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JPH09503657A - 組換えアルファウイルスベクター - Google Patents

組換えアルファウイルスベクター

Info

Publication number
JPH09503657A
JPH09503657A JP7509370A JP50937095A JPH09503657A JP H09503657 A JPH09503657 A JP H09503657A JP 7509370 A JP7509370 A JP 7509370A JP 50937095 A JP50937095 A JP 50937095A JP H09503657 A JPH09503657 A JP H09503657A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
alphavirus
vector
sequence
virus
sindbis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP7509370A
Other languages
English (en)
Inventor
ダブリュ．，ジュニア． ダベンスキー，トーマス
イー． イバネス，カルロス
エム．ダブリュ． チャン，スティーブン
ジェイ． ジョリー，ダグラス
エー． ドライバー，デビッド
エム． ポロ，ジョン
Original Assignee
チロン ビアジーン インコーポレイティド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26820897&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH09503657(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by チロン ビアジーン インコーポレイティド filed Critical チロン ビアジーン インコーポレイティド
Publication of JPH09503657A publication Critical patent/JPH09503657A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、組換えαウイルスベクターを用いるための組成物及び方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えアルファウイルスベクター技術分野 本発明は、一般的にはベクターとしての組換えウイルスの使用、さらに詳しく は、標的細胞中で異種配列（heterologous sequence）を発現することができる シンドビスウイルス（Sindbis virus）のような組換えアルファウイルス（alpha virus）に関する。発明の背景 アルファウイルスはトガウイルス科の一群の血清学的に関連した節足動物に運 搬されるウイルスよりなる。簡単に説明すると、アルファウイルスは全世界に分 布しており、自然界では蚊から脊椎動物へのサイクルを介して存在する。鳥、齧 歯類、馬、霊長類およびヒトは、アルファウイルス脊椎動物病原体保有者／宿主 として指定されているものの仲間である。 血球凝集阻害（HI）測定法を用いて、アルファウイルス属内で、26の公知のウ イルスおよびウイルスサブタイプが分類されている。簡単に説明すると、HI試験 は26のアルファウイルスを３つの大きな群(complex)に分離する〔ベネズエラ脳 炎(Venezuelan encepahlitis）（VE）群、セムリキ森林（Semliki Forest）(SF) 群、そしてウェスタン脳炎（western encephalitis）(WE)群〕。さらにHI血清学 的測定法に基づき、さらに４つのウイルス〔イースタン脳炎（EE）、バーマー森 林(Barmah Forest)、ミドルバーグ（Middleburg）、およびヌヅム(Ndumu)〕が、 それぞれ分類されている。 アルファウイルス属のメンダーはまた、ヒトでの相対的な臨床的 特徴に基づき分類される〔主に脳炎に関連するアルファウイルス、そして主に発 熱、発疹そして多発性関節炎に関連するアルファウイルス〕。前者の群に含まれ るのは、VE，WEおよびEE群である。一般的にこの群による感染は永続的な後遺症 （例えば行動変化や学習無能力、または死）に至る。後者の群はSF群であり、各 アルファウイルスであるチクングニア(Chikungunya)、オニョン・ニョン(O'nyon g-nyong)、シンドビス(Sindbis)、ロス・リバー（Ross River）、およびヤマロ （Mayaro）よりなる。この群に関しては重大な流行病が報告されているが、感染 は一般に自己制限式であり、永続的な後遺症はない。 シンドビスウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属の原型である。 シンドビスウイルスの臨床症状は通常は明確ではないが、発熱、関節炎そして発 疹がある。シンドビスウイルスは、ヨーロッパ、アフリカ、アジアそしてオース トラリアに分布しており、ほとんどの流行病データは南アフリカから得られ、こ こでは人口の20％は血清反応陽性である。（総説については、Peters and Dalry ple，Fields Virolgy(第２版)、Fieldsら編、B．N．Raven Press、ニューヨーク 、ニューヨーク州、第26章、pp．713-762を参照）。感染症シンドビスウイルス は、ウガンダでの大発生中と、中央アフリカの１つの症例からのみ、ヒトの血清 から単離されている。 アルファウイルス属の形態と形態発生は一般に非常に均一的である。特にエン ベロープのある60−65nm粒子は、ほとんどの脊椎動物細胞に感染し、増殖性感染 は細胞変性作用がある。一方非脊椎動物細胞（例えば、蚊の細胞）の感染では、 顕著な細胞変性が現れない。典型的にはアルファウイルスはBHK-21細胞またはベ ロ（Vero）細胞で増殖し、増殖は急速であり、感染後24時間以内に最大収率に達 する。フィールド株は、通常発達第一段階の鳥類の胎児（例えばヒ ヨコ）繊維芽細胞の培養物から単離される。 アルファウイルスのゲノムRNA（49S RNA）は断片に分かれてはおらず、明確な 極性を有し、長さは約11−12kbであり、５’キャップと３’ポリアデニル化テー ルを有する。感染性のエンベロープで覆われたウイルスは、細胞質中でウイルス のゲノムRNA上にウイルスのヌクレオカプシッド蛋白が組み込まれ、ウイルスに コードされた糖蛋白が埋め込まれた細胞膜から発芽することにより産生される。 細胞内へのウイルスの侵入は、カテリン（catherin）で被覆されたくぼみへのエ ンドサイトーシス、ウイルス膜とエンドソームとの融合、ヌクレオカプシッドの 放出そしてウイルスゲノムの脱外皮により起きる。ウイルスの複製の間、ゲノム 性49S RANは、相補的な負の鎖の合成の鋳型として作用する。この負の鎖は次に 、ゲノムRNAの鋳型、そして内部的にイニシエート（initiate）された26Sサブゲ ノムRNAの鋳型として作用する。この非構造蛋白はゲノムRNAから翻訳される。ア ルファウイルス構造蛋白は、サブゲノム26S RNAから翻訳される。すべてのウイ ルス遺伝子は、ポリ蛋白として発現され、翻訳後の蛋白分解により各蛋白に処理 される。 ヒトを治療するために組換えアルファウイルスベクターを使用するには、組換 えウイルスの感染性と生存性（viability）が保持されるように、目的の温度で 長期間運搬され保存することができなければならない。組換えウイルスの現在の 保存方法は、一般に液体として低温で保存する。この方法は、通常充分な冷蔵能 力を有さない第３世界では問題である。例えば、アフリカでは毎年何万人もの子 供が麻疹のような感染性疾患により死んでいる。冷房手段が容易に利用できない これらの国の大部分では、これらの疾患の防止に必要なワクチンを分配すること ができない。 液体としてそして低温で保存されることに加えて、現在のウイル ス調製物はしばしば、患者への注射には好ましくない培地成分を含有する。従っ て当該分野には、精製された組換えウイルスベクター（特にアルファウイルスベ クター）を凍結乾燥の形で高温で保存する方法、かつこれが患者への注射に適し た形であることに対するニーズがある。 本発明は、種々の用途（例えば、遺伝子療法）での使用に適し、かつ他の関連 する利点を与える組換えアルファウイルスベクターを開示する。発明の要約 簡単に説明すると、本発明はアルファウイルスベクター作成体およびアルファ ウイルス粒子、そしてこの作成方法と使用方法を提供する。本発明のは１つの面 において、インビトロでcDNAからウイルスRNAの合成を開始することができる５ ’プロモーター、アルファウイルスの転写を開始することができる５’配列、ア ルファウイルスの非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、サブゲノム断片の ウイルス転写を防止するように不活性化されたウイルス結合領域、そしてアルフ ァウイルスRNAポリメラーゼ認識配列よりなる、アルファウイルスベクター作成 体が提供される。本発明の別の面において、サブゲノム断片のウイルス転写が低 下するように修飾されたウイルス結合領域が提供される。 本発明のさらに別の面において、インビトロでcDNAからウイルスRNAの合成を 開始することができる５’プロモーター、アルファウイルスの転写を開始するこ とができるcDNA５’配列からインビトロでウイルスRNAの合成を開始することが できる５’プロモーター、アルファウイルスの非構造蛋白をコードするヌクレオ チド配列、サブゲノム断片のウイルス転写を防止するように不活性化された第１ のウイルス結合領域、サブゲノム断片のウイルス転写が低下するように修飾され た第２のウイルス結合領域、そしてアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列 よりなる、アルファウイルスcDNAベクター作成体が提供される。 本発明の別の面において、インビトロでcDNAからウイルスRNAの合成を開始す ることができる５’プロモーター、cDNAからウイルスRNAの合成を開始すること ができる５’プロモーター、その後に続くアルファウイルスの転写を開始するこ とができる５’配列、アルファウイルスの非構造蛋白をコードするヌクレオチド 配列、サブゲノム断片のウイルス転写が低下するように修飾されたウイルス結合 領域、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、そして転写の停止を制御す る３’配列よりなる、アルファウイルスcDNAベクター作成体が提供される。 本発明の別の面において、cDNAからウイルスRNAの合成を開始することができ る５’プロモーター、その後に続くアルファウイルスの転写を開始することがで きる５’配列、アルファウイルスの非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、 サブゲノム断片のウイルス転写が低下するように不活性化されたウイルス結合領 域、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、そして転写の停止を制御する ３’配列よりなる、アルファウイルスcDNAベクター作成体が提供される。 本発明のさらに別の面において、cDNAからウイルスRNAの合成を開始すること ができる５’プロモーター、その後に続くアルファウイルスの転写を開始するこ とができる５’配列、アルファウイルスの非構造蛋白をコードするヌクレオチド 配列、サブゲノム断片のウイルス転写を防止するように不活性化された第１のウ イルス結合領域、その後に続くサブゲノム断片のウイルス転写が低下するように 修飾された第２のウイルス結合領域、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配 列よりなる、そして転写の停止を制御する３’配列よりなる、アルファウイルス cDNAベクター作成体が提供される。 １つの実施態様において、上記のベクター作成体は異種配列を含有する。典型 的にはそのようなベクター作成体は、100塩基より大きい異種ヌクレオチド配列 を含有し、一般的には異種ヌクレオチド配列は３kbより大きく、好ましくは異種 ヌクレオチド配列は５kbより大きく、さらに好ましくは異種ヌクレオチド配列は ８kbより大きい。種々の実施態様において、異種配列はIL−１，IL−２，IL−３ ，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−８，IL−９，IL−10，IL−11，IL−12 ，IL−13，IL−14，IL−15，α，βおよびγ−IFN，Ｇ−CSF、およびGM−CSFよ りなる群から選択される蛋白をコードする配列である。 さらに別の実施態様において上記ベクター作成体は、インフルエンザウイルス 、HPV，HBV，HCV，EBV，HIV，HSV，FeLV，FIV、ハンタウイルス（Hanta virus） 、HTLVＩ，HTLV IIそしてCMVよりなる群から選択されるウイルスからの、選択さ れた異種配列を含む。本発明の１つの好適な実施態様において、HPVから得られ る異種配列は、E5，E6，E7およびL1よりなる群から選択される蛋白をコードする 。 さらに別の実施態様において上記のベクター作成体は、HIV gp120およびgagよ りなる群から選択されるHIV蛋白をコードする、選択された異種配列を含む。 上記の選択された配列は、アンチセンス配列であってよい。好適な実施態様に おいて、アンチセンス配列はインフルエンザウイルス、HPV，HBV，HCV，EBV，HI V，HSV，FeLV，FIV、ハンタウイルス(Hanta virus)、HTLVＩ，HTLV IIおよびCMV よりなる群から選択され る。 別の実施態様において、上記のベクター作成体はアルファウイルス構造蛋白を 含有しない。別の実施態様において、選択された異種配列はウイルス結合領域の 下流に位置する。第２のウイルス結合を有する上記のベクター作成体において、 選択された異種配列はいくつかの実施態様において、第２のウイルス結合領域の 下流に位置してもよい。異種配列がウイルス結合領域の下流に位置する場合、ベ クター作成体はさらにウイルス結合領域に続いて位置するポリリンカーを含有し てもよい。好適な実施態様において、このようなポリリンカーは野生型アルファ ウイルスのウイルス制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有しない。 さらに別の実施態様において、上記のベクター作成体中で、選択された異種配 列はアルファウイルス非構造蛋白をコードするヌクレアーゼ配列内に位置しても よい。 具体的な実施態様において上記ベクター作成体は、ヌクレオチド番号7579から ヌクレオチド番号7597までの図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）よりな るウイルス結合領域を含む。ベクター作成体が第２のウイルス結合を含む別の実 施態様においてベクター作成体は、第２のウイルス結合領域の下流に位置するE3 アデノウイルス遺伝子を含有し、またさらに第１のウイルス結合領域と第２のウ イルス結合領域の間に位置するレトロウイルスパッケージング配列よりなる。 さらなる面において、本発明は、機能性ウイルス結合領域を含まず、好適な実 施態様ではサブゲノム断片のウイルス転写の低下を示す単離された組換えアルフ ァウイルスベクターを提供する。 さらに別の面において本発明は、プロモーターと１つまたはそれ以上のアルフ ァウイルス構造蛋白（プロモーターは、アルファウイ ルス構造蛋白の発現を指令することきができる）よりなる発現カセットを提供す る。 種々の実施態様において発現カセットは、アルファウイルスカプシッド蛋白（ 例えば、6K，E3，E2およびE1よりなる群から選択されるシンドビス構造蛋白）を 発現することきができる。 さらに別の面において本発明は、プロモーター、１つまたはそれ以上のアルフ ァウイルス構造蛋白、および異種リガンド配列（プロモーターはアルファウイル ス構造蛋白と異種配列の発現を指令することができる）よりなる発現カセットを 提供する。種々の実施態様において、異種リガンド配列は、VSVG，HIV gp120、 抗体、インスリン、およびCD4よりなる群から選択される。 ある実施態様において、上記の発現カセットは、MuLV，MMTV、アルファウイル ス結合領域、CMVおよびVA1RNAよりなる群から選択されるプロモーターを含む。 さらに別の面において本発明は、標的細胞に導入されると、感染後少なくとも 72時間は生存している感染細胞を産生するアルファウイルス粒子を提供する。ま た本発明のアルファウイルス粒子による感染後少なくとも72時間は生存している 標的細胞が提供される。 別の面において、本発明は、標的細胞に導入後、感染後少なくとも72時間は生 存している感染細胞を産生する組換えアルファウイルス粒子を提供する（ここで この粒子はまた、アルファウイルス粒子が感染した標的細胞中の少なくとも１つ の抗原またはその修飾された型を有し、その抗原または修飾された型は動物内で 免疫応答を刺激することができる）。種々の実施態様において、発現された抗原 またはその修飾された型は、細胞性免疫応答、好ましくはHLAクラスＩに制限さ れた免疫応答を誘発する。 さらに別の面において本発明は、アルファウイルス粒子で感染し た細胞内で緩和剤（palliative）の発現を指令することができるベクター作成体 を有する組換えアルファウイルス粒子を提供する（ここで緩和剤は、病原性に必 要な病原体の機能を阻害することができる）。種々の実施態様において、病原体 はウイルス、カビ、原生動物、または細菌であり、阻害される機能は吸収、複製 、遺伝子発現、集合、感染細胞からの病原体の排出よりなる群から選択される。 他の実施態様において、病原体はガン細胞、癌促進成長因子、自己免疫疾患、心 血管系疾患（例えば再狭窄）、骨粗鬆症および男性型禿頭であり、阻害される機 能は、細胞の生存性や細胞複製よりなる群から選択される。さらなる実施態様に おいてベクター作成体は、感染した標的細胞中の病原体に関連した物質の存在に 応答して、そのような細胞中の毒性緩和剤の発現を指令する。緩和剤は、好まし くは病原性遺伝子の発現を選択的に阻害、または病原体により産生される蛋白の 活性を阻害することができる。さらに別の実施態様において緩和剤は、ウイルス プロテアーゼに特異的な阻害性ペプチド、病原性に必要なRNA配列に相補的なア ンチセンスRNA、病原性に必要なRNA配列に相補的なセンスRNA、または病原体の 欠陥のある構造蛋白（このような蛋白は病原体の集合を阻害することができる） よりなる。 さらに別の実施態様において、緩和剤の発現を指令する上記のアルファウイル ス粒子は、さらに詳しくは病原体の不活性な前駆体を活性な阻害剤に活性化する ことができる遺伝子生成物（例えば、ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子生成物、 癌抑制遺伝子、またはほとんどまたは全く細胞毒性のない化合物を病原体の存在 下で毒性生成物に活性化する、従って病原体に対して局所的治療法を与える蛋白 ）の発現を指令する。あるいはアルファウイルス粒子は、病原体由来の蛋白によ る処理または修飾に対して毒性である蛋白、アルファ ウイルスに感染した蛋白の表面のレポーティング生成物、または病原性RNA分子 に特異的なアンチセンスまたはリボザイムとして機能するRNA分子の発現を指令 する。 いくつかの実施態様において、上記のアルファウイルスにおいて蛋白はヘルペ スチミジンキナーゼまたはCD4である。 さらに別の面において本発明は、アルファウイルスが感染した標的細胞中の免 疫系の１つの以上の成分を抑制することができる遺伝子の発現を指令するアルフ ァウイルス粒子、そしてシンドビスウイルスが感染した細胞中の阻止成分の発現 を指令するアルファウイルス粒子（ここで阻止成分は、リセプターまたは病原体 に結合してリセプター／病原体相互作用を阻止する）を提供する。 さらなる面において本発明は、アルファウイルスが感染した標的細胞中の少な くとも１つの抗原またはその修飾型の発現を指令するアルファウイルス粒子で、 感受性のある標的細胞を感染させることよりなる、抗原に対する免疫応答を刺激 する方法を提供し、該抗原またはその修飾型は動物の免疫応答を刺激することが できる。好適な実施態様において、標的細胞はインビボで感染される。 本発明のさらなる面において、アルファウイルスが感染した標的細胞中の病原 性抗原の修飾型を発現を指令するアルファウイルス粒子で、感受性のある標的細 胞を感染させることよりなる、病原性抗原に対する免疫応答を刺激する方法が提 供され、該修飾抗原は動物の免疫応答を刺激することができるが、病原性抗原に 比較して病原性は低下している。 本発明のさらなる面において、複数のエピトープ（１つまたはそれ以上のエピ トープは異なる蛋白に由来する）を有するペプチドの発現を指令するアルファウ イルス粒子で、感受性のある標的細胞を感染させることよりなる、抗原に対する 免疫応答を刺激する方法が 提供される。 本発明のさらなる面において、ヒトのクラスＩまたはクラスIIMHC蛋白または これらの組合せをコードする核酸配列で、温血動物に関連した感受性のある標的 細胞を感染させ、アルファウイルス粒子で感染した標的細胞中の少なくとも１つ の抗原またはその修飾型の発現を指令するアルファウイルス粒子で、該細胞を感 染させることよりなる、温血動物の免疫応答を刺激する方法が提供され、該抗原 またはその修飾型は動物の免疫応答を刺激することができる。 本発明の別の面において、アルファウイルス粒子で感染した細胞中の緩和剤の 発現を指令するアルファウイルス粒子で感受性のある標的細胞を感染させること よりなる、病原体を阻害する方法が提供され、該緩和剤は病原性に必要な病原体 の機能を阻止することができる。 本発明の他の面において、真核細胞重層ベクターイニシエーション系（eukary otic layered vector initiation systems）が提供される。簡単に説明すると、 本発明の１つの実施態様において、真核細胞重層ベクターイニシエーション系は 、５’プロモーター、自立的にまたは１つまたはそれ以上の要因に応答して細胞 中で複製することができる異種ヌクレオチド配列を発現することができる作成体 、および転写停止配列よりなる。別の面において、５’プロモーター、自律的に または１つまたはそれ以上の要因に応答して複製することができる異種RNA配列 を発現することができる作成体、および転写停止配列よりなる、RNA真核細胞重 層ベクターイニシエーション系が提供される。好適な実施態様において、１つま たはそれ以上の異種ヌクレオチド配列を発現することができる作成体は、シンド ビスcDNAベクターである。他の実施態様において、作成体はポリオウイルス、ラ イノウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、 インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、ヘルペスウ イルス、SV40ウイルス、HIV、麻疹ウイルス、アストロウイルス（Astrovirus） 、セムリキ森林ウイルスおよびコロナウイルスよりなる群から選択されるウイル スベクターである。さらなる実施態様において、真核細胞重層ベクターイニシエ ーション系はさらなポリアデニル化配列よりなる。 さらに別の面において本発明は、標的細胞中で緩和剤の発現を指令することが できる、上記のアルファウイルスRNAベクター分子を提供する。このアルファウ イルスRNA発現ベクター形状中の緩和剤は、発現される時、アルファウイルス粒 子の上記の面と同様の効果を示す。アルファウイルスRNA発現ベクターは順に、 アルファウイルスウイルスの転写を開始することができる５’配列、アルファウ イルス非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、ウイルス結合粒子、異種配列 、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、そして一続きの25の連続ポリア デニル酸残基を含有し、RNA分子として物理的に直接、種々のリポソーム調製物 との複合体として、またはアルファウイルスRNAベクター分子、ポリリジンのよ うなポリ陽イオン化合物、リセプター特異的リガンド、および随時ソラレン不活 性化ウイルス（例えば、センダイウイルスまたはアデノウイルス）を含むRNAリ ガンド複合体として標的細胞中に導入される。 本発明はまた、組換えアルファウイルス粒子の産生に適したパッケージ細胞株 およびプロデューサー細胞株を提供する。このようなパッケージ細胞株またはプ ロデューサー細胞株は、哺乳動物または非哺乳動物（例えば、蚊の細胞のような 昆虫細胞）であってよい。 本発明において広範なアルファウイルスが使用される。代表例としてはオーラ （Aura）、ベネズエラ馬脳炎（Venezuelan Equine Encephalitis）、フォート・ モルガン(Fort Morgan)、セムリキ森林 ウイルス（Semliki Forest Virus）およびマヤロ（Mayaro）がある。 本発明のこれらおよび他の面は、以下の詳細な説明と添付の図面を参照するこ とにより明らかになるであろう。さらにいくつかの方法や組成物（例えば、プラ スミド）を詳細に記載している種々の文献を以下に示す。これらの文献は参考の ためその全体が本明細書中に引用されている。図面の簡単な説明 図１は、シンドビスウイルスゲノム組成の概略図である。 図２は、RT-PCRによるシンドビスRNAゲノムの増幅法を示す図である。 図3A-Hは、シンドビスより得られる代表的な真核細胞重層ベクターイニシエー ション系の配列（配列番号89も参照）を示す。 図４は、シンドビスベーシックベクター（Sindbis Basic Vector）とシンドビ ス−ルシフェラーゼベクターの概略図である。 図５は、シンドビスヘルパーベクター作成の図である。 図６は、シンドビス−ルシフェラーゼベクターの発現とレスキュー（rescue） を示すグラフである。 図７は、シンドビス結合領域を修飾する１つの方法の図である。 図８は、シンドビスパッケージング発現カセットの概略図である。 図９は、LTR/SindIBspE細胞中のシンドビス−ルシフェラーゼベクターパッケ ージングを示す棒グラフである。 図10は、シンドビス構造蛋白を発現するためのアストロウイルスまたは他の異 種ウイルスの使用法を示す概略図である。 図11は、「RNAループアウト」（“RNA loop-out”）により無能 力化させたウイルス結合領域を活性化する機構の概略図である。発明の詳細な説明 本発明を説明をする前に、以後使用されるいくつかの用語を定義することが本 発明の理解に有用であろう。 「アルファウイルスベクター作成体」とは、目的の配列または遺伝子の発現を 指令することきができる集合体を意味する。このベクター作成体は、インビトロ でcDNAからウイルスRNAの合成を開始することができる５’プロモーター、アル ファウイルスの転写を開始することができる５’配列、および発現された時生物 活性のあるアルファウイルス非構造蛋白（すなわち、NSP1，NSP2，NSP3、および NSP4）をコードする配列、よりなる。さらに本ベクター作成体は、サブゲノム断 片のウイルス転写を防止、阻害または低下するためにいくつかの実施態様におい て修飾されたウイルス結合領域、およびアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識 配列を含有する。本ベクター作成体はまた、生存ウイルスの産生を可能にするの に充分なサイズの核酸分子、および１つまたはそれ以上の制限部位も含有しても よい。アルファウイルスベクター作成体がcDNAベクター作成体の時、これは、cD NAからウイルスRNAの合成を開始することができる５’プロモーター、そして転 写停止とスプライス認識を制御する３’配列を、さらに含む。 「発現カセット」は、アルファウイルス構造蛋白を発現することができる組換 えで産生される分子を意味する。発現カセットは、プロモーターと、アルファウ イルス構造蛋白をコードする配列を含有しなければならない。場合により発現カ セットは、転写停止、スプライス認識およびポリアデニル添加部位を含有しても よい。好適なプロモーターにはCMVおよびアデノウイルスVA1RNAプロモーターが ある。さらに発現カセットは、Neo，SV2 Neo、ヒグロマイシン（hygromycin）、 フレオマイシン（phleomycin）、ヒスチジノール（histidinol）、およびDHFRの ような選択マーカーを含有してもよい。 「アルファウイルス粒子」は、アルファウイルスベクターを含有するカプシッ ドを意味する。アルファウイルス粒子の中には、本発明のアルファウイルスベク ター作成体を含む種々のベクターが含まれる。好ましくはアルファウイルスカプ シッドは、ウイルスにコードされた蛋白が埋め込まれている脂質２重層（例えば 細胞膜）内に含有される。 Ａ．アルファウイルスの起源 前述のように本発明は、アルファウイルスベクター作成体、そのような作成体 を含有するアルファウイルス粒子、およびそのようなベクター作成体と粒子の使 用方法を提供する。簡単に説明すると、上記のベクター作成体や粒子の調製に使 用するのに適した野生型アルファウイルスをコードする配列は、本明細書で与え られる開示内容により、天然起源、または保管機関（例えば、アメリカンタイプ カルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、ロックヴィル 、メリーランド州）から容易に得られる。 適切なアルファウイルスの代表的な例としては、オーラ（Aura）(ATCC VR-368 )、ベバル（Bebaru）ウイルス(ATCC VR-600，ATCC VR-1240)、カバソウ（Cabass ou）(ATCC VR-922)、チクングニア(Chikungunya)ウイルス(ATCC VR-64，ATCC VR -124)、イースタン馬脳脊髄炎（Eastern equine encephalomyelitis）ウイルス （ATCC VR-65，ATCC VR-1242）、フォート・モルガン（Fort Morgan）(ATCC VR- 924)、ゲター(Getah)ウイルス(ATCC VR-369，ATCC VR-1243)、キジラガッハ（Ky zylagach）（ATCC VR-927）、マヤロ（Mayaro）(ATCC VR-66)、マヤロウイルス （ATCC VR-1277）、ミドルバーグ（ Middleburg）(ATCC VR-370)、ムカンボ(Mucambo)ウイルス(ATCC VR-580，ATCC V R-1244)、ヌズム（Ndumu）(ATCC VR-371)、ピクスナ（Pixuna）ウイルス(ATCC V R-372，ATCC VR-1245)、ロス・リバー（Ross River）ウイルス(ATCC VR-373，AT CC VR-1246)、セムリキ森林ウイルス（ATCC VR-67，ATCC VR-1247）、シンドビ スウイルス（ATCC VR-68，ATCC VR-1248）、トナテ（Tonate）（ATCC VR-925） 、トリニチ（Triniti）(ATCC VR-469)、ウナ（Una）(ATCC VR-374)、ベネズエラ 馬脳脊髄炎（ATCC VR-69）、ベネズエラ馬脳脊髄炎ウイルス（ATCC VR-923，ATC C VR-1250，ATCC VR-1249，ATCC VR-532）、ウェスタン馬脳脊髄炎(ATCC VR-70 ，ATCC VR-1251，ATCC VR-622，ATCC VR-1252)、ワタロア（Whataroa）（ATCC V R-926）、およびY-62-33（ATCC VR-375）がある。 Ｂ．野生型シンドビスウイルスをコードする配列 本発明の１つの好適な面において、野生型アルファウイルスをコードする配列 はシンドビスウイルスから得られる。特に本発明の１つの実施態様において（お よび実施例１に詳述されているように）、シンドビスcDNAクローンは、シンドビ スウイルスcDNAクローンの５’末端を、バクテリオファージRNAポリメラーゼプ ロモーターに結合させ、cDNAクローンの３’末端を少なくとも25ヌクレオチドの ポリーアデノシン（poly A）系に結合させて得られる。特にウイルスRNA鋳型か らの第１のcDNA鎖の合成は、酵素認識配列よりなる連続的配列、25のデオキシチ ミジンヌクレオチドの配列、およびウイルスの３’末端に相補的な一続きの約18 ヌクレオチドを有する３’オリゴヌクレオチドプライマーと、緩衝ヌクレオチド 、酵素認識配列、バクテリオファージプロモーター、およびウイルスの５’末端 に相補的な配列を有する５’プロモーターを用いて、行われる。これらのプライ マーのそれぞれに存在する酵素認識部位は、互いに異 なり、シンドビスウイルスには見いだされない。さらにバクテリオファージRNA ポリメラーゼプロモーターの３’末端に結合している第１のヌクレオチドは、RN Aウイルスの真正の第１のヌクレオチドでなければならない。前述の構造を有し ユニークなdT：dA３’末端制限酵素による消化により線状化された、ウイルスcD NAからインビトロで転写されたRNAは、適当な真核細胞への導入の後、cDNAがク ローン化される野生型のウイルスによる感染に特徴的な同じ感染サイクルを開始 させる。インビトロ転写の後に感染を開始させることができるRNAを与える、こ のウイルスcDNAクローンは以後「感染性cDNAクローン」と呼ばれる。 Ｃ．不活性化ウイルス結合領域を用いる組換えアルファウイルスベクター作成体 の産生 前述のように（または、他の供給源から得られるアルファウイルスをコードす る配列を用いて）調製された感染性cDNAクローンは、本発明のアルファウイルス ベクター作成体を調製するのに直ちに使用することができる。簡単に説明すると 、本発明の１つの面において、アルファウイルスの転写を開始することができる ５’配列、アルファウイルス非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、サブゲ ノム断片のウイルス転写が防止されるように不活性化されたウイルス結合領域、 そしてアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列よりなる、組換えアルファウ イルスベクター作成体が提供される。後に詳述されるように、不活性化ウイルス 結合領域を有するアルファウイルスベクター作成体はサブゲノム断片を転写しな いため、広範囲の応用に適している。 １．RNAポリメラーゼプロモーター 前述のように本発明のある実施態様において、インビトロでcDNAからウイルス RNAの合成を開始することができる５’プロモーター を含有するアルファウイルスベクター作成体が提供される。特に好適な５’プロ モーターには、RNAポリメラーゼプロモーター(例えばT7，T3およびSP6)がある。 ２．転写を開始する配列 前述のように好適な実施態様において、本発明のアルファウイルスベクター作 成体は、アルファウイルスの転写を開始することができる５’配列を含有する。 そのような配列の代表例としては、野生型シンドビスウイルスのヌクレオチド１ −60（図３を参照）、tRNAアスパラギンのヌクレオチド10−75（Schlesingerら 、米国特許第5,091,309号）、そして転写を開始する他のトガウイルスからの５ ’配列がある。 ３．アルファウイルス非構造蛋白 本発明のアルファウイルスベクター作成体はまた、アルファウイルス非構造蛋 白(NSP)をコードする配列を含有する。例として、シンドビスウイルスについて は４つのシンドビス非構造蛋白（NSP1，NSP2，NSP3およびNSP4）があり、これら はウイルスが自己増殖できるようにする蛋白をコードする。本発明の１つの実施 態様において、非構造蛋白１から３（NSP1〜NSP3）は、野生型シンドビスウイル スのヌクレオチド60〜5750によりコードされる（図３を参照）。これらの蛋白は ポリ蛋白として産生され、後に非構造蛋白NSP1，NSP2、およびNSP3に切断される 。１つの実施態様において、NSP4はヌクレオチド5928〜7579によりコードされる （図３参照）。 前述の配列以外にアルファウイルスの非構造蛋白をコードする広範囲の配列が 本発明において使用できることは、当業者には明白であり、従ってこれらは用語 「アルファウイルス非構造蛋白」の範囲内に入ると考えられる。例えば本発明の １つの実施態様において、遺伝子コードの縮重のために２つ以上コドンが特定の アミノ酸をコ ードする。従って、アルファウイルス非構造蛋白をコードする広範囲の核酸配列 が産生される。本発明の他の実施態様において、種々の他の非構造蛋白誘導体（ 例えば、種々の置換、挿入または欠失が含まれる）が作成されるが、これらは最 終的にアルファウイルス非構造蛋白の生物活性を変化させない。本発明において 、アルファウイルス非構造蛋白がもしベクター作成体の自己複製を促進するなら 、アルファウイルス非構造蛋白は全体として「生物活性がある」と考えられる。 ウイルス性核酸の複製を意味し、感染性ウイルスの産生を意味するのではない自 己複製は、ある時間をかけて行われるRNase保護測定法により容易に測定される 。そのような誘導体の作成法は、本明細書中の開示内容により当業者は容易に実 施できる（Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第２版)、コールドスプリ ングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)も参 照）。 ４．ウイルス結合領域 本発明の１つの面において、サブゲノム断片のウイルス転写が防止されるよう に、アルファウイルスベクター作成体はまた、不活性化されたウイルス結合領域 を含有する。簡単に説明すると、アルファウイルスのウイルス結合領域は通常サ ブゲノム断片の転写開始を制御する。シンドビスウイルスの場合、正常なウイル ス結合領域は典型的には、大体ヌクレオチド番号7579で始まり、少なくともヌク レオチド番号7612（そしておそろくはそれ以上）まで続く。少なくともヌクレオ チド7579〜7602（5'-ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT AGT − 配列番号１）は、 サブゲノム断片の転写に必要であると考えられている。この領域（ヌクレオチド 7579〜7602）は、以後「最小結合領域核」と呼ぶ。 本発明の好適な実施態様において（そして、以下により詳しく説 明されるように）、サブゲノム断片のウイルス転写を防止するために、ウイルス 結合領域は不活性化されている。本発明での使用において「不活性化」は、RNas e保護測定法による測定ではサブゲノム断片の開始点に対応する断片は検出され ないことを意味する（代表的な測定法は、Meltonら、Nuc．Acids Res．12：7035 -7056，1984；Calzonら、Methods in Enz．152：611-632，1987；およびKekule ら、Nature 343：457-461，1990）。 本発明の１つの実施態様において、ウイルス結合領域はヌクレオチド7597で端 を切り取る（truncate）することにより、不活性化されている（すなわち、この ウイルス結合領域は図３に示すようにヌクレオチド7579〜7597の配列よりなる） 。この端の切り取り（truncation）によりサブゲノム断片の転写が防止され、さ らに完全なNSP4領域（ヌクレオチド5928〜7579によりコードされる）の合成を可 能にする。 本発明の開示より当業者には明らかなように、ウイルス結合領域を不活性化す るために広範囲の他の欠失、置換または挿入を行うことができる。例えば本発明 の他の実施態様において、ウイルス結合領域はさらにNSP4をコードする領域まで 切り取ることができ、これによりNSP4の生物活性を維持しながらサブゲノム断片 からのウイルス転写を防止できる。あるいは他の実施態様において、遺伝子コー ドの重複性のために、NSP4の生物活性を変化させずにサブゲノム断片の転写を防 止するような、NSP4をコードする配列のヌクレオチド置換が可能である。 ５．アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列とポリ−Ａテール 前述のように本発明のアルファウイルスベクター作成体はまた、アルファウイ ルスRNAポリメラーゼ認識配列（「アルファウイルスレプリカーゼ認識配列」と も呼ぶ）を含む。簡単に説明するとアル ファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列は、アルファウイルスが負の鎖の複製を 始める認識部位を提供する。アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列として 、広範な配列が使用できる。例えば１つの実施態様において、本発明のシンドビ スベクター作成体は、ヌクレオチド11,647〜11,703（図３を参照）にコードされ るシンドビスポリメラーゼ認識配列を含む。他の実施態様においては、シンドビ スポリメラーゼ認識は、認識配列として機能する最小の領域まで端が切り取られ ている（例えば、図３のヌクレオチド11,684〜11,703）。 本発明の好適な実施態様において、ベクター作成体は追加的にポリ−Ａテール を含有してもよい。簡単に説明すると、ポリ−Ａテールは細胞質中の安定性を促 進するのに充分な任意のサイズであり、従ってウイルスの生活史の開始効率を上 昇させる。本発明の種々の実施態様において、ポリ−Ａテールは少なくとも10ア デノシンヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも25アデノシンヌクレオ チドよりなる。 Ｄ．他のアルファウイルスベクター作成体 一般的に記載した前述のベクター作成体以外に、本明細書の開示内容を用いて 広範な他のアルファウイルスベクター作成体が調製できる。 １．修飾ウイルス結合領域 本発明の１つの面において、サブゲノム断片のウイルス転写が低下するように 、ウイルス結合領域が修飾されたアルファウイルスベクター作成体が提供される 。簡単に説明すると、野生型アルファウイルスで細胞を感染すると、通常ウイル ス結合領域から開始するサブゲノム断片の多すぎるウイルス転写の結果として細 胞が死滅する。この多すぎるRNA分子は、感染細胞の転写機構を破壊し、最終的 に細胞を死に至らせることがある。標的細胞の感染が細胞の死ではなく治療効果 を示すような好ましい応用（例えば、標的核酸の鎖の切断、または異種蛋白の発 現の延長）では、サブゲノム断片のウイルス転写のレベルを低下させ、これによ りベクター感染標的細胞の寿命を延長させるために、（前述のベクター作成体の 不活性化以外に）アルファウイルスベクター作成体にいくつかの修飾をすること もできる。本発明においては、RNase保護測定法により測定される、ウイルス転 写により産生されるサブゲノム断片が標準的野生型アルファウイルス(例えば、 シンドビスウイルスATCC番号VR-1248)より少ない場合、そのサブゲノム断片のウ イルス転写は「低下している」と見なされる。 サブゲノム断片のウイルス転写のレベルを低下させるために、ウイルス結合領 域は種々の方法により修飾してもよい。例えば本発明の１つの実施態様において は、遺伝子コードの重複性のために、アミノ酸配列NSP4（または、他の実施態様 においてはNSP4の生物活性）に変化を及ぼさずに、サブゲノム断片のウイルス転 写のレベルを低下させる、ウイルス結合領域7579〜7597でのヌクレオチド置換が 行われる。修飾されたベクター作成体が7597を越えてヌクレオチドを含有する場 合（例えば、7602または7612まで）、同様の置換がさらに可能であるが、NSP4は 7597で停止するためそのような置換は遺伝的重複性に基づく必要はない。修飾さ れたウイルス結合領域の代表例は、以下の実施例３により詳細に記載される。 ２．縦列（tandem）ウイルス結合領域 本発明の別の面において、アルファウイルスの転写を開始することができる５ ’配列、アルファウイルスの非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、サブゲ ノム断片のウイルス転写を防止するように不活性化された第１のウイルス結合領 域、サブゲノム断片のウイ ルス転写が低下するように修飾された第２のウイルス結合領域、そしてアルファ ウイルスRNAポリメラーゼ認識配列よりなる、アルファウイルスベクター作成体 が提供される。このようなベクター作成体は、第１の不活性化（または「不能化 」）ウイルス結合領域、および第２の修飾（または「合成」）ウイルス結合領域 よりなるため、「縦列」（“tendem”ベクター作成体と呼ぶ。本発明の好適な実 施態様において、不活性化したウイルス結合領域の後に、直接第２の修飾したウ イルス結合領域が続く。 低レベルのサブゲノム転写が好ましい応用例では、最小結合領域核は不活性化 した結合領域の下流に縦列で挿入される。目的の効果を得るためにサブゲノム転 写のレベルを徐々に上昇させるために、全結合領域に対応する配列を、縦列の結 合領域内に徐々に増やしながら追加することができる。 ３．アデノウイルスE3遺伝子 本発明の別の面において、アルファウイルス感染細胞内のHLA発現をダウンレ ギュレートするために、第２のウイルス結合領域に続いて縦列のベクター作成体 にアデノウイルスE3遺伝子が挿入される。簡単に説明すると、本発明の種々の実 施態様において、同一人への遺伝子治療薬の繰り返し接種が好ましい。しかしシ ンドビスウイルスのようなアルファウイルスの接種の繰り返しは、シンドビスウ イルスの非構造蛋白(NSP)に対する特異的抗体または細胞性免疫応答の生成を招 くことがある。従って、同一人に繰り返し投与するために、ベクター特異的蛋白 に対する宿主の免疫応答を弱める必要がある。 従って本発明の１つの実施態様において、感染細胞の表面に発現される完全な 組織適合性抗原の発現をダウンレギュレートするために、アデノウイルス２型初 期領域遺伝子３の生成物が使用される。 簡単に説明すると、E3 19,000ダルトン(E3／19K)蛋白は小胞体中のクラスＩ Ｈ −２／HLA抗原に結合して複合体を形成し、クラスＩ Ｈ−２／HLA抗原の完全な 成熟と細胞膜への輸送に必要な末端グリコシル化経路を妨害する。Ad2E3蛋白を コードするアルファウイルスベクターで感染された標的細胞中では、クラスＩ抗 原内のウイルス非構造蛋白の同時発現は起きない。従って、Ad2E3蛋白を発現す るアルファウイルスベクターを、治療用緩和剤の成分として同一人に繰り返し投 与することができる。アデノウイルスE3遺伝子の使用の代表例は、以下の実施例 4Aに詳述される。 ４．CMV H301遺伝子 ウイルスNSPに対する宿主の免疫応答を緩和するために、他の方法を使用する こともできる。例えば本発明の別の面において、ベクターで感染した細胞内で発 現される特異的蛋白に対する宿主のCTL応答を阻害するために、好ましくは縦列 ベクター中の第２のウイルス結合領域のすぐ後に、ヒトサイトメガロウイルス（ 「HCMV」）H301遺伝子をアルファウイルスベクター作成体内にクローン化される 。 簡単に説明すると、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）蛋白は、高等真核生物 のクラスＩ主要組織適合性分子のα鎖のα１，α２およびα３のドメインに結合 する。β２ｍとMHCクラスＩ生成物の間の相互作用を妨害すると、感染細胞は細 胞毒性Ｔ細胞により認識されなくなる。従って実施例4Bに詳述されるように、治 療用緩和剤の成分としてのHCMV H301遺伝子生成物の発現は、ウイルスNSPに対す る宿主の免疫応答を緩和するために使用することができる。 ５．レトロウイルスパッケージング配列 本発明の別の面において、レトロウイルスパッケージング配列が縦列ベクター に挿入され、第１の（不活性化された）ウイルス結合 領域と第２の修飾されたウイルス結合領域の間に配置される。簡単に説明すると 、レトロウイルスバッケージング配列は、レトロウイルス粒子へのRNAゲノムの パッケージングの信号を送る。以下に詳述されるように、レトロウイルスパッケ ージング配列は、レトロウイルスパッケージング細胞株を用いてレトロウイルス 粒子にアルファウイルスベクターをパッケージングするために使用される。これ は、アルファウイルスパッケージング細胞株へのアルファウイルスベクターの移 動効率を上げるために行われる。 ６．複数の異種遺伝子の発現 野生型アルファウイルスが感染した細胞内で転写されたmRNAのゲノムの長さと サブゲノムの長さは、ポリシストロン性であり、それぞれウイルスの４つの非構 造蛋白(NSP)と４つの構造蛋白（SP）をコードする。ゲノムmRNAおよびサブゲノ ムmRNAはポリ蛋白として翻訳され、各非構造蛋白および構造蛋白への処理は、ウ イルスにコードされたNSP-およびSP−特異的プロテアーゼに触媒される、翻訳後 の蛋白分解性切断により行われる。 本明細書に記載したアルファウイルスベクターのいくつかの応用例では、２つ 以上の異種遺伝子の発現が好ましい。例えばゴーシェ症候群（Gaucher's syndro me）のような代謝性疾患の治療には、治療用緩和剤の持続期間が限定されている ため、アルファウイルスベクターまたは粒子の複数回投与が必要である。従って 本発明のいくつかの実施態様におては、グルコセルブロシダーゼ遺伝子（実施例 11を参照）のような緩和剤とともに、標的細胞のAd2e3遺伝子（実施例４を参照 ）を同時発現することが好ましい。しかし野生型ウイルスでは、構造蛋白（「SP 」）ポリシストロン性メッセージは１つのポリ蛋白に翻訳され、これは次にSPに コードされたプロテアーゼにより切断されて個々の蛋白に処理される。従ってSP プロテアーゼ 遺伝子または切断のために認識されるペプチドは、アルファウイルスベクターの 置換領域内に存在しないため、ポリシストロン性メッセージからの複数の異種遺 伝子の発現は、野生型ウイルスとは異なる機構を必要とする。 従って本発明の１つの実施態様において、適切なシグナルをリボゾームの読通 し(readthrough)またはシストロンの間へのリボゾームの侵入により、アルファ ウイルスベクターが作成される。複数の異種遺伝子を発現する代表的な方法の１ つは、以下の実施例５に記載される。 本発明のさらに別の実施態様において、不能になった結合領域ベクターpKSSIN BVdlJRのすぐ下流へのリボゾームの読み通しまたは内部リボゾームの侵入を促進 するシグナルの配置が記載される（実施例３を参照）。このベクターの形状では 、サブゲノムのメッセージの合成は起こらず、異種蛋白はリボザイムの読み通し （スキャニング）または内部リボザイム侵入により、ゲノム長さのmRNAから異種 蛋白が発現される。野生型に関して、このアルファウイルスベクターによる低レ ベルのウイルス転写は、感染した標的細胞の寿命を延ばすであろう。 本発明のさらに別の実施態様において、pKSSINBVdlJRsjrまたはpKSSINBVのす ぐ下流へのリボゾームの読み通しまたは内部リボゾームの侵入を促進するシグナ ルの配置が記載される。簡単に説明すると、サブゲノムmRNAの合成はpKSSINBVdl JRsjrまたはpKSSINBVベクターが感染した細胞内で起きるため、これらの２つの 異種遺伝子の間へのリボゾームの読み通しまたは内部リボゾームの侵入配列の配 置は、サブゲノムmRNAポリシストロン性メッセージによりコードされる両蛋白の 翻訳を可能にする。さらにAUG翻訳開始コドンの５’末端に適当な翻訳開始シグ ナルが存在すれば、追加の異種遺伝子が サブゲノムmRNA領域中に配置される。サブゲノムmRNA領域に挿入され得る異種遺 伝子の数は、本明細書に記載するようにベクターのパッケージングの制限によっ てのみ限定される。 リボゾームを読み通し、capに無関係の翻訳、または内部リボゾーム侵入を可 能にする異なる配列は、上記の構造のシンドビスウイルスベクターpKSSINBVdlJR ，pKSSINBV、またはpKSSINBVdlJRsjrc中に配置される。これらの翻訳制御配列の 起源は、ピコルナウイルスポリおよびEMCV、ヒト免疫グロブリンの重鎖結合蛋白 の５’非コード配列、および効率的な翻訳開始のためのコザック(Kozak)コンセ ンサス配列に一部対応する少なくとも15塩基対の合成配列である。ここでは詳述 されないが、翻訳開始に影響するこれらのシグナルは、結合領域の下流、および 実施例３に記載の修飾結合領域ベクター中のすべての異種遺伝子の間に配置する ことができる。 ７．アルファウイルスcDNAベクター作成体 前述のように本発明はまた、アルファウイルスcDNAベクター作成体を提供する 。例えば本発明の１つの面において、cDNAからウイルスRNAの合成を開始するこ とができる５’プロモーター、その後に続くアルファウイルスの転写を開始する ことができる５’配列、アルファウイルス非構造蛋白をコードするヌクレオチド 配列、活性であるかまたはサブゲノム断片のウイルス転写が防止されるように不 活性化されているウイルス結合領域、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配 列、そして転写停止を制御する３’配列、よりなるアルファウイルスcDNAベクタ ー作成体が提供される。種々の実施態様において、ウイルス結合領域は、サブゲ ノム断片のウイルス転写が不活性化されるよりもむしろ単に低下するように修飾 される。別の実施態様において、第２のウイルス結合領域は、第１の不活性化ウ イルス結合領域に続いて挿入されており、この第２のウイルス結合 領域は、サブゲノム断片のウイルス転写が低下するように修飾されている。 前述のように、アルファウイルスの転写を開始することができる５’配列、ア ルファウイルス非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、サブゲノム断片のウ イルス転写が防止されるように不活性化されたウイルス結合領域、そしてアルフ ァウイルスRNAポリメラーゼ認識配列よりなる、アルファウイルスcDNAベクター 作成体の種々の面が記載された。さらに修飾結合領域と縦列結合領域も記載され た。しかしアルファウイルスcDNAベクター作成体は、cDNAからウイルスRNAの合 成を開始することができる５’プロモーターの添加により異なる。適切なプロモ ーターの代表例には、lacプロモーター、メタラチオン(metallathione)プロモー ター、CMVプロモーターおよび熱ショックプロモーターなどがある。 前述のように、アルファウイルスcDNAベクター作成体はまた、転写停止を制御 する３’配列を含む。このような配列の代表例は、以下の実施例２に詳細に記載 される。 ８．組織特異的発現 本発明の別の面において、選択された組織内でのみ目的の異種配列を発現する ことができるアルファウイルスベクター作成体が提供される。このような代表例 の１つを図11に示す。簡単に説明すると図11Ａに示されるように、標的細胞にベ クターが導入される（図11Ａ）と、転写制御配列（例えば、修飾結合領域）に隣 接する逆方向反復配列がループ構造から出て（図11Ｂを参照）、合成結合領域か らのサブゲノム配列（「Ｇ．Ｏ．Ｉ．」）のウイルス転写を防ぐように、組換え アルファウイルスベクターは作成される。 一方、もし逆方向反復配列が、選択された組織または細胞型に特徴的な特異的 細胞性RNA配列にもハイブリダイズするように設計さ れているならば、ベクターの活性化が達成される。このような細胞性RNAは無能 化幹ループ構造を破壊し、こうしてさらに安定な２次幹ループ構造を形成させる （図11Ｃと11Ｄ）。この２次幹ループ構造は、結合領域を正しい配置に戻すこと によりサブゲノムメッセージの転写を可能にする。 コピー選択と呼ばれる鎖ジャンプ（strand hopping）機構を用いて負の鎖の合 成中に鎖型を交換するウイルスポリメラーゼの能力を利用して、２次幹ループ構 造を使用して全長アルファウイルスベクターを転写することもできる(King，RNA genetics II，CRC Press，Inc．Boca Raton Fla.，Domingoら（編）、pp．150- 185，1988)。ポリメラーゼコピー選択の結果として逆方向反復配列は欠失してい るため、転写がいったん１回うまく起きれば、得られるRNA転写体は逆方向反復 配列を含有しない。この新たに合成されたRNA分子は、前述の任意の他の非無能 化ゲノムアルファウイルスベクターのように転写し発現する一次RNAベクター転 写体として機能する。このRNAベクター構造では、標的細胞または組織型にのみ 存在する特異的RNA配列が、逆方向反復配列の設計に使用されるなら、無能化し たシンドビスベクターの組織または細胞特異的な活性化が達成される。この方法 でシンドビスのようなアルファウイルスは、前述の類似の逆方向反復配列を用い て、組織特異的発現ベクターとして作成することができる。 組織特異的発現を達成するこのベクター系を用いると、治療的アルファウイル スベクターまたは粒子を患者に全身的に送達することができる。もしベクターが 適切なRNA種を発現しない細胞に感染した場合は、ベクターは非構造蛋白を発現 できるのみであり、目的の遺伝子は発現しない。最終的にベクターは無害に分解 されるであろう。 前記のベクターを使用すると、種々の治療的応用（例えば、種々の型の癌の治 療のためにベクターを標的とすることを含む）のための事実上の組織特異的発現 が可能になる。この理論は、癌胎児性癌性特異的抗原(CEA)やアルファフェトプ ロテイン癌マーカーのような癌特異的マーカーの特異的発現に依存する。簡単に 説明すると、特異的な癌を標的とするのにこのような癌特異的RNAを使用するこ とは、後述の毒性分子、リンホカインまたはプロドラッグの癌特異的発現を可能 にする。この方法は、大腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌など の種々の癌のすべてがCEAを発現するため、これらの癌に利用される。本発明の この面においての使用に適したベクターの１つの代表例は、以下の実施例15に詳 述されている。 簡単に説明すると、CEAはアルファフェトプロテイン癌マーカーとともに、最 初に記載された癌特異的マーカーの１つであった。CEAは、胎児成長の最初の２ 回の３ヶ月に消化管、膵臓および肝臓などの胎児組織に見いだされる普通の糖蛋 白である（Pathologic Basis of Disease、第３版、1984，Robbinsら、編者）。 以前はCEAは大腸の腺癌に特異的であると考えられていたが、後に好感度のラジ オイムノアッセイが開発されたため、多くの内胚葉由来の癌（特に膵臓癌、胃癌 および食道癌）の血漿中に存在することが明らかになった。 本発明の関連する面において、アルファウイルス細胞特異的発現ベクターは、 ウイルス感染細胞型の標的治療のために、ウイルス抗原、リボザイム、アンチセ ンス配列、またはガンマ−インターフェロン(γ−IFN)またはIL−２のような免 疫刺激性因子を発現するように作成される。特に、特異的外来微生物または病原 体感染細胞にアルファウイルスベクターをターゲティングするために、アルファ ウイルスベクターの逆方向反復配列は、任意の病原体特異的RNAにハイブリダイ ズするように選択される（例えば、HIV，CMV，HBV，HPV、およびHSVのような病 原体に感染された標的細胞）。 本発明のさらに別の面において、遺伝子置換療法を用いる組織特異的代謝性疾 患の治療のために、特定の臓器がターゲティングされる。例えば、肝臓は体の多 くの代謝機能に関与し、多くの代謝性遺伝性疾患に関連しているため、重要な標 的組織である。そのような疾患には、多くのグリコーゲン保存疾患、フェニルケ トン尿性、ゴーシェ病および家族性高コレステロール血症などがある。現在多く の肝臓特異的酵素やマーカーがある（これらは配列が決定されており、アルファ ウイルスベクターの適切な逆方向反復配列を作成するのに使用される）。そのよ うな肝臓特異的cDNAには、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ（Horikawaら 、Biochem．Int．25：81，1991）；レシチン；コレステロールアシルトランスフ ェラーゼ（Rogneら、Biochem．Biophys．Res．Commun．148：161，1987）；およ び他の肝臓特異的cDNA(Chinら、Ann．N．Y．Acad．Sci．478：120，1986)がある 。このような肝臓特異的アルファウイルスベクターは、家族性高コレステロール 血症(Wilsonら、Mol．Biol．Med．７：223，1990)の治療のために肝細胞に低密 度リポ蛋白リセプター（Yamamotoら、Cell 39：27，1984）を送達するのに使用 できるであろう。 Ｅ．異種配列 前述のように本発明のアルファウイルスベクター作成体により、広範なヌクレ オチド配列が担持される。好ましくはヌクレオチド配列は、生存可能な（viable ）ウイルスの産生を可能にするのに充分なサイズであるべきである。本発明にお いて、測定可能な力価の感染性ウイルスまたは感受性単層の産生は、「生存可能 なウイルスの 産生」と考えられる。これは最小の場合、追加の異種配列を含有しないアルファ ウイルスベクター作成体でもよい。しかし他の実施態様において、ベクター作成 体は追加の異種配列または外来配列を含有してもよい。好適な実施態様において 異種配列は、少なくとも約100塩基、２kb，3.5kb，５kb，７kb、または少なくと も約８kbの異種配列よりなる。 本明細書中の開示内容から当業者には明らかなように、パッケージングの効率 従ってウイルス力価は、ある程度パッケージングされる配列のサイズに依存する 。従って生存可能なウイルスのパッケージングおよび産生の効率を上昇させるに は、追加の非コード配列をベクター作成体に付け加えてもよい。さらに本発明の いくつかの実施態様において、ウイルスの力価を上昇または低下させることが好 ましいことがある。この上昇または低下は異種配列のサイズ、従ってパッケージ ングの効率を上昇または低下させることにより達成される。 ベクター作成体には、例えばリンホカイン、トキシン、プロドラッグ、免疫応 答を刺激する抗原、リボザイム、および免疫応答を補助または阻害する蛋白、そ してアンチセンス配列（または「アンチセンス応用」のためのセンス配列）のよ うな緩和剤をコードする配列などの広範な異種配列が含まれる。前述のように本 発明の種々の実施態様において、本明細書中に提供されるアルファウイルスベク ター作成体は２つまたはそれ以上の異種配列を含有（そして、ある実施態様にお いては発現）してもよい。 １．リンホカイン 本発明の１つの実施態様において、異種配列はリンホカインをコードする。簡 単に説明するとリンホカインは、免疫エフェクター細胞を増殖、活性化または分 化させるのに働く。リンホカインの代表 例には、IL−１，IL−２，IL−３，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−８， IL−９，IL−10，IL−11，IL−12，IL−13，IL−14，IL−15，GM−CSF，CSF−１ 、およびＧ−CSFがある。 本発明の関連する実施態様において、異種配列は免疫調節性補助因子をコード する。簡単に説明すると、本発明に関連して使用される「免疫調節性補助因子」 は、免疫応答に関与して１つまたはそれ以上の細胞により産生される時、または 細胞に外から加えられる時、その補助因子がない時に発生したであろう質または 強さとは異なる免疫応答を引き起こす。応答の質または強さは、当業者に公知の 種々の方法により測定することができ、例えば細胞の増殖を測定するインビトロ 測定法（例えば、3Ｈチミジン摂取）、およびインビトロ細胞毒性測定法（例え ば、51Cr放出を測定するもの）（Warnerら、AIDS Res．and Human Retrovirus７ ：645-655，1991）がある。 免疫調節性補助因子の代表例は、アルファインターフェロン（Finterら、Drug s 42（5）：749-765，1991；米国特許第4,892,743号；米国特許第4,966,843号； WO 85/02862；Nagataら、Nature 284：316-320，1980；Famillettiら、nethods in Enz．78：387-394，1981；Twuら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：2046-20 50，1989；Faktorら、Oncogene５：867-872，1990）、ベータインターフェロン （Seifら、J．Virol．65：664-671，1991）、ガンマインターフェロン（Radford ら、American Society of Hapatology：2008-2015，1991；Watanabeら、PNAS 86 ：9456-9460，1989；Gansbacherら、Cancer Research 50：7820-7825，1990；Ma ioら、Can．Immunol．Immunother．30：34-42，1989；米国特許第4,762,791号お よび4,727,138号）、Ｇ−CSF（米国特許第4,999,291号および4,810,643号）、Gn −CSF（WO 85/04188）、TNF（Jayaraman ら、J．Immunology 144：942-951，1990）、インターロイキン−２（IL−２）（ Karupiahら、J．Immunology 144：290-298，1990；Weberら、J．Exp．Med．166 ：1716-1733，1987；Gansbacherら、J．Exp．Hed．172：1217-1224，1990；米国 特許第4,738,927号）、IL−４（Tepperら、Cell 57：503-512，1989；Golumbek ら、Science 254：713-716，1991；米国特許第5,017,691号），IL−６（Brakenh ofら、J．Immunmol．139：4116-4121，1987；WO 90/06370），IL−12，IL−15， ICAM−１（Altmanら、Nature 338：512-514，1989），ICAM−２，LFA-１，LFA- ３，MHCクラスＩ分子、MHCクラスII分子、β2−ミクログロブリン、チャペロン （chaperones）、CD3，B7/BB1，MHC結合トランスポーター蛋白またはこれらの類 似体がある。 アルファウイルスベクター作成体中に免疫調節性補助因子を含めるか否かの選 択は、補助因子の公知の治療効果に基づくか、または実験的に決定される。例え ば慢性Ｂ型肝炎感染では、患者の免疫不全を補い従って疾患からの回復を助ける のに、アルファインターフェロンが有効であることがわかっている。あるいは安 定な免疫調節性補助因子を実験的に決定してもよい。簡単に説明すると、肝疾患 の患者からまず血液試料を採取する。自己細胞またはHLAの一致した細胞（例え ば、EBVで形質転換した細胞）でインビトロで、抹消血を再刺激し、肝炎抗原の 免疫性部分と免疫調節性補助因子の発現を指令するアルファウイルスベクター作 成体で形質導入する。HLAの一致した形質導入細胞を標的として、刺激したPBLを CTL測定法のエフェクターとして使用する。HLAの一致した刺激物質と抗原のみを コードするベクターで形質導入した標的細胞を用いて行った同じ測定法で見られ るCTL応答よりも大きい応答は、有用な免疫調節性補助因子であることを示す。 本発明の１つの実施態様において、 免疫調節性補助因子のガンマインターフェロンが特に好ましい。 免疫調節性補助因子の別の例は、B7/BB1補助刺激因子である。簡単に説明する とＴ細胞の完全な機能の活性化には２つのシグナルが必要である。１つのシグナ ルは抗原特異的Ｔ細胞リセプターと、主要組織適合性複合体(MHC)分子に結合し たペプチドとの相互作用により与えられ、第２のシグナル（補助刺激と呼ぶ）は 抗原提示細胞によりＴ細胞に送達される。簡単に説明すると、第２のシグナルは Ｔ細胞によるインターロイキン−２（IL−２）産生に必要であり、抗原提示細胞 上のB7/BB1分子と、Ｔリンパ球上のCD28およびCTLA−４リセプターとの相互作用 が関与しているようである(Linsleyら、J．Exp．Med.，173：721-730，1991a、 およびJ．Exp．ned.，174：561-570，1991)。本発明の１つの実施態様において 、CD8+Ｔ細胞が拡張した充分活性化するために充分なIL−２を産生するように、 B7/BB1はCD8+Ｔ細胞の補助刺激を起こすために癌細胞に導入される。これらのCD 8+Ｔ細胞は、さらなるCTL機能のために補助刺激が必要ではないためB7を発現し ていない癌細胞を殺すことができる。B7/BB1因子と例えば免疫原性HBVコア蛋白 の両方を発現するベクターは、本明細書に記載した方法を使用して作成すること ができる。これらのベクターで形質導入される細胞は、より有効な抗原提示細胞 となるであろう。HBVコア−特異的CTL応答は、補助刺激リガンドB7/BB1を介して 、充分に活性化されたCD8+Ｔ細胞から増強される。 ２．トキシン 本発明の別の実施態様において、異種配列はトキシンをコードする。簡単に説 明すると、トキシンは細胞の増殖を直接阻害するように作用する。トキシンの代 表例には、リシン（Lambら、Eur．J．Biochem．148：265-270，1985）、アブリ ン（abrin）（Woodら、Eur． J．Biochem．198：723-732，1991；Evensenら、J．of Biol．Chem．266：6848-6 852，1991；Collinsら、J．of Biol．Chem．265：8665-8669，1990；Chenら、Fe d．of Eur．Biochem Soc．309：115-118，1992）、ジフテリアトキシン（Tweten ら、J．Biol．Chem．260：10392-10394，1985）、コレラトキシン（Mekalanosら 、Nature 306：551-557，1983；Sanchez and Holmgren，PNAS 86：481-485，198 9）ゲロニン（gelonin）（Stirpeら、J．Biol．Chem．255：6947-6953，1980） 、ポークウィード（Irvin，Pharmac．Ther．21：371-387，1983）、抗ウイルス 蛋白（Barbieriら、Biochem．J．203：55-59，1982；Irvinら、Arch．Biochem． & Biophys．200：418-425，1980；Irvin，Arch．Biochem．& Biophys．169：522 -528，1975）、トリチン（tritin）、赤痢菌毒素（Calderwoodら、PNAS 84：436 4-4368，1987；Jacksonら、nicrob．Path．２：147-153，1987）、シュードモナ ス外毒素Ａ（Carroll and Collier，J．Biol．Chem．262：8707-8711，1987）、 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）(Fieldら、J．Gen．Virol．49 ：115-124，1980)、および大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが ある。 ３．プロドラッグ 本発明の他の実施態様において、異種配列は「プロドラッグ」をコードする。 簡単に説明すると、本発明において「プロドラッグ」とは、ほとんどまたは全く 毒性のない化合物を毒性生成物に活性化する遺伝子生成物を意味する。このよう な遺伝子生成物の代表例には、HSVTKとVZVTKがあり、これらはいくつかのプリン アラビノシドおよび置換ピリミジン化合物を選択的にモノリン酸化して、これら を細胞毒性または細胞増殖抑制代謝物に交換する。さらに詳しくは、ガンシクロ ビル、アシクロビルのような薬剤または他の任意の 類似体（例えば、FIAU，FIAC，DHPG）をHSVTKに接触させると、薬剤は対応する 活性ヌクレオチド三リン酸型にリン酸化される。 本発明に関連して使用される他のプロドラッグの代表例には：大腸菌グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（これはチオキサンチンを毒性のあるチオキ サンチンモノリン酸に交換する）（Besnardら、Mol．Cell．Biol．７：4139-414 1，1987）；アルカリ性ホスファターゼ（これは不活性のリン酸化化合物（例え ば、マイトマイシンリン酸やドコソルビシン−ホスフェート）を毒性の脱リン酸 化化合物に交換する）；カビ性(例えば、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium Oxysporum))または細菌性シトシンデアミナーゼ（これは５−フルオロシトシン を毒性の化合物５−フルオロウラシルに交換する）（Mullen，PNAS 89：33，199 2）；カルボキシペプチダーゼG2（これはパラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル） アミノベンジルグルタミン酸からグルタミン酸を切断して、毒性の安息香酸マス タードを生み出す）；そしてペニシリン−Ｖアミダーゼ（これはドコソルビシン とメルファランのフェノキシアセトアビド誘導体を毒性化合物に変換する）(一 般的には、Vrudhulaら、J．of Med．Chem．36（7）：919-923，1993；Kernら、C anc．Immun．Immunother．31（4）：202-206，1990)がある。 ４．アンチセンス配列 本発明の別の実施態様において、異種配列はアンチセンス配列である。簡単に 説明すると、アンチセンス配列はRNAに結合して、これにより特定の蛋白の細胞 性合成を防止するか、または細胞によるRNA配列の使用を防止するように、設計 される。このよな配列の代表例には、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセ ンスジヒドロ葉酸リダクターゼ(Maher and Dolnick，Arch．Biochem．& Biophys ．253：214-220，1987；Bzikら、PNAS 84：8360-8364，1987) 、アンチセンスHER2(Coussensら、Science 230：1132-1139，1985)、アンチセン スABL（Fainsteinら、Oncogene４：1477-1481，1989）、アンチセンスMyc（Stan tonら、Nature 310：423-425，1984）およびアンチセンスras、そしてヌクレオ チド生合成経路の任意の酵素を阻止するアンチセンス配列がある。さらに本発明 の別の実施態様において、γ−インターフェロンおよびβ−２ミクログロブリン に対するアンチセンス配列は、免疫応答を低下させるために使用される。 さらに本発明の別の実施態様において、アンチセンスRNAは強力なクラスＩ制 限応答を誘導するために使用される。簡単に説明すると、RNAに結合してこれに より特異的mRNAの翻訳を防止する以外に、高レベルの特異的アンチセンス配列は 多量の２本鎖RNAの形成のためインターフェロン（ガンマ−インターフェロンを 含む）の発現の増加を誘導すると考えられる。次にガンマ−インターフェロンの 発現は増加は、MHCクラスＩ抗原の発現を増強する。この転写で使用に好適なア ンチセンス配列には、アクチンRNA、ミオシンRNA、およびヒストンRNAがある。 アクチンRNAと不適正塩基対と形成するアンチセンスRNAは特に好ましい。 ５．リボザイム 本発明の１つの面において、宿主細胞に感染するとリボザイムを産生するアル ファウイルスベクターが提供される。簡単に説明すると、特異的RNAを切断する のにリボザイムが使用され、１つの特異的RNAのみに影響を与えるようにリボザ イムは設計される。一般的には、リボザイムの基質結合配列は10〜20ヌクレオチ ドの長さである。この配列の長さは、標的RNAとハイブリダイズし、切断されたR NAからリボザイムを解離するのに充分である。リボザイムを作成する代表例には 、米国特許第5,116,742号；5,225,337号；そして 5,246,921号に記載のものがある。本発明における使用に特に好適なリボザイム には、以下の実施例（例えば実施例18）に詳述されるものがある。 ６．蛋白と他の細胞成分 本発明の別の面において、広範な蛋白または他の細胞成分がアルファウイルス ベクター作成体に担持される。そのような蛋白の代表例には、例えばウイルス、 細菌、寄生体、またはカビ中に見いだされる未変性または変化した細胞成分、お よび外来蛋白または細胞成分がある。 （ａ）変化した細胞成分 １つの実施態様において、免疫原性で非癌原性の、変化した細胞成分の発現を 指令するアルファウイルスベクター作成体が提供される。本明細書において、「 免疫原性」とは適切な条件下で免疫応答を引き起こすことができる細胞成分を意 味する。この応答は細胞性であるが、体液性応答を含んでいてもよい。用語「非 癌原性」とは、細胞の形質転換またはヌードマウスの癌形成を誘導しない、変化 した細胞成分を意味する。用語「変化した細胞成分」とは細胞を癌原性にするこ とに関連するか、または癌原性細胞一般に関連するが細胞を癌原性にするために 必須ではない蛋白および他の細胞成分を意味する。 変化の前に、正常な細胞の増殖および制御に細胞成分が必須であり、これには 例えば、細胞内蛋白分解、転写制御、細胞サイクルの制御、および細胞−細胞相 互作用が含まれる。変化後には細胞成分はもう制御機能を果たさず、従って細胞 は制御できない増殖を示す。変化した細胞成分の代表例には、ras*，p53*，Rb* 、ウイルムズ癌遺伝子(Wilms' tumor gene)によりコードされる変化した蛋白、 ユビキチン*、ムチン*、DCC，APCおよびMCC遺伝子にコード される蛋白、乳癌遺伝子BRCA1*、およびリセプターまたはリセプター様構造（例 えば、neu、甲状腺ホルモンリセプター、血小板由来増殖因子（PDGF）リセプタ ー、インスリンリセプター、上皮増殖因子（EGF）リセプター、およびコロニー 刺激因子(CSF)リセプターがある。 本発明の１つの実施態様において、非癌原性で変化したras（ras*）遺伝子の 発現を指令するアルファウイルスベクター作成体が提供される。簡単に説明する と、ras*遺伝子は新生物性表現型に軽く結合しているため魅力的な標的であり、 確かに広範な確定癌（例えば膵臓癌、大腸癌および肺腺癌）の癌原性の誘導と維 持に必要かも知れない。さらにras*遺伝子は前新生物癌において見いだされ、従 って悪性癌の検出の前に免疫介在療法が行われる。 正常なras遺伝子は非癌原性であり、すべての動物に存在する。これは進化の 過程で高度に保存されており、細胞サイクルと正常な増殖性の維持に重要な役割 を果たすようである。正常なras遺伝子は、GTPに結合しGTPase活性を示すＧ−蛋 白であり、外部環境から細胞内部へシグナルを伝達するのに関与しており、こう して細胞が環境に応答することを可能にする。一方ras*遺伝子は、細胞の挙動を 環境から切り離してしまい、新生物細胞の制御されない増殖を導くことにより、 新生物細胞の正常な増殖制御を変化させる。ras遺伝子の突然変異は発癌性の初 期の出来事であり(Kumarら、Science 248：1101-1104，1990)、これは早期に治 療されれば癌発生を防止することができる。 ras*遺伝子は広範な癌（例えば、膵臓癌、大腸癌および肺腺癌）に存在する。 種々の癌で見られるras*遺伝子に発生する突然変異の範囲は極めて限定されて いる。これらの突然変異は、正常なオン／オフスイ ッチを構成性のオンの位置に変換することにより、ras蛋白のGTPase活性を変化 させる。ras*の癌原性突然変異は、主に３つのコドンにのみ起きる：12，13そし て61。ヒトおよび動物の癌において、コドン12の突然変異が最も多い。 以下の表１はヒトのrasを活性化するインビボの突然変異（コドン12，13およ び61）、およびインビトロの形質転換活性を有する可能性のある突然変異を要約 する。インビトロの形質転換活性を有する可能性のある突然変異は、正常のコド ンのアミノ酸の全体的な置換（例えば、12位の正常なグリシンの代わりに他のア ミノ酸が置換されている）により産生される。インビトロの突然変異はヒトや動 物で発生することは知られていないが、最終的にインビボで発生することが見い だされれば、抗癌性免疫療法の基礎となるかも知れない。 上記の変化により、新規なコード配列を含有する蛋白が産生される。これらの 配列にコードされる新規蛋白は癌原性細胞のマーカーとして使用され、これらの 新規コード領域に対する免疫応答は、変化した配列(ras*)を含有する癌原性細胞 を破壊するのに使用される。 本発明の別の実施態様において、変化した53(p53*)遺伝子の発現を指令するア ルファウイルスベクター作成体が提供される。簡単に説明すると、p53は元々形 質転換した細胞の抽出物中に発見された核リン蛋白であり、従って最初は癌遺伝 子として分類された（Linzer and Levine，Cell 17：43-52，1979；Lane and Cr awford，Nature 278：261-263，1979）。後に、元々のp53 cDNAクローンはp53の 突然変異体であることが発見された(Hindsら、J．Viirol．63：739-746，1989) 。p53は細胞サイクルを負に制御する癌抑制遺伝子であり、この遺伝子の突然変 異が癌形成につながるようである。研究された大腸癌のうち75％〜80％はp53の 両方の対立遺伝子がなくなっている（一方は欠失により、他方は点突然変異によ る）。肺癌や脳および乳癌でも同様の突然変異が見られる。 p53突然変異の多く（例えば、p53*1，p53*2など）は、アミノ酸残基130〜290 の間に集まっている（Levineら、Nature 351：453-456，1991を参照；および具 体的な突然変異をさらに詳細に説明する以下の文献も参照：Bakerら、Science 2 44：217-221，1989；Nigroら、Nature 342：705-708，1989（p53突然変異は遺伝 子の高度に保存された４つの領域に一致する「ホットスポット」に集まり、これ らの突然変異はヒトの脳癌、乳癌、肺癌および大腸癌で観察される）；Vogelste in，Nature 348：681-682，1990；Takahashiら、Science 246：491-494，1989； Iggoら、Lancet 335：675-679，1990；Jamesら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 6：2858 -2862，1989；Mackayら、Lancet 11：1384-1385，1988；Kelmanら、Blood 74：2 318-2324，1989；Malkinら、Science 250：1233-1238，1990；Bakerら、Cancer Res．50：7717-7722，1991；Chibaら、Oncogene５：1603-1610，1990（初期の非 小細胞肺癌の病因は、コドン132〜283の間のp53遺伝子の体細胞性突然変異が関 係している）；Prosserら、Oncogene５：1573-1579，1990（アミノ酸126〜224を コードするp53遺伝子の突然変異が原発性乳癌で同定された）；Cheng and Hass ，Mol．Cell．Biol．10：5502-5509，1990；Bartekら、Oncogene５：893-899，1 990；Rodriguesら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：7555-7559，1990；Menon ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：5435-5439，1990；Mulliganら、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 87：5863-5867，1990；およびRomanoら、Oncogene４：1483 -1488，1990（ヒトの骨肉腫由来細胞株HOS-SLのコドン156のp53突然変異の同定 ））。 p53遺伝子のいくつかの変化は、いくつかの特異的トキシンが原因である。例 えば、Bressacら（Nature 350：429-431，1991）は、肝細胞癌患者のコドン249 の特異的なＧからＴへの突然変異を記載している。この突然変異の示唆されてい る原因物質は、アフリカで食物汚染物質として知られている肝臓癌の癌原性物質 であるアフラトキシンＢ1である。 特に影響を受ける遺伝子の４つの領域は、残基132〜145，171〜179，239〜248 、そして272〜286である。特に興味深いこれらの領域に見いだされる３つの「ホ ットスポット」は、残基175，248そして273（Levinら、Nature 351：453-456，1 991）に存在する。これらの変化および前述の他の変化により、新規のコード配 列を含有する蛋白が産生される。これらの配列にコードされる新規蛋白は癌原性 細胞のマーカーとして使用でき、これらの新規コード配列に対 する免疫応答は、変化した配列を含有する癌原性細胞(p53*)を破壊するのに使用 される。 変化した細胞成分をコードする配列がいったん得られたら、これらの配列が非 癌原性蛋白をコードすることを確認することが必要である。種々の測定法が公知 であり、特定の細胞成分の癌原性を評価する測定法が容易に実施できる。代表的 測定法には、ラット繊維芽細胞測定法、ヌードマウスまたはラットにおける癌形 成、軟寒天中のコロニー形成、およびトランスジェニック動物（例えばトランス ジェニックマウス）の調製などがある。 ヌードマウスまたはラットにおける癌形成は、特定の細胞成分の癌原性を測定 するのに特に重要で高感度な測定法である。ヌードマウスは機能的な細胞免疫系 が欠如しており（すなわち、CTLを有さない）、従って細胞の癌原性の可能性を 調べるのに有用なインビボのモデルである。正常な非癌原性細胞は、ヌードマウ スに感染させても制御できない増殖は示さない。しかし形質転換した細胞はヌー ドマウス中で急速に増殖し、癌を発生させる。簡単に説明すると１つの実施態様 において、アルファウイルスベクター作成体は同系のマウスの細胞に投与され、 次にヌードマウスに注射される。癌の増殖を調べるために注射後２〜８週間マウ スを肉眼で観察する。また癌の存在を調べるために、マウスを屠殺して解剖して もよい（Giovanellaら、J．Natl．Cancer Inst．48：1531-1533，1972；Fursez ら、Abnormal Cells，New Products and Risk，Hopps and Petricciani編、Tiss ue Culture Association，1985；およびLevenbookら、J．Biol．Std．13：135-1 41，1985）。 癌原性はまた軟寒天中のコロニー形成を目視することによっても評価すること ができる(Macphersn and Montagnier，Vir．23：291-294，1964)。簡単に説明す ると、正常な非癌原性細胞の１つの性 質は「接触阻害」である（すなわち、細胞は隣接する細胞に接触すると増殖を止 める）。細胞を半固体寒天支持培地中に入れると、正常な細胞はすぐ接触阻害を 受けて増殖を止めるが、癌原性細胞は増殖し続け軟寒天中でコロニーを形成する 。 変化した細胞成分の癌原性を評価するのに。トランスジェニック動物（例えば トランスジェニックマウス）も使用することもできる。(Stewartら、Cell 38：6 27-637，1984；Quaifeら、Cell 48：1023-1034，1987；およびKoikeら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 86：5615-5619，1989)。トランスジェニック動物では目的 の遺伝子は、動物のすべての組織中で発現される。この突然変異遺伝子の無制御 な発現は、新たに導入された遺伝子の癌原性の可能性を調べるためのモデルとし て役に立つ。 変化した細胞成分が細胞を癌原性にすることに関係しているならば、変化した 細胞成分を非癌原性にすることが必要である。例えば１つの実施態様において、 変化した細胞成分をコードする目的の配列または遺伝子は、遺伝子生成物を非癌 原性にするために端が切り取られる。変化した細胞成分をコードする遺伝子は種 々のサイズに切り取られるが、変化した細胞成分をできるだけ保持することが好 ましい。さらに切り取りが行われても、変化した細胞成分の免疫原性配列の少な くともいくつかは無傷であることが必要である。あるいは複数の翻訳停止コドン を免疫原性領域の下流に導入してもよい。停止コドンの挿入により蛋白発現が早 期に停止され、こうして蛋白の形質転換部分の発現を防止する。 １つの実施態様において、ras*遺伝子はras*蛋白を非癌原性にするために端が 切り取られる。簡単に説明するとras*のカルボキシル末端アミノ酸は、機能的に 蛋白を細胞膜に結合させる。これらの配列の端の切り取りは、変化した細胞成分 を非癌原性にする。 好ましくはras*遺伝子はプリン環結合部位（例えば、アミノ酸番号110をコード する配列の近辺）で端が切り取られる。アルファウイルスベクター作成体により わずかに約20アミノ酸（変化したアミノ酸を含む）がコードされるようにするた にras*遺伝子の端を切り取ることができるが、できるだけ多くのアミノ酸が発現 される（非癌原性を維持しながら）ことが好ましい。 別の実施態様において、細胞成分を非癌原性にするためにp53*蛋白は端の切り 取りにより修飾される。前述のように必ずしもすべてのp53蛋白の突然変異が癌 原性ではなく、従って必ずしもすべての突然変異の端を切り取る必要はない。し かしながら好適な実施態様では、p53*はアミノ酸100〜300をコードする配列まで 端を切り取り、こしてすべての４つの主要な「ホットスポット」は含まれている 。 発癌性である他の変化した細胞成分も非癌原性にするために、その端を切り取 ることもできる。例えばneuおよびbcr/ablもこれらを非癌原性にするために端を 切り取ることができる。非癌原性は、端が切り取られた変化した細胞成分を前述 のように測定法することにより確認することができる。 しかし変化した細胞成分は非癌原性細胞一般にのみ関連していて、細胞を癌原 性にするのに必要または必須でない場合は細胞成分を非癌原性にする必要はない 。癌原性でないそのような変化した細胞成分の代表例には、Rb*、ユビキチン(ub iquitin)*そしてムチン*がある。 前述のように適当な免疫応答を作り出すために、変化した細胞成分は免疫原性 でなければならない。特定の配列の免疫原性は予測することが難しいが、Ｔ細胞 のエピトープはしばしば免疫原性で両親媒性のアルファらせん成分を有する。し かし一般に免疫原性は測定 により決めることが好ましい。代表的測定法には、新規に導入したベクターに対 する抗体の存在を検出するELISA、およびガンマインターフェロン測定法、IL− ２産生測定法、および増殖測定法のようにＴヘルパー細胞を試験する測定法があ る。 前述のように一般的な抗癌治療薬を作成するために、いくつかの異なる変化し た細胞成分を同時発現することができる。一般に種々の組合せが可能であること は当業者には明らかであろう。好適な実施態様では、この治療薬は特定の型の癌 を標的とする。例えばほとんどすべての大腸癌は、ras，p53，DCC，APCまたはMC C遺伝子に突然変異を有する。これらのいくつかの変化した細胞成分を同時発現 するアルファウイルスベクター作成体が、すべての可能な突然変異を治療するた めに大腸癌患者に投与される。この方法は他の癌の治療にも使用できる。すなわ ち、ムチン*，ras*，neu，BRCA1*、およびp53*を同時発現するアルファウイルス ベクター作成体は、乳癌の治療に使用できる。 （ｂ）外来生物または他の病原体の抗原 本発明の他の面において、外来生物または他の病原体からの抗原の免疫原性部 分の発現を指令するアルファウイルスベクター作成体が提供される。外来抗原の 代表例には、細菌性抗原（例えば、大腸菌、ストレプトコッカス、スタフィロコ ッカス、マイコバクテリウムなど）、カビ抗原、寄生体抗原、およびウイルス抗 原（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（「HIV」）、 Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ、「HAB」、「HBV」、および「 HCV」）、ヒトパピローマウイルス（「HPV」）、エプスタインバーウイルス（「 EBV」）、単純ヘルペスウイルス（「HSV」）、ハンタウイルス、TTLVＩ，HTLV I Iおよびサイトメガロウイルス（「CMV」）がある。本明細書中で使用される「免 疫原性 部分」とは、適当な条件下で免疫応答（すなわち、細胞性または体液性）を引き 起こすことができる各抗原の部分を意味する。「部分」とは種々のサイズである が、好ましくは少なくとも９アミノ酸の長さであり、完全な抗原を含有してもよ い。細胞性免疫応答は主要組織適合性抗原複合体（「MHC」）クラスＩ，MHCクラ スII、またはその両方を介する。 本発明の１つの面において、Ｂ型肝炎抗原の免疫原性部分の発現を指令するア ルファウイルスベクター作成体が提供される。簡単に説明するとＢ型肝炎のゲノ ムは、約3.2キロダルトンの長さの環状DNAよりなる（Tiollaisら、Science 213 ：406-411，1981；Tiollaisら、Nature 317：489-495，1985；およびGanem and Varmus，Ann．Rev．Biochem．56：651-693，1987；EP 0 278,940，EP 0 241,021 ，WO 88/10301、および米国特許第4,696,898号と5,024,938号も参照、これらは 参考のため本明細書に引用される）。Ｂ型肝炎ウイルスは数個の異なる抗原を示 し、特に３つのHB「Ｓ」抗原（HBsAGs）、HBc抗原(HBcAg)、HBe抗原(HBeAg)、お よびHBx抗原(HBxAg)がある（Blumら、TIG５（5）：154-158，1989を参照）。簡 単に説明すると、HBeAgはP22プレコア中間体の蛋白分解切断により得られ、細胞 から分泌される。HBeAgは血清中に17kD蛋白として存在する。HBcAgは183アミノ 酸の蛋白であり、HBxAgはサブタイプにより異なり、145〜154アミノ酸の蛋白で ある。 HBsAgs（「大」、「中」、「小」と呼ぶ）はＢ型肝炎ウイルスゲノムの３つの 領域によりコードされる：Ｓ、プレ−S2およびプレ−S1。389〜400アミノ酸の長 さを有する大蛋白はプレ−S1、プレ−S2およびＳ領域によりコードされ、グリコ シル化または非グリコシル化型で見いだされる。中蛋白は281アミノ酸の長さで 、プレ−S2とＳ領域によりコードされる。小蛋白は226アミノ酸の長さであり 、Ｓ領域によりコードされる。これは２つの型で存在する：グリコシル化（GP27s ）と非グリコシル化(P24s)。これらの領域が別々に発現されると、プレ−S1領 域は約119アミノ酸の蛋白をコードし、プレ−S2領域は約55アミノ酸の蛋白をコ ードし、そしてＳ領域は約226アミノ酸の蛋白をコードする。 当業者には明らかなように、前述のアルファウイルスベクター作成体の１つに より投与された時免疫応答を誘導するように、上記のＳ抗原の種々の免疫原性部 分を組合せることができる。さらにHBVのＳオープンリーディングフレーム（ope n reading frame）の異なる領域に見いだされる大きな免疫学的多様性のために 、特定の地域では投与のために抗原の特定の組合せが好まれる。簡単に説明する と、ヒトＢ型肝炎ウイルスＳ試料中に見いだされるエピトープは、抗原決定基「 α」と定義される。しかし互いに排他的なサブタイプ抗原決定基は、二次元２重 免疫拡散法(Ouchterlony，Progr．Allergy５：１，1958)により同定されている 。これらの抗原決定基は「ｄ」または「ｙ」、および「ｗ」または「ｒ」と命名 されている（LeBouvier，J．Infect．123：671，1971；Bancroftら、J．Immunol ．109：842，1972；およびCourouceら、Bibl．Haematol．42：1-158，1976）。 この免疫学的多様性はＢ型肝炎ウイルスＳオープンリーディングフレームの２つ の領域の単一のヌクレオチド置換に起因し、これが以下のアミノ酸変化を引き起 こす：（１）Ｂ型肝炎ウイルスＳオープンリーディングフレーム中のリジン−22 からアルギニン−160への変化は、サブタイプをｄからｙに変化させ、そして（ ２）アルギニン−160からリジンへの変化は、サブタイプをｒからｗに変化させ る。アフリカ人の間ではサブタイプaywが多く、米国や北ヨーロッパではサブタ イプadw2が多い(Holecular Biology of the Hepatitis B Virus，McLachlan編、 CRC Press，1991)。 当業者には明らかなように、投与される地域に多い特定のＢ型肝炎ウイルスサブ タイプに適切な、投与用のベクターを作成することが一般に好ましい。特定の地 域のサブタイプは、二次元２重免疫拡散法、好ましくはその地域の個人から単離 されたＢ型肝炎ウイルスのＳオープンリーディングフレームを配列決定すること により決定される。 HBVにまたは、pol（「HBV pol」），ORF5、そしてORF6抗原がある。簡単に説 明すると、HBVのポリメラーゼオープンリーディングフレームは、感染した肝臓 のウイルス粒子やコア様粒子に見いだされる逆転写酵素活性をコードする。ボリ メラーゼ蛋白は少なくとも２つのドメインよりなる：逆転写を開始する蛋白をコ ードするアミノ酸ドメインと、逆転写酵素とRNase Ｈ活性をコードするカルボキ シル末端ドメイン。HBV polの免疫原性部分は、本明細書に記載の方法（例えば 、以下および実施例12A2および13）と、下記のアルファウイルスベクター作成体 を用いて決定され、温血動物で免疫応答を生成させるために投与される。同様に ORF5とORF6のような他のHBV抗原（Millerら、Hepatology９：322-327，1989）が 、本明細書に記載のアルファウイルスベクター作成体を用いて発現される。ORF5 とORF6を用いるアルファウイルスベクター作成体の代表例は、以下の実施例に記 載されている。 前述のようにＢ型肝炎抗原の少なくとも１つの免疫原性部分が、アルファウイ ルスベクター作成体中に取り込まれる。アルファウイルスベクター作成体に取り 込まれる免疫原性部分は種々の長さであるが、一般的には少なくとも９アミノ酸 の長さであることが好ましいが全抗原を含有してもよい。特定の配列の免疫原性 を予測することは困難であるが、Ｔ細胞のエピトープは可能性のあるＴヘルパー 部位とCTL部位のコード配列をスキャンするためにTSITES（MedImm une、メリーランド）のようなコンピューター手法を用いて予測できる。この解 析から、ペプチドが合成され、インビトロの細胞毒性測定法で標的として使用さ れる。新規に導入したベクターに対する抗体の存在を検出するELISA、およびガ ンマインターフェロン測定法、IL−２産生測定法、および増殖測定法のようなＴ ヘルパー細胞を試験する測定法がある。 免疫原性部分はまた他の方法により選択される。例えば、HLA A2.1トランスジ ェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識のモデルとして有用であるこ とが証明されている。簡単に説明するとインフルエンザウイルスとＢ型肝炎ウイ ルス系では、マウスのＴ細胞リセプター群がヒトのＴ細胞により認識される抗原 決定基と同じものを認識する。両方の系においてHLA A2.1トランスジェニックマ ウスで産生されるCTL応答は、ヒトのHLA A2.1ハプロタイプのCTLにより認識され るエピトープと事実上同じエピトープに対する(Vitielloら、J．Exp．Med．173 ：1007-1015，1991；Vitielloら、Abstract of Molecular Biology of Hepatiti s B Virus Symposia，1992)。 アルファウイルスベクター作成体への導入に特に好適な免疫原性部分は、HBeA g，HBcAg、およびHBsAgs（以下の実施例10に詳述される）を含む。 Ｂ型肝炎ウイルスの追加の免疫原性部分は、コード配列を種々の位置（例えば 、BstUＩ，SspＩ，PpuM１、およびMspＩ）で端を切り取ることにより得られる（ Valenzuelaら、Nature 280：815-19，1979：Valenzuelaら、Animal Virus Genet ics：ICN/UCLA Symp．Mol．Cell Biol.，1980，B．N．Fields and R．Jaenisch 編、pp．57-70，New York：Academic）。適当な免疫原性部分を決定するさらな る方法は、以下のＣ型肝炎の項で記載される。 前述のように、アルファウイルスベクター作成体には２つ以上の免疫原性部分 が導入される。例えばアルファウイルスベクター作成体は、HBcAg，HBeAg，HBsA gs，HBxAgのすべてまたは免疫原性部分、およびHCV抗原の免疫原性部分を（別に 、または１つの作成体として）発現する。 ７．異種配列の供給源 前述の蛋白をコードする配列は、種々の供給源、例えばアメリカンタイプカル チャーコレクション（American Type Culture Collection）（ATCC、ロックヴィ ル、メリーランド州）、またはブリティッシュ・バイオテクノロジー社(British Bio-Technology Limited)(コーレイ、オックスフォード、イングランド)から容 易に得られる。代表例には、BBG12（127アミノ酸の成熟蛋白をコードするGM−CS F遺伝子を含有する）；BB6（ガンマインターフェロンをコードする配列を含有す る）；ATCC No.39656（TNFをコードする配列を含有する）；ATCC No.20663(アル ファインターフェロンをコードする配列を含有する)；ATCC No.31902および3951 7(ベータインターフェロンをコードする配列を含有する)；ATCC No.67024（イン ターロイキン−1bをコードする配列を含有する）；ATCC No.39405，39452，3951 6，39626および39673（インターロイキン−２をコードする配列を含有する）；A TCC No.59399，59398、および67326(インターロイキン−３をコードする配列を 含有する)；ATCC No.57592(インターロイキン−４をコードする配列を含有する) ；ATCC No.59394および59395(インターロイキン−５をコードする配列を含有す る)；そしてATCC No.67153(インターロイキン−６をコードする配列を含有する) がある。 前述の変化した細胞生成物をコードする配列は、種々の供給源から容易に得ら れる。例えば、変化した細胞生成物をコードする配列 を含有するプラスミドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、ロ ックヴィル、メリーランド州）のような寄託機関、またはアドバンスト・バイオ テクノロジーズ（Advanced Biotechnologies（コロンビア、メリーランド州）の ような市販の供給源から得ることもできる。前述の配列のいくつかを含有するプ ラスミドの代表例には、ATCC No.41000（rasの12番目のコドンにＧからＴへの突 然変異を含む）、およびATCC No.41049（12番目のコドンにＧからＡへの突然変 異を含む）がある。 あるいは正常な細胞成分をコードするプラスミドは、ATCCのような寄託機関か ら得られ（例えば、ATCC No.41001、正常なras蛋白をコードする配列を含む；AT CC No.57103，ablをコードする；ATCC No.59120または59121，bcr座をコードす る）、変化した細胞成分を形成するために突然変異される。特定の部位を突然変 異する方法は、公知の方法（例えば、Sambrookら、前述、15.3以下参照）を用い て容易に実施される。特にrasのような正常な細胞成分の点突然変異は、特定の コドン（例えば、コドン12，13、または61）の部位特異的突然変異により容易に 実施できる。 前述のウイルス抗原をコードする配列も同様に種々の供給源から得られる。例 えば、Ｂ型肝炎ウイルスをコードする分子的にクローン化したゲノムは、アメリ カンタイプカルチャーコレクション（ATCC、ロックヴィル、メリーランド州）の ような供給源から得られる。例えばATCC No.45020は、pBR322(Moriartyら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87：2606-2610，1981)のBamHＩ部位にＢ型肝炎の全ゲ ノムDNA(精製したDane粒子から抽出された)（Blumら、TIG５（5）：154-158，19 89の図３を参照）を含有する。 あるいは前述の異種配列をコードするcDNA配列は、配列を発現または含有する 細胞から得られる。簡単に説明すると１つの実施態様 において、目的の遺伝子を発現する細胞のmRNAは、オリゴヌクレオチドdTまたは ランダムプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写される。次にこの１本鎖cD NAを、目的の配列のいずれかの側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマ ーを用いてPCRにより増殖する（米国特許第4,683,202号；4,683,195号および4,8 00,159号を参照。PCR Technology：Principles and Applications for DNA Ampl ification，Erlich編、Stockton Press，1989も参照）。特に２本鎖DNAは、熱安 定性Taqポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、dATP，dCTP，dGTPおよびdTTP の存在下で、加熱により変性される。合成が完了すると２本鎖DNAが産生される 。このサイクルは何回も繰り返すことができ、目的のDNAが何乗培も増殖される 。 前述の蛋白をコードする配列はまた、例えばApplied Biosystems Inc．のDNA 合成機（例えば、APB DNA合成機モデル392（フォスターシティ、カリホルニア州 ）で合成することもできる。 ７．真核細胞重層ベクターイニシエーション系 前述のように本発明はまた、５’プロモーター、自立的にまたは１つまたはそ れ以上の因子に応答して細胞内で複製することができる異種ヌクレオチド配列を 発現することができる作成体（例えばアルファウイルスベクター作成体）、そし て転写停止配列よりなる、真核細胞重層ベクターイニシエーション系を提供する 。簡単に説明すると、真核細胞重層ベクターイニシエーション系は、異種ヌクレ オチド配列の発現を制御する２段階または「重層」機構を提供する。第１の層は 第２の層の転写を開始し、５’プロモーター、転写停止部位、および１つまたは それ以上のスプライス部位と、必要であればポリアデニル化部位よりなる。この 点で使用に適したプロモーターの代表例には、任意の細胞性プロモーター（例え ば、CMV、レトロウイルスLTR，SV40、β−アクチン、免疫グロブリンプロモー ター）、および誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターや グルココルチコイドプロモーター）がある。第２の層は１つまたはそれ以上の異 種ヌクレオチド配列を発現することができ、自律的にまたは１つまたはそれ以上 の因子に応答して細胞中で複製することができる作成体よりなる。１つの実施態 様において、作成体は前述のシンドビスcDNAベクター作成体でもよい。 真核細胞重層ベクターイニシエーション系では、以下のウイルスから開発され るウイルス性ベクター作成体を含む、広範な他のcDNAおよびDNAベクター作成体 が使用できる：ポリオウイルス（Evansら、Nature 339：385-388，1989；および Sabin，J．Biol．Standardization１：115-118，1973）；ライノウイルス；カナ リア痘ウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Fisher-H ochら、PNAS 86：317-321，1989；Flexnerら、Ann．N．Y．Acad．Sci．569：86- 103，1989；Flexnerら、Vaccine８：17-21，1990：米国特許第4,603,112号、4,7 69,330号および5,017,487号；WO 89/01973）；SV40（Mulliganら、Nature 277： 108-114，1979）：レトロウイルス（米国特許第4,777,127号、GB 2,200,651，EP 0,345,242およびWO 91/02805）；インフルエンザウイルス（Luytjesら、Cell 5 9：1107-1113，1989；McMichealら、N．Eng．J．Med．309：13-17，1983；およ びYapら、Nature 273：238-239，1978）；アデノウイルス（Berkner，Biotechni ques６：616-627，1988；Rosenfeldら、Science 252：431-434，1991）；アデノ 関連ウイルスのようなパーボウイルス（parvovirus）（Samulskiら、J．Vir．63 ：3822-3828，1989；Mendelsonら、Virol．166：154-165，1988；PA 7/222,684 ）；ヘルペス（Kit，Adv．Exp．Med．Biol．215：219-236，1989）；SV40；HIV （Poznansky，J．Virol．65：532-536，1991）；麻疹（EP 0,440,219）；アスト ロウイルス（ Munroeら、J．Vir．67：3611-3614，1993）；セムリキ森林ウイルスおよびコロ ナウイルス、および他のウイルス系（例えば、EP 0,440,219；WO 92/06693；米 国特許第5,166,057号）。 前述のように本発明の１つの実施態様において、真正の５’末端でアルファウ イルスのインビトロ転写を開始することができる５’配列、アルファウイルスの 転写を開始ことができる５’配列、アルファウイルス非構造蛋白をコードするヌ クレオチド配列、ウイルス結合領域、異種ヌクレオチド配列、アルファウイルス RNAポリメラーゼ認識配列、およびポリアデニル酸配列よりなる、真核細胞重層 ベクターイニシエーション系が提供される。アルファウイルスcDNAベクター作成 体のインビトロ転写に引き続いて、得られるアルファウイルスRNAベクター分子 は、アルファウイルスの転写を開始することができる５’配列、アルファウイル ス非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、ウイルス結合領域、異種ヌクレオ チド配列、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列およびポリアデニル酸配 列よりなる。 本発明の別の面において、温血動物に真核細胞重層ベクターイニシエーション 系を投与する工程よりなる、温血動物に異種ヌクレオチド配列を送達する方法が 提供される。真核細胞重層ベクターイニシエーション系は温血動物に、直接（例 えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経口、直腸内、眼内、鼻腔内）に、また はリポフェクション(lipofection)のような種々の物理的方法(Felgnerら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84：7413-7417，1989)、直接DNA注射（Acsadiら、Natu re 352：815-818，1991）；微小発射体衝撃（microprojectile bombardment）（ Williamsら、PNAS 88：2726-2730，1991）；数種の型のリポソーム（例えば、Wa ngら、PNAS 84：7851-7855，1987を参照）；CaPO4（Dubenskyら、PNAS 81：7529 -753 3，1984）；DNAリガンド（Wuら、J．of Biol．Chem．264：16895-16897，1989） ；核酸単独の投与（WO 90/11092）；または死滅したアデノウイルスに結合したD NAの投与（Curielら、Hum．Gene Ther．３：147-154，1992）；ポリリジン、リ セプター特異的リガンドとしてのポリ陽イオン化合物；およびソラレン不活性化 ウイルス（例えばセンダイウイルスまたはアデノウイルス）により投与される。 真核細胞重層ベクターイニシエーション系は、特異的免疫応答を刺激するため に；薬剤と宿主細胞リセプターとの相互作用を阻害するために；毒性緩和剤（例 えば、条件性毒性緩和剤）を発現するために；免疫系を制御するために；マーカ ーを発現するために、そして置換遺伝子療法のために、温血動物に投与すること もできる。これらおよび他の用途はさらに詳細に以下に記載される。 Ｇ．シンドビスパッケージング細胞株 本発明のさらなる実施態様において、アルファウイルスパッケージング細胞株 が提供される。特に本発明の１つの面において、安定に組み込まれた発現ベクタ ーからウイルス構造蛋白がトランスに供給される、アルファウイルスパッケージ ング細胞株が提供される。アルファウイルスベクターRNA転写体の以後のトラン スフェクションまたは感染は、アルファウイルスベクター産生細胞株を作り出す 。例えば、本発明の１つの実施態様において、目的の遺伝子をコードするcDNAク ローンとアルファウイルス非構造蛋白から転写するために、T6インビトロRNAポ リメラーゼ系を用いて、まずアルファウイルスRNAベクター分子が産生される。 このベクターRNAは次に、アルファウイルスパッケージング細胞株にトランスフ ェクションされ、ここでRNA転写体は高レベルに複製し、次にウイルス構造蛋白 によりパッケージングされて、感染性ウイルス粒子を与える。アルファウイルス cDNA分子は長いため、インビトロの転写反応は非効率 的である。さらにシャーレ中のわずか１％〜10％の細胞がトランスフェクション されるのみである。従ってベクター産生細胞株の効率と力価を最適化するために 、２つの連続的工程が行われる。これを行うために、まずベクターを一次アルフ ァウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションする。次にこのトラン スフェクションした細胞株は、培養上澄液中に低力価の感染性ウイルス粒子を産 生する。次にこれらの感染性上澄液を用いてアルファウイルスパッケージング細 胞の単層を形質導入する。パッケージング細胞株へのアルファウイルスベクター の感染は、RNAの移動効率が高いことと細胞内にベクターが最適化されて入れら れるためトランスフェクションより好ましい。この２段階アプローチにより、パ ッケージングされた感染性組換えシンドビスウイルスベクターのより高い発現と より高い力価が得られる。 本発明のいくつかの実施態様において、細胞株はアルファウイルスベクターの 付着のための細胞性リセプターを阻止する細胞性エンベロープ蛋自の産生が増加 しているため、アルファウイルス粒子は同じパッケージング細胞株を形質導入し ない。そのような場合アルファウイルスパッケージング細胞に感染することがで きる第２の型のアルファウイルス粒子が作成される。インビトロで転写したアル ファウイルスRNAベクター転写体でトランスフェクションされた結果一時的なウ イルス粒子を産生するめ「ホッピング細胞株」として知られているパッケージン グ細胞株により、この第２の型のウイルス粒子は産生されなければならない。こ のホッピング細胞株は、疑タイピング(pseudo-typing)と呼ばれる工程でアルフ ァウイルスベクターを、異なる細胞リセプターに再指向させるアルファウイルス エンベロープ蛋白を提供することにより一時的に産生されたウイルス粒子の親和 性を再指向させるように作成される。現在アルファウ イルスベクター粒子の疑タイピングのために２つのアプローチが作成されている 。最初のアプローチは、水胞性口内炎ウイルス−Ｇ蛋白（VSV-Ｇ）を同時発現す るアルファウイルスパッケージング細胞株（前述）よりなる。このVSV-Ｇ疑タイ ピングは広範な細胞株を感染することが証明されている(Marsh，Adv．Virus Res ．36：107-151，1989)。しかしタイピングされたアルファウイルスベクター粒子 を産生する第２のアプローチは、レトロウイルスパッケージング配列を含有する アルファウイルスRNAベクターをパッケージングすることができるレトロウイル スgag/polとenv配列を含有するレトロウイルスパッケージング細胞株(例えば、W O 92/05266)を使用することである。 本発明の別の面において、自己複製する能力を維持するアルファウイルスベク ターRNA分子を産生するために、安定に取り込まれたアルファウイルスDNA発現ベ クターが使用される。取り込まれたDNAは変化していないRNAベクターを構成的に （constitutively）発現するため、このアプローチは培養の長期間にわたって高 い発現レベルを維持するのに有用であるかも知れない。この形状ではSP6RNAポリ メラーゼ認識部位を含有するプラスミドからあらかじめ転写されたベクターは、 使用される親細胞株に規定される適切なプロモーター配列で置換される。このプ ラスミド配列はまた、パッケージング細胞株を作成するために使用されるものと は異なる選択マーカーを含有してもよい。この形状では前述したように、DNAを ベースにしたアルファウイルスベクターはトランスフェクションによりパッケー ジング細胞株に導入され、次に最大の力価を示す細胞株に希釈クローニングされ る。 １．自殺ベクター 本発明の１つのさらなる面は、パッケージング／プロデューサー 細胞株中の野生型アルファウイルスの拡散を制限するためのアルファウイルス自 殺ベクターの発現に関する。簡単に説明すると１つの実施態様において、アルフ ァウイルス自殺ベクターは、ベクターの結合領域の３’配列とパッケージング細 胞株発現ベクターの５’アルファウイルス構造配列の間のRNA組換えにより産生 される、野生型アルファウイルス配列に特異的なアンチセンスまたはリボザイム 配列よりなるであろう。アンチセンスまたはリボザイム配列は特異的組換え配列 の存在下でのみ熱安定性があり、アルファウイルスパッケージング／プロデュー サー細胞株には他の影響はないであろう。あるいは毒性分子（前述のようなもの ）を、野生型アルファウイルスの存在下でのみ発現するであろうベクターの中で 発現してもよい。 ２．転移癌の進展を防止するためのアルファウイルスベクター 本発明の１つのさらなる面は、悪性新生物の侵襲性を阻害または低下させるた めのアルファウイルスベクターの使用に関する。簡単に説明すると悪性の程度は 典型的には癌の血管新生に関連する。癌の血管新生の１つの原因は、いくつかの 癌により発現される可溶性の癌血管形成因子(TAF)の産生である（Paweletzら、C rit．Rev．Oncol．Hematol．９：197，1989）。本発明の１つの面において、癌 の血管新生は、TAFに特異的なアンチセンスまたはリボザイムRNA分子を発現する アルファウイルスベクターを用いて遅らせることができる。あるいは癌の血管新 生を遅らせるかまたは阻害するために、抗血管新生因子（Mosesら、Science 248 ：1408，1990；Shapiroら、PNAS 84：2238，1987）を単独か、または前述のリボ ザイムまたはアンチセンスと組合せて発現することができる。あるいは周囲の組 織のTAFリセプターに特異的な抗体を発現させるために、アルファウイルスを使 用することもできる。 Ｈ．アルファウイルスベクターの使用法 １．免疫刺激 本発明の１つの面において、感染性、癌性、自己免疫性または免疫疾患を防止 、阻害、安定化または逆転写するすることができるアルファウイルスベクター作 成体の投与のための組成物と方法が提供される。このような疾患の代表例には、 HIV，HBV，HTLVＩ，HTLV II，CMV，EBV、およびHPVのような感染症、メラノーマ 、糖尿病、移植片対宿主反応疾患、アルツハイマー病および心臓疾患などがある 。 さらに詳しくは本発明の１つの面において、病原体が死滅または阻害されるよ うに、病原体に対する免疫応答（体液性または細胞性）を刺激するための組成物 と方法が提供される。病原体の代表例には、細菌、カビ、寄生体、ウイルスおよ び癌細胞がある。 本発明の１つの実施態様において、病原体はウイルスであり、（１）ウイルス 抗原に対する免疫応答を開始させるか、または（２）ウイルスの相互作用に必要 な細胞リセプターを占有することによりウイルスの拡散を防止するすることがで きる感受性のある標的細胞に、ベクター作成体を指向させるように設計された組 換えアルファウイルス粒子を用いることにより、特異的免疫応答を刺激しそして ウイルスの拡散を阻害するための方法が提供される。ベクターの核酸にコードさ れた蛋白の発現は一時的であるか、または時間が経過しても安定化である。病原 体抗原に対する免疫応答が刺激される場合、組換えアルファウイルスは好ましく は、免疫応答を刺激しかつ未変性の抗原に対して病原性が低下している、修飾さ れた型の抗原を発現するように設計される。この免疫応答は細胞が正しい方法、 すなわち、MHCクラスＩおよび／またはII分子とCD3，ICAM-１，ICAM−２，LFA- １、またはこれらの類似体のような付属分子とともに 抗原を指示するとき達成される（例えば、Altmanら、Nature 338：512，1989） 。アルファウイルスベクターで感染した細胞は真のウイルス感染を厳密に模倣し 、そしてこれらは、（ａ）複製していない細胞に感染することができ、（ｂ）宿 主細胞ゲノム内に取り込まれなく、（ｃ）いかなる致死的疾患にも関係がなく、 そして（ｄ）高レベルの異種蛋白を発現するため、アルファウイルスベクターで 感染した細胞は前記免疫応答を効率的に行うことが予想される。これらの違いの ために、アルファウイルスベクターはワクチンとしての利用のための健常人に対 して安全なウイルスベクターとして容易に考えられる。 提示細胞が完全に生存しており、健康であり、異種遺伝子に比較して低レベル のウイルス抗原が発現されるという点で、本発明のこの面は同様に機能すると予 想される他の系に対してさらなる利点を有する。発現される抗原性エピトープは 、抗原の遺伝子のサブ断片の組換えアルファウイルスへの選択的クローニングに より変更でき、従って他の場合には免疫原性が優勢なエピトープに隠されてしま う免疫原性エピトープに対する応答が得られるため、これは顕著な利点を有する 。このようなアプローチは複数のエピトープ（このエピトープの１つまたはそれ 以上は、異なる蛋白由来である）を有するペプチドの発現に拡張することができ る。さらに本発明のこの面は、細胞内合成およびこれらのペプチド断片とMHCク ラスＩ分子との会合を介する、抗原性エピトープおよび遺伝子のサブ断片にコー ドされる抗原のペプチド断片に対する細胞毒性Ｔリンパ球(CTL)の効率的な刺激 を可能にする。このアプローチはCTL誘導のための主要な免疫優勢エピトープを マッピングするのに利用できる。 目的の抗原を認識する特異的Ｔ細胞リセプターの遺伝子（必要な場合は適切な MHC分子を用いて）、目的の抗原を認識する免疫グロ ブリンの遺伝子、またはMHCの非存在下でCTL応答を与える２つのハイブリッドの うちの１つの遺伝子を、適当な免疫細胞（例えばＴリンパ球）に移動させること によっても、免疫応答を達成することができる。すなわち組換えアルファウイル ス感染細胞は、免疫刺激剤、免疫調節剤またはワクチンとして使用できる。 本発明の別の実施態様において、アルファウイルスベクターが、ウイルスの集 合を阻害する欠陥のある妨害性ウイルス構造蛋白を送達または発現する、阻害剤 緩和剤を産生するための方法が提供される。このようなベクターは、欠陥のある gag，pol，envまたは他のウイルス粒子蛋白またはペプチドをコードし、ウイル ス粒子の集合を主体に阻害する。これは、ウイルス粒子の正常なサブユニットの 相互作用が欠陥のあるサブユニットとの相互作用により乱されるために発生する 。 本発明の別の実施態様において、ウイルスプロテアーゼに特異的な阻害性ペプ チドまたは蛋白の発現方法が提供される。簡単に説明すると、ウイルスプロテア ーゼはウイルス性gag、およびgag/pol蛋白をいくつかの小さいペプチドに切断す る。この切断がないと、すべての場合に感染性レトロウイルス粒子の産生が完全 に阻害される。例としてHIVプロテアーゼはアスパルチルプロテアーゼとして知 られており、これらは蛋白または類似体からのアミノ酸から作成されるペプチド により阻害されることが知られている。HIVを阻害するベクターは、このような ペプチド阻害剤の１つまたは複数の融合したコピーを発現する。 別の実施態様は、細胞型の中で欠失、突然変異または発現されない時、その細 胞型の中で癌原性による抑制遺伝子の送達に関する。ウイルスベクターによる欠 失した遺伝子の再導入により、これらの細胞の癌表現型は退縮する。このような 癌の例は網膜芽細胞腫とWi lms癌である。いくつかの悪性腫瘍は、細胞増殖に比較して末端分化の阻害、ア ルファウイルスベクター送達の阻害、そして癌の分化または一般的には退縮へつ ながる遺伝子生成物の発現の阻害であると考えられている。 さらに別の実施態様において、アルファウイルスベクターは、病原性機能に対 応するRNA分子を切断従って不活性化するリボザイム（RNA酵素）をコードするこ とにより治療効果を提供する（Haseloff and Gerlach，Nature 334：585，1989 ）。リボザイムは標的RNA中の特異的配列を認識することにより機能し、この配 列は通常12〜17塩基対であるため、これはRNAまたはレトロウイルスゲノムのよ うな特定のRNA種を認識することができる。 ある場合には、これを条件的毒性緩和剤とすることにより追加の特異性が達成 される（後述）。 阻害性緩和剤の効果を上昇させる１つの方法は、問題のウイルスにより耐性細 胞の感染の可能性を上昇させる遺伝子の発現とともに、ウイルス性阻害性遺伝子 を発現することである。その結果は、増殖性感染に競合する非競合的「行き止ま り」である。HIVの具体例では、HIV複製を（前述のアンチセンスtatなどを発現 することにより）阻害し、かつCD4のような感染に必要な蛋白を過剰に発現する ベクターが送達される。こうして比較的少数のベクター感染HIV耐性細胞は、遊 離のウイルスまたはウイルスの感染した細胞による多数の非増殖性融合の「巣」 または「磁石」として作用する。 ２．ブロッキング剤 多くの感染性疾患、癌、自己免疫疾患、および他の疾患には、ウイルス粒子と 細胞、細胞と細胞、または細胞と因子の相互作用が関与する。ウイルス感染では 、ウイルスは普通感受性のある細胞表面のリセプターを介して細胞に入る。癌で は、細胞は他の細胞または 因子からのシグナルに不適当に応答するかまたはまったく応答しない。自己免疫 疾患では、「自己」マーカーが不適切に認識される。本発明においてそのような 相互作用は、相互作用のいずれかの相手に対する類似体をインビボで産生するこ とによりブロックされる。 このブロック作用は細胞内、細胞膜上、または細胞外で起きる。ブロッキング 剤を有するウイルス（特にアルファウイルスベクター）のブロッキング作用は、 感受性細胞の内部から、または病原性相互作用を局所的にブロックするブロック 蛋白の一種を分泌することにより介在される。 HIVの場合、相互作用の２つの物質はgp120/gp41エンベロープ蛋白とCD4リセプ ター分子である。すなわち適当なブロッカーは、病原作用を示さずHIVの侵入を ブロックするHIV env類似体か、またはCD4リセプター類似体を発現するベクター 作成体であろう。CD4類似体は隣接の細胞を保護するように分泌され機能し、gp1 20/gp41はベクター含有細胞のみを保護するように、分泌されるかまたは細胞内 でのみ産生される。安定性を上げるかまたは補体溶解性を向上させるために、CD 4に免疫グロブリン重鎖かまたは他の成分を加えることが有利である。そのよう なハイブリッド可溶性CD4をコードするアルファウイルスベクターの宿主への送 達により、安定なハイブリッド分子が連続的に供給される。治療の効果は、抗体 レベル、ウイルス抗原産生、感染性HIVレベル、または非特異的感染のレベルな どの、疾患進行の通常の指標を測定することにより測定できる。 ３．緩和剤の発現 病原体または遺伝子の機能を阻害することができる物質（すなわち「緩和剤」 ）の発現を指令することができるベクター作成体により組換えアルファウイルス を産生するのに、前述の方法と類似の方 法を使用することができる。本発明において「機能を阻害することができる」と は、緩和剤は直接機能を阻害するか、または例えば細胞中に存在する物質を、通 常は病原体の機能を阻害しないものから機能を阻害するものに交換することによ り間接的に阻害することを意味する。ウイルス疾患のそのような例には、吸収、 複製、遺伝子発現、集合、および感染細胞からのウイルスの排出がある。癌性細 胞または癌促進性増殖因子に関するそのような機能の例には、生存性(viability )、細胞複製、外部シグナルに対する感受性の変化（例えば、接触阻害）、およ び産生の欠如または抗癌遺伝子蛋白の突然変異型の産生がある。 （ａ）阻害緩和剤 本発明の１つの面において、アルファウイルスベクター作成体は、例えばウイ ルス疾患または悪性腫瘍疾患における病原体の機能を妨害する遺伝子の発現を指 令する。そのような発現は基本的に連続的であるか、または細胞中の病状または 特定の細胞型（「同定物質」）に関連する他の物質の存在に応答して起きる。さ らにベクターの送達は、前述したようにベクターの侵入を具体的に目的の細胞型 （例えば、ベクター感染細胞または悪性腫瘍細胞）にターゲティングすることに より制御される。 投与の１つの方法は白血球伝達（leukophresis）であり、ここでは個人の約20 ％のPBLが取り出され、インビトロで操作される。すなわち約２×109個の細胞が 治療され置換される。繰り返し治療も行われる。あるいは骨髄が治療され、前述 のように増殖される。さらにベクターを産生するパッケージング細胞株は対象者 に直接注射され、組換えウイルス粒子が連続的に産生される。 １つの実施態様において、主要な病原体遺伝子転写体の蛋白への翻訳を阻害（ 例えば、HIV tat蛋白の翻訳の阻害）ために、そのよ うな病原体遺伝子転写体（例えば、ウイルス遺伝子生成物または活性化細胞性癌 遺伝子）に相補的なRNAを発現するアルファウイルスベクターが使用される。こ の蛋白の発現はウイルス複製に必須であるため、ベクターを含有する細胞はHIV 複製に耐性であろう。 病原体はパッケージングシグナルを有す１本鎖ウイルスである２つめの実施態 様において、ウイルスパッケージングシグナル（例えば、緩和剤がHIVに対する 時はHIVパッケージングシグナル）に相補的なRNAが発現され、その結果これらの 分子とウイルスパッケージングシグナルとの会合は、レトロウイルスの場合はア ルファウイルスRNAゲノムの正しいカプシッド化(encapsidation)または複製に必 要な、幹ループ形成またはtRNAプライマー結合を阻害する。 ３つめの実施態様において、病原体遺伝子の発現を選択的に阻害することがで きる緩和剤、または病原体により産生される蛋白の活性を阻害することができる 緩和剤を発現するアルファウイルスベクターが導入される。HIVの場合１つの例 は、HIV LTRからの発現をトランス活性化する能力が欠如しており、tat蛋白の正 常な機能を（トランスドミナントに）妨害する突然変異tat蛋白である。このよ うな突然変異体はHTLV II tat蛋白と同定された（「Ｘ II Leu5」突然変異体；W achsmanら、Science 235：674，1987を参照）。突然変異体のトランスリプレッ サーtatは、HSV-１で類似の突然変異体リプレッサーについて示されたように複 製を阻害するはずである（Friedmanら、Nature 335：452，1988）。 このような転写リプレッサー蛋白は、その発現がウイルス特異的トランス活性 化蛋白（前述）により刺激される、ウイルス特異的転写プロモーターを用いて組 織培養で選択される。HIVの具体的なケースでは、HIV tat蛋白を発現する細胞株 とHIVプロモーターに支配されるHSVTK遺伝子は、ACVの存在下で死滅する。しか しもしこ の系に一連の突然変異したtat遺伝子が導入されるなら、適切な性質（すなわち 、野生型tatの存在下でHIVプロモーターからの転写を抑制する）を有する突然変 異体が増殖し選択されるであろう。次にこの突然変異遺伝子はこれらの細胞株か ら単離される。生存している細胞クローンはこれらの遺伝子の内因性突然変異に より引き起こされるのではないことを確認するために、条件的に致死的ベクター ／tat系の複数のコピーを含有する細胞株を使用することができる。次に「レス キューが可能な」アルファウイルスベクター（すなわち、突然変異tat蛋白を発 現し、細菌内での増殖と選択のために細胞由来の複製および薬剤耐性マーカーを 含有するもの）を用いて、これらの細胞に一群のランダムに突然変異したtat遺 伝子が導入される。これにより多数のランダム突然変異を評価することができ、 目的の突然変異細胞株の以後の分子クローニングが容易になる。この方法は、抗 ウイルス療法の可能性のための種々のウイルス性転写アクチベータ／ウイルスプ ロモーター系における突然変異を同定し利用するために使用できる。 ４．条件的毒性緩和剤 病原体を阻害する別のアプローチは、病原性条件を発現する細胞にとって毒性 の緩和剤を発現することである。この場合ベクターからの緩和剤の発現は、非病 原性細胞の破壊を避けるために、病原体に関連した物質（例えば特異的ウイルス RNA配列）の存在により制限される。 この方法の１つの実施態様において、組換えアルファウイルスベクターは、細 胞特異的応答性ベクターから発現される毒性遺伝子（前述）を含有するベクター 作成体を含有する。この方法で、細胞特異的応答性ベクターを活性化することが できるRNA配列を含有する、急速に複製している細胞は、アルファウイルスベク ター作成体に より産生される細胞毒性物質により優先的に破壊される。 前記の実施態様と同様の方法で、アルファウイルスベクター作成体はリン酸化 、ホスホリボシル化、リボシル化、またはプリン−またはピリミジン−ベースの 薬剤の他の代謝のための遺伝子を有することができる。この遺伝子は哺乳動物に 類似体がなくてもよく、またウイルス、細菌、または原性動物のような微生物由 来でもよい。この１つの例は、チオキサンチンの存在下で致死的である、大腸菌 のグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子生成物である（Besnardら 、Mol．Cell．Biol．７：4139-4141，1987）。この型の条件的致死的遺伝子生成 物（前述のように「プロドラッグ」とも呼ぶ）は、多くの公知のプリン−または ピリミジン−ベースの抗癌剤への用途を有し、有効な細胞毒性物質であるために しばしば細胞内リボシル化またはリン酸化を必要とする。この条件的致死的遺伝 子生成物はまた、プリンまたはピリミジン類似体ではない非毒性薬剤を細胞毒性 型に代謝する（Searleら、Brit．J．Cancer 53：377-384，1986）。 一般的に哺乳動物ウイルスは、他のウイルスプロモーター成分からの以後の転 写活性化に必要な「極初期」（“immediate early”）遺伝子を有することが多 い。この性質を有するRNA配列は、ウイルス感染のアルファウイルスベクター細 胞シグナル（または「同定物質」）を活性化するための優れた候補である。すな わち、これらのウイルス性「極初期」遺伝子生成物に応答するアルファウイルス 細胞特異的ベクターから発現される条件的致死的遺伝子は、任意の特定のウイル スに感染された細胞を死滅させるであろう。さらにヒトαおよびβインターフェ ロンプロモーター成分は、広範な非関連ウイルスにより転写的に活性化されるた め、インターフェロン産生に応答してHSVTKのような条件的致死的遺伝子生成物 を発現するベ クターの導入により、種々の異なるウイルスに感染した細胞が破壊される。 本発明の別の面において、組換えアルファウイルスウイルスベクターは、他の 場合には不活性な前駆体を病原体の活性な阻害剤に活性化することができる、遺 伝子生成物の発現を指令するベクター作成体を有する。例えばHSVTK遺伝子生成 物は、AZTやddCのような抗ウイルス活性の可能性のあるヌクレオチド類似体をよ り有効に代謝するために使用される。HSVTK遺伝子は細胞特異的応答性ベクター の制御下で発現され、これらの細胞型に導入される。AZT（および他のヌクレオ シド抗ウイルス剤）はレトロウイルス逆転写酵素を特異的に阻害し、従ってHIV 複製を特異的に阻害するために、細胞性機構によりヌクレオチド三リン酸型に代 謝されなければならない(Furmamら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：8333-833 7，1986)。HSVTK（非常に広い基質特異性を有するヌクレオシドおよびヌクレオ シドキナーゼ）の構成的（constitutive）発現により、これらの薬剤はより有効 にその生物活性のある三リン酸型に代謝される。従ってAZTまたはddC療法は、よ り効果的であり、投与量は少なく、全身への毒性は低く、増殖性感染に対して高 い力価を有する。そのヌクレオシド三リン酸型がレトロウイルス逆転写酵素に対 して選択性を示すが、細胞性ヌクレオシドおよびヌクレオシドキナーゼの基質特 異性の結果リン酸化されない追加のヌクレオシド類似体は、より効果的にするこ とができるであろう。 これらの抗ウイルスベクターのヒトＴ細胞およびマクロファージ／単球細胞株 への投与は、レトロウイルスベクター治療のない同じ細胞より、AZTやddCの存在 下でHIVに対して耐性を上昇させる。AZTによる治療は毒性の副作用を避けるため 通常より低濃度であるが、それでもHIVの増殖を有効に阻害する。治療のコース はブロッ カーについて前述したものと同様である。 １つの実施態様において、組換えアルファウイルスベクターは、それ自身毒性 はないが、ウイルスまたは他の病原体に特異的なプロテアーゼのような蛋白によ り処理または修飾されると毒性型に変換される生成物を規定する遺伝子を含有す る。例えば組換えアルファウイルスは、リシンＡ鎖のプロ蛋白をコードする遺伝 子を含有するが、これはHIVプロテアーゼによる処理により毒性になる。さらに 詳しくは、毒素リシンまたはジフテリアＡ鎖の合成的に不活性なプロ蛋白型は、 HIVにコードされたプロテアーゼが認識し易いように再配置し、適当な「プロ」 成分を切り離すことにより、活性型に切断することができる。 別の実施態様において、アルファウイルスベクターは、細胞内の同定物質の存 在（例えば、ウイルス遺伝子の発現）に応答して標的細胞の表面に「レポーティ ング生成物」を発現する。この表面蛋白は、レポーティング蛋白または細胞毒性 Ｔ細胞のような細胞毒性物質により認識される。同様にこのような系は、同定蛋 白を発現する特定の遺伝子を有することれらの細胞を単純に同定するための検出 系（後述）として使用できる。 同様に別の実施態様において、それ自身が治療的に有効である表面蛋白が発現 される。HIVの特定の場合に、HIV感染細胞中に特異的にヒトCD4蛋白が発現され ることは２つの意味で有益である： １．可溶性CD4が遊離のウイルスについて阻害することが証明されているよう に、細胞内でのHIV envへのCD4の結合は、生存活性のあるウイルス粒子の形成を 阻害するが、この蛋白は膜に結合したままであり構造的に内因性CD4(患者はこれ には免疫学的に寛容（tolerant）である)と同じであるため、全身性のクリアラ ンスおよび免疫原性の問題はない。 ２．CD4/HIV複合体は細胞死の原因であるとされているため、（HIV感染細胞中 の過剰のHIV-envの存在下で）CD4の追加の発現はさらに急速な細胞の死を引き起 こし、従ってウイルス拡散を防止する。これは特に、HIV誘導細胞毒性に対して 比較的耐性がある結果（これは細胞表面にCD4が比較的少ないためである）ウイ ルス産生の受け器として作用する単球やマクロファージに特に応用できる。 別の実施態様において、アルファウイルスベクターは、ベクターに感染した細 胞の生存性に必須のRNA分子を切断し不活性化するリボザイムをコードする。リ ボザイム産生を病原性の状態(例えば、HIV tat)に対応して特定のRNA配列に依存 するようにすることにより、毒性が病原性状態に特異的になる。 ５．マーカーの発現 特異的RNA配列に応答して細胞中の緩和剤を発現する前述の方法は、同定蛋白 を発現する細胞中で特定の遺伝子（例えば、特定のウイルスが有する遺伝子）を 検出できるように、従ってそのウイルスを有する細胞を検出できるように修飾す ることもできる。さらにこの方法は、ウイルスに関連する同定蛋白を有する細胞 の臨床試料中のウイルス(例えば、HIV)の検出を可能にする。 感染細胞中で同定蛋白の存在に応答するアルファウイルスベクター中で、その 存在が容易に同定される生成物（「マーカー生成物」）をコードするゲノムを提 供することにより、この修飾は容易に実施される。例えば、HIVは適当な細胞に 感染するとき、tatとrevを作る。この指示細胞は、tatおよび／またはrevRNA転 写体による活性化によって、組換えアルファウイルスにより発現されるマーカー 遺伝子（例えばアリカル性ホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、また はルシフェラーゼ遺伝子）をコードするゲノム（例えば、適当な組換えアルファ ウイルスによる感染）に与えられる。 β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼの場合、細胞を基質類似 体に接触させると、試料がHIV陽性の場合は色または蛍光が変化する。ルシフェ ラーゼの場合は試料をルシフェリンに接触させることにより、試料がHIV陽性の 場合発光する。β−ガラクトシダーゼのような細胞内酵素の場合、着色細胞また は蛍光細胞を計測するか、または細胞抽出物を作成して適切な測定法を行うこと により、ウイルスの力価を直接測定することができる。膜結合型のアルカリ性ホ スファターゼの場合、蛍光性基質を用いて細胞表面で酵素測定法を行うことによ りウイルスの力価を測定することができる。分泌された酵素（例えば操作された 型のアルカリ性ホスファターゼ）については、少量の培養上澄液の活性を測定す ることにより、単一の培養の経時変化を追跡できる。すなわち異なる目的に異な る型のこのマーカー系を使用することができる。これらには活性のあるウイルス の計測、培養中のウイルスの増殖の単純な測定、そして種々の薬剤によるこの増 殖の阻害を含む。 このウイルスに対する中和抗体の存在下または非存在下で、ウイルスの存在を 試験することにより、前記の系にさらなる特異性を与えることができる。例えば 試験する臨床試料の一部については中和抗体が存在するが、別の部分では中和抗 体がまったく存在しないこともある。抗体があるところでこの試験が陰性であり 、抗体がないところで試験が陽性の場合、これはHIVの存在を確認する補助にな る。 インビトロ測定法の類似の系で、特定の遺伝子（例えばウイルス遺伝子）の存 在は、細胞試料で測定される。この場合試料の細胞は、適当なウイルスRNA転写 体の存在下でのみ発現されるレポーター遺伝子を有する適当なアルファウイルス ベクターで感染させる。レポーター遺伝子は試料細胞に入った後、宿主細胞が適 当なウイルス 蛋白を発現する場合のみ、レポーター生成物（例えばβ−ガラクトシダーゼまた はルシフェラーゼ）を発現する。 レポーター遺伝子は存在する同定物質よりもより多くのレポーター生成物を発 現し、増幅効果が得られるため、これらの測定法はより迅速で好感度である。 ６．免疫ダウンレギュレーション 簡単に前述したように、本発明はアルファウイルスに感染した標的細胞中の免 疫系の１つまたはそれ以上の成分を抑制することができるベクター作成体を有す る組換えアルファウイルスを提供する。 簡単に説明すると、不適当なまたは好ましくない免疫応答（例えば慢性肝炎、 または骨髄のような異種組織の移植）の特異的ダウンレギュレーションは、移植 (MHC)抗原の表面発現を抑制する免疫抑制性ウイルス遺伝子生成物を用いて操作 できる。Ｃ群アデノウイルスAd2とAd5は、ウイルスのE3領域にコードされる19kd 糖蛋白（gp19）を有する。このgp19分子は細胞の小胞体中のクラスＩMHC分子に 結合し、細胞表面に対するクラスＩMHCの末端グリコシル化と細胞表面への移動 を防止する。このドナー細胞の移植の移植片拒絶の危険性は小さく、移植患者の 免疫抑制療法は最少でよい。このためほとんど合併症もなく、ドナー−受容個体 の許容されるキメラ状態が存在する。いわゆる自己免疫疾患（例えば、ループス エリテマトーデス、多発性硬化症、リウマチ様関節炎または慢性Ｂ型肝炎感染） を治療するのに、同様の治療法が使用できる。 別の方法は、自然界で自己反応性のＴ細胞クローンに特異的な、アンチセンス メッセージ、リボザイムまたは他の特異的遺伝子発現阻害剤を使用する。これら は、自己免疫応答に関与する特定の好ましくないクローンのＴ細胞リセプターの 発現をブロックする。このアンチセンス、またはリボザイムまたは他の遺伝子は 、ウイルスベ クターを送達系を用いて導入される。 ７．置換または増強遺伝子療法 本発明のさらに１つの面は、治療用蛋白を発現することができる遺伝子配列を 与えるための、遺伝子移動の運搬体として作用する組換えアルファウイルスベク ターによる、動物細胞の形質転換に関する。本発明の１つの実施態様において、 ウイルスベクター作成体は、代謝、免疫制御、ホルモン制御、酵素的または膜関 連構造機能における、遺伝性または非遣伝性の遺伝子欠陥を防止、阻害、安定化 または逆転写することができる治療用蛋白を発現するように設計される。この実 施態様はまた、各細胞を形質導入することができるウイルスベクターを記載し、 これにより治療用蛋白が特定の細胞または組織から全身的にまたは局所的に発現 され、これにより治療用蛋白は（ａ）存在しないかまたは欠陥のある細胞性蛋白 または酵素の置換、または（ｂ）欠陥のあるかまたは発現量の少ない細胞性蛋白 または酵素の補充産生が可能である。このような疾患には、嚢胞性繊維症、パー キンソン病、高コレステロール血症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、β−グロ ビン疾患、血友病ＡおよびＢ、ゴーシェ病、糖尿病および白血病がある。 本発明の１つの例として、ゴーシェ病の治療に組換えアルファウイルスベクタ ーが使用される。簡単に説明するとゴーシェ病は酵素グリコセレブロシダーゼの 欠損を特徴とする遺伝子疾患である。この型の治療は、機能性細胞性酵素を与え ることによる単一の遺伝子置換療法の１つの例である。この酵素の欠損により、 体内のすべての細胞のリソゾームにグルコセレブロシドが蓄積する。しかしこの 疾患の表現型は、非常にまれな神経障害の場合を除いて、マクロファージにのみ 現れる。この疾患では通常肝臓と脾臓そして骨の病変部が拡大する（総説につい ては、Science 256：794，1992および The Metabolic Basis of Inherited Disease、第６版、Scriverら、第２巻、p． 1677を参照）。 ８．アルファウイルス粒子の投与 本発明の１つの面において、組換えアルファウイルスベクターまたは粒子の投 与法が提供される。簡単に説明すると、ウイルスベクター投与の最終モードは、 特定の治療応用、ベクターの力価を上昇させる最良の方法、および最も便利な投 与法に依存する。一般的に本実施態様は、（１）血流への直接注入、（２）特定 の組織または癌への直接注入、（３）経口投与、（４）鼻内吸入、（５）粘膜組 織への直接適用、（６）動物への形質導入した自己細胞の体外投与により、送達 されるように設計されることができる組換えアルファウイルスベクターを含む。 すなわち治療用アルファウイルスベクターは、ベクターが（ａ）正常な健常細胞 を形質導入しかつ細胞を形質転換して、全身性または局所的に分泌される治療用 蛋白または物質のプロデューサーにする、（ｂ）異常または欠陥のある細胞を形 質転換して、細胞を正常に機能する表現型にする、（ｃ）異常な細胞を破壊され るように形質転換する、および／または（ｄ）細胞を形質導入して免疫応答を操 作することができるように、投与することができる。 Ｉ．転写因子活性の制御 さらに別の実施態様において、アルファウイルスベクターは感染細胞の転写因 子の増殖制御活性を制御するのに使用することができる。簡単に説明すると、転 写因子は配列特異的トランス活性化または抑制を介して、遺伝子発現のパターン に影響を与える(Karin，New Biologist 21：126-131，1990)。すなわち、突然変 異した転写因子が一群の癌遺伝子になることは驚くべきことではない。アルファ ウイルス遺伝子移行療法は例えば、その無制御な増殖が癌遺伝子 性転写因子により活性化される癌細胞、そしてホモ−またはヘテロダイマーのト ランス活性化または抑制性転写因子複合体の形成に共同して結合を促進または阻 害する蛋白を制御するのに使用される。 細胞増殖を逆転させる１つの方法は、c-myc/Maxヘテロダイマー転写因子複合 体のトランス活性化の可能性を阻害することであろう。簡単に説明すると、核性 癌遺伝子c-mycは細胞を増殖させることにより発現され、いくつかの顕著な機構 （レトロウイルス挿入、増幅、および染色体転座を含む）により活性化される。 Max蛋白は静止細胞中で発現され、c-mycとは独立に、単独でまたは未同定の因子 とともに発現され、myc/Maxヘテロダイマーにより活性化されるものと同じ遺伝 子の発現を抑制するように作用する(Cole，Cell 65：715-716，1991)。 癌細胞のc-mycまたはc-myc/Max増殖の阻害は、アルファウイルスベクターによ り制御される標的細胞中でMaxを過剰発現させることにより行われる。Max蛋白は わずか160アミノ酸（長さが480ヌクレオチドのRNAに相当する）であり、独立で または細胞の増殖制御を放出する因子にターゲティングされた他の遺伝子および ／またはアンチセンス／リボザイム部分とともにアルファウイルスベクターに取 り込まれる。 ホモ／ヘテロ複合体会合の修飾は、転写因子活性化遺伝子発現を制御するため の別のアプローチである。例えばトランス活性化転写因子NF−κＢの細胞質から 核への移行は、阻害蛋白ＩκＢとともにヘテロダイマー複合体中にある時防止さ れる。種々の物質（ある種のサイトカインを含む）による誘導により、ＩκＢは リン酸化され、NF−κＢは放出され核に移行され、ここで配列特異的トランス活 性化機能を示す(Baeuerle and Baltimore，Science 242：540-546，1988)。NF− κＢ／ＩκＢ複合体の解離は、ＩκＢのリン酸化部 位を抗体でマスクすることにより防止できる。このアプローチは、核への移行を 防止することにより、NF−κＢ転写因子のトランス活性の活性化を有効に阻害で きるであろう。標的細胞中のＩκＢリン酸化部位特異的抗体または蛋白の発現は 、アルファウイルス遺伝子移行ベクターを用いて行われる。ここに記載した方法 と類似のアプローチは、junとfos蛋白の間の会合を阻害することにより、トラン ス活性化転写ヘテロダイマー因子AP−１の形成を防止するのに使用されるであろ う(Turner and Tijan，Science 243：1689-1694，1989)。 Ｊ．薬剤組成物 前述のように、本発明はまた、薬剤学的に許容される担体、希釈剤、または受 容体とともに、組換えシンドビス粒子またはウイルス、またはシンドビスベクタ ー作成体よりなる組成物も提供する。 簡単に説明すると、感染性組換えウイルス（粒子とも呼ぶ）は、粗製な型また は純粋な型で保存される。粗製な型でウイルスを産生するために、ウイルス産生 細胞をまずバイオリアクターで培養し、ウイルス粒子を細胞から培地へ放出させ る。次にまず組換えウイルスを含有する培地に充分量の調製緩衝液を加えて水性 懸濁液を作成することにより、ウイルスを粗製の型で保存する。いくつかの好適 な実施態様において、調製緩衝液は糖、高分子量構造添加剤、および緩衝化成分 を水中に含有する水溶液である。この水溶液はまた、１つまたはそれ以上のアミ ノ酸を含有してもよい。 組換えウイルスも精製された形で保存される。さらに詳しくは調製緩衝液の添 加前に上記の粗組換えウイルスをフィルターに通して清澄化し、次に向流濃縮系 （フィルトロン・テクノロジー社（Filtron Technologies Corp．）、Nortborou gh、マサチューセッツ州）などにより濃縮する。１つの実施態様において、DNas eを濃縮物に 加えて外来DNAを消化する。次に消化物を濾過して過剰の培地成分を除去し、さ らに好ましい緩衝液中で組換えウイルスを確立する。次に濾過物をセファデック スS-500ゲルカラムに通して、精製した組換えウイルスを溶出させる。次にこの 溶出液に充分量の調製緩衝液を加えて目的の最終成分濃度にし、組換えウイルス の希釈を最小にする。次に水性懸濁液を好ましくは−70℃で保存し、直ちに乾燥 する。前述のように、調製緩衝液は糖、高分子量構造添加剤、および緩衝化成分 を水中に含有する水溶液でもよい。この水溶液はまた１つまたはそれ以上のアミ ノ酸を含有してもよい。 粗組換えウイルスはまたイオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製され る。簡単に説明すると粗組換えウイルスをまずフィルターに通し、次に濾液を高 度にスルホン化したセルロースマトリックスを含有するカラムにのせる。次に高 塩緩衝液を用いて組換えウイルスを精製した形でカラムから溶出させ、溶出液を 分子量排除カラムに通すことにより高塩緩衝液をより好ましい緩衝液に交換する 。次に前述のように精製した組換えウイルスに充分量の調製緩衝液を加え、水性 懸濁液を直ちに乾燥させるかまたは好ましくは−70℃で保存する。 粗または精製された型の水性懸濁液は、周囲温度で凍結乾燥または溶媒留去に より乾燥される。簡単に説明すると、凍結乾燥工程は水性懸濁液をガラス遷移温 度以下または水性懸濁液の共融温度以下に冷却して、昇華により冷却した懸濁液 から水分を除去して凍結乾燥ウイルスを形成する。１つの実施態様におて、調製 した組換えウイルスの分画を凍結乾燥機（Supermodulyo 12K）を取り付けたEdwa rds Refrigerated Chamber(３Shelf RC3S unit)に入れる。Phillipsらの記載す る他段階凍結乾燥法（Cryobiology，18 :414，1981）を用いて、調製した組換え ウイルスを好ましくは−40℃〜−45℃で 凍結乾燥する。得られる組成物は凍結乾燥したウイルスの10重量％未満の水を含 む。いったん凍結乾燥されると、組換えウイルスは安定であり、以下に詳述され るように−20℃〜25℃で保存される。 蒸発法において、水分は周囲温度で蒸発により水性懸濁液から除去される。１ つの実施態様において、水分は噴霧乾燥により除去される（ヨーロッパ特許第52 0,748号）。噴霧乾燥法では水性懸濁液はあるかじめ加熱された気体流（通常は 空気）の中に入れられ、懸濁液の液滴から水分は急速に蒸発する。噴霧乾燥装置 は多くの会社から入手できる（例えば、Drytec Itd.,トンブリッジ(Tonbridge) 、イングランド；Lab-Plant，Ltd.,ハダーフィールド（Huddersfield）、イング ランド）。本明細書に記載した方法で、得られた乾燥または凍結乾燥ウイルスの 水分含量は、カール−フィッシャー装置（EM，Science AquastarTM VIB volumet ric titrator、チェリーヒル(Cherry Hill)、ニュージャージー州）、または重 量法により測定される。 前述のように、調製に使用される水溶液は糖、高分子量構造添加剤、および緩 衝化成分および水よりなる。この溶液はまた１つまたはそれ以上のアミノ酸を含 有してもよい。これらの成分の組合せが、凍結および凍結乾燥または蒸発による 乾燥時の組換えウイルスの活性を維持するのに作用する。好適な糖は乳糖である が、他の糖（例えば、ショ糖、マンニトール、グルコース、トレハロース、イノ シトール、果糖、マルトースまたはガラクトース）を使用することもできる。さ らに糖の組合せ（例えば、乳糖とマンニトール、またはショ糖とマンニトール） を使用してもよい。特に好適な乳糖の濃度は３〜４重量％である。好ましくは糖 の濃度範囲は１〜12重量％である。 高分子量構造添加剤は凍結時のウイルスの凝集を防ぐのに役立ち 、凍結乾燥または乾燥状態での構造的支持を与える。本発明におい構造添加剤と は、もし5000分子量以上の場合は「高分子量」であると考えられる。好適な高分 子量構造添加剤はヒト血清アルブミンである。しかし他の物質（例えば、ヒドロ キシエチル−セルロース、ヒドロキシメチル−セルロース、デキストラン、セル ロース、ゼラチン、またはポビドン）を使用してもよい。ヒト血清アルブミンの 特に好適な濃度は0.1重量％である。好ましくは高分子量構造添加剤の濃度は0.1 〜10重量％の範囲である。 もしアミノ酸が存在する場合、アミノ酸は水性懸濁液の冷却および融解時のウ イルス感染性を保存する働きをする。さらにアミノ酸は冷却した水性懸濁液の昇 華時および凍結乾燥状態でのウイルスの感染性を保存する働きをする。好適なア ミノ酸はアルギニンであるが、他のアミノ酸（例えば、リジン、オルニチン、セ リン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸またはアスパラギン 酸）を使用することもできる。特に好適なアルギニン濃度は0.1重量％である。 好ましくはアミノ酸濃度は0.1〜10重量％の範囲である。 緩衝化成分は比較的一定のpHを維持して、溶液を緩衝化する働きをする。目的 のpHの範囲（好ましくは7.0と7.8の間）により種々の緩衝液が使用できる。好適 な緩衝液にはリン酸緩衝液やクエン酸緩衝液がある。組合せウイルス製剤の特に 好適なpHは7.4であり、好適な緩衝液はトロメタミン（tromethamine）である。 さらに水溶液は、最終の調製された組換えアルファウイルスを適当な等浸透圧 塩濃度に調整するのに使用される中性の塩を含有することが好ましい。適当な中 性の塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化マグネシウムがある。好 適な塩は塩化ナトリウムである。 前述の目的の濃度の成分を含有する水溶液は、濃縮した保存溶液として調製し てもよい。 本明細書に開示した内容から凍結乾燥ウイルスを室温で保存する時は、水溶液 中にある種の糖を使用することが好ましいことは当業者には明らかであろう。さ らに詳しくは室温で保存には二糖（例えば、乳糖またはトレハロース）を使用す ることが好ましい。 本発明の凍結乾燥または脱水したウイルスは、種々の物質を用いて復元できる が、好ましくは水が使用される。ある場合には最終調製液を等張にする希塩溶液 を使用することもできる。さらに組換えウイルスの活性を上げることが公知の成 分を含有する水溶液を使用することが有利であろう。このような成分にはサイト カイン、IL−２、ポリ陽イオン（例えば硫酸プロタミン）または形質導入効率を 上げる他の成分がある。凍結乾燥または脱水した組換えウイルスは、便利な量の 水、または前述のように凍結乾燥または脱水試料の実質的な、好ましくは完全な 溶解を可能にする復元物質により復元される。 以下の実施例は、例示のためであり、本発明を制限するものではない。 実施例 実施例１ シンドビスゲノム長cDNAのクローニング 陽性の極性を有するRNAゲノムを有するウイルスの性質は、許容宿主(permissi ve host)として作用する真核細胞中に導入されると、精製されたゲノム核酸が機 能性メッセージRNA(mRNA)分子として作用することである。このように、ウイル スから精製されたこのゲノムRNAは、RNAが精製された元の野生型ウイルスによる 感染に特徴的な感染周期と同一の感染周期を開始することができる。 蚊(Culexus univittatus)から単離されたシンドビスウイルスAr-339株(ATCC # VR-1248，Taylorら、Am．J．Trop．Med．Hyg．４：844 1955)を、ベビーハムス ター腎臓(BHK)細胞で増殖し、低多重度で感染させる（0.1PFU／細胞）。あるい は、シンドビスウイルスhr株（リー・モレキュラー（Lee Biomolecular）、サン ジエゴ・カリホルニア州）を使用し、同一の方法で増殖させることもできる。前 述のように、感染の48時間後、０℃で10％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール （PEG-8000）で清澄化した細胞溶解物からシンドビスのビリオンが沈殿する。PE Gのペレットに含まれるこのシンドビスのビリオンを２％SDSで溶解して、市販の オリゴdTカラム(インビトロジェン(Invitrogen))を使用したクロマトグラフィー によりポリ−アデニル化mRNAを単離する。下記の配列を含むオリゴヌクレオチド プライマーを使用して、ポリＡで選択したmRNA上でcDNAの最初の鎖の合成を２回 実施した： 5'-TATATTCTAGA(dT)25-GAAATG-3'（配列番号２） このプライマーは、５’末端に効率的な制限エンドヌクレアーゼ消化のための ５個のヌクレオチドの「緩衝配列」、XbaＩ認識配列、25個の連続したdTヌクレ オチド、およびシンドビスの３’最末端に正確に相補的な６個のヌクレオチドを 含む。このように、最初の回のcDNA合成のための選択は、２つのレベルで行う： （１）機能性mRNAに必須の、ポリアデニル化分子、および（２）多数のmRNA種を 含有するプール中の、シンドビスmRNA分子からの選択的プライミング。さらに、 逆転写を10mMのMeHgOHの存在下で行い、逆転写中の人為的停止の頻度を低くする 。 元々のゲノム長シンドビスcDNAを、６対の重複するプライマーを使用して６つ の別のセグメントでPCRで増幅する。ウイルスの相補的配列に加えて、シンドビ ス５’末端順方向プライマーは、細菌の SP6 RNAポリメラーゼプロモーターに対応する19個のヌクレオチド配列と、５’ 末端に結合したApaＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。効率的な消化の ために５個のヌクレオチドの「緩衝配列」が、ApaＩ認識配列の前に位置する。 細菌のSP6 RNAポリメラーゼは、インビトロの転写により、Ａリボヌクレオチド に結合した単一の非ウイルス性Ｇリボヌクレオチド（これが本物のシンドビス５ ’末端に対応する）だけを含むように位置している。ApaＩ認識配列を含むこと は、プラスミドベクター(pKS II+、ストラタジェン(Strategene))ポリリンカー 配列へのPCRアンプリコン（amplicon）の挿入を促進する。SP６−５’シンドビ ス順方向プライマーおよび全シンドビスゲノムを増幅するために必要な全てのプ ライマー対の配列を以下に示す。参照配列(ジェンバンク(GenBank)参照番号SINC G)はStraussら、Virology 133：92-110による。 上記６個のプライマーマットによるシンドビスcDNAのPCR増幅は、サーマラー ゼ（Thermalase）熱安定性DNAポリメラーゼ（アムレスコ社（Amresco Inc.）ソ ロン(Solon)、オハイオ州）と、供給者から提供される1.5mMのMgCl2を含有する 緩衝液を使用して、別々の反応で行われる。さらに、この反応は、５％DMSO、お よびホット・スタート・ワックス・ビーズ(Hot Start Wax beads）(パーキン・ エルマー(Perkin-Elmer))を含み、下記のPCR増幅プロトコールを使用する： 増幅後、６個の反応生成物をまずpCR IIベクター(インビトロジェン(Invitrogen ))に挿入し、次いで前述の適切な酵素を使用して、段階的にpKS II+（ストラタ ジェン(Stratagen)）ベクターのApaＩおよびXbaＩ部位の間に挿入する。このク ローンを、pVGSP6GENと呼ぶ。 シンドビスゲノムcDNAクローンpVGSP6GENを、25個のヌクレオチド長のポリdA ：dTストレッチの下流に隣接した位置でpVGSP6GENを１回切断するXbaＩによる消 化により線状にする。線状化pVGSP6GENクローンをジーン・クリーン(Gene Clean )(バイオ101（BIO 101）、ラ・ホイヤ（La Jolla）、カリホルニア州)で精製し 、0.5mg/mlの濃度に調整する。以下の反応条件により、線状化pVGSP6GENクロー ンの転写をインビトロで40℃で90分間行う：DNA２ml／H2O 4.25ml／2.5mMのNTP （UTP，ATP，GTP，CTP）10ml/20mMのｍ7Ｇ（５’）ppp（５’）Ｇキャップ類似 体1.25ml／100mMのDTT 1.25ml／５Ｘ転写緩衝液（プロメガ(Promega)）５ml／RN asin（プロメガ）0.5ml/10mg/mlウシ血清アルブミン0.25ml／SP6 RNAポリメラー ゼ（プロメガ）0.5ml。インビトロ転写反応生成物は、DNaseI（プロメガ）によ り消化し、逐次希釈フェノール／CHCl3およびエーテル抽出により精製し、タメ ノール沈殿することができ、あるいは、直接トランスフェクションのために使用 することができる。インビトロの転写反応生成物または精製したRNAは、市販の 陽イオン性脂質化 合物（リポフェクチン（Lipofectin）、ギブコ−BRL（GIBCO-BRL）、ガイザース バーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）と複合体にし、75％のコンフルエン スで60mMのシャーレに維持されたベビーハムスター腎臓−21（BHK-21）細胞に適 用する。トランスフェクションされた細胞を30℃でインキュベートする。トラン スフェクションの94時間後、広範囲の細胞変性効果（cytopathologic effects） (CPE)が観察される。シンドビスcDNAクローンから転写されたRNAを受けないプレ ートでは、明白なCPEは観察されない。さらに、トランスフェクトされた細胞か ら採取し、BHK-21細胞の新鮮単層に添加され、30℃または37℃でインキュベート された上澄液１mlにより、18時間以内に明白なCPEが生じる。これは、シンドビ スcDNAクローンpVGSP6GENが真に感染性であることを証明している。 表１に示されるpVGSP6GENの配列分析は、本明細書に記載されたシンドビスの ゲノムクローンとジェンバンク(Genbank)に含まれるウイルスのクローンの間に ある多数の配列の差異を明らかにしている。多くの配列の差異は、シンドビス蛋 白における非保存性アミノ酸変化の置換をもたらす。どの配列変化が本明細書に 記載されたクローンに独特であるか、あるいはクローニング人工物の結果である かという問題を解決するために、前述のようにビリオンRNAをRT-PCRにより増幅 し、市販のキット（プロメガ(Promega)、マジソン(Madison)、ウィスコンシン州 ）を使用して、RT-PCRアンプリコン生成物の直接配列決定により、問題のヌクレ オチドに関する配列を決定し、そして対応するpVGSP6GEN配列と比較する。この 検討の結果を、表２に示す。簡単に説明すると、クローニング人工物の結果であ る３個の非保存性アミノ酸変化、Gly-〉Glu，Asp->Gly、およびTyr->ysが、各々 ウイルスヌクレオチド2245，6193、および6730で観察される。これらの非保存性 アミノ酸変化を生じさせるヌクレオ チド変化は、全てウイルスの非構造蛋白(NSP)遺伝子に（ヌクレオチド2245はNSP 2に、ヌクレオチド6193および6730はNSP4に）位置づけられる。 NSP2およびNSP4遺伝子の修復は、前述のように５回ブラーク精製したストック からのビリオンRNAを使用したRT-PCRにより達成される。前述のSP6-1A/1Bプライ マー対は、ヌクレオチド2245変化を修復するために使用される。RT-PCRアンプリ コン生成物を、Eco47IIIおよびBgl IIで消化し、882塩基対断片を１％アガロー ス／TBEゲル電気泳動により精製し、Eco47 IIIおよびBgl IIでの消化およびCIAP での処理により調製されたpVGSP6GENの対応する領域中に交換する。前記3A/7349 Rプライマー対は、ヌクレオチド6193およびヌクレオチド6730変化を修復するた めに使用される。RT-PCRアンプリコン生成物を、EcoRＩおよびHpaＩで消化し、1 ,050塩基対断片を１％アガロース／TBEゲル電気泳動により精製し、pVGSP6GENの 対応する領域中に交換する。このクローンはpVGSP6GENrepと呼ぶ。XbaＩでの消 化により線状にされたpVGSP6GENrepのDNAから、インビトロ転写されたRNAによる BHK細胞のトランスフェクションは、前述のようにトランスフェクションの18時 間後に広範囲のCPEをもたらす。 実施例２ シンドビス感染を開始するプラスミドDNAベクターの生成 全長ゲノムシンドビスcDNAクローンの大きさのため、全長分子のインビトロ転 写はやや効率が悪い。これは、プラーク形成により測定すると、ウイルスの感染 中心に関して、インビトロ転写したRNAのトランスフェクトした量に比例して、 低いトランスフェクション効率をもたらす。この概念はまた、シンドビス発現ベ クターのインビトロ転写にも該当する。cDNAが次にンビボのウイルスRNAの合成 に向けられるDNA分子として感受性細胞中にトランスフェクトされれば、感染周 期を開始する能力または異種配列の発現を指令する能力についての候補cDNAクロ ーンおよび他のシンドビスcDNA発現ベクターの試験は、大きく促進されるであろ う。100％近い高トランスフェクション効率が、種々の市販の合成脂質調製物と 複合体化したDNAで、またはエレクトロポレーションによりトランスフェクトさ れた細胞で報告された。また、ピコルナウイルス（picornaviruses）からのcDNA は、感受性細胞中にトランスフェクトされると、感染周期を開始することができ ることが証明されている(van er Werfら、PNAS 83：2330-2334，1986)。しかし 、ゲノムシンドビスcDNAが哺乳動物のプロモーターに近接して置かれ、細胞中に トランスフェクトされた時に、野生型ウイルスに特徴的な感染周期を開始するこ とのできるRNAが得られるかどうかは、文献には記載されていない。 適切なシグナルを有するDNA分子は、直接動物中に導入されると、インビボで 複製できることは公知である(Dubenskyら、PNAS 81：7429-7533，1984)。シンド ビスcDNAベクターのDNA分子としての直接の投与は、シンドビスが指令する緩和 剤の発現がトランスの効果を有する幾つかの適用には可能である。これらの適用 は、免疫調 節およびサイトカインまたは他の治療用蛋白の発現を含む。シンドビスの範囲で 、シンドビスcDNA発現ベクターの直接投与は、シンドビス粒子の作成よりもより 単純であるという利点を提供する。 異種の治療用緩和剤配列を含有するシンドビスcDNAベクター作成体を、真核RN AポリメラーゼII発現カセットに挿入する。この作成体は、真核細胞重層ベクタ ーイニシエーション系（Eukaryotic Layered Vector Initiation System）(ELVI S)として公知であり、順に下記の成分よりる：本物のシンドビス５’末端でウイ ルスRNAの合成を開始することができる５’真核細胞プロモーター、シンドビス の非構造蛋白をコードするヌクレオチド配列、ウイルスの結合領域、異種配列、 シンドビスRNAポリメラーゼ認識配列、転写終了配列および３’ポリアデニル化 シグナル。本明細書に記載された真核細胞シンドビスcDNA発現ベクターは、例え ばシンドビスと異種遺伝子領域の間に位置する適切なスプライシングシグナルを も含んでよい。 野生型ウイルスに特徴的な感染周期を開始する、シンドビスcDNAクローンpVGS P6GENrepの能力を、哺乳動物RNAポリメラーゼII発現カセットにゲノムウイルスc DNAを配置することにより最初に測定する。これは、以下に詳細に記載したよう に作成される。このクローンpVGSP6GENrepを、Bgl IIおよびXbaＩで消化し、反 応生成物を0.8％アガロース／TBEで電気泳動し、生じた9,438塩基対断片を摘出 し、ジーン・クリーン(Gene Clean)(バイオ101（BIO 101）、ビスタ(Vista)、カ リホルニア州)で精製し、pcDNA3（インビトロジェン（Invitrogen）、サンジエ ゴ、カリホルニア州）のBgl II，XbaＩ、およびCIAPにより処理から生じる4,475 塩基対ベクター断片に結合させる。 モロニー(Moloney)ネズミ白血病ウイルス（Mo-MLV）からのロン グ・ターミナル・リピート(LTR)を、最初の転写ヌクレオチドが単−Ｇ残基であ り、これがインビボでキャップされ、シンドビス５’末端が続くように、５’ウ イルス末端に位置させる。３個の非ウイルス性ヌクレオチドを５’末端に含有す るインビトロ転写RNAか感染性であることは公知である（Riceら、J．Virol．61 ：3809-3819，1987）。Mo-MLV LTRとシンドビス５’末端の並列化が、以下に詳 細に記載したように重複PCRにより行われる。BAGベクター(Priceら、PNAS 84：1 56-160，1987)と下記のプライマー対を含有する反応物中で、最初のプライマリ ーPCR反応でMo-MLV LTRが増幅される：順方向プライマー：BAGBg12F1(緩衝配列/Bgl II認識配列／Mo-MLV LTRヌクレオ チド１〜22)： ５’-TATATAGATCTAATGAAAGACCCCACCTGTAGG逆方向プライマー：BAGwt441R2（SINヌクレオチド５〜１/Mo-MLVLTRヌクレオチ ド441〜406）： ５’-TCAATCCCCGAGTGAGGGGTTGTGGGCTCTTTTATTGAGC 上記のプライマー対によるMo-MLV LTRのPCR増幅が、サーマラーゼ（Thermalas e）熱安定性DNAポリメラーゼ（アムレスコ社（Amresco Inc.）、ソロン(Solon) 、オハイオ州）と、供給者から提供される1.5mMのMgCl2を含有する緩衝液を使用 して行われる。さらに、この反応は、５％DMSO、およびホット・スタート・ワッ クス・ビーズ（Hot Start Wax beads）(パーキン・エルマー(Perkin-Elmer))を 含み、下記のPCR増幅プロトコールを使用する： 第２のプライマリーPCR反応中のシンドビス５’末端の増幅が、pVGSP6GENrep クローンと下記のプライマー対を含有する反応で達成される：順方向プライマー：（Mo-MLV LTRヌクレオチド421〜441/SINヌクレオチド１〜16 ）： ５’-CCACAACCCCTCACTCGGGGATTGACGGCGTAGTAC逆方向プライマー：（SINヌクレオチド3182〜3160）： ５’-CTGGCAACCGGTAAGTACGATAC Mo-MLV LTRのPCR増幅は、このプライマー対と上記増幅反応条件で、下記のPCR 増幅プロトコールを使用して行われる： プライマリーPCR反応からの457塩基対および3202塩基対生成物を、ジーン・ク リーン（Gene Clean）で精製し、下記のプライマー対と一緒にPCR反応で使用さ れる：順方向プライマー：BAGBg12F1(緩衝配列/Bgl II認識配列/Mo-MLV LTRヌクレオチ ド１〜22）： ５’-TATATAGATCTAATGAAAGACCCCACCTGTAGG逆方向プライマー：（SINヌクレオチド2300〜2278： ５’-GGTAACAAGATCTCGTGCCGTG プライマーPCRアンプリコン生成物のPCR増幅は、このプライマー対と上記増幅 反応条件で、下記のPCR増幅プロトコールを使用して行われる： 最初のプライマリーPCRアンプリコン生成物の25個の３’末端塩基は、第２の プライマーPCRアンプリコン生成物の25個の５’末端塩基と重複する；生じた2,7 52塩基対の重複第２PCRアンプリコン生成物を、0.8％アガロース／TBE電気泳動 により精製し、Bgl IIで消化し、そして2,734塩基対の生成物をBgl IIおよびCIA Pで処理したpcDNASINbgl/Xba中に結合する。生じた作成体は、16,656塩基対であ り、pVGELVISと呼ぶ。pVGELVISの配列は、図３に示す。シンドビスヌクレオチド は、配列の塩基１〜11,700に含まれる。 pVGELVISブラスミドDNAは、リポフェクタミン(Lipofectamine)（ギブコ−BRL （GIBCO-BRL）、ガイザースバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）と供給 者により示唆される条件により複合体化し（約５μｇ DNA／８mg脂質試薬）、約 75％コンフルエンスでBHK-21細胞を含有する35mmウェルに添加する。野生型シン ドビスウイルス感染に特徴的な細胞変性効果(CPE)が、感染の48時間後に観察さ れる。新鮮BHK-21単層へのトランスフェクト上澄液１mlの添加によ り、16時間以内にCPEが起こる。このデータは、pBGELVIS作成体中でウイルスcDN AとRNAポリメラーゼII発現カセットシグナルが正しく並列されたことを示してお り、これによりDNA発現モジュールからRNAウイルスの開始が新たにもたらされる 。この革新的技術は、一般的なシンドビス系の有用性を増強するのみでなく、物 理的遺伝子転移ベクター(Physical Gene Transfer vector)の別の方法を提供す るものである。 pVGELVISからのゲノム長RNAの最初の転写に続くベクター複製の効率もまた、 より本物の３’末端をもたらす修飾により増強される。この目的のために、ELVI Sベクター作成体に２つの異なる修飾を行う。最初の修飾はシンドビスポリアデ ニル酸領域に隣接させた、肝炎デルタウイルス(HDV)のアンチゲノムリボザイム 配列を利用する。第２の修飾は、シンドビスポリアデニル酸領域と下流のベクタ ー配列の欠失であり、これによりシンドビスヌクレオチド11,700の、ウシ成長ホ ルモン遺伝子転写停止／ポリアデニル化配列への融合がもたらされる。 HDVリボザイム含有作成体は、PCR法と、全84ヌクレオチドのアンチゲノムリボ ザイム配列（Perotta and Been，Nature 350：434-6，1991）を含有する重複オ リゴヌクレオチドプライマーを使用して作成される。HDV配列に加えて、２つの プライマーが、ELVISベクターへの挿入を目的として隣接する制限酵素部位を含 有する。２回転のPCRを行う：最初はオリゴヌクレオチドプライマーHDV49−XCと HDV17〜68（下記）を使用し、 HDV17〜68： 5'-TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGG- ACGCACGTCCACT-3'（配列番号 ） HDV49−XC： 5'-ACTTATCGATGGTTCTAGACTCCCTTAGCCATCCGAGTGGA- CGTGCGTCCTCCTTC-3'（配列番号 ） 続いて最初のPCR反応物を希釈し、これを次にプライマーHDV49−XC（最初の反応 から）とHDVX−36（下記）を用いるPCRの第２の周期で鋳型として使用する。 HDVX−36： 5'-ACGTCTAGATCTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGA-3' （配列番号 ） 合成後、HDVリボザイム断片を、隣接する配列（下線）を切断するXbaＩで消化し 、その２つの部位の一方のみを切断するためにXbaＩで部分的に消化されたELVIS ベクターDNA中に結合する。制限部位と配列分析により、正しい部位と正しい配 向での挿入についてスクリーニングを行う。この作成体は、pVGEGVISHDVと呼ぶ 。 第２の方法では、pVGEGVIS中のシンドビスポリアデニル酸領域と下流のベクタ ー配列の欠失による、ウシ成長ホルモン遺伝子転写停止／ポリアデニル化配列へ のシンドビスヌクレオチド11,700の融合が、重複PCRにより行われる。最初のプ ライマーPCR反応でのシンドビス３’末端の増幅が、pVGEGVISと下記のプライマ ー対を含有する反応で行われる：順方向プライマー：SIN10349F（SINヌクレオチド10394〜10372）： 5'-GACAGTGAGAACAGCCAGATGAG （配列番号 ）逆方向プライマー：SINBGH11700R（BGHヌクレオチド13〜１／SINヌクレオチド11 700〜11675）： 5'-CAGCGAGCTCTAGGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGTTG （配列番号 ） 上記プライマー対とのpVGEGVISのPCR増幅は、サーマラーゼ（Th ermalase）熱安定性DNAポリメラーゼ（アムレスコ社（Amresco Inc.）、ソロン( Solon)、オハイオ州）と、供給者から提供される1.5mMのMgCl2を含有する緩衝液 を使用して行われる。さらに、この反応は、５％ DMSO、およびホット・スター ト・ワックス・ビーズ（Hot Start Wax beads）(パーキン・エルマー(Perkin-El mer))を含み、下記のPCR増幅プロトコールを使用する： 第２のプライマリーPCR反応でのBGH遺伝子転写停止／ポリアデニル化配列の増 幅は、pVGELVISクローンと下記のプライマー対を含有する反応で行われる：順方向プライマー：pCSIN1018F（SINヌクレオチド11,687〜11,700／PCDNA3ヌク レオチド1018〜1039）： 5'-CCACAACCCCTCACTCGGGGATTGACGGCGTAGTAC （配列番号 ）逆方向プライマー：pCDNA1633R（pCDNA3ヌクオレチド1633〜1608）： 5'-GTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCAC （配列番号 ） BGII遺伝子の５’末端のPCR増幅は、このプライマー対と上記増幅反応条件で 、下記のPCR増幅プロトコールを使用して行われる： プライマリーPCR反応からの1,364塩基対および629塩基対の生成物を、ジーン ・クリーン（Gene Clean）で精製し、PCR反応で下記のプライマー対と一緒に使 用する：順方向プライマー：SIND310374F(５ヌクレオチド緩衝／Hind III認識部位／SIN ヌクレオチド10374〜10394）： 5'-TATATAAGCTTGAGGCGTACGTCGAATTGTCAG （配列番号 ）逆方向プライマー：pCDNA1575R（pCDNA3ヌクレオチド1575〜1552） 5'-GAAAAACCGTCTATCAGGGCGATG （配列番号 ） プライマーPCRアンプリコン生成物のPCR増幅は、このプライマー対と上記増幅 反応条件で、下記のPCR増幅プロトコールを使用して行われる： 最初のプライマリーPCRアンプリコン生成物の27個の３’末端塩 基は、第２のプライマリーPCRアンプリコン生成物の27個の５’末端塩基と重複 する；生じた1,976塩基対の重複第２PCRアンプリコン生成物を、0.8％アガロー ス／TBE電気泳動により精製し、Hind IIIとDra IIIで消化し、そして1,941塩基 対の生成物をHind IIIとDra IIIで消化しCIAPで処理したpcDNA3中に結合する。 この作成体は、pCDNAELVIS３’と呼ぶ。pCDNAELVIS３’作成体をBsiWＩとPvuＩ 消化し、生じた5197塩基対断片を0.8％アガロース／TBE電気泳動により精製し、 BsiWＩとPvuＩでのpVGELVISの消化しCIAPで処理して単離した11,398塩基対断片 に結合し、続いて0.8％アガロース／TBE電気泳動およびジーン・クリーン（Gene Clean）処理を行う。生じた作成体は、16,595塩基対であり、pVGELVISdl３’と 呼ぶ。 pVGELVISHDVおよびpVGELVISdl３’プラスミドの野生型シンドビスウイルスに 特徴的な感染を開始する能力を試験するために、DNAクローンをリポフェクタミ ン（Lipofectamine）（ギブコ−BRL（GIBCO-BRL）、ガイザースバーグ（Gaither sburg）、メリーランド州と供給者により示唆される条件により複合体化し（約 ５μｇ DNA／８mg脂質試薬）、約75％コンフルエンスでBHK-21細胞を含有する35 mmウェルに添加する。この方法によりCPEが観察されれば、新鮮BHK-21単層を感 染させるためにトランスフェクション上澄液１mlを使用するか、あるいは上澄液 中のシンドビスウイルスのレベルをプラーク測定により直接定量することができ る。 他の応用では、インビボの転写開始が本物の５’末端ウイルスヌクレオチドに 対応するように、pCDNA3プラスミド中に含まれるCMVプロモーターをシンドビス ゲノムcDNAの隣に位置させることが望ましい。プラスミドpcDNA3上のCMVプロモ ーターの出発部位は、インビトロで転写開始点をマッピングすることにより測定 される。これは、最初にpcDNA3プラスミドをDra III制限エンドヌクレアーゼ（ ニ ュー・イングランド・バイオラブス社（New England Biolabs Inc.）、ビバリー (Beverly)、マサチューセッツ州）で製造者の指示により消化することにより行 われる。Dra IIIは、このプラスミドをヌクレアーゼ1546で１度切断し、線状の5 446塩基対DNA分子が生じる。このDNAをジーンクリーンIIキット（Geneclean II kit）（バイオ101（BIO 101）、サンジエゴ、カリホルニア州）を使用して説 明書に従い正確に精製する。線状化されたpcDNA3は、HeLa核抽出物インビトロ転 写系(HeLa Nuclear Extract in vitro Transcription System)(プロメガ(Promeg a)、マジソン(Madison)、ウイスコンシン州)により、３μｇの線状化pcDNA3，40 0μＭの各リボヌクレオチド、３mMのMgCl2、および８単位のHeLa細胞核抽出物を 含有する反応で転写される。この25μｌの反応物を35℃で１時間インキュベート する。１単位のRQI DNAase(プロメガ(Promega)、マジソン(nadison)、ウィスコ ンシン州）および40単位のRNasin（プロメガ（Promega)、マジソン(Madison)、 ウィスコンシン州）を反応物に添加し、37℃で30分間インキュベートしてDNAの 鋳型を除去する。この反応は、ストップ・ミックス（Stop Mix）（HeLa抽出物と 一緒に供給される）175μｌの添加により終了する。反応物は、同容量のフェノ ール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）で抽出し、続いてク ロロホルム：アミルアルコール（24：１）で抽出する。反応物を500μｌの無水 エタノールで沈殿させる。このRNAを12,000×Ｇで15分間遠心分離してペレット 化する。このペレットを80％エタノールで濯ぎ、20μｌの水に再懸濁する。 SP6プロモーターに相補的なプライマー（ATTTAGGTGACACTATAG，BRL社(BRL Cor p.)、ベセスダ（Bethesda）、メリーランド州）は、10pmolのプライマーを２倍 過剰のガンマ32Ｐ ATP（ICN社(ICN Corp.)、アーバイン（Irvine）、カリホルニ ア州）、10単位のT4ポ リヌクレオチドキナーゼ（プロメガ(Promega)、マジソン(Madison)、ウィスコン シン州）およびIXキナーゼ緩衝液（T4キナーゼと共に供給される）と混合するこ とにより、５’末端を32Ｐで標識する。反応物を37℃で30分間、次に95℃で５分 間インキュベートする。 インビトロで転写したRNA 10μｌを1.5pmolのプライマーと混合することによ り、RNAを標識したプライマーにアニーリングする。この混合物を90℃に加熱し て、徐々に冷却する。この混合物を、50mMのトリス−HCl pH8.3，10mMのMgCl2， 50mMのNaCl，１mMのDTT，10μｍの各dNTP、および15単位のAMVリバース・トラン スクリプターゼ（AMV Reverse Transcriptase）（USB社(UAB Corp.)、クリーブ ランド、オハイオ州）の中に入れる。この反応混合物を42℃で30分間インキュベ ートする。反応は、１／３容量の95％ホルムアミド、20mMのEDTA，0.05％ブロモ フェノール・ブルー、および0.05％のキシレン・シアノール・FF（Xylene Cyano l FF）の添加により終了する。 pcDNA3プラスミドは、上記と同一の32Ｐ標識プライマーを使用して、fmolDNA 配列決定系（fmol DNA Sequencing System）（プロメガ(Promega)、マジソン(Ma dison)、ウィスコンシン州）を正確に指示書の通りに使用することにより配列決 定される。配列決定反応物は、プライマーを伸長したインビトロRNA反応物２μ ｌに隣接した６％変性ゲル上で展開される。このゲルを1600Ｖで１時間電気泳動 し、乾燥し、そしてフィルムに一晩暴露させる。転写開始部位を決定するため、 全長cDNAバンドをpcDNA3配列のレーンと比較する。この方法を使用して、CMVプ ロモーターの転写開始部位は、CMVプロモーターのちょうど39塩基下流であるヌ クレオチド番号858のＧ残基にあると決定される（インビトロジェンのpcDNA3ベ クターの番号づけによる）。 次にpVGELVISの作成のための上記方法を使用して、pcDNA3プラスミドからのCM Vプロモーターを、重複PCRによりシンドビスcDNAに並列にする。上記方法により 、任意のRNAポリメラーゼIIプロモーターの正確な転写開始点を決定することが でき、ELVIS配置のプロモーターの適切な並列配置が可能になる。ELVIS配置の誘 導可能なプロモーターの使用により、トランスフェクションされた細胞株の感染 の開始を制御することが可能になる。実施例３ RNAおよびプラスミドDNAシンドビスベクターの調製Ａ．シンドビスベーシックベクターの作成 塩基性シンドビスベクターの作成の最初の工程は、ウイルス５’および３’末 端からの別々の成分を含有する２つのプラスミドサブクローン（これらは次に塩 基性遺伝子転移ベクターを組み立てるために使用される）の生成である。最初の プラスミドサブクローンは、ウイルスの３’末端に40個の末端ヌクレオチドを含 有し、dA：dTヌクレオチドの25塩基ストレッチを含有する。ベクターの３’末端 は、下記のプライマーの配列を有するように化学合成される。順方向プライマー：SIN11664F(緩衝配列/NotＩ部位／SINヌクレオチド11664〜11 698)： 5'-TATATGCGGCCGCTTTCTTTTATTAATCAACAAAATTTTGTTTTTAA （配列番号 ）逆方向プライマー：SINXba 11700R(緩衝配列/SacＩ部位dT25/SINヌクレオチド11 700〜11692）： 5'-TATATGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATGTTAAAA （配列番号 ） 上記オリゴヌクレオチドは、10mMのMgCl2の存在下で等モル濃度で混合され、1 00℃に５分間加熱されて、徐々に室温に冷却される 。次にこの部分的に２本鎖の分子をクレノー（Klenow）DNAポリメラーゼと50μ ＭのdNTPを使用して完全にする。次にこの89塩基対分子をNotＩとSacＩで消化し 、２％ヌシーブ(NuSieve)／１％アガロースゲルで精製し、pKS II＋プラスミド( NotＩとSacＩで消化し、そして10：１モル過剰の挿入：ベクター比のCIAPで処理 された）中に結合する。この作成体は、pKS II３’SINと呼ぶ。 第２のプラスミドサブクローンは、シンドビスの５’末端RNAポリメラーゼプ ロモーターを含む５’の7，643塩基対を含有する。このクローンの３’末端は、 下記の配列を有する逆方向のプライマーによるPCR増幅により誘導される。逆方向プライマー：SINXho7643R(緩衝配列/XhoＩ部位/SINヌクレオチド7643〜76 21)： 5'-TATATCTCGAGGGTGGTGTTGTAGTATTAGTCAG （配列番号 ） この逆方向プライマーは、ウイルスヌクレオチド7643〜7621にマップされ、結 合コア成分の３’末端から41塩基対下流にある。さらに、ウイルスヌクレオチド 7643は、構造蛋白翻訳開始点から４ヌクレオチド上流にある。XhoＩ認識配列よ りなる６個のヌクレオチドが後に続く。このプライマーの最初の５個の５’ヌク レオチドは、PCRアンプリコン生成物の充分な消化のための「緩衝配列」として 作用するために含まれる。 この反応で順方向プライマーは、プライマー2A（実施例１に記載）であり下記 の配列を有する： ATACTAGCCACGGCCGGTATC （配列番号 ） 上記プライマーをpVGSP6GENrepプラスミドと共に使用するPCR実験から生じた4 510塩基対アンプリコン生成物は、酵素SfiＩおよびXhoＩで消化される。生じた2 526塩基対断片は、ゲル精製される。 このシンドビスcDNAクローンpVGSP6GENrepは、ApaＩおよびSfiＩで消化される。 5144塩基対断片は、ゲル精製されて2526塩基対のSfiＩ/XhoＩ断片、およびApaＩ とXhoＩで消化してCIAPで処理したpKS II＋プラスミドと一緒に結合される。pKS II＋プラスミドに含有される５’末端にRNAポリメラーゼプロモーターを含むシ ンドビスヌクレオチド１〜7643を有するクローンが単離される。この作成体は、 pKS II５’SINと呼ぶ。 完全に塩基性のベクターの組み立ては、pKS５’SINをXhoＩとSacＩで消化し、 CIAPで処理し、そして大きな10,533塩基対断片をゲル精製することにより達成さ れる。このpKS５’SINの10,533塩基対断片は、pKS II３’SINのXhoＩとSacＩで の消化から生じる168塩基対の小さい断片と一緒に結合される。この作成体は、p KSSINBVと呼び、概略を図４に示す。 シンドビスベクタークローンのインビトロ転写から生じるRNAでトランスフェ クトされた細胞中の異種遺伝子の発現を証明するために、ホタルのルシフェラー ゼレポーター遺伝子をシンドビスベーシックベクターに挿入する。この実験は、 シンドビスベクターの全機能を証明する。 Ｂ．シンドビスルシフェラーゼベクターの作成 シンドビスルシフェラーゼベクターの作成は、３つの独立のプラスミド： pK S II５’SIN，pKS II３’SIN、およびpGL2−塩基性ベクターの成分を一緒に組み 立てることにより行われる。pGL-２ベクタープラスミド（プロメガ(Promega)、 マジソン(Madison)、ウィスコンシン州）は、ホタルルシフェラーゼ全遺伝子を 含有する。このルシフェラーゼ遺伝子を、まずpKS II３’SINプラスミド中に挿 入する。これは、pGL2−塩基性ベクターをBamHＩとHind IIIで消化して生じる断 片を含有する2689塩基対のルシフェラーゼのゲル精製、 およびpKS II３’SINをBamHＩとHind IIIでの消化しCIAPで処理して生じる3008 塩基対の大きなゲル精製された断片との結合により行われる。この作成体は、pK S II３’SIN-lucと呼ぶ。 シンドビスルシフェラーゼベクターの最終組み立ては、pKS II５’SINをXhoＩ とSacＩで消化し、CIAPで処理し、そして大きな10,533塩基対断片をゲル精製す ることにより行われる。このpKS II５’SINの10,533塩基対断片は、pKS II３’S IN-lucのXhoＩとSacＩを用いる消化により生じる2854塩基対の小さい断片と一緒 に結合される。この作成体は、全シンドビス非構造遺伝子コーディング領域とゲ ノム複製に必要な３’ウイルス成分を含有する。このホタルルシフェラーゼ遺伝 子を、これら２つのウイルス５’および３’成分の間に配置する。このベクター は、pKSSINBV-lucとして公知であり、概略は図４に示される。このFfiＩおよびS acＩ間のSIN-BV作成体は、pGVELVISのFfiＩおよびSacＩ部位間に交換される。異 種遺伝子の発現は、BHK細胞へのトランスフェクション後に観察される。 Ｃ．トランスフェクションされ感染されたBHK細胞中のルシフェラーゼの発現 シンドビスベーシックベクターの機能を試験するために、実施例１に記載した ように、SacＩで消化して線状化した、pKSSINBV-lucから、インビトロで転写し たRNAでトランスフェクションした細胞中のルシフェラーゼの発現を行った。さ らに、BspEＩを用いてpVGSP6GENrepを消化して、非構造遺伝子領域の大部分が欠 如した相補的パッケージングベクターを作成し、希釈条件下で結合させた。この 作成体はpVGSP6GENdlBspとして知られ、塩基422〜7,054の間の非構造遺伝子配列 が欠如している。このクローンは8,008塩基対であり、その概略を図５に示す。p VGSP6GENdlBspのインビトロの転写は 実施例１に示した通りであり、XbaＩにより線状化する。トランスフェクション した細胞株のルシフェラーゼの発現は、トランスフェクション後24時間目に行う 。転写生成物をインビトロでリポフェクチン（Gibco-BRL，Gaithersber、メリー ランド州）と複合体を形成させて、トランスフェクションと同時トランスフェク ションを行う。さらに１mlの上澄液を用いてBHK細胞のコンフルエントな単層を 感染させ、感染後24時間目にルシフェラーゼの発現を試験する。この実験の結果 を図６に示す。結果は、BHK細胞のトランスフェクション後に多量のレポーター 遺伝子が発現され、インビトロで転写したpVGSP6GENdlBspで細胞を同時トランス フェクションすると発現活性が移行（例えば、パッケージング）することを明瞭 に示す。 Ｄ．変化した結合領域SINDBISベクターの作成 １．結合領域を不活性化するために、NSP4カルボキシ末端と結合領域の重複部 分内のヌクレオチドを変化させ、Sindbisに対応するベクターヌクレオチドをサ ブゲノム開始点の前でSindbisヌクレオチド7598で停止させる。この作成の概略 を図７に示す。 簡単に説明すると、以下の配列を有する逆プライマーを用いて非緊縮反応サイ クル条件下でpKSSINBVクローンから断片をPCR増幅する： TATATGGGCCCTTAAGACCATCGGAGCGATGCTTTATTTCCCC （配列番号 ） 逆方向プライマー中の下線を引いた塩基は、コードされたアミノ酸に影響しない 結合領域のヌクレオチド変化に対応する（下記）。すべてのヌクレオチド変化は トランスバージョン（塩基変換）である。 NSP4の３’末端（ウイルスヌクレオチド7580〜7597）： （逆方向プライマーからヌクレオチド変化が生じる） 逆方向プライマーは、シンドビスヌクレオチド7597〜7566に相補的であり（ただ し、結合領域が変化した領域は除く）、効率的な酵素消化のための５’末端TATA Tテール「緩衝配列」の後に、５’末端に６個のヌクレオチドのApaＩ認識部位を 有する。 この反応の順方向プライマーは、下記の配列を有するプライマー2Aである（実 施例１に記載）： ATACTAGCCACGGCCGGTATC（配列番号 ） 前述のプライマーを用いるpKSSINBVによるPCR反応から得られる4,464塩基対ア ンプリコンをSfiＩとApaＩで消化し、ゲル精製された2,480塩基対断片を、pKS I I＋ApaＩの消化とCIAPによる処理により得られるゲル精製した5,142塩基対断片 と結合する。前述の結合領域に変化を有しシンドビスヌクレオチド１に細菌性T7 プロモーターを含むシンドビスヌクレオチド１〜7597よりなる作成体を、pKS５ ’SINdlJRと呼ぶ。 不活性化した結合領域ベクターの最終的作成は、pKS５’SINdlJRをApaＩで消 化して得られる7,622塩基対の大きなシンドビス断片を、pKS II３’SINのApaＩ による消化とCIAPによる処理により得られる3,38塩基対断片と結合することによ り行われる。３’シンドビス成分と比較して５’シンドビス成分の陽性の配向は 、制限エンドヌクレアーゼ分析により確認される。 サブゲノムmRNAの開始と合成は、pKSSINBVdlJRベクターからは起きない。この 仮説を検証するためにpKSSINBVとpKSSINBVdlJRのRNase保護aseを行う。ウイルス ヌクレオチド7,598にウイルスサブゲノムRNA開始点を有する、一部が結合領域に 相補的な32Ｐ標識RNA プローブを用いて、pKSSINBVとpKSSINBVdlJRベクターでBHK-21細胞をトランスフ ェクションして得られるウイルスRNAとハイブリダイゼーションさせる。RNase保 護測定法は、pKSSINBVでトランスフェクションした細胞は２つの断片（ゲノム性 のサブゲノム性）を有し、pKSSINBVdlJRでトランスフェクションした細胞はゲノ ム特異性の１つの断片のみを有することを示す。これらの結果は、pKSSINBVdlJR 中の結合領域が確かに不活性化されていることを証明する。 ２．サブゲノムRNAメッセージに対応する領域からのゲノムRNAの翻訳を試験する ために、上記pKSSINBVdlJRベクターの不活性化した結合領域にルシフェラーゼレ ポーター遺伝子を挿入する。これはpKSSINBVdlJRプラスミドをXhoＩとSacＩで消 化しCIAPで処理をして、得られる10,197塩基対断片をゲル精製することにより作 成される。pKSSINBVdlJR断片を、pKS II３’SIN-lucをXhoＩとSacＩで処理して 得られる2854断片と結合させる。この作成体は、不活性化した結合領域中でシン ドビスヌクレオチド7597で停止する領域をコードする全シンドビス非構造遺伝子 と、ゲノム複製に必要な３’ウイルス成分を含有する。ホタルのルシフェラーゼ 遺伝子はこれらの２つの５’と３’成分の間に入れる。このベクターをpKSSINBV dlJR−lucと呼ぶ。 pKSSINBVdlJR−lucベクターからのレポーター遺伝子の発現を、トランスフェ クションしたBHK-21細胞中で試験する。機能性節蛋白の翻訳を、検出にルミノメ ーターを用いてルシフェリン発光測定法により測定する。この測定法の感度は１ ×10〜20モル（ルシフェラーゼ）である。ルシフェラーゼの分子領域は62,000ダ ルトンであるため、この検出限界は6,020分子である。すなわち典型的な実験に おいても、もし60mMシャーレ中の１×106細胞の0.6％がpKSSINBVdlJR−lucベク ターでトランスフェクションされ、かつもしこれら のトランスフェクションされた細胞がただ１つのルシフェラーゼの機能性分子を 発現するなら、本測定法によりこの酵素活性を測定される。この実験ではpKSSIN BVdlJR−lucベクターの結合領域領域が不活性化されていることを証明すること が重要である。これはRNase保護測定法により行われ、前述のプライマーを用い て、pKSSINBVdlJR−lucとpKSSINBV−lucベクターでトランスフェクションした細 胞中で合成したウイルスRNAを比較する。 ３．すでに定義されているように（Levisら、J．Virol．64：1726-1733，1990） シンドビスヌクレオチド7579-7602よりなる、最小-19>+5結合領域各オリゴヌク レオチド対を、インビトロで合成し、下記のようにApaＩとXhoＩ認識配列を隣接 （flank）させる： オリゴヌクレオチド１： CATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTC（配列番号 ） オリゴヌクレオチド２： TCGAGACTATTTAGGACCACCGTAGAGATGGGCC（配列番号 ） 上記のオリゴヌクレオチドを10mMのMg2+の存在下で混合し、５分間100℃に加熱 し、ゆっくり室温に冷却する。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、以下の ように調製した挿入体：pKSSINBVdlJRベクターのモル比25：１で結合する： Xh oＩによる完全な消化、次に１分子当たり（可能な２つの切断のうち）１つのApa Ｉ誘導切断がもたらす部分的条件下でApaＩによる消化、10,655塩基対断片のゲ ル精製、そしてCIAPによる処理。不活性化した結合領域核中で停止し、合成結合 領域核に結合し、そして複製に必要な３’ウイルス成分が後に続き、pKS II＋プ ラスミドに含有されている、全NSPコード領域を含有するこのベクターを、pKSSI NdlJRsjrcと呼ぶ。 サブゲノムmRNA合成のレベルを制御するために、プラスミドpKSSINdlJRsjrc中 に縦列で挿入された合成結合領域核をさらに修飾する 。結合領域核のこれらの修飾は２つのアプローチにより行われる：結合領域核内 のヌクレオチド変化、または本物のウイルス配列によると隣接するシンドビスヌ クレオチド５’および３’結合領域核末端での延長。ウイルスヌクレオチド7579 -7602にわたる最小結合領域核を以下に示す： ATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGT（配列番号 ） ８種類のアルファウイルス内のゲノム配列を比較することにより、結合領域核 内に配列の多様性があることが証明されている。特定の結合領域の位置について 、シンドビスヌクレオチドの後に、他のウイルスで見いだされる対応するヌクレ オチドを以下に示す： シンドビスヌクレオチド7579，7580，7581，7583，7589，7590，7591，7592の 結合領域の変化は、結合領域内で重複するNSP4のカルボキシ末端のすべての５個 のコドン内の、アミノ酸コーディング能の変化につながる。NSP4コーディィング 能のレベルと結合領域対活性のレベルでのアルファウイルス間の結合領域中に見 られる変化は 、機能に影響しないNSP4と結合領域中の許容変化か、または他方で単に異なるウ イルスであることのいずれかを示すか、またはその両方を表しているのかも知れ ない。いずれにしてもここに示した結合領域の変化はそこからNSP蛋白の合成は 起きない縦列に挿入された結合領域核に関する。前述のように全NSP領域の翻訳 はpKSSINBVdlJR作成体から起きる。シンドビスヌクレオチド7600と7602の結合領 域の変化は、NSP4停止コドンの下流で構造蛋白開始コドンの上流にある。 いくつかのアルファウイルス株の間で観察される結合領域核内のヌクレオチド の差異の位置を、本明細書中では許容変化と呼ぶ。いくつかのアルファウイルス 株の間で観察される結合領域核内のヌクレオチドの位置を、本明細書中では非許 容変化と呼ぶ。 合成結合領域核からのサブゲノムmRNA開始のレベルを低下させるために、許容 変化に対応するヌクレオチド内と非許容変化に対応するヌクレオチド内で別々に 変化させる。許容変化に対応する結合領域ヌクレオチドは上記の表に示す。配列 決定した８種類のアルファウイルスの間で変化が見られない14の結合領域ヌクレ オチド（セムリキ森林ウイルス、ミドルバーグウイルス、ロスリバーウイルス、 オニョンヨンウイルス、イースタン馬脳炎ウイルス、ウェスタン馬脳炎ウイルス そしてベネズエラ馬脳炎ウイルス）を以下に示す。 ヌクオレチド番号： 7582 7584 7585 7586 7587 7588 7593 7594 7595 7596 7597 7598 7599 7601 アルファウイルスの間で観察される結合領域の変化は、特定のアルファウイル スRNAポリメラーゼとその同じ起源の結合領域の間の相互作用を反映するのかも 知れない。すなわち、「許容」ヌクレオチド間の変化は、結合領域の「非許容」 ヌクレオチド間の変化と同様に、サブゲノムmRNA合成レベルを顕著に低下させる かも知れない。一方これらは、結合領域核内の許容変化の部位かも知れない。 結合領域核内の１つの本物の非許容変化は、サブゲノムmRNA開始点に対応する シンドビスヌクレオチド7598のようである。プラスミドpKSSINdlJRsjrcの縦列に 挿入された結合領域核のヌクレオチド変化は、ここでは記載していない。 合成最小−19->＋５結合領域核内の全体の許容ヌクレオチドの置換は、インビ トロで合成され、ApaＩとXhoＩ認識配列が隣接する 以下のオリゴヌクレオチド対で行われる： オリゴヌクレオチド１： CCCTTGTACGGCTAACCTAAAGGAC（配列番号 ） オリゴヌクレオチド２： TCGAGTCCTTTAGGTTAGCCGTACAAGGGGGCC（配列番号 ） 上記のオリゴヌクレオチドを10mMのMgの存在下で混合し、５分間100℃に加熱し 、ゆっくり室温に冷却する。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、以下のよ うに調製した挿入体：pKSSINBVdlJRベクターのモル比25：１で結合する： Xho Ｉによる完全な消化、次に１分子当たり（可能な２つの切断のうち）１つのApa Ｉ誘導切断がもたらす部分的条件下でApaＩによる消化、１分子当たり（可能な ２つの切断のうち）１つのApaＩ誘導切断がもたらされ、10,655塩基対断片のゲ ル精製、そしてCIAPによる処理。このベクターを、pKSSINdlJRsjrcと呼ぶ。 結合領域核内の13個の非許容ヌクレオチド（ヌクレオチド7598は変化していな い）のそれぞれを、以下の規則により、大きな塩基変換を行う： Ａ−＞Ｃ Ｔ−＞Ｇ Ｇ−＞Ｔ Ｃ−＞Ａ 例えば、インビトロで合成され、ApaＩとXhoＩ認識配列が隣接する以下のオリ ゴヌクレオチド対を用いてヌクレオチド7582をＴからＧに変化させる： オリゴヌクレオチド１： CATCGCTACGGTGGTCCTAAATAGTC（配列番号 ） オリゴヌクレオチド２： TCGAGACTATTTAGGACCACCGTAGCGATGGGCC（配列番号 ） （非許容結合領域部位の塩基変換を起こすヌクレオチド配列太字で示す） 上記のオリゴヌクレオチドを10mMのHg2+の存在下で混合し、５分間100℃に加熱 し、ゆっくり室温に冷却する。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、以下の ように調製した挿入体：pKSSINBVdlJRベクターのモル比25：１で結合する： Xh oＩによる完全な消化、次に１分子当たり（可能な２つの切断のうち）１つのApa Ｉ誘導切断がもたらす部分的条件下でApaＩによる消化、１分子当たり（可能な ２つの切断のうち）１つのApaＩ誘導切断がもたらされ、10,655塩基対断片のゲ ル精製、そしてCIAPによる処理。このベクターを、pKSSINdlJRsjrc7582と呼ぶ。 前述の変換規則を用いて、ApaＩとXhoＩ認識配列が隣接する前述の12個の別々 のオリゴヌクレオチド対を用いて、結合領域核の12個の残存する非許容部位を変 化させる。これらのベクターは以下のように呼ぶ。 pKSSINdlJRsjrNP7584 pKSSINdlJRsjrNP7585 pKSSINdlJRsjrNP7586 pKSSINdlJRsjrNP7587 pKSSINdlJRsjrNP7588 pKSSINdlJRsjrNP7593 pKSSINdlJRsjrNP7594 pKSSINdlJRsjrNP7595 pKSSINdlJRsjrNP7596 pKSSINdlJRsjrNP7597 pKSSINdlJRsjrNP7599 pKSSINdlJRsjrNP7601 サブゲノムmRNA合成の相対的レベルを試験するために、ルシフェラーゼレポー ター遺伝子を、修飾された縦列結合領域ベクター中に挿入する。この作成は、縦 列に挿入された合成結合領域核ベクターをXhoＩとSacＩで消化し、CIAPで処理し 、得られる約10,200塩基対断片をゲル精製することにより行われる。こうして処 理したベクター断片を、XhoＩとSacＩのよるpKS II３’SIN-lucの消化により得 られる2854塩基対の小断片と結合させる。これらの作成体は、不活性化結合領域 中のシンドビスヌクレオチド7597で停止する全シンドビス非構造遺伝子コード領 域、縦列に挿入された合成結合領域核（修飾されているかまたは修飾されていな い）、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子、およびゲノム複製に必要な３’ウイルス 成分を含有する。これらのベクターの名前は以下の通りである： 直前に示したすべてのルシフェラーゼベクターの翻訳効率が同じであると仮定 して、BHK-21細胞によるトランスフェクションの16時間後にルシフェラーゼ産生 のレベルを比較することによりサブゲノム合成の相対的レベルを測定する。サブ ゲノム転写の相対的レベルは、ベクターpKSSINBV-lucとpKSSINdlJRsjrc-lucによ るルシフェラーゼ産生を、前記の修飾された結合領域ルシフェラーゼベクターの すべてと比較することにより測定する。 縦列に挿入された合成結合領域核（pKSSINdlJRsjrcとその誘導体）を含有する ベクターは、pKSSINBV作成体に比較してサブゲノムmRNA発現のレベルが低いこと が予測される。ある実施態様においては 、pKSSINdlJRsjrcベクターから観察されるサブゲノムmRNA発現のレベルを上げる ことが必要かも知れない。これは、本物のウイルス配列に従って、５’および３ ’合成結合領域核末端を11個の追加の隣接シンドビスヌクレオチドで延長するこ とにより行われる。 以下に示す合成オリゴヌクレオチド対はインビトロで合成され、最小結合領域 核の24ヌクレオチド（太字で示してある）を含む46個のシンドビスヌクレオチド を含有する。シンドビスヌクレオチドは、以下に示すようにAPaＩとXhoＩが隣接 している： オリゴヌクレオチド１： CGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGT ACC（配列番号 ） オリゴヌクレオチド２： TCGAGGTACTATGCTGACTATTTAGGACCACCGTAGAGATGCTTTA TTTC-CGGGCC（配列番号 ） 上記のオリゴヌクレオチドを10mMのMgの存在下で混合し、５分間１00℃に加熱し 、ゆっくり室温に冷却する。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、以下のよ うに調製した挿入体：pKSSINBVdlJRベクターのモル比25：１で結合する： Xho Ｉによる完全な消化、次に１分子当たり（可能な２つの切断のうち）１つのApa Ｉ誘導切断がもたらす部分的条件下でApaＩによる消化、10,655塩基対断片のゲ ル精製、そしてCIAPによる処理。不活性化した結合領域核中で停止し、延長した 合成結合領域に結合し、そして複製に必要な３’ウイルス成分が後に続き、pKS II＋プラスミドに含有されている、全NSPコート領域を含有するこのベクターを 、pKSSINdlJRsjrcと呼ぶ。 サブゲノムmRNA合成の相対的レベルを試験するために、ルシフェラーゼレポー ター遺伝子を、延長された縦列結合領域pKSSINdlJRsexjrベクター中に挿入する 。この作成は、pKSSINdlJRsexjrプラス ミドをXhoＩとSacＩで消化し、CIAPで処理し、得られる約10,200塩基対断片をゲ ル精製することにより行われる。こうして処理したベクター断片を、XhoＩとSac ＩのよるpKS II３’SIN-lucの消化により得られる2854塩基対の小断片と結合さ せる。この作成体は、不活性化結合領域中のシンドビスヌクレオチド7597で停止 する全シンドビス非構造遺伝子コード領域、縦列に挿入された延長合成結合領域 、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子、およびゲノム複製に必要な３’ウイルス成分 を含有する。このベクターの名前はpKSSINdlJRsexjr-lucである。 サブゲノム転写の相対的レベルは、ベクターpKSSINBV-lucとpKSSINdlJRsjrc-l ucベクターによるルシフェラーゼ産生を、pKSSINdlJRsexjr-lucによるルシフェ ラーゼ産生と比較することにより測定する。実施例４ Ａ．シンドビスベクターへのアデノウイルス初期領域E3遺伝子の挿入 繰り返し投与による治療が必要な場合のベクター感染細胞中で発現されるウイ ルス特異的蛋白に対する宿主CTL指向応答を阻害するために、アデノウイルス２ 型（Ad2）E3/19K遺伝子ATCC VR-846を、pKSSINdlJRsjrcプラスミドの結合領域核 のすぐ下流にクローン化する。 簡単に説明すると、Ad2を許容細胞株（例えば、Hela細胞またはVero細胞）中 で増殖させ、細胞変性作用が確認された後、細胞溶解液からビリオンを精製し、 ウイルスからAd2 DNAを精製する。 Ad2 DNA E3/19K遺伝子（アミノ末端シグナル配列を含有し、後にE3 19K蛋白が それ自身を小胞体内に埋め込ませる管腔内（intraluminal）ドメインとカルボキ シ末端細胞質性テールが続く）を、ウイ ルスヌクレオチド28,812と29,288の間に位置させる。ウイルスゲノムDNAからのA d2 E3 19K遺伝子の単離は、以下のプライマー対を用いてPCR増幅により行われる ： Ad2 E3順方向プライマー（Ad2ヌクレオチド28,812〜28,835）： 5'-TAT ATC TCC AGA TGA GGT ACA TGA TTT TAG GCT TG-3' （配列番号14） Ad2 E3逆方向プライマー（Ad2ヌクレオチド29,241〜29,213）： 5'-TAT ATA TCG ATT CAA GGC ATT TTC TTT TCA TCA ATA AAA C-3'（配列番号15） Ad2相補的配列に加えて、両方のプライマーは、PCR増幅アンプリコン生成物の 効率的な酵素消化のための５つのヌクレオチド「緩衝配列」をその５’末端に含 有する。順方向プライマーの配列の後にはXhoＩ認識部位が続き、逆方向プライ マーでは配列の後にClaＩ認識部位が続く。すなわち５’から３’方向に、E3/19 K遺伝子はXhoＩとClaＩ認識部位が隣接している。Ad2 DNAからのE3/19K遺伝子の 増幅は、以下のPCRサイクルプロトコールを用いて行われる： 増幅に続いて、1.5％アガロースゲル上で451塩基対のアンプリコンが精製され 、次にXhoＩとClaＩ酵素で消化され、あらかじめ XhoＩとClaＩで消化したCIAPで処理したpKSSINdlJRsjrcプラスミドに結合させ る。このプラスミドpKSSINdlJRsjrcAdE3と命名する。同じクローニング戦略を用 いて、実施例２に記載の修飾合成結合領域ベクターのすべてにAd2 E3/19K遺伝子 を挿入する。 Ｂ．シンドビスベクターへのヒトサイトメガロウイルスH301遺伝子の挿入 繰り返し投与による治療が必要な場合のベクター感染細胞中で発現されるウイ ルス特異的蛋白に対する宿主CTL指向応答を阻害するために、ヒトサイトメガロ ウイルス（HCMV）H301遺伝子を、pKSSINdlJRsjrcプラスミドの結合領域核のすぐ 下流にクローン化する。 簡単に説明すると、HCMV AD169株(ATCC VR-538)を許容細胞株（例えば、初期 ヒト包皮繊維芽細胞（HFF）（GIBCO/BRL、ガイザースバーグ（Gaithersburg）、 メリーランド州）中で増殖させ、細胞変性作用が確認された後、細胞溶解液から ビリオンを精製し、ウイルスからHCMV DNAを精製する。 HCMV H301遺伝子を、ウイルスヌクレオチド23,637と24,742の間に位置させる 。ウイルスゲノムDNAからのHCMV H301遺伝子の単離は、以下のプライマー対を用 いてPCR増幅により行われる： HCMV H301順方向プライマー（緩衝配列/XhoＩ部位/HCMヌクレオチド23,637〜23, 660）： 5'-TAT ATC TCC AGA TGA TGA CAA TGT GGT GTC TGA CG-3' （配列番号16） HCMV H301逆方向プライマー（緩衝配列/ClaＩ部位/HCMヌクレオチド24,744〜24, 722）： 5'-TAT ATA TCG ATT CAT GAC GAC CGG ACC TTG CG-3' （配列番号17） HCMV H301遺伝子相補的配列に加えて、両方のプライマーは、PC R増幅アンプリコン生成物の効率的な酵素消化のための５つのヌクレオチド「緩 衝配列」をその５’末端に含有する。順方向プライマーの配列の後にはXhoＩ認 識部位が続き、逆方向プライマーでは配列の後にClaＩ認識部位が続く。すなわ ち５’から３’方向に、HCMV H301遺伝子はXhoＩとClaＩ認識部位が隣接してい る。HCMV DNAからのHCMV H301遺伝子の増幅は、以下のPCRサイクルプロトコール を用いて行われる： 増幅に続いて、1.0％アガロースゲル上で1,129塩基対のアンプリコン生成物が 精製され、次にXhoＩとClaＩ酵素で消化され、あらかじめXhoＩとClaＩで消化し たCIAPで処理したpKSSINdlJRsjrcプラスミドに結合させる。このプラスミドpKSS INdlJRsjrcH301と命名する。同じクローニング戦略を用いて、実施例３に記載の 修飾合成結合領域ベクターのすべてにHCMV H301遺伝子を挿入する。実施例５ シンドビスベクターからの多数の異種遺伝子の発現 プラスミドpBS-ECAT（Jangら、J．Virol 63：1651，1989）は、内部リボザイ ム侵入部位（IRES）を含有する、ウイルスゲノムのヌクレオチド260〜848からの 脳心筋炎ウイルス（EMCV）の５’非翻訳領域を含む。EMCVヌクレオチド260〜848 は、以下のプライマー を用いてPCRによりpBS-ECATから増幅される： EMCV IRES順方向プライマーＡ(ApaＩ部位でベクターpKSSINdlJRの無能化した結 合領域の隣への挿入のため）： 5'-TAT ATG GGC CCC CCC CCC CCC CCC AAC G-3' （配列番号18） EMCV IRES順方向プライマーＢ（ClaＩ部位で停止し、NcoＩ部位で開始する異種 遺伝子の間への挿入のため）： 5'-TAT ATA TCG ATC CCC CCC CCC CCC CCA ACG-3' （配列番号19） EMCV IRES逆方向プライマー（プライマーＡまたはＢとともに使用される）： 5'-TAT ATC CAT GGC TTA CAA TCG TGG TTT TCA AAG G-3' （配列番号20） 順方向プライマーＡと逆方向プライマーによる増幅から得られるアンプリコン は、５塩基対「緩衝配列」内でApaＩ（5- NcoＩ認識部位が隣接している。 順方向プライマーＢと逆方向プライマーによる増幅から得られるアンプリコン は、５塩基対「緩衝配列」内でClaＩとNcoＩ認識部位が隣接している。 pBS-ECATプラスミドからのEMCV IRES配列の増幅は、以下のPCRサイクルプロト コールを用いて行われる： pKSSINBVdlJRベクターへの挿入のために、589塩基対のアンプリコンをApaＩと NcoＩで消化し、１％アガロースゲル上で精製し、ApaＩとNcoＩで消化したCIAP で処理したベクターに結合させる。EyiCV IRES挿入体のすぐ下流に挿入される異 種遺伝子の開始コドンに対応するATGは、NcoＩ部位（CCATGG）を含有するように 修飾する。 異種遺伝子の間のpKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcベクターへの挿入のために 、589塩基対のアンプリコンをApaＩとNcoＩで消化し、１％アガロースゲル上で 精製し、ApaＩとNcoＩで消化しCIAPで処理した２シストロン性異種遺伝子ベクタ ーに結合させる。２シストロン性異種遺伝子の構造では、上流異種遺伝子の３’ 末端はClaＩ認識部位で停止するように修飾される。EMCV IRES挿入体のすぐ下流 に挿入される第２の下流異種遺伝子の開始コドンに対応するATGは、NcoＩ部位（ CCATGG）を含有するように修飾する。すなわち５’から３’へ、成分は以下の順 序である：pKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrc−遺伝子＃１-Cla/Nco EMCV IRES遺 伝子＃２−３’SIN。修飾された結合領域のすべての実施例２に記載のベクター への挿入は、pKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcベクターについてここで記載した 戦略に従う。 ２シストロン性異種構造を含有するpKSSINBVdlJRベクターは、前述の各EHCV I RESアンプリコンを用いて作成される。前述のように最初のEMCV IRESアンプリコ ンはApaＩとNcoＩ部位が隣接し、ApaＩ部位で無能化した結合領域のすぐ下流に 挿入される。このEMCV IRES配列の後に、ClaＩ認識部位で停止する最初の異種遺 伝子が続く。この最初の異種遺伝子の後に、ClaＩとNcoＩ認識部位に隣接される アンプリコンを用いて、第２のEMCV IRES配列が続く。第２の異種遺伝子は第２ のEMCV IRES配列の後に続く。すなわち５’から３’へ、成分は以下の順序であ る：SINBVdlJR-Apa/Nco EMCVＩRES遺伝子＃１−Cla/Nco EMCV IRES遺伝子＃２− ３’SIN。 プラスミドpP２−５’（Pelletierら、Mol．Cell Biol．８：1103，1988）は 、ウイルスゲノム（ポリオIRESを含有する）のヌクレオチド１〜1,872からのポ リオウイルスP2／ランシング(Lansing)株の５’非翻訳領域を含む。ポリオウイ ルスヌクレオチド320〜631は、以下のプライマー対を用いてPCRによりpP２−５ ’から増幅される： ポリオIRES順方向プライマーＡ(ApaＩ部位でベクターpKSSINBVdlJRの無能化した 結合領域の隣への挿入のため)： 5'-TAT ATG GGC CCT CGA TGA GTC TGG ACG TTC CTC-3' （配列番号21） ポリオIRES順方向プライマーＢ（ClaＩ部位で停止しNcoＩ部位で開始する異種遺 伝子の間への挿入のため）： 5'-TAT ATA TCG ATT CGA TGA GTC TGG ACG TTC CTC-3' （配列番号22） ポリオIRES逆方向プライマー（プライマーＡまたはＢとともに使用される）： 5'-TAT ATC CAT GGA TCC AAT TTG CTT TAT GAT AAC AAT C-3' （配列番号23） 上記のポリオIRES順方向プライマーＡ／逆方向プライマー対によるPCRから得 られるアンプリコンは、５塩基対「緩衝配列」内でApaＩとNcoＩ認識部位が隣接 している。 上記のポリオIRES順方向プライマーＢ／逆方向プライマー対によるPCRから得 られるアンプリコンは、５塩基対「緩衝配列」内でClaＩとNcoＩ認識部位が隣接 している。 pP２−５’プラスミドからのポリオIRES配列の増幅は、実施例５のPCRプロト コールを用いて行われる： pKSSINBVdlJRベクターへの挿入のために、333塩基対のアンプリコンをApaＩと NcoＩで消化し、1.5％アガロースゲル上で精製し、ApaＩとNcoＩで消化しCIAPで 処理したベクターに結合させる。ポリオIRES挿入体のすぐ下流に挿入される異種 遺伝子の開始コドンに対応するATGは、NcoＩ部位（CCATGG）を含有するように修 飾する。 異種遺伝子の間のpKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcベクターへの挿入のために 、333塩基対のアンプリコンをClaＩとNcoＩで消化し、1.5％アガロースゲル上で 精製し、ClaＩとNcoＩで消化しCIAPで処理した２シストロン性異種遺伝子ベクタ ーに結合させる。２シストロン性異種遺伝子の構造では、上流異種遺伝子の３’ 末端はClaＩ認識部位で停止するように修飾される。ポリオIRES挿入体のすぐ下 流に挿入される第２の下流異種遺伝子の開始コドンに対応するATGは、NcoＩ部位 （CCATGG）を含有するように修飾する。すなわち５’から３’へ、成分は以下の 順序である：pKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrc−遺伝子＃１−Cla/NcoポリオIRE S遺伝子＃２−３’SIN。修飾された結合領域のすべての実施例３に記載のベクタ ーへの挿入は、pKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcベクターについてこ こで記載した戦略に従う。 ２シストロン性異種構造を含有するpKSSINBVdlJRベクターは、前述の各ポリオ IRESアンプリコンを用いて作成される。前述のように最初のポリオIRESアンプリ コンはApaＩとNcoＩ部位が隣接し、ApaＩ部位で無能化した結合領域のすぐ下流 に挿入される。このポリオIRES配列の後に、ClaＩ認識部位で停止する最初の異 種遺伝子が続く。この最初の異種遺伝子の後に、ClaＩとNcoＩ認識部位に隣接さ れるアンプリコンを用いて、第２のポリオIRES配列が続く。第２の異種遺伝子は 第２のポリオIRES配列の後に続く。すなわち５’から３’へ、成分は以下の順序 である：SINBVdlJR-Apa/NcoポリオIRES遺伝子＃１−Cla/Nco EMCV IRES遺伝子＃ ２−３’SIN。 ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白mRNAの５’リーダー領域に対応する220塩基 対BiP cDNAは、PCRを用いてクローンpGEM5ZBiP５’から増幅される、。BiP cDNA に対応する配列は、元々ヒトGRP78遺伝子(Ting and Lee，DNA７：275-286，1988 )のバクテリオファージラムダhu28−１中で決定された。このPCR反応で使用され る順方向プライマーは、BiP cDNAが挿入されるシンドビスベクターに依存して異 なる。このPCR反応の逆方向プライマーは、シンドビスベクターと同じである。 シンドビスベクターpKSSINBVdlJRの無能化した結合領域のすぐ下流への挿入のた めのプラスミドからのpGEM5ZBiP５’からのBiP cDNA配列の増幅は、以下の順方 向プライマーを用いて行われる： 5'-TAT ATG GGC CCG GTC GAC GCC GGC CAA GAC-3' （配列番号24） ヌクレオチド12で始まるBiP cDNA相補的配列に加えて、このプライマーは、PC Rアンプリコン生成物の効率的な酵素消化のための５つのヌクレオチド「緩衝配 列」をその５’末端に含有する。この配 列の後にApaＩ認識部位が続く。 シンドビスベクターpKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcへの挿入のためのpGEM5Z BiP５’プラスミドからのBiP cDNA配列の増幅は、下記の順方向プライマーを用 いて増幅により行われる。これらのベクターについては、BiP cDNAは、シンドビ ス構造遺伝子に対応する領域に入れられる２つの異種遺伝子の間に挿入される。 5'-TAT ATA TCG ATG GTC GAC GCC GGC CAA GAC-3' （配列番号25） ヌクレオチド12で始まるBiP cDNA相補的配列に加えて、このプラスミドは、PC Rアンプリコン生成物の効率的な酵素消化のための５つのヌクレオチド「緩衝領 域」をその５’末端に含有する。この配列の後にClaＩ認識部位が続く。 シンドビスベクターpKSSINBVdlJR，pKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcへの挿入 のためのpGEM5ZBiP５’プラスミドからのBiP cDNA配列の増幅のための逆方向プ ライマーは、以下のものである： 5'-TAT ATC CAT GGT GCC AGC CAG TTG GGC AGC AG-3' （配列番号26） ヌクレオチド12で始まるBiP cDNA相補的配列に加えて、逆方向プライマーは、 PCRアンプリコン生成物の効率的な酵素消化のための５つのヌクレオチド「緩衝 配列」をその５’末端に含有する。この配列の後にNco I o認識部位が続く。 pGEM5ZBiP５’からのBiP cDNAの増幅は、前述のPCRプロトコールを用いて行わ れる： pKSSINBVdlJRベクターへの挿入のために、242塩基対のアンプリコンをApaＩと NcoＩで消化し、２％アガロースゲル上で精製し、ApaＩとNcoＩで消化しCIAPで 処理したベクターに結合させる。BiP cDNA挿入体のすぐ下流に挿入される異種遺 伝子の開始コドンに対 応するATGは、NcoＩ部位（CCATGG）を含有するように修飾する。 異種遺伝子の間のpKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcベクターへの挿入のために 、242塩基対のアンプリコンをClaＩとNcoＩで消化し、２％アガロースゲル上で 精製し、C1aＩとNcoＩで消化しCIAPで処理した２シストロン性異種遺伝子ベクタ ーに結合させる。２シストロン性異種遺伝子の構造では、上流異種遺伝子の３’ 末端はClaＩ認識部位で停止するように修飾される。BiP cDNA挿入体のすぐ下流 に挿入される第２の下流異種遺伝子の開始コドンに対応するATGは、NcoＩ部位（ CCATGG）を含有するように修飾する。すなわち５’から３’へ、成分は以下の順 序である：pKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrc−遺伝子＃１−Cla/Nco BiP cDNA遺 伝子＃２−３’SIN。修飾された結合領域のすべての実施例２に記載のベクター への挿入は、pKSSINBVまたはpKSSINBVdlJRsjrcベクターについてここで記載した 戦略に従う。 ２シストロン性異種構造を含有するpKSSINBVdlJRベクターは、前述の各BiP cD NAアンプリコンを用いて作成される。前述のように最初のBiP cDNAアンプリコン はApaＩとNcoＩ部位が隣接し、ApaＩ部位で無能化した結合領域のすぐ下流に挿 入される。このBiP配列の後に、ClaＩ認識部位で停止する最初の異種遺伝子が続 く。この最初の異種遺伝子の後に、ClaＩとNcoＩ認識部位に隣接されるアンプリ コンを用いて、第２のBiP cDNA配列が続く。第２の異種遺伝子は第２のBiP配列 の後に続く。すなわち５’から３’へ、成分は以下の順序である：SINBVdlJR-Ap a/Nco BiP遺伝子＃１−Cla/Nco BiP遺伝子＃２−３’SIN。 リボザイム読み通しを促進する配列は、pKSSINBVdlJRベクター中の無能化した 結合領域のすぐ下流に入れられ、これは非構造遺伝子停止から異種遺伝子へのベ クターmRNAのリボゾームスキャニングを 可能にする。この異種蛋白はリボゾームスキャニングによりゲノム長mRNAから発 現される。このベクターで感染された細胞中でサブゲノム転写は起きないため、 これは感染標的細胞の寿命を延長させるはずである。さらにこれらの同じリボゾ ームスキャニング配列は、ポリシストロン性サブゲノムmRNAに含有される異種遺 伝子の間に入れられる。pKSSINBVdlJRベクター中とポリシストロン性mRNA領域中 の異種遺伝子の間に使用されるリボゾームスキャニング配列は、以下の通りであ る： 5'-TTA ATT AAC GGC CGC CAC CAT GG-3'（配列番号27） 太字のコドンは、それぞれオーカー停止コドンとAUG開始コドンである。停止 コドンの周りの下線を引いた塩基はPacＩ認識部位であり、開始コドンの周りの 下線を引いた塩基はNcoＩ認識部位である。すでの証明されているように（Levin ら、Gene 108：167-174，1991）、開始コドンと停止コドンの間の15塩基対のシ ストロン間距離は効率的なリボゾーム読み通しを可能にする。塩基−９から＋１ までのATG開始コドンの周りの配列は、効率的な翻訳開始のためのKozakコンセン サス配列（Kozak，Cell 44：283-292，1986）に一致する。可能な場合はカルボ キシ末端アミノ酸に対応する３’末端ヌクレオチドを、部位特異的突然変異誘発 によりＴに変化させる。また下流のシストロン中のアミノ末端アミノ酸に対応す る５’末端ヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発によりＧに変化させる。 異種遺伝子間、または前述のように修飾したベクターpKSSINBVdlJR中の無能化 した結合領域の下流へのシストロン間配列(intercistronic sequence)の挿入は 、融和性のあるPacＩ/NcoＩ末端中に以下の２本鎖オリゴヌクレオチド対を挿入 することにより行われる： 読み通しセンスオリゴヌクレオチド： 5'-TAA CGG CCG CCA C-3'（配列番号28） 読み通しアンチセンスオリゴヌクレオチド： 5'-CCA TGG TGG CGG CCG TTA AT-3'（配列番号29） 上記のオリゴヌクレオチドを10mMのMgCl2の存在下で等モル量で混合し、95℃ で５分間加熱し、次にゆっくり室温に冷却して、PacＩとNcoＩ部位が隣接する目 的のシストロン間配列を得る。次にこのシストロン間配列を、PacＩとNcoＩ融和 性部位を含有する適当なベクター中に結合させる。実施例６ 同時パッケージングによる多数の異種遺伝子の発現 本発明の１つの面で記載したように、シンドビス非構造蛋白遺伝子と構造蛋白 遺伝子は、もし各RNAが複製とパッケージングに必要なcis作用性配列を含有する なら、複製能力を有する別々の陽性センスRNA分子として、同時パッケージング されることができる。従ってこの面において、同時パッケージングされたオーラ （Aura）ウイルスRNA断片はまた、オーラRNAの転写を開始することができる５’ 配列、オーラウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、そしてRNAパッケージング配列 の少なくとも１つのコピーを含有する。同時パッケージングされたRNA分子の少 なくとも１つは、オーラウイルス非構造蛋白をコードする配列を含有しなければ ならない。本発明の好適な実施態様において、同時パッケージングされる１つま たはそれ以上のRNA断片はまた、異種遺伝子が後に続くウイルス結合領域を含有 するであろう。 Ａ．多数の発現のための同時パッケージングした発現カセットの作成 １．異種遺伝子 多数の異種遺伝子の発現を可能にする同時パッケージングの実用 性を証明するために、２つのベクター作成体を作成した。第１の作成体は、シン ドビスウイルスRNAの転写を開始することができる５’配列、パッケージングに 必要なRNAシンドビスRNA配列、非構造蛋白１〜４の合成をコードする配列、シン ドビス結合領域、ルシフェラーゼ遺伝子、そして負の鎖RNAの合成に必要なシン ドビス３’配列よりなる。第２の作成体は、シンドビスウイルスの転写を開始す ることができる５’配列、シンドビス結合領域、パッケージングに必要なシンド ビス配列、LacZ遺伝子をコードする配列、そして負の鎖RNAの合成に必要な３’ 配列よりなる。１つのパッケージング細胞株にトランスフェクションされたこれ らの作成体のRNA転写体は、同時パッケージングされてルシフェラーゼとβ−ガ ラクトシダーゼの発現を同じ真核細胞に移行させることができるベクター粒子を 産生する。 β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子をシンドビスベーシックベクター（pK SSINBV）に挿入し、次にベクターからのシンドビス非構造蛋白蛋白の一部の欠さ せる。この作成体からのRNAを、シンドビスルシフェラーゼベクター（pKSSINBV- luc）からのRNAで同時トランスフェクションして、以下の方法の１つにより同時 パッケージングさせる。同時パッケージングされたRNA発現カセットを含有する ベクター粒子によるBHK-21細胞の感染させると、同じ細胞内でルシフェラーゼと β−ガラクトシダーゼの両方を発現される。 Ｂ．β−ガラクトシダーゼ発現カセットの作成 lacZ遺伝子はpSV−β−ガラクトシダーゼDNA（プロメガ社(Promega Corp.)、 マジソン、ウィスコンシン州）を酵素HindIIIとSalＩで消化することにより得ら れる。lacZ遺伝子を含有する3749塩基対断片を１％アガロースゲルで精製する。 次にこの断片をpSP72プラスミド（プロメガ社(Promega Corp.)）に結合させて、 これはま たHind IIIとSalＩで消化し、ジーンクリーン（Gene clean）（バイオ101（BIO 101）、サンジエゴ、カリホルニア州）を用いて精製する。この作成体はpSP72-l acZと呼ぶ。プラスミドpSP72を酵素XhoＩとXbaＩで消化して、3767塩基対lacZ含 有断片を１％アガロースゲルで精製する。次にこの断片をpKSSINBVに結合させ、 これはまたXhoＩとXbaＩで消化し、ジーンクリーン（Gene Clean）を用いて精製 する。このlacZを含有するシンドビス作成体はpKSSINBV-lacZと呼ぶ。次にpKSSI NBV-lacZを酵素AgeＩで消化する（これはシンドビス非構造蛋白遺伝子配列のヌ クレオチド3172と6922で切断する）。残存するベクター断片をジーンクリーンで 精製し、その末端を再結合する。このプラスミドはシンドビス非構造蛋白遺伝子 内に3750塩基対欠失を有し、機能的にこれらを不活性化する。この作成体はpKSS INBVdlNSP-lacZと呼ぶ。 pKSSINBVdlNSP-lacZとpKSSINBV-lusのSP６転写体は前述のように調製される。 これらのRNA転写体はパッケージング細胞内に同時トランスフェクションされ、 これは前述の機構の１つによりシンドビス構造蛋白を発現する。各RNA転写体は 、シンドビスウイルスの転写を開始することができる５’配列、パッケージング に必要なRNA配列、シンドビス結合領域、レポーター遺伝子、そして負の鎖RNAの 合成に必要なシンドビス３’配列を含有する。pKSSINBV-luc転写体はまた、シン ドビス非構造蛋白を含有する。同時トランスフェクションされた細胞において両 方のRNA転写体は複製され、ウイルス粒子の一部は、同じ粒子内に同時パッケー ジングされた両方のRNA転写体を含有する。同時パッケージングしたRNA粒子で新 鮮な細胞を感染させると、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼの両方を発現 する細胞が得られる。 Ｃ．パッケージング能を上げるための多数の発現カセットの同時パ ッケージング 第VIII因子のような大きな遺伝子は同時パッケージングの恩恵を受ける。第VI II因子をコードするcDNAをシンドビスベーシックベクター（pKSSINBV）に挿入す ると、長さが約16kbのRNA転写体が得られる。この長さのためにこのRNAは効率的 には複製やパッケージングをされないかも知れない。前述の方法を用いて、シン ドビス非構造蛋白と第VIII因子遺伝子は長さが約８kbと９kbの別々のRNA分子に 分解されて、同じ粒子に同時パッケージングされる。 Ｄ．第VIII因子発現カセットの作成 pKSSINBV作成体を酵素SacＩで消化する（これはシンドビス３’末端とポリＡ 配列のすぐ後ろで切断する）。出っ張った３’末端を酵素T4 DNAポリメラーゼと dNTPを添加することにより平滑にし、16℃で10分間インキュベートする。消化し た断片をジーンクリーンで精製し、SgrAＩ認識部位を含有する12ヌクレオチドの 自己相補的リンカー（5'-GTCACCGGTGAC-3'）（配列番号30）に結合させる。第VI II因子は数個のSacＩ部位を含有するためこの工程は必要であり、SP6転写の前に プラスミド線状化の部位を作成するために、SacＩの代わりにSgrAＩ認識部位を 用いる。この作成体はpKSSINBV−SgrAＩと呼ぶ。pKSSINBV−SgrAＩ作成体を酵素 XbaＩとNotＩで消化し、ジーンクリーンを用いて精製する。酵素XbaＩとNotＩで 消化して第VIII因子cDNA配列を得る。第VIII因子をコードする８kbの断片を１％ Ageで精製し、次にXbaＩ/NotＩで消化したpKSSINBV−SgrAＩに結合させる。この 作成体はpKSSINBV−第VIII因子と呼ぶ。 次にpKSSINBV−第VIII因子作成体を酵素AgeＩで消化（これはシンドビス非構 造蛋白のヌクレオチド3172と6922で切断する）し、ジーンクリーンで精製し、自 身に再結合させる。この作成体はシンドビス非構造蛋白内に3750塩基対欠失を有 し、機能的にこれらを不活性 化する。この作成体はpKSSINBVdlNSP-第VIII因子と呼ぶ。 pKSSINBVdlNSP-第VIII因子とpKSSINBVのSP６転写体は前述のように調製される 。これらのRNA転写体はパッケージング細胞内に同時トランスフェクションされ 、これは前述の機構の１つによりシンドビス構造蛋白を発現する。両RNA転写体 は、シンドビスウイルスの転写を開始することができる５’配列、RNAパッケー ジングに必要な配列、シンドビス結合領域、そして負の鎖RNAの合成に必要なシ ンドビス３’配列を含有する。さらにpKSSINBV転写体はまた、シンドビス非構造 蛋白遺伝子を含有し、pKSSINBV−第VIII因子転写体は第VIII因子遺伝子を含有す るが、シンドビス非構造蛋白遺伝子はがゆしない。同時トランスフェクションさ れた細胞において両方のRNA転写体は複製され、ウイルス粒子の一部は、同じ粒 子内に同時パッケージングされた両方のRNA転写体を含有する。同時パッケージ ングしたRNAでBHK-21細胞を感染させると、両RNAが同じ細胞上に存在する時のみ 第VIII因子が得られる。 Ｅ．オーラウイルス同時パッケージングベクターの作成 シンドビスについて記載した系と類似のアルファウイルス発現系を開発するた めに、当該分野で公知の方法および本発明内に記載した具体的な方法を使用する ことができる。ウイルスはATCCから得られ、細胞を培養して増殖させ、ウイルス のRNAを抽出し、全ゲノムにわたるcDNAを合成紙、従来法を用いてクローン化す る。次にこのcDNAを用いて、シンドビスの特許で記載したものと原則的に類似の 遺伝子移行ベクター系を作成する。これは、異種遺伝子を運搬することができる レプリコン、構造蛋白遺伝子を発現するパッケージング細胞株、そして本系に独 特の、追加の異種遺伝子を運搬できる別のパッケージング能を有するサブゲノム ベクターよりなるが、これらに限定されない。オーラウイルスサブゲノムRNAは パッケージン グシグナルを含有するため、異種遺伝子で置換中の不活性化を防止するために、 この配列を同定するために予備的な実験をする必要がある。パッケージング配列 の同定の後に、オーラベースの系の各成分を作成する。以下の最小条件を含有す る基本的レプリコンベクターが作成される：複製に必要なオーラ５’配列、非構 造蛋白コード領域、サブゲノムmRNA合成のための修飾されたまたは修飾されてい ない結合領域、異種遺伝子の挿入のための多数のクローニング部位、１つまたは それ以上のパッケージングシグナル、そして複製に必要な３’オーラ配列（ポリ アデニル酸配列を含む）。レプリコンRNAのインビトロ転写のために上流のバク テリオファージRNAポリメラーゼプロモーターが使用される。あるいは、cDNAか ら直接転写するために、真核細胞RNAポリメラーゼプロモーターが使用される。 以下の最小条件を含有するパッケージング能のあるサブゲノムベクターが作成 される：修飾されたまたは修飾されていない結合領域、異種遺伝子の挿入のため の多数のクローニング部位、１つまたはそれ以上のパッケージングシグナル、複 製／負の鎖の合成に必要な３’オーラ配列（ポリアデニル酸配列を含む）。この サブゲノムベクターはある場合には、ベクターがアンプリコンとして作用するよ うにするため、オーラ５’レプリコンが結合領域の上流に配置されるように作成 される。サブゲノムベクターRNAの転写は、バクテリオファージRNAポリメラーゼ プロモーターを用いてインビトロで、または真核細胞RNAポリメラーゼプロモー ターを用いてインビボで行われる。さらに最初の転写体はセンス構造でもまたは アンチセンス構造でもよい。 １つまたはそれ以上の構造蛋白のmRNAが結合領域から転写されオーラレプリコ ンに誘導されるように、シンドビスベクターについてパッケージング細胞株が作 成される。他の場合には、誘導性または 公正性真核細胞プロモーターの制御下で、１つまたはそれ以上の構造蛋白が発現 される。それぞれの場合にレプリコンによるこれらの配列のカプシッド化を防止 するために、構造蛋白遺伝子中に１つまたはそれ以上の存在する任意のパッケー ジング配列に特異的不活性化突然変異が作成される。これらの突然変異は通常、 コードされるアミノ酸に影響を与えない、コドンの３番目の位置の沈黙（silent ）の変化である。 多数の異種遺伝子をパッケージングする能力は多くの治療用途に使用されるで あろう。これらには、多数のサイトカイン、多数のCTLエピトープ、免疫提示を 増強するためのサイトカインCTLエピトープの組合せ、治療用蛋白の多数のサブ ユニット、治療用蛋白とアンチセンスRNAの組合せなどの発現があるが、これら に限定されない。多数の異種遺伝子を発現できる能力以外に、ウイルスへのサブ ゲノムmRNAのパッケージングは、このベクターが極端の長い異種配列を運搬する ことを可能にする（これは他のアルファウイルス系では不可能である）。さらに 、この多くの部分に分かれたアプローチは、プロデューサー細胞株の開発に有用 であり、これによりレプリカーゼ蛋白と構造蛋白が安定に発現され、サブゲノム ベクター中に含まれる任意の遺伝子が安定な組み込み体として容易に導入される 。 例７ シンドビスウイルスパッケージング細胞系統の構築 シンドビス遺伝子トランスファ系のもう１つの実施態様は、シンドビスパッケ ージング細胞系統の開発に関するものである。正常なシンドビス複製サイクルは 完全に細胞質の中で起こることから、シンドビスパッケージング細胞系統系を作 り出すための１つのアプローチは、この系をその天然の複製サイクルにならって モデリングす ることにある。このアプローチを用いて、単数又は複数の安定した形で組込まれ た発現ベクターからトランス形で供給されるウイルス構造タンパク質が細胞質内 でトランスフェクション又はトランスダクションを受けたベクターRNAの写しを 包膜することができるようにするシンドビスパッケージング細胞系統系が設計さ れる。細胞の細胞質の中で複製することのできるシンドビスRNAベクター分子は 、問題の遺伝子およびシンドビス非構造タンパク質（前述）をコードするcDNAベ クタークローンをインビトロで転写するのに用いられるT7 RNAポリメラーゼ系に よって最初に産生される。次にベクターRNAの写しはシンドビスパッケージング 細胞系統へとトランスフェクションされ、かくしてベクターRNAは、高いレベル まで複製しその後ウイルス構造タンパク質によってパッケージングされて、感染 性ベクター粒子を生成することになる。シンドビスcDNA分子の長さが延びている ことから、インビトロ転写プロセスは効率的でない。さらに、単層内に含まれて いる細胞の１分画のみが大部分の手順によって標的にトランスフェクションされ る。ベクター産生細胞系統の性能及び力価を最適化させようとして、遺伝子トラ ンスファの２回の連統サイクルが行なわれる。生産者細胞系統内にシンドビスRN Aベクター分子を直接トランスフェクションするよりもむしろ、まず最初にベク ターを一次シンドビスパッケージング細胞系統内にトランスフェクションさせる 。トランスフェクションを受けた細胞系統は、培養上清内に感染性ベクター粒子 を分泌し、これらの感染性上清は次にシンドビスパッケージング細胞の新鮮な単 層をトランスダクションするのに用いられる。パッケージング細胞系統内へのシ ンドビスベクターのトランスダクションは、細胞内へのRNAトランスファ効率が より高く細胞内でのベクターの生物学的位置が最適化されていることから、トラ ンスフェクションよりも好ましい。こう してパッケージングされた感染性の組換え型シンドビスベクターのより高い発現 及びより高い力価が導かれることになる。 細胞系統がシンドビスベクター付着のための細胞レセプタを遮断する細胞外外 被タンパク質を産生することから、産生されたシンドビスベクター粒子が同じパ ッケージング細胞系統をトランスダクションできない場合にはシンドビスパッケ ージング細胞をトランスダクションできる第２のタイプのシンドビスウイルス粒 子を作り出さなくてはならない。この第２のタイプのウイルス粒子は、インビト ロで転写されたシンドビスRNAベクターの写しのトランスフェクションを受けた 結果として過渡的なベクター粒子を産生する。「ホッピング細胞系統」として知 れているパッケージング細胞系統により産生されなくてはならない。ホッピング 細胞系統は偽性型別（pseudotyping）と呼ばれるプロセスの中で異なる細胞レセ プタへとシンドビスベクターを再度導く代替的ウイルス外被タンパク質を提供す ることにより過渡的に産生されたベクター粒子のレセプター向性を再度導くよう に工学処理されている。現在、シンドビスベクター粒子の偽性型別のためには２ つのアプローチが考案されている。第１のアプローチは、水疱性口内炎ウイルス Ｇタンパク質(VSV-G)を同時発現するシンドビスパッケージング細胞系統から成 る。我々の所では、VSV-G偽性型別は以前レトロウイルスベクターのレセプタ向 性を再度導くためにうまく機能し、多様な細胞タイプを感染させることが立証さ れてきた。偽性型別されたシンドビスベクター粒子を産生するための第２のアプ ローチは、レトロウイルスパッケージング配列を含むシンドビスRNAベクターを パッケージングすることができることになるレトロウイルスgag/pol及びenv配列 を含む現在利用可能なレトロウイルスパッケージング細胞系統を使用することで ある。シンドビスウイルスの天然の複製サイクルにならってシン ドビスパッケージング細胞系統をモデリングすることによって、複製RNA分子か ら生成される翻訳に利用可能なRNA分子の数に基づいて高レベルの遺伝子発現を 生み出す細胞系統が結果として得られるはずである。一方では、ポジティブ鎖の RNAウイルスは、RNAベクターを変性してベクター粒子の全体的有効性を減少させ る傾向をもつ可能性があり同様に長い培養期間中に高い発現レベルを低下させる 可能性もある欠陥干渉性RNAを産生する傾向をもつ。従って、第１のアプローチ の場合と同様に自己複製する能力を維持するシンドビスベクターRNA分子を産生 するために、安定して組込まれたDNA発現ベクターが使用される第２のアプロー チが考案された。このアプローチは、薬物選択標識を通して組込まれたDNAベク ター発現系が維持され、DNA系が欠陥RNAコピーにより希釈し尽され得ない未変性 RNAベクターを構成的に発現することになることから、長い培養期間にわたる連 続的なベクター発現を可能にする。この生産者細胞形態では、サイズ制約条件に よりトランスダクションのためのウイルスベクター粒子内への発現ベクターのパ ッケージングが妨げられる可能性があることから、DNAベースのシンドビスベク ターは当初パッケージング細胞系統内へトランスフェクションによって導入され る。同様に、この形態のためには、以前ベクターRNAを転写するのに使用された プラスミドのT7 RNAポリメラーゼ認識部位は、使用される親細胞系統により規定 されたもう１つの適当なプロモーター配列で置換される。このプラスミド配列は 同様に、パッケージング細胞系統を作り出すのに使用されるものとは異なる選択 標識を含むことになる。 或る一定のレベルでのシンドビスタンパク質及び／又はレプリコンRNAの発現 は、パッケージング細胞系統内の細胞障害効果という結果をもたらす可能性があ る。従って、場合によっては、細胞が或 る一定の臨界的密度まで増殖してしまった後で初めてこれらの要素を発現させる のが望ましい可能性もある。この目的のため、RNAベクター自体又はその他のい くつかの刺激による誘発の後にのみパッケージングに必要は構造タンパク質が合 成されるようにする付加的な修正が加えられる。同様に、いくつかの修正は、こ れらのタンパク質をコードする遺伝子のリンケージを解除する発現ベクターを利 用することによって、別々の誘発可能な要素の制御下でこれらのタンパク質の個 々の発現を可能にする。その上、組込まれたベクター分子自体の発現は、さらに もう１つの誘発可能な系によって制御され得る。この形態は結果として誘発に続 く一連の段階的事象がもたらされ、こうして究極的に、パッケージングされたベ クター粒子の産生が導かれることになる。 Ａ．シンドビスパッケージング細胞系統の開発のための親細胞系統の選択 １．持続的に又は慢性的に感染可能な細胞 シンドビスパッケージング細胞系統を作り出すべく潜在的親細胞系統を選択す るための１つの重要な基準は、シンドビスベクターの複製及び産生中に溶解され ない細胞系統の選択である。この基準は、長期間にわたって増殖させ安定したベ クター供給源として使用することのできるシンドビスベクター生産者細胞系統の 開発にとって必要不可欠のものである。大部分の哺乳動物細胞のシンドビス感染 が結果として細胞溶解をもたらすことがわかっている。しかしながらさまざまな 昆虫細胞系統の利用によってこの問題を回避できるはずである。一例としては、 シンドビスウイルスによるセスジャブカ（Aedes albopictus）細胞の感染は、感 染した細胞が生存可能な状態にとどまり連続的にウイルスを放出する、持続性の 又は慢性の非細胞変性ウイルスの成長という結果をもたらす。Aedes aegypti，S podoptera frugiperda、及びDrosophila melanogaster細胞系統といったその他 の昆虫細胞系統も同じ持続性の感染を示すはずである。従って第１のシンドビス パッケージング細胞系統の形態は、これらの細胞タイプの中で有効な誘発可能な 又は誘発不可能なプロモーターの制御下でシンドビス構造タンパク質を発現する 安定した形でトランスフェクションを受けた発現ベクターを含み、選択可能な標 識を同時発現するAedes albopictus又はDrosophila細胞系統といった昆虫親細胞 系統を使用する。 最近、感染したAedes albopictus細胞の中でのシンドビスウイルスの産生のダ ウンレギュレーションに結びつけられた細胞由来のシンドビスウイルス誘発タン パク質が同定され精製された（Virology（ウイルス学）194：44）。このタンパ ク質は、抗ウイルス状態を誘発し49S及び26Sの両方のウイルスRNA合成を阻害す ることのできる、約3200Daの小さい疎水性ペプチドである。抗ウイルス性ペプチ ドで処理された細胞は、通常、未感染細胞内で96時間細胞分裂の静止性停止を示 し、その後正常な成長速度を回復する。感染に先立ってこのペプチドにさらされ た細胞は、シンドビスウイルスを複製することができず、10ヵ月の連続継代を通 して抗ウイルス性タンパク質を構成的に産生することによってこの表現型を維持 するように思われる。 Aedes albopictus細胞内でのシンドビス感染に対するこの細胞応答が組換え型 シンドビスベクター産生系の最適な効率を減少させる可能性があるということが 認められている。シンドビスベクター産生の効率を改善するため、ウイルス誘発 された細胞抗ウイルス性タンパク質を不活性化させてベクター粒子の力価の減少 をことごとく防止する２つの方法が考案された。第１の方法は、上述のこの細胞 タンパク質の精製及び、当該技術分野において既知の立証済み技術 を用いた、一次アミノ酸配列の一部のそのカルボキシ末端からの決定を内含する ものである。結果として得られたアミノ酸配列はその後、考えられる対応するゲ ノミック配列を誘導するのに用いられ、かくして特定の細胞配列を増幅するのに 使用できる縮重PCRプライマー対を設計することができるようになる。このとき この増幅した配列は、この阻害タンパク質をコードする遺伝子の孤立性領域を得 るため、当該技術分野において知られている標準的な技術を用いてクローニング される。このクローンのヌクレオチド配列の決定によって、次に相同な組換えに よってこのシンドビス阻害遺伝子内に特異的に組込まれ機能的タンパク質を発現 するその能力を「ノックアウトする」ことになる１つのベクターを設計すること が可能になる。ノックアウト配列を含むクローンは、ベクターで細胞をトランス フェクションする前に、阻害タンパク質の孤立性のクローニングされた領域内へ 選択可能な標識を挿入することによって選択できる。 このシンドビスウイルス阻害タンパク質を不能にするための第２の方法には、 例えばBUDR（５−ブロモデオキシウリジン）でのAedes albopictus細胞の突然変 異誘発が関与する。この突然変異誘発されたパッケージング細胞系統集団は次に 、ネオマイシン耐性標識を発現できるシンドビスベクターでの感染を受ける。高 濃度のG418薬物の下で、大量のシンドビスベクターを再生する、ひいてはシンド ビス阻害遺伝子を発現することができない細胞のみが存続できることになる。選 択の後、耐性コロニーはプールされ、希釈クローニングされ、高力価のシンドビ ス産生についてテストされる。 ２．シンドビス発現に対する感受性を減小させるための細胞の修正：アポプト −シスの抑制 大部分の哺乳動物細胞系統は、シンドビスウイルス感染の間に溶解させられる が、最近の実験では、ラット前立腺ガン（AT−３）細 胞系統内での溶解シンドビス感染から持続性シンドビス感染への変換が実証され た。この変換は、シンドビス感染に先立って細胞系統内でbcl-２オンコ遺伝子産 物を構成的に発現することによって行なわれた。bcl-２オンコ遺伝子を発現する AT−３細胞のシンドビス感染は、明白な細胞病理無しでウイルスの産生を結果と してもたらす（Nature，361：739）。この細胞系統の修正は、イヌ細胞系統Ｄ− 17及びCf2；ヒト細胞系統HT1080及び293：ウズラ細胞系統AT−６；ベビーハムス ター腎細胞系統BHK-21；マウス神経芽細胞腫細胞系統N18；及びラット前立腺ガ ンAT−３といった細胞系統を、レトロベクター産生系統のものと同様の潜在的シ ンドビスパッケージング及び生産者細胞系統として使用するための持続的に感染 可能な状態へと変換するのに有効であることが立証できた。 bcl-２オンコ遺伝子レトロウイルス発現ベクターは、以前にも記述されてきた （Nature，361：739）。新しいbcl-２発現ベクターは、プラスミドp84(Nature 3 36：259)から誘導された910塩基対のEcoR I cDNAフラグメントを、構成性プロモ ーターを含み選択可能な標識をコードする市販のあらゆる発現ベクターの中に挿 入するべく当該技術分野において既知の標準的組換え型DNA技術を使用すること によって構築される。シンドビス核酸配列とその他のトランスダクションを受け たベクターの間のあらゆるタイプの相同性を回避するよう、入念に考慮しなけれ ばならない。この予防措置は、組換え型シンドビス粒子内の選択可能な標識又は bcl-２オンコ遺伝子の望ましくないパッケージングを導く可能性のある組換え事 象を防ぐために構じられるべきものである。本書に記述するシンドビスベクター 系は生物学療法として使用するように設計されていることから、これは重要な指 摘点である。ひとたびbcl-２発現ベクターが構築されると、哺乳動物の親細胞系 統（すなわちBHK-21細胞）はあらゆる 標準技術を用いてトランスフェクションされ、適切な標識について選択される。 次に耐性コロニーはプールされ、その後希釈クローニングを受ける。個々のクロ ーンはその後増殖され、bcl-２発現についてスクリーニングを受ける。発現がひ とたび確認されると、持続性シンドビス感染がテストされ、その後シンドビスパ ッケージング細胞系統の開発のための親細胞系統として用いられる。 BHK細胞のシンドビス感染は、形態的変化及びアポプト−シス（細胞自滅）のD NA断片化パターン診断という結果をもたらし、bcl-２オンコ遺伝子による溶解性 から持続性感染への交換は、このプログラミングされた細胞死滅の抑制によって 媒介されうる（Nature 361：739）。さらに、アデノウイルス、ポリオーマウイ ルス、SV40、及びHIVを含むその他のウイルスでの哺乳動物細胞の感染は、アポ プト−シスによる細胞障害性という結果をもたらした。従って、シンドビスパッ ケージング又は生産者細胞系統内での発現のためには、アポプト−シスを抑制す るその他の遺伝子産物が、bcl-２オンコ遺伝子に加えて望ましいものである。当 初、アポプト−シスを抑制することが示された３つのウイルス遺伝子が、シンド ビスパッケージング細胞系統内で発現されることになる。すなわち、19−kDタン パク質をコードするアデノウイルスEIB遺伝子（Ras et al.，PNAS 89：7742〜77 46，1992）、Ｉ型単純ヘルペスウイルスgI34.5遺伝子Chou及びRoiz man，PNAS 8 9：3266-3270，1992)及びAcMNPVバキュロウイルスp35遺伝子（Clem et al.，Sci ence 254：1388-1390，1991）である。個々の遺伝子は、当該技術分野において 既知の標準技術を用いて、選択可能な標識を含み構成性真核性転写プロモーター の制御下にあるプラスミド発現ベクター内に挿入される。これらの発現ベクター はその後、前述のとおり細胞系統内にトランスフェクションされ、適当な選択が 適用される。これらの遺伝子の安 定した組込み及びその産物の構成性発現についての選択により、シンドビスで誘 発されたアポプト−シス事象に対し感受性をもつものとして知られている細胞系 統内でのより拡大したベクター産生が可能となるはずである。その上、各々の遺 伝子産物がそれ自身の独自のメカニズムによりアポプト−シスを阻害できるよう にすることも実現可能である。従って、遺伝子も、より強い抑制効果を得るため さまざまな組合せでパッケージング細胞系統内に導入されることになるだろう。 最後に、アポプト−シスに対して類似の効果をもつその他の遺伝子産物を、それ が発見されるにつれてパッケージング細胞系統の中に容易に取り込むことが可能 である。 シンドビスベクター生産者細胞系統の誘導において、ベクター及びベクターパ ッケージングカセットの両方で安定した形で形質転換された生産者細胞系統を誘 導させることができるように、ウイルス遺伝子の発現を抑制するための数多くの アプローチが提案されている。これらのアプローチには、誘発可能な及び／又は 分化感応性プロモーター、アンチセンス構造遺伝子、非相同制御系及び蚊、そし て持続性ウイルス感染が樹立されているその他の細胞が含まれる。シンドビスベ クター生産者細胞系統の最終的形態がいかなるものであれ、持続性感染の樹立又 は少なくともウイルス遺伝子発現の結果としての細胞死滅の遅れがアポプト−シ スを阻害することによって増強されることになるということは明白であると思わ れる。アデノウイルス、HPV，SV40及びマウスポリオーマウイルス（Py）を含むD NA腫瘍ウイルスは、一部には、網膜芽細胞（Rb）遺伝子産物p105及びその密に関 係する遺伝子産物p107及びサイクリンＡ，p33cdk2及びp34cdc2を含む細胞サイク ルの制御に関与するその他の遺伝子産物に対する結合及びそれらの不活性化によ って、細胞を形質転換させる。Pyを除いてこれらのウイルスは全て、p53に結合 し、それ を不活性化する遺伝子産物をコードする。唯一Pyだけは、膜チロシンキナーゼsr e及びこのウイルスの完全な形質転換ポテンシャルのために必要とされるホスフ ァチジルイノシトール−３−キナーゼに結合しこれを活性化する中間Ｔ抗原（mT ）をコードする（Talmage et al.，Cell 59：55〜65，1989）。Rb及びp53劣性オ ンコ遺伝子産物に対する結合及びその不活性化はこれらのDNA腫瘍ウイルスによ り形質転換された細胞がアポプト−シス経路に入るのを防ぐ。p53は、一部には 、C-fos，hsc70及びbcl-２を含む細胞増殖と結びつけられたタンパク質の発現を 抑制することによって、細胞分裂を停止させることができるということが知られ ている（Miyashita et al.，Cancer Research 54：3131〜3135，1994）。 シンドビスウイルスの産生の期間を延長するため、又は可能であれば持続性シ ンドビス感染を促進するため、パッケージング細胞はpy又はSV40からのウイルス 性ゲノミックDNAを用いて形質転換される。マウス及び霊長類のDNA腫瘍ウイルス Py及びSV40がそれぞれ、天然宿主以外の種からの細胞内で容易に安定した形質転 換を樹立するということは周知のことである。このような非許容的細胞、例えば ハムスターから誘導された非許容的細胞においては、これらのウイルスは複製で きず、ウイルスの早期領域発現依存性（例えばＴ抗原）組込みという結果をもた らす（Bevjamin及びVogt，Fields Virology 第１巻、第19章参照）。SV40及びPy Ｔ抗原はこれらの形質転換されたハムスター細胞内で構成的に発現される。 SV40及びPyの形質転換された細胞系統が樹立され、ウイルス感染後の動態及び シンドビス産生レベル及び細胞病理学が見極められる。ハムスター細胞内のシン ドビス増殖の特徴であるアポプト−シス事象が低減されたならば、各々のプロト タイプシンドビスパッケージング細胞系統は、これらの細胞からのパッケージン グされたベク ターの収量を増大させるためPy又はSV40で形質転換される。 ３．シンドビス発現に対する感受性を減少させるための細胞の修正：活成化依 存性ベクター粒子の産生 前駆物質PE2としてシンドビスE2糖タンパク質を合成させる。このPE2前駆物質 及び第２のウイルス糖タンパク質E1は、小胞体の中で結びつき、処理され、ビリ オン取込みのためのヘテロダイマーとして、感染した細胞膜まで輸送される。こ の処理中の或る点で、PE2はE3と成熟E2に分割される。E3は、PE2の64アミノ末端 残基であり、成熟中細胞外空隙の中で喪失する。さらに大きい分割産物E2は、E1 と結びつき、ウイルスエンベロープとなるものの中に固定される。保存度の高い 正準４アミノ酸（aa）残基モチーフ、basic-X-basic-basic aa'sのすぐ後に続く 部位において分割するPE2前駆物質の処理を担当するのは、宿主細胞のプロテア ーゼである。RPE.40と呼ばれるCHO-K1菌株から誘導された突然変異細胞系統（Wa tson et al.，（1991）J．Virol．65：2332-2339）は、PE2前駆物質をE3及びE2 形に処理する能力がないことから、シンドビスウイルス菌株AR339の産生におい て不完全である。従って、RPE.40細胞系統の中で産生されるシンドビスビリオン のエンベロープは、PE2/E1ヘテロダイマーを含んでいる。RPE.40細胞は、親CHO- K1細胞よりもシンドビスウイルス感染に対して少なくとも100倍の耐性をもち、 このことはすなわち、ビリオンを含むPE2の細胞を感染させる能力が非効率的で あることを示唆している。RPE.40により産生されたこれらの欠陥ビリオンは、ト リプシンでの処理によって完全に感染性の形に変換されうる。 パッケージング及び生産者細胞系統の中では、組換えにより産生されたあらゆ る野生型ウイルスが細胞を再感染させ、迅速に増幅されることになり、かくして パッケージングされたベクター調製物を 著しく汚染する。RPE.40系統から開発された生産者細胞は、ベクターの産生及び パッケージング中に生成されたあらゆる野生型ウイルスの効率の低い増幅のため 、シンドビスウイルス感染に対し許容的なその他の系統に比べ著しい改善となる だろう。かくして、ベクター調製物は、野生型ウイルスによる著しい汚染を受け ない。その上、この系は、類似の細胞プロテアーゼ内で「ノックアウト」突然変 異体を開発することによってその他の細胞系統にも拡大できる。 ４．ホッピング細胞系統の開発 前述のようなシンドビスホッピング細胞系統は、異なる細胞レセプタ向性につ いて偽性型別された感染性RNAベクター粒子を過渡的に産生するために用いられ る。ホッピング細胞系統がベクター粒子をひとたび産生すると、それはもはや必 要でなくなる。というのも、上述のもとのシンドビスパッケージング細胞系統を トランスダクションするのには、感染性培養上清しか必要でないからである。従 って、ベクター粒子を過渡的に産生するためには、ホッピング細胞系統がシンド ビスによる持続性感染を示す必要はない。この場合、親細胞は、持続性感染を示 す昆虫細胞系統であってもよいし、或いは生産的シンドビス感染の後72時間以内 に溶解する可能性の高い哺乳動物細胞系統であってもよい。唯一の基準は、その 細胞系統が、シンドビスRNAベクターでのトランスフェクションに先立って細胞 の成長に影響を及ぼすことなくVSV-Gタンパク質又はレトロウイルスgag/pol及び envタンパク質のいずれかを同時発現しながら、シンドビス構造タンパク質を発 現し処理することができるということである。従って、シンドビスホッピング細 胞系統は、bcl-２オンコ遺伝子発現といったような前述のような付加的な細胞の 修正無くシンドビス又はレトロウイルスのいずれかの複製を支持することのでき る上述の親細胞系統のいずれかであってよい。 VSV-G偽性型別されたシンドビスベクターを作り上げるためには、シンドビス パッケージング細胞系統内にVSV-G外被タンパク質を発現するベクターPMLP-Gと 共にインビトロで転写されたシンドビスベクターRNA又はDNAの同時トランスフェ クションが必要とされる。細胞成長条件及びトランスフェクション手順について は、「構成要素のアッセンブリー」という見出しの下で記述されており、記述さ れているパッケージング細胞形態のいずれでも使用される。トランスフェクショ ンから24時間後に、VSV-G偽性型別シンドビスベクターを含む上清を収穫し、次 にこれを用いて、トランスダクション効率の低下を克服するべく同一のシンドビ スパッケージング細胞系統の新鮮な単層をトランスダクションする。 レトロウイルスパッケージング細胞系統の中でのシンドビスベクターの偽性型 別のためには、レトロウイルスパッケージング配列を含むべく工学処理されたシ ンドビスRNAベクターをパッケージングするのに、レトロウイルスgag-pol及びen v配列を発現する文献内に参照指示されているあらゆる細胞系統を使用すること ができる。サブゲノミックRNAではなくゲノミック長のベクターのみがレトロウ イルス外被タンパク質によってパッケージングされるように、レトロウイルスps iパッケージング配列は、不活性化された接合領域と合成接合領域縦列反復の間 に挿入される。シンドビスベクターRNAを含むレトロウイルス粒子は、前述した 手順を用いて、インビトロ転写されたシンドビスベクターRNAをトランスフェク ションすることによって産生される。シンドビスRNAベクターを含む偽性型別レ トロウイルス粒子を伴う上清を、トランスフェクションから24時間後に収穫し、 これらの上清は次にシンドビスパッケージング細胞系統のトランスダクションに 使用することができる。 Ｂ．構造タンパク質発現構成体 １．誘発可能な構成性構造タンパク質ベクター構成体 シンドビスパッケージング細胞系統の開発は、必要な構造タンパク質すなわち カプシド、E2及びE1の高い細胞間レベルを合成する能力に依存している。残念な ことに、これらのタンパク質時に外被糖タンパク質E2及びE1の高レベル発現は、 それに付随する細胞病理及び偶発的細胞死滅を導く可能性がある。従って、構造 タンパク質発現カセットは、構成性発現レベルを維持するその他のものに加えて 遺伝子発現のレベルを制御する誘発可能な調節要素を伴って設計されてきた。 第１の形態においては、シンドビス構造タンパク質の発現は、誘発可能なlac オペロン配列と組合わせた状態でRSV LTRの制御下にある。これはpOP13及びpORR SV1ベクター（Stratagene）内へのウイルス構造タンパク質遺伝子に対するシン ドビスcDNAの挿入により達成される。別々に使用されるこれらのベクターは、la cリプレッサー「ｉ」タンパク質を発現するp3'SSベクター（Stratagene）を用い て同時トランスフェクションされる。例えば、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラ クトピラノシド（IPTG）といった誘発物質が無い場合、ルシフェラーゼリポータ ー遺伝子の基礎的又は構成性発現レベルは、細胞１つにつき10〜20コピーである と報告されてきた。IPTGの付加は、リプレッサータンパク質のコンホーメーショ ン変化という結果をもたらし、こうしてlac-オペレーター配列に対するlac；タ ンパク質の親和力は減少し、非相同遺伝子の高レベル発現を可能にする。95倍と いうIPTGの存在下での誘発レベルが、pOP13ベクター内に含まれている非相同遺 伝子に対して報告された。 特定的に言うと、シンドビス構造タンパク質遺伝子（SP）cDNAは、以下の通り pOP13及びpOPRSV1ベクター内に挿入される。SPコーディング領域は、シンドビス nt 7638での効率のよい翻訳開始のた めのKozakコンセンサス配列に対応する周囲のヌクレオチドを含め、真正のAUG翻 訳開始部位及びUGA翻訳停止部位に対してそれぞれマッピングする５’末端をも つプライマー対と共に全体として増幅される。順方向プライマーは、シンドビス nts 7638〜7661に対し相補的であり、逆方向プライマーはシンドビスnts 11,384 〜11,364に対して相補的である。構造タンパク質遺伝子に対応するシンドビスcD NAのPCR増幅は、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、標準的２温度循環プロ トコルによって達成される。 順方向プライマー（7638Ｆ）： ５’-TATATGCGGCCGCACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGC-３’ （配列培養38） 逆方向プライマー（1138Ｒ）： ５’-TATATGCGGCCGCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG-３’ （配列培養39） 指示されたシンドビスntsに対するそのそれぞれの相補性に加えて、５ヌクレ オチド「バッファ配列」とそれに続くNotＩ認識配列が、各プライマーの５’末 端に付着されている。PCR増幅の後、１％のアガロースゲル中で3763bpのフラグ メントが精製され、次にＮotＩ酵素でひきつづき消化される。その後、結果とし て得られた3749bpのフラグメントは別々にpOP13及びpOPRSV1ベクターへと連結さ れ、これらのベクターはNotＩで消化され、仔ウシ腸内アルカリ性ホスファター ゼで処理される。シンドビス構造タンパク質のコーディングキャバシティ全体を 含むこれらの発現カセットベクターは、pOP13-SINSP及びpORRSV1-SINSPとして知 られている。 lacオペロン−シンドビス構造タンパク質遺伝子発現カセットの変形態様と、 その他のウイルス、細胞又は昆虫ベースのプロモーターを用いて構築することも できる。当該技術分野において知られて いる一般的な分子生物学技術を用いて、lacオペロン及びRSV LTRプロモーター又 は単にRSV LTRプロモーターのみの配列をStratagene pOP13及びpOPRSV1ベクター からスイッチし、サイトメガロウイルス主要即時プロモーター（pOPCMV-SINSP） ；アデノウイルス主要後期プロモーター（pOPAMLP-SINSP）又は；Drosophilaメ タロチオネイン誘発性プロモーター（pMET-SINSP）、Drosophilaアクチン5C遠位 プロモーター（pOPA5C-SINSP）、熱衝撃プロモーターHSP65又はHSP70（pHSP-SIN SP）又はバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター(pPHED-SINSP)といったそ の他のプロモーター配列により置換させることができる。 ２．タンパク質発現レベルを増大させるためのカセットの修正 mRNA写しのレベルが増大した場合、シンドビス構造タンパク質の発現を増大さ せることができる。mRNA写しのレベルの増大は、シンドビス非構造タンパク質が これらの写しを認識し、その代りにメッセージをより高いレベルまで複製するよ うな形で、発現カセットを修正することによって達成されうる。この修正は、翻 訳のための第１の真正なATG部位と発現カセットのプロモーター配列の間にて、 シンドビス構造タンパク質コーディング領域の極端の５’末端に対して野生型最 小接合領域コア（ヌクレオチド7579〜7602）を付加することによって行なわれる 。このことはシンドビス構造タンパク質cDNAをpOP13及びpOPRSV1発現ベクターの 中に入れるため以上で記述したものと同じPCR増幅技術に従うことで達成できる 。この手順に対する唯一の修正は、以下のとおりのコーディング領域の第１のAT GとNotＩ制限酵素部位の間に接合領域コアヌクレオチド7579〜7602を含む類似の プライマーでの7638Ｆの順方向プライマーの置換である： 順方向プライマー（JUN 7638Ｆ）： 5'-TATATGCGGCCGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTACCACCACC- ATGAATAGAGGATTC-3'（配列番号40）。 PCR増幅に続いて、１％のアガロースゲルの中で、結果として得られた3787bp フラグメントを精製させ、次にNotＩ酵素でひきつづき消化させる。その後、結 果として得た3773bpのフラグメントを別々にpOP13及びpOPRSV1ベクターへと連結 させ、これらのベクターはNotＩで消化され、仔ウシ腸内アルカリ性ホスファタ ーゼで処理させる。結果として得られた発現カセットベクターは、pOP13-JUNSIN SP及びpOPRSV1-JUNSINSPとして知られている。しかしながら、構造タンパク質発 現カセット内への接合領域配列の導入は、野生型シンドビスウイルスの生成を導 く望ましくない組換え事象をもたらす可能性のある配列を導入することになる、 ということに留意すべきである。 ３．シンドビスベクターを介しての構造浩タンパク質の誘発可能な発現 構造タンパク質の発現からの潜在的な細胞障害効果のため、これらのタンパク 質の適度の基礎レベルさえ発現する誘発可能なパッケージング細胞系統の樹立は 、最良の方法ではない場合もある。従って、シンドビスベクターによりトランス 形で供給された非構造タンパク質を介しての高レベルの構造タンパク質合成誘発 のための調節要素を含むものの適切に刺激を受けるまでは基礎的合成レベルを全 くもたないパッケージング細胞系統発現カセットが構築される。 この形態においては、隣接するシンドビス接合領域配列から構造タンパク質遺 伝子の転写が起こるようにする構造タンパク質遺伝子カセットが構築される。こ のカセットの一次的特徴は、転写開始が真正のシンドビスヌクレオチド１で始ま るような、シンドビスヌクレオチド１に直接隣接して位置づけされているRNAポ リメラーゼII プロモーター、トランスクリプターゼ（転写酵素）認識のために必要とされる５ ’−末端シンドビス配列、構造タンパク質遺伝子mRNAの発現のためのシンドビス 接合領域配列、シンドビス構造タンパク質遺伝子配列、複製のために必要とされ る３’末端シンドビス配列及び転写終結／ポリアデニル化配列である。構造タン パク質遺伝子のAUG開始部位に先立つ翻訳終結コドンで終る上流読取り枠のため 、シンドビス構造タンパク質の発現は、ベクター供給された非構造タンパク質に よるマイナス鎖RNAの合成とその後の接合領域からの構造タンパク質遺伝子mRNA の転写の後にのみ起こりうる。従って、この系の誘発可能性は、インビトロ転写 されたRNA又は適切なプロモーター要素の下流に位置づけされたcDNAのいずれか として導入される、シンドビスベクター自体によって供給される非構造タンパク 質の存在に完全に依存している。さらに、５’−及び３’末端のシンドビス配列 は、構造タンパク質遺伝子カセットのこのRNA写しが同じベクター供給された非 構造タンパク質によって増幅されることを可能にする（図８参照）。 特定的に言うと、ポジティブセンスのベクター誘発可能なパッケージングカセ ットの構築は以下の通りに達成される。前述のpVGELVISベクターは、非構造遺伝 子コーディング配列の大部分を含むヌクレオチド422〜7054を除去するべく酵素B spEＩで消化され、残りの9925bpフラグメントは0.8％のアガロースゲル内で精製 され、その後自らに再連結されてpLTR/Sind1 BspEとして知られている構成体を 生成する。この欠失は、nts 60-62にある５’末端真正翻訳開始コドンを無傷の ままに残し、それぞれnts.7130〜7132及び7190〜7192（当初の番号付け）におい て枠内下流UAA及びUGA停止コドンを作り出し、かくして下流構造タンパク質遺伝 子読み取り枠の翻訳を防いでいる。pLTR/Sind1 BspEパッケージングカセット構 成体はひ き続きBHK細胞（ATCC #CLL 10）内にトランスフェクションされ、前述の通り400 μｇ／mlにてG418薬物を用いて、陽性トランスフェクションが選択される。図４ に示したデータにより、これらのLTR/Sind1 BspEパッケージング細胞内へのSin- lucベクターRNAのトランスフェクションは、回収された上清がSin-lucベクターR NAをBHK細胞の新鮮な単層までトランスファするものであることが示されている ことから、Sin-luc RNAを含む感染性シンドビス粒子の産生という結果をもたら す、ということが実証されている。 BspEＩ欠失を作り出すための初期材料としてPVG-ELVISdクローン（前述のもの ）を用いて、類似のパッケージング構成体も作られる。このクローン内では、シ ンドビス３’−末端配列の後には、シンドビスの３’末端配列に隣接する一次写 しのより精確な処理を可能にするべく、触媒リボザイム配列が続いている。さら に、これらのパッケージングカセット構成の変形態様を、現行のMuL VLTRに対す るその他のRNAポリメラーゼプロモーターの置換、RNAポリメラーゼプロモーター と第１のシンドビスヌクレオチドの間の単数又は複数のヌクレオチドの付加、又 はトランスクリプターゼ認識に必要とされる５’末端シンドビス配列を保持しう る又は保持し得ない、構造タンパク質配列の上流でのシンドビスコーディングを 受けていない読取り枠の置換を含む、当該技術分野における標準的技術を用いて 作ることも可能である。 もう１つのベクター誘発可能なパッケージング形態においては、発現カセット は、その天然の接合及び３’−未翻訳領域によってフランキングされ、プロモー ターからの一次転写がアンチセンス構造タンパク質遺伝子及び分子を産生するよ うに１つの配向で発現ベクター内に挿入されたシンドビス挿入タンパク質遺伝子 配列のcDNAコピーを含んでいる。付加的には、これらの構成体は同様に接合領域 に隣接して、ウイルストランスクリプターゼによる認識にとって必要なシンドビ ス５’末端配列及び５’末端配列のシンドビスヌクレオチド１に直ぐ隣接して位 置づけされた触媒リボザイム配列をも含んでいる。このため、このリボザイムは 第１のシンドビスヌクレオチドの後で精確に一次RNA写しを分割する。このアン チセンス配向においては、構造タンパク質遺伝子は翻訳され得ず、その発現に先 立つポジティブ鎖のmRNA内への転写のために、シンドビスウイルス非構造タンパ ク質の存在に完全に依存している。これらの非構造タンパク質は、シンドビスベ クター自体により提供される。その上、この形態では精確なシンドビスゲノム５ ’−及び３’−末端配列が含まれていることから、構造タンパク質遺伝子の写し は、シンドビスベクターにより提供されたものと同じ非構造タンパク質を利用す ることによって、増幅を受ける。 特定的には、シンドビス構造タンパク質遺伝子cDNAはゲノミッククローンpVGS p6GENから取出され、以下のとおり、pcDNA3（Invitrogen Corp.，Sandiego，CA ）発現ベクター内に挿入される。第１にプラスミドpVGS p6GENは、非構造タンパ ク質１，２，３及び大部分の４をコードする遺伝子を含むヌクレオチド7335まで の全てのシンドビス配列を除去するべく酵素ApaＩ及びBamHＩで消化される。シ ンドビス構造タンパク質遺伝子を含む残りの7285bpのベクターフラグメントを、 0.8％のアガロースゲル内で精製し、その後、２つの合成オリゴヌクレオチドを アニールすることによって得られるSinMCSと呼ばれるポリリンカー配列と連結さ せる。オリゴヌクレオチドSimMCSＩ及びSinMCS IIは、ClaＩ，Bgl II及びSpeＩ についての認識部位を含み、アニーリングの後、ApaＩ及びBamHＩ末端を有する 。その配列は以下のとおりである。 SinMCSＩ： 5'-CTCATCGATCAGATCTGACTAGTTG-3'（配列番号31） SinMCS II： 5'-GATCCAACTAGTCAGATCTGATCCATGAGGGCC-3'（配列番号32） このとき、pMCS-26Sとして知られている結果として得られた構成体は、重複PC R増幅を用いて肝炎デルタウイルス（HDV）の抗ゲノミック鎖からの84ヌクレオチ ドリボザイム配列に融合されたシンドビスの５’−末端の299のヌクレオチドを 含むように修正される（Nature 350：434）。２つのプライマー対は当初別々の 反応において使用され、その後２回目のPCRにおいて、その重複合成が行なわれ る。反応＃１では、順方向プライマー（HDV49-XC）はHDVゲノムヌクレオチド823 -859に対して相補的であり、逆方向プライマー（HDV17-68）はHDVゲノムヌクレ オチド839-887に対して相補的であり、配列は以下の通りである： 順方向プライマー（HDV49-XC） 5'-ACTTATCGATGGTTCTAGACTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTG- CCGTCCTCCTTC-3'（配列番号33） 逆方向プライマー（HDV17-68） 5'-TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCAC- GTCCACT-3'（配列番号34） そのそれぞれの相補性に加えて、プライマーHDV49-XCは、５’−末端にフラン キングXbaＩ及びClaＩ認識配列を含んでいる。HDV配列のPCR増幅は、これらのプ ライマー及びVentポリメラーゼでの標準的２温度循環プロトコルによって達成さ れる。反応＃２では、精確にHDV及びシンドビス配列を接合する順方向プライマ ー（SIN-HDV）はシンドビスのヌクレオチド１−21及びHDVのゲノミックヌクレオ チド871〜903に対し相補的であり、20のヌクレオチド分だけプライマーHDV17-68 （以上から）の配列と重複し、逆方向プライマ ー（SIN276-SPE）はシンドビスヌクレオチド299-276に対し相補的であり、配列 は以下の通りである。 順方向プライマー（SIN-HDV） 5'-TCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCATTGACGGC- GTAGTACACACT-3'（配列番号35） 逆方向プライマー（SIN276-SPE） 5'-CTGGACTAGTTAATACTGGTGCTCGGAAAACATTCT-3'（配列番号36） そのそれぞれの相補性に加えて、プライマーSIN276-SPEは、その５’−末端に 、フランキングするUAA翻訳終了コドン及びSpeＩ認識配列を含んでいる。HDVリ ボザイム配列に融合されたシンドビス５’−末端配列を含むフラグメントのPCR 増幅は、鋳型としてのpVGS p6GENプラスミド、これらのプライマー及びVentポリ メラーゼを用いて、標準的な２温度循環プロトコルにより達成される。一回目の PCR増幅の後、反応＃１及び反応＃２の各々からの合計量の１／20を組合わせ、 付加的にプライマーHDV49-XC及びSIN276-SPEを投与し標準的な２温度循環プロト コルを用いた２回目のPCR増幅において、鋳型としてこれを使用する。２回目のP CRの後、414bpのアンプリコンをMermaidキット（Biolol，La Jalla，CA）で精製 し、酵素ClaＩ及びSpeＩで消化させる。消化したアンプリコンを１％のアガロー スゲル内で精製し、その後プラスミドpMCS-26sへと連結させるが、このプラスミ ドと同様にClaＩ及びSpeＩで消化させられ１％のアガロースゲル中で精製される 。結果として得られる、発現カセット要素HDV抗ゲノミックリボザイム／シンド ビス５’−末端299 nts.／シンドビス接合領域／シンドビス構造タンパク質遺伝 子／シンドビス３’−末端未翻訳領域を含む構成体は、ｐδ5'26sとして知られ ている。 ｐδ5'26sからpcDNA3ベクター内への構造タンパク質遺伝子カセ ットの挿入は、以下の通りに行なわれる。プラスミドｐδ5'26は酵素XbaＩで消 化され、３’−陥凹末端は、クレノウ酵素及びdNTPの付加により平滑末端にされ る。4798bpの構造タンパク質遺伝子カセット全体を１％のアガロースゲル中で精 製する。プラスミドpcDNA3と酵素Hind III及びApaＩで消化させ、T4 DNAポリメ ラーゼ酵素及びdNTPを付加することによって末端を平滑にし、１％のアガロース ゲル中で5342bpのベクターを精製する。その後、精製された２つの平滑末端DNA フラグメントを連結させ、結果として得た構造タンパク質遺伝子発現カセットベ クターは、pCMV−δ5'26として知られている（図８参照）。細胞内へのこのDNA のトランスフェクション及びG418耐性についての選択は、前述のとおりに行なわ れる。 cMVプロモーター／アンチセンス−シンドビス構造タンパク質ベクターの修正 態様を、その他のウイルス、細胞又は昆虫ベースのプロモーターを用いて構築す ることも可能である。当該技術分野において知られている一般的分子生物学的技 術を用いて、CMVプロモーターをインビトロ−ゲンpcDNA3ベクターからスイッチ し、以前に列挙したもののようなプロモーターにより置換させることができる。 このアンチセンスパッケージングカセットのその他の変形態様としては、第１の シンドビスヌクレオチドと触媒リボザイムの間の単数又は複数のヌクレオチドの 付加、写しの処理のためのその他の触媒リボザイム配列の使用、触媒リボザイム 配列のための精確な転写終了シグナルの置換又は、構造タンパク質第１mRNAの転 写を結果としてもたらすRNAポリメラーゼによって認識されるあらゆる下流配列 を用いた構造タンパク質遺伝子カセットのアンチセンス発現、があるが、これら に制限されるわけではない。 さらに、記述されたベクター誘発可能な構成体の各々がシンドビスベクター自 体に対し相同な配列を含んでいるということに留意す べきである。従って、２つのRNA分子の間の組換えによる野生型ウイルスの生成 の潜在性が存在する。以下で記述する通り、この可能性を無くするべく付加的な 修正が加えられる。 ４．組換えを防ぐための構造タンパク質遺伝子の分離 ここで記述するアプローチの有用性を実証した後、これらの原理に基づいて、 付加的なパッケージング細胞系統を生成する。これらの付加的な系統は、構造タ ンパク質遺伝子の組込み及び発現を分離し、重複しない独立したRNA分子として のそれらの転写を可能にする。糖タンパク質E2及びE1とは独立したカプシドタン パク質の発現、又は３つのタンパク質の各々の互いから独立した発現は、ベクタ ーRNAとの組換えそしてその後の汚染性野生型ウイルスの生成の可能性を削除す る。 特定的に言うと、カプシドタンパク質は、誘発可能な発現ベクターから独立し て発現され、そのためベクターRNAとの組換えという結果をもたらす可能性のあ る配列は削除されるようになっている。一例を挙げると、カプシドタンパク質遺 伝子は、ヌクレオチド7632−7655（順方向プライマー）及び8415〜8439（逆方向 プライマー）に対し相補的なプライマー対を用いてプラスミドpVGS p6GENから増 幅され、配列は以下の通りである。 順方向プライマー： 5'-GTCAAGCTTGCTAGCTACAACACCACCACCATGAATAGAG-3' （配列番号37） 逆方向プライマー： 5'-CAGTCTCGAGTTACTACCACTCTTCTGTCCCTTCCGGGGT-3' （配列番号41） そのそれぞれの相補性に加えて、順方向プライマーはその５’−末端にNheＩ 及びHind III認識配列を含み、逆方向プライマーはその ５’−末端にUAG及びUAA翻訳ストップコドン及びXhoＩ認識配列の両方を含んで いる。標準的２温度循環プロトコルを用いて増幅が達成され、結果として得られ たアンプリコンは酵素NheＩ及びXhoＩで消化され、１％のアガロースゲル中で精 製される。デキサメタゾン−誘発可能なMMTV LTRプロモーター配列を含む発現プ ラスミドpnAM（Clontech）を酵素NheＩ及びXhoＩで消化させ、プラスミドDNAを １％のアガロースゲル内で精製する。カプシドタンパク質遺伝子フラグメントは 、pMAMベクター内に連結され、結果として得られる構成体はpMAM-SinCとして知 られている。プラスミドpMAM-SinCを、前述のとおり適切な細胞系統内にトラン スフェクションし、メーカーが記述する通りHAT（ヒポキサンチン、アミノプテ リン、チミジン）培地を用いて、安定したトランスフェクタントについての選択 を達成する。 糖タンパク質遺伝子E1及びE2は、前述の誘発可能な系の１つを用いて一緒に発 現される。例えば、E1及びE2遺伝子は、シンドビスヌクレオチド8440−8459（順 方向プライマー）及びシンドビスnts.11,384〜11,364（逆方向プライマー）に対 して相補的なプライマー対を用いて、プラスミドpVGS p6GENから増幅される。PC R増幅は、標準的な２温度循環プロトコルを以下のオリゴヌクレオチド対を用い て行なわれる： 逆方向プライマー（11384R）： 5'-TATATGCGGCCGCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG-3' （配列番号39） 順方向プライマー（8440Ｆ） 5'-TATATGCGGCCGCACCACCATGTCCGCAGCACCACTGGTCACG-3' （配列番号42） そのそれぞれの相補性に加えて、順方向プライマーは、「枠内」 AUG翻訳開始コドンを含み、両方のプライマー共、その５’−末端にNotＩ認識配 列を含んでいる。PCR増幅の後、アンプリコンは、NotＩ酵素で消化され、１％の アガロースゲル中で精製される。次に、結果として得られたフラングメントを別 々にpOP13及びpOPRSV1ベクター（Stratagene）内に連結させ、NotＩで消化させ 、前述の通り仔ウシ腸内アルカリ性ホスファターゼで処理する。カプチドタンパ ク質発現構成体で予めトランスフェクションを受けた細胞をトランスフェクショ ンするためにこれらの糖タンパク質発現ベクターを使用する。 ５．シンドビスパッケージング細胞系統を作り出すための構成要素のアッセン ブリー 例示を目的として、構成要素のアッセンブリーを実証するのにAedes albopict us（セスジヤブカ）を使用する。ただし、シンドビスパッケージング細胞系統を 作り出すのに、考えられるその他の親細胞系統を使用することもでき、これにつ いては前述した。Aedes albopictus蚊細胞（ATCC No.CTL 1660）を、可欠アミノ 酸、２mMのＬ−グルタミン、アールの平衡塩溶液、0.11％の重炭酸ナトリウム及 び10％のウシ胎児血清を含む最少必要培地（イーグル）（最適培地）中の５％の CO2の中で、28℃にて成長させる。35mM入りのペトリ皿の中で成長させた約５×1 05の蚊細胞を、供給業者が提案するとおり、血清を含まない培地条件で５μｌの トランスフェクタム(Promega)カチオン性脂質試薬を用いて５μｇのp3'SSでトラ ンスフェクションする。ただし、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降によって、 又は当該技術分野において一般に知られている容易に入手可能なカチオン性リポ ソーム製剤及び手順のいずれかを用いることによって、あらゆるトランスフェク ション方法を実施することができる。トランスフェクションから24時間後に、20 0μｇ／mlの抗生物質 ハイグロマイシンで補足された上述の最適培地４ml用いて、細胞をオーバーレイ し、10〜14日の期間にわたり選択する。次に、膨張したクローンを分離し、ノー ザンブロットハイブリダイゼーションによりLacリプレッサーの発現についてテ ストする。その後、充分なレベルのLacリプレッサーmRNAを発現する個々のクロ ーンを、シンドビス構造タンパク質（すなわちpOP13-SINSP又はpOPRSV1-SINSP） を発現するlacオペロンベクター構成体を用いて再度トランスフェクションし、 それに続いて200〜800μｇ／mlのゲネチジンでの薬物選択及び連続的ハイグロマ イシン選択が行なわれる。その後、両方の抗生物質に対する耐性を表わしている コロニーを次にプールし、希釈クローニングし、増殖させる。その後個々のクロ ーンを12時間５mMのIPTGで誘発させ、高レベルのシンドビス構造タンパク質発現 についてスクリーニングする。特異的抗体（文献中にて入手可）を用いたウェス タンブロット分析、又はシンドビス構造タンパク質遺伝子領域のRNAに対して相 補的な32Ｐ末端標識付けされたRNAプローブを用いたRNアーゼ防御検定内でのシ ンドビス特異的RNAの数量化によって発現を試験することができる。これらの検 定手順は、IPTGでの誘発に応答しての最高レベルの構造タンパク質発現をもつク ローンを明らかにする。このとき、機能的活性について、最高の発現を行なう蚊 細胞クローン（Albopictus SINpak細胞と呼ぶ）のいくつかを試験する。機能的 活性は、ルシフェラーゼ発現ベクターをパッケージングする細胞系統の能力及び BHK-21細胞を再感染させルシフェラーゼ活性をトランスファする培地上清のその 後の能力を実証することによって、試験される。 特定的に言うと、35mm入りペトリ皿の中で、ハイグロマイシン及びゲネチシン を含む上述の選択培地を用いて、成長させたAlbopictus SINpak細胞を、上述のp SKSINBV-luc cDNAのインビトロ転写（ Promega)によって合成されたRNAを用いてトランスフェクションさせる。トラン スフェクションから１時間後に、培地に５mMのIPTGを補足する。トランスフェク ションから24時間後に上清を収穫し、BHK-21細胞を直接感染させるのにこれを用 い、Albopictus SINpak細胞の新鮮な単層を少なくとも12時間５mMのIPTGを用い て上述のとおり誘発させる。感染からの上清を感染から24時間後に収穫し、次に 、35mmのペトリ皿の中で成長させたBHK-21細胞の第２の単層を感染させるのにこ れを用いる。感染から16時間後に、BHK-21細胞を溶解させ、上述のとおりルシフ ェラーゼ活性について試験する(Promega)。１回目のベクター産生の後感染を受 けたBHK21細胞から得たルシフェラーゼ活性を２回目のベクター再生の後感染を 受けたBHK-21細胞と比較すると、発現レベルで少なくとも10倍の差が実証される はずである。レベルの差が10倍より低いならば、トランスファの後のトランスダ クションの効率の低下は、過渡的ベクターを産生した同一のシンドビスパッケー ジング細胞系統上の占有させた細胞レセプターのせいである可能性がある。この ことは、偽性型別されたシンドビスベクターの産生がエンベロープ関連パッケー ジング細胞系統内へのトランスダクションの効率を改善することが必要であると いうことを表わしているかもしれない。 Ｃ．シンドビス生産者細胞系統のための誘発可能なベクター及び構造タンパク質 の発現 １．ウイルス性プロモーターの使用 シンドビスベクター生産者細胞系統を開発しようとする挑戦は、哺乳動物の細 胞がそれに感染するとほぼ排他的に生産性溶解細胞を死滅させる結果となるよう なウイルスを何とか変換してこれらの同じ細胞中の持続性感染を樹立させること ができるか否か、という問題にある。１つの可能性は、感染後にウイルスの持続 性が結果とし てもたらされるような蚊細胞からのシンドビスベクター生産者系統を生成するこ とにある。しかしながら、持続的に感染を受けた蚊細胞の中で産生された感染性 ウイルスの力価は、わずか約１×104PFU/mlにすぎず、これは、BHK細胞のシンド ビス溶解性感染の後に見られるものよりも少なくとも５ケタ小さいものである。 かくして、蚊由来のシンドビスベクター生産者細胞系統を開発することは、商業 的に実施可能でないかもしれない。 生産的細胞溶解感染が適正な刺激の後にのみ起こるように、ベクター及びウイ ルスの構造遺伝子カセットの両方を含む誘発可能なシンドビスベクター生産者細 胞系統について、数多くの戦略が記述されてきた。これらのアプローチは「フィ ードフォワード」レベルで作用することから、系内に漏出性があるとシンドビス の生活環の開始及び細胞の死滅という結果をもたらすことになる。 開発の保証は、分化状態に依存する遺伝子発現パターンにある。遺伝子発現パ ターンは、未分化状態と末端で分化された状態の間で大幅に異なっている。従っ て、その分化状態を制御することのできる細胞が、シンドビスベクター生産者細 胞系統を誘導すべき理想的宿主である可能性がある。このような形態では、ベク ター及び構造的構成要素は、記述されたELVIS戦略に従って、末端分化状態誘発 可能プロモーターに共役（カップリング）され、未分化の宿主細胞を安定した形 で形質転換するために使用される。 適切な刺激による誘発の後の宿主生産者細胞の末端分化は同時に、シンドビス 複製サイクルの誘発とパッケージングされたベクターの産生という結果をもたら す。アンチセンス構造遺伝子及び非相同ウイルス発現系を含む、本書に記述され ているその他の戦略は、以下で記述する細胞分化状態依存性プロモーターと共役 されることになる。 このアプローチでは、末端でのみ分化された細胞の中で活性であるウイルス性 又は細胞性プロモーターのいずれかを用いた３つの例について記述される。 マウスポリオーマウイルス（Py）、SV40及びモロニーマウス白血病ウイルス（ M-MuLV）が全て、未分化のマウス胚性ガン腫（EC）細胞を感染させその中に入る ことのできるものであるが、それらの遺伝子（及び非相同遺伝子）の発現及び生 産的感染の樹立は遮断されている、ということが示されてきた(Swartzendruber 及びLehman，J．Cell．Physiol．85：179〜188，1975；Peries et al.，J．Natl ．Cancer Iast，59 463-465，1977)。これらのウイルス成長特性は、マウス奇形 ガン腫の悪性基幹細胞に由来する２つの細胞系統PCC4及びF9の中で実証された。 ウイルス増殖の遮断は、転写及び複製のレベルで起こり、ウイルス非コーディン グ制御領域内に含まれたエンハンサーに対しマッピングする(Linney et al.，Na ture 308：470〜472，1984；Fujimura et al.，Cell 23：809〜814，1981：Kati nka及びYaniv．Cell 20：393〜399，1980)。 M-MuLVが未分化のEC細胞を感染させた時点で、ウイルスDNAはゲノム内に組込 まれる。しかしながら、上述のように、ウイルス遺伝子又は非相同遺伝子の発現 は遮断される。ウイルス発現のこの遮断はレチノイン酸を成長培地に付加するこ とによるEC細胞の末端分化の時点で解除される。 EC細胞内のpVGELVIS構成体のRNA発現特性を試験するため、供給業者が提案す る条件（ca．５μｇのDNA/８mgの脂質試薬）に従って、リポフェクタミン(GIBCO -BRL，Gaithersburg，MD)とプラスミドDNAの複合体を形成させ、約75％の集密性 で未分化のPCC4又はF4細胞を含む35mmのウェルに付加する（Fujimura et al.，1 981．Cell 23：809-814）。細胞変性効果（CPE）の発生及び培地上清のプラー ク検定により数量化されたシンドビス生産的感染のレベルを、未分化の及び分化 したトランスフェクションを受けた細胞の中で５日にわたって規則的な間隔で測 定する。F9及びPCC4細胞の分化は、１μＭの最終濃度でレチノイン酸（Sigma Ch emical Co.，St．Louis；Mo）の付加によって達成される。 M-MuLVベクターの感染を受けた未分化のEC細胞の中で観察される非相同遺伝子 の相対的発現の階層が一部には挿入依存性のものでありうるということが提案さ れてきた(Linney et al.，1987，J．virol．61：3248-3253)。かくして、pVGELV ISでのトランスフェクションを受けた未分化のEC細胞は、シンドビスゲノミック cDNAの転写そして今度はウイルス生活環の開始という点で、異なる結果をもたら す可能性が高くなる。この場合、pVGELVISでのトランスフェクションを受けた未 分化EC細胞のG418選択の後、残りの細胞はクローニングされ膨張させられる。こ のとき細胞クローンは、１μＭという最終濃度でレチノイン酸を付加することに より(Sigma Chemical Co.，St．Louis，Mo)、分化後のシンドビスウイルスの産 生について試験される。 シンドビスNSPの存在下でのその構造タンパク質産生が細胞分化状態に依存し ているベクターパッケージング細胞系統を分離するため、上述のとおり、未分化 F9及びPCC4細胞をpLTR/SINdIBspEを用いてトランスフェクションし、G418で選択 する。次に、パッケージングされたSIN-lucベクターを用いた高い多重度での感 染により、分化状態に感応性あるクローンを選択する。細胞溶解に対して耐性あ る又はパッケージングされたSIN-lucベクター粒子を産生しないクローンは、ベ クターパッケージングクローンの候補である。これらの候補クローンを、記述の 通り、レチノイン酸での末端分化の後のSIN-lucベクター分子産生について試験 する。 マウス野生型ポリオーマウイルス（Py）は、奇形ガン腫細胞系統PCC4又はF9の 中で複製できない。未分化細胞内でのこの複製遮断は、早期領域（すなわちＴ抗 原）遺伝子の転写レベルで起こり、ビタミンＡでの末端分化の誘発により解除さ れる。未分化のPCC4及びF9細胞内で生産的感染を樹立することのできるPy突然変 異体は、ウイルスエンハンサー領域に対しマッピングする。胚組織特異的転写エ ンハンサー要素の発生は、これらの突然変異体という結果をもたらした。未分化 奇形ガン腫細胞系統内のPy複製の阻害というこの特性を活用するため、エンハン サーを含むウイルス調節非コーディング領域を、ELVIS戦略に従って、シンドビ スウイルスのゲノミックcDNAに結合させる。Py早期領域の精確な転写開始部位が 決定されてきた（Tooze，DNA腫瘍ウイルス参照）。PCC4及びF9細胞系統は、Py− シンドビスベクターを用いて安定した形で形質転換される。このモデルにおいて は、培地にレチノイン酸を付加し末端分化を誘発させた後で、シンドビス生産的 感染が起こる。 ウイルス性エンハンサー、21bpの反復、複製原点、CAAT及びTATAボックス、及 び早期mRNA転写５’キャップ部位に対応する配列を含む、塩基5021-152からのPy 非コーディング領域は、５’ウイルス端部に位置づけされ、かくしてnvivoでは 、わずか単一キャップのＣ残基のみがシンドビス５’末端に付加されるようにな っている。Py非コーディング領域及びシンドビス５’末端の並置が、以下で詳述 するようにPCRを重複させることによって達成される。第１の一次PCR反応におけ るPy非コーディング領域の増幅が、pBR322/Py、菌株A2プラスミド（ATCC番号450 17-p53，A6.6(pPy-1)）及び以下のプライマー対を含む反応の中で達成される：順方向プライマー：pybgl 5021F(バッファ配列/bgl II bgl II認識配列/Pynts 5 021-5043) 5'-TATATAGATCTCTTGATCAGCTTCAGAAGATGGC（配列番号43）逆方向プライマー：SINPy 152R（SIN nts 5-1/Py nts 152-134） 5'-TCAATGGCGGGAAGAGGCGGTTGG（配列番号44） 以上に示したプライマー対を用いたPy非コーディング領域のPCR増幅が、テル メラーゼ熱安定性DNAポリメラーゼ（Ameresco Inc.，Solon．Ohis）及び供給業 者が供給した1.5mMのMgCl2を含む緩衝液を用いて行なわれる。付加的には、反応 には、以下に示すPCR増幅プロトコルを用いて、５％のDMSO及びHot Star Waxビ ーズ(Perkins-Elmer)が含まれる： 第２の一次PCR反応でのシンドビス５’末端の増幅が、pVGS p6GENクローン及 び以下のプライマー対を含む反応において達成される：順方向プライマー（py nts 138-152/SIN nts 1-16） 5'-CCGCCTCTTCCCGCCATTGACGGCGTAGTAC（配列番号45）逆方向プライマー（SIN nts 3182-3160）： 5'-CTGGCAACCGGTAAGTACGATAC（配列番号46） 上述のプライマー対を用いたシンドビス５’末端領域のPCR増幅は、以下のPCR 増幅プロトコルを用いて、上述の反応条件によるものである。 一次PCR反応からの442bp及び3202bpの産物は、Gene Clean（BIO 101）で精製 され、以下のプライマー対を用いてPCR反応の中で一緒に用いられる。順方向プライマー：Pybgl 5021F(バッファ配列/Bgl II認識配列/Pynts 5021-504 3）： 5'-TATATAGATCTCTTGATCAGCTTCAGAAGATGGC（配列番号47）逆方向プライマー：（SIN nts 2300-2278）： 5'-GGTAACAAGATCTCGTGCCGTG（配列番号48） 上述のプライマー対でのプライマーPCRアンプリコン産物の（？）PCR増幅は、 以下のPCR増幅プロトコルを用いて、上述の反応条件によるものである。 第１の一次PCRアンプリコン産物の20の３’末端塩基は、第２の一次PCRアンプ リコン産物の20の５’末端塩基と重複する：結果として得られる2,742bpの重複 する二次PCRアンプリコン産物を、0.8％のアガロース／TBE電気泳動により精製 し、Bgl IIで消化させ 、2,734bpの産物をBgl II及びCIAPで処理されたpcDNASINbgl/xba（例３参照）内 に連結させる。結果として得られた構成は16,641bpsであり、ELVIS-PySINとして 知られている。ベクターパッケージング細胞系統の誘導のためのpLTR/SindlBsp に類似した構造タンパク質発現ベクターを構築するため、BspEＩを用いて完成す るまでELVIS-PySIN構成を消化し、塩基422-7054間の非構造タンパク質の欠失を 達成するため、希釈条件下でこれを再結合させる。この構成は、ELVIS-PySIN Bs pEとして知られている。 ELVIS-PySINプラスミドDNAを、供給業者により提案された条件（ca．５μｇの DNA/８mgの脂質試薬）に従ってリポフェクタミン(GIBCO-BRL，Gaithersbery，MD )と複合体形成させ、約75％の集密性で未分化のPCC4又はF9細胞を含む35mmのウ ェルにこれを付加する。細胞変性効果(CPE)の発生及び培地上清のプラーク検定 によって数量化されるシンドビス生産的感染レベルは、未分化の及び分化された PCC4又はF9細胞の中で５日の規則的間隔で測定される。F9及びPCC4細胞の分化は 、１μＭの最終濃度でレチノイン酸(Sigma Chemical Co.，St．Louis，Mo)を付 加することによって達成される。 未分化のEC細胞がELVIS-PySINでのトランスフェクションに対する非相同応答 を示す場合、pVGELVISのトランスフェクションを受けた未分化のEC細胞のG418選 択に続くシンドビスウイルスの増殖により溶解されなかった残りの細胞はクロー ニングされ、膨張させられる。その後、１μＭの最終濃度でレチノイン酸(Sigma Chemical Co.，St．Louis，Mo)を付加することにより、分化後のシンドビスウ イルスの産生について細胞クローンを試験する。 シンドビスNSPの存在下で構造タンパク質の細胞分化状態依存性の発現パター ンをもつ、ELVIS-PySINdl BspEで安定した形でトランスフェクションを受けたベ クターパッケージング細胞系統の分離を 、pLTR/Sind1 BspEプラスミドについて上述した通りに達成する。 ２．細胞プロモーターの使用 この戦略の第３の例は、β−グロブリン遺伝子座制御領域を使用する。β−グ ロブリン多重遺伝子クラスタは、４つの発生調節された遺伝子を含んでいる。人 間の発生の早期段階において、胚の卵黄嚢は造血組織であり、ε−グロブリン遺 伝子を発現する。この後には、胎児の肝臓内のＴ−グロブリン遺伝子及び成人骨 髄内のδ−及びｂ−グロブリン遺伝子へのスイッチングが続く（Collins及びWei ssman，1984，Prog，Nucleic Acid Res．Mol．Biol．31：315）。 少なくとも２つのマウス赤白血病系統MEL及びFriendが、β−グロブリンの末 端分化依存性発現のためのモデルとして役立つ。成長培地に２％のDMSOを付加す ることにより末端分化の誘発後のみにこれらの系統内でβ−グロブリンの発現が 観察れる。 β−グロブリン遺伝子座全体は、遺伝子座制御領域(LCR)により調節される。L CR内にあるのは、コーディング領域の５’であるDNアーゼＩ過敏性領域内にある 優性制御領域(DCR)である。DCRは５つのDNアーゼＩ過敏性(HSI-HS5)部位を含む 。DCRは、トランスジェニックマウス及び安定した形でトランスフェクションを 受けたマウスの赤白血病(MEL)細胞内の結合されたヒトβ−グロブリン遺伝子上 での組込み独立型でコピー数依存型の発現の高レベル部位を導く。(Grosveld et al.，1993，CSHSOB 58：7-12)。最近の研究では(Ellis et al．1993 EMBO 12： 127-134)、HS2内の配列に一致する合成コアのコンカテマーが、遺伝子座制御領 域として機能することが示された。 シンドビスベクターの分化状態依存型発現を達成するため、ウイルスのゲノミ ックcDNAを、LCRHS2部位に対応する縦列合成コアを含むプロモーターと並置させ る。代替的には、相同組換えにより内因 性β−グロブリン遺伝子内でLCRの下流に望ましいシンドビスベクター構成体を 挿入することができる。このような戦略においては、末端分化後のβ−グロブリ ン転写開始部位をまず決定して、シンドビスベクターを精確に出発部位に置くこ とができるようになっている。 宿主細胞の分化状態によって溶解性ウイルス生活環の開始が制御される、ここ で提案されている戦略は、ウイルスが誘発する細胞病理の制御が望まれるその他 の系において利用できるはずである。 ３．分化状態により制御される誘発可能なプロモーターの中へのベクター構成 体の挿入 例３に記述されているようなELVIS形態に位置づけされたシンドビスベクター からの非相同遺伝子の発現が分化状態に依存したものであるクローンの生成を、 pVGELVIS，pLTR/Sind1 BspEプラスミドについて上述のとおりに達成する。その ベクターを粒子産生が分化状態に依存しているクローンの生成を、ELVIS非相同 遺伝子発現ベクターを用いて上述の分離した分化依存性ベクターパッケージング クローンをトランスフェクションすることによって達成する。レチノイン酸によ り誘発された分化後に望ましい表現型又はベクター産生を有するクローンを、上 述のとおりに分離する。 Ｄ．非相同アストロウイルス接合領域からの構造タンパク質の発現 ベクターパッケージング系の重要な特性の中には、ベクターと構造遺伝子構成 要素の間の組換えを通して野生型ウイルスを作り出すことなく、感染性粒子を生 成するのに必要な構造的構成要素を細胞が発現するということがある。パッケー ジング細胞系統のこれら２つの望ましい特性は、個々の非相同RNAポリメラーゼI I発現カセット上でのgag/pol及びenv遺伝子の構成性発現を通して、レトロウイ ルスベースの系において達成される。 ベクターパッケージング細胞系統のもう１つの重要な面は、野生型ウイルスの 正常な複製戦略をできるかぎり密接に模倣する系を誘導することにある。この問 題は、パッケージングされた組換え型ベクターの観察された力価レベルという点 で重要なものである。接合領域プロモーターからの高レベルのサブゲノミックmR NAの転写及びそれに続く構造タンパク質への効率の良い翻訳の後で、シンドビス 感染中のウイルス構造タンパク質の合成が達成される。接合領域プロモーターは 、アンチセンス配向においてのみ機能的であり、アンチゲノミックRNAの合成は 、非構造タンパク質の翻訳の後に起こり、かくして構造タンパク質の発現が遅延 される。このため、シンドビスに関しては、それ自体組換え型ベクター分子から 発現された非構造タンパク質によって活性化される接合領域プロモーターから構 造タンパク質の合成が行なわれるようなパッケージング細胞系統を構築すること が好ましいということになる。 選択模写メカニズムを介してシンドビスでの感染の間にRNAゲノミック分子の 間の比較的高い頻度の組換えが起こるということが知られている（PNAS 1991 88 ：3253-3257）。ベクターと接合領域／構造遺伝子カセット。間の組換えは、恐 らくはパッケージングされたベクター粒子100万につき１つの野生型ウイルスの レベルで野生型シンドビスウイルスの生成という結果をもたらすことになる（Li ljestrom Bio/Technology 1991 9：1356-1361）。野生型ウイルスの生成を緩和 する１つの方法は、レトロウイルスパッケージング細胞系統について使用されき わめて成功し、例７で前述したアプローチである、別々の発現カセットへと構造 遺伝子を分離する方法である。 シンドビスベクターパッケージング細胞系統内の野生型ウイルス産生レベルを 低下させるもう１つのアプローチは、アストロウイル ス遺伝子要素の制御下で構造タンパク質を発現することである。この形態につい ての概略図が図10に描かれている。シンドビスウイルスと同様に、アストロウイ ルス構造タンパク質の発現は、サブゲノミックメッセージから高い構造タンパク 質レベルが合成される接合領域戦略を取り入れている。アストロウイルス発現カ セットは、以下の順序の２つの要素のうちの１つで構成されていてよい：（１） 誘発可能なプロモーター／アストロウイルス５’末端／アストロウイルス接合領 域／シンドビス構造遺伝子／アストロウイルス３’末端、又は（２）アンチセン スアストロウイルス３’末端／アンチセンスシンドビス構造遺伝子／アンチセン スアストロウイルス接合領域／アンチセンスアストロウイルス５’末端／肝炎デ ルタウイルスリボザイム又は例７に記述されたその他の形態。両方の形態におい て、発現ユニットは、ウイルス複製の間に起こるものと同じメカニズムを通して アストロウイルス非構造タンパク質によって増幅される。接合領域から開始され る多数回にわたるサブゲノミックmRNA合成は、各々の発現ユニットから起こるこ とから、アストロウイルス非構造タンパク質による発現ユニットの増幅は、きわ めて高レベルのシンドビス構造タンパク質の産生という結果をもたらすことにな る。上述のシンドビス構造タンパク質発現カセットの第２の形態は、毒性シンド ビス構造遺伝子の一次写しがアンチセンスであることから、第１の形態よりもう まく機能するかもしれない。第１の形態における構造遺伝子の発現は、ネガティ ブ鎖の合成とそれに続く接合領域からのポジティブサブゲノミックRNAの合成ま で起こるはずがないものの、第２の形態における一次写しのアンチセンス性は、 細胞障害性タンパク質の発現を防ぐ付加的な制御レベルを表わしている。 シンドビスウイルスの構造タンパク質がアストロウイルス接合領 域発現カセットから個別に合成されるパッケージング細胞系統内では、いかなる 野生型ウイルスも生成されない可能性が高い。ベクターの非構造タンパク質領域 とアストロウイルス構造タンパク質発現カセットの間の組換えは、生存不能な組 合せであるシンドビスウイルス遺伝子とアストロウイルスシス要素の共役が見ら れる分子という結果をもたらす。シンドビスシス及びトランス要素の適正な共役 には、ベクターとアストロウイルス発現カセットの間、アストロウイルス接合領 域と構造遺伝子ATGの間、そして構造遺伝子終止コドンとアストロウイルス３’ 末端の間に２つの精確な組換え事象が必要となる。野生型ウイルスを生成するた めには、この２重組換え事象は、３つの別々のシンドビス構造遺伝子を取り込む べく同じ分子上で３回ずつ（合計６回の事象）起こらなくてはならない。 アストロウイルスタンパク質の考えられる毒性を減少させるために、アストロ ウイルス発現カセットの合成が誘発可能なプロモーターにより制御される。１つ の可能性は、例７で前述した「lac-スイッチ」系に従ってlacオペロンを使用す ることである（Stratagene）。無償誘発物質IPTGの不在下でのオペロン制御され た遺伝子の構成性発現レベルは、細胞１個につき約10コピーである。アストロウ イルス／シンドビス構造遺伝子発現カセットに対応する誘発可能なプロモーター は、lacオペロン又はその他の非常に低い構成性発現レベルをもつ適当なプロモ ーターであってよい。非相同性ウイルスによりシンドビスタンパク質の制御が導 かれているこれらの形態のパッケージング細胞系統の構築は、高力価の野生型ウ イルスを含まないパッケージングされたベクター粒子の生成という結果をもたら すはずである。 例８ 代替的ウイルスベクターパッケージング技術 ベクター構成体を支持する組換え型シンドビスウイルスを産生するためにさま ざまな代替的系を使用することができる。これらの系の各々は、バキュロウイル ス及び哺乳動物ウイルス、ワクチン及びアデノウイルスが近年、遺伝子クローニ ングの対象となったいずれかの与えられたタンパク質を大量に作るように適合さ せられたという事実を利用するものである（Smith et al.，Hol．Cell．Biol．3 ：12，1983；Piccini et al.，Meth．Enzymology 153：545，1987；及びMansonr et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：1359，1985）。 これらのウイルスベクターは、ウイルスベクター内への適当な遺伝子の挿入に より組織培養細胞内でタンパク質を産生するために使用でき、又シンドビスベク ター粒子を作るように適合させることも可能なものである。 アデノウイルスベクターは、核複製ウイルスから誘導され、欠陥状態でありう る。ベクター内に遺伝子を挿入し、インビトロ構築（Ballay et al.，EMBO J．4 1：3861，1986）、又は細胞内の組換え（Thummel et al.，J．Mol．Appl．Genet ris１：435，1982）のいずれかにより哺乳動物細胞内でタンパク質を発現するの にこの遺伝子を使用することができる。 １つの好ましい方法は、（１）シンドビス非構造タンパク質、及び（２）修正 されたシンドビスベクター構成体を駆動するアデノウイルス主要後期プロモータ ー(MLP)を使用してプラスミドを構築することである。この形態における修正さ れたシンドビスベクターは、転写されたRNAベクターが天然の状況下でそうであ る通りに自己複製するものとなることができるようにする修正された接合領域を なおも含むことになる。 このときこれらのプラスミドを、インビトロでアデノウイルスゲ ノムを作るのに使用することができる（Ballay et al.，Embo．J.4：3861，1985 ）。複製欠陥性であるこれらのアデノウイルスゲノムは、293個の細胞（アデノ ウイルスE1Aタンパク質を作っているヒトの細胞系統）の中でトランスフェクシ ョンされて、欠陥アデノウイルスベクター内に別々に支持されたシンドビス構造 タンパク質及びシンドビスベクターの純粋な株を生み出す。このようなベクター の力価は標準的に107〜1011／mlであることから、これらの株を、高い感染多重 度で同時に組織培養を感染させるのに使用することができる。このとき、細胞は 、シンドビスタンパク質及びシンドビスベクターゲノムを高いレベルで産生する 。アデノウイルスベクターは欠陥性であることから、直接的細胞溶解は大量に起 こらず、シンドビスベクターを細胞上清から収穫できる。 同じ要領で、一次細胞からベクターを生成するため、無関係のシンドビスベク ター(例えばRSV，MMTV又はHIV)から誘導されたものといったその他のウイルスベ クターを使用することも可能である。一つの実施態様においては、これらのアデ ノウイルスベクターを一次細胞と合わせて使用してシンドビスベクター調製物を 生み出している。 キメラHIV/ポリオウイルスゲノムが、融合タンパク質を発現することのできる キメラミニレプリコンの生成（J．Virol．65：2875，1991）を結果としてもたら す代替的発現系についても同様に記述されている。これらのキメラポリオウイル スミニレプリコンは後に、包膜され、キメラミニレプリコンの中で欠陥のある置 換されたポリオウイルスカプシド前駆物質P1タンパク質を発現する組換え型ワク チニアウイルス（VV−P1）を用いることによって感染性粒子を産生するものであ ることが実証された（J．Virol．67：3712，1993）。この研究において、HIV-1 gag-pol配列は、ポリオウイルスのP1カ プシドのVP2及びVP3カプシド遺伝子に置換させられた。類似のやり方で、シンド ビスベクターゲノムをP1カプシド配列に置換させ、この系内で、インビトロ転写 されたシンドビスRNA写しを細胞系統内にトランスフェクションした後ポリオ偽 性型別シンドビスベクターを提供するための手段としてこれを使用することが可 能である。換言すると、シンドビス構造タンパク質は同様に、VP2及びVP3配列を 置換し、その後シンドビスベースのベクターのための代替的パッケージング細胞 系統系を提供することができる。 １つの代替的系においては、以下の構成要素が用いられる： １．Smith et al（前出）の中で記述されているものと類似の要領でバキュロ ウイルス系内（又は酵母又はE．coliといったようなその他のタンパク質産生系 内）で作られたシンドビス構造タンパク質； ２．既知のT7又はSP6又はその他のインビトロRNA生成系（Flamant et al，J． Virol．62：1827，1988）の中で作られたウイルスベクターRNA； ３．酵母又は哺乳動物組織培養細胞から精製された又は（２）の通りに作られ たtRNA； ４．リポソーム（包埋されたenvタンパク質を伴う）；及び ５．RNA処理及びいずれかの又はその他の必要な細胞由来の機能を提供するも のとして同定された場合の（標準的にマウスの細胞からの）細胞抽出物又は精製 された必要な構成要素。 この手順内で、（１），（２）及び（３）が混合され、その後、env随伴シン ドビスタンパク質、細胞抽出物及びプリリポソーム混合物（適当な溶剤中の脂質 ）が付加される。（１），（２）及び（３）の混合物に対して結果として得られ たリポソーム包埋envを付加する前にリポソーム内にシンドビスenvタンパク質を 包埋するこ とが必要である可能性がある。薬剤のリポソーム包膜のための方法と同じ要領で 脂質プラス包埋シンドビスenvタンパク質で発生期のウイルス粒子を包膜できる ようにするため、混合物を処理する（例えば、音波処理、温度操作又は回転透析 による）（Gould-Fogerite et al.，Aral．Biochem．148：15，1985）。この手 順は、中間パッケージング細胞系統を樹立するという必要条件無しに、高力価の 複製不全シンドビスウイルスベクターを産生する。 例９ 細胞系統又は組織特異的シンドビスベクター・「ハイブリッドエンベロープ」 シンドビスウイルスの組織及び細胞型特異性は、ウイルスコーディングされた 外被タンパク質E1及びE2によりまず決定される。これらのビリオン構造タンパク 質は、ウイルス粒子が感染細胞の表面から発芽したときに得られる宿主細胞由来 の脂質エンベロープの中に包埋された膜内外糖タンパク質である。このエンベロ ープは、単一のカプシドタンパク質の多重高次コピーと複合体形成したゲノミッ クRNAで構成されている二十面体ヌクレオカプシドを取り囲んでいる。E1及びE2 外被糖タンパク質は、３量体構造内にアッセンブリー（集合）すると思われるヘ テロダイマーとして複合体形成され、ビリオン表面上に特徴的な「スパイク」を 形成する。その上、これらのタンパク質の細胞質テイルはヌクレオカプシドと相 互作用し、新しいウイルス粒子のアッセンブリーを開始させる（Virology 193： 424，1993）。個々のシンドビス糖タンパク質に起因する特性としては、糖タン パク質E2によるレセプタ結合（Virology 181：694，1991）、及び細胞質内への ヌクレオカプシド粒子の送り出しという結果をもたらすビリオンエンベロープと エンドゾーム膜の糖タンパク質E1を媒介にした融合（ポジティブ鎖RNAウイルス の新しい様相 、p166〜172，1990）がある。 本発明は、糖タンパク質活性（特にE2であるがこれに限られるわけではない） を分析し無傷の非相同糖タンパク質を同時発現させること、又は、ハイブリッド エンベロープ遺伝子産物（すなわち特定的に言うと、同じタンパク質分子内で天 然には発見されない外因性結合ドメイン及びその天然の細胞質及び膜にまたがる 領域を有するシンドビス外被糖タンパク質）を作り上げること、又はその組織向 性においてシンドビスとは異なるその他のアルファウイルス又はその誘導体の糖 タンパク質とこれらのE2及び／又はE1糖タンパク質を置換することによって、ビ リオンアッセンブリーにとって必要とされる細胞質機能を分析することなく宿主 範囲特異性を変えることができる、ということを認めている。かくして、導入さ れたタンパク質分子又はドメインの向性に応じて、予め選択された標的細胞に対 して特異的に結合することになる組換え型シンドビスベクター粒子を産生するこ とができる。 第１の形態においては、組織の向性を変えるため、その他のアルファウイルス 又はその変異体からの類似の外被糖タンパク質E1及び／又はE2の置換が用いられ る。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)は、そのシンドビスウイルス相 対物とは異なり、リンパ球由来の細胞に対する向性を示すアルファウイルスであ る。従って、VEE構造タンパク質を発現する細胞系統内にパッケージングされた シンドビスベクターは、パッケージング細胞構造タンパク質遺伝子カセットを提 供した親VEEウイルスと同じリンパ向性を示すことになる。 特定的には、VEEウイルスのトリニダードロバ株(ATCC #VR-69)をBHK細胞内で 増殖させ、シンドビスのクローニングについて記述したものと類似の手順を用い てビリオンRNAを抽出する。構造タン パク質コーディング領域全体を、周囲のKozakコンセンサス配列を含む真正AUG翻 訳開始部位及びUGA翻訳停止部位に対しそれぞれマッピングする５’−末端をも つプライマー対を用いて増幅させる。順方向プライマーはVEEヌクレオチド7553 −7579に対し相補性をもち、逆方向プライマーは、VEEヌクレオチド11206〜1118 6(Virology 170：19からの配列)に対し相補的である。構造タンパク質遺伝子に 対応するVEE cDNAのPCR増幅は、シンドビスについて記述されたとおりの２段階 式送トランスクリプターゼ−PCRプロトコル、鋳型としてのVEEゲノムRNA及び以 下のオリゴヌクレオチド対を用いて、達成される。 順方向プライマー（VEE 7553F） 5'-TATATGCGGCCGCACCGCCAAGATGTTCCCGTTCCAGCCA-3' （配列番号49） 逆方向プライマー（VEE 11206R） 5'-TATATGCGGCCGCTCAATTATGTTTCTGGTTGGT-3' （配列番号50） 表示されたVEEヌクレオチドに対するそのそれぞれの相補性に加えて、各々の プライマーには、その５’末端にNotＩ認識配列が含まれている。PCR増幅に続い て、3800bpのフラグメントを１％のアガロースゲルの中で精製させ、その後酵素 NotＩで消化させる。次に、結果として得られたフラグメントを前述のpOP13及び pOPRSV1ベクター（Stratagene）の中に別々に連結させ、これらのベクターをNot Ｉで消化させ仔ウシ腸内アルカリ性ホスファターゼで処理する。完全なVEE構造 タンパク質コーディング配列を含む、これらの結果として得られたベクターは、 pOP13-VEESP及びpORSV1-VEESPとして知られている。パッケージング細胞系統の 開発におけるこれらのクローンの使用は、シンドビスパッケージングラインにつ いて記 述されたものに追従する。さらに、本特許においてシンドビスについて概略説明 された系及び当該技術分野で既知の標準技術を用いて、lacオペロン−VEE構造タ ンパク質遺伝子発現ベクターの変形態様も構築する。その上、VEEの変異体及び 組織向性が異なっているその他のアルファウイルス及びその変異体が、このアプ ローチに従う場合に有用なものである。 第２の形態では、エンベロープシンドビスベクター粒子を産生することのでき るパッケージング細胞系統の脂質２重層の中で、非相同糖タンパク質又は細胞リ ガンドが発現される。この形態は、VSV-G偽性型別シンドビスベクターの産生に ついて例６で記述したものと類似している；ただし、この形態では、E2レセプタ 結合機能は、挿入、欠失又は塩基特異的配列突然変異誘発によって不活性化され る。E2のレセプタ結合機能は、非相同糖タンパク質又は細胞リガンドにより供給 されるものにベクター粒子向性を制限するように不活性化される。VSV-G偽性型 別の列に加えて、シンドビスパッケージング細胞系統内に安定した形でトランス フェクションされた標準ベクターから発現された場合には、特定の細胞レセプタ （例えばCD4細胞ターゲティングのためのレトロウイルスHIV gp 120タンパク質 ）をターゲティングするその他のウイルス糖タンパク質が利用される。 第３の形態では、インビトロの特定の細胞系統又はインビボの組織タイプへと シンドビスウイルスベクターをターゲティングすることができるようにするキメ ラ糖タンパク質も調製される。このようなキメラ糖タンパク質を構築するために は、シンドビス構造タンパク質発現ベクターへと置換されうるインサート配列を 増幅させるのに、望ましいレセプタのリガンド結合ドメイン及び相同性シンドビ ス配列（唯一の特異的制限エンドヌクレアーゼ部位を含むもの）を 含む特異的オリゴプライマが用いられる。代替的には、許容的挿入部位に消化し 戻すために適当な制限酵素部位からの制限されたBal-31消化を行ない、その後続 いて、小さいレセプタ結合ドメインをコードするフラグメント、又は全ウイルス 糖タンパク又は細胞表面リガンドの平滑末端連結が行なわれる。一例を挙げると 、HIV gp 120外被タンパク質（Virology 185：820，1991）の主要な中和ドメイ ンに対応するペプチドを、正常なE2向性を分断しCD4細胞ターゲティングを提供 するのに用いることができる。 HIV gp 120の例は１つのハイブリッドタンパク質を例示しているが、可能性が ウイルス糖タンパク質に制限されているわけではない。例えば、ヒトインターロ イキン−２のレセプタ結合部分は、IL−２レセプタをもつ細胞内にベクターをタ ーゲティングするようシンドビスの外被タンパク質と組み合わされる。その上、 抗体のFc部分を認識する外被タンパク質を用いて組換え型シンドビスベクター粒 子を作り出すのに、前述の技術を使用する。このとき、予め選択された標的細胞 のみを認識するモノクローナル抗体をこのようなFcレセプタを支持するシンドビ スベクター粒子に結合させ、ベクター粒子がこれらの予め選択された標的細胞（ 例えば腫瘍細胞）のみに結合しこれを感染させるようにする。代替的には、ビオ チニル化された抗体又はその他のリガンドでコーディングされた細胞をターゲテ ィングするため、アビジンの結合ドメインをもつハイブリッドエンベロープが使 用される。患者はまず抗体でのフラッディングを受け、次にベクターの投与に先 立ち未結合の及び非特異的に結合した抗体を一掃する時間をもらう。ビオチンに 対するアビジン結合部位の高い親和性（10〜15）は、モノクローナルイメージ」 により同定されたものとの組織に対する精確かつ効率の良いターゲティングを可 能にしてくれる。 例10 シンドビス接合領域の制御下でのβ−ガラクトシダーゼを発現する細胞系統の感 染による調製物内のベクターユニットの決定 β−ガラクトシダーゼを発現するリポータ細胞系統の感染による調製物内のベ クターユニットの決定。 患者に適正な治療用量のベクターを投与するためには、調製物中に含まれたベ クター感染性ユニットを容易に決定することのできる方法を誘導することが望ま しい。これは、その細胞内に機能的シンドビス非構造タンパク質が存在する場合 にのみβ−ガラクトシダーゼ又はもう１つのリポータ遺伝子を発現する細胞系統 を生成することによって達成される。個々の細胞が複数のベクター粒子による感 染を受けず、かくして力価又はベクターユニットを決定できるように、増大する 希釈度のシンドビスベクター調製物で細胞系統を感染させることができる。従っ て、この細胞系統は、ベクター調製物の中に存在する機能的粒子の検定法である 。 Ａ．シンドビス非構造タンパク質の制御下で機能的β−ガラクトシダーゼタンパ ク質を発現する細胞系統の生成 １つの形態においては、シンドビスRNAの転写を開始させることのできる５’ −末端配列、シンドビス接合領域、リポータ遺伝子及びマイナス鎖合成のための ３’−末端シンドビスRNAポリメラーゼ認識配列を含む真核性発現カセットが構 築される。このカセットは、真核性転写プロモーターに隣接してアンチセンス配 向で位置づけられる。付加的にはこれらの構成体は、同様に、５’−末端配列の シンドビスヌクレオチド１に直ぐ隣接して、精確にこのシンドビスヌクレオチド の後で一次RNA写しの分割という結果をもたらすことになる触媒リボザイム配列 を含んでいてよい。このアンチセンス配向では、リポータ遺伝子は翻訳され得ず 、リポータ遺伝子発現に先 立つポジティブ鎖のmRNA内への転写のためのシンドビス非構造タンパク質の存在 に完全に依存している。これらの非構造タンパク質は、滴定されているシンドビ スベクター調製物によって提供されることになる。さらに、この形態は、精確な シンドビスゲノム５’−及び３’−末端配列を含むよう設計された場合、シンド ビスベクターによって提供されるものと同じ非構造タンパク質を利用することに より、リポータ遺伝子の写しが増幅を受けることができるようにする。 このアンチセンス滴定構成の例は、以下のとおりである。酵素SacＩを用いて プラスミドpSKSINBV-lacZを消化させる。これは、シンドビス３’−末端及びポ リＡ配列の直後で分割する。酵素T4 DNAポリメラーゼ及びdNTPを付加しその後16 ℃で10分間インキュベートすることにより、突出する３’−末端を平滑にする。 15分間75℃でのインキュベーションにより、T4 DNAポリメラーゼを熱で不活性化 する。直線化されたプラスミドを次に酵素BamHＩで消化させ、これは、シンドビ ス接合領域の上流、ヌクレオチド7335のところで切断する。結果として得られた フラグメントを１％のアガロースゲル中で精製し、酵素XbaＩで消化され上述の とおり平滑末端にされBamHＩで消化され１％のアガロースゲル内で精製され仔ウ シ腸内アルカリ性ホスファターゼで脱リンされたpMCS-26s（例７に記述）を用い て連結させる。 次に、pMCS-lacZとして知られている結果として得られた構成体を、重複PCR増 幅（図７に詳述）を用いて、肝炎デルタウイルス（HDV）の抗ゲノミック鎖から の84ヌクレオチドリボザイム配列に融合されたシンドビスの５’−末端299ヌク レオチドを含むように修正する。最初、別々のPCR反応の中で２つのプライマー 対を使用し、それに続いて２回目のPCRにおいてそれらの重複合成を行なう。反 応＃１はプライマーHDV 17〜18（配列番号 ）とHDV 49−XC（配列番号 ）を含 み、反応＃２は、プライマーSIN-HDV（配列番号 ）及びSIN276-SPE（配列番号 ）そして鋳型としてのプラスミドpVGS p6GENを含んでいる。PCR増幅は、標準 的な２温度循環プロトコルによって達成される。第１回目のPCR増幅の後、反応 ＃１と反応＃２の各々からの合計量の１／20を組合せ、プライマーHDV 49−XC及 びSIN276-SPE及び標準的２温度循環プロトコルを用いた２回目のPCR増幅におい て鋳型としてこれを使用する。２回目のPCRの後、414bpのアンプリコンをMermai dキット(Bio 101，La Jalla，CA)で精製し、酵素ClaＩ及びSpeＩで消化させる。 １％のアガロースゲル中で消化されたアンプリコンを精製し、その後、同様にCl aＩとSpeＩで消化され１％のアガロースゲル中で精製されるプラスミドpMCS-Lac Z内に連結させる。発現カセット要素HDV抗ゲノムリボザイム／シンドビス５’− 末端299 nts.／接合領域／lacZ遺伝子／３’−末端未翻訳領域を含む、結果とし て得られた構成体は、pd5'LacZとして知られている。 プラスミドpd5'LacZからのLacZ発現カセットをその後pcDNA3内に挿入する(Inv itrogen Corp.，San Diego，CA)。プラスミドpd5'LacZを酵素NotＩで消化し、上 述のとおり平滑末端化し、その後酵素XbaＩで消化する。形態シンドビス３’− 末端配列／LacZ遺伝子／接合領域／シンドビス５’末端配列／HDVリボザイムの アンチセンスリポータカセットRNAを転写するCMVプロモーターを含む、結果とし て得られた構成体は、pSINjraβ−galとして知られている。 ポリカチオン試薬Transfectam（Promega，Madison WI）と複合体形成されたpS INjraβ−galベクター５μｇを用いて60mmのペトリ皿の中で成長させた５×105 のBHK-21細胞のトランスフェクションによって、BHKSINjraβ−gal細胞を誘導す る。トランスフェクシ ョンから24時間後に、培地に400μｇ／mlのG418(Gibco BRL，Gaithersburg，HD) を補足する。トランスフェクションを受けていない細胞が全て死滅し、G418耐性 コロニーが分割し始めた後、細胞をトリプシン処理によってプレートからとり除 き、プールし、その後限界希釈法によりクローニングする。シンドビスウイルス の野生型株の既知の力価での感染による機能的β−ガラクトシダーゼの産生につ いて、いくつかのクローンを試験する。まず２％のホルムアルデヒド（37％の原 液）／0.2％のグルタルアルデヒドを含む溶液でPBS洗浄された細胞を固定し次に 0.5mMのフェリシアン化カリウム／0.5mMのフェロシアン化カリウム／２mMのMgCl2 ／１mg／mlのXgalを含む溶液で細胞を染色することによって、感染から６時間 後に、の候補のBHKSINjraβ−galクローン中の機能的ｂ−ガラクトシダーゼの産 生を決定する。３時間以内に青色細胞が明確に見える。シンドビスウイルス株が 高レベルの欠陥干渉（DI）粒子を含んでいないということを条件として、BHK-21 細胞についてプラーク検定によって決定されるウイルス力価は、BHKSINjraβ−g al細胞上でのX-gal染色により観察された力価と類のものであるはずである。 例７に記述されているもののようなパッケージング細胞系統から産生されたベ クターユニットで表わされたさまざまなシンドビスベクター調製物の力価は、い くつかのベクター希釈物でのBHKSINjraβ−gal細胞の集密的単層の感染によって 決定される。ベクター調製物の力価は、上述のとおりβ−ガラクトシダーゼタン パク質を産生する細胞の視覚化によって、感染から６時間後に決定される。記述 されたシンドビスベクターが構造遺伝子に対応するウイルス領域を含まないこと から、BHK-21細胞中のプラーク検定によりベクター調製物の力価を決定すること は不可能である。 代替的には、真核性プロモーター／ウイルストランスクリプター ゼにより認識される５’−末端シンドビス配列／シンドビス接合領域／リポータ 遺伝子／マイナス鎖合成のためのシンドビスRNAポリメラーゼ認識配列から成る 異なるリポータカセット形態を用いることによって、滴定用細胞系統が産生され 、センス配向で発現される。このリポータ発現カセットは、リポータ遺伝子をコ ードするサブゲノミックメッセージの転写に先立って、ベクターにより供給され たシンドビス非構造タンパク質によるアンチセンスRNA分子への合成を必要とす る。 特定的に言うと、センス配向のパッケージング構成体は、以下のように作り上 げられる。酵素ApaＩを用いてプラスミドpVGELVISを消化させ、これはシンドビ ス３’−末端のちょうど下流でヌクレオチド11737のところで分割する。T4 DNA ポリメラーゼ及びdNTPの付加及び10分間16℃でのインキュベーションによりApa Ｉ−消化されたDNAを平滑末端にする。ポリメラーゼの熱不活性化の後、DNAフラ グメントを酵素SfiＩで消化させ、１％のアガロースゲル内で10041bpのフラグメ ントを精製する。プラスミドpSKSINBV-lacZを酵素SacＩで消化させ、上述のとお りに平滑末端化する。その後、フラグメントをSfiＩで消化させ、１％のアガロ ースゲル中で7kbpのフラグメントを精製する。次に７kbのpSKSINBV-lacZフラグ メントを精製されたpVGELVISフラグメントナトリウム内に連結させてプラスミド pELVIS-bgalを作り出す。このプラスミドは、MuLVLTRプロモーターの制御下で完 全なシンドビス非構造タンパク質、シンドビス接合領域、LacZ遺伝子及びシンド ビス３’−末端レプリカーゼ認識配列を含む。プラスミドpELVIS-bgalをBspEＩ で消化させ、Gene clean（Bio 101 corp.，San Diego，CA）で精製し、自らに再 度連結させる。BspEはnts 422-7054の間のシンドビス非構造タンパク質遺伝子配 列を除去する。再連結された構成体は、全てのMuLV-LTRプ ロモーターの転写制御下にありかつ下流にある、シンドビスRNAの転写を開始す ることのできる５’配列、シンドビス接合領域、LacZ遺伝子をコードする配列、 そしてマイナス鎖のRNAの合成のために必要とされるシンドビス３’−末端配列 を含んでいる。この構成体は、pELVISdlNSP-bgalとして知られている。 プラスミドpELVISdlNSP-bgalを、BHK細胞中にトランスフェクションさせ、前 述のとおりに試験する。BHK，pELVISdlNSP-bgal細胞は、シンドビストランスク リプターゼにより認識される、末端配列、シンドビス接合領域、LacZ遺伝子をコ ードする配列そしてマイナス鎖RNAの合成のために必要とされるシンドビス３’ 末端配列を伴うRNA写しを産生する。BspEＩの欠失により作り上げられた終止コ ドンと上流の読取り枠のため、一次写しからのβ−ガラクトシダーゼ発現が防が れる。滴定されつつあるシンドビスベクターによって提供されたシンドビス非構 造タンパク質の付加は、アンチセンス中間体の初期合成の後、シンドビス接合領 域からの活性lacZ写しの転写という結果をもたらすことになる。さらに、この形 態は、精確なシンドビスゲノム５’−及び３’−末端配列を含むよう設計されて いる場合、シンドビスベクターにより提供されたものと同じ非構造タンパク質を 利用することによってリポータ遺伝子の写しが増幅を受けることができるように する。 もう１つの形態においては、センス配向で位置づけされたアンチセンスリポー タ遺伝子とそれに続く３’−末端シンドビスレプリカーゼ認識配列を含む発現カ セットを用いて、滴定用細胞系統が産生される。この構成体は、真核性プロモー ターの制御下で、滴定されるきベクターによって提供されるシンドビス非構造タ ンパク質により認識され転写されるRNA写しを産生する。シンドビス非構造タン パク質は、一次リポータ写しの中の配列を認識し、今度はセンスリ ポータ写しを合成する。この構成体はリポータ遺伝子写しの増幅から恩恵を受け ず、それでもベクター滴定を可能にするのに充分な写しを提供しなければならな い。 このタイプの滴定用カセットの構成は、以下のとおりである。pSV-β−ガラク トシダーゼベクター（Promega Corp.，Madison，WI）を酵素Hind IIIで消化させ 、上述のとおり平滑末端にする。プラスミドをさらに酵素BamHＩ及びXmnＩで上 述させて、LacZ遺伝子を除去し、残りのフラグメントのサイズを低減させる。La cZ遺伝子を含む3737nt．フラグメントを１％のアガロースゲルの中で精製し、酵 素BamHＩ及びEcoRＶで消化された消化されたpcDN3（Inuitrogen，San Diego，CA ）内に連結させる。この新しいプラスミド構成体は、pc DNAaLacZとして知られ ている。このプラスミドを、酵素ApaＩで消化させ、上述のとおり平滑末端にし 、酵素XhoＩでさらに消化させる。プラスミドpSKSINBV（前述のもの）をSacＩで 消化させ、上述のとおり平滑末端化し、その後XhoＩで消化させる。シンドビス ３’レプリカーゼ認識配列を含む、結果として得られた146ntのフラグメントを 、1.2％のアガロースゲル中で精製し、消化されたpcDNAaLacZベクター内に連結 させる。再度連結された構成体は、アンチセンスLacZ遺伝子及び３’シンドビス レプリカーゼタンパク質認識配列をCMVプロモーターから下流のところに含んで いる。結果として得られた構成体は、pcDNAaLacZ-3'Sinとして知られている。こ の構成体はBHK細胞内にトランスフェクションされ、前述の通りに利用される。 例11 免疫応答の誘発のためのHBV抗原を発現するベクター構成体の生成 Ａ．HBVE／コア配列の分離 Ｂ型肝炎の全プリコア／コアコーディング領域を含む1.8kb BamH ＩフラグメントをプラスミドpAM6(ATCC No.45020)から得、KS II+のBamHＩ部位 （Stratagene，La Jolla，CA）内に連結させる。このプラスミドは、KS II+HBpc /cと呼称される。XhoＩリンカーをKS II+HBpc/cを、KS II+HBpc/c内のプリコア ／コアのStuＩ部位（ヌクレオチド配列1704で）に付加し、ひきつづきHinc IIで 分割を行なう（ヌクレオチド配列2592で）。結果として得られた877塩基対XhoＩ −Hinc IIプリコア／コアフラグメントを、SK II+のXhoＩ／HinC II部位内でク ローニングさせる。このプラスミドはSK II+HBeと呼称される。 Ｂ．PCRを利用する配列の調製 １．PCRを利用したHBV e/コア配列の部位特異的突然変異誘発 プラスミドKS II+HBpc/c中のプリコア／コア遺伝子を配列決定して、プリコア ／コアコーディング領域が適正であるか否かを決定する。この配列は、コドン84 及び85において２つの連続する枠内TAG停止コドンという結果をもたらすコドン7 9におけるフレームシフトをひき起こす単一塩基対欠失を有することがわかって いる。この欠失は、プラスミドSK+HBe内のプリコア／コアコーディング領域のPC Rオーバーラップ（重複）拡張（Ho et al.，Gene．77：51，1989）によって補正 される。欠失を補正するべく行なわれる３回のPCR反応のためには、４つのオリ ゴヌクレオチドプライマーが使用される。 第１の反応は２つのプライマーを利用する。センスプライマー配列は、adw菌 株のヌクレオチド配列1805〜1827に対応し、５’末端に２つのXhoＩ制限部位を 含む。ヌクレオチド配列番号はGenbank(Intelligenics，Inc.，Mountain View， CA)から得られる。 5'-CTC GAG CTC GAG GCA CCA GCA CCA TGC AAC TTT TT-3' （配列番号51） 第２のプライマー配列は、Ｂ型肝炎ウイルスのadw菌株のアンチセンスヌクレ オチド配列2158〜2130に対応し、コドン79，84及び85を含む。 5'-CTA CTA GAT CCC TAG ATG CTG GAT CTT CC-3' （配列番号52） 第２の反応も同様に２つのプライマーを利用する。センスプライマーはadw菌 株のヌクレオチド配列2130〜2158に対応し、コドン79，84及び85を含む。 5'-GGA AGA TCC AGC ATC TAG GGA TCT AGT AG-3' （配列番号53） 第２のプライマーはSK+プラスミドポリリンカーからのアンチセンスヌクレオ チド配列に対応し、HBVプリコア／コアコーディング領域の停止コドンより135bp 下流にClaＩ部位を含む。 5'-GGG CGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CG-3' （配列番号54） 第３の反応は同様に２つのプライマーを利用する。センスプライマーはadw菌 株のヌクレオチド配列５〜27に対応し、５’末端に２つのXhoＩ制限部位を含む 。 5'-CTC GAG CTC GAG GCA CCA GCA CCA TGC AAC TTT TT （配列番号55） 第２のプライマー配列は、SK+プラスミドポリリンカーからのアンチセンスヌ クレオチド配列に対応し、HBVプリコア／コアコーディング領域の停止コドンよ り135bp下流にClaＩ部位を含む。 5'-GGG CGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CG-3' （配列番号56） 第１のPCR反応は、アンチセンス鎖内の欠失を補正し、第２の反応はセンス鎖 内の欠失を補正する。RCR反応１及び２は、コドン79 内で起こるCCからCCAまでの突然変異及びコドン81内のTCAからTCTまでの塩基対 置換を補正する。プライマー１は、HBVeコーディング領域のATGコドンの上流10b pのところに２つの連続的XhoＩ部位を含んでおり、プライマー４はHBVプリコア ／コアコーディング領域の停止コドンより135bp下流のところにClaＩ部位を含む 。第１及び第２のPCR反応の産物は、第３のPCR反応において拡張されて、正しい 配列をもつ１つの完全なHBVプリコア／コアコーディング領域を生成する。 以下の循環条件を用いてPCR反応が行なわれる：最初に、試料を２分間94℃で 加熱する。溶融ステップと呼ばれるこのステップは２本鎖DNAを合成のための１ 本鎖に分離する。次に試料を30秒間56℃で加熱する。アニーリングステップと呼 ばれるこのステップはプライマーが第１段階で産生された１本鎖DNAまでアニー ルできるようにする。次に試料を30秒間72℃で加熱する。拡張ステップと呼ばれ るこのステップは、第１段階で産生された１本鎖DNAの相補的鎖を合成する。第 ２の溶融ステップを30秒間94℃で行ない、その後に30秒間56℃でのアニーリング ステップを行ない、これに続いて30秒間72℃での拡張ステップを行なう。その後 、この手順を35サイクル反復し、望ましいDNA産物の増幅を結果として得る。 PCR反応産物を1.5％のアガロースゲル電気泳動によって精製し、NA45紙（Schl eichen and Schuell, Keene, New Hampshire）上へ移す。400μｌの高塩緩衝液 （1.5ＭのNaCl，20mMのトリス、pH8.0、及び0.1mMのEDTA）の中で65℃で30分間 インキュベートすることにより、望ましい787bp DNAフラグメントをNA45紙から 溶出させる。溶出の後、500μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアル コール（25：24：１）を溶液に加える。混合物を渦流に付し、次にBrinkmann Ep pendorf遠心分離器（5415Ｌ）内で５分間14000rpm で遠心分離する。望ましいDNAフラグメントを含む水相を新鮮な1.5mlのmicrofug e管に移し、100％のEtoHを1.0ml加える。この溶液を５分間ドライアイス上でイ ンキュベートし、その後10000rpmで20分間遠心分離する。上清を傾瀉させ、ペレ ットを70％のEtoH 500μｌで洗い流す。Savant Speed-Uac濃縮器の中で真空下10 000rpmでの遠心分離によりペレットを乾燥させ、次に10μｌの脱イオン水の中で 再懸濁させる。PCR産物１マイクロリットルを、1.5％のアガロースゲル電気泳動 により分析する。787 XhoＩ−ClaＩ−C1aＩプリコア／コアPCR増幅フラグメント をSK+プラスミドのXhoＩ−ClaＩ部位の中にクローニングする。このプラスミド はSK+HBe-cと呼称される。E．coli（DH5 alpha，Bethesda Research Labs．Gait kersburg，MD）をSK+HBe-cプラスミドで形質転換させ増幅させてプラスミドDNA を生成する。このプラスミドを次に、基本的にBirnboimが記述する通りに分離し 精製する（Nuc．Acid Res．７：1513，1979：分子クローニング：実験室マニュ アル、Sambrook et al．(eds.)，Cold Spring Harbor Press．1989も参照のこと ）。プリコア／コア遺伝子の配列を確認するためSK+HBe-cプラスミドを分析する （図４）。 ２．HBVコア配列の分離 プラスミドSK+HBe中の単一の塩基対を、例9Bで記述されている通りPCRオーバ ーラップ拡張によって補正する。突然変異を補正するよう行なわれるPCR反応の ため４つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。 第１の反応は２つのプライマーを利用する。センスプライマーはSK+HBeプラス ミドのＴ−７プロモーターのためのヌクレオチド配列に対応する。 5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' （配列番号57） 第２のプライマーは、adw菌株のアンチセンス配列2158〜2130に対応し、コド ン79，84及び85を含む。 5'-CTA CTA GAT CCC TAG ATG CTG GAT CTT CC-3' （配列番号58） 第２の反応は２つのプライマーを利用する。アンチセンスプライマーはSK+HBe プラスミドの中に存在するＴ−３プロモーターのためのヌクレオチド配列に対応 する。 5'-3':ATT AAC CCT CAC TAA AG （配列番号59） 第２のプライマーは、adw菌株のセンスヌクレオチド配列2130〜2158に対応し 、コドン79，84及び85を含む。 5'-GGA AGA TCC AGC ATC TAG GGA TCT AGT AG-3' （配列番号60） 第３の反応は２つのプライマーを利用する。アンチセンスプライマーは、SK+H Beプラスミドの中に存在するＴ−３プロモーターのためのヌクレオチド配列に対 応する。 5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3' （配列番号61） 第２のプライマーはSK+HBeプラスミド内に存在するＴ−７プロモーターのセン ス配列に対応する。 5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' （配列番号62） 第３の反応からのPCR産物は、HBVプリコア／コアコーディング領域についての 正しい配列を生成する。 HBVコアコーディング領域を分離するため、コアコーディング領域のATG開始コ ドンの上流にXhoＩ制限部位を導入しHBVプリコー ディング領域の29アミノ酸リーダー配列を削除するようにプライマーを設計する 。第４の反応では、第３の反応からのPCR産物及び以下の２つのプライマーを用 いてHBVコアコーディング領域を産生する。 センスプライマーは、adw菌株のヌクレオチド配列1885〜1905に対応し、５’ 末端に２つのXhoＩ部位を含む。 5'-CCT CGA GCT CGA GCT TGG GTG GCT TTG GGG CAT G-3' （配列番号63） 第２のプライマーは、SK+HBeプラスミド内に存在するＴ−３プロモーターのた めのアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。第４のPCR反応からの約600bpの PCR産物は５’末端にHBVコアコーディング領域及び新規のXhoＩ制限部位を、又S K+HBeプラスミドのマルチクローニング部位の中に存在した３’末端においてCla Ｉ制限部位を、含んでいる。 5'-ATT ACC CCT CAC TAA AG-3' （配列番号64） 第４のPCR反応の後、溶液を新鮮な1.5mlのmicrofuge管の中に移す。この溶液 に３Ｍの酢酸ナトリウムを50マイクロリットル付加し、その後500μｌのクロロ ホルム：イソアミルアルコール（24：１）を加える。混合物を渦流に付し、次に ５分間14000rpmで遠心分離する。新鮮なmicrofuge管に水相を移し、1.0mlの100 ％EtoHを付加する。この溶液を4.5時間−20℃でインキュベートし、その後20分 間10000rpmで遠心分離する。上清を傾瀉し、ペレットを500μｌの70％EtoHで洗 い流す。真空下で10,000rpmで遠心分離によりペレットを乾燥させ、次に10μｌ の脱イオン水の中で再度懸濁させる。PCR産物を１マイクロリットル、1.5％のア ガロースゲル電気泳動法により分析する。 ３．HBV Ｘ抗原の分離 Ｂ型肝炎ウイルスＸ読取り枠を含む642bpのNCOＩ−TaqＩフラグメントを、pAM 6プラスミド（adw）（ATCC 45020）から得、クレノウフラグメントにより平滑末 端にし、SK+のHinc II部位の中に連結させる（Stratagene，La Jolla，Califarn ia）。 連結反応を用いてE．coli（DH5 alpha，Bethesda Research Laboreteries，Ga itherburg，MD）を形質転換させ、増殖させる。次に、基本的にBirnboim et al によって記述されている通りに（Nuc．Acid Res．７：15134，1979；分子クロー ニング：実験室マニュアル、Sambrook et al．（eds.）Cold Spring Harbor Pre ss，1989）ミニプレップDNAを分離し精製する。 このフラグメントはいずれの配向ででも挿入できることから、SK+マルチクロ ーニング部位の中のXhoＩ及びClaＩ部位に関してセンス配向を有するクローンが 選択される。より特定的に言うと、ミニプレップDNAを診断用制限酵素BamHＩで 消化させる。正しい配向でのインサートは、サイズが3.0kb及び0.6kbの２つのフ ラグメントを生み出す。正しくない配向でのインサートは、3.6kb及び0.74kbの ２つのフラグメントを生み出す。正しい配向でのクローンが選択され、SK−XAg と呼称される。 ４．HBVe-c，HBVコア及びHBV Xを発現するシンドビスベクターの構築 HBVe-c配列を発現するシンドビスベクターの構築は、HBVe-c配列をコードする cDNAフラグメントを放出するべくXhoＩ及びClaＩの制限酵素部位でSK+HBe-cプラ スミドを消化することによって達成される。このときフラグメントは、アガロー スゲル電気泳動によって分離され、Gene CleanTM（BIO 101，San Diego，CA）で 精製され、XhoＩ及びClaＩでの消化によって調製されCIAPで処理された望 ましいシンドビスベクターバックボーンの中に挿入される。例２で記述したシン ドビスベクターは、HBV抗原配列の挿入に適している。このようなシンドビスベ クターには、pKSSINBV，pKSSINdlJRsjrc，pKSSINdlJRsjrPC，pKSSINdlJRsjrNR(7 582-7601)及びpKSSINdlJRsexjrが含まれる。 HBVコア配列を発現するシンドビスベクターの構築は、上述のPCR産物のGene C leanTM処理により達成される。このとき、増幅された産物は、XhoＩ及びClaＩ制 限酵素部位で消化され、アガロースゲル電気泳動で分離され、Gene CleanTMで精 製され、XhoＩ及びClaＩ酵素で予め処理された上述のものと同じシンドビスベク ターの中に連結される。 〔HBV-X抗原配列を発現するシンドビスベクターの構築は、HBV-X配列をコードす るcDNAフラグメントを放出するべくXhoＩ及びClaＩ制限部位でプラスミドSK−XA gを消化することによって達成される。フラグメントは、アガロースゲル電気泳 動により分離され、Gene CleanTMを用いて精製され、XhoＩ及びClaＩ酵素で予備 処理された前述の望ましいシンドビスベクターバックボーン内に挿入される。 上述のシンドビスのHBV発現ベクターは同様に、ベクターに感染した細胞の実 験又は処理の必要条件に応じて、選択可能な薬物耐性標識を同時発見するように 修正することもできる。上述のシンドビスHBV発現ベクターのいずれも、G418耐 性について同時発現するように設計することもできる。これは、ベクターの多重 クローニング部位を用いてベクターの終端３’末端から５’のところ及びHBVコ ーディング配列から３’のところに置かれた細菌ネオマイシンホスフォトランス フェラーゼ遺伝子が後につづく内部リボザイム侵入部位（例５）を取り込むこと によって達成される。これらのG418耐性 ベクター構成体は以下の節でHBV特異的CTL標的の生成のためにベクター感染した 細胞を選択するために使用することができる〕。 Ｄ．シンドビスベクターに感染した細胞の発現 １．ELISA 1.0×107個の培養細胞をPBSで洗浄し、PBS中で合計600μｌの量まで細胞を再 懸濁させ、Branson音波処理機350型（Fisher，Pittsburgh，PA）内で30の設定値 で２回５秒間音波処理するか又は３回凍結融解させることによって、HBV発現ベ クターのいずれかによる感染を受けた細胞からの細胞リゼイトを作る。５分間10 000rpmで遠心分離によりリゼイトを清澄させる。 細胞リゼイト中のコア抗原及びプリコア抗原及び培養上清中の分泌されたｅ抗 原を、Abott HBe，rDNA EIAキット（Abbott Laboratsuis Diagnostic Division ，Chicago，IL）を用いて検定する。細胞リゼイト中のプリコア抗原及び培養上 清中の分泌されたｅ抗原のためのもう１回の感受性EIA検定を、Incstar ETI-EB キット（Instar Corporation，Stillwater，MN）を用いて行なう。Biogen（Gene va、スイス）から得たｅ抗原及び組換え型Ｂ型肝炎コアの希釈物から標準曲線を 生成する。 これらの手順を用いて、トランスダクションを受けた細胞系統の中で約10ng／ mlのｅ抗原が発現される。 ２．免疫沈降法／ウエスタンブロット法 ベクター感染細胞により発現されたプリコア／コア及びｅ抗原の特徴づけは、 免疫沈降法とそれに続くウエスタンブロット法によって行なわれる。特定的に言 うと、PBS又は培養上清中の0.5〜1.0mlの細胞リゼイトを、Ｇ−セファロース（P harmacia LKB，Uppsala、スウェーデン）に結合されたポリクローナルウサギ抗 Ｂ型肝炎コア抗原（DAKO Corporatirs，Carpinteria，Calfornia）と混合し、 ４℃で一晩インキュベートする。20mMのトリス−HCl，pH8.0，100mMのNaCl，10m MのEDTAの中で２度洗浄し、0.5％のβ２−メルカプトエタノールを含む試料投入 緩衝液中で煮沸する。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってタンパク 質をまず分解し、その後Immolilon（Millipore Corp.，Bedford，ME）へと移し 、DAKOポリクローナルウサギ抗肝炎コア抗原とそれに続く125Ｉ−プロテインＡ で精査する。 Ｅ．免疫応答の試験 １．細胞障害性検定 （ａ）近交系マウス 照射された（室温で10000ラド）１×107個のシンドビスベクターの感染を受け たＬ−Ｍ（TK-）細胞（ATCC CLL I.3）を１週間の間隔で２回、生後６週間〜８ 週間の雌のBalb/C，C57B1/6及びC3Hマウス(Harlan Sprague Dawley，Indianapol is，IN)に腹腔内（ip）注射する。７日後に動物を安楽死させ、脾細胞（３×106 /ml）をＴ−25フラスコ（Corning，Corning，NY）の中でそのそれぞれの照射さ れたシンドビスベクター感染細胞（６×104/ml）と共にインビトロで培養する。 培地は、RPMI1640，５％の熱不活性化ウシ胎児血清、１mMのピルビン酸ナトリウ ム、50μｇ／mlのゲンタマイシン及び10-5Ｍのβ２−メルカプトエタノール（Si gma，St．Louis，MO）から成る。４〜７日後にエフェクタ細胞を収穫し、標準的 クロム放出検定において96ウェルのマイクロタイタープレート（Corning，Corni ng，NY）の中でさまざまなエフェクタ：標的細胞比を用いて試験する。標的は、 ベクター感染した及びベクター感染していないＬ−Ｍ（TK-）細胞であり、一方 トランスダクションを受けていない細胞系統が負の対照として使用される。特定 的に言うと、200μｌの最終体積内でさまざまなエフェクタ対標的細胞比で、Na2 51 CrO4 で標識付けされた（Amersham，Arlington Heights，IL）（100uCi，37℃で１時 間）標的細胞（１×104細胞／ウェル）をエフェクタ細胞と混合する。インキュ ベーションの後、100μｌの培地を除去し、Beckmanガンマ分光計(Beckman，Dall as，TX)の中で分析する。標的と培地からのCPMとして自然的放出（SR）を決定し 、標的と１ＭのHClからのCPMとして最大放出（MR）を決定する。標的細胞溶解百 分率を、〔（エフェクター細胞＋標的CPM）−（SR）／（MR）−（SR）〕×100と して計算する。標的の自然放出値は、標準的にはMRの10％〜20％である。 いくつかのCTL検定のためには、エフェクターは、例えば一次インビトロ刺激 の後８〜12日目といったように何回もインビトロ刺激を受けることができる。よ り特定的に言うと、照射された（10000ラド）６×105個の刺激体細胞と、照射さ れた（3000ラド）の２×107個の「フィラー」細胞（以下で記述する通りに調製 したもの）と107のエフェクタ細胞を、10mlの「完全」RPMI培地の中で混合する 。（RPMIは以下のものを含む：５％の熱不活性化ウシ胎児血清。２mMのＬ−グル タミン、１mMのピルビン酸ナトリウム、1X可欠アミノ酸、及び５×105Ｍのβ２ −メルカプトエタノール）。エフェクター細胞のインビトロ刺激のための刺激体 細胞を、G418耐性と同時発現するシンドビスHBVベクターを用いてＬ−Ｍ（TK-） 細胞を感染させることで生成する。２週間G418を800μｇ／ml用いて標識選択の ため、ベクター感染細胞を選択する。G418耐性細胞を次に10000ラドで照射し、 次に記述したとおりエフェクタ細胞を再度刺激するためにこれを用いる。室温で 3000ラドで照射を受け、RPNI内で再懸濁させた、特定の投薬を受けたことのない 同系のマウス脾細胞から「フィラー」細胞を調製する。脾細胞をRPMIで洗浄し、 ５分間室温で3000rpmで遠心分離し、ペレットをRPMI内で再懸濁する。再懸 濁した細胞を３〜５分間37℃で1.0mlのトリス−塩化アンモニウム（100mlの0.17 Ｍのトリスベース、pH7.65、と900mlの0.155ＭのNH4Cl；最終溶液のpHは7.2に調 整する）で処理する。その後二次インビトロ再刺激物を、CTL検定における試験 の前に５〜７日間培養する。２〜10Ｕの組換え型ヒトIL−２（200Ｕ／ml、カタ ログ＃799068，Boehringer Mannheim、西ドイツ）を付加しながら、前述のとお り、その後の全ての再刺激物を培養する。 これらの手順を用いて、CTL−HBVe抗原の誘発が可能であることを示すことが できる。 （ｂ）HLA A2.1トランスジェニックマウス 照射され（室温で10000ラド）、ベクタートランスダクションを受けた1.0×107 のEL4 A2/K6細胞（ATCC No.TIB-39）を１週間の間隔をおいて、生後６〜８週間 の雌のHLA A2.1トランスジェニックマウス（V．Engelhard，Charlottes ville， VA）に２回腹腔内（i.p.）投与する。７日後に動物を安楽死させ、脾細胞（３× 106/ml）を、フラスコ（Ｔ−25，Corning，Corning．NY）内で、照射済み（1000 0ラド）でトランスダクションを受けたJurkat A2/K6細胞又はペプチドコーディ ングされたJurkat A2/K6細胞（６×104/ml）と共にインビトロで培養する。クロ ム放出検定の残りの部分は、標的がトランスダクションを受けた及び受けていな いEL4 A2/K6及びJurkat A2/K6細胞である例9E 1.a．の中で記述されている通り に行なわれる。トランスダクションを受けていない細胞系統が、負の対照として 利用される。 標的は同様に、ペプチドコーディングを受けたEL4 A2/K6細胞であってもよい 。 （ｃ）ベクター構成体でのヒトの細胞のトランスダクション B95-８，EBV形質転換マルモセット白血球(ATCC CRL 1612)の３ 週間培養の上清から取った新鮮なエプスタイン−バールウイルス(EBV)でそのＢ 細胞を感染（形質転換）させることにより、各患者についてリンパ芽球様細胞系 統(LCL)を樹立する。EBV形質転換から３週間後に、HBVコア又はｅ抗原及びG418 耐性を発現するシンドビスベクターでLCLを感染させる。4.0mlの培地を含む６cm のプレート中で1.0×106個の照射済み（10000ラド）シンドビスベクター生産者 細胞と1.0×106のLCL細胞を同時培養すること又はfectiousベクター上清を付加 することによって、LCLのベクター感染を達成する。培地は、RPMI1640，20％の 熱不活性化ウシ胎児血清（Hyclone，Logan，UT）、5.0mMのピルビン酸ナトリウ ム及び0.5mMの可欠アミノ酸から成る。37℃及び５％のCO2での一晩の同時培養後 、LCL懸濁細胞を、照射済み（10000ラド）シンドビスベクター生産者細胞から除 去する。感染したLCL細胞を、800μｇ／mlのG418を付加することによって選択す る。基本的にLCL細胞の感染について記述した通りに、Jurkat A2/K6細胞(L．She rman，Scripps Insttute，San Diego，CA)を感染させる。 （ｄ）ヒトCTL検定 フィコール比重差遠心分離(Sigma，St．Louis，MO)により、ヒトPBMCを分離す る。特定的に言うと、５分間室温で3000rpmで細胞を遠心分離させる。PBMCをイ ンビトロでその自己トランスダクションを受けたLCL(例9E, 1.c.）を用いて10日 間、10：１のエフェクター：標的比で再刺激させる。培地は、５％の熱不活性化 されたウシ胎児血清、１mMのピルビン酸ナトリウム及び50μｇ／mlのゲンタマイ シンの予備スクリーニングされたロットを伴うRPMI1640から成る。結果として得 られた刺激を受けたCTLエフェクターを、標準クロム放出検定（例9E, 1.a.）内 で標的として感染した自己由来のLCL又はHLA整合細胞を用いて、CTL活性につい て試験する。大部分の 患者はEBVに対する免疫を有することから、負の対照として使用されるトランス ダクションを受けていないEBV形質転換されたＢ細胞（LCL）も同様に、トランス ダクションを受けたLCLと共にEBV特異的CTLにより標的として認識されることに なる。EBV特異的CTLによる標識付けされた標的細胞の死滅による高いバックグラ ンドを低減させるため、50：１の比で、標識付けされた標的細胞に対して標識付 けされておらずトランスダクションを受けていないLCLを付加することが必要で ある。 ２．体液性免疫応答の検出 HBVコア及びｅ抗原に特異的なマウス内の体液性免疫応答をELISAにより検出す る。ELISAプロトコルは、96ウェルのプレートをコーディングするため、100μｇ ／ウェルの組換え型HBVコア及び組換え型HBV ｅ抗原（Biogen，Geneva、スイス ）を利用する。次に、HBVコア又はHBV ｅ抗原を発現する細胞又は直接ベクター で免疫化されたマウスからの血清を、抗原コーディングされたウェル内にて段階 希釈し、室温で１〜２時間インキュベートする。インキュベーションの後、同等 の力価をもつウサギ抗マウスIgG1，IgG2a，IgG2b及びIgG3の混合物をウェルに付 加する。各々のウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ（「HRP」）−接 合されたヤギ抗ウサギ抗血清を付加し、試料を室温で１〜２時間インキュベート する。インキュベーションの後、適切な基質を付加することにより反応性を視覚 化する。HBVコア又はHBV ｅ抗原に特異的なIgG抗体を含むウェルの中で、発色が 見られる。 ３．Ｔ細胞増殖 HBVコア又はｅ抗原を発現する直接ベクター調製物の２回又は３回の注入の結 果得られる抗原誘発されたＴヘルパー活性をインビトロで測定する。 特定的に言うと、免疫化されたマウスからの脾細胞を、負の対照としてHBVコ ア又はｅ抗原を発現しない細胞を又はHBVコア又はｅ抗原を発現する細胞を用い て、予め定められた比率でインビトロで再刺激する。５％のFBS，1.0mMのピルビ ン酸ナトリウム及び10-5のβ２−メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地中の ５％のCO2及び37℃で５日間経過した後、上清をIL−２活性について試験する。H BVコア又はｅ抗原により刺激されたＴヘルパー細胞によって特異的にIL−２が分 泌され、CTLクローン、CTLL−２（ATCC TIB 214）を用いてその活性を測定する 。簡単に言うと、CTLL−２クローンは成長に関しIL−２に依存しており、IL−２ が無い場合増殖しない。96−ウェルのプレート内で上清試料の段階希釈物に対し てCTLL−２細胞を付加し、３日間37℃で５％のCO2にてインキュベートする。そ の後、CTLL−２細胞に0.5μのCi3H−チミジンを付加する。CTLL−２細胞が増殖 する場合にのみ、0.5μのCi3H−チミジンを取り込む。一晩インキュベートした 後、細胞をPHD細胞収穫装置（Cambridge Teehnology Inc., Watertown, MA）を 用いて収穫し、Beckmanベーター計数器で計数する。試料中のIL−２の量を、Boe hringer Mannhim（Indianapslis，IN）から得た組換え型IL−２標準から生成さ れた標準曲線から決定する。 Ｆ．投与プロトコル １．マウス （ａ）直接ベクター投与 HBVコア又はｅ抗原をコードするベクターの直接投与による体液体及び細胞媒 介型の免疫応答の誘発を評価するのに、マウス系を用いることも可能である。簡 単に言うと、（無菌の脱イオン精製水で）再構成された凍結乾燥されたHBVコア 又はHBVeを発現するシンドビスベクター0.1mlを、生後６〜８週間の雌のBalb/c C57B16又は C3Hマウスに筋肉（i.m.）注射する。１週間離して２回の注射を行なう。２回目 の注射から７日後に、動物を安楽死させる。その後、基本的に例9E 1aに記述さ れている通りにクロム放出CTL検定を行なう。 ２．チンパンジー投与プロトコル Ｂ型肝炎ウイルスに慢性的に感染したチンパンジーの体内にベクターを投与す るプロトコルを決定するために、上述のマウス系で生成されたデータを使用する 。マウス体内でのHBV特異的CTLの誘発に基づいて、チンパンジー試験の被験動物 は、２つの連続的に上昇する用量のグループで与えられる28日間隔でのコア又は ｅ抗原をコードするベクターの３回の用量を受けることになる。対照被験動物は 、HBV-IT(V)融合媒質から成るプラシーボを受ける。用量は、注射日毎に0.5ml× ４回の筋肉注射で与えられる106又は107のいずれかのHBV-IT(V)cfuである。血清 アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)レベル、Ｂ型肝炎ｅ抗原の存在、Ｂ型 肝炎ｅ抗原に対して導かれた抗体の存在を測定し治療の安定性及び許容度を評価 するため、４日目、12日目、24日目、36日目、52日目、70日目及び84日目及び６ ヵ月目、12ヵ月目、18ヵ月目、24ヵ月目、30ヵ月目及び36ヵ月目に血液試料を採 取する。Abbott HBe rDNA EIAキット（Abbott Laboratories Diagnestic Diuisi on、シカゴ、IL）により、Ｂ型肝炎ｅ抗原及びHBｅ抗原に対する抗体を検出する 。Ｂ型肝炎コア又はｅ抗原に対するCTLの誘発の効率を、例9E 1cにある通りに決 定することができる。 チンパンジー研究からの安定性及び効力の結果に基づいて、人体試験における 患者に対するベクター投与のために、用量及び接種スケジュールを決定する。こ れらの患者は、血清ALTレベル、HBV ｅ抗原の存在及びHBV ｅ抗原に対して導か れた抗体の存在について、 基本的に前述のとおりに監視される。Ｂ型肝炎コア又はｅ抗原に対するヒトCTL の誘発は、例9E 1.Cにあるとおりに決定される。 例12 免疫応答の誘発又はウイルス宿主細胞相互作用の遮断のためのウイルスタンパク 質を発現するシンドビスベクター 以下の例は、HIVウイルス抗原を発現することにより免疫応答を生成すること のできるシンドビスベクターを構築するための手順を記述するものである。免疫 応答の誘発及び発現を試験する方法も同様に示されている。免疫応答を惹起するために用いられるシンドビスベクター Ａ．HIV IIIB ENN発現ベクター HIVプロウイルスクローンBH10-R3(配列につては、Ratner et al.，Nature 313 ：277，1985参照)から2.7kbのKpn-Ｉ-XhoＩ DNAフラグメントを分離し、III exE 7diltaenv（nt．5496に対するBal31欠失）からの〜400bp SalＩ−KpnＩ DNAフ ラグメントを、プラスミドSK+中のSalＩ部位の中に連結された。このクローンか ら、3.1kbのenv DNAフラグメント（XhoＩ−ClaＩ）を精製し、前述したXhoＩ及 びClaＩで予備消化されたシンドビスベクターの中に連結させた。 Ｂ．HIV特異的抗原を発現する生産者細胞系統の作成 上述のベクターから誘導されたHIV IIIB envを発現するベクター産生細胞系統 を構築するために、シンドビスパッケージング細胞系統の中でインキュベート転 写されたRNA写しをトランスフェクションする（例７）。特定的に言うと、HIV特 異的配列をコードするcDNAシンドビスベクタークローンから転写するのに用いら れるSP6インキュベート転写RNAポリメラーゼ系を用いて、シンドビスRNAベクタ ー分子を最初に産生する。その後、生成されたインビトロRNA ベクター産物を、24時間以内で過渡的感染性ベクター粒子の産生を導くシンドビ スパッケージング又はホッピング細胞系統の中にトランスフェクションする。こ のとき、これらのベクター粒子を細胞系統培養の上清から収集し、次に0.45ミク ロンのフィルタを通してろ過して細胞汚染を防ぐ。その後ろ過した上清を用いて シンドビスパッケージング細胞の新鮮な単層を感染させる。感染から24時間以内 に、シンドビス非構造タンパク質及びHIV特異的配列をコードするポジティブ鎖 のシンドビス組換え型RNAを含むシンドビスベクター粒子が産生される。 シンドビスHIV IIIB envベクターの代替的形態は、選択可能な標識を含むプロ モーター駆動のcDNAシンドビス構成体である。この形態では、特異的HIV IIIB e nv配列を含む上述のXhoＩ−ClaＩフラグメントは、バクテリオファージポリメラ ーゼ認識配列に代わって、構成体プロモーターにより駆動される類似のcDNAシン ドビスベクターの中に置かれる。この形態を使用すると、発現ベクタープラスミ ドはパッケージング細胞系統内へトランスフェクションされ、トランスフェクシ ョンから24〜48時間後に薬物耐性遺伝子について選択される。このとき、（使用 される選択標識に応じて）14日後に耐性コロニーをプールし、希釈クローニング する。次に、いくつかの希釈クローンを増殖させ、最高のベクター力価について 検定する。その後最高の力価のクローンを膨張させ、凍結乾燥する。保存したク ローンを、HIV特異的タンパク質の産生及び免疫応答の誘発について試験する。 Ｃ．HIV特異的タンパク質の産生及び免疫応答についての試験 ウエスタンブロット分析により、HIV特異的タンパク質の産生について、シン ドビスHIV産生者細胞系統からの細胞リゼイトを試験する。インビトロで発現を トランスファするベクターの能力を試験 するためには、ウイルスベクターを含むろ過された上清でBHK-21細胞を感染させ 、感染から24時間後にウエスタンブロット分析法により検定する。タンパク質発 現がひとたび確認されたならば、ベクター処理後の外来性抗原を発現する同系の 細胞がもつ、（ａ）感染した同系細胞又は感染性ベクターの調製物のいずれかを 注入することによりマウス体内でCTL応答を惹起する能力；（ｂ）ヒトインビト ロ培養系内でCTL応答を惹起する能力及び（ｃ）一次細胞を含めヒト、チンパン ジー及びマカク細胞を感染させ、かくしてこれらをCTL応答の惹起に利用できる ようにしかつCTL検定において標的とし役立ちうるようにすることができる能力 、そして（ｄ）免疫応答エピトープをマッピングする能力、そして（ｅ）マウス CMV(MCMV)といったようなその他の非HIV抗原に対するCTL応答を惹起し測定する 能力、を実証するため、インビボでのマウス及び霊長類の研究を行なうことがで きる。 １．シンドビスウイルスベクターでコードされる抗原に対する免疫応答 シンドビスHIV IIIB envベクターでのトランスダクションを受けた細胞系統か ら惹起された免疫応答を試験するため、HIV IIIBベクターを支持する組換え型シ ンドビスウイルスで、マウス腫瘍細胞系統（B/C 10ME）（Ｈ−２d）(Patek et a l.，Cell Immunol．72：113，1982)を感染させる。その後、同系（すなわちMHC が同一の）Balb/c（Ｈ−２d）マウスの体内でHIV env特異的CTLを刺激するべく 、HIV env発現細胞系統(B/C 10ME−IIIB)を利用した。B/C 10ME−IIIB細胞（１ ×107細胞）を腹腔内注射してマウスを免疫化し、７〜14日目に追加免疫する（ 追加免疫が必要とされない場合もある）。これらの免疫化されたマウスから応答 体脾細胞懸濁液を調製し１：50という刺激体：応答体細胞比にて、B/C 10ME−II IB(B Cen v)又はB/C 10ME（BC）のいずれかのマイトマイシン処理済み細胞の存在下で、４ 日間インビボで細胞を培養する。これらの培養からエフェクター細胞を収穫し、 計数し、標準的な４〜５時間の51Cr−放出検定においてさまざまなエフェクター ：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で放射性標識付け（51Cr）された標的細胞（すなわちB/ C 10ME env-29又はB/C 10ME）と混合させる。インキュベーションの後、マイク ロタイタープレートを遠心分離し、100μｌの培養上清を除去し、Beckmanガンマ 分光計で溶解した細胞から放出された放射性標識の量を数量化する。標的細胞溶 解は以下のとおり計算された：標的細胞溶解％＝ExpCPM-SP CPM/MP CPM-SR CPM ×100。なお式中、分あたりの実験的計数(Exp CPM)はエフェクタープラス標的を 表わし、自然放出（SR）CPMは標的単独を表わし、最大放出（MR）CPMは１ＭのHC lの存在下での標的を表わす。 ２．組換え型シンドビスベクターの直接注入によるマウス体内免疫応答の刺激 マウス体内の直接注入の後のHIV外被タンパク質の発現を誘発する組換え型シ ンドビスウイルスベクターの能力を評価するために、実験を行なう。HIV IIIB e nvベクター構成体を支持する約104〜105（pfu）の組換え型シンドビスウイルス を、腹腔内（i.p.）又は筋肉（i.m.）経路のいずれかで３週間間隔で２回注射す る。このシンドビスウイルスの量は、免疫応答を刺激するものとみなされている 量よりも低くなるように決定される。２回目のベクター注射から約７〜14日後に CTL用に脾細胞を前処理する。 Ｄ．組換え型シンドビスベクターから発現されたウイルスタンパク質類似体から 誘導された遮断薬 数多くの感染性疾患、ガン、自己免疫疾患及びその他の疾病には、細胞とウイ ルス粒子、細胞と細胞、又は細胞と因子の相互作用が 関与している。ウイルス感染においては、ウイルスは一般に感受性細胞の表面上 のレセプタを介して細胞内に入る。ガンでは、細胞はその他の細胞又は因子から のシグナルに対し不適切にしか又は全く応答できない。自己免疫疾患の場合、「 自己」標識の不適切な認識が存在する。これらの相互作用は、インビボで１つの 相互作用の中のいずれかのパートナーに対する類似体を産生することによって、 遮断されうる。 この遮断作用は、細胞内、細胞膜上又は細胞外で起こり得る。遮断薬のための 遺伝子を支持するウイルスの又は特にシンドビスのベクターの遮断作用は、感受 性細胞の内側から又は病原性相互作用を局所的な遮断するべく遮断タンパク質の 一変形態様を分泌することによって媒介されうる。 HIVの場合、相互作用の２つの作用物質は、gp 120/gp 41外被タンパク質及びC D4レセプタ分子である。かくして、適切な遮断物は、病原性効果をひき起こすこ となくHIVの侵入を遮断するHIV env類似体か又はCD4レセプタ類似体のいずれか を発現するベクター構成体となる。CD4類似体は、隣接する細胞を防御するよう に分泌され機能するが、一方gp 120/gp 41はベクター含有細胞のみを防御するよ う細胞内でのみ分泌又は産生される。安定性又は補体溶解を増強するためには、 ヒト免疫グロブリン重鎖又はその他の構成要素をCD4に付加することが有利であ るかもしれない。このようなハイブリッド−可溶性CD4をコードするレトロウイ ルスベクターの宿主への送り出しは、安定したハイブリッド分子の連続的供給と いう結果をもたらす。 HIV env類似体の発現を導くベクター粒子も同様に、上述のとおりに構築する ことができる。どの部分が、明白な病原性の副作用なくウイルス吸着を遮断する ことができるかは、当業者にとって明ら かなことである(Willy et al.，J．Virol．62：139，1988：Fishen et al.，Sci ence 233：655，1986)。 例13 全身的タンパク質産生のための組換え型シンドビスベクターを用いる置換遺伝子 療法・ゴーシェ病のための治療法 Ａ．グルコセレブロシダーゼシンドビスベクターの作製 cDNAコーディング配列の５’にXhoＩ制限酵素部位を、又cDNAコーディング配 列の３’にClaＩ制限酵素部位を含むグルコセレブロシダーゼ（GC）cDNAクロー ンをまず最初に生成する。このクローンは、NcoＩでpMFG-GC(Ohashi et al.，PN AS 89：11332，1992)を消化することによって生成させ、Vent DNAポリメラーゼ （New England Biolabs，Beverly，MA）で平滑末端化し、次にXhoＩリンカーに 連結させることのできるものである。その後、このプラスミドはBamHＩで消化さ れ、Vent DNAポリメラーゼで平滑末端化され、その後ClaＩリンカーに対し連結 される。その後、フラグメントをXhoＩ及びClaＩで消化させ、望ましいシンドビ スベクターのXhoＩ−ClaＩ部位の中に連結させる。 Ｂ．シンドビスGCベクター産生細胞系統の構築 使用されたシンドビスcDNAベクタークローンに応じて、生産者細胞系統を作り 出すため２つのアプローチが提示される。１つのタイプのシンドビスベクターは 、複製応答能あるインビトロRNA写しの産生のためにSP6 NAポリメラーゼ認識配 列を使用する。このタイプのベクターは、パッケージング細胞系統内で持続的に 複製することになる非組込みベクターに基づいてベクター生産者細胞系統を作り 出すのに使用される。第２のタイプのベクターは、パッケージング細胞系統内で 安定した組込みができるようになっているプラスミド構成体の中の非相同プロモ ーター（例７）を使用する。このとき、 複製応答能あるベクター写しが、トランスフェクションを受けたパッケージング 細胞系統内に転写される。 シンドビスGCウイルスベクターがSP6 RAN認識配列を使用する場合、まず最初 に、市販のインビトロ転写系のいずれかを用いて（MegascriptTM転写キット：Am bion Inc.，Austin，TX）cDNAをインビトロで転写させ、その後シンドビスパッ ケージング細胞系統へのリポソーム又はリン酸カルシウム沈降による全長RNA写 しのトランスフェクションを行なわなくてはならない。前述のとおり、次に、そ の後ウイルスベクター供給源として役立つシンドビスパッケージング細胞の新鮮 な単層を再度感染させるために、トランスフェクションを受けたパッケージング 細胞系統からの感染性ベクター粒子を含むろ過済み上清を使用する。10cmの皿の 中で５×106個の細胞を感染させるのに約10mlの感染性上清を使用しなくてはな らない。 シンドビスGCウイルスベクターが、選択可能な標識（ネオマイシン耐性遺伝子 ）を伴う発現プラスミド形態の中で非相同プロモーターを使用する場合、cDNAベ クターを、パッケージング細胞系統内にトランスフェクションして、その後薬物 耐性選択を行なわなくてはならない。このとき耐性あるコロニーをプールし希釈 クローニングする。次に個々のクローンを増幅させ、凍結させる。クローンを高 力価、ウェスタンブロット分析法によるGCの発現及びタンパク質の機能的活性に ついて、個別にスクリーニングする。 選択可能な標識をもたないベクターについては、安定した形で又は持続的にト ランスフェクションを受けたクローンの選択は、シンドビスベクターで細胞をト ランスフェクションしてから１日〜２日後に、DAトランスダクションを受けた細 胞を希釈クローニングすることによって行なわれなくてはならない。このとき、 伝令RNAの逆転写を用いることによって希釈クローンをGCの存在についてスクリ ーニングし、その後ポリメラーゼ連鎖反応技術によりcDNAメッセージの増幅を行 なう。この手順はRT−PCR技術として知られ、Invitrogen Corp.(San Diego，CA) からこの検定を行なうための市販キットが入手できる。RT−PCRは、少なくとも1 0日間増幅させたクローンについて行なわれる。安定して持続的に感染を受けた クローンの適正な数を見い出すため、約50〜100のクローンがスクリーニングさ れる。RT−PCRを行なうため、望まれるメッセージがRNA産物の増幅によってスク リーニングされるように特定のプライマーが必要とされる。GCスクリーニングの ために521塩基対産物を増幅するよう設計されたプライマーは以下のようなもの である： GCスクリーニングのためのプライマー： GC PCRプライマー#1:5'-TTT CTG GCT CCA GCC AAA GCC ACC CTA GGG GAG-3'（配列番号69） GC PCRプライマー #2:5'-AAT GGA GTA GCC AGG TGA GAT TGT CTC CAG GAA-3'（配列番号70） 次に最高の発現及び力価を示すクローンをBHK-２細胞上への発現のトランスフ ァについて試験し、その後GC活性についてウェスタンブロット分析法及び機能的 検定を行なう。ウェスタンブロット分析法のためには、タンパク質の存在を決定 するのにヒトGCに対する特異的モノクローナル抗体(8E4)が使用される（Ohashi et al.，PNAS 89：11332，1992：Barneveld et al．Eur．J．Biochem．134：310 ，1983）。Corell et al（Blood 80：331，1992）により記述されている通りGC 酵素活性を試験する。適当なクローンがひとたび同定されると、動物による研究 を実施する。 例14 組換え型シンドビス粒子の投与 半ビボプロトコルで自己由来のCD34+細胞をトランスダクション するか又は患者の骨髄にベクターを直接注入することにより、ゴーシェ病の治療 のために使用された（例13）治療用シンドビスベクターを投与することができる 。組換え型多価ベクターからのGCの最長の治療的発現を達成するため、最良の投 与様式は、例えば単球又はマクロファージといった臨床的に作動させられた細胞 タイプの長命細胞前駆物質をトランスダクションすることにある。作動させられ た細胞タイプの最も早期の前駆物質をトランスダクションすることにより、細胞 前駆物質は、自己更新し、成熟GC陽性細胞で抹消血を再増殖させることができる 。今日までに研究されてきた最も早期の多能性造血基幹細胞は、健康な骨髄集団 の１％〜４％又は抹消血集団の0.1％を構成するCD34+細胞である。CD34+細胞を トランスダクションできるということは、単球／マクロファージ系列についての みならず治療用タンパク質にターゲティングされているあらゆる造血細胞にとっ て長期にわたる発現を支持する上で重要である。CD34+細胞をトランスダクショ ンするための２つのアプローチとして、半ビボ及びインビボプロトコルがある。 インビボプロトコルは、患者の骨髄の中にベクターを直接注射することにより骨 髄細胞の無差別集団をトランスダクションすることに焦点をあてている。半ビボ プロトコルは、患者の骨髄又は乳児患者のさい帯血からCD34+陽性基幹細胞を分 離すること、ベクターで細胞をトランスダクションすることそしてその後自己由 来細胞を患者に注射し戻すことに焦点をあてている。両方のアプローチ共実施可 能であるが、半ビボプロトコルは、CD34+細胞の特定の培養された集団をトラン スダクションすることによりベクターを最も効率良く使用できるようにする。半 ビボ方法の詳細を以下の節で記す。 多価GCシンドビスベクターの半ビボ投与 技術に習熟した医師によって行なわれた注射器吸引により、患者 の骨髄からCD34+細胞を収集する。代替的には、患者が生まれる前に診断を受け た場合には乳児のさい帯血からCD34+細胞を得ることもできる。一般には骨髄がC D34+細胞の供給源である場合、局部又は全身麻酔下で後腸骨稜から又は大髄骨幹 を穿刺することによって、20の骨髄吸引物が得られる。このとき、骨髄吸引物を プールし、１mlにつき100ユニットのヘパリンと100μｇ／mlのデオキシリボヌク レアーゼＩを含むヘルペス緩衝されたハンクス平衡塩類溶液の中で懸濁させ、次 にフィコール比重差遠心分離に付す。その後バッフィーコーディングを受けた骨 髄細胞を収集しCell ProのCEPRATETMLC（Cell Pro，Bothell，WA）（CD34）分離 システムに従って洗浄する。その後、洗浄済みのバッフィコーディングを受けた 細胞を、順次抗−CD34モノクローナル抗体で染色し、洗浄しその後CEPRATETMシ ステムと共に供給されたビオチニル化された二次抗体で染色する。それから細胞 混合物をCEPRATETMアビジンカラム上に投入する。ビオチン標識付けされた細胞 はカラム上に吸着されるが、一方標識付けされていない細胞は通過する。その後 CEPRATETMシステムの指針に従って洗い流し、ゲル床を手で圧搾することにより カラムの撹拌でCD34+細胞を溶出させる。CD34+細胞がひとたび精製されると、精 製された基幹細胞を計数し、20％のプールされかつ熱不活性化されていないヒト AB血清（hAB血清）を含むIscoreの修正ダルベッコ培地(JMDM；Irvine Scientifi c，Santa Ana，CA)中で１×105細胞／mlの濃度で平板培養する。 精製の後、（？）精製された基幹細胞をトランスダクションするいくつかの方 法を実施することができる。１つのアプローチには、ベクター産生細胞から誘導 された上清培養を含むベクターを用いた精製基幹細胞集団の即時トランスダクシ ョンが関与している。第２のアプローチには、非粘着CD34+細胞の精製された集 団との、ベク ター産生細胞の照射済み単層の同時培養が関与している。第３のそして好ましい アプローチには類似の同時培養アプローチが関与しているが、精製されたCD34+ 細胞はさまざまなサイトカインで予め刺激を受け、照射済みのベクター産生細胞 との同時培養より48時間前に培養される。最近の出版物によると、レトロウイル スベクターを用いて細胞のトランスダクションに先立ち基幹細胞を予め刺激する と、これらの細胞タイプへの遺伝子トランスファのレベルが上昇するということ が実証されている。(Nolta et al.，Exp．Hematol．20：1065，1992)。トランス ダクションレベルの上昇は、効率の良いレトロウイルストランスダクションに必 要な基幹細胞の増殖の増大のせいである。シンドビスベクターは、複製しない細 胞を感染させることができることから、これらの細胞の予備刺激は、必要でない かもしれない。しかしながら増殖をひき起こすこれらの培養の予備刺激は、患者 の体内への返血のために増大した細胞集団を提供することになる。 CD34+細胞の予備刺激は、IL−１，IL−３，IL−６及び肥胖細胞成長因子(MGF) を含む成長因子及びサイトカインの組合せを用いて細胞をインキュベートするこ とによって行なわれる。予備刺激は、48時間、骨髄刺激培地を含むＴ25組織培養 フラスコ内で培地１mlにつき１〜２×105のCD34+細胞を培養することによって行 なわれる。骨髄刺激培養は、30％の熱不活性化されていないhAB血清、２mMのＬ −グルタミン、0.1mMのβ２−メルカプトエタノール、１μＭのヒドロコルチゾ ン及び１％の脱イオンウシ血清アルブミンを含むIMDMから成る。骨髄培養の中で 用いられる全ての試薬は、顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球、正常な骨 髄からのコロニー形成ユニットを最大数支持するその能力についてスクリーニン グされなくてはならない。予備刺激のための精製された組換え型ヒトサイト カイン及び成長因子（Immunex Corp.，Seattle，WA）は、つぎの濃度で使用すべ きである：E．coli由来のIL−１α(100Ｕ／ml)、酵母由来のIL−３（５ng／ml） 、IL−６（50Ｕ／ml）及びMGF（50ng/ml）(Anderson et al.，Cell Growth Diff er．２：373，1991)。 CD34+細胞の予備刺激の後、これらの細胞は、連続的に刺激培地が存在する状 態で、照射済みのシンドビス生産者細胞系統（GC治療用ベクターを発現するもの ）との同時培養により感染を受ける。DAベクター産生細胞系統はまずトリプシン 処理され、照射（10000ラド）を受け、骨髄刺激培地１mlあたり１〜２×105個の 細胞の割合で再度平板培養される。翌日、シンドビスベクター産生細胞単層に対 して、１〜２×105個の予備刺激されたCD34+細胞／mlを付加する。細胞の同時培 養は、48時間行なう。同時培養の後、培地で勢いよく洗浄することによって粘着 性シンドビスベクター産生細胞単層からCD34+細胞を収集し、移動したベクター 産生細胞があればその付着を可能にするように２時間平板培養させる。次に細胞 を収集し、さらに72時間膨張させる。その後、細胞を収集し、１本のバイアルに つき１×107個の細胞のアリコート内で凍結保護物質を用いて液体窒素中で凍結 させる。偶発性作用物質が存在しないか形質転換されたCD34+細胞をひとたびテ ストしたならば凍結した形質転換済みCD34+細胞を解凍し、１×105細胞／mlの濃 度まで平板培養し、骨髄刺激培地内でさらに48時間培養することができる。形質 転換した細胞を次に収集し、２回洗浄し、通常生理食塩溶液の中で再懸濁させる 。輸液によって患者に注入し戻すのに用いられるトランスダクションを受けた細 胞の数は、注入部位１つにつき患者一人あたり最低１〜10×107個の細胞の割合 で計画され、最高４つの注入部位を必要とする。輸液は、患者の骨髄の中に直接 戻すか又は末梢血流内に直接戻すように行なうことがてきる。自己由来のトラン スダク ションを受けた骨髄細胞を受けた患者は、既存の骨髄集団を涸渇させるよう、部 分的にか又は全身的に照射を受けることができる。治療は、GC活性を見極めるた めの輸液後さまざまな時点で、又分化された細胞タイプ内の発現の長さについて 、評価することができる。フォローアップ手順の間の或る時点で発現が低下する か又は存在しない場合、トランスダクションを受けた自己由来細胞は患者の体内 に再注入することができる。 例15 組織特異的細胞RNAを用いた不能になったシンドビスベクターの活性化による組 織特異的発現 結腸直腸ガンの治療のためのシンドビス腫瘍特異的発現ベクターの構築 Ａ．CER腫瘍標識の発現に依存する組換え型シンドビスベクター(SIN-CEA)の構築 シンドビスパッケージング細胞系統の中で不能にされたシンドビスベクター粒 子を産生するため、シンドビスベクターをDNAポリメラーゼプロモーターによっ て駆動させなければならない。ベクターRNAのインビトロ転写を使用しそれに続 いてシンドビス細胞系統内にRNAを貫通させるというオプションは不能になったR NA写しにより生成される三次構造が完全なゲノミック写しを防ぎ、パッケージン グ細胞系統内のベクター複製及び力価を制限する可能性があることから、勧めら れない。この理由から、CMV MIEPプロモーター（pCMV-SIN）又はDrosophilaメト ロチオネインプロモーター（pMET-CMV）を含む出発シンドビスベクターが、パッ ケージング細胞系統（すなわち昆虫又は哺乳動物）に応じて使用される。 前述の通り、不能にされた接合ループアウトモデルは、選択されたRNAに相同 である逆方向反復塩基配列によってベクターの接合領 域がフランキングされている状態で、構築される。この例では、CEA腫瘍抗原cDN A（Beauchemin et al.，Molec．and Cell．Biol．７：3221，1987）からの配列 が、逆方向反復の中で使用される。CEA RNA応答性シンドビスベクターを構築す るため、接合領域の前には、６つの塩基対ヒンジドメインによって分離された２ つのCEAアンチセンス配列ドメイン（Ａ’及びＢ’）がくる。A1に対し相補的で ある単一の20の塩基対CEAセンス配列（A2）が、接合領域の３’末端に置かれる 。正しいA1及びB1アンチセンス配列を選択するにあたり、唯一２つの必要条件は 、それらが標的RNA配列に対して特異的であることそしてアンチセンス配列が３ つのヌクレオチドにより分離された２つのRNA配列ドメインに対してハイブリッ ド形成すること、である。この３つのヌクレオチドギャップは、ベクターの非構 造タンパク質ドメインをベクターの接合領域に架橋する読取り鎖をホップ及びス イッチするべくポリメラーゼのためのヒンジドメインとして役立つことになる（ 図５）。このような形態を構築するためには、極端の５’及び３’末端に適当な 制限酵素部位を含むフラグメントインサートを作り出すため、互いに相補する２ つのオリゴヌクレオチドが合成される。このオリゴヌクレオチドフラグメントイ ンサートは、このときシンドビスベクターの多重クローニング部位と不能になっ た接合領域の間でシンドビスベクター内に連結される。 ５’から３’までのセンスオリゴヌクレオチド鎖は、ApaＩ制限部位とそれに 続くA1アンチセンスドメイン、６bpのヒンジドメイン、B1アンチセンスドメイン 、合成接合領域ドメイン及びA2アンチセンスドメインとそれに続くXhoＩ制限酵 素部位を含む。CEA RNA応答性シンドビスベクターを設計するためには以下のオ リゴヌクレオチド配列が使用される。ヌクレオチド番号配列は、Beauchemin et al.，Molec．and Cell Biol．７：3221，1987から得られる。５’−３’CEAセンス鎖 ５’−３’CEAアンチセンス鎖は、上述のオリゴヌクレオチドに対して相補的 である。両方のオリゴヌクレオチドが合成された後、オリゴヌクレオチドを10mM のMgの存在下で混合し、５分間1000℃まで加熱し、ゆっくりと室温まで冷却する 。その後、オリゴヌクレオチド対をApaＩ及びXhoＩ制限酵素で消化させ、同じ酵 素で予め消化されたプラスミドpCMV-SIN又はpMET-SINに対するインサートのモル 比25：１で、混合し連結した。これらの構成体はそれぞれpCMV/SIN-CEA及びpMET /SIN-CEAと呼ばれる。ガンマインターフェロンを発現するSIN CEAベクター及び生産者細胞系統（SIN-C EA/gIFN）の構築 チオシアン酸グアニジニウム抽出とそれに続くCsCl比重差による超遠心分離に よってPHAで刺激されたJurkat Ｔ細胞から分離されたRNAから、ヒトｇ−IFN cD NAを誘導する。次にRNA(Sigma，St． Louis，MO)をインビトロで逆転写させ、Tacポリメラーゼを用いたポリメラーゼ 連鎖反応によってｇ−IFN cDNAを増幅させるため遺伝子特異的オリゴヌクレオチ ド対を使用する。PCR DNAをT4 DNAポリメラーゼ及びクレノウで修復し、CIAPで 処理されたSK+プラスシド（Stratagene，San Dieg，CA）のHinc III部位の中に クローニングさせた。センス配向で、cDNAの５’末端は、SK+ポリリンカーのXho Ｉ部位に隣接しており、３’末端はClaＩ部位に隣接している。ヒトγ−IFN分子 をコードする512塩基対フラグメントをpCMV/SIN-CEA又はpMET/SIN-CEAベクター のいずれかのXhoＩ/ClaＩ部位に入れる。これらの新しいプラスミドをそれぞれ 、pCMV/SIN-CEA／γIFN又はpMET/SIN-CEA／γIFNと呼称する。 Ｂ．チミジンキナーゼを発現するSIN-CEAベクター及び生産者細胞系統（SIN-CEA /TA）の構築 pHS1TK3KB(Mcknight et al.，Nuc．Acids．Pes．８：5949，1980)クローンを 標的DNAとして使用して、５’XhoＩ及び３’ClaＩ制限酵素部位でフランキング された単純ヘルペスチミジンキナーゼ（「HSVTK」）のcDNAクローンを含むPCR増 幅された産物を得る。PCR増幅のために使用されたプライマーについての配列は 、公表された配列（Wagner et al.，PNAS，78；1442，1981）から得られる。こ のとき、1260塩基対の増幅産物は、XhoＩ及びClaＩで消化され、pCMV/SIN-CEA又 はpMET/SIN-CEAベクターのいずれかのXhoＩ/ClaＩ部位に連結される。これらの 新しいプラスミドは、それぞれpCMV/SIN-CEA/HSVTK又はpMET/SIN-CEA/HSVTKと呼 称される。 Ｃ．CEA RNA依存性シンドビスベクター生産者細胞系統の作製 生産者細胞系統を作り上げる前出の例（例７）とは異なり、ベクタートランス フェクションにより、パッケージング細胞系統内への唯一回の遺伝子トランスフ ァが可能である。これらのベクターは不 能にされ完全ゲノミックベクターの合成において防止されていることから、シン ドビスパッケージング細胞系統の新鮮な層の再感染は、これらのベクターが活性 状態になるのにCEA RNAの存在に依存しているために、頓座感染に終わることに なる。例11で前述したRT−PCR技術を用いて、トランスフェクションを受けた生 産者細胞系統を希釈クローニングすることによって、より高い力価を達成するこ とが可能である。 例16 合成タンパク質産生のための組換え型シンドビスベクターを用いた置換遺伝子療 法 第VIII因子欠損型血友病Ａの治療法 血友病は、血漿凝固因子である第VIII因子が欠如していることを特徴とする。 およそ２万人に１人の男性が、血液凝固カスケードを完成させる能力がないこと による出血障害として疾病状態が現われる血友病Ａを有している。 血友病Ａ患者の治療は、第VIII因子タンパク質での置換である。ヒト第VIII因 子の唯一の供給源はヒト血漿である。第VIII因子の精製のためヒト血漿を処理す るためには、人間のドナー試料が1000人以上のドナーのロットでプールされる。 第VIII因子タンパク質が不安定なものであるため、結果として得られる薬学的産 物は非常に不純であり、重量純度の見積りは約0.04％である。さらに、なかでも Ｂ型肝炎ウイルス及びヒト免疫不全症ウイルスといったような、血液供給源を汚 染し従って第VIII因子タンパク質と潜在的に同時精製可能であるような感染性疾 患の重大な兆しが現われている。 上述の理由で、第VIII因子の組換え型産生源が血友病Ａの治療に向けての将来 性ある進歩を画すると思われる。 血友病Ａの理想的な治療は、遺伝子置換療法すなわち、正常な凝 固カスケードが結果として起こりうるようにする正常な第VIII因子を患者の体内 で置換する方法がある。 上述のことは、血友病Ａ障害の考えられる治療について当業者にとって周知の 事柄である。第VIII因子の発現のために開発されてきた考えれる１つの遺伝子治 療ベクターはレトロウイルスである。しかしながら、理由はわからないがこの方 法及びその他の方法での組換え型第VIII因子の発現レベルは比較的低いものであ る。 レトロウイルス及びその他のベクターによるトランスダクションを受けた細胞 内での組換え型第VIII因子の低い発現について考えられる１つの可能性は、核小 体から細胞質への成熟第VIII因子RNAの処理及び輸送の比較的低い効率である。 当業者にとっては既知の通り、第VIII因子のＢドメインの欠失は、この凝固因子 が産生され分泌されるレベルを増大する。 低いRNA発現レベル及び不充分な処理に起因する第VIII因子タンパク質の低い レベルに付随する問題を回避するため、シンドビスベクター内への第VIII因子cD NAの挿入が記述されている。シンドビスの生活環は感染細胞の細胞質の中で完全 に起こることから、核小体から発現された第VIII因子に付随する問題は避けられ る。その上、シンドビスの自己複製する効率から見て、理論的には、シンドビス ／第VIII因子感染細胞内での第VIII因子産生レベルは、細胞１個あたり１×108 の第VIII因子タンパク質分子といった高いものとなりうる。 シンドビスベクター内に第VIII因子を挿入することに付随する潜在的な１つの 問題点は結果として得られるベクター／非相同遺伝子構成体の物理的サイズ及び 、第VIII因子ベクター構成体を機能的な感染性シンドビス粒子内にパッケージン グするという考えられる制約条件である。野生型シンドビスのゲノミックサイズ は、11,703ヌクレオチドと１つのポリＡテイルである。シンドビス塩基性ベクタ ー構 成体（pKSSINBV、例２参照）のサイズは、25-merポリＡテイルを含めて7830ヌク レオチドである。かくして、野生型ウイルスと同じ物理的サイズのゲノミック補 体という結果をもたらすpKSSINBV内に挿入すべき非相同遺伝子材料の許容サイズ は、3898ヌクレオチドである。 しかしながら、１つの主要な証拠書類によると、pKSSINBV内に挿入され機能的 感染性シンドビス粒子内にパッケージングされ得る非相同性遺伝子材料の容量が 3898bpsよりもはるかに大きいということが示唆されている。文献(Geigenmuller -Gnirke et al.，PNAS 88：3253-3257，1991)内で公表された研究作業において は、各々シス−要求パッケージングシグナルを含む２つの分子の、単機能シンド ビス粒子へのパッケージングについて記述されている。この研究における２つの パッケージングされたゲノムの合計物理サイズは14600bpsである。この結果は、 非相同遺伝子材料のためのシンドビスベクターの容量が以前に想像されたものよ りもはるかに大きいということを、強力に示している。シンドビスベクター内へ の大きい細胞遺伝子の挿入の潜在的可能性は、この系の有用性を実質的に拡大す る。 第VIII因子cDNAクローンは野生型8000bpsである。pKSSINBV内への第VIII因子c DNAの挿入は野生型15830bpsのベクター／非相同ゲノミックサイズを生み出す。 この粒子のパッケージングが低効率であるならば、第VIII因子インサートの「Ｂ −ドメイン」を削除することによりインサートのサイズをさらに減少させること ができる。ひきつづき発現されるタンパク質の官能性に影響を及ぼすことなく、 cDNAから第VIII因子Ｂ−ドメイン領域を除去することが可能であるということが 示されてきた。 第VIII因子cDNAの供給源はクローンpSP64-VIII、つまり全長ヒトタン パク質をコードするcDNAを有する受け入れ番号39812のATCCクローンである。pSP 64-VIIIはSalＩで消化され、末端はT4 DNAポリメラーゼと各dNTPを50μＭ用いて 平滑末端化され、ca．7700bpのフラグメントは、１％のアガロース／TBEゲル上 で電気泳動され、Gene CleanTMで精製される。平滑末端を含む第VIII因子のcDNA を次に、Hinc IIでの消化により前処理され、CIAPで処理され、Gene CleanTMで 精製されたpKS II 3'SIN(例２)の中へ連結させる。このプラスミドはpF83'SINと して知られている。 例２に記述されているさまざまなシンドビスベクター内への第VIII因子の挿入 のため、プラスミドpF83'SINをXhoＩ及びSac IIで消化し、結果として得られた7 850bpのフラグメントを１％のアガロース／TBEゲル上で分離し、Gene CleanTMに より精製する。この第VIII因子−3'SINフラグメントを以下に列挙するベクター の各々の中に挿入する。このフラグメントの挿入に先立って、XhoＩ及びSac II での消化によりプラスミドを前処理し、CIAPで処理し、１％のアガロース／TBE ゲル電気泳動により分離し、Gene CleanTMで精製する： ベクター 機能的接合領域（+/-） pKSSINBV ＋ pKSSINdlJRsjrc ＋ pKSSINdlJRsjrPC ＋ pKSSINdlJRsjrNP(7,582-7,601) ＋ pKSSINdlJRsexjr ＋ 第VIII因子cDNAの挿入の後、これらのベクターはそれぞれ、以下の通り呼称さ れる： pKSSINBVF8 pKSSINdlJRsjrcF8 pKSSINdlJRsjrPCF8 pKSSINdlJRsjrNP(7,582-7,601)F8 pKSSINdlJRsexjrF8 第VIII因子cDNAを含むベクターのパッケージングは、ベクター／第VIII因子で インビトロ転写されたRNAでトランスフェクションされた細胞を野生型ウイルス で感染させることによって、又は代替的には、例７に記述されたパッケージング 細胞系統のインビトロ転写されたベクター／第VIII因子RNAでのトランスフェク ションによって達成される。パッケージング効率は、感染細胞内の第VIII因子発 現を測定し、例３に記述されているpKSSIN-lucベクターを用いて行なわれた同じ 実験において観察される発現レベルと比較することによって、決定される。 例17 Ａ．グルコセレブロシダーゼシンドビスベクターの作製 まず最初に、cDNAコーディング配列の５’にXhoＩ制限酵素部位を及びcDNAコ ーディング配列の３’にClaＩ制限酵素部位を含むグルコセレブロシダーゼ（GC ）cDNAクローンを生成する。このクローンは、NcoＩでpMFG-GC（PNAS 89：1132 ：1992）を消化することによって生成され、Vent DNAポリメラーゼで平滑末端化 され、XhoＩリンカーを連結されうる。プラスミドを次にBamHＩで消化させ、Ven t DNAポリメラーゼで平滑末端化し、次にClaＩリンカーに連結させる。第VIII因 子を例２で記述されたさまざまなシンドビスベクター内に挿入するため、次にフ ラグメントをXhoＩ及びClaＩで消化させ、１％のアガロース／TBEゲル上でゲル 分離させ、Gene Cleanで精製する。GCフラグメントを、XhoＩ及びClaＩでの消化 、CIAPでの処理、１％アガロース／TBEゲル電気泳動による分離及びGene Clean での精製によって前処理された以下のベクターの各々の中に挿入する。 ベクター 機能的接合域（+/-） pKSSINBV ＋ pKSSINdlJRsjrc ＋ pKSSINdlJRsjrPC ＋ pKSSINdlJRsjrNP(7582-7601) ＋ pKSSINdlJRsexjr ＋ 第VIII因子cDNAの挿入の後、これらのベクターは以下に示すものとして知られ ている。 pKSSINBV-GC pKSSINdlJRsjrc-GC pKSSINdlJRsjrPC-GC pKSSINdlJRsjrNP(7582-7601)-GC pKSSINdlJRsexjr-GC グルコセレブロシダーゼ（GC）シンドビスベクターは、動物研究においてGC c DNAを発現するために用いられ、場合によっては直接注入により人間を治療する ために用いられることになる。治療を受けた患者の体内でのGC発現を持続させる ために多重注入が必要とされる場合、シンドビスベクターが最低限の抗原性をも つように設計されているか又はベクターに対する免疫応答を誘発しないような形 で設計されていれば理想的であろう。このような要領で設計されており多重タン パク質を発現することのできるシンドビスベクターの例は、例３（アデノウイル ス早期領域E3）；例４（HCMV H301）；例５（同義遺伝子の発現）及び例17（イ ンターフェロンＡのリボザイム発現）の中で記述されている。上述の例を用いる と、ベクターの多重クローニング部位において同じXhoＩ〜ClaＩクローニング部 位を用いて、インターフェロンＡヘアピンリボザイムの後にADE3又はCMVH301遺 伝子が続きその後に内部リボザイム進入部位が続き、 その後にGC cDNA又はその他の治療的緩和剤が続くような形態でGC cDNAを発現す るようにシンドビスベクターを設計することが可能である。 Ｂ．シンドビスグルコセレブロシダーゼベクター産生細胞系の構築 例７に記述されている、使用されるシンドビスcDNAベクタークローンのタイプ に応じて生産者細胞系統を作製する２つのアプローチが紹介される。１つのシン ドビスベクタータイプは、インビトロRNA写しの合成のために、SP6 RNAポリメラ ーゼ認識配列を使用する。このタイプのベクターは、パッケージング細胞系統内 で持続的に複製することになる組込みしないベクターに基づいてベクター生産者 細胞系統を作り出すために用いられる。第２のタイプのベクターは、パッケージ ング細胞系統内での安定した組込みを可能にするプラスミド構成体の中でSP6配 列の代わりに非相同プロモーターを使用する（再考のため例７参照）。このとき 複製応答能あるシンドビスベクターの写しがDNAレベルから発現され、シンドビ スパッケージング細胞系統内にトランスフェクションされることになる。 シンドビスGCウイルスベクターがT7 RNA認識配列を使用する場合、cDNAはまず 市販のインビトロ転写系（Megascript転写キット：Ambion Inc.，Austin，Texas ）のいずれかを用いてインビトロ転写され、その後リボソーム又はリン酸カルシ ウム沈降によりシンドビスパッケージング細胞系統内に全長RNA写しがトランス フェクションされる。前述の通り（例７）、トランスフェクションを受けたパッ ケージング細胞系統からの感染性ベクター粒子を含むろ過された上清は、次にシ ンドビスパッケージング細胞の新鮮な単層を再度感染させるのに使用され、この 単層はこのときウイルスベクターの供給源として役立つ。10cmの皿の中で５×106 個の細胞を感染させるためには、約10mlの感染性上清を使用しなければならな い。 シンドビスGCウイルスベクターが、選択可能な標識（ネオマイシン耐性遺伝子 ）を伴う発現プラスミド形態の中で非相同プロモーターを使用する場合、cDNAベ クターはパッケージング細胞系統の中にトランスフェクションされ、その後薬物 耐性選択の行なわれなければならない。次に耐性コロニーをプールし希釈クロー ニングする。その後、個々のクローンを増殖し、凍結させる。次に個々のクロー ンを、ウェスタンブロット分析法によりグルコセレブロシダーゼの発現について （及び）例９に記されているような高い力価についてスクリーニングし、タンパ ク質の機能的活性についてテストする（Correll et al.，Blood 80：331，1992 ）。 選択可能な標識をもたないベクターについては、安定した形で又は持続的にト ランスフェクションされたクローンの選択は、細胞をシンドビスベクターでトラ ンスフェクションしてから１日〜２日後にパッケージング細胞系統を希釈クロー ニングすることによって行なわれなくてはならない。その後、伝令RNAの逆転写 とその後に続くポリメラーゼ連鎖反応技術によるcDNAメッセージの増幅を用いて 、グルコセレブロシダーゼの存在について希釈クローンをスクリーニングする。 この手順は、RT−PCR技術として知られており、Invitrogen Corp.(San Diego，C A)を通してこの検定を実施するための市販キットを入手することができる。RT− PCRは、少なくとも10日間増殖させられたクローンについて行なわれる。安定し た持続的に感染を受けたクローンの適正な数を見い出すため、約50〜100のクロ ーンをスクリーニングする。RT−PCRを行なうためには、RNA産物の増幅によって 望ましいメッセージがスクリーニングされるよう、特異的プライマーが必要とさ れる。グルコセレブロシダーゼスクリーニングのために521塩基対産物を増幅す るように設計されたプライマーは、以下のものである。グルコセレブロシダーゼのスクリーニングのためのプライマー GC PCR(F) ブライマー #1: 5' TTT CTG GCT CCA GCC AAA GCC ACC CTA GGG GAG 3' （配列番号74） GC PCR(R) ブライマー #2: 5' AAT GGA GTA GCC AGG TGA GAT TGT CTC CAG GAA 3' （配列番号75） このとき、最高の発現及び力価を示すクローンが、BHK-２細胞を感染させるこ とによる発現のトランスファについてテストされ、それに続いてウェスタンブロ ット分析及び、BHK-２細胞内のグルコセレブロシダーゼ（GC）活性についての機 能的検定が行なわれる。ウェスタンブロット(PNAS 89：11332，1992)のためには ヒトGCに対する特異的モノクローナル抗体(8E4)が用いられ、これはBarneveld， R．A．et al.(Eur．J．Biochem．134：310，1983)中で記述されている。適切な クローンがひとたび同定されたならば、ベクターを得るため成長培養からの上清 が用いられ、0.45ucフィルターを通してろ過され、動物の体内への直接注入を介 して動物研究を始めるのに用いられる。動物研究がひとたび行なわれたならば、 動物研究から誘導されたスケールアップした直接注入プロトコルをゴーシェ病患 者の治療のために使用することができる。このベクターのための代替的投与プロ トコルは、以下の例で示されている。 例18 シンドビスウイルスのベクターから発現された配列特異的アンチセンスまたはリ ボザイム分子によるヒト乳頭腫ウイルスの病原性の阻止 今日まで、上皮由来の細胞について顕著な向性を有する、ヒト乳頭腫ウイルス (HPV)の60より大きい型が単離されそして特性決定さ れた。HPV群の中には、ヒトの肛門性器の道を感染する実質的な数の型が存在す る。この群のHPVは、肛門性器の道の良性または悪性の増殖に関連する型にさら に再分割することができる。 米国において１年につき13,000〜20,000の子宮頸癌の死亡が存在する。開発途 上国において、子宮頸癌は最も頻繁な悪性疾患であり、そして先進国において子 宮頸癌は乳癌、肺癌、子宮癌、および卵巣癌の後に等級づけられる。肛門性器の 増殖が増大しつつある健康の問題であるという見解を殊に支持する１つの統計学 は、性器いぼについての医学的相談が1966年における169,000件から1988年にお ける２百万件より大に増加したことである。 HPVを頸部の増殖の疾患の病原性に関連させるいくつかの証拠が存在する。型 の明確なサブセット、いわゆる「低い危険のHPV」は頸の良性の増殖状態に関連 する（例えば、HPV6，11，43，44）が、型の他のサブセット、「高い危険のHPV 」は悪性の状態に進行することがある病変に関連する（例えば、HPV16，18，31 ，33，35など）。子宮頸腫瘍のほぼ95％はHPVを含有し、HPV16または18型のDNA はそれらの約70％において見出される。 若い性的に活性な女性の集団におけるHPVの頻度は非常に高いように思われる 。事実、454人の大学の女性の最近の研究において、213人、すなわち、46％はHP V陽性である。HPV陽性の群の間で、３％はHPV6／11陽性であり、そして14％はHP V16/18陽性であった。これらの454人の女性のうちで、33人(7.3％)は、細胞学に より決定して、異常な子宮頸の増殖を有した。 HPVにターゲッティングされるアンチセンスおよびリボザイムの治療因子の設 計に関すると、ターゲッティングすべきHPV型（すなわち、尖圭コンジロームに 関連する型または悪性の子宮頸の増殖に関連する型）およびターゲッティングす べきHPV発現遺伝子（これ らはHPV遺伝子E2，E6、またはE7を包含するが、これらに限定されない）に関し て考慮すべき重要なパラメーターが存在する。 一般に、HPV遺伝子の発現は一時的に２つの期で定められる、すなわち、ウイ ルスDNAの複製前に発現される初期の（Ｅ）遺伝子、すなわちウイルスDNAの複製 後に発現される後期の（Ｌ）遺伝子。７つの初期の酵素HPV遺伝子、および２つ の後期の構造HPV遺伝子が存在する。 上に掲示した議論に基づいて、ウイルスE2遺伝子をターゲッティングするHPV6 ／11群に対して向けられたアンチセンス／リボザイム治療因子を構成することが できる。E2タンパク質の発現の阻害によりウイルスの組込みを維持する機構によ り、E2遺伝子の標的はHPV16/18群に関して不確かであることがある可能性がある ように思われる。こうして、HPV16/18型におけるE6／E7遺伝子は直接ターゲッテ ィングすべきであるように思われる。 HPV16型E6およびE7のRNAに対して特異的なシンドビスウイルスのベクター（実 施例２に記載する）の中へのアンチセンスおよびリボザイムの治療因子の構成を 下に記載する。HPVのアンチセンスおよびリボザイムの部分の挿入はシンドビス ベクターのClaＩおよびXhoＩ部位の間である。 Ａ．HPV16E6/E7アンチセンス治療因子の構成 HPV16ウイルスのゲノムのクローン、pHPV−16(ATCC No.45113)を、ウイルスE6 ／E7遺伝子からの特定の配列の増幅のためのPCR反応において鋳型として使用す る。HPV16アンチセンス部分をまずプラスミドベクターpKS II+の中に挿入する； プラスミドベクターからのアンチセンス治療因子の除去および種々のシンドビス ベクターの主鎖の中への挿入は、独特アンチセンス部分の末端のClaＩおよびXho Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を経て達成される。HPV16E6/ E7遺伝子の一部分の増幅は下に示すプライマーの対を使用して達成される： 前方のプライマー（緩衝配列／XhoＩ部位／HPV16ヌクレオチド201-222）： TATATTCTAGAGCAAGCAACAGTTACTGCCGACG（配列番号76） 逆プライマー（緩衝配列／ClaＩ部位／HPV16ヌクレオチド759-738）： TATATATCGATCCGAAGCGTAGAGTCACACTTG（配列番号77） HPV16E6/E7相補的配列に加えて、両方のプライマーはPCRアンプリコン生成物 の効率よい酵素消化のためにそれらの５’末端に５ヌクレオチドの「緩衝配列」 を含有する。上に示すプライマーを使用するHPV16アンプリコンの発生は、実施 例４に記載するPCRプロトコールを使用して達成される。感染した子宮頸上皮中 のE6／E7mRNAは３つの形態、すなわち、アンスプライスのオールタネイティブお よび２つのスプライスされたオールタネイティブ（E6＊およびE6**）、E6のヌク レオチド226-525が成熟メッセージの中に存在しないもの、で存在することが従 来示された(Smotkinら、J．Virol 63：1441-1447，1989)。ここに記載するアン チセンス部分とHPV16ゲノムとの間の相補性の領域はウイルスのヌクレオチド201 -759である。こうして、アンチセンス部分はE6／E7アンスプライスメッセージお よびスブライスE6＊E6**スプライスメッセージに結合しそしてそれらの翻訳を阻 害することができるであろう。 HPV16E6/E7の580bpのアンプリコン生成物をまずジーン・クリーン（Gene Clea n）（Bio 101、カリフェルニア州サンディエゴ）で精製し、制限酵素ClaＩおよ びXhoＩで消化し、そして１％アガロース／TBEゲル上で電気泳動させる。次いで 568bpのバンドをゲルから切り出し、DNAをジーン・クリーンで精製し、そしてpK S II+ プラスミドの中に結合し、そしてpKS II+はClaＩおよびXhoＩを使用する消化、C IAPを使用する処理、およびジーン・クリーンを使用する処理により調製される 。このプラスミドはpKSaHPV16E6/E7として知られている。 Ｂ．HPV16E6/E7ヘアピンリボザイム治療因子の構成 HPV16のE6およびE7タンパク質の発現を効率よく阻害するために、E6mRNAに対 する標的の特異性をもつヘアピンリボザイム（HRBZ）を構成する。HPV16リボザ イム部分をまずプラスミドベクターpKS II+の中に挿入する；プラスミドベクタ ーからのリボザイム治療因子の除去および種々のシンドビスベクターの主鎖の中 への挿入は、独特リボザイム部分の末端のClaＩおよびXhoＩ制限エンドヌクレア ーゼ部位を経て達成される。 HRBZは下に示すHPV16E6RNA(ヌクレオチド414-431)に対して相同性である： TTAACTGTCAAAAGCCAC（配列番号78） HRBZはTCTCヘアピン中のＴ残基の後で、上に下線で示す、リボザイムのループ ５基質のモチーフを切断するように設計する。切断後、HRBZを再循環させ、そし てHRBZは他のアンスプライスE6／E7mRNAまたはE6＊スプライスmRNA分子にハイブ リダイゼーションし、そしてそれを切断することができる。 従来定められた二本鎖HRBZ(Hampelら、Nucleic Acids Research 18：299-304 ，1990)は、４塩基の「テトラループ」３および延長したらせん４を含有し、上 に示したHPV16E6のRNAに対する特異性をもち、化学的に合成されそして、それぞ れ、ClaＩおよびXhoＩ部位の両方の５’および３’末端を含む。化学的に合成さ れたHPV16E6HRBZ鎖の配列を下に示す： HPV16E6HRBZ、上部の鎖（５’−＞３’）： CGATGTGGCTTTTAGATGTTAAACCAGAGAAACACACGGACTTCGGT CCGTGGTATATTAGCTGGTAT （配列番号79） HPV16E6HRBZ、下部の鎖（５’−３’）： CTAGATACCAGCTAATATACCACGGACCGAAGTCCGTGTGTTTCTCTGG TTTAACATCTAAAAGCCACAT（配列番号80） ClaＩおよびXhoＩの粘着末端をもつ二本鎖HPV16E6特異的HRBZを形成するため に、等しい量のオリゴヌクレオチドを10mMのMg2+中で一緒に混合し、95℃に５分 間加熱し、次いで室温にゆっくり冷却して鎖をアニーリングさせる。 ClaＩおよびXhoＩ粘着末端をもつ二本鎖HPV16E6HRBZをまずpKS II+プラスミド ベクターの中に結合し、pKS II+はClaＩおよびXhoＩを使用する消化、CIAPを使 用する処理、およびジーン・クリーンを使用する処理により調製させる。このプ ラスミドはpKSHPV16E6HRBZとして知られている。 HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイム部分をそれらのプラスミドベク ター、それぞれ、pKSaHPV16E6/E7およびpKSHPV16E6HRBZから遊離させる、ここで ClaＩおよびXhoＩで消化し、アガロースの電気泳動およびジーン・クリーンで精 製し、そして、ClaＩおよびXhoＩを使用する消化およびCIAPを使用する処理によ り調製された、所望のベクターの主鎖の中に挿入する。いくつかの可能なシンド ビスベクターは、HPV16アンチセンスおよびリボザイムの治療因子の部分の挿入 のために適当であり、それらのベクターのいくつかは下に示されており、そして その詳細な構成は実施例２に記載されている： ベクター 機能的接合領域（+/-） pKSSINBV ＋ pKSSINBVdlJR − pKSSINdlJRsjrc ＋ pKSSINdlJRsjrPC ＋ pKSSINdlJRsjrNP(7582-7601) ＋ pKSSINdlJRsexjr ＋ アンチセンスおよびリボザイムの治療因子はRNAのレベルで働くので、これら の部分を含有するベクターが機能的接合領域を含有することは不必要である。す なわち、シンドビス構造タンパク質に相当する領域の翻訳はサブゲノムRNAから のみ起こる。しかしながら、アンチセンスおよびヘアピンリボザイムの治療因子 の翻訳は結果ではないので、これらの部分はプラス鎖シンドビスゲノムのベクタ ーRNAのレベルからそれらの影響を発揮する。 他方において、反復した投与量を個体に投与ことは望ましいことがある；こう して、アンチセンスおよびヘアピンの緩和因子（palliative）はアデノウイルス E3またはヒトサイトメガロウイルスのH301遺伝子の下流に挿入され、ここでE3ま たはH301遺伝子は感染した細胞におけるMHCクラスＩ分子の発現をダウンレギュ レーションする。アンチセンスおよびヘアピンの緩和因子の挿入は、下に示す実 施例３および４からのベクターにおいて、ClaＩおよびXhoＩ部位の間で達成され る： ベクター 機能的接合領域（+/-） pKSSINdlJRsjrcAdE3 ＋ pKSSINdlJRsjrcH301 ＋ サブゲノムmRNAはこれらのベクターの中で合成され、Ad E3およびCMV H301遺 伝子のための翻訳鋳型として働く。こうして、これら の構成体において、機能的HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイムの緩和 因子はサブゲノムおよびプラス鎖ゲノムの両方のシンドビスベクターRNAのレベ ルで存在するであろう。 さらに、HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイムの緩和因子は、記載し たシンドビスベクターの中に挿入された異種遺伝子の下流に挿入される。例えば 、HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイムの緩和因子は、例えば、E6／E7 またはL1タンパク質からの、HPV16の免疫原性エピトープをコードする異種遺伝 子の下流に挿入できるであろう。これらのベクターにおいて、免疫調節Ad E3ま たはCMV H301遺伝子を含有させることは望ましくないであろう。 高いおよび低い危険の両方のHPV群による感染の間のE6／E7遺伝子の発現は、 子宮頸上皮の増殖のために要求される。試験したHPV型からのHPVE7タンパク質は 網膜芽細胞腫タンパク質と複合体を形成し、そしてHPV16および18型からのE6タ ンパク質は細胞p53タンパク質に連合しそしてそれを分解する。p53および網膜芽 細胞腫細胞の遺伝子生産物は細胞の成長調節に関係づけられ、そしてこれらのタ ンパク質の発現または機能の変更は影響を受けた細胞における成長の調節を解放 することができる。こうして、両方のHPV群に対するアンチセンスまたはリボザ イムの治療因子はこれらの遺伝子の一方または両方の発現を直接または究極的に 減少するであろう。E6／E7遺伝子の発現はウイルスE2タンパク質によりトランス 活性化される。しかしながら、別のスプライシング戦略を利用することによって 、E2タンパク質はまたトランス−リプレッサーとして使用することができる。オ ンコジーンHPV型の組込みはウイルスE2領域において起こり、そしてE2タンパク 質の発現を阻害する。オンコジーンHPV型による組込みは、子宮頸癌の明白な誘 発および／または維持において重要な事象であるように思われた。この事象はE6 ／E7遺伝 子の連続的発現を生ずる。組込まれた状態にいて、E6／E7遺伝子の発現は感染し たケラチノサイトの中に存在する因子によりトランス活性化される。E6／E7発現 の細胞ケラチノサイト因子の活性化に応答するウイルスE2の調節機構の不活性化 は、ウイルスの組込みにおいて決定的な事象である。 HPV16型E6およびE7RNAに対して特異的なシンドビスウイルスのベクター（実施 例２に記載する）の中へのアンチセンスおよびリボザイムの治療因子の構成を下 に記載する。HPVアンチセンスおよびリボザイム部分の挿入は、シンドビスベク ターのClaＩおよびXhoＩ部位の間である。 Ｃ．HPV16E6/E7アンチセンス治療因子の構成 HPV16ウイルスゲノムのクローン、pHPV−16(ATCC No.45113)を、ウイルスE6／ E7遺伝子からの特定の配列の増幅のためのPCR反応において鋳型として使用する 。HPV16をまずプラスミドベクターpKS II+の中に挿入する；プラスミドベクター からのアンチセンス治療因子の除去および種々のシンドビスベクターの主鎖の中 への挿入は、独特アンチセンス部分の末端のClaＩおよびXhoＩ制限エンドヌクレ アーゼ部位を経て達成される。HPV16E6/E7遺伝子の一部分の増幅は下のプライマ ー対を使用して達成される： HPV16前方プライマー（緩衝配列／XhoＩ部位／HPV16ヌクレオチド201-222）： 5'-TAT ATT CTA GAG CAA GCA ACA GTT ACT GCG ACG-3' （配列番号81） HPV16逆プライマー（緩衝配列／ClaＩ部位／HPV16ヌクレオチド759-738）： 5'-TAT ATA TCG ATC CGA AGC GTA GAG TCA CAC TTG-3' （配列番号82） HPV16E6/E7相補的配列に加えて、両方のプライマーはPCRアンプリコン生成物 の効率よい酵素消化のためにそれらの５’末端に５ヌクレオチドの「緩衝配列」 を含有する。上のプライマーを使用するHPV16アンプリコンの発生は、実施例４ に記載するPCRプロトコールを使用して達成される。感染した子宮頸上皮中のE6 ／E7mRNAは３つの形態、すなわち、アンスプラ・イスのオールタネイティブ（E6 ＊およびE6**）、ここでE6のヌクレオチド226-525は成熟メッセージの中に存在 しない、で存在することは知られている(Smotkinら、J．Virol 63：1441-1447， 1989)。アンチセンスとHPV16ゲノムとの間の相補性の領域はウイルスのヌクレオ チド201-759である。こうして、アンチセンス部分はE6／E7アンスプライスメッ セージおよびスプライスE6＊およびE6**メッセージに結合しそしてそれらの翻訳 を阻害することができるであろう。 HPV16E6/E7の580bpのアンプリコン生成物をまずジーン・クリーン（Gene Clea n）（BIO 101、カリフォルニア州サンディエゴ）で精製し、制限酵素ClaＩおよ びXhoＩで消化し、そして１％アガロース／TBEゲルにより単離する。次いで568b pのバンドをゲルから切り出し、DNAをジーン・クリーン（Gene CleanR）で精製 し、そしてClaＩおよびXhoＩを使用する消化により調製されたpKS II+プラスミ ドの中に結合し、CIAPで処理し、そしてジーン・クリーン（Gene CleanR）で処 理する。このプラスミドをpKSαHPV16E/E7と表示する。 Ｄ．HPV16E6/E7ヘアピンリボザイム治療因子の構成 HPV16のE6およびE7タンパク質の発現を効率よく阻害するために、E6mRNAに対 する標的の特異性をもつヘアピンリボザイム（HRBZ）を構成する。HPV16リボザ イム部分をまずプラスミドベクターpKS II+の中に挿入する；ブラスミドベクタ ーからのリボザイム治療因 子の除去および種々のシンドビスベクターの主鎖の中への挿入は、独特リボザイ ム部分の末端のClaＩおよびXhoＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を経て達成される 。 HRBZは下に示すHPV16E6RNAヌクレオチド414-431に対して相同性である： 5'-TTA ACT GTC AAA AGC CAC-3'（配列番号83） HRBZはTGTCヘアピン中の最初のＴ残基の後で、上に下線で示す、リボザイムの ループ５基質のモチーフを切断するように設計する。切断後、HRBZを再循環させ 、そしてHRBZは他のアンスプライスE6／E7mRNAまたはE6＊スプライスmRNA分子に ハイブリダイゼーションし、そしてそれを切断することができる。 二本鎖HRBZ(Hampelら、Nucleic Acids Research 18：299-304，1990)は、４塩 基の「テトラループ」３および延長したらせん４を含有し、上に示したHPV16E6 のRNAに対する特異性をもち、化学的に合成されそして、それぞれ、ClaＩおよび XhoＩ部位を、それぞれ、５’および３’末端に含む。化学的に合成されたHPV16 E6HRBZ鎖の配列を下に示す： HPV16E6HRBZ、センス鎖： 5'- CGA TGT GGC TTT TAG ATG TTA AAC CAG AGA AAC ACA CGG ACT TCG GTC CGT GGT ATA TTA GCT GGT AT-3' （配列番号84） HPV16E6HRBZ、アンチセンス鎖： 5'- CTA GAT ACC AGC TAA TAT ACC ACG GAC CGA AGT CCG TGT GTT TCT CTG GTT TAA CAT CTA AAA GCC ACA T-3' （配列番号85） ClaＩおよびXhoＩの粘着末端をもつ二本鎖HPV16E6特異的HRBZを形成するため に、等しい量のオリゴヌクレオチドを10mMのMg2+中で混合し、95℃に５分間加熱 し、次いで室温にゆっくり冷却して鎖をアニーリングさせる。 ClaＩおよびXhoＩ粘着末端をもつ二本鎖HPV16E6HRBZをpKS II+プラスミドベク ターの中に結合する。pKS II+ベクターをまずClaＩおよびXhoＩで消化し、CIAP で処理し、そして結合前にジーン・クリーン（Gene CleanR）で精製する。この プラスミドをpKSHPV16E6HRBZと表示する。 HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイム部分をそれらのプラスミドベク ター、それぞれ、pKSaHPV16E6/E7およびpKSHPV16E6HRBZから遊離させる、ここで ClaＩおよびXhoＩで消化し、アガロースの電気泳動により単離し、そしてジーン ・クリーン（Gene CleanR）で精製する。次いで、それらを所望のベクターの主 鎖の中に挿入する。ベクターの主鎖はClaＩおよびXhoＩを使用する消化により調 製し、そしてCIAPで処理する。いくつかの可能なシンドビスベクターは、HPV16 アンチセンスおよびリボザイムの治療因子の部分の挿入のために適当である。実 施例２からのこれらのベクターのいくつかを下に示す。 ベクター 機能的接合領域（+/-） pKSSINBV ＋ pKSSINBVdlJR − pKSSINdlJRsjrc ＋ pKSSINdlJRsjrPC ＋ pKSSINdlJRsjrNP(7,582-7,601) ＋ pKSSINdlJRsexjr ＋ アンチセンスおよびリボザイムの治療因子はRNAのレベルで働く ので、これらの部分を含有するベクターが、また、機能的接合領域を含有するこ とは不必要である。詳しくは、シンドビス構造タンパク質に相当する領域の翻訳 はサブゲノムRNAからのみ起こる。しかしながら、アンチセンスおよびヘアピン リボザイムの治療因子の翻訳は結果ではないので、これらの部分はプラス鎖シン ドビスゲノムのベクターRNAのレベルからそれらの影響を発揮する。 他方において、反復した投与量を個体に投与ことは望ましいことがある；こう して、アンチセンスおよびヘアピンの緩和因子はアデノウイルスE3またはヒトサ イトメガロウイルスのH301遺伝子の下流に挿入される。（E3およびH301遺伝子は 感染した細胞におけるMHCクラスＩ分子の発現をダウンレギュレーションする。 ）アンチセンスおよびヘアピンの緩和因子の挿入は、実施例３および４からのベ クターにおいて、ClaＩおよびXhoＩ制限部位の間で達成される： ベクター 機能的接合領域（+/-） pKSSINdlJRsjrcAdE3 ＋ pKSSINdlJRsjrcH301 ＋ サブゲノムmRNAはこれらのベクターの中で合成され、Ad E3およびCMV H301遺 伝子のための翻訳鋳型として働く。こうして、これらの構成体において、機能的 HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイムの緩和因子はサブゲノムおよびプ ラス鎖ゲノムの両方のシンドビスベクターRNAのレベルで存在するであろう。 さらに、HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイムの緩和因子は、記載し たシンドビスベクターの中に含有された異種遺伝子の下流に挿入される。例えば 、HPV16アンチセンスおよびヘアピンリボザイムの緩和因子は、HPV16E6/E7また はL1タンパク質の免疫原性エピトープをコードする異種遺伝子の下流に挿入でき るであろう。これらのベクターにおいて、免疫調節Ad E3またはCMV H301遺伝子 を含有させることは望ましくないであろう。 例19 シンドビスウイルスのベクターから発現された配列特巽的リボザイム分子による 感染した細胞におけるヒトインターフェロンＡの発現の阻害 インターフェロン（IFNs）は小さいタンパク質のファミリーからなり、これら のタンパク質はMHC抗原の発現、細胞成長の調節を変調するいくつかの遺伝子の 発現、およびウイルス感染に対する耐性を包含する、哺乳動物細胞における広い 範囲の生物学的活性を実行する(Pestkaら、Ann．Rev．Biochem．56：727-777，1 987)。IFNsの３クラス、すなわち、ａ，ｂ、およびｇ、のうちで、IFN-ａ、すな わち、白血球インターフェロンは感染した細胞におけるウイルスの複製を制限す る活性に関係する。 IFN-ａの抗ウイルス作用は、感染した細胞におけるウイルスの生活環を阻害す る２つの細胞酵素に関係する。１つの酵素は二本鎖RNA依存性68kDaのタンパク質 キナーゼであり、これはタンパク質合成阻害因子eIF-２のサブユニットのリン酸 化を触媒する。IFN-ａにより誘発される第２酵素は２’，５’−オリゴアデニレ ートシンターゼ(２’，５’−OAS)であり、これは二本鎖RNAの存在下に潜在的エ ンドヌクレアーゼ、すなわち、RNアーゼＬを活性化し、このRNアーゼＬはウイル スおよび細胞のRNAの消化に関係する（JohnstonおよびTorrence，Interferons ３：189-298，Friedman(編)、Elsevier Science Publishers，B．V.，アムステ ルダム、1984）。 それらの複製戦略は二本鎖RNAの中間体を含むので、RNAウイルスはとくにイン ターフェロンの強い誘発因子である。シンドビスウイルスに関すると、二本鎖RN A分子はプラス鎖およびマイナス鎖の両方のゲノム長さの分子の複製の間および サブゲノムメタノールの 転写の間に存在する。シンドビスウイルスを使用する細胞の感染はインターフェ ロンの誘発を生ずることが証明された(Saito，J．Interferon Res．９：23-24， 1989)。 治療緩和因子の延長した発現を望む応用において、感染した細胞におけるIFN の発現はシンドビスベクター中のIFN-amRNAに対する特異性をもつヘアピン酵素 の含有による阻害される。こうしてIFN-ａ発現の阻害は、感染した細胞中でウイ ルスが複製できる程度を阻害する、eIF-２タンパク質キナーゼおよび２’，５’ −OASを包含する、細胞タンパク質のカスケードの誘発を軽減する。ベクター感 染細胞に向かってターゲッティングされた免疫応答の誘発なしの治療緩和因子の 延長した発現は、抗原の提示以外のすべての応用において望ましくそして、例え ば、系統的タンパク質の生産、アンチセンスおよびリボザイム、およびアクセサ リー分子を包含する。 Ａ．インターフェロンＡのmRNAに対するターゲッティングされた特異性をもつヘ アピンリボザイムの構成 シンドビスベクターで感染した細胞中のインターフェロンＡタンパク質の発現 を効率よく阻害するために、インターフェロンＡのmRNAに対するターゲッティン グされた特異性をもつヘアピンリボザイム（HRBZ）を構成する。IFN-ａリボザイ ム部分をまずプラスミドベクターpKS II+（Stratagene、カリフォルニア州ラジ ョラ）の中に挿入する；プラスミドベクターからのリボザイム治療因子の除去お よび種々のシンドビスベクターの主鎖の中への挿入は、独特リボザイム部分の末 端のClaＩおよびXhoＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を経て達成される。 HRBZは下に示すヒトインターフェロンアルファ遺伝子IFN-アルファ4bのヌクレ オチド1026-1041に対して、そして、５，６，７，８、および14を包含するが、 遺伝子16を包含しない、配列決定された すべてのIFN-ａ遺伝子(Hencoら、J．Mol．Biol．185：227-260，1985)に対して 相同性である： TCT CTG TCC TCC ATG A （配列番号86） HRBZはTGTCヘアピン中のＴ残基の後で、上に下線で示す、リボザイムのループ ５基質のモチーフを切断するように設計する。切断後、HRBZを再循環させ、そし てHRBZは他のIFN-amRNA分子にハイブリダイゼーションし、そしてそれを切断す ることができる。 従来定められた二本鎖HRBZ(Hampelら、Nucleic Acids Research 18：299-304 ，1990)は、４塩基のテトラループ３および延長したらせん４を含有し、上に示 したIFN-amRNAに対する特異性をもち、化学的に合成されそして、それぞれ、Cla ＩおよびXhoＩ部位を、それぞれ、５’および３’末端に含む。化学的に合成さ れたIFN-aHRBZ鎖の配列を下に示す： IFN-aHRBZ、センス鎖（５’→３’）： TCG AGT CAT GGA GAG AGG AGA ACC AGA GAA ACA CAC GGA CT T CGG TCC GTG GTA TAT TAC CTG GAT （配列番号87） IFN-aHRBZ、アンチセンス鎖（５’→３’）： CGA TCC AGG TAA TAT ACC ACG GAG CGA AGT CCG TGT GTT TCT CTG GTT C TC CTC TCT CCA TGA C （配列番号88） ClaＩおよびXhoＩの粘着末端をもつ二本鎖IFN-ａ特異的HRBZを形成するために 、等しい量のオリゴヌクレオチドを10mMのMg2+中で一緒に混合し、95℃に５分間 加熱し、次いで室温にゆっくり冷却して鎖をアニーリングさせる。 ClaＩおよびXhoＩ粘着末端をもつ二本鎖IFN-aHRBZをpKS II+ プラスミドベクターの中に結合し、ここでpKS II+ベクターはClaＩおよびXhoＩ で消化し、CIAPで処理し、そしてジーン・クリーン（Gene CleanR）で処理して 調製される。このプラスミドをpKSIFNaHRBZと表示する。 IFN-ａヘアピンリボザイム部分をそれらのプラスミドベクター、それぞれ、pK SaIFNaHRBZから遊離させる、ここでClaＩおよびXhoＩで消化し、２％NuSieve／ アガロース電気泳動およびジーン・クリーン（Gene CleanR）により精製し、そ してそれらを所望のベクターの主鎖の中に挿入し、ここでベクターの主鎖はCla ＩおよびXhoＩを使用する消化およびCIAPを使用する処理により調製する。いく つかの可能なシンドビスベクターはIFN-ａヘアピンリボザイム部分の挿入のため に適当であり、それらのいくつかを下に示し、そしてそれらの詳細な構成は実施 例２，３、および４に記載されている： ベクター 機能的接合領域（+/-） pKSSINBV ＋ pKSSINBVdlJR − pKSSINdlJRsjrc ＋ pKSSINdlJRsjrPC ＋ pKSSINdlJRsjrNP(7582-7601) ＋ pKSSINdlJRsexjr ＋ pKSSINdlJRsjrcAdE3 ＋ pKSSINdlJRsjrcH301 ＋ リボザイム活性はRNAのレベルで働くので、この領域は部分的サブゲノムmRNA として発現されることは不必要である。しかしながら、機械的接合領域の下流に 配置するとき、合成されるリボザイムのレベルはIFN-aRNA標的を切断するとき非 常により大きくそして多分 いっそう有効である。 さらに、いくつかの応用、例えば、タンパク質の系統的発現において、個体へ の多数の投与量の投与が要求される。これらの応用において、ベクター感染細胞 に向かってターゲッティングされた免疫応答の誘発なしの治療緩和因子の延長し た発現は望ましい。この立体配置において、IFN-aHRBZ部分はアデノウイルスE3 またはヒトサイトメガロウイルスのH301遺伝子の下流に挿入することができ、こ こでE3およびH301遺伝子は感染した細胞におけるMHCクラスＩ分子の発現をダウ ンレギュレーションする。MHCクラスＩ分子の発現を変調する遺伝子の後に、連 続的に、実施例５に記載する群の間から選択されるIRES要素、および治療緩和因 子が存在する。ベクター接合領域と３’末端との間にベクターの中に位置する多 重クローニング配列に沿ったヘアピンリボザイム、Ad E3またはCMV H301，IRES 、および問題の異種遺伝子の成分の規則挿入は、成分５’および３’末端の適当 な制限酵素認識部位を使用する修飾により達成される。これらの構成体において 、機能的IFN-ａヘアピンリボザイムの緩和因子はサブゲノムおよびプラス鎖ゲノ ムの両方のシンドビスベクターRNAのレベルで存在するであろう。 実施例20 組換えアルファウイルスのベクターのラクトース配合物 粗製の組換えアルファウイルスのベクターはセリガン（Celligan）バイオリア クター（New Brunswick、ニュージャージイ州）から入手し、組換えアルファウ イルスのベクターでトランスフェクションまたは形質導入されたパッケージング 細胞を含有し、そしてバイオリアクターのマトリックスのビーズに結合されてい る。細胞は、連続的流れプロセスにおいて細胞の上を通る成長培地の中に、組換 えアルファウイルスのベクターを解放する。バイオリアクターを出 る培地を集め、そして最初に0.8ミクロンのフィルター、次いで0.65ミクロンの フィルターに通過させて、粗製の組換えアルファウイルスのベクターを清浄化す る。交差流濃縮システム（Filtron、マサチュセッツ州ボストン）を利用して、 濾液を濃縮する。濃縮物の１mlにつきほぼ50単位のDNアーゼ（Intergen、ニュー ヨーク州ニューヨーク）を添加して、外因性DNAを消化する。消化物を同一の交 差流システムで150mMのNaCl，25mMのトロメタミン、pH7.2に対して透析濾過する 。50mMのNaCl，25mMのトロメタミン、pH7.4中で平衡化した、セファデックス（S ephadex）Ｓ−500ゲルカラム（Pharmacia、ニュージャージイ州ピスカタェイ） 上に透析濾過物を負荷する。精製した組換えアルファウイルスのベクターを50mM のNaCl，25mMのトロメタミン、pH7.4中でセファデックス（Sephadex）Ｓ−500ゲ ルカラムから溶離する。 ラクトースを含有する配合緩衝液を２×濃縮原溶液として調製した。配合緩衝 液は、25mMのトロメタミン、70mMのNaCl，２mg／mlのアルギニン、10mg／mlのヒ ト血清アルブミン(HSA)、および100mg／mlのラクトースを100mlの最終体積でpH7 .4において含有する。 １部のＳ−500精製した組換えアルファウイルスのベクターに１部の２×ラク トース配合緩衝液を添加することによって、精製した組換えアルファウイルスの ベクターを配合する。配合した組換えアルファウイルスのベクターは−70℃〜− 80℃において構造するか、あるいは乾燥することができる。 スーパーモデュリョ（Supermodulyo）12Ｋ凍結乾燥器に取り付けられたエドワ ーズ・レフリジェレイテッド・チャンバー（Edwards Refrigerated Chamber）（ 3Shelf RC3Sユニット）（Edwards High Vacuum、ニューヨーク州トナワンダ）中 で、配合したアルファウイルスを凍結乾燥する。凍結乾燥サイクルが完結したと き、わずかの 窒素ガスの抽出後真空下にバイアルに栓をする。取り出したとき、バイアルをア ルミニウムのシールでクリンプする。凍結乾燥した組換えレトロウイルスを1.0m lの水で再構成する。 以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例証の目的で記載したが、 本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更が可能である。したがって 、本発明は添付した請求の範囲により以外限定されない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/18 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/04 ＡＢＡ 7/00 9051−4Ｃ 37/54 ＡＤＹ Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＴ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 イバネス，カルロス イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ミルポンド ウェイ 13592 (72)発明者 チャン，スティーブン エム．ダブリュ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ビア カカレス 9838 (72)発明者 ジョリー，ダグラス ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92024, ルーカディア，ヒルクレスト ドライブ 277 (72)発明者 ドライバー，デビッド エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92117, サンディエゴ，ビルトモア ストリート 5142 (72)発明者 ポロ，ジョン エム. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92109, サンディエゴ，ナンバー フォー，リード アベニュ 1222

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．cDNAからインビトロでウイルスRNAの合成を開始させることのできる５’ プロモーター、アルファウイルスの転写を開始させることのできる５’配列、ア ルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノミッ クフラグメントのウイルス転写が妨げられるように不活性化されたウイルス接合 領域そしてアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列を含むアルファウイルス ベクター構成体。 ２．cDNAからインビトロでウイルスRNAの合成を開始させることのできる５’ プロモーター、アルファウイルスの転写を開始させることのできる５’配列、ア ルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノミッ クフラグメントのウイルス転写が減少されるように修正されたウイルス接合領域 及びアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、を含んで成るアルファウイル ス構成体。 ３．cDNAからインビトロでウイルスRNAの合成を開始させることのできる５’ プロモーター、アルファウイルスの転写を開始させることのできる５’配列、ア ルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノミッ クフラグメントのウイルス転写が妨げられるように不活性化された第１のウイル ス接合領域、サブゲノミックフラグメントのウイルス転写が減少されるように修 正された第２のウイルス接合領域及びアルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配 列を含んで成るアルファウイルスベクター構成体。 ４．cDNAからのウイルスRNAの合成を開始させることができる５’プロモータ ーとそれに続くアルファウイルスの転写を開始させることのできる５’配列、ア ルファウイルス非構造タンパク質をコー ドするヌクレオチド配列、サブゲノミックフラグメントのウイルス転写が妨げら れるように不活性化されているか又は活性であるかのいずれかであるウイルス接 合領域、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列、転写の終了を制御する３ ’配列、を含んで成るアルファウイルスcDNAベクター構成体。 ５．cDNAからのウイルスDNAの合成を開始させることのできる５’プロモータ ーとそれに続くアルファウイルスの転写を開始されることのできる５’配列、ア ルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノミッ クフラグメントのウイルス転写が減少されるように修正されたウイルス接合領域 、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認識配列及び転写の終了を制御する３’配 列を含んで成る、アルファウイルスcDNAベクター構成体。 ６．cDNAからのウイルスRNAの合成を開始させることのできるプロモーターと それに続くアルファウイルスの転写を開始させることのできる５’配列、アルフ ァウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、サブゲノミックフ ラグメントのウイルス転写が妨げられるように不活性化された第１のウイルス接 合領域とそれに続くサブゲノミックフラグメントのウイルス転写が減少されるよ うに修正された第２のウイルス接合領域、アルファウイルスRNAポリメラーゼ認 識配列及び転写の終了を制御する３’配列、を含んで成るアルファウイルスcDNA ベクター構成体。 ７．前記アルファウイルスがアウウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロ ス・リバーウイルス、セムリキ森林ウイルス及びマヤロウイルスから成るグルー プの中から選択されている、請求の範囲第１項〜第６項に記載のベクター構成体 。 ８．前記アルファウイルスがシンドビスウイルスである請求の範囲第１項〜第 ６項に記載のベクター構成体。 ９．非相同配列を含む、請求の範囲第１項〜第６項に記載のベクター構成体。 10．100以上の塩基の非相同ヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第９項に記 載のベクター構成体。 11．３kb以上の非相同ヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第９項に記載のベ クター構成体。 12．５kb以上の非相同ヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第９項に記載のベ クター構成体。 13．８kb以上の非相同ヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第９項に記載のベ クター構成体。 14．前記選択された非相同配列が、IL−１，IL−２，IL−３，IL−４，IL−５ ，IL−６，IL−７，IL−８，IL−９，IL−10，IL−11，IL−12，IL−13，IL−14 ，IL−15，γ−IFN，Ｇ−CSF及びGM−CSFから成るグループの中から選択された タンパク質をコードする配列である、請求の範囲第９項に記載のベクター構成体 。 15．前記選択された非相同配列が、インフルエンザウイルス、HPV，HBV，HCV ，EBV，HIV，HSV及びCMVから成るグループの中から選択されたウイルスから得ら れる、請求の範囲第９項に記載のベクター構成体。 16．HPVから得られる非相同配列が、E5，E6，E7及びL1から成るグループの中 から選択されている、請求の範囲第15項に記載のベクター構成体。 17．前記選択された非相同配列が、HIV gp 120及びgagから成るグループの中 から選択されたHIVタンパク質をコードする、請求の範囲第９項に記載のベクタ ー構成体。 18．前記選択された非相同配列がアンチセンス又はリボザイム配列である、請 求の範囲第９項に記載のベクター構成体。 19．前記アンチセンス配列が、インフルエンザウイルス、HPV，HBV，HCV，HIV ，HSV及びCMVをコードする配列から成るグループの中から選択されている、請求 の範囲第18項に記載のベクター構成体。 20．アルファウイルス構造タンパク質を全く含んでいない、請求の範囲第１項 〜第６項に記載のベクター構成体。 21．選択された非相同（配列）が前記ウイルス接合領域から下流に位置づけら れている、請求の範囲第１項、第２項、第４項又は第５項に記載のベクター構成 体。 22．選択された非相同配列が前記第２のウイルス接合領域から下流に位置づけ されている、請求の範囲第３項又は第６項に記載のベクター構成体。 23．前記ウイルス接合領域に続いて位置づけされているポリリンカーをさらに 含んで成る、請求の範囲第21項に記載のベクター構成体。 24．前記ポリリンカーが野生型アルファウイルス制限エンドヌクレアーゼ認識 配列を含まない、請求の範囲第21項に記載のベクター構成体。 25．前記選択された非相同配列が、アルファウイルス非構造タンパク質をコー ドする前記ヌクレオチド配列内に位置づけられている、請求の範囲第９項に記載 のベクター構成体。 26．前記ウイルス接合領域がヌクレオチド番号7579〜ヌクレオチド7597までの 図１に示されているようなヌクレオチド配列から成る、請求の範囲第１項又は第 ４項に記載のベクター構成体。 27．前記第２のウイルス接合領域から下流に位置づけされたE3アデノウイルス 遺伝子をさらに含んで成る、請求の範囲第３項又は第６項に記載のベクター構成 体。 28．前記第１のウイルス接合領域と前記第２のウイルス接合領域の間に位置づ けられたレトロウイルスパッケージング配列をさらに含んで成る請求の範囲第３ 項及び第６項に記載のベクター構成体。 29．機能的ウイルス接合領域を含まない分離された組換え型アルファウイルス ベクター。 30．サブゲノミックフラグメントの減少したウイルス転写を生成する分離され た組換え型アルファウイルスベクター。 31．１つのプロモーター及び単数又は複数のアルファウイルス構造タンパク質 を含み、このプロモーターがこのアルファウイルス構造タンパク質の発現を導く ことのできるものである、発現カセット。 32．前記アルファウイルス構造タンパク質がアルファウイルスカプシドタンパ ク質である、請求の範囲第31項に記載の発現カセット。 33．前記アルファウイルス構造タンパク質がシンドビス構造タンパク質6K，E3 ，E2及びE1から成るグループの中から選択される、請求の範囲第31項に記載の発 現カセット。 34．プロモーター、単数又は複数のアルファウイルス構造タンパク質及び非相 同リガンド配列を含み、このプロモーターは前記アルファウイルス構造タンパク 質及び前記非相同配列の発現を導くことのできるものである、発現カセット。 35．前記非相同リガンド配列が、VSVG，HIV gp 120及びCD4から成るグループ の中から選択されている、請求の範囲第34項に記載の発現カセット。 36．前記プロモーターが、MuLV，MMTV、アルファウイルス接合領域、CMV及びV A1 RNAから成るグループの中から選択されている、請求の範囲第31項〜第35項に 記載の発現カセット。 37．標的細胞内への導入の時点で、感染後少なくとも72時間生存可能な感染細 胞を産生するアルファウイルス粒子。 38．アルファウイルス粒子の感染後、少なくとも72時間生存可能である標的細 胞。 39．ポリ−Ａテイルをさらに含んで成る、請求の範囲第１項〜第３項に記載の ベクター構成体。 40．標的細胞内への導入の時点で、感染後少なくとも72時間生存可能である感 染細胞を産生する組換え型アルファウイルス粒子において、アルファウイルス粒 子での感染を受けた標的細胞内で少なくとも１つの抗原又はその修正された形態 の発現を導くベクター構成体をも支持しており、この抗原又はその修正された形 態が動物の体内で免疫応答を刺激できるものである、組換え型アルファウイルス 。 41．発現された抗原が細胞媒介型免疫応答を惹起する、請求の範囲第40項に記 載の組換え体粒子。 42．発現された抗原がHLAクラスＩ制限免疫応答を惹起する、請求の範囲第40 項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 43．発現された抗原がさらにHLAクラスII制限免疫応答を惹起する、請求の範 囲第40項に記載の組換え型アルファウイルス。 44．アルファウイルス粒子での感染を受けた細胞内での緩和剤の発現を導くこ とのできるベクター構成体を支持する組換え型アルファウイルス粒子において、 前記緩和剤は病原性にとって必要な病原性作用物質の機能を阻害することのでき るものである、組換え型アルファウイルス粒子。 45．病原性作用物質がウイルスであり、阻害される機能は、感染を受けた細胞 からのウイルスの退出、吸着、複製、遺伝子発現、アッセンブリーから成るグル ープの中から選択されている、請求の範 囲第44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 46．病原性作用物質がガン性細胞又はガン促進成長因子であり、阻害される機 能し、生存可能性、細胞複製、外部シグナルに対する変化した感受性、及び抗オ ンコ遺伝子の産生又はその突然変異形態の産生の欠如から成るグループの中から 選択されている、請求の範囲第44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 47．病原性作用物質と結びつけられた１つの実体がその細胞内に存在すること に応答して、この感染した標的細胞内での毒性緩和剤の発現を導く、請求の範囲 第44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 48．緩和剤が病原性遺伝子の発現を選択的に阻害することのできるものである 、請求の範囲第44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 49．緩和剤が、病原性作用物質により産生されたタンパク質の活性を阻害でき るものである、請求の範囲第44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 50．緩和剤が、病原性のために必要であるRNA配列に対し相補的なアンチセン スRNAを含んでいる、請求の範囲第44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子 。 51．緩和剤が、病原性にとって必要なRNA配列に対し相補的なセンスRNAを含ん でいる、請求の範囲第44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 52．緩和剤が、病原性作用物質の欠陥構造タンパク質を含み、このタンパク質 が病原性作用物質のアッセンブリーを阻害できるものである、請求の範囲第44項 に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 53．病原性作用物質の活性阻害物質へとそうでなければ不活性で ある前記物質を活性化することのできる遺伝子産物の発現を導く、請求の範囲第 44項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 54．ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子産物の発現を導く、請求の範囲第44項に 記載の組換え型アルファウイルス粒子。 55．病原性RNA分子に特異的なリボザイムとして機能するRNA分子の発現を導く 、請求の範囲第43項に記載の組換え型アルファウイルス粒子。 56．前記シンドビスウイルスでの感染を受けた標的細胞内で免疫系の単数又は 複数の要素を抑制することのできる遺伝子の発現を導く、組換え型アルファウイ ルス粒子。 57．レトロウイルスでの感染を受けた標的細胞内で少なくとも１つの抗原又は その修正された形態の発現を導く組換え型アルファウイルス粒子で、感受性ある 標的細胞を感染させることを含み、前記抗原又はその修正された形態が動物の体 内での免疫応答を刺激することのできるものである、抗原に対する免疫応答を刺 激する方法。 58．標的細胞はインビボで感染を受ける、請求の範囲第57項に記載の方法。 59．発現された抗原がHLAクラスＩ−制限免疫応答を惹起する、請求の範囲第5 7項に記載の方法。 60．発現された抗原がさらにHLAクラスII−制限免疫応答を惹起する、請求の 範囲第57項に記載の方法。 61．発現された抗原がHIVタンパク質又はその修正された形態である、請求の 範囲第57項に記載の方法。 62．標的細胞を感染させる段階の前又は後に、クラスＩ又はクラスIIのMHCタ ンパク質又はその組合せ或いはCD3，ICAM-1，LFA-3又はその類似体から成るグル ープの中から選択されたタンパク質のいずれかをコードする核酸分子で標的細胞 を感染させることを含む、 請求の範囲第57項に記載の方法。 63．アルファウイルス粒子の感染を受けた細胞内で緩和剤の発現を導く組換え 型アルファウイルス粒子で、感受性ある標的細胞を感染させることを含み、この 緩和剤が病原性にとって必要な病原性作用物質の機能を阻害できるものである、 病原性作用物質を阻害する方法。 64．病原性作用物質がガン性細胞又はガン促進成長因子であり、阻害される機 能が、生存可能性、細胞複製、外部シグナルに対する変性した感受性及び抗オン コ遺伝子の産生の欠如から成るグループの中から選択されたものである、範囲第 63項に記載の方法。 65．病原性作用物質と結びつけられた実体が感染標的細胞の中に存在すること に応答して、シンドビス粒子がこの細胞内の毒性緩和剤の発現を導く、範囲第63 項に記載の方法。 66．緩和剤には、病原性にとって必要なRNA配列に対して相補的なアンチセン スRNAが含まれる、範囲第63項に記載の方法。 67．緩和剤には、病原性にとって必要なRNA配列に対して相補的なセンスRNAが 含まれる、範囲第63項に記載の方法。 68．緩和剤には病原性作用物質の欠陥構造タンパク質が含まれており、このタ ンパク質が病原性作用物質のアッセンブリーを阻害できるものである、範囲第63 項に記載の方法。 69．シンドビス粒子が、病原性作用物質の活性阻害物質へとそうでなければ不 活性な前駆物質を活性化させることができる遺伝子産物の発現を導く、範囲第63 項に記載の方法。 70．シンドビス粒子がヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子産物の発現を導く、範 囲第63項に記載の方法。 71．シンドビス粒子が、その感染を受けかつ病原性作用物質を含む標的細胞の 表面上で、リポーティング産物を発現する、範囲第63 項に記載の方法。 72．アルファウイルス粒子の感染を受けた細胞内での遮断要素の発現を導く組 換え型アルファウイルス粒子で感受性標的細胞を感染させることを含み、ここで この遮断要素はレセプタ／作用物質の相互作用が遮断されるようにレセプター又 は作用物質に対し結合できるものである、１つの細胞に結びつけられたレセプタ に対する作用物質の結合を阻害する方法。 73．請求の範囲第41項〜第57項のいずれかに記載のアルファウイルス粒子の感 染を受けた半ビボ細胞。 74．レトロウイルス構成体を支持するアルファウイルス粒子の感染を受けた半 ビボ細胞。 75．生理学的に受容可能な担体又は希釈剤と組合わせた形で、請求の範囲第41 項〜第57項のいずれか１項に記載のアルファウイルス粒子を含む薬学組成物。 76．アルファウイルス粒子を産生するパッケージング細胞系統。 77．アルファウイルス粒子を産生する哺乳動物パッケージング細胞系統。 78．アルファウイルス粒子を産生する哺乳動物でないパッケージング細胞系統 。 79．アルファウイルス粒子を産生する昆虫パッケージング細胞系統。 80．前記昆虫パッケージング細胞が蚊パッケージング細胞である、請求の範囲 第79項に記載のパッケージング細胞系統。 81．パッケージング細胞系統が、ベクター構成体の導入時点で、ヒト細胞を感 染させることのできるシンドビス粒子を産生する、請求の範囲第80項に記載のパ ッケージング細胞系統。 82．アルファウイルスベクターのパッケージング及び産生に適し たレトロウイルスパッケージング細胞系統。 83．シンドビス阻害遺伝子を発現することのできる発現ベクターをさらに含む 、請求の範囲第76項〜第82項のいずれか１項に記載のパッケージング細胞系統。 84．組換え型アルファウイルス粒子を産生することのできるアルファウイルス 産生者細胞系統。 85．自律的にであるか又は単数又は複数の要因に応答して細胞内で複製するこ とのできる非相同ヌクレオチド配列及び転写終了配列を発現することのできる構 成体である、５’プロモーターを含む、真核性重層ベクター開始系。 86．自律的にであるか又は単数又は複数の要因に応答して細胞内で複製するこ とのできる非相同RNA配列及び転写終了配列を発現することのできる構成体でき る、５’プロモーターを含むDNA真核性重層ベクター開始系。 87．単数又は複数の非相同ヌクレオチド配列を発現することのできる前記構成 体がシンドビスcDNAベクター構成体である、請求の範囲第85項及び第86項に記載 の真核性重層ベクター開始系。 88．前記構成体が、ポリオウイルス、ライノウイルス、ポックスウイルス、レ トロウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス 、ヘルペスウイルス、SV40ウイルス、HIV、はしかウイルス、アストロウイルス 、セムリキ森林熱ウイルス及びコロナウイルスから成るグループの中から選択さ れたウイルスベクター構成体であ、請求の範囲第85項及び第86項に記載の真核性 重層ベクター開始系。 89．さらにポリアデニル化配列を含む、請求の範囲第85項及び第86項に記載の 真核性重層ベクター開始系。 90．温血動物に対して、請求の範囲第85項〜89項のいずれか１項 に記載の真核性重層ベクター開始系を投与することを含んで成る、温血動物に対 して非相同性ヌクレオチド配列を送り出すための方法。
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