrockneten oder getrockneten Zustand bereit. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeuten Strukturzusatzstoffe mit einem "hohem Molekulargewicht", wenn sie größer als 5.000 m.w. sind. Ein bevorzugter Strukturzusatzstoff mit hohem Molekulargewicht ist humanes Serumalbumin. Es können jedoch auch andere Substanzen verwendet werden, wie Hydroxyethyl- Cellulose, Hydroxymethyl-Cellulose, Dextran, Cellulose, Gelatine oder Povidone.
  • Eine besonders bevorzugte Konzentration des humanen Serumalbumins liegt bei 0,1 Gew.-%. Vorzugsweise liegt die Konzentration des Strtukturzusatzstoffes mit hohem Molekulargewicht im Bereich von 0,1 Gew.-% bis 10 Gew.-%.
  • Die Aminosäuren, falls vorliegend, fungieren, um weiter die virale Infektiösität nach dem Kühlen und Auftauen der wäßrigen Suspension zu konservieren. Zusätzlich fungieren die Aminosäuren, um weiter die virale Infektiösität während der Sublimation der gekühlten wäßrigen Suspension und während des lyophilisierten Zustandes zu konservieren. Eine bevorzugte Aminosäure ist Arginin, aber andere Aminosäuren wie Lysin, Ornithin, Serin, Glycin, Glutamin, Asparagin, Glutaminsäure oder Arparaginsäure können auch verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Arginin-Konzentration liegt bei 0,1 Gew.-%. Vorzugsweise liegen die Aminosäure- Konzentrationen im Bereich von 0,1 Gew.-% bis 10 Gew.-%.
  • Die Pufferkomponente wirkt, um die Lösung durch Aufrechterhalten eines relativ konstanten pH-Wertes zu puffern. Eine Vielzahl von Puffern kann, abhängig vom gewünschten pH-Bereich, vorzugsweise zwischen 7,0 und 7,8, verwendet werden. Geeignete Puffer schließen Phosphatpuffer und Citratpuffer ein. Ein besonders bevorzugter pH-Wert der rekombinanten Virusformulierung ist 7,4, und ein bevorzugter Puffer ist Tromethamin.
  • Zusätzlich wird bevorzugt, daß die wäßrige Lösung ein neutrales Salz enthält, welches verwendet wird, um das endformulierte rekombinante Alphavirus auf eine angemessene iso-osmotische Salzkonzentration einzustellen. Geeignete neutrale Salze schließen Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Magnesiumchlorid ein. Ein bevorzugtes Salz ist Natriumchlorid.
  • Wäßrige Lösungen, welche die gewünschte Konzentration der oben beschriebenen Komponenten enthalten, können als konzentrierte Stammlösungen hergestellt werden.
  • Es wird für einen Fachmann offensichtich sein, welchem die hierin zur Verfügung gestellte Offenbarung gegeben wird, daß es bevorzugt sein kann, bestimmte Saccharide in der wäßrigen Lösung zu verwenden, wenn das gefriergetrocknete Virus für die Lagerung bei Raumtemperatur vorgesehen ist. Noch spezifischer ist es bevorzugt, Disaccharide, wie Lactose oder Trehalose, insbesondere für die Lagerung bei Raumtemperatur zu verwenden.
  • Die gefriergetrockneten oder entwässerten Viren des erfindungsgemäßen Gegenstandes können unter Verwendung einer Vielzahl von Substanzen rekonstituiert werden, aber sie werden vorzugsweise unter Verwendung von Wasser rekonstituiert. In besonderen Fällen können ebenso verdünnte Salzlösungen verwendet werden, welche die Endformulierung zur Isotonizität bringen. Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, wäßrige Lösungen zu verwenden, welche Komponenten enthalten, welche bekannt sind, die Aktivität des rekonstituierten Virus zu vergrößern. Solche Komponenten schließen Zytokine, wie IL-2, Polykationen, wie Protaminsulfat, oder andere Komponenten, welche die Transduktionseffizienz des rekonstituierten Virus vergrößern, ein. Gefriergetrocknetes oder entwässertes rekombinantes Virus kann mit jedem geeigneten Volumen von Wasser oder den oben angemerkten rekonstituierenden Mitteln rekonstituiert werden, welche eine wesentliche und vorzugsweise vollständige Lösung der gefriergetrockneten oder entwässerten Probe erlauben.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Beschreibung und nicht zur Einschränkung bereit gestellt.
    • BEISPIELE BEISPIEL 1 KLONIERUNG EINER SINDBIS-cDNA MIT GENOMISCHER LÄNGE
  • Die Natur der Viren mit einem RNA-Genom mit positiver Polarität ist derart, daß, wenn sie in eine eukaryotische Zelle eingeführt werden, welche als permissiver Wirt dient, die gereinigte genomische Nukleinsäure als funktionelles messenger- RNA-(mRNA)-Molekül dient. Deshalb kann diese genomische RNA, gereinigt aus dem Virus, den gleichen Infektionszyklus initiieren, welcher für die Infektion durch das Wildtypvirus, aus welchem die RNA gereinigt wurde, charakteristisch ist.
  • Der Sindbis-Virusstamm Ar-339 (ATCC #VR-1248, Taylor et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 4: 844, 1955), isoliert aus dem Mosquito Culexus univittatus, wird in Babyhamsternieren- bzw. "baby hamster kidney"-(BHK)-Zellen vermehrt, welche mit geringer Multiplizität (0,1 PFU/Zelle) infiziert werden. Alternativ kann der Sindbis-Virusstamm hr (Lee Biomolecular, San Diego, CA) verwendet werden und durch die gleichen Verfahren vermehrt werden. Sindbis-Virionen werden aus dem geklärten Lysat 48 Stunden nach Infektion mit 10% (wlv) Polyethylenglykol (PEG- 8000) bei 0ºC, wie kürzlich beschrieben, präzipitiert. Die in dem PEG-Pellet enthaltenen Sindbis-Virionen werden mit 2% SDS lysiert, und die polyadenylierte mRNA wird durch Chromatographie unter Verwendung im Handel erhältlicher Oligo-dT-Säulen (Invitrogen) isoliert. Zwei Runden der Erststrang-cDNA-Synthese werden mit der polyA-selektierten mRNA unter Verwendung eines Oligonukleotidprimers mit der unten gezeigten Sequenz durchgeführt:
  • 5'-TATATTCTAGA(dT)&sub2;&sub5;-GAAATG-3' (SEQ. ID NR. 2)
  • Der Primer enthält an seinem 5'-Ende eine fünf Nukleotid-"Puffersequenz" für einen effizienten Restriktionsendonukleaseverdau, gefolgt durch eine Xba I Erkennungssequenz, 25 aufeinanderfolgenden dT-Nukleotiden und sechs Nukleotiden, welche präzise komplementär zu dem äußersten Sindbis 3'-Ende sind. Daher erfolgt diese Selektion für die erste Runde der cDNA-Synthese auf zwei Niveaus:
  • (1) polyadenylierte Moleküle, eine Voraussetzung für funktionelle mRNA und (2) selektives Starten bzw. "Primen" der Sindbis-mRNA-Moleküle in einem Pool, welcher verschiedene mRNA-Spezies enthält. Ferner wird die reverse Transkription in Anwesenheit von 10 mM MeHgOH ausgeführt, um die Häufigkeit von künstlichen Stops während der reversen Transkription zu verringern.
  • Die primäre genomische Sindbis-cDNA wird durch PCR in sechs unterschiedlichen Segmenten unter Verwendung von sechs Paaren von überlappenden Primern amplifiziert. Zusätzlich zu viralen komplementären Sequenzen, enthält der Sindbis-5'-Ende-Forward-Primer bzw. Sindbis-5'-Ende- Vorwärts-Primer die 19 Nukleotidsequenz, welche dem bakteriellen SP6-RNA- Polymerasepromotor entspricht und die Apa I-Restriktions-Endonuklease- Erkennungssequenz, welche mit seinem 5'-Ende verknüpft ist. Eine fünf Nukleotid-"Puffersequenz" für den effizienten Verdau geht der Apa I- Erkennungssequenz voran. Die bakterielle SP6-RNA-Polymerase ist ausgeglichen, so daß die Transkription in vitro den Einschluß von nur einem einzelnen nicht-viralen G-Ribonukleotid, verknüpft an das A-Ribonukleotid, ergibt, welches dem authentischen Sindbis-5'-Ende entspricht. Einschluß der Apa I- Erkennungssequenz erleichtert die Insertion des PCR-Amplikons bzw. PCR- Amplifikationsproduktes in die Plasmid-Vektor-(pKS II&spplus;, Strategene)- Polylinkersequenz. Die Sequenz des SP6-5'-Sindbis-Forward-Primers und aller anderen Primerpaare, welche notwendig sind, um das ganze Sindbis-Genom zu amplifizieren, werden unten gezeigt. Die Referenzsequenz (GenBank Hinterlegungs-Nr. SINCG) stammt aus Strauss et al., Virology 133: 92-110.
  • Die PCR-Amplifikation der Sindbis-cDNA mit den oben gezeigten sechs Primersets wird in getrennten Reaktionen unter Verwendung der Thermalasethermostabilen-DNA-Polymerase (Amresko Inc., Solon, Ohio) und dem Puffer, enthaltend 1,5 mM MgCl&sub2;, welcher durch den Lieferanten bereit gestellt wird, ausgeführt. Zusätzlich enthalten die Reaktionen 5% DMSO und die Heißstart- Wachskügelchen (Perkin-Elmer) unter Verwendung des folgenden, unten gezeigten PCR-Amplifikationsprotokolls:
  • Auf die Amplifikation folgend, werden die sechs Reaktionsprodukte erst in den pCR-II-Vektor (Invitrogen) insertiert, dann unter Verwendung der oben gezeigten, geeigneten Enzyme schrittweise in den pKS II&spplus;-(Stratagene)-Vektor zwischen die Apa I- und Xba I-Stellen insertiert. Dieser Klon wird als pVGSP6GEN bezeichnet.
  • Der Sindbis-genomische cDNA-Klon pVGSP6GEN wird durch Verdau mit Xba I linearisiert, welches pVGSP6GEN einmal, direkt angrenzend und stromabwärts zu der 25 Nukleotid-langen poly-dA:dT-Strecke, spaltet. Der linearisierte pVGSP6GEN-Klon wird mit Geneclean (BIO 101, La Jolla, CA) gereinigt und auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml eingestellt. Die Transkription des linearisierten pVGSP6GEN-Klons wird in vitro bei 40ºC für 90 Minuten gemäß den folgenden Reaktionsbedingungen ausgeführt: 2 ml DNA/4,25 ml H&sub2;O/10 ml 2,5 mM NTPs (UTP, ATP, GTP, CTP)/1,25 ml 20 mM m&sup7;G(5')ppp(5')G cap Analog/1,25 ml 100 mM DTT/5 ml 5X Transkriptionspuffer (Promega)/0,5 ml Rnasin (Promega)/0,25 ml 10 mg/ml Rinderserumalbumin/0,5 ml SP6-RNA-Polymerase (Promega). Die in vitro-Transkriptionsreaktionsprodukte können mit DNase I (Promega) verdaut werden und durch nachfolgende Phenol/CHCl&sub3;- und Etherextraktion, gefolgt durch Ethanolpräzipitation, gereinigt werden, oder alternativ direkt für die Transfektion verwendet werden. Die in vitro-Transkriptionsreaktionsprodukte oder gereinigte RNA werden mit einer im Handel erhältlichen kationischen Lipidverbindung (Lipofectin, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) komplexiert und an Babyhamster- Kidney-21 (BHK-21)-Zellen, welche in einer 60 mm Petrischale bei 75% Konfluenz gehalten werden, verwendet. Die transfizierten Zellen werden bei 30ºC inkubiert. 94 Stunden nach der Infektion werden ausgedehnte zytopathologische Effekte (CPE) beobachtet. Kein offensichtlicher CPE wurde auf den Platten beobachtet, welche keine, von dem Sindbis-cDNA-Klon transkribierte, RNA erhalten haben. Ferner ergibt 1 ml Überstand, genommen von den transfizierten Zellen, hinzugegeben zu frischen Monolayern von BHK-21 Zellen und inkubiert bei 30ºC oder 37ºC einen offensichtlichen CPE innerhalb von 18 Stunden. Dies zeigt, daß der Sindbis-cDNA-Klon pVGSP6GEN tatsächlich infektiös ist.
  • Sequenzanalyse von pVGSP6GEN, gezeigt in Tab. 1, offenbart verschiedene Sequenzunterschiede zwischen dem, hierin beschriebenen, Sindbis-genomischen Klon und dem viralen, in der Genbank enthaltenen Klon. Viele Sequenzunterschiede resultieren aus der Substitution der nicht-konservativen Aminosäureänderungen in den Sindbis-Proteinen. Um anzusprechen, welche Sequenzänderungen für den hierin beschriebenen Klon einzigartig sind, oder ein Ergebnis eines Klonierungsartifakts sind, wird die Virion-RNA durch RT-PCR, wie oben beschrieben, amplifiziert, und der Sequenzbezug zu den infrage kommenden Nukleotiden durch direktes Sequenzieren des RT-PCR Amplikonprodukts unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Promega, Madison WI) bestimmt und mit der entsprechenden pVGSP6GEN-Sequenz verglichen. Die Ergebnisse dieser Studie werden in Tab. 2 angegeben. Kurz gesagt, werden drei nicht-konservative Aminosäureänderungen, Gly→Glu, Asp→Gly und Tyr→Cys, welche ein Ergebnis eines Klonierungsartifaktes sind, respektive an den viralen Nukleotiden 2245, 6193 und 6730, beobachtet. Diese Nukleotidänderungen, welche nicht-konservative Aminosäureänderungen ergeben, betreffen alle virale Nicht-Strukturprotein-(NSP)-Gene, Nukleotid 2245 bei NSP 2 und Nukleotide 6193 und 6730 bei NSP4.
  • Die Reparatur der NSP 2- und NSP 4-Gene wird durch RT-PCR, wie oben beschrieben, unter Verwendung von Virion-RNA aus fünfmal Plaque-gereinigter Stammlösung ausgeführt. Das oben beschriebene SP6-1A/1B-Primerpaar wird verwendet, um die Nukleotid-2245-Änderung zu reparieren. Das RT-PCR- Amplikonprodukt wird mit Eco 47III und Bgl II verdaut, und das 882 bp-Fragment wird durch 1% Agarose/TBE-Gel-Elektrophorese gereinigt und in der entsprechenden Region des pVGSP6GEN-Klons ausgetauscht, welcher durch Verdau mit Eco 47III und Bgl II und Behandlung mit CIAP hergestellt wurde. Das oben beschriebene 3A/7349R-Primerpaar wird verwendet, um die Nukleotid 6193- und Nukleotid 6730-Änderungen zu reparieren. Das RT-PCR-Amplikonprodukt wird mit Eco RI und Hpa I verdaut, und das 1.050 Basenpaartragment durch 1% Agarose /TBE-Gel-Elektrophorese gereinigt und mit der entsprechenden Region des pVGSP6GEN-Klons ausgetauscht. Dieser Klon ist als pVGSP6GENrep bekannt. Transfektion von BHK-Zellen mit in vitro-transkribierter RNA aus pVGSP6GENrep DNA, linearisiert durch Verdau mit Xba I, ergibt, wie oben beschrieben, einen ausgedehnten CPE 18 Stunden nach Transfektion. Tabelle 1 Sindbis-genomische Klonunterschiede zwischen Viagen- und GenBank- Sequenzen Tabelle 2 Analyse der Sindbis-genomischen Klon-Artefakte
  • * Mischung: Beide Genbank- und Viagen-Sindbis-Stränge liegen an diesem Nukleotid vor.
    • BEISPIEL 2 ERZEUGUNG VON PLASMID DNA-VEKTOREN, WELCHE DIE SINDBIS- INFEKTION INITIIEREN
  • Wegen der Größe des Gesamtlängen-genomischen Sindbis-cDNA-Klons ist die in vitro-Transkription des Gesamtlängenmoleküls eher ineffizient. Dies ergibt eine verringerte Transfektionseffizienz in Bezug auf die infizierten Viruszentren, wie durch Plaquebildung gemessen, relativ zu der Menge der in vitro transkribierten transfizierten RNA. Diese Beziehung ist auch für die in vitro Transkription der Sindbis-Expressionsvektoren relevant. Das Prüfen der cDNA-Klon-Kandidaten und anderer Sindbis-cDNA-Expressionsvektoren auf ihre Fähigkeit, einen Infektionszyklus zu initiieren oder zur Expression einer heterologen Sequenz zu führen, würde bedeutend erleichtert werden, wenn der cDNA-Klon in empfänglichen Zellen als ein DNA-Molekül transfiziert würde, was dann zu der Synthese viraler RNA in vivo führen würde. Transfektionseffizienten von 100% sind in Zellen, transfiziert mit DNA, komplexiert mit verschiedenen im Handel erhältlichen synthetischen Lipidpräparationen, oder transfiziert durch Elektroporation, berichtet worden. Es ist auch gezeigt worden, daß cDNA aus Picornaviren befähigt ist, einen Infektionszyklus zu initiieren, wenn sie in empfänglichen Zellen transfiziert wird (von der Wert et al., PNAS 83: 2330-2334, 1986). Es ist jedoch nicht in der Literatur beschrieben worden, ob genomische Sindbis-cDNA, wenn sie nahe einem Säugerpromotor plaziert wird und in Zellen transfiziert wird, RNA ergibt, welche befähigt ist, den infektiösen Zyklus, welcher für Wildtypvirus charakteristisch ist, zu initiieren.
  • Es ist wohl bekannt, daß DNA-Moleküle mit geeigneten Signalen in vivo replizieren können, wenn sie direkt in Lebewesen eingeführt werden (Dubensky et al., PNAS 81: 7429-7533, 1984). Die Verabreichung von Sindbis-cDNA-Vektoren, direkt als DNA-Moleküle, ist in einigen Anwendungen möglich, in welchen die Sindbis-gerichtete Expression der Palliativa einen Trans-Effekt aufweist. Diese Anwendungen schließen Immunmodulation und Expression von Zytokinen oder anderen therapeutischen Proteinen ein. Im Bereich des Sindbis bietet die direkte Verabreichung der Sindbis-cDNA-Expressionsvektoren eine Anwendung, die einfacher ist als die Erzeugung eines Sindbis-Partikels.
  • Sindbis-cDNA-Vektorkonstrukte enthalten eine heterologe, therapeutische palliative Sequenz, welche in einer eukaryotischen RNA-Polymerase-II- Expressionskassette insertiert ist. Diese Konstruktion ist als ein "Eukaryotic- Layered-Vector-Initiation-System" (ELVIS) bekannt und umfaßt die folgenden angeordneten Elemente: einen 5'-eukaryotischen Promotor, befähigt zur Initiation der Synthese von viraler RNA an dem authentischen Sindbis-5'-Ende, eine 5'- Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Sindbis-Virus befähigt ist, eine Nukleotidsequenz, kodierend Sindbis-Nichtstrukturproteine, eine virale Verbindungsregion, eine heterologe Sequenz, eine Sindbis-RNA-Polymerase- Erkennungssequenz, eine Transkriptions-Terminationssequenz und ein 3'- Polyadenylierungssignal. Der hierin beschriebene eukaryotische Sindbis-cDNA- Expressionsvektor kann auch das geeignete Splicing-Signal einschließen, welches beispielsweise zwischen Sindbis und heterologen Genregionen lokalisiert ist.
  • Die Fähigkeit des Sindbis-cDNA-Klons pVGSP6GENrep, einen Infektionszyklus zu initiieren, welcher für das Wildtyp-Virus charakteristisch ist, wird zuerst durch das Ersetzen der genomischen viralen cDNA in einer Säuger-RNA-Polymerase-II- Expressionskassette bestimmt. Diese Konstruktion wird, wie in der folgenden Ausführung beschrieben, durchgeführt. Der Klon pVGSP6GENrep wird mit Bgl II und Xba I verdaut, die Reaktionsprodukte werden auf einem 0,8% Agarose/TBE- Gel elektrophoresiert, und das resultierende 9.438 bp-Fragment wird ausgeschnitten, mit Geneclean (BIO 101, Vista, CA) gereinigt und in das 4,475 bp-Vektorfragment, welches aus der Behandlung von pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) mit Bgl II, Xba I und CIAP resultiert, ligiert. Diese Konstruktion ist als pcDNASINbgl/xba bekannt.
  • Der "long terminal repeat" (LTR) des Moloney-Maus-Leukämie-Virus (Mo-MLV) wird an dem viralen 5'-Ende angeordnet, so daß das erste transkribierte Nukleotid ein einzelner G-Rest ist, welcher in vivo eine cap-Struktur aufweist, gefolgt von dem Sindbis-5'-Ende. Es ist bekannt, daß in vitro-transkribierte RNAs, welche drei nicht-virale Nukleotide an ihrem 5'-Ende enthalten, infektiös sind (Rice et al., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987). Die Nebeneinanderanordnung des Mo-MLV-LTR und des Sindbis-5'-Endes wird durch überlappende PCR, wie in der folgenden Ausführung beschrieben, durchgeführt. Die Amplifikation des Mo-MLV-LTR in der ersten primären PCR-Reaktion wird in einer Reaktion, welche den BAG-Vektor (Price et al., PNAS 84: 156-160, 1987) und das folgende Primer-Paar enthält, durchgeführt: Forward-Primer bzw. Vorwärts-Primer: BAGBg12F1 (Puffersequenz/Bgl II Erkennungssequenz/Mo-MLV LTR Nukleotide 1-22): Reverse-Primer bzw. Rückwärts-Primer: BAGwt441R2 (SIN Nukleotide 5-1/Mo- MLV LTR Nukleotide 441-406):
  • Die PCR-Amplifikation des Mo-MLV-LTR mit dem oben gezeigten Primerpaar wird unter Verwendung der Thermalase-thermostabilen-DNA-Polymerase (Amresko lnc., Solon, Ohio) und dem 1,5 mM MgCl&sub2; enthaltenden Puffer, welcher von dem Lieferanten bereit gestellt wird, ausgeführt. Zusätzlich enthält die Reaktion 5% DMSO und die Heißstart-Wachskügelchen (Perkin-Elmer), wobei das folgende, unten gezeigte PCR-Amplifikationsprotokoll verwendet wird:
  • Die Amplifikation des Sindbis-5'-Endes in der zweiten primären PCR-Reaktion wird in einer Reaktion, welche den pVGSP6GENrep-Klon und das folgende Primerpaar enthält, durchgeführt: Forward-Primer: (Mo-MLV LTR Nukleotide 421-441/SIN nts 1-16): Reverse-Primer: (SIN Nukleotide 3182-3160):
  • Die PCR-Amplifikation der Mo-MLV LTR mit dem Primerpaar und den Amplifikationsreaktionsbedingungen ist oben gezeigt, und das folgende PCR- Amplifikationsprotokoll, welches unten gezeigt wird, wird verwendet:
  • Die 457 bp- und 3202 bp-Produkte der primären PCR-Reaktionen werden mit Geneclean aufgereinigt und zusammen in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar verwendet: Forward-Primer: BAGBgl2F1 PufferseauenzlBgl II Erkennungssequenz/Mo-MLV LTR Nukleotide 1-22): Reverse-Primer: (SIN Nukleotide 2300-2278):
  • Die PCR-Amplifikation des Primer-PCR-Amplikonproduktes mit dem Primerpaar und den Amplifikations-Reaktionsbedingungen ist oben gezeigt, und das folgende, unten gezeigte, PCR-Amplifikationsproduktprotokoll wird verwendet:
  • Die 25 3'-terminalen Basen des ersten primären PCR-Amplikonprodukts überlappen mit den 25 5'-terminalen Basen des zweiten primären PCR- Amplikonprodukts; das resultierende, 2.752 bp überlappende, sekundäre PCR- Amplikonprodukt wird durch 0,8% Agarose/TBE-Elektrophorese gereinigt, mit Bgl II verdaut, und das 2.734 bp-Produkt wird in, mit Bgl II und CIAP behandelten, pcDBASINbgl/xba ligiert. Das resultierende Konstrukt weist 16.656 bps auf und ist als pVGELVIS bekannt. Die Sequenz von pVGELVIS ist in Fig. 3 angegeben. Die Sindbis-Nukleotide sind in den Basen 1-11.700 der Sequenz enthalten.
  • Die pVGELVIS-Plasmid-DNA wird mit Lipofectamin (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), gemäß den durch den Lieferanten vorgeschlagenen Bedingungen (ca. 5 ug DNA/8 mg Lipidreagens), komplexiert und zu 35 mm-Schalen hinzugegeben, welche BHK-21-Zellen von ungefähr 75% Konfluenz enthalten. Zytopathische Effekte (CPE), welche für die Wildtyp-Sindbisvirus-Infektion charakteristisch sind, werden innerhalb 48 h nach Infektion beobachtet. Zugabe von 1 ml Transfektionsüberstand zu frischen BHK-21-Monolayern ergibt einen CPE innerhalb von 16 h. Diese Daten zeigen eine korrekte Nebeneinanderanordnung von den Signalen der Expressionskassette der viralen cDNA und der RNA Polymerase II in dem pVGELVIS-Konstrukt, wodurch die de novo-Initiation eines RNA-Virus von einer DNA-Expressionseinheit resultiert. Diese Neuerung vergrößert nicht nur die Nützlichkeit des Sindbis-Systems im allgemeinen, sondern stellt auch ein anderes Verfahren für einen physikalischen Gentransfer-Vektor bereit.
  • Die Effizienz der Vektorreplikation, welche der ersten Transkription der genomischen RNA von pVGELVIS folgt, wird auch durch Modifikationen vergrößert, welche ein noch authentischeres 3'-Ende ergeben. Zu diesem Zweck werden zwei verschiedene Modifikationen an dem ELVIS-Vektorkonstrukt durchgeführt. Die Erste verwendet die anti-genomische Ribozymesequenz des Hepatitis Delta Virus (HDV), welche angrenzend an den Sindbispolyadenylierten Abschnitt angeordnet ist. Die Zweite schließt eine Deletion des Sindbispolyadenylierten Abschnitts und stromabwärts liegender Vektorsequenzen ein, was eine Fusion des Sindbis-Nukleotids 11.700 an die bovine- Wachstumshormon-Gentranskriptions-Terminations-/Polyadenylierungssequenz ergibt.
  • Das HDV-Ribozym-enthaltende Konstrukt wird unter Verwendung von PCR- Techniken und überlappenden Oligonukleotidprimern, welche die gesamte 84 Nukleotid-antigenomische Ribozymsequenz (Perotta und Been, Nature 350: 434-6, 1991) enthalten, erzeugt. Zusätzlich zu der HDV-Sequenz enthalten die zwei Primer flankierende Restriktionsenzymstellen zum Zwecke der Insertion in den ELVIS-Vektor. Zwei PCR-Runden werden ausgeführt: zuerst unter Verwendung der Oligonukleotidprimer HDV49-XC und HDV17-68 (unten gezeigt),
  • gefolgt durch Verdünnung der ersten PCR-Reaktion und ihrer anschließenden Verwendung als Template bzw. Matrize in einer zweiten PCR-Runde mit den Primern HDV49-XC (von der ersten Reaktion) und HDVX-36 (unten gezeigt).
  • Nach der Synthese wird das HDV-Ribozymfragment mit Xba I verdaut, welches die flankierenden Sequenzen (kursiv) spaltet und in die ELVIS-Vektor-DNA ligiert, welche teilweise mit Xba I verdaut worden ist, um eine ihrer zwei Schnittstellen zu spalten. Das Absuchen nach der Insertion in die geeignete Stelle und die korrekte Orientierung wird durch Restriktionsschnittstellen und Sequenzanalyse durchgeführt. Dieses Konstrukt ist als pVGELVISHDV bekannt.
  • In dem zweiten Verfahren wird die Fusion des Sindbis-Nudleotids 11.700 an die bovine-Wachstumshormon-Gentranskriptions-Terminations-/Polyadenylierungssequenz durch Deletion des Sindbis-Polyadenylierungsabschnitts und stromabwärts liegender Vektorsequenzen in pVGELVIS durch überlappende PCR durchgeführt. Die Amplifikation des Sindbis-3'-Endes in der ersten primären PCR-Reaktion wird in einer Reaktion, welche pVGELVIS und das folgende Primerpaar enthält, durchgeführt: Forward-Primer: SIN10349F (SIN Nukleotide 10394-10372): Reverse-Primer: SINBGH11700R (BGH Nukleotide 13-1/SIN Nukleotide 11700-11675):
  • Die PCR-Amplifikation des pVGELVIS mit dem oben gezeigten Primerpaar wird unter Verwendung der Thermalase-thermostabilen DNA-Polymerase (Amresco Inc., Solon, Ohio) und den durch den Lieferanten bereit gestellten, 1,5 mM MgCl&sub2; enthaltenden Puffer durchgeführt. Zusätzlich enthält die Reaktion 5% DMSO und Heißstart-Wachskügelchen (Perkin-Elmer), wobei das folgende unten gezeigte PCR-Amplifikationsprotokoll verwendet wird:
  • Die Amplifikation der BGH-Gentranskriptions-Terminations-/Polyadenylierungssequenz in der zweiten primären PCR-Reaktion wird in einer Reaktion, welche den pVGELVIS-Klon und das folgende Primerpaar enthält, durchgeführt: Forward Primer: pCSIN1018F (SIN Nukleotide 11.687-11.700/PCDNA3 Nukleotide 1018-1039): Reverse Primer: pCDNA1633R (pCDNA3 Nukleotide 1633-1608):
  • Die PCR-Amplifikation des 5'-Endes des BGH-Gens ist oben mit dem Primerpaar und den Amplifikationsbedingungen gezeigt und verwendet das folgende unten gezeigte PCR-Amplifikationsprotokoll:
  • Die 1.364 bp- und 629 bp-Produkte der primären PCR-Reaktionen werden mit Geneclean gereinigt und zusammen in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar verwendet: Forward-Primer: SIND310374F (5 Nukleotid Puffer/Hind III Erkennunpssequenz/SIN Nukleotide 10374-10394): Reverse-Primer: pCDNA1575R (pCDNA3 Nukleotide 1575-1552):
  • Die PCR-Amplifikation des Primer PCR-Amplikonproduktes ist oben mit dem Primerpaar und Amplifikations-Reaktionsbedingungen gezeigt, und das unten gezeigte, folgende PCR-Amplifikationsprotokoll wird verwendet:
  • Die 27 3'-terminalen Basen des ersten primären PCR-Amplikonproduktes überlappen mit den 27 5'-terminalen Basen des zweiten primären PCR- Amplikonproduktes; das resultierende 1.976 bp überlappende sekundäre PCR- Amplikonprodukt wird durch 0,8% Agarose/TBE-Elektrophorese gereinigt, mit Hind III und Dra III verdaut, und das 1.941 bp-Produkt in, mit Hind III und Dra III verdaute pcDNA3 ligiert und mit CIAP behandelt. Dieses Konstrukt ist als pCDNAELVIS3' bekannt. Das pCDNAELVIS3'-Konstrukt wird mit Bsi WI und Pvu I verdaut, und das resultierende 5197 bp-Fragment wird durch 0,8% Agarose/TBE- Electrophorese gereinigt und mit dem durch Verdau von pVGELVIS mit Bsi WI und Pvu I isolierten 11.398 bp-Fragment ligiert und mit CIAP behandelt, gefolgt durch 0,8% Agarose/TBE-Elektrophorese und Geneclean. Das resultierende Konstrukt weist 16.595 bps auf und ist als pVGELVISdl3' bekannt.
  • Um die Fähigkeit von pVGELVISHDV- und pVGELVISdl3'-Plasmiden zu testen, eine für das Wildtyp-Sindbisvirus charakteristische Infektion zu initiieren, werden die DNA-Klone mit Lipofektamin (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), gemäß den durch den Lieferanten vorgeschlagenen Bedingungen (ca. 5 ug DNA/8 mg Lipidreagens), komplexiert und zu 35 mm Schalen, welche BHK-21-Zellen mit ungefähr 75% Konfluenz enthalten, hinzugegeben. Wenn ein CPE durch dieses Verfahren beobachtet wird, kann 1 ml des Transfektionsüberstandes verwendet werden, um frische BHK-21-Monolayer zu infizieren, oder alternativ kann der Spiegel des Sindbisvirus in den Überständen direkt durch einen Plaque-Test quantifiziert werden.
  • In anderen Anwendungen ist es wünschenswert, den CMV-Promotor, welcher in dem pcDNA3-Plasmid enthalten ist, gleich neben der Sindbis-genomischen cDNA anzuordnen, so daß die in vivo-Transkriptionsinitiation in vivo dem authentischen 5'-Ende des viralen Nukleotids entspricht. Die CMV-Promotorstartstelle auf dem Plasmid pcDNA3 ist durch Kartierung des Transkriptionsinitiationspunktes in vitro bestimmt worden. Dies wird zuerst durch Verdau des pcDNA3-Plasmides mit der Dra III-Restriktionsendonuklease (New England Biolabs Inc., Beverly, MA), gemäß den Anweisungen des Herstellers, durchgeführt. Dra III spaltet das Plasmid einmal bei Nukleotid 1546, wobei ein lineares 5446 bp-DNA-Molekül resultiert. Die DNA wird unter Verwendung des Geneclean II-Kit (BIO 101 San Diego, CA), exakt wie in den Anweisungen angegeben, gereinigt. Ein linearisiertes pcDNA3 wird mit dem HeLa-Nuclear-Extract-in-vitro-Transkriptionssystem (Promega Korp., Madison, WI) in einer Reaktion, welche 3 ug linearisierten pcDNA3, 400 uM jedes Ribonukleotides, 3 mM MgCl&sub2; und 8 Einheiten bzw. Units von HeLa- Zellkernextrakt enthält, transkribiert. Die 25 uL Reaktion wird für eine Stunde bei 35ºC inkubiert. Eine Einheit RQ1-DNAse (Promega Korp., Madison, WI) und 40 Einheiten RNAsin (Promega Korp., Madison, WI) werden zu der Reaktion hinzugegeben und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert, um die DNA-Matrize zu entfernen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 175 uL Stop Mix (geliefert mit dem HeLa-Extrakt) beendet. Die Reaktion wird mit einem gleichen Volumen Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol (25 : 24 : 1), gefolgt von einer Extraktion mit Chloroform- Isoamylalkohol (24 : 1), extrahiert. Die Reaktion wird mit 500 uL absolutem Ethanol präzipitiert. Die RNA wird durch Zentrifugation bei 12.000 · g für 15 Minuten pelletiert. Das Pellet wird mit 80% Ethanol gespült und in 20 uL Wasser resuspendiert.
  • Ein zu dem SP6-Promotor komplementärer Primer (ATTTAGGTGACACTATAG, BRL Korp., Bethesda, MD) wird an dem 5'-Ende mit ³²P durch Mischen von 10 pmol Primer mit einem zweifachen Überschuß von gamma ³²P-ATP (ICN Corp., Irvine, CA), zehn Einheiten der T4-Polynukleotid-Kinase (Promega Corp., Madison, WI) und 1X Kinase-Puffer (zusammen mit der T4-Kinase geliefert), markiert. Die Reaktion wird für 30 Minuten bei 37ºC und dann für 5 Minuten bei 95ºC inkubiert.
  • Die in vitro-transkribierte RNA wird an den markierten Primer durch Mischen von 10 uL RNA mit 1,5 umol Primer gebunden bzw. annealed. Die Mischung wird auf 90ºC erhitzt und langsam abkühlen lassen. Die Mischung wird auf 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 40 uM jedes dNTP und 15 Einheiten der AMV-Reversen Transkriptase (USB Korp., Cleveland, OH) eingestellt. Die Reaktionsmischung wird bei 42ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe eines Drittelvolumens 95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol FF beendet.
  • Das pcDNA3-Plasmid wird unter Verwendung des gleichen, oben beschriebenen ³²P-markierten Primer durch Verwendung des fmol-DNA-Sequenzierungssystems (Promega Corp., Madison, WI), exakt wie in den Anweisungen beschrieben, sequenziert. Die Sequenzreaktionen werden auf ein 6% denaturierendes Gel, angrenzend an 2 uL einer Primer-verlängerten in vitro RNA-Reaktion, geladen. Das Gel wird für eine Stunde bei 1600 V elektrophoresiert, getrocknet und mit einem Film über Nacht exponiert. Die Gesamtlängen-cDNA-Bande kann mit den peDNA3-Sequenzspuren verglichen werden, um die Transkriptionsinitiationsstelle zu bestimmen. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann die Transkriptionsinitiationsstelle des CMV-Promotors auf exakt 39 Basen stromabwärts zu dem CMV-Promotor beim G-Rest mit der Nukleotidzahl 858 (gemäß dem Numerierungssystem des Invitrogen pcDNA3-Vektor) bestimmt werden.
  • Der CMV-Promotor des pcDNA3-Plasmids wird dann neben die Sindbis-cDNA durch überlappende PCR unter Verwendung der, wie oben beschriebenen, Verfahren für die Konstruktion von pVGELVIS angeordnet. Der genaue Transkriptionsinitiationspunkt eines jeden RNA-Polymerase-II-Promotors kann durch die oben beschriebenen Verfahren bestimmt werden, was eine annähernde Nebeneinanderanordnung des Promotors in der ELVIS-Konfiguration erlaubt. Die Verwendung eines induzierbaren Promotors in der ELVIS-Konfiguration erlaubt, die Initiation der Infektion in transfizierten Zelllinien zu kontrollieren.
    • BEISPIEL 3 HERSTELLUNG VON RNA- UND PLASMID-DNA-SINDBIS-VEKTOREN A. KONSTRUKTION DES SINDBIS-BASIS-VEKTORS
  • Der erste Schritt in der Konstruktion des Basis-Sindbis-Vektor ist die Erzeugung von zwei Plasmid-Subklonen, welche getrennte Elemente für die viralen 5'- und 3'- Enden enthalten, welche anschließend verwendet werden, um die Basis- Gentransfer-Vektoren zusammenzubauen. Der erste Plasmid-Subklon enthält 40 terminale Nukleotide am viralen 3'-Ende und eine 25 Basenstrecke von dA:dT- Nukleotiden. Das 3'-Ende des Vektors wird chemisch synthetisiert, um die Sequenz des unten gezeigten Primerpaars aufzuweisen. Forward-Primer: SIN11664F: (Puffersequenz/Not I-Schnittstelle/SIN Nukleotide 11664-11698): Reverse Primer: SINXba11700R (Puffersequenz/Sac I Schnittstelle dT25/SIN Nukleotide 11700-11692):
  • Die oberen Nukleotide werden in gleichen molaren Konzentrationen in Anwesenheit von 10 mM Mg Cl&sub2; gemischt, für 5 Minuten auf 100ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das teilweise doppelsträngige Molekül wird dann unter Verwendung der Klenow-DNA-Polymerase und 50 uM dNTPs aufgefüllt. Das 89 bp-Molekül wird dann mit Not I und Sac I verdaut, auf einem 2% NuSieve-/1% Agarosegel gereinigt, in das pKS II&spplus; Plasmid ligiert, mit Not I und Sac I verdaut und mit CIAP bei einem 10 : 1 molaren Überschuß von Insert : Vektor- Verhältnis behandelt. Dieses Konstrukt ist als pKSII3'SIN bekannt.
  • Der zweite Plasmid-Subklon enthält 5' 7.643 bps einschließlich eines 5' terminalen RNA-Polymerasepromotors von Sindbis. Das 3'-Ende dieses Klons wird durch PCR-Amplifikation mit einem Reverse-Primer mit der unten gezeigten Sequenz abgeleitet. Reverse-Primer: SINXho7643R (Puffersequenz/Xho I Schnittstelle/SIN Nukleotide 7643-7621):
  • Der Reverse-Primer wird von den viralen Nukleotiden 7643-7621 dargestellt und liegt 41 bps stromabwärts von dem Verbindungskernelement des 3'-Endes. Zusätzlich liegt das virale Nukleotid 7643 4 Nukleotide stromaufwärts zu dem strukturellen Protein-Translationsinitiationspunkt. Die ersten 5 5'-Nukleotide in diesem Primer, denen 6 Nukleotide, umfassend eine Xho-1-Erkennungssequenz, folgen, sind enthalten, um als "Puffersequenz" für den effizienten Verdau des PCR-Amplifizierungsproduktes zu dienen.
  • Der Forward-Primer in dieser Reaktion ist Primer 2A (beschrieben in Beispiel 1), mit der folgenden Sequenz:
  • Das 4510 bp-Amplikonprodukt, welches aus dem PCR-Experiment, unter Verwendung der oben gezeigten Primer mit dem pVGSP6GENrep-Plasmid resultiert, wird mit den Enzymen Sfi I und Xho I verdaut. Das resultierende 2526 bp-Fragment wird auf einem Gel gereinigt. Der Sindbis-cDNA-Klon pVGSP6GENrep wird mit Apa I und Sfi I verdaut. Das 5144 bp-Fragment wird auf einem Ge1 gereinigt und zusammen mit dem 2526 bp-Sfi I/Xho I-verdauten Fragment und den Apa I- und Xho I-verdauten CIAP ehandelten pKS II&spplus;- Plasmiden ligiert. Ein Klon wird mit den Sindbis-Nukleotiden 1-7643, einschließlich des RNA-Polymerasepromotors am 5'-Ende, welcher in dem pKSII+Plasmid enthalten ist, isoliert. Dieses Konstrukt ist als pKSII5'SIN bekannt.
  • Der Zusammenbau des vollständigen Basisvektors wird durch Verdau von pKS5'SIN mit Xho I und Sac I, Behandlung mit CIAP und Gelreinigung des 10.533 bp-großen-Fragmentes durchgeführt. Das pKSS'SIN-10.533-bp-Fragment wird zusammen mit dem 168 bp-kleinen-Fragment, welches durch den Verdau des pKSII3'SIN mit Xho I und Sac I resultiert, ligiert. Dieses Konstrukt ist als pKSSINBV bekannt und ist schematisch in Fig. 4 gezeigt.
  • Das Glühwürmchen-Luziferase-Reportergen wird in den Sindbis-Basisvektor insertiert, um die Expression eines heterologen Genes in Zellen, welche mit RNA transfiziert wurden, welche aus in vitro Transkription des Sindbis-Vektorklones resultiert, zu zeigen. Dieses Experiment zeigt die gesamte Funktionsfähigkeit des Sindbis-Vektors.
    • B. KONSTRUKTION DES SINDBIS-LUZIFERASE-VEKTORS
  • Die Konstruktion des Sindbis-Luziferase-Vektors wird durch Zusammenbau der Komponenten aus 3 unabhängigen Plasmiden durchgeführt: pKSII5'SIN, pKSII3'SIN und pGL2-Basisvektor. Das pGL2-Basisvektorplasmid (Promega, Madison, WI) enthält das gesamte Glühwürmchen-Luziferase-Gen. Das Luziferase-Gen wird als erstes in das pKSII3'SIN-Plasmid insertiert. Dieses wird durch Gelreinigung des 2689 bp-Luziferase-enthaltenden Fragmentes ausgeführt, welches durch Verdau des pGL2-Basisvektors mit Bam HI und Hind III und Ligation mit dem in einem Gel gereinigten 3008 bp großen Fragment resultiert, welches durch Verdau mit Bam HI und Hind III und Behandlung mit CIAP von pKSII3'SIN resultiert. Dieses Konstrukt ist als pKSII3'SIN-luc bekannt.
  • Der Endzusammenbau des Sindbis-Luziferase-Vektors wird durch Verdau von pKS5'SIN mit Xho I und Sac I, Behandlung mit CIAP und Gelreinigung des 10.533 bp großen Fragmentes durchgeführt. Das pKS5'SIN 10.533 bp-Fragment wird, mit dem 2854 bp kleinen Fragment zusammen ligiert, welches durch Verdau von pKSII3'SIN-luc mit Xho I und Sac I resultiert. Dieses Konstrukt enthält die gesamte Sindbis-Nicht-Strukturgen-kodierende-Region und 3'-virale Elemente, welche für die Genomreplikation wichtig sind. Das Glühwürmchen-Luziferase-Gen wird zwischen diese zwei viralen 5'- und 3'-Elemente plaziert. Dieser Vektor ist als pKSSINBV-luc bekannt und wird in Fig. 4 schematisch gezeigt. Die SIN-BV- Konstrukte zwischen Ffi I und Sac I werden in pGVELVIS zwischen Ffi I- und Xba I-Schnittstellen ausgewechselt. Die Expression der heterologen Gene wird nach Transfektion in BHK-Zellen beobachtet.
    • C. EXPRESSION DER LUZIFERASE IN TRANSFIZIERTEN UND INFIZIERTEN BHK-ZELLEN
  • Um die Funktionsfähigkeit des Sindbis-Basisvektors, die Expression der Luziferase in mit in vitro-transkribierter RNA transfizierten Zellen, wie in Beispiel 1 beschrieben, von pKSSINBV-luc zu überprüfen, wird durch Verdau mit Sac I linearisiert. Zusätzlich wird ein komplementärer Verpackungsvektor, von dem die meiste Nicht-Strukturgen-Region deletiert ist, durch Verdau von pVGSP6GENrep mit Bsp E1 konstruiert und unter Verdünnungsbedingungen ligiert. Dieses Konstrukt ist als pVGSP6GENdlBsp bekannt und weist deletierte Nicht- Strukturgen-Sequenzen zwischen den Basen 422-7.054 auf. Dieser Klon weist 8.008 bps auf und ist schematisch in Fig. 5 gezeigt. Die in vitro-Transkription von pVGSP6GENdfBsp ist wie in Beispiel 1 beschrieben; linearisiert wird mit Xba I. Die Expression der Luziferase in transfizierten Zellen wird 24 h nach Transfektion überprüft. Transfektionen und Kotransfektionen werden durch direkte Komplexierung von in vitro-Transkriptionsprodukten mit Lipofectamin (Gibco-BRL, Gaithersberg, MD) durchgeführt. Zusätzlich wird 1 ml des Überstandes verwendet, um einen konfluenten Monolayer von BHK-Zellen zu infizieren, und die Expression der Luziferase wird 24 h nach Infektion überprüft. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen deutlich eine reichliche Reportergen-Expression nach der Transfektion der BHK-Zellen und dem Transfer (z. B. Verpackung) der Expressionsaktivität, wenn die Zellen mit in vitro transkribierten pVGSP6GENdlBsp kotransfiziert werden.
    • D. KONSTRUKTION EINER VERÄNDERTEN VERBINDUNGSREGION IN SINDBIS-VEKTOREN
  • 1. Um die Verbindungsregion zu inaktivieren, werden die Nukleotide in dem Überlappungsbereich des carboxyterminalen NSP4 und der Verbindungsregion geändert, und die Vektor-Nukleotide, welche Sindbis entsprechen, werden vor dem subgenomischen Initiationspunkt bei Sindbis-Nukleotid 7598 terminiert bzw. beendet. Dieses Konstrukt ist schematisch in Fig. 7 gezeigt.
  • Kurz gesagt, ein Fragment wird durch PCR von dem pKSSINBV Klon unter nicht- stringenten Reaktionszyklus-Bedingungen, unter Verwendung eines Reverse- Primers, mit der folgenden Sequenz amplifiziert:
  • Die unterstrichenen Basen in dem Reverse-Primer beziehen sich auf Nukleotidänderungen in der Verbindungsregion, ohne die kodierte Aminosäure (siehe unten) zu beeinflussen. Alle diese Nukleotidänderungen sind Transversionen. 3'-Ende von NSP 4 (virale Nukleotide 7580-7597):
  • (resultierende Nukleotid-Änderungen von dem Reverse-Primer)
  • Der Reverse-Primer ist zu den Sindbis-Nukleotiden 7.597-7.566 (ausgenommen bei den Nukleotiden, wo, wie gezeigt, Verbindungsregionänderungen durchgeführt wurden) komplementär und schließt an seinem 5' Ende die 6 Nukleotid Apa 1- Erkennungssequenz, welche auf eine 5'-terminale TATAT-Schwanz- "Puffersequenz" für effizienten Enzymverdau folgt, ein.
  • Der Forward-Primer in dieser Reaktion ist Primer 2A (beschrieben in Beispiel 1) mit der folgenden Sequenz:
  • Das 4.464 bp-Amplikon, welches aus einer PCR-Reaktion mit pKSSINBV, unter Verwendung des oben beschriebenen Primerpaares resultiert, wird mit Sfi I und Apa I verdaut, und das in einem Gel gereinigte 2.480 bp-Fragment wird zusammen mit dem in einem Gel gereinigten 5.142 bp-Fragment, welches aus dem Verdau von pKSSINBV mit Apa I und Sfi I resultiert und mit dem Gelgereinigten 2.961 bp Fragment, welches aus dem Verdau von pKSII+ mit Apa I und aus der Behandlung mit CIAP resultiert, ligiert. Dieses Konstrukt, welches die Sindbis-Nukleotide 1-7.597 umfaßt, einschließlich der oben beschriebenen Änderungen in der Verbindungsregion und einschließlich des bakteriellen T7- Promotors, welcher an Sindbis-Nukleotid 1 gebunden ist, wird als pKS5'SINdlJR bezeichnet.
  • Das Endkonstrukt des inaktivierten Verbindungsregion-Vektors wird durch Ligierung des 7.622 bp-großen Sindbis Fragmentes, welches aus dem Verdau von pKSS'SINdiJR mit Apa 1 resultiert, mit dem 3.038 bp Fragment, welches aus dem Verdau mit Apa I und Behandlung mit CIAP von pKSII3'SIN resultiert, durchgeführt. Die positive Orientierung des 5'-Sindbis-Elementes, relativ zu dem 3'-Sindbis-Element, wird durch Restriktionsendonuklease-Analyse bestätigt. Dieses Konstrukt wird als pKSSINBVdlJR bezeichnet.
  • Die Initiation und Synthese der subgenomischen mRNA kann nicht vom pKSSINBVdlJR-Vektor stattfinden. Um diese Annahme zu bestätigen, werden vergleichende RNase-Schutz-Tests der pKDDINBV und pKSSINBVdlJR-Vektoren durchgeführt. Eine ³²P-endmarkierte RNA-Probe, welche zum Teil zur Verbindungsregion komplementär ist, wird, einschließlich des subgenomischen RNA-Initiationspunktes beim viralen Nukleotid 7.598, verwendet, um mit der viralen RNA, welche aus der Transfektion von BHK-21-Zellen mit dem pKSSINBV und pKSSINBVdlJR-Vektoren resultiert, zu hybridisieren. Der RNase-Schutz-Test zeigt, daß die Zellen, welche mit pKSSINBV transfiziert werden, zwei Fragmente mit genomischer und subgenomischer Spezifität aufweisen, während Zellen, welche mit pKSSINBVdlJR transfiziert werden, nur ein einzelnes Fragment mit genomischer Spezifität aufweisen. Diese Ergebnisse beweisen, daß die Verbindungsregion in dem pKSSINBVdlJR-Vektor tatsächlich inaktiviert ist.
  • 2. Um zu überprüfen, ob die Translation der genomischen RNA von der Region der subgenomischen RNA-Botschaft entspricht, wird das Luziferase- Reportergen, wie oben beschrieben, in den inaktivierten Verbindungsregion- Vektor pKSSINBVdlJR insertiert. Dieses Konstrukt wird durch Verdau des pKSSINBVdlJR-Plasmides mit Xho I und Sac I und Behandlung mit CIAP und Gelreinigung des resultierenden 10.197 bp-Fragmentes durchgeführt. Das pKSSINBVdlJR-Fragment wird zusammen mit dem 2.854 bp-kleinen Fragment, welches aus dem Verdau von pKSII3'SIN-luc mit Xho I und Sac I resultiert, ligiert. Diese Konstruktion enthält die gesamte Sindbis-Nichtstrukturgen-kodierende Region, welche in einer inaktivierten Verbindungsregion bei Sindbis-Nukleotid 7597 und 3'-viralen Elementen, welche für die Genomreplikation erforderlich sind, abschließt; das Glühwürmchen-Luziferase-Gen wird zwischen diese zwei viralen 5'- und 3'-Elemente plaziert. Dieser Vektor ist als pKSSINBVdlJR-luc bekannt.
  • Die Expression des Reportergens des PKSSINBVdlJR-luc-Vektors wird in transfizierten BHK-21-Zellen überprüft. Die Translation des funktionalen Luziferaseproteins wird in einem Luziferin-Lumineszenztest unter Verwendung eines Luminometers zum Nachweis bestimmt. Die Sensivität dieses Tests liegt bei 1 · 10-20 Mol der Luziferase. Vorausgesetzt, daß das Molekulargewicht der Luziferase 62.000 Dalton aufweist, wandelt die Nachweisgrenze 6.020 Moleküle um. Deshalb wird in einem typischen Experiment, wenn nur 0,6% der 1 · 10&sup6; Zellen, welche in einer 60 mm Petrischale enthalten sind, mit dem pKSSINBVdlJR-luc-Vektor transfiziert werden, und wenn diese transfizierten Zellen nur ein einzelnes funktionierendes Luziferasemolekül exprimieren, die enzymatische Aktivität durch den verwendeten Test nachgewiesen. Es ist wichtig, in diesem Experiment zu zeigen, daß die Verbindungsregion des pKSSINBVdlJRluc-Vektors inaktiviert ist. Dies wird durch einen RNase-Schutz-Test durchgeführt, welcher die synthetisierten viralen RNAs in mit den pKSSINBVdlJR-luc- und den pKSSINBV-luc-Vektoren transfizierten Zellen unter Verwendung der oben beschriebenen Probe vergleicht.
  • 3. Das minimale -19-> +5 Verbindungsregionkern/-Oligonukleotidpaar, welches Sindbis-Nukleotide 7579-7602, wie kürzlich definiert (Levis et al., J. Virol. 64: 1726-1733, 1990) umfaßt, wird in vitro synthetisiert und durch Apa I und Xho I- Erkennungssequenzen, wie gezeigt, flankiert: Oligonukleotid 1: Oligonukleotid 2:
  • Die obigen Oligonukleotide werden zusammen in Gegenwart von 10 mM Mg²&spplus; gemischt, auf 100ºC für 5 Minuten erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die annealten Oligonukleotide werden in einem 25 : 1 molaren Verhältnis von Insert zu dem pKSSINBVdlJR-Vektor ligiert, hergestellt entsprechend: vollständiger Verdau mit Xho L, gefolgt durch Verdau mit Apa I unter unvollständigen Bedingungen, wobei eine Apa I induzierte Spaltung pro Molekül (von zwei möglichen Spaltungen) resultiert, Gelreinigung des 10.655 bp- Fragmentes und Behandlung mit CIAP. Dieser Vektor, welcher die gesamte NSP- kodierende Region enthält, welche in einem inaktivierten Verbindungsregionkern, gebunden an einen synthetischen Verbindungsregionkern und gefolgt durch 3' virale Elemente, welche für die Replikation benötigt werden, abschließt und in dem pKSII+-Plasmid enthalten ist, ist als pKSSINdlJRsjrc bekannt.
  • Um den Spiegel der subgenomischen RNA-Synthese zu regulieren, werden weitere Modifikationen des tandemartig insertierten Verbindungsregionkernes in dem Plasmid pKSSINdlJRsjrc durchgeführt. Diese Modifikationen des Verbindungsregionkernes werden durch zwei Ansätze durchgeführt; Nukleotidänderungen in dem Verbindungsregionkern oder Ausdehnung auf die 5'- und 3'-Verbindungsregionkernenden der flankierenden Sindbisnukleotide, gemäß der authentischen viralen Sequenz. Der minimale Verbindungsregionkern, welcher an den viralen Nukleotiden 7579-7602 liegt, ist unten gezeigt:
  • Durch Vergleich der genomischen Sequenz zwischen acht Alphaviren ist kürzlich gezeigt worden, daß es eine Sequenzabweichung in dem Verbindungsregionkern gibt. Nachstehend ist für bestimmte Verbindungsregionbereiche das Sidnbisnukleotid, gefolgt von entsprechenden Nukleotiden, welche in anderen Alphaviren gefunden werden, gezeigt:
  • Verbindungsregionänderungen an den Sindbis-Nukleotiden 7579, 7580, 7581, 7583, 7589, 7590, 7591, 7592 ergeben mögliche Aminosäure-kodierende Änderungen in allen 5 Codons des Carboxyterminus von NSP 4, welcher mit der Verbindungsregion überlappt. Diese in der Verbindungsregion beobachteten Änderungen zwischen Alphaviren auf der Ebene des NSP 4-kodierenden Potentials und auf der Ebene der Verbindungsregion-cis-Aktivität können sowohl permissive Änderungen in NSP 4 als auch der Verbindungsregion, welche die Funktionalität nicht beeinflussen, oder auf der anderen Seite einfach unterschiedliche Viren darstellen. Auf jeden Fall betreffen die hierin präsentierten Änderungen den tandemartiginsertierten Verbindungsregionkern, von welchem keine NSP-Proteinsynthese stattfindet. Wie vorstehend diskutiert, findet die Translation der gesamten NSP-Region von dem pKSSINBVdlJR-Konstrukt statt. Die Verbindungsregionänderungen an den Sindbis-Nukleotiden 7600 und 7602 liegen stromabwärts zu dem NSP 4-Terminationscodon und stromaufwärts zu dem strukturellen Proteininitiationscodon.
  • Orte der Nukleotidunterschiede in dem Verbindungsregionkern, welche zwischen den unterschiedlichen Alphavirusstämmen beobachtet werden, werden hier als permissive Änderungen bezeichnet. Orte der Nukleotide in dem Verbindungsregionkern, welche den konservierten Sequenzen zwischen den unterschiedlichen Alphavirusstämmen entsprechen, werden hier als nicht- permissive Änderungen bezeichnet.
  • Um den Spiegel der subgenomischen mRNA-Initiation von dem synthetischen Verbindungsregionkern zu verringern, werden getrennt Änderungen in Nukleotiden, welche den permissiven Änderungen entsprechen und in Nukleotiden, welche den nicht-permissiven Änderungen entsprechen, gemacht. Die Verbindungsregionnukleotide, welche den permissiven Änderungen entsprechen, sind in der obigen Tabelle angegeben. Vierzehn Verbindungsregionnukleotide, an welchen keine Änderungen unter den acht sequenzierten Alphaviren (Semliki Forest Virus, Middleburg Virus, Ross River Virus, O'Nyong Nyong Virus, Eastern Equine Encephalitis Virus, Western Equine Encephalitis Virus und Venezuelan Equine Encephalitis Virus) beobachtet werden, sind unten angegeben:
    • Nukleotidzahl
  • 7582
  • 7584
  • 7585
  • 7586
  • 7587
  • 7588
  • 7593
  • 7594
  • 7595
  • 7596
  • 7597
  • 7598
  • 7599
  • 7601
  • Änderungen in der Verbindungsregion, welche unter Alphaviren beobachtet werden, können eine spezifische Wechselwirkung zwischen einer gegebenen alphaviralen RNA-Polymerase und ihrer verwandten Verbindungsregion wiederspiegeln. Daher können Änderungen unter den "permissiven" Nukleotiden, wie angemerkt, in einer Verringerung der subgenomischen mRNA-Synthese- Spiegel als Änderungen unter den "nicht-permissiven" Nuklevtiden der Verbindungsregion, resultieren. Auf der anderen Seite können diese tatsächlich Stellen von permissiven Änderungen in dem Verbindungsregionkern sein.
  • Die einzige wirkliche nicht-permissive Änderung in dem Verbindungsregionkern ist möglicherweise Sindbis-Nukleotid 7598, welches dem subgenomischen mRNA- Initiationspunkt entspricht. Änderungen dieses Nukleotides in dem tandemartiginsertierten Verbindungsregionkerns des Plasmides pKSSINdlJRsjrc sind hier nicht beschrieben.
  • Die Substitution der permissiven Nukleotide insgesamt in dem synthetischen minimalen -19-> +5 Verbindungsregionkern wird mit folgendem Nukleotidpaar durchgeführt, welches in vitro synthetisiert und von Apa I- und Xho I- Erkennungssequenzen, wie gezeigt, flankiert wird: Oligonukleotid 1: Oligonukleotid 2:
  • Die obigen Oligonukleotide werden miteinander in Gegenwart von 10 mM Mg gemischt, auf 100ºC für 5 Minuten erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die annealten Oligonukleotide werden in einem 25 : 1 molaren Verhältnis von Insert zu pKSSINBVdlJR-Vektor ligiert, hergestellt entsprechend: vollständiger Verdau mit Xho I, gefolgt durch Verdau mit Apa I unter unvollständigen Bedingungen, welche eine Apa I-induzierte Spaltung pro Molekül (bei zwei möglichen Spaltungen) ergeben, Gelreinigung des 10.655 bp- Fragmentes und Behandlung mit CIAP. Dieser Vektor ist als pKSSINdlJRsjrPc bekannt.
  • Jedes der 13 (Nukleotid 7598 nicht geändert) nicht-permissiven Nukleotide in dem Verbindungsregionkern wird, unter Verwendung folgender Regeln, welche die drastischste transversale Substitution ergeben, individuell geändert:
  • A → C
  • T → G
  • G → T
  • C → A
  • Beispielsweise wird Nukleotid 7582 von T → G unter Verwendung des folgenden Oligonukleotidpaares geändert, welches in vitro synthetisiert und durch Apa I- und Xho I-Erkennungssequenzen, wie gezeigt, flankiert wird: Oligonukleotid 1: Oligonukleotid 2:
  • (Nukleotide, welche Transversion an nicht-permissiven Verbindungsregionstellen bewirken, werden in fetter Schrift gezeigt)
  • Die obigen Nukleotide werden zusammen in Gegenwart von 10 mM Mg²&spplus; gemischt, auf 100ºC für 5 Minuten erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die annealten Oligonukleotide werden in einem 25 : 1 molaren Verhältnis von Insert zu dem pKSSINBVdlJR-Vektor ligiert, hergestellt entsprechend: kompletter Verdau mit Xho I, gefolgt durch Verdau mit Apa I unter unvollständigen Bedingungen, welche eine Apa I-induzierte Spaltung pro Molekül (bei zwei möglichen Spaltungen) ergeben, Gelreinigung des 10.655 bp Fragmentes und Behandlung mit CIAP. Der Vektor ist als pKSSINdlJRsjrNP7582 bekannt.
  • Unter Verwendung der oben gezeigten Transversionsänderungsregeln werden Änderungen in jeder der 12 verbleibenden nicht-permissiven Stellen in dem Verbindungsregionkern mit 12 getrennten Oligonukleotidpaaren, flankiert mit Apa I- und Xho I-Erkennungssequenzen, wie oben beschrieben, durchgeführt. Diese Vektoren sind bekannt als:
  • pKSSINdlJRsjrNP7584
  • pKSSINdlJRsjrNP7585
  • pKSSINdlJRsjrNP7586
  • pKSSINdlJRsjrNP7587
  • pKSSINdlJRsjrNP7588
  • pKSSINdlJRsjrNP7593
  • pKSSINdlJRsjrNP7594
  • pKSSINdlJRsjrNP7595
  • pKSSINdlJRsjrNP7596
  • pKSSINdlJRsjrNP7597
  • pKSSINdlJRsjrNP7599
  • pKSSINdlJRsjrNP7601
  • Um die relativen Spiegel der subgenomischen mRNA-Synthese zu überprüfen, wird das Luziferasereportergen in die modifizierten Tandemverbindungsregion- Vektoren insertiert. Dieses Konstrukt wird durch Verdau mit Xho I und Sac I und Behandlung mit CIAP der tandemartig insertierten synthetischen Verbindungsregionkern-Vektoren und Gelreinigung des resultierenden ungefähr 10.200 bp-Fragmentes erreicht. Das so behandelte Vektorfragment wird zusammen mit dem 2854 bp-kleinen Fragment, welches aus dem Verdau von pKS113'SIN-luc mit Xho I und Sac I resultiert, ligiert. Diese Konstruktionen enthalten die gesamte Sindbis-Nicht-Strukturgen-kodierende Region, welche in einer inaktivierten Verbindungsregion bei Sindbis-Nukleotid 7597, dem tandemartig insertierten synthetischen Verbindungsregionkern (modifiziert oder nicht-modifiziert), dem Glühwürmchen-Luziferase-Gen und den 3'-viralen Elementen, welche für die Genomreplikation notwendig sind, abschließt. Die Bezeichnungen dieser Vektoren sind wie folgt:
    • Sindbis-Luziferasevektor tandemartig insertierte Verbindungsregion-Modifikation
  • pKSSINdlJRsjrc-luc Nicht modifiziert
  • pKSSINdlJRsjrPe-luc Permissive Änderungen
  • pKSSINdlJRsjrNP7582-luc Nicht-permissive Änderungen
  • pKSSINdlJRsjrNP7584-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7585-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7586-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7587-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7588-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7593-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7594-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7595-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7596-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7597-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7599-luc "
  • pKSSINdlJRsjrNP7601-luc "
  • Unter der Annahme, daß die Translationeffizienzen in allen oben unmittelbar gezeigten Luziferase-Vektoren gleich sind, werden die relativen Spiegel der subgenomischen Synthese durch Vergleich der Luziferaseproduktion 16 Stunden nach Infektion der BHK-21-Zellen verglichen. Die relativen Spiegel der subgenomischen Transkription werden durch Vergleichen der Luziferaseproduktion durch die Vektoren pKSSINBV-luc und pKSSINdlJRsjrc-luc mit allen oben gezeigten Luziferase-Vektoren der modifizierten Verbindungsregion bestimmt.
  • Es wird erwartet, daß die Vektoren, welche den tandemartig insertierten synthetischen Verbindungsregionkern (pKSSINdlJRsjrc und Derivate davon) enthalten, einen niedrigeren Spiegel der subgenomischen mRNA-Expression relativ zu dem pKSSINBV-Konstrukt aufweisen werden. In bestimmten Ausführungsformen kann es erforderlich sein, den Spiegel der subgenomischen mRNA-Expression, welcher von dem pKSSINdlJRsjrc-Vektor beobachtet wird, zu vergrößern. Dies wird durch Ausdehnung an den 5' und 3' synthetischen Verbindungsregionkernenden mit 11 zusätzlichen flankierenden Sindbis- Nukleotiden gemäß der authentischen viralen Sequenz erreicht.
  • Das unten gezeigte synthetische Oligonukleotidpaar wird in vitro synthetisiert und enthält 46 Sindbis-Nukleotide, einschließlich aller 24 Nukleotide (gezeigt in Fettschrift) des minimalen Verbindungsregionkerns. Die Sindbis-Nukleotide werden durch die Apa I- und Xho I-Erkennungssequenzen, wie gezeigt, flankiert: Oligonukleotid 1: Oligonukleotid 2:
  • Die oberen Oligonukleotide werden zusammen in Anwesenheit von 10 mM Mg gemischt, auf 100ºC für 5 Minuten erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die annealten Oligonukleotide werden in einem 25 : 1 molaren Verhältnis von Insert zu dem pKSSINBVdlJR-Vektor ligiert, hergestellt entsprechend: vollständiger Verdau mit Xho I, gefolgt durch Verdau mit Apa I unter unvollständigen Bedingungen, welche eine Apa I-induzierte Spaltung pro Molekül (bei zwei möglichen Spaltungen) ergeben, Genreinigung des 10.655 bp- Fragmentes und Behandlung mit CIAP. Dieser Vektor, welcher die gesamte NSP- kodierende Region enthält, welche an einem inaktivierten Verbindungsregionkern, verknüpft mit einer ausgedehnten synthetischen Verbindungsregion und gefolgt durch 3' virale Elemente, welche für die Replikation benötigt werden und in dem pKSII+Plasmid enthalten sind, abschließt, ist als pKSSINdlJRsexjr bekannt.
  • Um die relativen Spiegel der subgenomischen mRNA-Synthese zu überprüfen, wird das Luziferase-Reportergen in den ausgedehnten Tandem- Verbindungsregion-pKSSINdlJRsexjr-Vektor insertiert. Dieses Konstrukt wird durch Verdau mit Xho 1 und Sac I und Behandlung mit CIAP des pKSSlNdlJRsexjr-Plasmids und Gelreinigung des resultierenden ungefähr 10.200 bp Fragmentes erreicht. Das so behandelte Vektorfragment wird zusammen mit dem 2854 bp-kleinen Fragment, welches durch den Verdau von pKSII3'SIN-luc mit Xho I und Sac I resultiert, ligiert. Diese Konstruktion enthält die gesamte Sindbis-Nichtstruktur-Gen kodierte Region, welche in einer inaktivierten Verbindungsregion des Sindbis-Nukleotids 7597, der tandemartig insertierten ausgedehnten synthetischen Verbindungsregion, dem Glühwürmchen-Luziferase- Gen und den 3'-viralen Elementen, welche für die Genomreplikation notwendig sind, abschließt. Der Name dieses Vektors ist pKSSlNdlJRsexjr-luc.
  • Die relativen Spiegel der subgenomischen Transkription werden durch Vergleich der Luziferaseproduktion durch den pKSSINdlJRsexjr-luc-Vektor mit den pKSSINBV-luc und pKSSINdlJRsjrc-luc-Vektoren bestimmt.
    • BEISPIEL 5 EXPRESSION VON VERSCHIEDENEN HETEROLOGEN GENEN VON SINDBIS-VEKTOREN
  • Das Plasmid pBS-ECAT (Jang et al., J. Virol 63: 1651, 1989) schließt die 5'-nicht translatierte Region des Enzephalomyocarditis-Virus (EMCV) von den Nukleotiden 260-848 des viralen Genoms ein, welches die interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) enthält. Die EMCV-Nukleotide 260-827 werden von pBS-ECAT durch PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert:
  • EMCV IRES Forward-Primer A (zur Insertion nächstliegend zu der funktionsunfähigen Verbindungsregion in Vektor pKSSINBVdlJR an der ApaI- Schnittstelle):
  • EMCV IRES Forward-Primer B (zur Insertion zwischen heterologen Genen, endend mit Cla I-Schnittstellen und beginnend mit Nco I-Schnittstellen):
  • EMCV IRES Reverse-Primer (zur Verwendung mit entweder Primer A oder B):
  • Das Amplikon, welches aus der Amplifikation mit dem Forward-Primer A und dem Reverse-Primer resultiert, wird durch Apa I- und Nco I-Erkennungssequenzen in einer 5 bp-"Puffersequenz" flankiert.
  • Das Amplikon, welches aus der Amplifikation mit dem Forward-Primer B und dem Reverse-Primer resultiert, wird durch Cla I- und Nco I-Erkennungssequenzen in einer 5 bp-"Puffersequenz" flankiert.
  • Die Amplification der EMCV IRES-Sequenz des pBS-ECAT-Plasmids wird mit dem folgenden PCR-Zyklusprotokoll durchgeführt:
  • Für die Insertion in den pKSSINBVdlJR-Vektor wird das 589 bp-Amplikon mit Apa I und Nco I verdaut, auf einem 1% Agarosegel gereinigt und in den CIAP- behandelten Vektor, welcher mit Apa I und Nco I verdaut wurde, ligiert. Das ATG, entsprechend dem Startcodon des heterologen Gens, welches unmittelbar stromabwärts zu dem EMCV IRES Insert insertiert werden soll, wird zum Erhalt einer Nco I-Schnittstelle (CCATGG) modifiziert.
  • Für die Insertion in die pKSSINBV- oder pKSSINBVdlJRsjrc-Vektoren zwischen heterologene Gene wird das 589 bp-Amplikon mit Cla I und Nco I verdaut, auf einem 1% Agarosegel gereinigt und in den bicistronischen heterologen Gen- Vektor, welcher mit Cla I und Nco I verdaut wird und mit CIAP behandelt wird, ligiert. In einer bicistronischen heterologen Gen-Konfiguration wird das 3'-Ende des stromabwärts liegenden heterologen Genes modifiziert, um in einer Cla 1- Erkennungsstelle zu enden. Das ATG, entsprechend dem Startcodon des zweiten stromabwärts liegenden heterologen Genes, welches unmittelbar stromabwärts von dem EMCV IRES-Insert insertiert werden soll, wird zum Erhalt einer Nco 1- Schnittstelle (CCATGG) modifiziert. Deshalb ist die Reihenfolge der Komponenten von 5' nach 3': pKSSINBV- oder pKSSINBVdlJRsjrc-Gen #1-Cla/Nco EMCV IRES-Gen #2-3'SIN. Die Insertion in allen modifizierten Verbindungsregion- Vektoren, beschrieben in Beispiel 2, folgt der hier angegebenen Strategie für die pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc-Vektoren.
  • Der pKSSINBVdlJR-Vektor, welcher eine bicistronische heterologe Konfiguration enthält, wird mit jedem der oben beschriebenen EMCV IRES-Amplikons konstruiert. Das erste EMCV IRES-Amplikon wird durch Apa I-und Nco I- Schnittstellen flankiert und wird unmittelbar stromabwärts zur funktionsunfähigen Verbindungsregion an der Apa I-Schnittstelle, wie oben beschrieben, insertiert. Dieser EMCV IRES-Sequenz folgt das erste heterologe Gen, welches in einer Cla I-Erkennungssesqenz endet. Dem ersten heterologenen Gen folgt die zweite EMCV IRES-Sequenz unter Verwendung des Amplikons, welches durch Cla I und Nco I-Erkennungssequenzen flankiert wird. Das zweite heterologe Gen folgt der zweiten EMCV IRES-Sequenz. Deshalb ist die Reihenfolge der Komponenten von 5' nach 3': SINBVdlJR-Apa/Nco EMCV IRES Gen #1-Cla/Nco EMCV IRES #2-3' SIN.
  • Das Plasmid pP2-5' (Pelletier et al. Mol. Cell Biol. 8: 1103, 1988) schließt die Nicht-translatierte Region des Poliovirus P2/Lansing-Stammes von den Nukleotiden 1-1.872 des viralen Genoms ein, welches Polio IRES enthält. Die Poliovirusnukleotide 320-631 werden von pP2-5' durch PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaares, amplifiziert:
  • Polio IRES Forward-Primer A (zur Insertion nächstliegend zu der funktionsunfähiges Verbindungsregion in Vektor pKSSINBVdlJR an der Apa I- Schnittstelle):
  • Polio IRES-Forward-Primer B (zur Insertion zwischen heterologen Genen, welche mit Cla I-Schnittstellen abschließen und mit Nco I-Schnittstellen beginnen):
  • Polio IRES Reverse-Primer (zur Verwendung mit einem der Primer A oder B):
  • Das Amplikon, welches aus der PCR mit dem oben gezeigten Polio IRES- Forward-Primer A-IReverse-Primer-Paar resultiert, wird von Apa I und Nco I- Erkennungssequenzen in einer 5 bp-"Puffersequenz" flankiert.
  • Das Amplikon, welches aus der PCR mit dem oben gezeigten Polio IRES Forward-Primer B/reverse-Primerpaar resultiert, wird von Cla I- und Nco I- Erkennungssequenzen in einer 5' bp-"Puffersequenz" flankiert.
  • Die Amplifikation der Polio IRES-Sequenz aus dem pP2-5'-Plasmid wird mit dem in Beispiel 5 gezeigten PCR-Protokoll durchgeführt:
  • Für die Insertion in den pKSSINBVdlJR-Vektor wird das 333 bp-Amplikon mit Apa I und Nco I verdaut, auf einem 1,5% Agarosegel gereinigt und in den mit Apa I und Nco I verdauten und mit CIAP behandelten Vektor ligiert. Das ATG, entsprechend dem Startcodon des heterologenen Gens, welches unmittelbar stromabwärts zum Polio IRES-Insert insertiert werden soll, wird zum Erhalt einer Nco I-Schnittstelle (CCATGG) modifiziert.
  • Zur Insertion in die pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc-Vektoren zwischen heterologen Genen wird das 333 bp Amplikon mit Cla I und Nco I verdaut, auf einem 1,5% Agarosegel gereinigt und in den bicistronischen heterologen Gen- Vektor, welcher mit Cla I und Nco I verdaut ist und mit CIAP behandelt ist, ligiert. In einer bicistronischen heterologen Genkonfiguration wird das 3'-Ende des stromaufwärts liegenden heterologen Genes modifiziert, um in einer Cla I- Erkennungsstelle zu enden. Das ATG, entsprechend dem Startcodon des zweiten stromabwärts liegenden heterologen Genes, welches unmittelbar stromabwärts zu dem Polio IRES-Insert insertiert werden soll, wird zum Erhalt einer Nco I- Schnittstelle (CCATGG) modifiziert. Deshalb ist die Reihenfolge der Komponenten von 5' nach 3': pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc-Gen #1-Cla/Nco Polio IRES- Gen #2-3'SIN. Die Insertion in alle modifizierten Verbindungsregion-Vektoren, beschrieben in Beispiel 3, folgt der hier für pKSSINBV- oder pKSSINBVdlJRsjrc- Vektoren angegebenen Strategie.
  • Der pKSSINBVdlJR-Vektor, welcher eine bicistronische heterologe Konfiguration enthält, wird mit jedem der Polio-IRES-Amplikons, wie oben beschrieben, konstruiert. Das erste Polio-IRES-Amplikon wird von zwei Apa I- und Nco I- Schnittstellen flankiert und wird direkt stromabwärts zu der funktionsunfähigen Verbindungsregion an der Apa I-Schnittstelle, wie oben beschrieben, insertiert. Dieser Polio-IRES-Sequenz folgt das erste heterologe Gen, welches an einer Cla I-Schnittstelle endet. Dem ersten heterologen Gen folgt eine zweite Polio-IRES- Sequenz unter Verwendung der das Amplikon flankierenden Cla I und Nco I- Schnittstellen. Das zweite heterologe Gen folgt der zweiten Polio-IRES-Sequenz. Daher ist vom 5'- bis zum 3'-Ende die Reihenfolge der Komponenten: SINBVdlJR- Apa/Nco Polio-IRES-Gen #1-Cla/Nco EMCV-IRES #2-3' SIN.
  • Die 220 bp BiP-cDNA, welche der 5'-Leader-Region der mRNA des humanen schwere Kette-Immunglobulin-bindenden Proteins entspricht, wird von dem Klon pGEM5ZBiP5' unter Verwendung von PCR amplifiziert. Die Sequenz, welche der BiP-cDNA entspricht, wurde ursprünglich in dem Bacteriophagen lamda hu28-1- Klon des humanen GRP78-Genes (Ting and Lee, DNA 7: 275-286, 1988) bestimmt. Der in der PCR zu verwendende Forward-Primer variiert, abhängig von dem Sindbis-Vektor, in welchem die BiP-cDNA insertiert wird. Der Reverse-Primer für die PCR-Reaktion ist für alle Sindbis-Vektoren der Gleiche. Die Amplifikation der BiP-cDNA-Sequenz von pGEMSZBiP5' aus dem Plasmid für die Insertion in die Sindbis-Vektor pKSSINBVdlJR direkt stromabwärts zu der funktionsunfähigen Verbindungsregion wird durch Amplifikation mit dem folgenden Forward-Primer erreicht:
  • Zusätzlich zu den BiP-cDNA komplementären Sequenzen, welche bei Nukleotid 12 beginnen, enthält der Primer eine fünf Nukleotide-lange "Puffersequenz" an seinem 5'-Ende für einen effizienten Enzymverdau des PCR-Amplikonprodukts. Dieser Sequenz folgt die Apa I-Schnittstelle.
  • Die Amplifikation der BiP-cDNA-Sequenz vom pGEM5ZBiP5'-Plasmid für die Insertion in die Sindbis-Vektoren pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc wird durch Amplifikation mit dem folgenden unten gezeigten Forward-Primer erreicht. Für diese Vektoren wird die BiP-cDNA zwischen zwei heterologene Gene insertiert, welche in der Region, welche den Sindbis-Strukturgenen entspricht, lokalisiert sind.
  • Zusätzlich zu den BiP-cDNA komplementären Sequenzen, welche am Nukleotid 12 beginnen, enthält der Primer eine fünf Nukleotide-lange "Puffersequenz" an seinem 5'-Ende für einen effizienten Enzymverdau des PCR-Amplikonprodukts. Dieser Sequenz folgt die Cla I-Erkennungssequenz.
  • Der Reverse-Primer für die Amplifikation der BiP-cDNA-Sequenz vom pGEM5ZBiP5'-Plasmid für die Insertion in die Sindbis-Vektoren pKSSINBVdlJR, pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc, ist:
  • Zusätzlich zu den BiP-cDNA komplementären Sequenzen, welche am Nukleotid 12 beginnen, enthält der Reverse-Primer eine fünf Nukleotide-lange "Puffersequenz" an seinem 5'-Ende für einen effizienten Enzymverdau der PCR- Amplikonprodukte. Dieser Sequenz folgt die Nco I-Erkennungssequenz.
  • Die Amplifikation der BiP-cDNA von dem pGEM5ZBiPS' wird mit dem PCR- Protokoll, welches oben beschrieben ist, durchgeführt:
  • Für die Insertion in den pKSSINBVdlJR-Vektor wird das 242 bp-Amplikon mit Apa I und Nco I verdaut, auf einem 2%igen Agarosegel gereinigt und in den mit Apa I und Nco I verdauten und mit CIAP behandelten Vektor ligiert. Das ATG, welches dem Startcodon des heterologen Genes entspricht, welches direkt stromabwärts zu dem BiP-cDNA-Insert insertiert werden soll, wird zum Erhalt einer Nco I- Schnittstelle (CCATGG) modifiziert.
  • Für die Insertion in die pKSSINBV- oder pKSSINBVdlJRsjrc-Vektoren zwischen heterologe Gene wird das 242 bp-Amplikon mit Cla I und Nco I verdaut, auf einem 2%igen Agarosegel gereinigt und in den bicistronischen heterologen, mit Cla I und Nco I verdauten und mit CIAP behandelten Gen-Vektor ligiert. In einer bicistronischen heterologen Genkonfiguration wird das 3'-Ende des stromaufwärts liegenden heterologen Genes modifiziert, so daß es in einer Cla 1- Erkennungssequenz endet. Das ATG, welches dem Startcodon des zweiten stromabwärts liegenden heterogenen Genes entspricht, welches direkt stromabwärts zu dem BiP-cDNA-Insert insertiert werden soll, wird zum Erhalt einer Nco I-Schnittstelle (CCATGG) modifiziert. Deshalb ist von 5' nach 3' die Reihenfolge der Komponenten: pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc-Gen #1- Cla/Nco BiP-Gen #2-3' SIN. Die in Beispiel 2 beschriebene Insertion in alle modifizierten Verbindungsregion-Vektoren folgt der hier für die pKSSINBV oder pKSSINBVdlJRsjrc-Vektoren angegebenen Strategie.
  • Der pKSSINBVdlJR-Vektor, welcher eine bicistronische heterologe Konfiguration enthält, wird mit jedem der oben beschriebenen BiP-cDNA-Amplikons konstruiert. Das erste BiP-cDNA-Amplikon wird von Apal- und Nco I-Sequenzen flankiert und wird direkt stromabwärts zu der funktionsunfähigen Verbindungsregion an der Apa I Schnittstelle, wie oben beschrieben, insertiert. Dieser BiP-Sequenz folgt das erste heterologe Gen, welches an einer Cla I-Erkennungssequenz endet. Dem ersten heterologen Gen folgt die zweite BiP-cDNA-Sequenz, unter Verwendung des durch Cla I- und Nco I-Erkennungssequenzen flankierten Amplikons. Das zweite heterologe Gen folgt der zweiten BiP-Sequenz. Deshalb ist von 5' nach 3' die Reihenfolge der Komponenten: SINBVdlJR-Apa/Nco BiP-Gen #1-Cla/Nco BiP- Gen #2-3' SIN.
  • Die Sequenzen, welche das ribosomale Durchlesen fördern, werden direkt stromabwärts zu der funktionsunfähigen Verbindungsregion in den pKSSINBVdlJR-Vektor plaziert, welcher ribosomales Scannen in genomischer mRNA vom Nicht-Strukturgenende zu den heterologen Genen erlaubt. Die heterologen Proteine werden von der mRNA mit genomischer Länge durch ribosomales Scannen exprimiert. Dies soll das Leben der infizierten Targetzellen verlängern, da keine subgenomische Transkription in mit diesem Vektor infizierten Zellen stattfindet. Ferner werden diese gleichen ribosomalen Scanningsequenzen zwischen heterologe Gene, welche in polycistronischen subgenomischen mRNAs enthalten sind, angeordnet. Die ribosomale Scanningsequenz, welche in dem pKSDINBVdlJR-Vektor und zwischen heterologen Genen in der polycistronischen mRNA-Region zu verwenden ist, lautet:
  • Die fett gedruckten Codons beziehen sich auf das Ochre-Stopcodon bzw. das AUG-Startcodon. Die unterstrichenen Basen, welche das Stopcodon umgeben, beziehen sich auf die Pac I-Erkennungssequenz, und die unterstrichenen Basen, welche das Startcodon umgeben, beziehen sich auf die Noc I- Erkennungssequenz. Der intercistronische Abstand von 15 bp zwischen den Start- und Stopcodons erlaubt, wie kürzlich gezeigt, ein effizientes ribosomales Durchlesen (Levine et al., Gene 108: 167-174, 1991). Die Sequenzen, welche das ATG-Startcodon von den Basen -9 bis +1 umgeben, entsprechen der Kozak- Konsensus-Sequenz für effiziente Translationsinitiation (Kozak, Cell 44: 283-292, 1986). Wo möglich, wird das 3'-terminale Nukleotid, welches der carboxyterminalen Aminosäure entspricht, durch ortsspezifische Mutagenese in ein T geändert. Das 5'-terminale Nukleotid, welches der aminoterminalen Aminosäure in dem stromabwärts liegenden Cistron entspricht, wird auch durch ortsspezifische Mutagenese in ein G geändert.
  • Die Insertion der intercistronischen Sequenz zwischen heterologen Genen oder stromabwärts zu der funktionsunfähigen Verbindungsregion im Vektor pKSDINBVdlJR, welcher, wie oben beschrieben, modifiziert ist, wird durch Insertion des unten gezeigten doppelsträngigen Oligonukleotidpaares in kompatible Pac I/Nco I Enden erreicht: Durchlesen der Sense-Oligonukleotide: Durchlesen der Antisense-Oligonukleotide:
  • Die obigen Nukleotide werden in gleichen molaren Mengen in Gegenwart von 10 mM MgCl&sub2; gemischt, auf 95ºC für 5 Minuten erhitzt, langsam Raumtemperatur abkühlen gelassen, was die gewünschte, intercistronische, durch Pac I- und Nco I- Schnittstellen flankierte Sequenz ergibt. Die intercistronische Sequenz wird dann in den geeigneten Vektor, welcher Pac I- und Nco I-kompatible Sequenzen enthält, ligiert.
    • BEISPIEL 6 EXPRESSION VON VERSCHIEDENEN HETEROLOGEN GENEN DURCH ZUSAMMENPACKEN
  • Wie oben in einer Ausführung der Erfindung angemerkt, können Sindbis Nicht- Strukturproteingene und Strukturproteingene als getrennte positive-Sense RNA- Moleküle zusammengepackt werden, welche ihre Replikationsfähigkeit beibehalten, wenn jede der RNAs cis-wirkende Sequenzen enthält, welche für Replikation und Verpackung benötigt werden. Daher sollten in dieser Ausführung alle zusammengepackten Auravirus-RNA-Fragmente auch eine 5'-Sequenz enthalten, welche zur Initiation der Transkription von Aura RNA, einer Auravirus- RNA-Polymerase-Erkennungssequenz und mindestens einer Kopie der RNA- Verpackungssequenz befähigt ist. Mindestens eines der zusammen verpackten RNA Moleküle muß die Sequenz enthalten, welche die Auravirus-Nicht- Strukturproteine kodiert. In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthalten ein oder mehrere RNA Fragmente, welche zusammengepackt werden sollen, auch eine virale Verbindungsregion, gefolgt von einem heterologen Gen.
    • A. KONSTRUKTION DER ZUSAMMENGEPACKTEN EXPRESSIONSKASSETTEN ZUR EXPRESSION VON VERSCHIEDENEM 1. Heterologe Gene
  • Um die Durchführbarkeit der Zusammenpackung, um die Expression von verschiedenen heterologen Genen zu erlauben, zu zeigen, wurden zwei Vektorkonstrukte erzeugt. Das erste Konstrukt besteht aus einer 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription der Sindbisvirus-RNA befähigt ist, Sindbis RNA Sequenzen, welche für die Verpackung benötigt werden, Sequenzen, welche die Synthese von Nicht-Strukturproteinen 1-4 kodieren, einer Sindbis Verbindungsregion, dem Luziferasegen und Sindbis 3'-Sequenzen, welche für die Synthese der Minusstrang-RNA benötigt werden. Das zweite Konstrukt besteht aus einer 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Sindbisvirus befähigt ist, einer Sindbis-Verbindungsregion, Sindbis-Sequenzen, welche für die Verpackung benötigt werden, Sequenzen, welche das LacZ-Gen kodieren und Sindbis 3'-Sequenzen, welche für die Synthese von Minusstrang RNA benötigt werden. RNA-Transkripte von diesen Konstrukten, welche in eine Verpackungszellinie transfiziert werden, werden zusammengepackt, um einen Vektorpartikel herzustellen, welcher zum Transfer der Expression sowohl von Luziferase als auch β-Galactosidase in die gleiche eukaryotische Zelle befähigt ist.
  • Das β-Galactosidase-Reportergen wird in den Sindbis Basisvektor (pKSSINBV), gefolgt durch Deletion eines Teils des Sindbis-Nicht-Strukturproteins aus dem Vektor, insertiert. Die RNA dieses Konstrukts wird mit RNA aus dem Sindbis Luziferasevektor (pKSSINBV-luc) kotransfiziert und durch eine der unten beschriebenen Methoden zusammengepackt. Die Infektion von frischen BHK-21- Zellen mit Vektorpartikeln, welche die zusammengepackte RNA- Expressionskassetten enthalten, sollten die Expression von sowohl Luziferase als auch β-Galactosidase in der gleichen Zelle ergeben.
    • B. KONSTRUKTION DER β-GALACTOSIDASE EXPRESSIONSKASSETTE
  • Das lacZ-Gen wird durch Verdau der pSV-β-Galactosidasevektor-DNA (Promega Corp., Madison, WI) mit den Enzymen HindIII und SalI erhalten. Das 3749 bp- Fragment, welches das LacZ-Gen enthält, wird in einem 1% Agarosegel gereinigt. Anschließend wird dieses Fragment in das pSP72-Plasmid (Promega Corp.) ligiert, welches auch mit HindIII und SalI verdaut worden ist und unter Verwendung von Geneclean (Bio101 Corp., San Diego, CA) gereinigt worden ist. Dieses Konstrukt ist als pSP72-lacZ bekannt. Das Plasmid pSP72 wird mit den Enzymen XhoI und XbaI verdaut, und das 3767bp lacZ-enthaltende Fragment wird in einem 1% Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird dann in den pKSSINBV ligiert, welcher auch mit XhoI und XbaI verdaut worden ist und unter Verwendung von Geneclean gereinigt worden ist. Dieses Sindbis Konstrukt, welches lacZ enthält, ist als pKSSINBV-lacZ bekannt. Das Plasmid pKSSINBV- lacZ wird anschließend mit dem Enzym Agel verdaut, welches bei den Nukleotiden 3172 und 6922 der Sindbis Nicht-Strukturproteine-Gensequenzen spaltet. Das verbleibende Vektorfragment wird durch Geneclean gereinigt und seine Enden religiert. Das Plasmid weist jetzt eine 3750 bp-Deletion in den Sindbis Nicht-Strukturprotein-Genen auf, welche sie funktionell inaktiviert. Dieses Konstrukt ist als pKSSINBVcINSP-lacZ bekannt.
  • SP6-Transkripte von pKSSINBVdlNSP-facZ und pKSSINBV-luc werden, wie oben beschrieben, hergestellt. Diese RNA-Transkripte werden in Verpackungszellen kotransfiziert, welche die Sindbis Strukturproteine durch einen, der kürzlich beschriebenen, Mechanismen exprimieren. Jedes RNA-Transkript enthält eine 5'- Sequenz, welche zur Initiation der Transkription eines Sindbisvirus befähigt ist, RNA-Sequenzen, welche für die Verpackung benötigt werden, eine Sindbis Verbindungsregion, ein Reportergen und Sindbis-3'-Sequenzen, welche für die Synthese einer Minusstrang-RNA benötigt werden. Die pKSSl NBV-luc Transkripte enthalten auch die Sindbis Nicht-Strukturproteine. In kotransfizierten Zellen werden beide RNA-Transkripte repliziert, und einige der viralen Partikel werden beide RNA-Transkripte, welche in den gleichen Partikeln verpackt sind, enthalten. Die Infektion von frischen Zellen mit zusammengepackten RNA-Partikeln ergibt eine Zelle, welche sowohl Luziferase als auch β-Lactosidase exprimiert.
    • C. ZUSAMMENVERPACKUNG VON VERSCHIEDENEN EXPRESSIONSKASSETTEN, UM DIE VERPACKUNGSKAPAZITÄT ZU VERGRÖSSERN
  • Große Gene, wie der Faktor VIII, können von Vorteil bei der Zusammenverpackung sein. Die Insertion der cDNA, welche den Faktor VIII kodiert, in den Sindbis Basisvektor (pKSSINBV) ergibt ein RNA-Transkript von etwa 16 kb Länge. Wegen der vergrößerten Länge kann diese RNA nicht effizient repliziert oder verpackt werden. Unter Verwendung des oben beschriebenen Ansatzes konnten die Sindbis Nicht-Strukturprotein- und Faktor VIII-Gene auf zwei getrennte RNA-Moleküle von ungefähr 8 kb und 9 kb in der Länge aufgeteilt werden und in die gleichen Partikel zusammenverpackt werden.
    • D. KONSTRUKTION EINER EXPRESSIONSKASSETTE DES FAKTORS VIII
  • Das pKSSINBV-Konstrukt wird mit dem Enzym SacI verdaut, welches direkt nach dem Sindbis-3'-Ende und der Poly-A-Sequenz spaltet. Die überhängenden 3'- Enden werden durch Zugabe des Enzyms T4-DNA-Polymerase und dNTPs geglättet und für 10 Minuten bei 16ºC inkubiert. Das verdaute Fragment wird unter Verwendung von Geneclean gereinigt und in einen 12 Nukleotide langen selbstkomplementären Linker (5'-GTCACCGGTGAC-3') (SEQ. ID NR: 30), welcher die SgrAi Erkennungssequenz enthält, ligiert. Dieser Schritt ist notwendig, da das Faktor VIII-Gen mehrere SacI Schnittstellen enthält, und die SgrAl- Erkennungssequenz für die SacI-Sequenz substituiert ist, um eine Sequenz für die Linearisierung des Plasmids vor der SP6-Transkription zu erzeugen. Dieses Konstrukt ist als pKSSINBV-SgrAl bekannt. Das pKSSINBV-SgrAl Konstrukt wird mit den Enzymen XbaI und NotI verdaut und unter Verwendung von Geneclean gereinigt. Die cDNA-Sequenz des Faktors VIII wird durch Verdau mit den Enzymen XbaI und NotI erhalten. Das Bkb Fragment, welches den Faktor VIII kodiert, wird in einem 1% Agarosegel gereinigt und anschließend in den XbaI/NotI verdauten pKSSINBV-SgrAl ligiert. Dieses Konstrukt ist als pKSSINBV-Faktor VIII bekannt.
  • Das pKSSINBV-Faktor VIII Konstrukt wird mit Age I verdaut, welches an den Sindbis-Nicht-Strukturproteinen bei den Nukleotiden 3172 und 6922 spaltet, unter Verwendung von Geneclean gereinigt und mit sich selbst relegiert. Dieses Konstrukt weist jetzt eine 3750 bp-Deletion in den Sindbis-Nicht-Strukturproteinen auf, welches sie funktionell inaktiviert. Dieses Konstrukt ist als pKSSINBVdlNSP- Faktor VIII bekannt.
  • Die SP6-Transkripte des pKSSINBVdlNSP-Faktors VIII und des pKSSINBV werden, wie oben beschrieben, hergestellt. Diese RNA-Transkripte werden in die Verpackungszellen kotransfiziert, welche die Sindbis Strukturproteine, durch einen oben beschriebenen Mechanismus, exprimieren. Beide RNA-Transkripte enthalten eine 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription von Sindbis- RNA-Sequenzen befähigt ist, welche für die RNA-Verpackung benötigt werden, eine Sindbis-Verbindungsregion und die Sindbis 3'-Sequenzen, welche für die Synthese der Minusstrang-RNA benötigt werden. Zusätzlich enthält das pKSSINBV-Transkript die Sindbis-Nicht-Strukturprotein-Gene, und das pKSSINBV-Faktor VIII-Konstrukt enthält die Faktor VIII Gene, aber nicht die Sindbis Nicht-Strukturproteingene. In kotransfizierten Zellen werden beide RNA- Transkripte repliziert, und einige virale Partikel enthalten beide in den gleichen Vektorpartikel zusammenverpackte RNA-Transkripte. Die Infektion der frischen BHK-21-Zellen mit der zusammenverpackten RNA ergibt nur die Faktor VIII- Expression, wenn beide RNA-Moleküle in der gleichen Zelle vorliegen.
    • E. KONSTRUKTION EINES AURAVIRUS-ZUSAMMENVERPACKUNGSVEKTORS
  • Um ein Auravirus-Expressionssystem analog zu dem für Sindbis beschriebenen zu entwickeln, werden Standardtechniken, welche im Stand der Technik bekannt sind, genauso wie spezifische Ansätze, welche in diesem Patent beschrieben sind, für die Konstruktionen verwendet. Das von ATCC erhaltene Virus wird in den gezüchteten Zellen vermehrt, seine Virion-RNA extrahiert und unter Verwendung von konventionellen Techniken, die cDNA, welche sich über das gesamte Genom erstreckt, synthetisiert und kloniert. Diese cDNA wird dann verwendet, um Gentransfer-Vektorsysteme, im Prinzip ähnlich zu diesen, beschrieben für das Sindbis-Patent, zu konstruieren, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, ein Replikon, welches zum Tragen von dem heterologen Gen(en) befähigt ist, Verpackungszellinien, welche die strukturellen Proteingene exprimieren und einzigartig für dieses System, ein getrennter Verpackungs-kompetenter subgenomischer Vektor, welcher befähigt ist, das (die) zusätzliche(n) heterologe(n) Gen(e) zu tragen. Da die Auravirus-subgenomische RNA ein Verpackungssignal enthält, mußten Vorexperimente durchgeführt werden, um diese Sequenz zu identifizieren, um deren Inaktivierung während des Ersetzens durch ein heterologes Gen(en) zu verhindern. Nach der Identifizierung dieser Verpackungssequenz werden individuelle Elemente dieses Aura-basierten Systems erzeugt.
  • Ein Basis-Replikonvektor wird konstruiert, um die folgenden minimalen Anforderungen zu enthalten: Aura-5'-Sequenzen, welche für die Replikation notwendig sind, Nicht-Strukturprotein-kodierende Regionen, eine modifizierte oder nicht modifizierte Verbindungsregion für subgenomische mRNA-Synthese, eine multiple Klonierungssequenz für die Insertion von einem heterologen Gen(en), eine oder mehrere Kopien des Verpackungssignals und 3'-Aura-Sequenzen, welche für die Replikation wichtig sind, einschließlich einer polyadenylierten Sequenz. Ein stromaufwärts liegender Bakteriophagen-RNA-Polymerase- Promotor wird für die in vitro Transkription der Replikon-RNA verwendet. Alternativ wird ein eukaryotischer RNA-Polymerase-Promotor für die direkte Transkription von der cDNA verwendet.
  • Ein Verpackungs-kompetenter subgenomischer Vektor soll derart konstruiert werden, daß er die folgenden Minimalanforderungen erfüllt: Eine modifizierte oder nicht-modifizierte Verbindungsregion, eine multiple Klonierungssequenz zur Insertion von einem heterologen Gen(en), eine oder mehrere Kopien des Verpackungssignals und 3'-Aura-Sequenzen, welche für die Replikation/Minus- Strangsynthese notwendig sind, einschließlich einer Polyadenylierungssequenz. Der subgenomische Vektor kann in einigen Fällen mit Aura-5'-Replikations- Sequenzen konstruiert werden, welche stromabwärts zu der Verbindungsregion positioniert sind, so daß der Vektor als ein Amplikon fungiert. Die Transkription der subgenomischen Vektor-RNA wird in vitro unter Verwendung eines Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotors oder der cDNA in vivo unter Verwendung eines eukaryotischen RNA-Polymerase-Promotors durchgeführt werden. Ferner kann das anfängliche Transkript in Sense-Konfiguration oder in Antisense-Konfiguration vorliegen.
  • Verpackungszellinien werden, wie kürzlich für Sindbis-Vektoren beschrieben, derart konstruiert, daß die mRNA für eine oder mehrere der Strukturproteine von der Verbindungsregion transkribiert wird und durch das Aura-Replikon induzierbar ist. In anderen Fällen wird ein oder mehrere Strukturproteine unter der Kontrolle eines induzierbaren oder konstitutiven eukaryotischen Promotors exprimiert werden. In jedem Fall werden spezifische inaktivierende Mutationen an einigen Verpackungssequenzen durchgeführt, welche in den Strukturproteingenen vorliegen, um die Enkapsidierung dieser Sequenzen mit dem Replikon zu verhindern. Diese Mutationen sind stille Änderungen, gewöhnlich an der dritten Position des Codons, welche nicht die kodierten Aminosäuren beeinflußt.
  • Die Fähigkeit, verschiedene heterologe Gene zu verpacken, wird für viele therapeutische Anwendungen benützt, welche die Expression von verschiedenen Zytokinen, verschiedenen CTL-Epitopen, Kombinationen von Zytokinen und CTL- Epitopen, um die Immunpräsentation zu vergrößern, verschiedene Untereinheiten eines therapeutischen Proteins, Kombinationen von therapeutischen Proteinen und Antisense-RNAs, usw. einschließen, aber nicht darauf begrenzen. Zusätzlich zu seinem Nutzen für die Expression von verschiedenen heterologen Genen ermöglicht die Verpackung von subgenomischen mRNAs in Virionen diesem Vektorsystem auch den Transfer von extrem langen heterologen Sequenzen, welche in anderen Alphavirussystemen unmöglich sein könnten. Darüber hinaus kann dieser mehrphasige Ansatz auch für die Entwicklung von Herstellerzellinien nützlich sein, wobei Replikaseproteine und Strukturproteine stabil exprimiert werden, und ein beliebiges heterologes Gen, welches in einem subgenomischen Vektor enthalten ist, könnte dann schnell als stabiler integrierender Bestandteil eingeführt werden.
    • BEISPIEL 7 KONSTRUKTION VON SINDBISVIRUS-VERPACKUNGSZELLINIEN
  • Eine weitere Ausführungsform des Sindbis-Gentransfersystems betrifft die Entwicklung von Sindbis-Verpackungszellinien. Da der normale Sindbis- Replikationszyklus vollständig im Zytoplasma stattfindet, ist ein Ansatz zur Erzeugung eines Sindbis-Verpackungszelliniensystems das System nach seinem natürlichen Replikationszyklus zu modellieren bzw. nachzubilden. Unter Verwendung dieses Ansaatzes ist das Sindbis-Verpackungszelliniensystem entworfen worden, wobei die viralen Strukturproteine, welche trans von einem oder mehreren stabil integrierten Expressionsvektoren bereit gestellt werden, befähigt sind, transfizierte oder transduzierte Vektor RNA-Transkripte im Zytoplasma zu enkapsidieren und infektiöse verpackte Vektorpartikel durch die Zellmembran freizusetzen, um eine solche Sindbis-Vektor-Herstellerzellinie zu erzeugen. Die Sindbis-RNA-Vektormoleküle, welche zur Replikation im Zytoplasma der Zelle befähigt sind, werden anfänglich durch ein T7-RNA- Polymerasesystem hergestellt, welches verwendet wird, um in vitro einen cDNA- Vektorklon, welcher das Gen von Interesse kodiert, und die Sindbis-Nicht- Strukturproteine (kürzlich beschrieben) zu transkribieren. Die Vektor-RNA- Transkripte werden dann in die Sindbis-Verpackungszellinien derart transfiziert, daß die Vektor-RNA auf hohen Spiegeln repliziert und anschließend durch die viralen Strukturproteine, welche infektiöse Vektorpartikel ergeben, verpackt wird. Wegen der ausgedehnten Länge der Sindbis-cDNA-Moleküle ist der in vitro- Transkriptionsprozeß sehr ineffizient. Ferner wird nur ein Teil der Zellen, welche in einer Monolayer enthalten sind, typischerweise durch die meisten Verfahren transfiziert. Im Bemühen, die Ausführung und den Titer der Vektor- Herstellerzellinie zu optimieren, wurden zwei aufeinanderfolgende Zyklen des Gentransfers durchgeführt. Eher als der direkte Transfer der Sindbis-RNA- Vektormoleküle in die Herstellerzellinie, wird der Vektor zuerst in eine primäre Sindbis-Verpackungszellinie transfiziert. Die transfizierte Zellinie sekretiert infektiöse Vektorpartikel in die Kulturüberstände, und diese infektiösen Überstände werden dann verwendet, um frische Monolayer von Sindbis- Verpackungszellen zu transduzieren. Die Transduktion des Sindbis-Vektors in die Verpackungszellinie wird vor der Transfektion wegen ihrer höheren RNA- Transfereffizienz in die Zellen und der optimierten biologischen Plazierung des Vektors in der Zelle bevorzugt. Dies führt zu höherer Expression und zu höheren Titern von verpackten infektiösen rekombinanten Sindbis-Vektoren.
  • Für den Fall, daß die hergestellten Sindbis-Vektorpartikel scheitern, die gleiche Verpackungszellinie zu transduzieren, da die Zellinie extrazelluläre Hüllproteine herstellt, welche zelluläre Rezeptoren für die Sindbis-Vektor-Anlagerung blockieren, muß ein zweiter Typ von Sindbis-viralen Partikeln erzeugt werden, welche befähigt sind, die Sindbis-Verpackungszellen zu transduzieren. Dieser zweite Typ der viralen Partikel muß durch eine Verpackungszellinie, welche als "Hopping-Zellinie" bekannt ist, hergestellt werden, welche transiente Vektorpartikel als das Ergebnis der Transfektion mit in vitro transkribierten Sindbis-RNA- Vektortranskripten erzeugt. Die Hopping-Zellinie wird konstruiert, um den Rezeptor-Tropismus der transient hergestellten Vektorpartikel durch Bereitstellen von alternativen viralen Hüllproteinen umzuleiten, welche die Sindbis-Vektoren auf verschiedene zelluläre Rezeptoren in einem als Pseudotypisierung bezeichneten Prozeß umleiten. Gegenwärtig sind zwei Ansätze für die Sindbis-Vektorpartikel- Pseudotypisierung eingerichtet worden. Der erste Ansatz besteht aus einer Sindbis-Verpackungszellinie, welche das vesikuläre Stomatitis-Virus-G-Protein (VSV-G) koexprimiert. Bei uns hat kürzlich die VSV-G-Pseudotypisierung gut für die Umleitung des Vektor-Tropismus der retroviralen Vektoren funktioniert und hat die Infektion einer großen Vielzahl von Zelltypen gezeigt. Der zweite Ansatz zur Herstellung von pseudotypisierten Sindbis-Vektorpartikeln ist gegenwärtig die Verwendung verfügbarer retroviraler Verpackungszellinien, welche retrovirale gag/pol und env-Sequenzen enthalten, welche zur Verpackung eines Sindbis- RNA-Vektors befähigt wären, welcher eine retrovirale Verpackungssequenz enthält.
  • Die Nachbildung der Sindbis-Verpackungszellinie nach dem natürlichen Replikationszyklus des Sindbisvirus sollte eine Zellinie ergeben, welche hohe Spiegel der Genexpression ergibt, basierend auf der Zahl der zur Translation befähigten RNA-Moleküle, welche von dem replizierenden RNA-Molekül erzeugt werden. Auf der anderen Seite sind positiv-strängige RNA-Viren darauf gerichtet, defekt-interferierende RNAs herzustellen, welche darauf gerichtet sein können, den RNA-Vektor zu verändern, um so die Gesamteffektivität der Vektorpartikel zu verringern, und welche auch die hohen Spiegel der Expression während ausgedehnten Züchtungsperioden verringern können. Deshalb ist ein zweiter Ansatz eingerichtet worden, in welchem ein stabil integrierter DNA- Expressionsvektor hergestellt wird, um das Sindbis-Vektor-RNA-Molekül zu erzeugen, welches wie bei dem ersten Ansatz die Fähigkeit beibehält, selbst zu replizieren. Dieser Ansatz erlaubt kontinuierliche Vektor-Expression über lange Züchtungszeiträume, da das integrierte DNA-Vektor-Expressionssystem durch einen Arzneimittel-Selektionsmarker aufrechterhalten wird, und das DNA-System konstitutiv unveränderte RNA-Vektoren exprimiert, welche nicht durch defekte RNA-Kopien ausverdünnt werden können. In dieser Hersteller-Zellkonfiguration wird der DNA-basierte Sindbis-Vektor anfänglich in die Verpackungszellinie durch Transfektion eingeführt, da Größenbegrenzungen die Verpackung des Expressionsvektors in einen viralen Vektorpartikel für die Transduktion verhindern könnten. Auch für diese Konfiguration wird die T7-RNA-Polymerase- Erkennungssequenz des Plasmids, welche kürzlich verwendet worden ist, um die Vektor-RNA zu transkribieren, durch eine andere geeignete Promotorsequenz, welche durch die verwendete Elternzellinie definiert ist, ersetzt. Diese Plasmidsequenz würde auch einen Selektionsmarker unterschiedlich von diesen, welche verwendet werden, um die Verpackungszellinie zu erzeugen, enthalten.
  • Die Expression der Sindbisproteine und/oder Replikon-RNA auf bestimmten Spiegeln kann zytotoxische Effekte in Verpackungszellinien ergeben. Daher ist es in einigen Fällen für diese Elemente wünschenswert, nur exprimiert zu werden, nachdem die Zellen sich auf eine gewisse kritische Dichte vermehrt haben. Zu diesem Zweck sind zusätzliche Modifikationen durchgeführt worden, wobei die Strukturproteine, welche für die Verpackung notwendig sind, nur nach der Induktion durch den RNA-Vektor selbst oder anderen Stimulanzien synthetisiert werden. Einige Modifikationen erlauben auch die individuelle Expression dieser Proteine unter der Kontrolle von getrennt induzierbaren Elementen unter Verwendung von Expressionsvektoren, welche die Gene, welche diese Proteine kodieren, entkoppeln. Zusätzlich kann die Expression des induzierten Vektormoleküls selbst durch noch ein anderes induzierbares System kontrolliert werden. Diese Konfiguration ergibt eine Kaskade von Ereignissen, welche der Induktion folgen, welche schließlich zu der Herstellung von verpackten Vektorpartikeln führt.
    • A. AUSWAHL EINER ELTERNZELLINIE FÜR DIE ENTWICKLUNG DER SINDBIS-VERPACKUNGSZELLINIE 1. Persistent oder chronisch infizierbare Zellen
  • Ein wichtiges Kriterium für die Auswahl möglicher Elternzellinien, um Sindbis- Verpackungszellinien zu erzeugen, ist die Wahl von Zellinien, welche nicht während der Sindbis-Vektorreplikation und -produktion lysiert werden. Dieses Kriterium ist für die Entwicklung einer Sindbis-Vektor-Herstellerzellinie essentiell, welche über lange Zeiträume vermehrt werden kann und als eine stabile Vektorquelle verwendet werden kann. Es ist bekannt, daß die Sindbis-Infektion der meisten Säugerzellen die Lyse der Zelle ergibt; die Verwendung von verschiedenen Insektenzellinien sollte dieses Problem jedoch umgehen. Als ein Beispiel ergibt die Infektion von Aedes albopictus-Zellen mit Sindbisvirus ein persistentes oder chronisches nicht-zytopathisches Viruswachstum, in welchem die infizierten Zellen lebensfähig bleiben und kontinuierlich Virus ausscheiden. Andere Insektenzellinien wie Aedes aetypti-, Spodoptera frugiperda- und Drosophila melanogaster-Zellinien sollten auch die gleiche persistente Infektion ausüben. Deshalb verwendet die erste Sindbis-Verpackungszellinien- Konfiguration eine Insekten-Elternzellinie, wie die Aedes albopictus- oder Drosophila- Zellinie, welche einen stabil transfizierten Expressionsvektor, welcher die Sindbis-Strukturproteine unter der Kontrolle von induzierbaren oder nicht- induzierbaren Promotoren, welche in diesen Zelltypen aktiv sind, enthält und einen selektierbaren Marker koexprimiert.
  • Kürzlich ist ein Sindbisvirus-induziertes Protein zellulären Ursprungs, welches mit der Herunterregulation der Sindbisvirus-Produktion in infizierten Aedes albopictus- Zellen assoziiert worden ist, identifiziert und gereinigt worden (Virologie 194: 44). Das Protein ist ein kleines hydrophobes Peptid von etwa 3200 Da., welches den antiviralen Status induzieren und sowohl die 49S als auch die 265 virale RNA- Synthese inhibieren kann. Mit dem antiviralen Peptid behandelte Zellen zeigen gewöhnlich ruhenden Stillstand der Zellteilung für 96 Stunden in nicht-infizierten Zellen, und dann werden normale Wachstumsraten wiederhergestellt. Zellen, welche diesem Peptid vor der Infektion ausgesetzt worden sind, sind nicht befähigt, Sindbisvirus zu replizieren und scheinen diesen Phenotyp durch konstitutives Herstellen des antiviralen Proteins über 10 Monate kontinuierlicher Passagierung aufrechtzuerhalten.
  • Es ist erkannt worden, daß diese zelluläre Antwort auf die Sindbisinfektion in Aedes albopictus-Zellen die optimale Effizienz eines rekombinanten Sindbis- Vektor-Herstellersystems verringern könnte. Um die Effizienz der Sindbis-Vektor- Produktion zu verbessern, sind zwei Verfahren ausgedacht worden, um das Virusinduzierte zelluläre antivirale Protein zu inaktivieren, um so jegliche Reduktion der Vektorpartikel-Titer zu verhindern. Dieses erste Verfahren bringt eine Reinigung dieses oben beschriebenen zellulären Proteines und die Bestimmung eines Teils der primären Aminosäuresequenz von ihrem carboxyterminalem Ende unter Verwendung etablierter, im Stand der Technik bekannter Methoden mit sich. Die resultierende Aminosäuresequenz wird dann verwendet, um mögliche entsprechende genomische Sequenzen abzuleiten, welche es einem ermöglichen, ein degeneriertes PCR-Primerpaar zu entwerfen, welches verwendet werden kann, um die spezifische zelluläre Sequenz zu amplifizieren. Diese amplifizierte Sequenz wird dann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardmethoden kloniert, um einen getrennten Bereich der Gene zu erhalten, welche dieses hemmende Protein kodieren. Die Bestimmung der Nukleotidsequenz dieses Klons ermöglicht es dann, einen Vektor zu entwerfen, welcher spezifisch in dieses Sindbis-hemmenden Gen durch homologe Rekombination integriert, und dessen Kapazität ausschaltet bzw. "ausknockt", ein funktionelles Protein zu exprimieren. Klone, welche diese "Knockout-Sequenz" enthalten, können durch Insertion eines auswählbaren Markers in die einzelne klonierte Region des hemmenden Proteins, vor der Transfektion der Zellen mit dem Vektor, selektiert werden.
  • Ein zweites Verfahren, um dieses Sindbis-Virus-hemmende Protein funktionsunfähig zu machen, schließt die Mutagenese von Aedes albupictus- Zellen mit beispielsweise BUDR (5-Bromdesoxyuridin) ein. Diese mutagenisierte Verpackungszellinien-Population wird dann mit einem Sindbis-Vektor infiziert, welcher fähig ist, den Neomycin-Resistenzmarker zu exprimieren. Bei hohen Konzentrationen des G418-Arzneimittels sind nur diese Zellen, welche große Mengen des Sindbis-Vektors herstellen und deshalb unfähig sind, das Sindbishemmende Gen zu exprimieren, fähig zu überleben. Nach der Selektion werden resistente Kolonien gepooled, verdünnungskloniert bzw. unter verdünnten Bedingungen kloniert und auf hohe Titer der Sindbis-Produktion überprüft.
    • 2. Modifizierung der Zellen, um die Empfindlichkeit der Sindbis- Expression zu verringern: Unterdrückung der Apotose
  • Obwohl die meisten Säuger-Zellinien typischerweise während der Sindbis- Virusinfektion lysiert werden, haben neuere Ergebnisse den Wechsel von lytischer zur persistenten Sindbis-Infektion in einer Ratten-Prostata-Adenokarzinom (AT-3)- Zellinie gezeigt. Dieser Wechsel wurde durch konstitutive Expression des bcl-2- Onkogenproduktes in der Zellinie vor der Sindbis-Infektion durchgeführt. Die Sindbis-Infektion von AT-3-Zellen, welche das bcl-2-Onkogen exprimieren, ergibt die Herstellung des Virus ohne offensichtliche Zytopathologie (Nature 361: 739). Diese Zellinien-Modifikation könnte sich für die Umwandlung von Zellinien, wie die Hundezellinien D-17 und Cf2, die humanen Zellinien HT1080 und 293, die Wachtelzellinie QT-6, die Babyhamster-Nierenzellinie BHK-21, die Maus- Neuroblastomzellinie N18 und die Rattenprostata-Adenokarzinom AT-3, für den persistent infizierbaren Status zur Verwendung als potentielle Sindbis- Verpackungs- und Herstellerzellinien, ähnlich zu denen der Retrovektor- Herstellerlinien, als nützlich erweisen
  • Ein bcl-2-Onkogen-retroviraler Expressionsvektor ist kürzlich beschrieben worden (Nature 369: 739). Ein neuer bcl-2-Expressionsvektor wird unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten, rekombinanten DNA-Standardtechniken konstruiert, um das 910 bp-EcoRI-cDNA-Fragment, welches von dem Plasmid p84 (Nature 336: 259) stammt, in jeden im Handel erhältlichen Expressionsvektor, welcher einen konstitutiven Promotor enthält und einen selektierbaren Marker kodiert, zu insertieren. Sorgfältige Überlegungen müssen gemacht werden, um jeden Typ von Homologie zwischen Sindbis-Nukleinsäuresequenzen und anderen transduzierten Vektoren zu vermeiden. Diese Vorkehrung sollte getroffen werden, um Rekombinationsereignisse zu verhindern, welche zum unerwünschten Verpacken von selektierbaren Markern oder dem bcl-2-Onkogen in rekombinanten Sindbis-Partikeln führen können. Dies ist als ein wichtiger Punkt durchzuführen, da das hierin beschriebene Sindbis-Vektorsystem zu Verwendung als ein biologisches Therapeutikum entworfen ist. Sobald der bcl-2-Expressionsvektor konstruiert ist, wird die Eltern-Säugerzellinie (e. h. BHK-21-Zellen) unter Verwendung von Standardtechniken transfiziert und nach dem geeigneten Marker selektiert. Die resistenten Kolonien werden dann vereinigt, gefolgt durch Verdünnungsklonierung. Individuelle Klone werden dann vermehrt und auf bcl-2- Expression geprüft. Sobald die Expression nachgewiesen ist, wird die persistente Sindbis-Infektion überprüft, gefolgt durch ihre Verwendung als Elternzellinie für die Sindbis-Verpackungszellinien-Entwicklung.
  • Die Sindbis-Infektion von BHK-Zellen ergibt morphologische Änderungen und DNA-Fragmentationsmuster, welche Apoptose diagnostizieren, und die Umwandlung von lytischer zu persistierender Infektion durch das bcl-2-Onkogen kann durch eine Suppression dieses programmierten Zelltodes (Nature 361: 739) vermittelt werden. Zusätzlich hat die Infektion von Säugerzellen mit anderen Viren, einschließlich Adenovirus, Polyomavirus, SV40 und HIV Zytotoxizität wegen der Apoptose ergeben. Deshalb wären andere Genprodukte, zusätzlich zu dem bcl-2- Onkogen, welche Apoptose unterdrücken, für die Expression in einer Sindbis- Verpackungs- oder Herstellerzellinie wünschenswert. Anfänglich werden drei virale Gene, welche gezeigt haben, die Apoptose zu unterdrücken, in Sindbis- Verpackungszellinien exprimiert: Das Adenovirus E1B-Gen, welches das 19-kD- Protein kodiert (Rao et al., PNAS 89: 7742-7746, 1992), das Herpes Simplex- Virustyp-1-g&sub1;34.5-Gen (Chou and Roizman, PNAS 89: 32663270, 1992) und das AcMNPV-Baculovirus p35-Gen (Clem et al., Science 254: 1388-1390, 1991). Die individuellen Gene werden in Plasmid-Expressionsvektoren, welche von eukaryotischen konstitutiv transkriptionellen Promotoren kontrolliert werden und einen selektierbaren Marker enthalten, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardtechniken insertiert. Diese Expressionsvektoren werden anschließend, wie kürzlich beschrieben, in Zellinien transfiziert und die geeignete Selektion verwendet. Die Selektion nach stabiler Integration dieser Gene und konstitutiver Expression ihrer Produkte sollte eine weiter ausgedehnte Vektor-Produktion in Zellinien, welche bekannt sind, empfindlich auf Sindbisinduzierte apoptotische Ereignisse zu sein, erlauben. Zusätzlich ist es möglich, daß jedes Genprodukt Apoptose durch seinen eigenen einzigartigen Mechanismus hemmen kann. Deshalb werden die Gene auch in die Verpackungszellinien in verschiedenen Kombinationen eingeführt werden, um einen stärkeren suppressiven Effekt zu erhalten. Schließlich können andere Genprodukte mit ähnlichen Effekten auf die Apoptose leicht in Verpackungszellinien aufgenommen werden, sowie sie entdeckt sind.
  • Bei der Herleitung von Sindbis-Vektor-Herstellerzellinien werden viele Ansätze vorgeschlagen, um die Expression der viralen Gene zu kontrollieren, so daß die Herstellerzellinien, welche stabil sowohl mit Vektor als auch mit Vektor- Verpackungskassetten transformiert sind, abgeleitet werden können. Diese Ansätze schließen induzierbare und/oder bezüglich der zellulären Differenzierung sensitive Promotoren, Antisense-Strukturgene, heterologe Kontrollsysteme und Moskito- und andere Zellen, in welchen virale persistente Infektionen etabliert werden, ein. Wie auch immer die Endkonfiguration der Sindbis-Vektor- Herstellerzellinie ist, es scheint klar zu sein, daß die Etablierung der persistenten Infektion oder zumindest der Verzögerung des Zelltods als ein Ergebnis der viralen Genexpression durch Hemmung der Apoptose verbessert werden würde. Die DNA-Tumorviren, einschließlich Adenovirus, HPV, SV40 und das Maus- Polyomavirus (Py) transformieren zum Teil die Zellen durch Bindung an und Inaktivierung des Retinoblastom-(Rb)-Genprodukts p105 und seines eng verwandten Genprodukts p107 und anderer Genprodukte, welche in die Kontrolle des Zellzyklus involviert sind, einschließlich Cyclin A, p33cdk2 und p34cdc2. Alle diese Viren, ausgenommen Py, kodieren Genprodukte, welche an p53 binden und inaktivieren. Einzig Py kodiert das mittlere T-Antigen (ml), welches an die Membran-Tyrosinkinase src und auch die Phosphatidylinositol-3-Kinase bindet und inaktiviert, welche für das volle Transformationspotential dieses Virus benötigt wird (Talmage et al., Cell 59: 55-65, 1989). Die Bindung an und Inaktivierung von Rb- und p53-rezessiven Onkogenprodukten verhindert, daß Zellen, welche durch diese DNA-Tumorviren transformiert sind, in den apoptotischen Weg eintreten. Es ist bekannt, daß p53 fähig ist, die Zellteilung anzuhalten, zum Teil durch Hemmung der Expression von Proteinen, welche mit der zellulären Proliferation assoziiert sind, einschließlich c-fos, hsc70 und bcl-2 (Miyashita et al., Cancer Research 54: 3131-3135, 1994).
  • Um die Dauer der Sindbis-Virusproduktion zu verlängern oder um möglicherweise die persistente Sindbis-Infektion zu fördern, werden die Verpackungszellen mit viraler genomischer DNA von Py oder SV40 transformiert. Es ist bekannt, daß die Maus- und Primaten-DNA-Tumorviren Py bzw. SV40 leicht eine stabile Transformation in Zellen von Arten unterschiedlich von dem natürlichen Wirt etablieren. In solchen nicht-permissiven Zellen, beispielsweise solche, abgeleitet aus Hamstern, sind diese Viren nicht fähig, zu replizieren, wobei sich eine virale "Early Region"- bzw. frühe Region-expressionabhängige (z. B. T-Antigen) Integration ergibt (s. Kapitel 19, Benjamin und Vogt, Fields Virology Bd. 1). SV40- und Py-T-Antigene werden konstitutiv in diesen transformierten Hamsterzellen exprimiert.
  • SV40- und Py-transformierte Zellinien werden etabliert, und die Kinetiken und Spiegel der Sindbis-Produktion und -zytopathologie nach der viralen Infektion bestimmt. Wenn die apoptotischen Ereignisse, welche für die Sindbis-Proliferation in Hamsterzellen charakteristisch sind, verringert werden, wird jede Prototyp- Sindbis-Verpackungszellinie anschließend mit Py oder SV40 transformiert, um die Ausbeute an verpacktem Vektor aus diesen Zellen zu vergrößern.
    • 3. Modifikation der Zellen, um die Empfänglichkeit der Sindbis- Expression zu verringern: Herstellung von Aktivierungs-abhängigen Vektopartikeln
  • Das Sindbis E2-Glykoprotein wird als ein "Precursor"- bzw. Vorläufer-PE2 synthetisiert. Dieser PE2-Vorläufer und das zweite virale Glykoprotein, E1, assoziieren im endoplasmatischen Retikulum und werden prozessiert und werden als ein Heterodimer für die Virion-Aufnahme zu der infizierten Zellmembran transportiert. Bei einigen Punkten während dieser Prozessierung wird PE2 in E3 und reifes E2 gespalten. E3 ist der 64-aminoterminale Rest von PE2 und wird während der Reifung in den extrazellulären Raum verloren. Das größere Spaltungsprodukt, E2, ist mit E1 assoziiert und mit dem verankert, was die virale Hülle wird. Eine Wirtszell-Protease ist für die Prozessierung des PE2-Vorläufers verantwortlich, welche an der Sequenz spaltet, welche direkt auf ein hochkonserviertes kanonisches vier Aminosäure-(aa)-Rest-Motiv, basische-X- basische-basische Aminosäuren folgt. Eine mutierte, aus dem CHO-K1 Stamm abgeleitete Zellinie, bezeichnet als RPE.40 (Watson et al., (1991) J. Virol 65: 2332-2339), ist durch seine Unfähigkeit, den PE2-Vorläufer in die E3- und reife E2-Form zu prozessieren, unzulänglich in der Produktion des Sindbis- Virusstammes AR339. Die Hüllen der in der RPE.40-Zellinie hergestellten Sindbis- Virionen enthalten deshalb das PE2/E1-Heterodimer. RPE.40-Zellen sind mindestens 100mal resistenter gegenüber der Sindbis-Virusinfektion als die Eltern-CHO-K1-Zellen, was auf eine Ineffizienz in der Fähigkeit der PE2- enthaltenden Virionen, Zellen zu infizieren, hindeutet. Diese defekten Virionen, erzeugt von der RPE.40-Zellinie, können in eine vollinfektiöse Form durch Behandlung mit Trypsin überführt werden.
  • In Verpackungs- oder Herstellerzellinien wird jedes durch Rekombination hergestellte Wildtyp-Virus Zellen reinfizieren und wird schnell amplifiziert werden; somit sind die verpackten Vektorpräparationen signifikannt kontaminiert. Aus der RPE.40-Linie entwickelte Herstellerzellen würden eine deutliche Verbesserung gegenüber den anderen, für die Sindbis-Virusinfektion permissiven Linien wegen der ineffizienten Amplifikation jedes, während der Vektorherstellung und Verpackung erzeugten, Wildtyp-Virus sein. Deshalb sind die Vektorpräparationen nicht signifikant mit Wildtyp-Virus kontaminiert. Darüber hinaus kann dieses System auf andere Zellinien durch Entwicklung von "Knock out"-Mutanten in der analogen zellulären Protease ausgedehnt werden.
    • 4. Hopping-Zellinien-Entwicklung
  • Sindbis-Hopping-Zellinien, wie zuvor erörtert, werden verwendet, um infektiöse RNA-Vektorpartikel transient herzustellen, welche für einen unterschiedlichen zellulären Rezeptortropismus pseudotypisiert worden sind. Wenn die Hopping- Zellinie Vektorpartikel herstellt, wird sie nicht länger benötigt, da nur die infektiösen Kulturüberstände benötigt werden, um die ursprünglichen, oben diskutierten Sindbis-Verpackungszellinien zu transduzieren. Deshalb muß die Hopping-Zellinie keine persistente Infektion von Sindbis ausüben, um die Vektorpartikel transient herzustellen. In diesem Fall kann die Elternzellinie entweder eine Insektenzellinie, welche die persistente Infektion ausübt, oder eine Säugerzellinie sein, welche voraussichtlich innerhalb von 72 Stunden nach einer produktiven Sindbis-Infektion lysiert wird. Das einzige Kriterium ist, daß die Zellinien befähigt sind, Sindbis-Strukturproteine zu exprimieren und zu prozessieren, während entweder das VSV-G-Protein oder das retrovirale gag-pol- und env-Protein ohne Einfluß auf das Zellwachstum vor der Transfektion mit dem Sindbis-RNA-Vektor koexprimiert wird. Deshalb kann die Sindbis-Hopping-Zellinie jede zuvor erwähnte Elternzellinie sein, welche befähigt ist, entweder Sindbis- oder retrovirale-Replikation, wie zuvor diskutiert, ohne zusätzliche Zellmodifikationen, wie bcl-2-Onkogen-Expression, zu unterstützen.
  • Die Erzeugung eines VSV-G-pseudotypisierten Sindbis-Vektors benötigt die Kotransfektion von in vitro transkribierter RNA oder DNA zusammen mit dem Vektor pMLP-G, welcher das VSV-G-Hüllprotein in einer Sindbis- Verpackungszellinie exprimiert. Zellwachstumsbedingungen und Transfektionsverfahren sind unter der Überschrift "Assembly bzw. Zusammenbau der Komponenten" beschrieben, und alle beschriebenen Verpackungszellkonfigurationen werden verwendet. Überstände, welche den VSV-G-pseudotypisierten Sindbis-Vektor enthalten, werden 24 Stunden nach Transfektion geerntet und dann verwendet, um frische Monolayer der identischen Sindbis-Verpackungszellinie zu transduzieren, um die Reduktion in der Transduktionseffizienz zu überwinden.
  • Für die Pseudotypisierung von Sindbis-Vektoren in retroviralen Verpackungszellinien kann jede in der Literatur zitierte Zellinie, welche retrovirale gag-pol- und env-Sequenzen exprimiert, verwendet werden, um einen Sindbis- RNA-Vektor zu verpacken, welcher konstruiert worden ist, eine retrovirale Verpackungssequenz zu enthalten. Die Retrovirus psi-Verpackungssequenz wird zwischen die inaktivierte Verbindungsregion und eine synthetische Verbindungsregion-Tandemwiederholung insertiert, so daß nur der genomische Vektor und keine subgenomische RNA durch die retroviralen Hüllproteine verpackt werden. Retrovirale Sindbis-Vektor-RNA enthaltende Partikel werden durch Transfizieren von in vitro-transkribierter Sindbis-Vektor-RNA, unter Verwendung von Verfahren, welche zuvor beschrieben worden sind, hergestellt. Überstände mit pseudotypisierten retroviralen Partikeln, welche Sindbis-RNA-Vektor enthalten, werden 24 Stunden nach Transfektion geerntet, und diese Überstände können dann verwendet werden, um eine Sindbis-Verpackungszellinie zu transduzieren.
    • B. STRUKTURELLE PROTEIN-EXPRESSION-KONSTRUKTE 1. Induzierbare und konstitutive Strukturprotein-Vektorkonstrukte
  • Die Entwicklung von Sindbis-Verpackungszellinien ist von der Fähigkeit abhängig, hohe intrazelluläre Spiegel von wichtigen Strukturproteinen zu synthetisieren: Kapsid, E2 und E1. Unglücklicherweise können die hohen Expressionsspiegel dieser Proteine, insbesondere der Hüllglykoproteine E2 und E1, zu gleichzeitiger Zytopathologie und möglichem Zelltod führen. Deshalb sind die strukturellen Protein-Expressionskassetten mit induzierbaren regulatorischen Elementen entworfen worden, welche den Spiegel der Genexpression zusätzlich zu anderen, welche konstitutive Spiegel der Expression aufrechterhalten, kontrollieren.
  • In der ersten Konfiguration ist die Expression der Sindbis-Strukturproteine unter der Kontrolle von RSV LTR, in Verbindung mit den induzierbaren lac-Operon- Sequenzen. Dies wird durch Insertion der Sindbis-cDNA, welche den viralen Strukturproteingenen entspricht, in die pOP13 und pOPRSV1-Vektoren (Stratagene) erreicht. Diese getrennt verwendeten Vektoren werden mit dem p3'SS-Vektor (Stratagene) kotransfiziert, welcher das lac-Repressor-"i"-Protein exprimiert. In Abwesenheit des Induktors, beispielsweise lsopropyl-B-D- Thiogalaktopyranosid (IPTG), ist vom Basal- oder vom konstitutiven Spiegel der Expression eines Luziferase-Reportergens bei 10-20 Kopien pro Zelle berichtet worden. Die Zugabe von IPTG ergibt eine Konformationsänderung des Repressorproteins, welche eine verminderte Affinität des lac-i-Proteins für lac- Operator-Sequenzen ergibt, was einen hohen Expressionsspiegel des heterologen Genes erlaubt. 95-fache Induktionsspiegel in Gegenwart von IPTG sind für heterologe Gene, welche in dem pOP13-Vektor enthalten sind, berichtet worden.
  • Insbesondere wird die Sindbis-Strukturproteingen-(SP)-cDNA in die pOP13- und pOPRSV1-Vektoren, wie folgt, insertiert. Die SP-kodierende Region wird im ganzen mit einem Primerpaar amplifiziert, dessen entsprechende 5'-Enden zu den authentischen AUG Translationalstart- und UGA-Translationalstop-Sequenzen, einschließlich der umgebenden Nukleotide, welche der Kozak-Konsensussequenz für effiziente translationale Initiation an Sindbis-Nukleotid 7638 entsprechen, passen. Der Forward-Primer ist zu den Sindbis-Nukelotiden 7631-7661 komplementär, und der Reverse-Primer ist zu den Sindbis-Nukleotiden 11384- 11364 komplementär. Die PCR-Amplifikation der Sindbis-cDNA, welche den Strukturproteingenen entspricht, wird mit einem Standard-Zweitemperatur- Zyklusprotokoll unter Verwendung des folgenden Oligonukleotidpaares durchgeführt: Forward-Primer (7638F): Reverse-Primer (11384R):
  • Zusätzlich zu ihren jeweiligen Komplementaritäten zu den angegebenen Sindbis- Nukleotiden wird eine 5 Nukleotid-"Puffersequenz", gefolgt von einer Not 1- Erkennungssequenz, an die 5'-Enden jedes Primers geknüpft. Nach der PCR- Amplifikation wird das 3.763 bp-Fragment in einem 1% Agarosegel gereinigt, dann anschließend mit Not I-Enzym verdaut. Das resultierende 3.749-bp Fragment wird dann getrennt in die pOP13-und pOPRSV1-Vektoren ligiert, welche mit Not I verdaut werden und dann mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt werden. Diese Expressionskassetten-Vektoren, welche die gesamte kodierende Kapazität der Sindbis-Strukturproteine enthalten, sind als pOP13-SINSP und pOPRSV1-SINSP bekannt.
  • Variationen der lac-Operon-Sindbis-Strukturprotein-Genexpressionkassetten können auch unter Verwendung anderer viraler, zellulärer oder Insekten-basierter Promotoren konstruiert werden. Unter Verwendung allgemeiner, in der Technik bekannter molekularbiologischer Techniken, das lac-Operon und der RSV LTR- Promotor, oder nur der RSV LTR-Promotor, können Sequenzen aus den Stratagene pOP13 und pOPRSV1-Vektoren herausgeschnitten werden und durch andere Promotorsequenzen, wie der Cytomegalievirus-major-immediate-Promotor (pOPCMV-SINSP), der Adenovirus-major-late-Promotor (pOPAMLP-SINSP) oder Insektenpromotorsequenzen, welche den Drosophila Metallothioneininduzierbaren Promotor (pMET-SINSP), Drosophila-Actin-5C distalen Promotor (pOPA5C-SINSP), Hitzeschockpromotoren HSP65 oder HSP70 (pHSP-SINSP) oder den Baculovirus Polyhedrinpromotor (pPHED-SINSP) einschließen, ersetzt werden.
    • 2. Modifikation der Kassetten, um die Proteinexpressionsspiegel zu vergrößern
  • Die Sindbis-Strukturproteinexpression kann erhöht werden, wenn der Spiegel der mRNA-Transkripte erhöht ist. Die Erhöhung der Spiegel der mRNA-Transkripte kann durch Modifizieren der Expressionskassette durchgeführt werden, so daß Sindbis-Nicht-Strukturproteine diese Transkripte erkennen, und wiederum die Botschaft auf höheren Spiegeln replizieren. Diese Modifikation wird durch Zugabe des Minimalen-Verbindungsregionkernes vom Wildtyp (Nukleotide 7579 bis 7602) zu dem äußersten 5'-Ende der Sindbis-Strukturprotein-kodierenden Region zwischen die erste authentische ATG-Startsequenz für die Translation und die Promotorsequenzen der Expressionskassette durchgeführt. Dies kann durch Folgen der gleichen, oben beschriebenen PCR-Amplifikationstechnik für die Plazierung der Sindbis-Strukturprotein-cDNA in die pOPRSV13 und pOPRSV1- Expressionsvektoren durchgeführt werden. Die einzige Modifikation in diesem Verfahren ist das Ersetzen des 7638F Forward-Primer gegen einen ähnlichen Primer, welcher die Verbindungsregionkern-Nukleotide 7579-7602 zwischen der Not I-Restrictionsenzymsequenz und des ersten ATG der kodierenden Region wie folgt enthält: Forward-Primer (JUN 7638F):
  • Nach der PCR-Amplifikation wird das resultierende 3.787 bp Fragment in einem 1% Agarosegel gereinigt, dann anschließend mit dem Not I Enzym verdaut. Das resultierende 3.773 bp Fragment wird dann getrennt in die pOP13 und pOPRSV1- Vektoren ligiert, welche mit Not I verdaut werden und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarmen behandelt werden. Die resultierenden Expressionskassetten- Vektoren sind als pOP13-JUNSINSP und pOPRSV1-JUNSINSP bekannt. Es muß jedoch erwähnt werden, daß die Einführung der Verbindungsregionsequenzen in die Strukturproteinexpressionskassetten Sequenzen einführt, welche möglicherweise zu unerwünschten Rekombinationsereignissen führen, was zu der Erzeugung von Wildtyp-Sindbisvirus führt.
    • 3. Induzierbare Expression von Strukturproteinen über Sindbis-Vektor
  • Wegen der möglichen zytotoxischen Effekte durch die Strukturproteinexpression kann die Etablierung von induzierbaren Verpackungszellinien, welche noch moderate Basalspiegel/dieser Proteine exprimieren, nicht das beste Verfahren sein. Deshalb werden Verpackungs-Zellinien-Expressionskassetten konstruiert, welche regulatorische Elemente für die Induktion der Strukturproteinsynthese durch hohe Spiegel durch Nicht-Strukturproteine, welche in trans durch den Sindbis-Vektor bereit gestellt werden, aber keine Basallevelsynthese, bis sie geeignet stimuliert werden, enthalten.
  • In dieser Konfiguration wird eine Strukturproteinkassette konstruiert, wobei die Transkription der Strukturproteingene von einer angrenzenden Sindbis- Verbindungsregion-Sequenz stattfindet. Die primären Merkmale dieser Kassette sind: ein RNA-Polymerase II-Promotor, welcher unmittelbar benachbart zu dem Sindbis-Nukleotid 1 positioniert ist, so daß die Transkriptioninitiation mit dem authentischen Sindbis-Nukleotid 1 beginnt, die 5'-terminalen-Sindbis-Sequenzen, welche für die Transkriptaseerkennung benötigt werden, die Sindbis- Verbindungsregion-Sequenz zur Expression der Strukturproteingen mRNA, die Sindbis-Strukturproteingensequenzen, die 3'-terminalen-Sindbis-Sequenzen, welche für die Replikation benötigt werden und eine Transkriptionsterminations/Polyadenylierungssequenz. Wegen eines stromaufwärts liegenden offenen Leserahmens, welcher an den Translation- Terminationscodons vor der AUG-Startsequenz der Strukturproteine endet, kann die Expression der Sindbis-Strukturproteine nur nach der Synthese der Minusstrang-RNA durch Vektor gelieferte Nicht-Strukturproteine und die anschließende Transkription einer Strukturproteingen-mRNA von der Verbindungsregion stattfinden. Deshalb hängt die Induzierbarkeit dieses Systems gänzlich von der Anwesenheit von Nicht-Strukturproteinen ab, welche mit dem Sindbis-Vektor selbst geliefert werden, welcher entweder als in vitro transkribierte RNA oder als cDNA, welche stromabwärts zu dem geeigneten Promotorelement positioniert ist, eingeführt ist. Zusätzlich erlauben die 5'- und 3'-terminalen- Sindbissequenzen diesem RNA-Transkript der Strukturproteingenkassette, durch die gleichen durch den Vektor gelieferten Nicht-Strukturproteine amplifiziert zu werden (s. Fig. 8).
  • Spezifisch wird die Konstruktion einer Positiv-Sequenz, Vektor-induzierbaren Verpackungskassette wie folgt durchgeführt. Der kürzlich beschriebene pVGELVIS-Vektor wird mit dem Enzym BspEI verdaut, um die Nukleotide 422 bis 7054, einschließlich der meisten Nicht-Strukturgen-kodierenden Sequenzen, zu entfernen, und das verbleibende 9925 bp Fragment wird in einem 0,8% Agarosegel gereinigt und anschließend mit sich selbst religiert, um ein Konstrukt bekannt als pLTR/SindIBspE zu erzeugen. Diese Deletion läßt das 5'-Ende des authentischen Translationsstartcodons an den Nukleotiden 60-62 intakt und erzeugt in-frame bzw. im Rahmen stromabwärts UAA- und UGA-Stopcodons bei den Nukleotiden 7130-7132 bzw. 7190-7192 (ursprüngliche Numerierung), um auf diese Weise die Translation von stromabwärts Strukturproteingen-offenen Leserahmen zu verhindern. Das pLTR/SindIBspE-Verpackungskassettenkonstrukt wird anschließend in BHK-Zellen (ATCC #CCL 10) transfiziert, und positive Transfektanten werden unter Verwendung des G418-Arzneistoffs bei 400 ug/ml, wie zuvor beschrieben, selektiert. Die in Fig. 4 gezeigten Daten zeigen, daß die Transfektion von Sin-luc Vektor-RNA in diese LTR/SindIBspE-Verpackungszellen die Herstellung von infektiösen Sindbis-Partikeln ergibt, welche die Sin-fuc-RNA enthalten, sowie für die erhaltenen Überstände gezeigt wird, daß sie Sin-luc- Vektor-RNA auf frische Monolayer von BHK-Zellen transferieren.
  • Ein ähnliches Verpackungskonstrukt wird auch unter Verwendung des pVG- ELVISd-Klons (zuvor beschrieben) Ausgangsmaterial zur Erzeugung der BspEl- Deletion hergestellt. In diesem Klon folgt der Sindbis-3'-terminalen-Sequenz eine katalytische Ribozym-Sequenz, um noch genaueres Prozessieren des primären Transkripts, benachbart zu den 3'-terminalen-Sequenzen von Sindbis, zu erlauben. Zusätzlich können Variationen dieser Verpackungskassetten- Konstruktionen, unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardtechniken, gemacht werden, welche einschließen: die Substitution von anderen RNA-Polymerasepromotoren für den gegenwärtigen MuLV LTR, Zugabe von einem oder mehreren Nukleotiden zwischen dem RNA-Polymerasepromotor und dem ersten Sindbis-Nukleotid oder die Substitution von Nicht-Sindbiskodierenden Leserahmen stromaufwärts zu den Strukturproteinsequenzen, welche das 5'-Ende der Sindbis-Sequenzen, welches für die Transkriptaseerkennung benötigt wird, beibehalten oder nicht beibehalten können.
  • In einer anderen Vektor-induzierbaren Verpackungskonfiguration enthalten die Expressionskassetten eine cDNA-Kopie der Sindbis-Strukturprotein- Gensequenzen, welche durch ihre natürliche Verbindungs- und 3'-untranslatierte Regionen flankiert sind und in einen Expressionsvektor in einer Orientierung insertiert sind, so daß eine primäre Transkription von dem Promotor Antisense- Strukturprotein-Gen-RNA-Moleküle herstellt. Zusätzlich enthalten diese Konstrukte auch, benachbart zu der Verbindungsregion, Sindbis-5'-terminale-Sequenzen, welche notwendig für die Erkennung durch die virale Transkriptase sind, und eine katalytische Ribozymsequenz, welche direkt benachbart zu der Sindbis-Nukleotid 1 der 5'-terminalen-Sequenz positioniert ist. Als solches spaltet dieses Ribozym das primäre RNA-Transkript präzise nach dem ersten Sindbis-Nukleotid. In dieser Antisense-Orientierung können die Strukturproteingene nicht translatiert werden und sind völlig von der Anwesenheit von Sindbisvirus-Nicht-Strukturproteinen zur Transkription in die Positiv-Strang-mRNA vor ihrer Expression abhängig. Diese Nicht-Strukturproteine werden durch den Sindbis-Vektor selbst bereit gestellt. Zusätzlich, da diese Konfiguration die genauen Sindbis-Genom-5'- und 3'- terminalen-Sequenzen enthält, erfahren die Strukturproteingentranskripte eine Amplifikation, unter Verwendung der gleichen Nicht-Strukturproteine, welche durch den Sindbis-Vektor bereit gestellt werden.
  • Spezifisch wird die Sindbis-Strukturproteingen-cDNA aus dem genomischen Klon pVGSP6GEN entfernt und in den pcDNA3-Expressionsvektor (Invitrogen Corp., San Diego, CA) wie folgt insertiert. Zuerst wird das Plasmid pVGSP6GEN mit den Enzymen ApaI und BamHI verdaut, um alle Sindbis-Sequenzen bis Nukleotid 7335, einschließlich der Gene, welche die Nicht-Strukturproteine 1, 2, 3 und das meiste von 4 kodieren, zu entfernen. Das verbleibende 7285 bp Vektorfragment, welches die Sindbis-Strukturproteingene enthält, wird in einem 0,8% Agarosegel gereinigt und anschließend mit einer Polylinkersequenz, genannt SinMCS, welche durch Annealing von zwei synthetischen OligoNukleotiden erhalten wird, ligiert. Die Oligonukleotide, SinMCSI und SinMCSII, erhalten die Erkennungssequenzen für ClaI, BglII und SpeI und weisen nach dem Annealing Apal- und BamHI-Enden auf. Diese Sequenzen sind wie folgt: SinMCSI: SinMCSII:
  • Das resultierende Konstrukt, bekannt als pMCS-26s, wird dann modifiziert, um die 5'-terminalen 299 Nukleotide von Sindbis zu enthalten, fusioniert an die 84 Nukleotide lange Ribozymesequenz von dem antigenomischen Strang des Hepatitis Delta Virus (HDV)(Nature 350: 434), unter Verwendung von übetiappender PCR-Amplifikation. Zwei Primerpaare werden anfänglich in getrennten Reaktionen verwendet, gefolgt durch ihre überlappende Synthese in einer zweiten PCR-Runde. In Reaktion #1 ist der Forward-Primer (HDV49-XC) komplementär zu HDV-Genom-Nukleotiden 823-859 und der Reverse-Primer (HDV17-68) ist komplementär zu den HDV-Genom-Nukleotiden 839-887, mit Sequenzen wie folgt: Forward-Primer (HDV49-XC): Reverse-Primer (HDV17-68):
  • Zusätzlich zu ihren entsprechenden Komplementaritäten enthält der Primer HDV49-XC flankierende XbaI und ClaI-Erkennungssequenzen am 5'-Ende. Die PCR-Amplifikation von HDV-Sequenzen wird durch ein Standard-Zweitemperatur- Zyklusprotokoll mit diesen Primern und Vent-Polymerase durchgeführt. In Reaktion #2 ist der Forward-Primer (SIN-HDV), welcher genau die HDV- und Sindbis-Sequenzen verbindet, komplementär zu den Nukleotiden 1-21 von Sindbis und genomischen Nukleotiden 871-903 von HDV und überlappt die Sequenz des Primer HDV17-68 (von oben) um 20 Nukleotide, und der Reverse- Primer (SIN276-SPE) ist komplementär zu den Sindbis-Nukleotiden 299-276, mit Sequenzen wie folgt: Forward-Primer (SIN-HDV): Reverse-Primer (SIN276-SPE):
  • Zusätzlich zu ihren entsprechenden Komplementaritäten, enthält der Primer SIN276-SPE ein flankierendes UAA-Translations-Terminationscodon und eine SpeI-Erkennungssequenz an seinem 5'-Ende. Die PCR-Amplifikation des Fragments, welches Sindbis-5'-terminale-Sequenzen fusioniert mit HDV- Ribozymsequenzen enthält, wird durch ein Standard-Zweitemperatur- Zyklusprotokoll unter Verwendung von Vent Polymerase, diesen Primern und pVGSP6GEN-Plasmid als Template bzw. Matrize durchgeführt. Nach der ersten Runde der PCR-Amplifikation wird ein Zwanzigstel der Gesamtmengen jeweils von Reaktion #1 und Reaktion #2 kombiniert und als Template in einer zweiten Runde der PCR-Amplifikation mit zusätzlicher Zugabe der Primer HDV49-XC und SIN276-SPE und einem Standard-Zweitemperatur-Zyklusprotokoll verwendet. Nach der zweiten Runde der PCR wird das 414 bp Amplikon mit dem Mermaid Kit (Bio 101, La Jolla, CA) gereinigt und mit den Enzymen ClaI und SpeI gereinigt. Das verdaute Amplikon wird auf einem 1% Agarosegel gereinigt und anschließend in das Plasmid pMCS-26s ligiert, welches auch mit ClaI und SpeI verdaut und auf einem 1% Agarosegel gereinigt wird. Das resultiernde Konstrukt, welches die Expressions-Kassettenelemente HDV antigenomisches Ribozym/Sindbis 5'- terminale 299 Nukleotide/Sindbis-Verbindungsregion/Siondbis- Strukturproteingene/Sindbis 3'-terminale untranslatierte Region enthält, ist als pδ5'26s bekannt.
  • Die Insertion der Strukturproteingenkassette von pδ5'26s in den pcDNA3-Vektor wird wie folgt durchgeführt. Plasmid pδ5'26s wird mit dem Enzym XbaI und den 3'- verkürzten Enden glatt bzw. "blunt" durch die Zugabe von Klenow-Enzym und dNTPs gemacht. Die gesamte 4798 bp Strukturproteingenkassette wird in einem 1% Agarosegel gereinigt. Plasmid pcDNA3 wird mit den Enzymen HindIII und Apal verdaut, und die Enden werden glatt durch Zugabe vonT4-DNA- Polymeraseenzym und dNTPs gemacht, und der 5342 bp Vektor wird in einem 1% Agarosegel gereinigt. Die zwei gereinigten DNA-Fragmente mit glatten Enden werden anschließend ligiert, und der resultierende Strukturprotein- Genexpressionskassetten-Vektor ist als pCMV-δ5'26s bekannt (s. Fig. 8). Die Transfektion von dieser DNA in Zellen und Selektion auf G418-Resistenz wird wie zuvor beschrieben ausgeführt.
  • Modifikationen des CMV-Promotor/Antisense-Sindbis-Strukturprotein-Vektors können auch unter Verwendung anderer viraler, zellulärer oder Insektenbasierender Promotoren konstruiert werden. Unter Verwendung allgemeiner im Stand der Technik bekannter molekularbiologischer Techniken kann der CMV- Promotor aus dem Invitrogen pcDNA3-Vektor ausgeschnitten werden und durch Promotoren wie solche, zuvor aufgelisteten, ersetzt werden. Eine andere Variation dieser Antisense-Verpackungskassette kann einschließen, ist aber nicht begrenzt darauf: Zugabe von einem oder mehreren Nukleotiden zwischen dem ersten Sindbis-Nukleotid und dem katalytischen Ribozym, die Verwendung von anderen katalytischen Ribozym-Sequenzen für die Transkript-Prozessierung, die Substitution eines genauen Transkriptions-Terminations-Signals für die katalytische Ribozym-Sequenz oder die Antisenseexpression von Strukturprotein- Genkassetten unter Verwendung einer beliebigen stromabwärts liegenden Sequenz, welche durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, welche die Transkription einer Strukturprotein-Gen-mRNA ergibt.
  • Ferner sollte angemerkt werden, daß jedes der beschriebenen Vektorinduzierbaren Konstrukte Sequenzen, homolog zu dem Sindbis-Vektor selbst, enthält. Daher besteht das Potential zur Erzeugung von Wildtyp-Virus durch Rekombination zwischen zwei RNA-Molekülen. Zusätzliche Modifikationen werden durchgeführt, um diese Möglichkeit, wie unten beschrieben, zu eliminieren.
    • 4. Trennung von Strukturprotein-Genen, um die Kombination zu verhindern
  • Nach dem Aufzeigen der Nützlichkeit der hier beschriebenen Ansätze werden zusätzliche Verpackungszellinien, basierend auf diesen Prinzipien, erzeugt. Diese zusätzlichen Linien trennen die Integration und Expression der Strukturprotein- Gene, was ihre Transkription als nicht-überlappende, unabhängige RNA-Moleküle erlaubt. Die Expression von Capsid-Protein, unabhängig von den Glykoproteinen E2 und E1 oder jedes dieser drei Proteine unabhängig voneinander, eliminiert die Möglichkeit der Rekombination mit Vektor-RNA und anschließende Erzeugung von kontaminierendem Wildtyp-Virus.
  • Insbesondere wird das Capsidprotein unabhängig von einem induzierbaren Expressionsvektor exprimiert, so daß die Sequenzen, welche eine Rekombination mit der Vektor-RNA ergeben könnten, eliminiert werden. Als ein Beispiel wird das Capsidprotein-Gen von dem Plasmid pVGSP6GEN mit einem Primerpaar, welches zu den Nukleotiden 7632-7655 (Forward-Primer) und 8415-8439 (Reverse-Primer) komplementär ist, mit folgenden Sequenzen amplifiziert: Forward-Primer: Reverse-Primer:
  • Zusätzlich zu ihren entsprechenden Komplementaritäten enthält der Forward- Primer NheI- und HindlII-Erkennungssequenzen an seinem 5'-Ende, und der Reverse-Primer enthält sowohl UAG- als auch UAA-Translationsstopcodons und eine XhoI-Erkennungssequenz an seinem 5'-Ende. Die Amplifikation wird unter Verwendung eines Standard-Zweitemperatur-Zyklusprotokolls durchgeführt, und das resultierende Amplikon wird mit den Enzymen NheI und XhoI verdaut und auf einem 1% Agarosegel gereinigt. Das Expressionsplasmid pMAM (Clontech), welches eine Dexamethason-induzierbare MMTV LTR Promotorsequenz enthält, wird mit den Enzymen NheI und XhoI verdaut und die Plasmid-DNA in einem 1% Agarosegel gereinigt. Das Capsidprotein-Genfragment wird in den pMAM-Vektor ligiert, und das resultierende Konstrukt ist als pMAM-SinC bekannt. Plasmid pMAM-SinC wird in die geeignete Zellinie, wie zuvor beschrieben, transfiziert und die Selektion auf stabile Transfektanten wird unter Verwendung von HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Medium, wie vom Hersteller beschrieben, durchgeführt.
  • Die Glykoproteingene, E1 und E2, werden zusammen unter Verwendung eines der zuvor beschriebenen induzierbaren Systeme exprimiert. Beispielsweise werden die E1- und E2-Gene von dem Plasmid pVGSP6GEN unter Verwendung eines Primerpaars, welches zu den Sindbis-Nukleotiden 8440-8459 (Forward- Primer) und den Sindbis-Nukleotiden 11.384-11.364 (Reverse-Primer) komplementär ist, amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wird unter Verwendung eines Standard-Zweitemperatur-Zyklusprotokolls und dem folgenden Oligonukleotidpaar durchgeführt: Reverse-Primer (11384R): Forward-Primer (8440F):
  • Zusätzlich zu ihren entsprechenden Komplementaritäten enthält der Forward- Primer ein "inframe"-AUG-Translation-Initiationscodon, und beide Primer enthalten eine NotI-Erkennungssequenz an ihren 5'-Enden. Nach der PCR-Amplifikation wird das Amplikon mit dem NotI-Enzym verdaut und in einem 1% Agarosegel gereinigt. Das resultierende Fragment wird dann getrennt in die pOP13- und pOPRSV1-Vektoren (Stratagene) ligiert, mit Not I verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm bzw. "calf-intestinal-alkaline-phosphatase" (engl.), wie zuvor beschrieben, behandelt. Diese Glykoprotein-Expressionsvektoren werden verwendet, um Zellen zu transfizieren, welche zuvor mit dem Capsidprotein-Expressionskonstrukt transfiziert worden sind.
    • 5. Zusammenbau bzw. "Assembly" der Komponenten, um die Sindbis- Vernackungszellinie zu erzeugen
  • Als Beispiel wird die Aedes albopictus-Zellinie verwendet, um den Zusammenbau bzw. das Assembly der Komponenten zu zeigen. Es können jedoch andere möglichen Elternzellinien verwendet werden, um Sindbis-Verpackungszellinien zu erzeugen, und sind zuvor diskutiert worden. Aedes albopictus-Moskitozellen (ATCC Nr. CRL 1660) werden bei 28ºC in 5% CO&sub2; in Minimal-Medium (Eagle) mit nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, Earle's balanced-Salzlösung, 0,11% Natriumbicarbonat und 10% fötales Kälberserum (optimales Medium) gezüchtet. Etwa 5 · 10&sup5; Moskitozellen werden in einer 35 mm Petrischale gezüchtet und mit 5 ug p3'SS unter Verwendung von 5 ml des Transfectam (Promega)-kationischen Lipidreagenses unter serumfreien Mediumbedingungen, wie durch den Hersteller beschrieben, transfiziert. Jedoch kann jede Methode der Transfektion durchgeführt werden, d. h. durch Elektroporation, Calciumphosphat- Präzipitation oder unter Verwendung einer von den leicht erhältlichen kationischen Liposomenformulierungen und Verfahren, welche im Stand der Technik allgemein bekannt sind. 24 h nach Transfektion werden die Zellen, wie oben beschrieben, mit 4 ml optimalen Medium bedeckt, mit 200 ug/ml des Antibioticums Hygromycin ergänzt und über einen Zeitraum von 10 bis 14 Tagen selektiert. Expandierte Klone werden dann isoliert und auf die Fähigkeit zur Expression des Lac- Repressors durch Northern Blot-Hybridisierung überprüft. Ein einzelner Klon, welcher zufriedendestellende Spiegel an Lac-Repressor-mRNA exprimiert, wird dann mit einem Lac-Operon-Vektorkonstrukt retransfiziert, welches die Sindbis- Strukturproteine (d. h. pOP13-SINSP oder pOPRSV1-SINSP) exprimiert, gefolgt durch Arzneistoff-Selektion mit 200 bis 800 ug/ml Geneticin und fortgesetzter Hygromycin-Selektion. Kolonien, welche Resistenz gegen beide Antibiotikas zeigen, werden dann vereinigt, verdünnungskloniert und vermehrt. Individuelle Klone werden dann mit 5 mM IPTG für 12 Stunden induziert und auf hohe Spiegel von Sindbis-Strukturprotein-Expression überprüft. Die Expression kann durch Western Blot-Analyse unter Verwendung von spezifischen Antikörpern (erhältlich in der Literatur) oder durch Quantifizierung der Sindbis-spezifischen RNA in RNase-Schutztests unter Verwendung von ³²P-endmarkierten RNA-Proben, welche zu der RNA der Sindbis-Strukturprotein-Genregion komplementär sind, überprüft werden. Diese Testverfahren zeigen Klone mit den höchsten Spiegeln von Strukturprotein-Expression als Antwort auf die Induktion mit IPTG. Verschiedene der hoch-exprimierenden Moskitozellklone (bezeichnet als Albopictus-SINpak-Zellen) werden dann auf ihre funktionelle Aktivität geprüft. Die funktionelle Aktivität wird durch Aufzeigen der Fähigkeit der Zellinien, den Luziferase-exprimierenden Vektor zu verpacken und die darauffolgende Fähigkeit des Mediumüberstandes BHK-21-Zellen zu reinfizieren und Luziferase-Aktivität zu übertragen, überprüft.
  • Spezifisch werden Albupictus-SINpak-Zellen, welche in 35 mm Petrischalen mit dem oben beschriebenen Selektionsmedium, welches Hygromycin und Geneticin enthält, mit RNA transfiziert, welche durch in vitro-Transkription (Promega) der zuvor beschriebenen pSKSINBV-luc cDNA transfiziert wird. Eine Stunde nach Transfektion wird das Medium mit 5 mM IPTG ergänzt. Der Überstand wird 24 h nach Transfektion geerntet und verwendet, um BHK-21-Zellen direkt und eine frische Monolayer von Albupictus-SINpak-Zellen, welche wie oben mit 5 mM IPTG für mindestens 12 h induziert werden, zu infizieren. Die Überstände der Infektion werden 24 h nach Infektion geerntet und dann verwendet, um eine zweite Monolayer von BHK-21-Zellen, welche in 35 mm Petrischalen wachsen, zu infizieren. 16 h nach Infektion werden die BHK-21-Zellen lysiert und auf ihre Luziferase-Aktivität, wie beschrieben (Promega), überprüft. Der Vergleich der Luziferaseaktivitäten, welche von BHK-21-Zellen erhalten werden, welche nach der ersten Runde der Vektorproduktion infiziert werden, mit BHK-21-Zellen, welche nach der zweiten Runde der Vektorproduktion infiziert werden, sollte mindestens eine zehnfache Differenz der Expressionsspiegel zeigen. Wenn die Unterschiede in den Spiegeln zehnfach niedriger sind, kann die Reduktion der dem Transfer folgenden Transduktionseffizienz eine Folge des besetzten zellulären Rezeptors auf der identischen Sindbis-Verpackungszellinie, aus welcher der transiente Vektor hergestellt wurde, sein. Dies kann die Notwendigkeit für die Erzeugung von pseudotypisierten Sindbis-Vektoren zeigen, um die Transduktions- Effizienz in Hülle-bezogenen Verpackungszellinien zu verbessern.
    • C. INDUZIERBARER VEKTOR UND STRUKTURPROTEIN-EXPRESSION FÜR SINDBIS-HERSTELLERZELLINIEN 1. Verwendung von viralen Promotoren
  • Die Herausforderung für die Entwicklung einer Sindbis-Vektor-Herstellerzellinie liegt in der Frage, ob ein Virus, dessen Infektion von Säugerzellen fast ausschließlich einen produktiven lytischen Zelltod ergibt, irgendwie umgewandelt werden kann, -um eine persistente Infektion in den gleichen Zellen zu etablieren.
  • Eine Möglichkeit ist die Sindbis-Vektor-Herstellerlinien aus Moskitozellen zu erzeugen, wo virale Persistenz nach der Infektion resultiert. Der Titer von infektiösem Virus, hergestellt in persistent-infizierten Moskitozellen, beträgt jedoch nur 1 · 10&sup4; PFU/ml, mindestens fünf Größenordnungen kleiner als der nach der lytischen Sindbisinfektion von BHK-Zellen Beobachtete. Deshalb kann es kommerziell nicht möglich sein, Moskito-abgeleitete Sindbis-Vektor- Herstellerzellinien zu entwickeln.
  • Viele Strategien sind für induzierbare Sindbis-Vektor-Herstellerzellinien beschrieben worden, welche sowohl Vektor- als auch virale Struktur-Genkassetten enthalten, so daß die produktive zytolytische Infektion nur nach dem korrekten Stimulus stattfindet. Da diese Versuche auf einem "feed forward" Spiegel operieren, resultiert jeder Fehler bzw. Schwäche des Systems in der Initiation des Sindbis-Lebenszyklus und Zelltod.
  • Das Entwicklungsmerkmal ist der Differenzierungsstatus, welcher vom Genexpressionsmuster abhängig ist. Genexpressionsmuster unterscheiden sich weit zwischen undifferenzierten und ausdifferenzierten Stadien. Daher ist es möglich, daß eine Zelle, deren Differenzierungsstadium kontrolliert werden kann, ein idealer Wirt ist, um eine Sindbis-Vektor-Herstellerzellinie abzuleiten. In einer solchen Konfiguration werden der Vektor und die Strukturkomponenten aus Differenzierungs-Stadium-induzierbare Promotoren, gemäß der beschriebenen ELVIS-Strategie, gekoppelt und verwendet, um undifferenzierte Wirtszellen stabil zu transformieren. Die terminale Differenzierung bzw. Ausdifferenzierung der Wirts-Herstellerzelle nach Induktion durch die geeigneten Stimuli ergibt übereinstimmend die Induktion des Sindbis-Replikationszyklus und die Herstellung des verpackten Vektors. Andere hierin beschriebene Strategien, einschließlich Antisense-Strukturgenen und heterologen viralen Expressionssystemen, würden mit unten beschriebenen zellulären Differenzierungsstadium-abhängigen Promotoren gekoppelt werden. Für diesen Ansatz werden drei Beispiele unter Verwendung von entweder einem viralen oder zellulären Promotor beschrieben, welche nur in ausdifferenzierten Zellen aktiv sind.
  • Es ist gezeigt worden, daß das Maus-Polyomavirus (Py), SV40 und Moloney- Murine-Leukemia-virus (M-MuLV) alle befähigt sind, differenzierte embryonale Karzinom (EC)-Zellen der Maus zu infizieren und zu erreichen, aber die Expression ihrer Gene (und heterologen Gene) und Etablierung der produktiven Infektion ist blockiert (Swartzendruber und Lehmann, J. Cell. Physiol. 85: 179-188, 1975; Peries et al., J. Natl. Cancer last. 59: 463-465, 1977). Diese viralen Wachstumseigenschaften sind in zwei Zellinien, PCC4 und F9 nachgewiesen worden, welche von malignen Stammzellen von Maus-Teratorkarzinomen stammen. Die Blockierung der viralen Vermehrung findet auf dem Niveau der Transkription und Replikation statt und passt zu den Enhancern, welche in den viralen nichtkodierenden Kontrollregionen enthalten sind (Linney et al., Nature 308: 470-472, 1984; Fujimura et al., Cell 23: 809-814, 1981; Katinka und Yaniv, Cell 20: 393-399, 1980).
  • Wenn M-MuLV undifferenzierte EC-Zellen infiziert, integriert die virale DNA in das Genom. Wie oben erwähnt, wird jedoch die Expression der viralen Gene oder der heterologen Gene blockiert. Diese Blockierung der viralen Expression wird nach der Ausdifferenzierung der EC-Zellen durch Zugabe von Retinsäure zum Wachstumsmedium aufgehoben.
  • Um die RNA-Expressionseigenschaften des pVGELVIS-Konstrukts in EC-Zellen zu überprüfen, wird Plasmid-DNA mit Lipofectamin gemäß der durch den Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen (ca. 5 ug DNA/8 mg Lipidreagens) komplexiert und zu 35 mm Vertiefungen, welche undifferenzierte PCC4- oder F9- Zellen enthalten (Fujimura et al. 1981. Cell 23: 809-814), bei etwa 95% Konfluenz gegeben. Die Entwicklung der zytopathischen Effekte (CPE) und der Spiegel der produktiven Sindbis-Infektion, welche durch einen Plaquetest des Medienüberstandes quantifiziert wird, wird in regelmäßigen Intervallen über 5 Tage in undifferenzierten und differenzierten transfizierten PCC4- oder F9-Zellen bestimmt. Die Differenzierung von F9- und PCC4-Zellen wird durch Zugabe von Retinsäure (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) bei einer Endkonzentration von 1 umol durchgeführt.
  • Es ist vorgeschlagen worden, daß die Hierarchie der relativen Expression heterologer Gene, welche in undifferenzierten EC-Zellen, welche mit M-MuLV- Vektoren infiziert sind, beobachtet wird, zum Teil insertionsabhängig sein kann (Linney et al. 1987. J. Virol. 61: 3248-3253). Deshalb werden möglicherweise undifferenzierte EC-Zellen, welche mit pVGELVIS transfiziert sind, unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf die Transkription der Sindbisgenomischen cDNA und als Folge in Bezug auf die Initiation des viralen Lebenszyklus liefern. Bei diesem Ereignis, welches auf die G418-Selektion von pVGELVIS-transfizierten undifferenzierten EC-Zellen folgt, werden die verbleibenden Zellen kloniert und expandiert. Die Zellklone werden dann auf die Produktion von Sindbisvirus nach der Differenzierung durch Zugabe von Retinsäure (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) bei einer Endkonzentration von 1 umol überprüft.
  • Um die Vektor-Verpackungszellinien, deren Herstellung aus Strukturproteinen in Anwesenheit von Sindbis-NSP Zelldifferenzierungsstadium-abhängig ist, zu isolieren, werden undifferenzierte F9- oder PCC4-Zellen, wie oben beschrieben, mit pLTR/SINdlBspE transfiziert und mit G418 selektiert. Differenzierungsstadiumsensitive Klone werden dann durch Infektion bei hoher Multiplizität mit verpacktem SIN-luc-Vektor selektioniert. Klone, welche gegenüber Zelllyse resistent sind oder keine verpackten SIN-luc-Vektorpartikel herstellen, sind Anwärter als Vektor- Verpackungsklone. Diese Anwärter-Klone werden dann auf SIN-luc-Vektor- Partikelproduktion, welche auf die Ausdifferenzierung durch Retinsäure, wie beschrieben, folgt, überprüft.
  • Das Maus-Wildtyp-Polyomavirus (Py) ist unfähig, in Teratorkarzinomzellinien PCC4 oder F9 zu replizieren. Diese Blockierung der Replikation in undifferenzierten Zellen findet auf dem Niveau der Transkription der early region (d. h. T-Antigen)-Gene statt und wird durch Induktion der Ausdifferenzierung mit Vitamin A freigesetzt. Py-Mutanten, welche befähigt sind, produktive Infektion in undifferenzierten PCC4- oder F9-Zellen zu etablieren, passen zu der viralen Enhancerregion. Die Entstehung von viralen embryonalen gewebespezifischen transkriptionalen Enhancerelementen resultiert aus diesen Mutanten. Um diese Eigenschaft der Hemmung der Py-Replikation in undifferenzierten Teratorkarzinomzellinien auszunützen, wird die virale regulatorische nichtkodierende Region, einschließlich des Enhancers, an die genomische cDNA des Sindbisvirus, gemäß der ELVIS-Strategie, gekoppelt. Die genaue transkriptionale Startstelle der Py-early-Region ist bestimmt worden (siehe Tooze, DNA-Tumorviren). Die PCC4- und F9-Zellinien werden stabil mit den Py- Sindbisvektoren transformiert. In diesem Modell findet die produktive Sindbisinfektion nach Zugabe von Retinsäure zu dem Kulturmedium und nach Induktion der Ausdifferenzierung statt.
  • Die Py-nichtkodierende Region der Basen 5021-152, welche die Sequenzen, welche den viralen Enhancern, 21 bp-Wiederholungen, Replikationsursprung, CAAT- und TATA-Boxen und der early-mRNA-Transkription-5'-Capsequenz entsprechen, einschließt, ist an dem 5'-viralen Ende positioniert, so daß in vivo nur ein einzelner gecappter C-Rest zu dem Sindbis-5'-Ende hinzugefügt wird. Das Nebeneinanderlegen der Py-nichtkodierenden Region und des Sindbis-5'-Endes wird durch überlappende PCR, wie im Folgenden detailiert beschrieben, durchgeführt. Die Amplifikation der Py-nichtkodierenden Region in der ersten primären PCR-Reaktion wird in einer Reaktion, welche den pBR322/Py, das Stamm-A2-Plasmid (ATCC-Nummer 45017-p53.A6.6(pPy-1)) und das folgende Primerpaar enthält, durchgeführt: Forward-Primer: Pybgl5021F (Puffersequenz/Bgl II-Erkennungssequenz/Py nts 5021-5043): Reverse-Primer: SINPy152R (SIN nts 5-1/Py nts 152-134):
  • Die PCR-Amplifikation der Py-nichtkodierenden Region mit dem oben gezeigten Primerpaar wird unter Verwendung der Thermalase-thermostabilen-DNA- Polymerase (Ameresco Inc., Solon, Ohio) und dem vom Lieferanten bereitgestellten Puffer, welcher 1,5 mmol MgCl&sub2; enthält, ausgeführt. Zusätzlich enthält die Reaktion 5% DMSO und Heißstart-Wachsperlen (Perkin-Elmer), unter Verwendung des unten gezeigten folgenden PCR-Amplifikationsprotokolls:
  • Die Amplifikation des Sindbis-5'-Endes in der zweiten primären PCR-Reaktion wird in einer Reaktion durchgeführt, welche den pVGSP6GEN-Klon und das folgende Primerpaar enthält: Forward-Primer: (Py nts 138-152/SIN nts 1-16): Reverse-Primer: (SIN nts 3182-3160):
  • Die PCR-Amplifikation der Sindbis-5'-terminale-Region mit dem oben gezeigten Primepaar weist die oben beschriebenen Reaktionsbedingungen unter Verwendung des unten gezeigten folgenden PCR-Amplifikationsprotokolls auf:
  • Die 442 bp- und 3202 bp-Produkte von den primären PCR-Reaktionen wurden mit Geneclean (BIO 101) gereinigt und zusammen in einer PCR-Reaktion mit dem folgenden Primerpaar verwendet: Forward-Primer: Pybgl5021F (Puffersequenz/Bql II-Erkennungssequenz/Py nts 5021-5043): Reverse-Primer: (SIN nts 2300-2278):
  • Die PCR-Amplifikation des Primer-PCR-Amplikonprodukts mit dem oben gezeigten Primerpaar ist mit den obigen Reaktionsbedingungen unter Verwendung des unten gezeigten PCR-Amplifikationsprotokolls beschrieben:
  • Die 20 3'-terminalen Basen des ersten primären PCR-Amplikonproduktes überlappen mit den 20 5'-terminalen Basen des zweiten primären PCR- Amplikonprodukts. Das resultierende 2,742 bp überlappende sekundäre PCR- Amplikonprodukt wird durch 0,8% Agarose/TBE-Elektrophorese gereinigt, mit Bgl II verdaut, und das 2.734 bp Produkt wird in den mit Bgl II und CIAP behandelten pcDNASINbgl/xba (siehe Beispiel 3) ligiert. Das resultierende Konstrukt weist 16.641 bps auf und ist als ELVIS-PySIN bekannt. Um einen Strukturprotein- Expressionsvektor ähnlich zu pLTR/SindlBsp für die Ableitung von Vektor- Verpackungszellinien zu konstruieren, wird die ELVIS-PySIN-Konstruktion mit Bsp EI vollständig verdaut und unter verdünnten Bedingungen religiert, um eine Deletion der Nichtstrukturproteine zwischen den Basen 422-7054 durchzuführen. Dieses Konstrukt ist als ELVIS-PySINdlBspE bekannt.
  • ELVIS-PySIN-Plasmid-DNA wird mit Lipofectamin (GIBCO-BRL, Gaithersbery, MD) gemäß der vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen (ca. 5 ug DNAIB mg Lipidreagens) komplexiert und zu 35 mm-Vertiefungen hinzugefügt, welche undifferenzierte PCC4- oder F9-Zellen von annähernd 75% Konfluenz enthalten. Die Entwicklung der zytopathischen Effekte (CPE) und der Spiegel der produktiven Sindbis-Infektion, welche durch Plaquetests des Mediumüberstandes quantifiziert werden, werden in regelmäßigen Intervallen von 5 Tagen in undifferenzierten und differenzierten PCC4- oder F9-Zellen bestimmt. Die Differenzierung von F9- und PCC4-Zellen wird durch Zugabe von Retinsäure (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) bei einer Endkonzentration von 1 umol erreicht.
  • Wenn die undifferenzierten EC-Zellen eine heterologe Antwort auf die Transfektion mit ELVIS-PySIN aufweisen, werden die verbleibenden Zellen, welche nicht durch die Sindbisvirusvermehrung, nach der G418-Selektion von pVGELVIS-transfizierten undifferenzierten EC-Zellen, lysiert werden, kloniert und expandiert. Die Zellklone werden dann auf die Produktion von Sindbisvirus nach Differenzierung durch Zugabe von Retinsäure (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) bei einer Endkonzentration von 1 uM überprüft.
  • Die Isolierung von Vektor-Verpackungszellinien, welche stabil mit dem ELVIS- PySINdlBspE transfiziert sind, mit einem Zelldifferenzierungsstadium-abhängigen Expressionsmuster der Strukturproteine in Gegenwart von Sindbis-NSP wird wie oben für das pLTR/SindlBspE-Plasmid beschrieben durchgeführt.
    • 2. Verwendung von zellulären Promotoren
  • Das dritte Beispiel dieser Strategie verwendet die β-Globin-Locus-Kontrollregion. Das β-Globin-Multigen-Kluster enthält fünf entwicklungsabhängig regulierte Gene.
  • In den frühen Stadien der menschlichen Entwicklung ist der embryonische Dottersack das hemopoetische Gewebe und exprimiert das ε-Globin-Gen. Dies wird gefolgt von einem Umschalten auf das γ-Globulin-Gen in der fötalen Leber und die δ- und β-Globulin-Gene im erwachsenen Knochenmark (Collins und Weissman, 1984, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Blot. 31-315).
  • Mindestens zwei Maus-Erythrozyten-Leukämielinien, MEL und Friend, dienen als Modelle für die von der Ausdifferenzierung abhängige Expression von β-Globin. Die Expression von β-Globin wird in diesen Linien nur nach Induktion der Ausdifferenzierung durch Zugabe von 2% DMSO zum Wachstumsmedium beobachtet.
  • Der gesamte β-Globin-Locus wird durch die Locus-Kontrollregion (LCR) reguliert. In der LCR liegt die dominante Kontrollregion (DCR) in der DNase I- hypersensitiven Region, welche sich 5' zu der kodierenden Region befindet. Die DCR enthält fünf DNase I-hypersensitive (HS1-HS5)-Sequenzen. Die DCR steuert auf hohem Niveau unabhängig von der Integration der Sequenz die Kopienzahlabhängige Expression von einem verknüpften humanen β-Globingen in transgenen Mäusen und transfiziert stabil Maus-Erythrozyten-Leukämie-(MEL)- Zellen (Grosveld et al., 1993, CSHSQB 58: 7-12). In einer neuen Studie (Ellis et al. 1993 EMBO 12: 127-134) werden Concatamere eines synthetischen Kerns, welcher mit Sequenzen in HS2 überstimmt, gezeigt, die als eine Locuskontrollregion funktionieren.
  • Um die vom Differenzierungsstadium abhängige Expression von Sindbis-Vektoren zu erreichen, wird die virale genomische cDNA neben einem Promotor angeordnet, welcher einen tandem-synthetischen Kern enthält, welcher der LCR HS2-Sequenz entspricht. Alternativ kann das gewünschte Sindbis-Vektorkonstrukt stromabwärts zu der LCR in dem endogenen β-Globingen durch homologe Rekombination insertiert werden. In einer solchen Strategie würde die β- Globintranskriptions-Insertionssequenz nach der terminalen Differenzierung zuerst bestimmt, damit der Sindbis-Vektor exakt an die Startstelle plaziert werden kann.
  • Die hierin vorgeschlagene Strategie, in welcher die Initiation eines lytischen viralen Lebenszyklus durch das Differenzierungsstadium der Wirtszelle kontrolliert wird, sollte Anwendung in anderen Systemen finden, wo die Kontrolle von virusinduzierter Zytopathologie erwünscht ist.
    • 3. Insertion der Vektorkonstrukte in Differenzierungsstadium- kontrollierte induzierbare Promotoren
  • Die Erzeugung von Klonen, deren Expression von heterologen Genen aus Sindbis-Vektoren, welche in der ELVIS-Konfiguration, wie in Beispiel 3 beschrieben, positioniert sind, Differenzierungsstadium abhängig ist, wird wie oben für die pVGELVIS-, pLTR-SindlRspE-Plasmide erreicht. Die Erzeugung der Klone, deren Vektorproduktion vom Differenzierungsstadium abhängig ist, wird durch Transfektion der isolierten Differenzierungs-abhängigen Vektor- Verpackungsklone, wie oben für die ELVIS heterologen Genexpressions-Vektoren beschrieben, durchgeführt. Klone mit dem gewünschten Phenotyp oder Vektorproduktion nach Retinsäure-induzierter Differenzierung werden, wie oben beschrieben, isoliert.
    • D. Strukturproteinexpression von einer heterologen Astrovirus- Verbindungsregion
  • Zu den kritischen Merkmalen eines Vektor-Verpackungssystems gehört eine Zellinie, welche die Strukturkomponenten exprimiert, welche wichtig sind, um einen infektiösen Partikel, ohne die Erzeugung von Wildtyp-Virus durch Rekombination zwischen Vektor und Strukturgen-Komponenten, zu erzeugen. Diese zwei gewünschten Fähigkeiten der Verpackungszellinie werden in Systemen auf Retrovirus-Basis durch die konstitutive Expression von gag/pol- und env-Genen von individuellen, heterologen RNA-Polymerase II- Expressionskassetten durchgeführt.
  • Ein anderer wichtiger Aspekt von Vektor-Verpackungszellinien ist, ein System abzuleiten, welches so nah wie möglich die normale Replikationsstrategie des Wiltyp-Virus nachahmt. Dieser Sachverhalt ist in bezug auf den beobachteten Titerspiegel des verpackten rekombinanten Vektors wichtig. Die Synthese von viralen Strukturproteinen während der Sindbisinfektion wird nach der Transkription von hohen Spiegeln der subgenomischen mRNA von dem Verbindungsregion- Promotor, gefolgt durch die effiziente Translation in die Strukturproteine, erreicht. Der Verbindungsregion-Promotor liegt funktionell nur in Antisense-Orientierung vor, und die Synthese der anti-genomischen RNA findet nach der Translation der Nicht-Strukturproteine statt, um so die Expression der Strukturproteine zu verzögern. Daraus folgt, daß unter Berücksichtigung von Sindbis es wünschenswert wäre, eine Verpackungszellinie zu konstruieren, in welcher die Synthese der Strukturproteine von dem Verbindungsregion-Promotor initiiert wird, welcher wiederum durch Nichtstrukturproteine aktiviert wird, welche von dem rekombinanten Vektormolekül exprimiert werden.
  • Es ist bekannt, daß eine relativ hohe Rekombinationshäufigkeit zwischen RNA genomischen Molekülen während der Infektion mit Sindbisvirus über einen "Copychoice"-Mechanismus auftritt (PNAS 1991 88: 3253-3257). Eine Rekombination zwischen Vektor und Verbindungsregion-/Strukturgenkassetten würde die Erzeugung von Wildtyp-Sindbisvirus, vielleicht bei einem Niveau von einem Wildtyp-Virus pro Million verpackter Vektorpartikel, erzeugen (Liljestrom Bio/Technology 1991 9: 1356-1361). Ein Weg, die Erzeugung von Wildtyp-Virus abzuschwächen, ist die Strukturgene auf getrennten Expressionskassetten aufzutrennen, ein Ansatz, welcher sehr erfolgreich mit Retrovirus- Verpackungszellinien verwendet worden ist und zuvor in Beispiel 7 diskutiert worden ist.
  • Ein zusätzlicher Ansatz, um den Spiegel von Wildtyp-Virusproduktion in Sindbis- Vektor-Verpackungszellinien zu verringern, würde sein, die Strukturproteine unter der Kontrolle von genetischen Elementen des Astrovirus zu exprimieren. Ein Schema für diese Konfiguration ist in Fig. 10 dargestellt. Ähnlich zu dem Sindbisvirus schließt die Expression der Astrovirus-Strukturproteine eine Verbindungsregion-Strategie ein, in welcher hohe Spiegel des Strukturproteins von der subgenomischen Botschaft synthetisiert werden. Die Astrovirus- Expressionskassette könnte aus einem der zwei folgenden angeordneten Elemente bestehen: (1) Induzierbarer Promotor/Astrovirus-5'-Ende/Astrovirus- Verbindungsregion/Sindbis-Strukturgene/Astrovirus-3'-Ende oder (2) Antisense- Astrovirus-3'-Ende/Antisense-Sindbis-Strukturgen/Antisense-Astrovirus- Verbindungsregion/Antisense-Astrovirus-5'-Ende/Hepatitis-Deltavirus-Ribozym oder andere Konfigurationen, wie in Beispiel 7 beschrieben. In beiden Konfigurationen wird die Expressionseinheit durch Astrovirus-Nichtstrukturproteine über den gesamten Mechanismus, welcher während der viralen Replikation stattfindet, amplifiziert. Da viele Runden der subgenomischen mRNA-Synthese, welche von der Verbindungsregion initiiert wird, von jeder Expressionseinheit stattfinden, wird die Amplifikation der Expressionseinheit mit den Astrovirus- Nichtstrukturproteinen in der Produktion von hohen Spiegeln von Sindbis- Strukturproteinen resultieren. Die zweite Konfiguration der oben beschriebenen Sindbis-Strukturproteinkassette kann besser als die erste funktionieren, da das primäre Transkript des toxischen Sindbis-Strukturgens antisense vorliegt. Obwohl die Expression der Strukturgene in der ersten Konfiguration nicht vor der Synthese des Negativstrangs, gefolgt von der Synthese der positiven, subgenomischen RNA von der Verbindungsregion, stattfinden sollte, stellt die Antisense-Natur des primären Transkripts in der zweiten Konfiguration ein zusätzliches Kontrollniveau dar, um zytotoxische Proteinexpression zu verhindern.
  • Es ist möglich, daß kein Wildtyp-Virus in einer Verpackungszellinie erzeugt wird, in welcher die Sindbisvirus-Strukturproteine individuell von den Astrovirus- Verbindungsregion-Expressionskassetten synthetisiert werden. Eine Rekombination zwischen der Nicht-Strukturprotein-Region des Vektors und einer Astrovirus-Strukturprotein-Expressionskassette würde ein Molekül ergeben, in welchem cis-Elemente des Astrovirus mit Sindbis-Virusgenen gekoppelt werden, eine nicht lebensfähige Kombination. Eine korrekte Kopplung von Sindbis cis- und trans-Elementen würde zwei exakte Rekombinations-Ereignisse zwischen Vektor und der Expressionskassette des Astrovirus, zwischen der Astrovirus- Verbindungsregion und Strukturgen-ATG und zwischen dem Strukturgen- Terminationscodon und dem Astrovirus-3'-Ende erfordern. Um Wildtyp-Virus zu erzeugen, würde dieses zweifache Rekombinationsereignis dreimal im gleichen Molekül (sechs Gesamtereignisse) stattfinden müssen, um die drei getrennten Sindbis-Strukturgene aufzunehmen.
  • Um jede mögliche Toxizität der Astrovirus-Proteine zu verringern, wird die Synthese der Astrovirus-Expressionskassetten durch induzierbare Promotoren kontrolliert. Eine Möglichkeit ist, das lac-Operon gemäß des "lac-switch"-Systems, welches zuvor in Beispiel 7 beschrieben worden ist (Stratagene), zu verwenden. Der konstitutive Expressionsspiegel der lac-Operon-kontrollierten Gene in Abwesenheit von dem nicht verlangten Induktor IPTG beträgt etwa 10 Kopien RNA pro Zelle. Der induzierbare Promotor, welcher der Astrovirus-/Sindbisvirus- Strukturgen-Expressionskassette entspricht, kann der lac-Operon oder andere geeignete Promotoren sein, welche sehr niedrige Spiegel der konstitutiven Expression aufweisen. Die Konstruktion der Verpackungszellinien dieser Konfigurationen, in welchen die Kontrolle der Sindbisproteine durch einen heterologen Virus gesteuert wird, sollte die Erzeugung von Hochtiter-Wildtyp- Virus-freien, verpackten Vektorpartikeln ergeben.
    • BEISPIEL 8 ALTERNATIVE VIRALE VEKTOR-VERPACKUNGSTECHNIKEN
  • Verschiedene alternative Systeme können verwendet werden, um rekombinante Sindbis-Viren, welche das Vektorkonstrukt tragen, herzustellen. Jedes dieser Systeme zieht einen Vorteil aus der Tatsache, daß das Baculovirus und die Säugerviren, Vaccinia bzw. Impfpocken und Adeno-Virus, welche kürzlich angepaßt worden sind, große Mengen von jedem gegebenen Protein, für welches das Gen kloniert worden ist, herstellen. (Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3: 12, 1983; Piccini et al., Meth. Enzymology 153: 545, 1987 und Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1359, 1985).
  • Diese viralen Vektoren können verwendet werden, um Proteine in Gewebekulturzellen durch Insertion von geeigneten Genen in den viralen Vektor herzustellen und können angepaßt werden, Sindbis-Vektorpartikel herzustellen.
  • Adeno-Virus-Vektoren stammen von im Kern replizierenden Viren ab und können funktionsunfähig sein. Gene können in Vektoren insertiert werden und verwendet werden, um Proteine in Säugerzellen entweder durch in vitro Konstruktion (Ballay et al. EMBO J. 4: 3861, 1985) oder durch Rekombination in Zellen (Thummel et al., J. Mol. Appl. Genetics 1: 435, 1982) herzustellen.
  • Ein bevorzugtes Verfahren ist, Plasmide unter Verwendung des Adeno-Virus- "Major late promoter "-(MLP)-Antriebes zu konstruieren: (1) Sindbis-Nicht- Strukturproteine und (2) ein modifiziertes Sindbis-Vektorkonstrukt. Ein modifizierter Sindbis-Vektor in dieser Konfiguration würde noch immer eine modifizierte Verbindungsregion enthalten, welche befähigt ist, dem transkribierten Vektor zu ermöglichen, selbst replizierend zu sein, wie es in einer natürlichen Umgebung wäre.
  • Diese Plasmide können dann verwendet werden, um Adeno-Virus-Genome in vitro herzustellen (Ballay et al., EMBO. J. 4: 3861, 1985). Diese adenoviralen Genome, welche Replikations-defekt sind, werden in 293-Zellen transfiziert (eine humane Zellinie, welche Adeno-Virus-EIA-Protein herstellt), um reine Bestände bzw. Vorräte von Sindbis-Strukturproteinen und Sindbis-Vektor, welche getrennt in den funktionsunfähigen Adenovirus-Vektoren vorkommen, zu erhalten. Da die Titer solcher Vektoren typischerweise bei 10&sup7;-10¹¹/ml liegen, können diese Bestände verwendet werden, um Gewebekulturzellen simultan bei hoher Multiplizität der Infektion zu infizieren. Diese Zellen stellen dann Sindbis-Proteine und Sindbis-Vektorgenome mit hohen Spiegeln her. Da diese Adenovirus- Vektoren defekt sind, wird keine größere Menge von direkter Zelllyse stattfinden, und die Sindbis-Vektoren können aus den Zellüberständen geerntet werden.
  • Andere virale Vektoren, wie solche von nicht verwandten Sindbis-Vektoren (z. B. RSV, MMTV oder HIV) stammenden, können auch in der gleichen Weise verwendet werden, um Vektoren aus primären Zellen zu erzeugen. In einer Ausführungsform werden diese adenoviralen Vektoren in Verbindung mit primären Zellen verwendet, was Sindbis-Vektorpräparationen hervorruft.
  • Ein alternatives Expressionssystem ist auch beschrieben worden, in welchem chimäre HIV-/Poliovirus-Genome die Erzeugung von chimären Minireplikons ergeben (J. Virol. 65: 2875, 1991), welche zur Expression von Fusionsproteinen befähigt sind. Für diese chimären Poliovirus-Minireplikons wurde später gezeigt, daß sie unter Verwendung eines rekombinanten Vaccinavirus (W-P1), welcher das ersetzte Poliovirus-Capsidvorläufer P1 Protein exprimiert, welches in dem chimären Minireplikon funktionsunfähig bzw. defekt ist, encapsidiert sind und infektiöse Partikel herstellen (J. Virol. 67: 3712, 1993). In der Untersuchung werden HIV1-gag-pol-Sequenzen durch die VP2- und VP3-Capsidgene des P1- Capsids des Poliovirus ersetzt. In ähnlicher Weise kann das Sindbis-Vektorgenom durch P1-Capsidsequenzen ersetzt werden und in diesem System als ein Mittel verwendet werden, um Polio-pseudotypisierte Sindbis-Vektoren nach Transfektion von in vitro transkribierten Sindbis-RNA-Transkripten der Zellinie bereit zu stellen. Umgekehrt können Sindbis-Strukturproteine auch durch die VP2- und VP3- Sequenzen substituiert werden, wobei anschließend ein alternatives Verpackungszelliniensystem für Vektoren auf Sindbis-Basis bereit gestellt wird.
  • In einem alternativen System werden die folgenden Komponenten verwendet:
  • 1. Sindbis-Strukturproteine, in dem Baculo-Virussystem in einer ähnlichen Weise hergestellt, wie bei Smith et al. (supra) (oder in anderen Protein- Herstellungssystemen, wie Hefe oder E. coli) beschrieben;
  • 2. Virale Vektor-RNA, in dem bekannten T7- oder SP6- oder in einem anderen in vitro-RNA-erzeugenden System hergestellt (Flamant et al., J. Virol. 62: 1827, 1988);
  • 3. tRNA, wie in (2) hergestellt oder aus Hefe oder Erzeugergewebekulturzellen gereinigt;
  • 4. Liposome (mit eingebetteten env-Protein); und
  • 5. Zellextrakte oder gereinigte notwendige Komponenten, wenn identifiziert (typischerweise aus Mauszellen), um RNA-Prozessierung bereit zu stellen und eine beliebige oder andere notwendige, zellabgeleitete Funktionen.
  • In diesem Verfahren werden (1), (2) und (3) gemischt und dann env-assoziierte Sindbisproteine, Zellextrakt, und prä-Liposomenmix (Lipid in einem geeigneten Lösungsmittel) hinzugefügt. Es kann notwendig sein, die Sindbis-env-Proteine in die Liposomen, vor Zugabe des resultierenden Liposomen-eingebetteten-env zu der Mischung aus (1), (2) und (3), einzubetten. Die Mischung wird (z. B. durch Ultraschall, Temperaturmanipulation oder Rotationsdialyse) behandelt, um die Encapsidierung der naszierenden bzw. frischen viralen Partikel mit Lipid plus eingebettetes Sindbis env-Protein, in einer Weise ähnlich zu der der Liposomenencapsidierung von Arzneimitteln, zu ermöglichen. Dieses Verfahren erlaubt hohe Titer von Replikations-inkompetenten Sindbis-Virus-Vektoren ohne den Bedarf, "intermediate"- bzw. Zwischenprodukt-Verpackungszellinien zu etablieren.
    • BEISPIEL 9 ZELLINIE ODER GEWEBESPEZIFISCHE SINDBIS-VEKTOR-"HYBRIDHÜLLEN"
  • Die Gewebe- und Zelltypspezifität von Sindbis-Virus wird primär durch die Viruskodierten Hüllproteine E1 und E2 bestimmt. Diese viralen Strukturproteine sind Transmembran-Glykoproteine, eingebettet in eine von Wirtszellen stammenden Lipidhülle, welche erhalten wird, wenn die viralen Partikel von der Oberfläche der infizierten Zelle knospen. Die Hülle umgibt ein ikosaedrisches Kerncapsid, umfassend eine genomische RNA, welche mit vielfachen, hochgeordneten Kopien eines einzelnen Capsidproteins komplexiert ist. Die E1-und die E2- Hüllglykoproteine sind als Heterodimere komplexiert, welche sich in trimären Strukturen zusammenzulagern scheinen, wobei die charakteristischen "Spikes" auf der Virusoberfläche gebildet werden. Zusätzlich wechselwirken die zytoplasmatischen Schwänze dieser Proteine mit den Kerncapsiden, wodurch die Zusammenlagerung von neuen viralen Partikeln initiiert wird (Virology 193: 424, 1993). Die individuellen, Sindbis-Glykoproteinen zugeschriebene Eigenschaften schließen Rezeptorbindung an Glykoprotein E2 (Virology 181: 694, 1991) und Glykoprotein E1-vermittelte Fusion der viralen Hülle und der endosomalen Membran ein, was in einer Lieferung des Kerncapsidpartikels in das Zytoplasma resultiert (New Aspects of Positive-Stranded RNA Virus, Seiten 166-172, 1990).
  • Die vorliegende Erfindung macht deutlich, daß durch Zerstörung bzw. Unterbrechen der Glykoprotein-Aktivität (insbesondere, aber nicht auf E2 begrenzt) und Koexpression eines intakten heterologen Glykoproteins oder durch Erzeugen von Genprodukten der Hybridhüllen (d. h. spezifisch ein Sindbis- Hüllglykoprotein mit seinen natürlichen zytoplasmatischen und membrandurchspannenden Regionen und exogenen Bindungsdomänen, welche in der Natur nicht im gleichen Proteinmolekül gefunden werden) oder durch Ersetzen der E2 und/oder E1-Glykoproteine durch andere Alpha-Viren oder ihrer Derivate, welche sich von Sindbis in ihrem Gewebetropismus unterscheiden, die Wirtsbereich-Spezifität ohne Zerstörung der zytoplasmatischen Funktionen, welche für die Virionzusammenlagerung benötigt werden, verändert werden kann. Deshalb können rekombinante Sindbis-Vektorpartikel hergestellt werden, welche spezifisch an vorselektierte Targetzellen, abhängig von dem Tropismus des eingeführten Proteinmoleküls oder Domäne, binden.
  • In der ersten Konfiguration wird die Substitution von analogen Hüllproteinen E1 und/oder E2 durch andere Alpha-Viren oder ihre Varianten verwendet, um den Gewebetropismus zu verändern. Zum Beispiel ist das Venezuelan-Equine Encephalitis-Virus (VEE) ein Alpha-Virus, welches einen Tropismus auf Zellen mit lymphoidem Ursprung, ungleich zu seinem Sindbis-Virus-Gegenpart, ausübt. Deshalb werden mit Sindbis-Vektor verpackte Zellinien, welche die VEE- Strukturproteine exprimieren, die gleichen lymphotropen Eigenschaften wie das Eltern-VEE-Virus, von welchem die Strukturprotein-Genkassette der Verpackungszellen erhalten wurde, zeigen.
  • Spezifisch wird der Trinidad-Donkey-Stamm des VEE-Virus (ATCC #VR-69) in BHK-Zellen vermehrt, und die virale RNA unter Verwendung von Verfahren, ähnlich zu denen für die Klonierung von Sindbis beschriebenen, extrahiert. Die gesamte Strukturprotein-kodierende Region wird mit einem Primerpaar, dessen 5'-Enden zu der authentischen AUG-Translationsstartsequenz passen, einschließlich der umgebenden Kozak-Konsensussequenz und UGA-Translations- Stopsequenz, amplifiziert. Der Forward-Primer ist zu VEE Nukleotiden 7553-7579 komplementär, und der Reverse-Primer ist zu den VEE Nukleotiden 11206-11196 komplementär(Sequenz aus Virology 170: 19). Die PCR-Amplifikation von VEE- cDNA, welche den Strukturprotein-Genen entspricht, wird unter Verwendung eines zweistufigen Reverse-Transkriptase-PCR-Protokolls, wie für Sindbis beschrieben, mit VEE-genomischer-RNA als Matrize und dem folgenden Oligonukleotidpaar durchgeführt: Forward-Primer (VEE 7553F): Reverse-Primer (VEE 11206R):
  • Zusätzlich zu ihren entsprechenden Komplementaritäten zu den angezeigten VEE-Nukleotiden enthält jeder Primer eine NotI-Erkennungssequenz an seinen 5'- Enden. Nach der PCR-Amplifikation wird das 3800 bp-Fragment in einem 1% Agarosegel gereinigt, dann anschließend mit dem Enzym NotI verdaut. Das resultierende Fragment wird dann getrennt in die zuvor beschriebenen pOP13 und pOPRSV1-Vektoren ligiert, welche mit NotI verdaut werden und mit alkalischer- Phosphatase aus Kälberdarm behandelt werden. Diese resultierenden Vektoren, welche die gesamte VEE-Strukturprotein-kodierende Sequenz enthalten, sind als pOP13-VEESP und pOPRSV1-VEESP bekannt. Die Verwendung dieser Klone in der Entwicklung von Verpackungszellinien folgt der für Sindbis- Verpackungszellinien beschriebenen. Zusätzliche Variationen der lac-Operon- VEE-Strukturprotein-Genexpression-Vektoren werden auch unter Verwendung der in diesem Patent für Sindbis ausgeführten Systeme und im Stand der Technik bekannten Standardtechniken konstruiert. Darüber hinaus sind Varianten von VEE und anderen Alphaviren und ihrer Varianten, welche sich im Gewebetropismus unterscheiden, nützlich, wenn man diesem Ansatz folgt.
  • In der zweiten Konfiguration wird ein heterologes Glykoprotein oder zellulärer Ligand in einer Lipiddoppelschicht einer Verpackungszellinie exprimiert, welche befähigt ist, umhüllte Sindbis-Vektorpartikel herzustellen. Diese Konfiguration ist ähnlich zu einer, welche in Beispiel 6 für die Herstellung von VSV-G- pseudotypisierten Sindbis-Vektoren beschrieben ist; außer daß in dieser Konfiguration die E2-Rezeptor-bindende Funktion durch Insertionsdeletion oder basenspezifische Sequenzmutagenese inaktiviert ist. Die Rezeptor-bindende Funktion von E2 wird inaktiviert, um den Vektorpartikel-Tropismus zu begrenzen, welcher durch das heterologe Glykoprotein oder zelluläre Liganden bereitgestellt wird. Zusätzlich zu dem Beispiel der VSV-G-Pseudotypisierung werden andere virale Glykoproteine, welche auf spezifische, zelluläre Rezeptoren gerichtet sind (wie das retrovirale HIV gp 120 Protein für CD4 Zelltargeting), verwendet, wenn sie von Standard-Vektoren, welche stabil in Sindbis-Verpackungszellinien transfiziert sind, exprimiert werden.
  • In der dritten Konfiguration werden auch chimäre Glykoproteine hergestellt, welche ein "Targeting" bzw. Ausrichten der viralen Sindbis-Vektoren auf bestimmte Zellinien in vitro oder Gewebetypen in vivo erlauben. Um ein solches chimäres Glykoprotein zu konstruieren, werden spezifische Oligoprimer, welche die Liganden-bindende Domäne des gewünschten Rezeptors plus homologe Sindbis-Sequenzen (welche eine einzigartige, spezifische Restriktionsendonuklease-Sequenz enthalten) verwendet, um eine Insert-Sequenz zu amplifizieren, welche durch den Sindbis-Strukturprotein-Expressionsvektor substituiert werden kann. Alternativ werden begrenzte Bal-31-Verdaus an einer passenden Restriktionsenzymsequenz durchgeführt, um hinter einer permissiven Insertions-Sequenz zu verdauen, gefolgt durch "glatte"-Enden-Ligierung eines Fragments, welches eine kleine Rezeptor-bindende Domäne kodiert, oder eines gesamten viralen Glykoproteins oder eines Zelloberflächenliganden. Als ein Beispiel können Peptide, welche der hauptsächlich neutralisierenden Domäne des HIV-gp120-Hüllproteins entsprechen (Virology 185: 820, 1991) verwendet werden, um den normalen E2-Tropismus zu unterbrechen und CD4-Zelltargeting bereit zu stellen.
  • Während das Beispiel von HIV-gp120 ein Hybridprotein erläutert, sind die Möglichkeiten nicht auf virale Glycoproteine beschränkt. Zum Beispiel wird der Rezeptor-bindende Teil des humanen Interleukin-2 mit dem(n) Hüllprotein(en) von Sindbis kombiniert, um Vektoren auf Zellen mit IL-2-Rezeptoren auszurichten. Darüber hinaus wird die vorhergehende Technik verwendet, um einen rekombinanten Sindbis-Vektorpartikel mit Hüllproteinen zu erzeugen, welcher Fc- Teile von Antikörpern erkennt. Monoklonale Antikörper, welche nur vorselektionierte Targetzellen erkennen, werden dann an solche Fc-Rezeptor- tragenden Sindbis-Vektor-Partikel gebunden, so daß die Vektorpartikel an diese vorselektionierten Targetzellen (z. B. Tumorzellen) binden und sie infizieren. Alternativ kann eine Hybridhülle mit der Bindungs-Domäne von Avidin verwendet werden, um Zellen zu treffen, welche mit biotinylierten Antikörpern oder anderen Liganden beschichtet worden sind. Der Patient wird zuerst mit Antikörpern überflutet und dann Zeit gegeben, die ungebundenen und nicht spezifischgebundenen Antikörper vor dem Verabreichen des Vektors zu entfernen. Die hohe Affinität (10-15) der Avidin-Bindungsstelle für Biotin erlaubt ein genaues und effizientes Ausrichten bzw. Targeting auf das Originalgewebe, welches durch das monoklonale "Bild" identifiziert wird.
    • BEISPIEL 10 BESTIMMUNG VON VEKTOR-EINHEITEN IN EINER PRÄPARATION DURCH INFEKTION VON EINER β-GALACTOSIDASE-EXPRIMIERENDEN ZELLLINIE UNTER DER KONTROLLE DER SINDBIS-VERBINDUNGSREGION BESTIMMUNG EINER VEKTOREINHEIT IN EINER PRÄPARATION DURCH INFEKTION EINER β-GALAKTOSIDASE-EXPRIMIERENDEN REPORTERZELLLNIE
  • Um eine geeignete therapeutische Dosis des Vektors an Individuen zu verabreichen, ist es wünschenswert, eine Methode zu erlangen, durch welche die Vektor-Infektionseinheiten, welche in einer Präparation enthalten sind, leicht bestimmt werden können. Dies wird durch die Erzeugung einer Zelllinie, welche β- Galaktosidase oder andere Reportergene nur exprimiert, wenn funktionelle Sindbis-Nichtstrukturproteine in der Zelle vorhanden sind, durchgeführt. Die Zelllinie kann mit steigenden Verdünnungen einer Sindbis-Vektorpräparation infiziert werden, so daß einzelne Zellen nicht mit mehr als mit einem Vektorpartikel infiziert sind, wodurch erlaubt wird, den Titer oder die Vektor-Einheiten zu bestimmen. Daher ist diese Zelllinie ein Test von funktionellen Partikeln, welche in einer Vektor-Präparation vorliegen.
    • A. Erzeugung einer Zelllinie, welche funktionelles β-Galaktosidase-Protein unter der Kontrolle der Sindbis-Nichtstrukturproteine exprimiert
  • In einer Konfiguration wird eine eukaryotische Expressionskassette konstruiert, welche eine 5'-terminale-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription von Sindbis-RNA befähigt ist, eine Sindbis-Verbindungsregion, ein Reportergen und eine 3'-terminale-Sindbis-RNA-Polymerase-Erkennungssequenz für die Minusstrangsynthese enthält. Diese Kassette wird in Antisense-Orientierung, benachbart zu einem eukaryotischen transkriptionalen Promotor, eingesetzt. Zusätzlich können diese Konstrukte auch eine katalytische Ribosym-Sequenz, unmittelbar benachbart zu dem Sindbis-Nukleotid 1 der 5'-terminalen-Sequenz, enthalten, welche die Spaltung des primären RNA-Transkripts präzise nach diesem Sindbis-Nukleotid ergeben wird. In dieser Antisense-Orientierung kann das Reportergen nicht translatiert werden und ist vor der Reporter-Genexpression völlig von der Anwesenheit von Sindbis-Nicht-Strukturproteinen für die Transkription in positivsträngige mRNA abhängig. Diese Nicht-Strukturproteine werden durch die titerbestimmte Sindbis-Vektorpräparation bereit gestellt. Zusätzlich wird diese Konfiguration, wenn sie entworfen wäre, die genauen Sindbisgenom-5'- und 3'-Endsequenzen zu enthalten, den Reporter- Gentranskripten ermöglichen einer Amplifikation durch Verwendung der gleichen Nicht-Strukturproteine, welche durch den Sindbis-Vektor bereit gestellt werden, zu unterliegen.
  • Ein Beispiel dieser Antisense-Titer-Konstruktion ist wie folgt. Plasmid pSKSINBV- lacZ wird mit dem Enzym Sacl verdaut, welches direkt nach dem Sindbis-3'-Ende und der Poly-A-Sequenz spaltet. Das überstehende 3'-Ende wird durch Zugabe des Enzyms T4 DNA-Polymerase und dNTPs, gefolgt durch eine Inkubation für 10 Minuten bei 16ºC, mit glatten Enden versehen. Das linearisierte Plasmid wird anschließend mit dem Enzym Bam HI verdaut, welches bei dem Nukleotid 7335 stromaufwärts zu der Sindbis-Verbindungsregion spaltet. Das resultierende Fragment wird in einem 1% Agarosegel gereinigt und mit pMCS-26s (in Beispiel 7 beschrieben), welches mit dem Enzym Xba I verdaut, mit glatten Enden, wie oben beschrieben, versehen, mit Bam HI verdaut, auf einem 1% Agarosegel gereinigt und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert worden ist, ligiert.
  • Das resultierende Konstrukt, bekannt als pMCS-LacZ, wird dann modifiziert, um das 5'-Ende von 299 Nukleotiden von Sindbis, fusioniert an eine 84 Nukleotid- Ribosymsequenz des antigenomischen Strangs des Hepatitisdeltavirus (HDV), unter Verwendung von überlappender PCR-Amplifikation, zu enthalten (detailliert beschrieben, in Beispiel 7). Zwei Primerpaare werden anfänglich in getrennten PCR-Reaktionen verwendet, gefolgt durch ihre überlappende Synthese in einer zweiten PCR-Runde. Reaktion #1 enthält die Primer HDV17-68 (SEQ. ID NR. __) und HDV49-XC (SEQ. ID NR. __), und Reaktion #2 enthält die Primer SIN-HDV (SEQ. ID NR. __) und SIN276-SPE (SEQ. ID NR. __) und das Plasmid pVGSP6GEN als Matrize. Die PCR-Amplifikation wird durch ein Standard- Zweitemperatur-Zyklusprotokoll erreicht. Nach der ersten Runde der PCR- Amplifikation wird ein Zwölftel der Gesamtmenge von jeder Reaktion #1 und Reaktion #2 kombiniert und als Matzrize in einer zweiten Runde der PCR- Amplifikation mit den Primern HDV49-XC und SIN276-SPE und einem Standard- Zweitemperatur-Zyklusprotokoll verwendet. Auf die zweite Runde der PCR folgend, wird das 414 bp-Amplikon mit dem Mermaid Kit (Bio101, La Jolla, CA) gereinigt und mit den Enzymen ClaI und SpeI verdaut. Das verdaute Amplikon wird auf einem 1% Agarosegel gereinigt und anschließend in das Plasmid pMCS- LacZ ligiert, welches auch mit ClaI und SpeI verdaut und in einem 1% Agarosegel gereinigt worden ist. Das resultierende Konstrukt, welches die Expressionskassettenelemente HDV antigenomisches Ribozyme/Sindbis-5'- terminale-299-Nukleotide/Verbindungsregion/LacZ-Gen/3'-terminaleuntranslatierte Region enthält, ist als pd5'LacZ bekannt.
  • Die LacZ-Expressionskassette des Plasmids pd5'LacZ wird anschließend in pcDNA3 insertiert (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Das Plasmid pd5'LacZ wird mit dem Enzym Not I verdaut, mit glatten Enden, wie oben beschrieben, versehen und dann mit dem Enzym Xba I verdaut. Das Fragment wird in einem 1% Agarosegel gereinigt und mit pcDNA3, welche mit dem Enzym Hind III verdaut, mit galtten Enden versehen, dann mit XbaI verdaut worden ist, ligiert. Das resultierende Konstrukt, welches einen CMV-Promotor enthält, welcher eine RNA der Antisense-Reporterkassette der Konfiguration Sindbis 3'-terminale- Sequenz/LacZ-Gen/Verbindungsregion/Sindbis 5'-terminale-Sequenz/HDV- Ribosym transkribiert, ist als pSINjraβ-gal bekannt.
  • Die BHKSINjraβ-gal-Zellen werden durch Transfektion von 5 · 10&sup5; BHK-21-Zellen, welche in einer 60 mm Petrischale wachsen, mit 5 ug des pSINjraβ-gal-Vektors, welcher mit dem Polykation-Reagens Transfectam (Promega, Madison WI) komplexiert ist, erlangt. 24 h nach der Transfektion wird das Medium mit 400 ug/ml G418 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) ergänzt. Nachdem alle nicht transfizierten Zellen tot sind und die G418-resistenten Kolonien begonnen haben, sich zu teilen, werden die Zellen von der Platte durch Trypsinierung entfernt, vereinigt und dann durch begrenzte Verdünnung kloniert. Mehrere Klone werden auf die Herstellung von funktioneller β-Galactosidase durch Infektion mit einem bekannten Titer von Wildtyp-Vorrat des Sindbisvirus überprüft. Die Herstellung von funktionaler β-Galactosidase in Anwärter-BHKSINjraβ-gal-Klonen wird 6 h nach Infektion durch Erstfixieren der PBS-gespülten Zellen mit einer Lösung, welche 2% Formaldehyd (37% Stammlösung)/0,2% Glutaraldehyd enthält, dann Färben der Zellen mit einer Lösung, welche 0,5 mmol Kaliumhexacyanoferrat(III)/0,5 mmol Kaliumhexacyanoferrat(II)/2 mmol MgCl&sub2;/1 mg/ml X- gal enthält, bestimmt. Blaue Zellen sind innerhalb von 3 Stunden klar sichtbar. Vorausgesetzt, daß der Sindbis-Virusvorrat keine hohen Spiegel von defekten interferierenden (DI)-Partikeln enthält, sollte der Virustiter, wie durch Plaquetest an BHK-21-Zellen bestimmt, ähnlich zu dem Titer sein, welcher bei X-gal-Färbung von BHKSINjraβ-gal-Zellen beobachtet wird.
  • Der Titer von verschiedenen Sindbis-Vektorpräparationen, in Vektoreinheiten, hergestellt durch solche Verpackungszelllinien, wie in Beispiel 7 beschrieben, wird durch Infektion von konfluenten Monolayern von BHKSINjraβ-gal-Zellen mit verschiedenen Verdünnungen des Vektors bestimmt. Der Titer der Vektorpräparation wird 6 h nach der Infektion durch Sichtbarmachen der Zellen, welche β-Galactosidaseprotein herstellen, wie oben beschrieben, bestimmt. Da die beschriebenen Sindbis-Vektoren nicht die virale Region enthalten, welche den Strukturgenen entspricht, ist es nicht möglich, den Titer einer Vektorpräparation durch Plaque-Test in BHK-21-Zellen zu bestimmen.
  • Alternativ wird eine Zellinie für die Titerbestimmung unter Verwendung einer unterschiedlichen Reporter-Kassettenkonfiguration hergestellt, welche aus einem eukaryotischen Promotor/ durch die virale Transkriptase erkannte 5'-terminale- Sindbissequenz/Sindbis-Verbindungsregion/Reportergen/Sindbis-RNA- Polymerase-Erkennungssequenz für Minusstrang-Synthese besteht, und in Sense-Orientierung exprimiert. Diese Reporter-Expressionskassette benötigt die Synthese, durch vom Vektor gelieferte Sindbis-Nicht-Strukturproteine, in ein Antisense-RNA-Molekül vor der Transkription der subgenomischen Reportergenkodierenden Botschaft.
  • Insbesondere wird das Verpackungskonstrukt in Sense-Orientierung wie folgt erzeugt. Plasmid pVGELVIS wird mit dem Enzym Apal verdaut, welches an dem Nukleotid 11737 genau stromabwärts zu dem Sindbis-3'-Ende spaltet. Die Apal- verdaute DNA wird durch die Zugabe von T4-DNA-Polymerase und dNTPs und Inkubation bei 16ºC für 10 Minuten mit glatten Enden versehen. Nach der Hitzeinaktivierung der Polymerase wird das DNA-Fragment mit dem Enzym Sfi I verdaut, und das 10041 bp Fragment in einem 1% Agarosegel gereinigt. Das Plasmid pSKSINBV-lacZ wird mit dem Enzym Sac I verdaut und, wie oben beschrieben, mit glatten Enden versehen. Das Fragment wird dann mit Sfi I verdaut, und das 7 kbp-Fragment wird in einem 1% Agarosegel gereinigt. Das 7kb-pSKSINBV-lacZ-Fragment wird dann in das gereinigte pVGELVIS-Fragment ligiert, um das Plasmid pELVIS-bgal zu erzeugen. Dieses Plasmid enthält die vollständigen Sindbis-Nicht-Strukturproteine, Sindbis-Verbindungsregion, LacZ- Gene und Sindbis-3'-terminale-Replikase-Erkennungssequenz unter der Kontrolle des MuLV-LTR-Promotors. Das Plasmid pELVIS-bgal wird mit BspE I verdaut, mit Geneclean gereinigt (Bio 101 Corp., San Diego, CA) und mit sich selbst religiert. BspE I entfernt die Sindbis-Nicht-Strukturprotein-Gensequenzen zwischen Nukleotiden 422-7054. Das religierte Konstrukt enthält eine 5'-Sequenz, welche zur Initiation der Transkription der Sindbis-RNA befähigt ist, die Sindbis- Verbindungsregion, Sequenzen, welche das lacZ-Gen kodieren, und Sindbis-3'- terminale-Sequenzen, welche für die Synthese von Minusstrang-RNA benötigt werden, alle stromabwärts und unter der Transkriptionskontrolle von einem MuLV- LTR-Promotor. Dieses Konstrukt ist als pELVISdlNSP-bgal bekannt.
  • Das Plasmid pELVISdlNSP-bgal wird in BHK-Zellen transfiziert und, wie zuvor beschrieben, überprüft. Die BHK-pELVISdlNSP-bgal-Zellen stellen ein RNA- Transkript mit einer 5'-terminalen-Sequenz her, welche durch die Sindbis- Transkriptase erkannt wird, eine Sindbis-Verbindungsregion, Sequenzen, welche das lacZ-Gen kodieren, und Sindbis-3'-terminale-Sequenzen, welche für die Synthese von Minusstrang-RNA benötigt werden. Die β-Galactosidase-Expression von dem primären Transkript wird wegen des stromaufwärts liegenden offenen Leserahmens und den durch die BspEI-Deletion erzeugten Stop-Codons verhindert. Die Zugabe von Sindbis-Nicht-Strukturproteinen, bereit gestellt durch den titerbestimmten Sindbis-Vektor, ergibt die Transkription von aktiven lacZ- Transkripten von der Sindbis-Verbindungsregion nach der anfänglichen Synthese eines Antisense-Intermediates. Darüber hinaus ermöglicht diese Konfiguration, wenn sie entworfen wäre, die genauen Sindbis-Genom-5'- und 3'-terminalen- Sequenzen zu enthalten, den Reportergen-Transkripten eine Amplifikation unter Verwendung der gleichen Nicht-Strukturproteine, welche durch den Sindbis-Vektor bereit gestellt werden, zu erfahren.
  • In einer anderen Konfiguration wird eine Zellinie zur Titerbestimmung unter der Verwendung einer Expressionskassette hergestellt, welche ein Antisense- Reportergen, gefolgt von dem 3'-Ende der Sindbis-Replikase- Erkennungssequenzen, positioniert in Sense-Orientierung, enthält. Dieses Konstrukt unter der Kontrolle eines eukaryotischen Promotors stellt ein RNA- Transkript her, das durch Sindbis-Nicht-Strukturproteine erkannt und transkribiert wird, welche durch den Vektor, dessen Titer zu bestimmen ist, bereit gestellt werden. Die Sindbis-Nicht-Strukturproteine erkennen Sequenzen in dem primären Reportertranskript und synthetisieren wiederum ein Sense-Reportertranskript. Dieses Konstrukt zieht keinen Vorteil aus der Amplifikation des Reporter- Gentranskripts, aber sollte noch immer genügend Transkripte bereit stellen, um die Vektor-Titerbestimmung zu ermöglichen.
  • Die Konstruktion dieses Typs der Titerbestimmungskassette ist wie folgt. PSV-B- Galactosidase-Vektor (Promega Corp., Madison, WI) wird mit dem Enzym Hind III verdaut und, wie oben beschrieben, mit glatten Enden versehen. Das Plasmid wird weiter mit den Enzymen BamHI und Xmn I verdaut, um das LacZ-Gen zu entfernen und die Größe des verbleibenden Fragments zu reduzieren. Das 3737 Nukleotid-Fragment, welches das LacZ-Gen enthält, wird in einem 1% Agarosegel gereinigt und in pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert, welches mit den Enzymen Bam HI und EvoRV verdaut worden ist. Das neue Plasmidkonstrukt ist als pcDNAaLacZ bekannt. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym Apa I verdaut, wie oben mit glatten Enden versehen, und weiter mit dem Enzym Xho I verdaut. Das Plasmid pSKSINBV (zuvor beschrieben) wird mit Sac I verdaut, wie oben mit glatten Enden versehen, und dann mit Xho I verdaut. Das resultierende 146 Nukleotid-Fragment, welches die Sindbis 3'-Replikase-Erkennungssequenz enthält, wird auf einem 1, 2% Agarosegel gereinigt und in den verdauten pcDNAaLacZ-Vektor ligiert. Das religierte Konstrukt enthält ein Antisense-lacZ- Gen und eine 3'-Sindbis-Replikase-Protein-Erkennungssequenz stromabwärts von einem CMV-Promotor. Das resultierende Konstrukt ist als pcDNAaLacZ-3'-SIN bekannt. Das Konstrukt wird in BHK-Zellen transfiziert und, wie zuvor beschrieben, verwendet.
    • BEISPIEL 14 VERABREICHUNG VON REKOMBINANTEN SINDBISPARTIKELN
  • Ein therapeutischer Sindbis-Vektor, welcher für die Behandlung der Gaucher- Krankheit (Beispiel 13) verwendet wird, kann durch transduzierte, autologe CD34&spplus;-Zellen in einem ex vivo-Protokoll oder durch direkte Injektion des Vektors in das Patientenknochenmark verabreicht werden. Um die längste therapeutische Expression des GC von dem rekombinanten multivalenten Vektor zu erreichen, ist die beste Art der Verabreichung langlebige Zellvorläufer des klinisch behafteten Zelltyps, z. B. Monozyten oder Macrophagen, zu transduzieren. Durch das Transduzieren der frühesten Vorläufer des behafteten Zelltyps sind die Zellvorläufer befähigt, sich selbst zu erneuern und das periphere Blut mit reifen GC-positiven Zellen wieder zu bevölkern. Die frühesten pluripotenten, hämatopoetischen Stammzellen, welche bis heute untersucht worden sind, sind die CD34&spplus;-Zellen, welche 1%-4% einer gesunden Knochenmarkspopulation oder 0,1% der peripheren Blutpopulation ausmachen. Die Fähigkeit CD34&spplus;-Zellen zu transduzieren, ist für das Aufrechterhalten der Langzeit-Expression, nicht nur für die Monozyten/Macrophagen-Familie, sondern für jede hämatopoetische Zelle, wichtig, welche für ein therapeutisches Protein ausgerichtet sind. Zwei Ansätze zur Transduktion von CD34&spplus;-Zellen schließen ein ex vivo- und ein in vivo-Protokoll ein. Das in vivo-Protokoll zielt auf die Transduktion einer willkürlichen bzw. unterschiedslosen Population von Knochenmarkzellen durch direkte Injektion des Vektors in das Knochenmark der Patienten ab. Das ex vivo-Protokoll zielt auf die Isolierung von CD34&spplus;-positiven Stammzellen aus dem Patientenknochenmark oder aus dem Nabelschnurblut eines Säuglingspatienten, Transduktion der Zellen mit dem Vektor, dann anschließendes Injizieren der autologen Zellen zurück in den Patienten ab. Beide Ansätze sind möglich, aber das ex vivo-Protokoll ermöglicht, den Vektor effizienter durch die Transduktion einer spezifischen gezüchteten CD34&spplus;-Zellenpopulation zu verwenden. Details des ex vivo- Verfahrens werden in dem folgenden Abschnitt bereit gestellt.
    • EX VIVO VERABREICHUNG EINES MULTIVALENTEN GC-SINDBIS-VEKTORS
  • CD34&spplus;-Zellen werden von dem Patientenknochenmark durch eine Spritzenabsaugung, ausgeführt von einem Arzt, welcher mit der Technik vertraut ist, gesammelt. Alternativ können die CD34&spplus;-Zellen auch aus dem Blut von Säuglingsnabelschnur erhalten werden, wenn bei dem Patienten vor der Geburt eine Diagnose gestellt wird. Allgemein, wenn das Knochenmark die Quelle der CD34&spplus;-Zellen ist, werden 20 Knochenmarksabsaugungen durch Punktion des Oberschenkels oder des hinteren Beckenkamms, unter Lokal- oder allgemeiner Anästhesie erhalten. Die Knochenmarksabsaugungen werden dann vereinigt, in Hepes-gepufferter Hanks ausgeglichener Salzlösung, welche Heparin mit 100 Einheiten pro ml und Desoxyribonuclease 1 mit 100 ug/ml enthält, suspendiert und dann einer Ficoll-Gradiententrennung unterworfen. Die über den Dichtegradienten präparierten Knochenmarkszellen werden dann gesammelt und gemäß dem Cellpro's CEPRATETM LC (Cellpro, Bothell, WA) (CD34) Trennungssystem gewaschen. Die gewaschenen, über den Dichtegradienten separierten Zellen werden dann anschließend sequenziell mit anti-CD34-monoklonalem Antikörper gefärbt, gewaschen, und dann mit biotinyliertem sekundärem Antikörper, der mit dem CEPRATETM-System geliefert wird, gefärbt. Die Zellmischung wird auf die CEPRATETM-Avidinsäule geladen. Die Biotin-markierten Zellen werden dann auf der Säule adsorbiert, während die unmarkierten Zellen durchfließen. Die Säule wird dann gemäß den Anweisungen des CEPRATETM-Systems gespült, und die CD34*-Zellen durch Bewegung der Säule durch manuelles Pressen des Gelbetts eluiert. Sobald die CD34&spplus;-Zellen gereinigt sind, werden die gereinigten Stammzellen gezählt und in einer Konzentration von 1 · 10&sup5; Zellen/ml in Iscove's modifziertem Dulbecco's Medium (JMDM, Irvine Scientific, Santa Ana, CA), welches 20% vereinigtes, nicht-hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum (hAB- Serum) enthält, ausplatiert.
  • Nach der Reinigung können verschiedene Verfahren zur Transduktion der gereinigten Stammzellen ausgeführt werden. Ein Ansatz beinhaltet die direkte Transduktion der gereinigten Stammzellpopulation mit Vektor-enthaltenden Kulturüberständen, welche von Vektor-herstellenden Zellen stammen. Ein zweiter Ansatz beinhaltet die Kokultivierung einer bestrahlten Monolayer von Vektorproduzierenden Zellen mit der gereinigten Population von nicht-adhärenten CD34&spplus;-Zellen. Ein dritter und bevorzugter Ansatz beinhaltet einen ähnlichen Kokultivierungsansatz, die gereinigten CD34&spplus;-Zellen werden jedoch mit verschiedenen Zytokinen vorstimuliert und 48 Stunden vor der Kokultivierung mit den bestrahlten Vektor-herstellenden Zellen kultiviert. Neuere Veröffentlichungen haben gezeigt, daß die Vorstimulation der Stammzellen vor dem Transduzieren der Zellen mit retroviralen Vektoren das Gentransferniveau in diesen Zelltypen steigert (Nolta et al., Exp. Hematol. 20: 1065, 1992). Das gesteigerte Niveau der Transduktion wird der gesteigerten Proliferation der Stammzellen zugeschrieben, welche für eine effiziente retrovirale Transduktion notwendig ist. Da die Sindbis- Vektoren befähigt sind, nicht-replizierende Zellen zu infizieren, kann die Vorstimulation dieser Zellen nicht erforderlich sein, die Vorstimulation dieser Kulturen, welche Proliferation verursachen, wird jedoch vergrößerte Zelipopulationen zur Reinfusion in den Patienten bereit stellen.
  • Die Vorstimulation von CD34&spplus;-Zellen wird durch Inkubation der Zellen mit einer Kombination von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, welche IL-1, IL-3, IL-6 und den Mastzellenwachstumsfaktor (MGF) einschließen, durchgeführt. Die Vorstimulation wird durch Züchten von 1-2 · 10&sup5; CD34&spplus;-Zellen/ml Medium in T25- Gewebekulturflaschen, welche Knochenmarkstimulations-Medium für 48 Stunden enthalten, durchgeführt. Das Knochenmarkstikulations-Medium besteht aus IMDM, welches 30% nicht-hitzeaktiviertes hAB-Serum, 2 mmol L-Glutamin, 0,1 mmol β 2-Mercaptoethanol, 1 umol Hydrokortison und 1% deionisiertes Rinderserumalbumin enthält. Alle in den Knochenmarkskulturen verwendete Reagenzien sollten auf ihre Fähigkeit überprüft werden, maximale Anzahlen der Granulozyten, Erythrozyten, Makrophagen, Megakaryozyten, Kolonie-bildenden Einheiten aus dem normalen Knochenmark zu unterstützen. Gereinigte rekombinante humane Zytokine und Wachstumsfaktoren (Immunex Corp., Seattle, WA) für die Vorstimulation sollten in den folgenden Konzentrationen verwendet werden: von E. coli-stammendes IL-Iα (100 U/ml), von Hefestammendes IL-3 (5 ng/ml), IL-6 (50 U/ml) und MGF (50 ng/ml) (Anderson et al., Cell Growth Differ. 2: 373, 1991).
  • Nach der Vorstimulation der CD34&spplus;-Zellen werden sie dann durch Kokultivierung mit der bestrahlten Sindbis-Herstellerzellinie (welche den GC-therapeutischen Vektor exprimiert) in fortlaufender Anwesenheit von Stimulationsmedium infiziert. Die DA-Vektor-herstellende Zellinie wird erst trypsiniert, bestrahlt (10.000 Rad) und 1-2 · 10&sup5; Zellen/ml in Knochenmarkstimulationsmedium ausplatiert. Am folgenden Tag werden 1-2 · 10&sup5; vorstimulierte CD34&spplus;-Zellen/ml zu der Monolayer der Sindbis-Vektor-Herstellerzellinie zugegeben. Die Kokultivierung der Zellen wird über 48 Stunden ausgeführt. Nach der Kokultivierung werden die CD34&spplus;-Zellen von der adhärenten Monolayer der Sindbis-Vektor-herstellenden Zellen durch kräftiges Waschen mit Medium gesammelt und für 2 Stunden ausplatiert, um das Anhaften von allen entfernten Vektor-herstellenden Zellen zu erlauben. Die Zellen werden dann gesammelt und für weitere 72 Stunden vermehrt. Die Zellen werden gesammelt und in flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Gefrierschutzmittels in Aliquots von 1 · 10&sup5; Zellen pro Gefäß eingefroren. Wenn die transformierten CD34&spplus;-Zellen auf die Abwesenheit von fremden Agenzien überprüft worden sind, können die transformierten CD34&spplus;-Zellen aufgetaut werden, in einer Konzentration von 1 · 10&sup5;-Zellen/ml ausplatiert werden und für weitere 48 Stunden in Knochenmarkstimulationsmedium kultiviert werden. Die transformierten Zellen werden dann gesammelt, zweimal gewaschen und in normaler Kochsalzlösung resuspendiert. Die Zahl der transduzierten Zellen, welche verwendet werden, um durch Infusion zurück in den Patienten verabreicht zu werden, wird bei einem Minimum von 1-10 · 10&sup7;-Zellen pro Patient pro Injektionsstelle geplant, wobei vier Injektionsstellen benötigt werden. Die Infusion kann direkt zurück in das Patientenknochenmark oder direkt in den peripheren Blutstrom durchgeführt werden. Patienten, welche autologe transduzierte Knochenmarkszellen erhalten, können entweder teilweise oder am ganzen Körper bestrahlt werden, um die existierenden Knochenmarkspopulationen zu entfernen. Die Behandlung kann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infusion überprüft werden, um die GC-Aktivität und die Dauer der Expression in den differenzierten Zelltypen zu bestimmen. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt während dem Verlauf der nachfolgenden Verfahren die Expression absinkt oder nicht existiert, können transduzierte autologe Zellen in den Patienten reinjiziert werden.
    • BEISPIEL 15 GEWEBESPEZIFISCHE EXPRESSION DURCH AKTIVIERUNG VON FUNKTIONSUNFÄHIGEN SINDBIS-VEKTOREN UNTER VERWENDUNG VON GEWEBESPEZIFISCHER ZELLULÄRER RNA KONSTRUKTION VON SINDBIS-TUMORSPEZIFISCHEN EXPRESSIONS- VEKTOREN FÜR DIE BEHANDLUNG DES KOLOREKTALEN KARZINOMS A. KONSTRUKTION EINES REKOMBINANTEN SINDBIS-VEKTORS (SIN- CEA) ABHÄNGIG VON DER EXPRESSION DES CEA-TUMORMARKERS
  • Um einen funktionsunfähigen Sindbis-Vektorpartikel in einer Sindbis- Verpackungszellinie herzustellen, muß der Sindbis-Vektor durch einen DNA- Polymerase-Promotor angetrieben werden. Die Möglichkeit, in vitro-Transkription der Vektor-RNA zu verwenden, gefolgt von Transfixieren der RNA in die Sindbis- Verpackungszellinie, wird nicht empfohlen, da die tertiäre Struktur, welche durch das funktionsunfähige RNA-Transkript erzeugt wird, vollständige genomische Transkripte verhindern, die Vektorreplikation und den Titer in der Verpackungszellinie begrenzen kann. Aus diesem Grund wird ein Start-Sindbis- Vektor, welcher den CMV-MIEP-Promotor (pCMV-SIN) oder den Drosophila- Metallothionin-Promotor (pMET-CMV) enthält, abhängig von der Verpackungszellinie (d. h. Insekten oder Säuger) verwendet.
  • Wie zuvor beschrieben, wird das funktionsunfähige Verbindungs-Loop-out-Modell mit der Verbindungsregion des Vektors, flankiert durch invertierte Wiederholungssequenzen, welche homolog zu der ausgewählten RNA sind, konstruiert. In diesem Beispiel werden Sequenzen der CEA-Tumorantigen-cDNA (Beauchemin et al., Molec. and Cell. Biol. 7: 3221, 1987) in invertierten Wiederholungen verwendet. Um einen CEA-RNA-empfänglichen Sindbis-Vektor zu konstruieren, gehen der Verbindungsregion zwei CEA-Antisense- Sequenzdomänen (A¹ und B¹), welche durch eine Sechs-Basenpaar- Gelenkdomäne getrennt sind, voraus. Eine einzelne Zwanzig-Basenpaar-CEA- Sensesequenz (A2), welche komplementär zu A1 ist, wird an das 3'-Ende der Verbindungsregion gesetzt. Beim Auswählen der korrekten A1- und B1-Antisense- Sequenzen gibt es nur zwei Anforderungen, daß sie spezifisch für die Target- RNA-Sequenz sind, und daß die Antisense-Sequenzen mit den zwei RNA- Sequenzdomänen, welche durch drei Nukleotide getrennt sind, hybridisieren. Diese Drei-Nukleotidlücke dient als eine Gelenkdomäne für die Polymerase, um zu springen und die Lesestränge, welche die Nichtstrukturproteindomäne des Vektors überbrücken, auf die Verbindungsregion des Vektors überzuleiten(Fig. 5). Um eine solche Konfiguration zu konstruieren, werden zwei Oligonukleotide synthetisiert, welche komplementär zueinander sind, um ein Fragmentinsert zu erzeugen, welches geeignete Restriktionsenzym-Sequenzen an den äußeren 5'- und 3'-Enden enthält. Das Oligonukleotid-Fragmentinsert wird dann in den Sindbis-Vektor zwischen der funktionsunfähigen Verbindungsregion und der Mehrfachklonierungssequenz des Sindbis-Vektors ligiert. Der Sense- Oligonukleotidstrang von 5' zu 3' sollte eine Apa I-Restriktionsstelle, gefolgt von einer A1-Antisense-Domäne, einer sechs bp Gelenkdomäne, einer B1-Antisense- Domäne, einer synthetischen Verbindungsregiondomäne und der A1-Sense- Domäne, gefolgt von einer Xho I-Restriktionsenzymsequenz, enthalten. Die folgende Oligonukleotidsequenz wird verwendet, um einen CEA-RNA- empfänglichen Sindbis-Vektor zu entwerfen. Die Nukleotidzahlsequenz ist aus Beauchemin et al., Molec. and Cell Biol. 7: 3221, 1987 erhalten. 5'-3'-CEA-Sense-Strang:
  • Der 5'-3'-CEA-Antisense-Strang ist zu dem oberen Nukleotid komplementär. Nachdem beide Oligonukleotide synthetisiert sind, werden die Oligonukleotide zusammen in Anwesenheit von 10 mM Mg gemischt, auf 100ºC für 5 Minuten erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Oligonukleotidpaar wird dann mit Apa I- und Xho I-Restriktionsenzymen verdaut, in einem 25 : 1 molaren Verhältnis von Insert zu Plasmid gemischt und ligiert, wobei pCMV-SIN oder pMET-SIN mit den gleichen Enzymen vorverdaut sind. Diese Konstrukte werden als pCMV/SIN-CEA bzw. pMET/SIN-CEA bezeichnet.
    • Konstruktion eines SIN-CEA-Vektors und Herstellerlinie, welche gamma-Interferon exprimiert (SIN-CEA/gIFN)
  • Die humane g-IFN-cDNA stammt von RNA, welche aus PHA-stimulierten Jurkat- T-Zellen durch Guanidin-Thiocyanat-Extraktion, gefolgt von Ultrazentrifugation über einen CsCl-Gradienten, isoliert wird. Die RNA (Sigma, St. Louis, MO) wird dann in vitro reverse-transkribiert, und ein genspezifisches Oligonukleotidpaar wird verwendet, um die g-IFN-cDNA durch Polymerasekettenreaktion, unter Verwendung von Taq-Polymerase, zu amplifizieren. Die PCR-DNA wird mit T4- DNA-Polymerase und Klenow repariert und in die Hinc II-Schnittstelle des SK&spplus;- Plasmids (Stratagene, San Diego, CA), welches mit ClAP behandelt ist, kloniert. In der Sense-Orientierung ist das 5'-Ende der cDNA zu der Xho I-Sequenz des SK&spplus;-Polylinkers benachbart, und das 3'-Ende ist zu der Cla I-Sequenz benachbart. Das 512-Basenpaarfragment, welches das humane gamma- Interferonmolekül kodiert, wird in die Xho I-/ Cla I-Sequenz von entweder dem pCMV/SIN-CEA- oder dem pMET/SIN-CEA-Vektor plaziert. Diese neuen Plasmide werden als pCMV/SIN-CEA/γIFN bzw. pMET/SIN-CEAIγIFN bezeichnet.
    • B. KONSTRUKTION EINES SIN-CEA-VEKTORS UND HERSTELLER- ZELLINIE, WELCHE THYMIDINKINASE EXPRIMIERT (SIN-CEA/TK)
  • Ein PCR-amplifiziertes Produkt, welches den cDNA-Klon der Herpes Simplex Thymidinkinase ("HSVTK"), flankiert von 5'-XHO I- und 3'-Cla I- Restriktionsenzymschnittstellen, enthält, wird unter Verwendung des pHS1TK3KB (Mcknight et al., Nuc. Acids Res. 8: 5949, 1980)-Klon als Target-DNA erhalten. Die Sequenzen für die Primer, welche für die PCR-Amplifikation benutzt werden, werden aus veröffentlichten Sequenzen erhalten (Wagner et al., PNAS 78: 1442, 1981). Das 1.260 Basenpaar-amplifizierte Produkt wird dann mit Xho I und Cla I in die Xho I-/Cla I-Schnittstelle von entweder dem pCMV/SIN-CEA oder dem pMET/SIN-CEA-Vektor ligiert. Diese neuen Plasmide werden als pCMV/SIN- CEA/HSVTK bzw. pMET/SIN-CEA/HSVTK bezeichnet.
    • C. ERZEUGUNG VON CEA-RNA-ABHÄNGIGEN SINDBIS-VEKTORHERSTELLERZELLINIEN
  • Im Unterschied zu den früheren Beispielen zur Erzeugung von Herstellerzellinien (Beispiel 7) kann es sein, daß nur eine einzige Runde des Gentransfers in die Verpackungszellinie durch Vektortransfektion möglich ist. Da diese Vektoren funktionsinaktiviert sind und in der Synthese von vollständigen genomischen Vektoren behindert sind, endet die Reinfektion einer frischen Schicht von Sindbis- Verpackungszellinien in einer abortierten Infektion, da diese Vektoren jetzt von der Anwesenheit von CEA-RNA abhängig sind, um aktiv zu werden. Hohe Titer können durch Verdünnungsklonierung der transfizierten Herstellerzellinien unter Verwendung der zuvor in Beispiel 11 beschriebenen RT-PCR-Technik erreicht werden.
    • BEISPIEL 17 A. ERZEUGEN EINES GLUKOZEREBROSIDASE-SINDBIS-VEKTORS
  • Ein Glukozerebrosidase (GC)-cDNA-Klon, welcher eine Xho I-Restriktionsenzymschnittstelle 5' zu der cDNA-kodierenden Sequenz und eine Cla I- Restriktionsenzymschnittstelle 3' zu der cDNA-kodierenden Sequenz enthält, wird zuerst erzeugt. Der Klon kann durch Verdau von pMFG-GC (PNAS 89: 11332; 1992) mit Nco I, Erzeugung glatter Enden mit Vent-DNA-Polymerase, dann Ligierung mit Xho I-Linkern erzeugt werden. Das Plasmid wird dann mit Bam HI verdaut, glatte Enden mit Vent-DNA-Polymerase erzeugt, dann an Cla I-Linker ligiert. Für die Insertion des Faktors VIII in die verschiedenen, in Beispiel 2 beschrieben Sindbis-Vektoren, wird das Fragment dann mit Xho I und Cla I verdaut und auf einem 1% Agarose/TBE-Gel Gel-isoliert und durch Gene Clean gereinigt. Das GC-Fragment wird in jeden der nachstehenden Vektoren, hergestellt durch Verdau mit Xho I und Cla I, Behandlung mit ClAP, Isolierung durch 1% Agarose/TBE-Gel-Elektrophorese und Reinigung mit Gene Clean, insertiert:
    • Vektor Funktionelle Verbindungsregion
  • pKSSINBV +
  • pKSSINdlFRsjrc +
  • pKSSINdlFRsjrPC +
  • pKSSINdlFRsjrNP(7582-7601) +
  • pKSSINdlFRsexjr +
  • Nach der Insertion der Faktor VIIIcDNA sind diese Vektoren, wie unten gezeigt, bekannt:
  • pKSSINBV-GC
  • pKSSINdlFRsjrc-GC
  • pKSSINdlFRsjrPC-GC
  • pKSSINdlFRsjrNP(7582-7601)-GC
  • pKSSINdlFRsexjr-GC
  • Der Glukozerebrosidase(GC)-Sindbis-Vektor wird verwendet, um die GC-cDNA in Tierversuchen zu exprimieren, und wird eventuell verwendet, um Menschen durch direkte Injektion zu behandeln. Wenn mehrfache Injektionen benötigt werden, um die GC-Expression in dem behandelten Individuum aufrechtzuerhalten, wäre es ideal, wenn der Sindbis-Vektor entworfen wäre, minimal antigen zu sein oder in solcher Weise entworfen wäre, keine Immunantwort gegenüber dem Vektor zu induzieren. Beispiele für Sindbis-Vektoren, welche in einer solchen Weise entworfen sind und befähigt sind, verschiedene Proteine zu exprimieren, sind in den Beispiel 3 (Adenovirus Early region E3); Beispiel 4 (HCMVH301); Beispiel 5 (Expression von verschiedenen Genen) und Beispiel 17 (Ribozymexpression von Interferon A) beschrieben. Unter Verwendung der obigen Beispiele kann ein Sindbis-Vektor entworfen werden, die GC-cDNA in einer solchen Konfiguration zu exprimieren, wobei dem Interferon A-Haarnadel-Ribozym das AD E3 oder CMV H301-Gen folgt, gefolgt von einer internen Ribozym-Eintrittssequenz, gefolgt von der GC-cDNA oder anderen therapeutischen Palliativa bzw. Linderungsmittel, unter Verwendung der gleichen Xho I- bis Cla I-Klonierungssequenzen in der Mehrfachklonierungssequenz des Vektors.
    • B. KONSTRUKTION EINER SINDBIS-GLUKOZEREBROSIDASE-VEKTOR HERSTELLENDEN ZELLINIE
  • Zwei Ansätze werden vorgestellt, um die Herstellerzellinie, abhängig von dem Typ des verwendeten Sindbis-cDNA-Vektorklons, beschrieben in Beispiel 7, zu erzeugen. Ein Typ des Sindbis-Vektors verwendet die SP6-RNA-Polymerase- Erkennungssequenz für die Synthese der in vitro-RNA-Transkripte. Dieser Vektortyp wird verwendet, um eine Vektor-Herstellerzellinie zu erzeugen, basierend auf einem nicht-integrierenden Vektor, welcher in der Verpackungszellinie persistent replizieren würde. Der zweite Typ des Vektors verwendet einen heterologen Promotor anstelle der Sp6-Sequenz in einem Plasmidkonstrukt, welches die stabile Integration in die Verpackungszellinie erlauben würde (s. Beispiel 7 zur Übersicht). Replikationskompetente Sindbis- Vektor-Transkripte werden dann auf dem DNA-Niveau exprimiert und würden in die Sindbis-Verpackungszellinie transfiziert werden.
  • Wenn der Sindbis-GC virale Vektor eine T7-RNA-Erkennungssequenz verwendet, muß die cDNA erst in vitro, unter Verwendung eines im Handel erhältlichen in vitro-Transkriptionssystems (Megascript transcription kit; Ambion Inc., Austin, Texas), transkribiert werden, gefolgt durch Transfektion mit dem Gesamtlängen- RNA-Transkript durch Liposomen oder Calciumphosphat-Präzipitation in die Sindbis-Verpackungszellinie. Wie zuvor beschrieben (Beispiel 7) werden die filtrierten Überstände, welche infektiöse Vektorpartikel von der transfizierten Verpackungszellinie enthalten, dann verwendet, um eine frische Monolayer von Sindbis-Verpackungszellen zu reinfizieren, welche dann als Quelle für den viralen Vektor dienen. Ungefähr 10 ml infektiöser Überstand sollten verwendet werden, um 5 · 10&sup6; Zellen in einer 10 cm Schale zu infizieren.
  • Wenn der Sindbis-GC virale Vektor einen heterologen Promotor in einer Expressionsplasmid-Konfiguration mit einem selektierbaren Marker (Neomycin- Resistenzgen) verwendet, dann muß der cDNA-Vektor in die Verpackungszellinie transfiziert werden, gefolgt von Arzneimittelresistenz-Selektion. Resistente Kolonien werden dann vereinigt und verdünnungskloniert. Einzelne Klone werden dann vermehrt und eingefroren. Die einzelnen Klone werden dann auf hohe Titer, wie in Beispiel 9 beschrieben, für die Expression von Glukozerebrosidase durch Westernblot-Test überprüft und dann auf funktionelle Aktivität des Proteins getestet (Correll et al.; Blood 80: 331, 1992).
  • Für solche Vektoren, welche nicht einen selektierbaren Marker aufweisen, muß die Selektion der stabilen oder persistent transfizierten Klone durch Verdünnungsklonierung der Verpackungszellinien ein bis zwei Tage nach der Transfektion der Zellen mit dem Sindbis-Vektor durchgeführt werden. Die verdünnten Klone werden dann auf die Anwesenheit von Glukozerebrosidase, unter Verwendung der reversen Transkription der messenger-RNA, gefolgt durch Amplifikation der cDNA-Message durch die Polymerase-Ketten-Reaktions-Technik überprüft. Dieses Verfahren ist als RT-PCR-Technik bekannt und ein im Handel erhältlicher Kit ist verfügbar, um diesen Test durchzuführen (Invitrogen Corp., San Diego, CA). RT-CPR wird mit Klonen durchgeführt, welche für mindestens 10 Tage vermehrt worden sind. Ungefähr 50 bis 100 Klone werden überprüft, um eine vernünftige Zahl von stabilen, persistent-infizierten Klonen zu finden. Um die RT-PCR durchzuführen, werden spezifische Primer für die gewünschte Botschaft benötigt, welche durch die Amplifikation des RNA-Produkts zu screenen ist. Primer, die entworfen wurden, um ein 521-Basenpaarprodukt für den Glukozerebrosidase-Test zu amplifizieren, sind: GC PCR (F) Primer#1: GC PCR (R) Primer#2:
  • Solche Klone, welche die höchste Expression und Titer zeigen, werden dann auf die Übertragung der Expression durch Infektion von BHK-2-Zellen, gefolgt durch Western Blot-Analyse und einem funktionellen Test der Glukozerebrosidase (GC)- Aktivität in den BHK-2-Zellen überprüft. Ein spezifischer monoklonaler Antikörper (8E4) gegen humanes GC wird für Western Blots verwendet (PNAS 89: 11332, 1992) und ist in Barneveld, R.A. et al. beschrieben (Eur. J. Biochem. 134: 310, 1983). Wenn der geeignete Klon identifiziert worden ist, werden Überstände aus den Wachstumskulturen verwendet zum Erhalt von Vektoren, filtriert durch einen 0,45 uC Filter, verwendet, um mit Tierversuchen durch direkte Injektion in die Tiere zu beginnen. Nachdem die Tierversuche durchgeführt worden sind, können maßstabvergrößerte direkte Injektionsprotokolle, welche aus den Tierversuchen stammen, für die Behandlung von Menschen mit der Gaucher-Erkrankung verwendet werden. Alternative Verabreichungsprotokolle für diesen Vektor werden in dem folgenden Beispiel angegeben.
    • BEISPIEL 20 LACTOSEFORMULIERUNG EINES REKOMBINANTEN ALPHAVIRUS- VEKTORS
  • Roher rekombinanter Alphavirus-Vektor wird aus dem Celligan Bioreaktor (New Brunswick, NJ) erhalten, welcher Verpackungszellen enthält, welche mit dem rekombinanten Alphavirus transfiziert oder transduziert sind, und an die Kügelchen der Bioreaktormatrix gebunden sind. Diese Zellen setzen den rekombinanten Alphavirus-Vektor in das Wachstumsmedium, das über die Zellen in einem kontinuierlichen Flußprozeß fließt, frei. Das Medium, welches den Bioreaktor verläßt, wird gesammelt und zuerst durch einen 0,8 micron Filter, dann durch einen 0,65 micron Filter durchgeleitet, um den rohen, rekombinanten Alphavirus-Vektor zu reinigen. Das Filtrat wird unter Verwendung eines Kreuzfluß- Konzentrierungssystems (Filtron, Boston, MA) konzentriert. Etwa 50 Einheiten DNase (Intergen, New York, NY) pro ml Konzentrat werden hinzugefügt, um die exogene DNA zu verdauen. Der Verdau wird unter Verwendung des gleichen Kreuzflußsystems auf 150 mM NaCl, 25 mM Tromethamin, pH-Wert 7,4 diafiltriert. Das Diafiltrat wird auf eine Sephadex S-500-Gelsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) geladen, welche mit 50 mM NaCl, 25 mM Tromethamin, pH-Wert 7,4 equilibriert ist. Der gereinigte rekombinante Alphavirus-Vektor wird von der Sephadex S-500-Gelsäule mit 50 mM NaCl, 25 mM Tromethamin, pH-Wert 7,4 eluiert.
  • Der Formulierungspuffer, welcher Lactose enthält, wird als eine 2X-konzentrierte Stammlösung hergestellt. Der Formulierungspuffer enthält 25 mM Tromethamin, 70 mM NaCl, 2 mg/ml Arginin, 10 mg/ml humanes Serumalbumin (HSA) und 10 mg/ml Lactose in einem Endvolumen von 100 ml bei einem pH von 7,4.
  • Der gereinigte rekombinante Alphavirus-Vektor wird durch Zugabe eines Teils 2X- Laktoseformulierungspuffers zu einem Teil S-500 gereinigten rekombinanten Alphavirus-Vektor formuliert. Der formulierte rekombinante Alphavirus-Vektor kann bei -70ºC bis -80ºC gelagert oder getrocknet werden.
  • Der formulierte Alphavirus-Vektor wird in einer Edwards Gefrierkammer (3 Shelf RC3S Unit), verbunden mit einem Supermodulyo 12K Gefriertrockner (Edwards High Vacuum, Tonawanda, NY) gefriergetrocknet. Wenn der Gefriertrocknungszyklus vollständig ist, werden die Gefäße unter einem Vakuum, gefolgt von einem schwachen Stickstoffgasfluß, verschlossen. Nach dem Entfernen werden die Gefäße mit Aluminiumsiegeln umfalzt. Das lyophilisierte rekombinante Retrovirus wird mit 1,0 ml Wasser rekonstituiert.
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) Allgemeine Information:
  • (i) Anmelder:
  • Name: Viagene, Inc.
  • Straße: 11055 Roselle Street
  • Stadt: San Diego, Kalifornien
  • Land: US
  • Postleitzahl: 92121
  • Telefon: (619) 452-1288
  • (ii) Titel der Erfindung: Rekombinante Alphavirus-Vektoren
  • (iii) Zahl der Sequenzen: 89
  • (iv) Korrespondenzadresse:
  • (A) Adressat: Seed und Berry
  • (B) Straße: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
  • (C) Stadt: Seattle
  • (D) Staat: Washington
  • (E) Land: US
  • (F) Postleitzahl: 98104-7092
  • (v) Computerlesbare Form:
  • (A) Mediumtyp: Floppy Disk
  • (B) Computer: IBM PC-kompatibel
  • (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) Software: Patentln Release # 1.0, Version #1.25
  • (vi) Gegenwärtige Anmeldungsdaten:
  • (A) Anmeldernummer:
  • (B) Anmeldetag:
  • (C) Klassifizierung:
  • (viii) Anwalt/Vertreterinformation:
  • (A) Name: McMasters, David D.
  • (B) Registrierungsnummer: 33.963
  • (C) Registrierungs-/Verzeichnisnummer: 930049.423PC
  • (ix) Telekommunikationsinformation:
  • (A) Telefon: (206) 622-4900
  • (B) Telefax: (206) 682-6031
  • (C) Telex: 3723836 Seedanberry
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 25:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 30 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 25:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 26:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 32 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 26:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 27:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 23 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 27:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 28:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 13 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 28:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 29:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 20 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 29:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 30:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 12 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 30:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 31:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 25 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 31:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 32:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 32:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 33:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 56 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 33:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 34:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 52 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 34:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 35:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 57 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 35:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 36:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 36 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 37:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 40 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 38:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 47 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 39:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 34 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 39:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 40:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 61 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 41:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 40 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 42:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 43 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 43:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 34 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 44:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 24 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 45:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 31 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 46:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 23 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 47:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 34 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 48:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 22 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 48:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 49:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 40 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 50:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 34 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 50:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 51:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 35 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 52:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 29 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 53:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 29 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 54:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 26 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 55:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 35 Basenpaare
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 56:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 26 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 57:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 19 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 58:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 29 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 58:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 59:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 17 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 60:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 29 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 61:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 17 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
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  • (2) Information für SEQ ID Nr 62:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 19 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 63:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 34 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
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  • (2) Information für SEQ ID Nr. 64:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 17 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 64: 17
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 65:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 52 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 65:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 66:
  • (i) Sequenzeigenschaften.
  • (A) Länge: 56 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 66:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 67:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 57 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 67:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 68:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 36 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 68:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 69:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 69:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 70:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 70:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 71:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 44 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 71:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 72:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 45 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 72:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 73:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 45 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 73:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 74:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 74:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 75:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 75:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 76:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 76:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 77:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 77:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 78:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 18 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 78:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 79:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 68 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 79:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 80:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 70 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 80:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 81:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 81:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 82:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 33 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 82:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 83:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 18 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 83:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 84:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 68 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 84:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 85:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 70 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 85:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 86:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 16 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 86:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 87:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 66 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 87:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 88:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 64 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 88:
  • (2) Information für SEQ ID Nr. 89:
  • (i) Sequenzeigenschaften
  • (A) Länge: 16656 Basenpaare
  • (B) Typ: Nukleinsäure
  • (C) Strangform: einzeln
  • (D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 89:

Claims (22)

1. Alphavirus-cDNA-Vektorkonstrukt, umfassend einen 5'-Promotor, welcher befähigt ist, von cDNA die virale RNA-Synthese in vitro zu initiieren, eine 5'- Sequenz, welche befähigt ist, die Transkription der Alphavirus-RNA zu initiieren, eine Nukleotidsequenz, kodierend Alphavirus-nichtstrukturelle Proteine, eine aktive virale Verbindungsregion oder eine Modifikation davon, welche eine funktionale Promotorsequenz zurückbehält bzw. enthält, eine heterologe Nukleotidsequenz und eine Erkennungssequenz der Alphavirus-RNA- Polymerase, worin die heterologe Nukleotidsequenz ein Palliativum kodiert, welches ein Genprodukt ist, welches eine Verbindung mit geringer oder keiner Zytotoxizität in ein toxisches Produkt oder Lymphokin überführt.
2. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach Anspruch 1, wobei die heterologe Nukleotidsequenz eine Herpes simplex Virus-Thymidinkinase (HSVTK) oder Cytosindesaminase aus Pilzen oder Bakterien kodiert.
3. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach Anspruch 1, wobei die heterologe Nukleotidsequenz ein Lymphokin, ausgewählt aus IL-2, IL-12 und γ-IFN, kodiert.
4. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches eine inaktivierte virale Verbindungsregion besitzt und eine zweite virale Verbindungsregion, welche derart modifiziert worden ist, daß diese befähigt ist, nur eine verminderte Transkription des subgenomischen Fragments zu erlauben.
5. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach Anspruch 4, wobei die inaktivierte virale Verbindungsregion eine Alphavirus-Verbindungsregion, inaktiviert durch Kürzung, ist, so daß die virale Transkription des subgenomischen Fragmentes verhindert wird, aber die kodierende Sequenz für das biologisch aktive Nicht- Strukturprotein 4 (NSP4) beibehalten wird.
6. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach Anspruch 4 oder 5, weiter umfassend eine retrovirale Verpackungssequenz zwischen der inaktivierten viralen Verbindungsregion und der zweiten viralen Verbindungsregion.
7. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der 5' Promotor, welcher befähigt ist, von c-DNA die virale RNA-Synthese in vitro zu initiieren, ein T7-, T3- oder SP6-Promotor ist.
8. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter umfassend einen Poly-A-Schwanz.
9. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welches weiter eine Sequenz umfaßt, welche das Ribosomen-Hindurchlesen oder den internen Ribosomeneintritt fördert.
10. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Alphavirus ein Venezuelian-Equine-Enzephalitis-Virus ist.
11. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Alphavirus ein Ross-River-Virus ist.
12. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Alphavirus ein Semliki-Forest-Virus ist.
13. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Alphavirus ein Sindbisvirus ist.
14. Alphavirus-Vektorkonstrukt nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welcher keine kodierende Sequenz eines Alphavirus-Strukturproteins enthält.
15. RNA-Vektorkonstrukt, erhältlich durch Transkription eines Alphavirus- Vektorkonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
16. RNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 15 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein RNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 15 in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
18. Ex vivo-Wirtszelle, enthaltend ein RNA-Vektorkonstrukt nach Anspruch 15.
19. Wirtszelle nach Anspruch 18, welche eine Verpackungszelle ist, weiter umfassend eine Alphavirus-Strukturprotein-Expressionskassette.
20. Rekombinante Alphavirus-Partikel, erhältlich aus einer Wirtszelle nach Anspruch 19.
21. Ex vivo-Wirtszellen, infiziert mit rekombinanten Alphavirus-Partikeln nach Anspruch 20.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend rekombinante Alphavirus- Partikel nach Anspruch 20 in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
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