DE69426649T2 - Spezifisch und paarweise bindende verbindungen, mit eine kovalent, in der bindungsstelle gebunden chemischen gruppe; ihre herstellung und auswahl - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft Elemente eines spezifischen Bindungspaars (sbp), die eine Bindungsstelle für ein komplementäres sbp-Element enthalten. Insbesondere betrifft sie sbp-Elemente, vor allem Repertoires davon, in denen eine chemische Gruppe spezifisch an einem Aminosäurerest innerhalb der Bindungsstelle eingebaut ist. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung und die Selektion solcher Repertoires und die Selektion eines ersten sbp-Elements mit Bindungsspezifität für ein zweites sbp-Element von Interesse aus einem Repertoire. Das sbp-Element kann eines sein, in dem die Bindungsstelle durch Bindungsregionen von variablen Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten- Domänen gebildet wird.
• Die WO 92/01047 offenbart, dass Polypeptide, die Elemente spezifischer Bindungspaare sind, einschließlich von Antikörperfragmenten, an der Oberfläche von Bakteriophagen freigelegt werden können und dass sie komplementäre Elemente des spezifischen Bindungspaars binden, z. B. Antigen im Fall von Antikörper. Das erste sbp-Element mit gewünschten Bindungseigenschaften kann direkt unter Ausnutzung dieser Eigenschaft selektiert werden. Die darin dargelegten Prinzipien wurden anschließend in den Patentanmeldungen WO 92/20791, WO 93/06213, WO 92/11236 und WO 93/19172 weiter vertieft. Es wurden Phagenbanken hergestellt, die Antikörper-Repertoires freilegen, z. B. aus Lymphozyten von menschlichem Peripherblut und den Milzen immunisierter Tiere sowie spezifische isolierte Antikörper. In WO 92/01047 wird beschrieben, wie V-Gen- Repertoires zum Freilegen auf Bakteriophagen durch Kombination nicht-neugeordneter V-Gene mit D- und J-Segmenten in vitro hergestellt werden können. Antikörper gegen eine Vielzahl von Antigenen wurden aus solchen auf Phagen freigelegten künstlich neuangeordneten V-Gen-Repertoires selektiert (H. R. Hoogenboom & G. Winter, J. Mol. Biol. 227, 381-388 (1992); WO 93/06213 und WO 93/11236).
• Die chemische Vielfalt dieser kodierten Banken ist jedoch auf natürliche Aminosäuren beschränkt. Es wäre wünschenswert, andere reaktive Gruppen an der Bindungsstelle von sbp-Elementen (z. B. Antikörper) einbauen zu können. Diese hätten zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten.
• Die Entwicklung von Antikörper-basierten Biosensoren (siehe J. R. North, Trends Biotechnol. 3, 180-186 (1985)) war im Hinblick auf die Fähigkeit eingeschränkt, Erkennungs- und Effektorfunktionen im gleichen Molekül zu kombinieren. Die Transduktion des Antigen-Bindungsereignisses müsste durch ein alternatives Mittel, wie z. B. Fluorophore, Luminophore oder Redoxgruppen, vermittelt werden. Diese Reportergruppen sollten idealerweise integraler Bestandteil der Antikörper-Bindungsstelle sein, so dass Antigen-Bindung zu einer Veränderung der Mikroumgebung der Gruppen und zu einer entsprechenden Veränderung der Fluoreszenz, der Lumineszenz oder des Redoxpotenzials führt.
• In ähnlicher Weise würde die Konstruktion katalytischer Antikörper (R. A. Lerner et al., Science 252, 659-667 (1991)) durch Einschleusen nukleophiler Gruppen und Nicht-Peptidyl-Cofalktoren, wie z. B. Metallionen, Hämen und Flavinen (ein übliches Merkmal zahlreicher Enzyme) in die Antikörper-Bindungsstelle erleichtert werden. Diese modifizierenden Gruppen würden idealerweise kovalent an der Antigen-Bindungsstelle eingearbeitet werden, wodurch sie integrale Bestandteile des Paratops werden. Solche chemisch modifizierten Antikörper könnten dann direkt als Detektionsmittel in Immungssay-Anwendungen, wie z. B. im zeitaufgelösten Fluoreszenz-Immungssay, oder direkt in der Katalyse eingesetzt werden.
• Die Anmelder zeigen hierin auf, dass chemische Gruppen kovalent in ein Repertoire von auf Phagen freilliegenden sbp-Elementen einbezogen und sbp-Elemente aus diesen Repertoires mit kovalent gebundenen Gruppen an der Antigen-Bindungsstelle selektiert werden können. Die Anmelder haben solche Repertoires "chemosynthetische Bibliotheken" genannt.
• Die Nützlichkeit des Einarbeitens chemischer Gruppen an den Antigen-Bindungsstellen von Antikörpermolekülen wurde bereits von anderen Forschern bestätigt, besonders zur Derivatisierung katalytischer Antikörper. Es wurde rationales Protein-Engineering angewandt (V. A. Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 6654-6658 (1990); B. L. Iversen et al., Science 249, 659-662 (1990); D. G. Gregory et al., Protein Engineering 6, 29-35 (1993)), wobei Metallkoordinationsstellen konstruiert wurden, um Metallionen in die Antigen-Bindungsstelle zu chelatieren, z. B. in den Leichtketten-Komplementaritäts-Determinations-Regionen. Roberts et al. schlagen vor, dass die Kombination einer spezifischen Leichtkette oder Schwerkette, die eine katalytische Metallstelle mit einer Biblio- I thek komplementärer Ketten enthält, die gegen potenzielle Substrate oder Analoge im Übergangsstadium gebildet sind, die Isolierung katalytischer Antikörper mit gewünschten Aktivitäten und Spezifitäten verbessern sollte. Gregory et al. berichten, dass eine Zink-Bindungsstelle aufgrund ihrer Konstruktion in den Anti-Lysozym-Antikörper HyHEL5 eingebaut wurde und dass sowohl Antigenbindung als auch Metallchelatbildung beibehalten wurden.
• C. F. Barbas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6385-6389 (1993); veröffentlicht im Juli 1993) schlugen die Verwendung einer iterativen Strategie der Zufalls-Mutagenese und Selektion für die Isolierung katalytischer Antikörper vor. Die Autoren regen an, dass sich an die CDR-Mutagenese zur Schaffung einer Metall-Bindungsstelle Mutagenese anderer CDRs anschließen könnte, um katalytische Metallo-Antikörper zu erzeugen, die sowohl Metall als auch ein Hapten binden.
• Barbas et al. begannen mit einem bereits existierenden Antikörper-Fab-Fragment mit Spezifität für Tetanustoxoid, das sie mutagenisierten, auf Phagen freilegten und aus den Fab-Fragment-Bibliotheken selektierten, die sich an Metall binden. Sie schlagen das Diversifizieren der isolierten Metallbindungs-Fab-Fragmente durch Kettenshuffling oder Mutagenese anderer CDRs und die anschließende Selektion vor, um Spezifität für das Substrat zu erzielen; die Autoren berichteten aber bislang nicht, ob dies erfolgreich durchgeführt werden kann. In Beispiel 2 beschreiben die Anmelder die Konstruktion einer Bibliothek von scFv-Fragmenten, die synthetisch aus Human-V-Genen hergestellt werden können, wobei die Antigen-Bindungsstellen einen Aminosäurerest enthalten, der spezifisch modifiziert sein kann, um eine funktionelle Gruppe einzuführen. Der Rest wird vor jedem Selektionsvorgang spezifisch chemisch derivatisiert, sodass Antikörperfragmente identifiziert werden, die sich an Antigen binden, wobei ein Nicht-Proteinelement an der Antigen-Bindungsstelle eingebaut ist.
• Wird et al., Nature 341, 544-546 (1989), schlugen das Konzept von Fv-Fragmenten vor, worin die VH-Domäne Substrat bindet und Seitenketten oder prosthetische Gruppen in der Vx-Domäne den Übergangszustand stabilisieren oder das Substrat angreifen.
• Es wird hierin aufgezeigt, dass sbp-Elemente (z. B. Antikörperfragmente) erhalten werden können, die von Derivatisierung abhängen, um sich fest an komplementäres sbp-Element (z. B. Antigen) zu binden. Bereits veröffentlichte Arbeiten über Metallo-Antikörper mutmaßten, dass das Metall nicht an der primären Erkennung von Antigen beteiligt sein würde (Roberts et al., 1990, s.o.; Gregory et al., 1993, s.o.). Kein Antikörperfragment wurde bislang von anderen Forschern isoliert, in dem die Erkennung von Antigen absolut von der Gegenwart von Metall an der Antigen-Bindungsstelle abhängt.
• Die Erfindung bietet einen neuartigen Ansatz zum Erhalt erster sbp-Elemente mit einer Bindungsstelle für zweite sbp-Elemente, wobei die Probleme oder Schwierigkeiten des Stands der Technik überwunden werden können.
• Sofern der Kontext nichts anderes erfordert, bezieht sich der Ausdruck "Antikörper" oder "Antikörperfragment" hierin auf ein erstes sbp-Element, dessen Bindungsstelle durch Assoziation einer ersten Polypeptiddomäne, die eine Bindungsregion einer variablen Immunglobulin-Schwerketten-Domäne (VH) umfasst, und einer zweiten Polypeptiddomäne gebildet wird, die eine Bindungsregion einer variablen Immunglobulin-Leichtketten- Domäne (VL) umfasst, umfassend das Fab-Fragment, bestehend aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen, das Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Antikörpers, einkettiges Fv (scFv), umfassend eine VL-Domäne und eine VH-Domäne (üner einen Peptidlinker verbunden), F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei verbundene Fab-Fragmente umfasst, bispezifische einzelkettige Fv-Dimere (PCT/US92/09965) und Diakörper, zweiwertige oder bispezifische Fragmente, die durch Genfusion konstruiert werden (P. Holliger et al., s.o.; PCT/GB93/02492).
• Der Ausdruck "Repertoire" dient dazu, die Diversität, d. h. die Sequenzvielfalt, auszudrücken und impliziert im Allgemeinen eine Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen, z. B. in der Größenordnung von Millionen (10&sup7;-10&sup9;-10¹²-10¹&sup4;). Ein Repertoire an Antikörpern oder Antikörperfragmenten kann eine Vielfalt aufweisen, die für einen Organismus, wie z. B. eine Maus oder einen Menschen, repräsentativ ist. Man kann davon ausgehen, dass man aus einem Repertoire erster sbp-Elemente eine große Anzahl unterschiedlicher erster sbp-Elemente isolieren kann, die jeweils in der Lage sind, eines einer Vielzahl unterschiedlicher zweiter sbp-Elemente zu binden.
• Die Erfindung bietet ein genetisch diverses Repertoire erster sbp-Elemente mit jeweils einer Bindungsstelle, die eine chemische Gruppe umfasst, die an einem oder mehreren Aminosäureresten innerhalb der Bindungsstelle kovalent gebunden ist. Für die chemische Gruppe kodiert keine Nukleinsäure zum Exprimieren der ersten sbp-Elemente; stattdessen wird sie durch kovalente Modifikation nach Produktion der Polypeptide eingeführt. Ein oder mehrere erste sbp-Elemente mit Bindungsspezifität für ein zweites sbp- Element (Antigen) von Interesse kann/können aus dem Repertoire ausgewählt werden, z. B. mittels Bindungsaffinität. Von besonderem Interesse und Vorteil ist die Fähigkeit, erste sbp-Elemente zu selektieren, deren Bindung an ein zweites sbp-Element von Interesse durch die Gegenwart der chemischen Gruppe verstärkt wird oder sogar vollständig davon abhängt. Ein chemisch modifiziertes sbp-Element kann ein zweites sbp-Element von Interesse mit höherer Affinität binden als ein nichtmodifiziertes, genetisch identisches sbp-Element, wenn die Bindung unter den gleichen Bedingungen verglichen wird. Es kann in einigen Fällen auch überhaupt keine Bindung stattfinden, ohne dass die chemische Gruppe innerhalb der Bindungsstelle des ersten sbp-Elements kovalent gebunden ist. Dann bildet die chemische Gruppe einen integralen Bestandteil der Bindungsstelle und ist für das zweite sbp-Element (Antigen im Fall von Antikörper) essentiell, um nicht-kovalente Bindungen damit zu bilde, um Bindung mit hoher Affinität zu erzielen.
• Die chemische Gruppe wird an einem oder mehreren spezifischen chemisch modifizierbaren Rest(en) eingeführt. Ein chemisch modifizierbarer Aminosäurerest ist ein Aminosäurerest, der mit einem ausgewählten chemischen Reagens unter spezifischen Bedingungen modifiziert werden kann. Die Aminosäure kann in der Bindungsstelle einzigartig oder einzigartig modifizierbar oder auch selektiv oder präferenziell modifizierbar sein (gegenüber anderen vorhandenen Aminosäuren). Beispielsweise kann ein Cysteinrest in die Bindungsstelle eingebracht werden und über seine Thiogruppe für die chemische Modifizierung zur Verfügung stehen. Es können andere Cysteine im Molekül vorhanden sein (z. B. in einer VH-Domäne), doch im Allgemeinen würden sie über Disulfidbrücken gepaart sein und daher für die chemische Modifizierung nicht zur Verfügung stehen, oder sie stehen zumindest nicht in dem Ausmaß zur Verfügung, wie jenes, das in die Bindungsstelle eingeführt wurde, die daher selektiv oder präferenziell modifizierbar ist. Es ist auch möglich, eine Aminosäure im Vergleich zu anderen Aminosäuren des gleichen Typs innerhalb des sbp-Elements präferenziell modifizierbar zu machen, indem ihre Umgebung einem "Engineering" unterzogen wird, z. B. durch ihre Positionierung innerhalb des Moleküls neben einer anderen Aminosäure mit bestimmten Eigenschaften. Beispielsweise würde eine Aminogruppe neben einer Carboxylatgruppe nukleophiler und selektiv modifizierbar werden, selbst wenn sie innerhalb der Bindungsstelle nicht einzigartig ist.
• Das Repertoire kann eine einzigartige Aminosäure in jedem ersten sbp-Element enthalten, eine Aminosäure, die in jedem ersten sbp-Element oder mehr als einem präferenziell modifizierbaren Aminosäurerest in jedem ersten sbp-Element einzigartig modifizierbar ist. Das Repertoire muss an einem oder mehreren spezifischen Aminosäureresten reproduzierbar modifizierbar sein, so dass eine reproduzierbare Modifikation ausgewählter Repertoires und Polypeptide, die aus aus einem Repertoire ausgewählten Klonen exprimiert werden, vorgenommen werden kann.
• Die vorliegende Erfindung weist zusätzliche Merkmale auf, die sie vom Stand der Technik unterscheiden. Die chemische Gruppe ist an der Stelle kovalent eingebaut und kann eine entscheidende Determinante der Bindungsstelle bilden. Diese kovalente Modifikation ermöglicht den Einbau einer größeren Anzahl an Gruppen, insbesondere von Reportergruppen oder Cofaktoren für die Katalyse. In einer Ausführungsform der Erfindung sind eine oder mehrere spezifisch modifizierbare Aminosäuren an der Bindungsstelle eingebaut. Dies erlaubt erstmals die Wechselwirkung großer organischer Gruppen, wie z. B. der fluoreszierenden Reportergruppe 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD). Es gibt kein früheres Beispiel dafür, dass ein gesamtes Repertoire an Bindungsproteinen derivatisiert und Bindemittel isoliert wurden. Erstmals wurde ein scFv-Fragment (kodiert von Klon SSL-34, Beispiel 2) isoliert, das der Derivatisierung mit einem Nicht-Protein-Element bedarf, um detektierbare Bindung an Antigen zu erzielen.
• Der Einbau einer kovalenten Modifikation zur Schaffung eines chemosynthetischen Repertoires ist mit einigen Schwierigkeiten verbunden. Erstens muss ein Aminosäurerest in der Bindungsstelle vorhanden sein, der spezifisch mit einem Reagens modifizierbar ist, um einen derivatisierten Antikörper zu ergeben. Zweitens bewirkt die Einführung einer chemischen Gruppe in ein Bindungsprotein, wie z. B. Antikörper, mit bereits existierenden Bindungsproteinen wahrscheinlich Änderungen hinsichtlich der Eigenschaften der Bindung. Die Modifikation an einer Stelle außerhalb der Bindungsstelle führt wahrscheinlich dazu, dass sich die eingeschleuste Gruppe viel weniger als Reporter- oder katalytische Gruppe eignet. Die Erfindung löst diese Probleme, indem die Auswahl von Bindungsproteinen ("ersten sbp-Elementen") ermöglicht wird, die ein zweites sbp-Element von Interesse binden können, wenn die eingeführte Gruppe an der Bindungsstelle vorhanden ist. Viele der Bindungsproteine (z. B. Antikörper) binden nur das Ziel von Interesse (z. B. Antigen) oder zeigen stark verbesserte Bindung, wenn sie chemisch modifiziert sind.
• Dies ist ein Unterschied zu bisherigen Ansätzen zur Modifikation eines einzelnen Antikörpers, von dem anfangs bekannt ist, dass er das Antigen von Interesse bindet. Da in der Erfindung die chemische Gruppe an der Bindungsstelle vorhanden ist, ist es wahrscheinlicher, dass ihre Eigenschaften durch Bindung von Antigen modifiziert werden. Dies macht das Verfahren zu einer sehr wirkungsvollen Technik des Einbaus von Reportergruppen, wie z. B. fluoreszierenden Gruppen für Immungssays, da es viel wahrscheinlicher ist, dass sich die Eigenschaften dieser Gruppen verändern, wenn sie sich nahe an der Stelle befinden, wo sich der Antikörper bindet. Cofaktoren für die Katalyse müssen sich auch nahe an jener Stelle befinden, an der sich das Substrat in katalytischen Antikörpern bindet. Eine Ausführungsform dafür wäre die Bereitstellung des Cofaktors auf einer fixierten Leichtkette und ausgewählten Schwerketten, die Substratspezifität Fiefern. Gruppen können an der Antigen-Bindungsstelle eingeführt werden, die hochaffine Bindung des Antigens begünstigen oder eine bestimmte Selektivität fördern, um z. B. zwischen Antigenmolekülen unterschiedlicher Größen zu differenzieren. Die in vitro-Erzeugung der Bindungsmodule ermöglicht die in vitro-Modifizierung dieser Strukturen, so dass auch Nicht-Peptidylelemente enthalten sind.
• Obwohl synthetische Gruppen über Disulfidbindung an jedem zugänglichen oberflächenexponierten Cysteinrest konstruiert werden können, sind die Antigenbindungs- CDR-Regionen die nahe liegenden Ziele der Modifizierung. Modifizierung der Leichtketten-CDR3 sollte dazu führen, dass das synthetische Element einen integralen Bestandteil der Bindungsstelle bildet, und trotzdem die Bildung von Antigenkontakten durch die dominante Schwerketten-CDR3 ermöglichen. Die Diversität und Funktionalität von Antikörpern kann daher über das Maß gesteigert werden, das mit bestehenden Antikörperbanken möglich ist, indem diese nicht-kodierten Elemente miteinbezogen werden.
• Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen es praktisch jeder chemischen Gruppe, in die Bindungsstelle eingebaut zu werden und eine essentielle Komponente für wirksame Bindungsaktivität zu sein. Die ersten sbp-Elemente im Repertoire können mit einer Oberflächenkomponente jedes Organismus fusioniert werden, um an der Oberfläche freizuliegen. In chemosynthetischen Bibliotheken, die auf filamentösem Bakteriophagen freiliegen, exprimiert jeder Klon ein erstes sbp-Element als Fusionsprotein auf der Phagenoberfläche, indem das entsprechende Gen insertiert wird, das für eine Oberflächenkomponente wie etwa das virale cpIII-Hüllenprotein kodiert. Nukleinsäure, die für das Bindungsprotein kodiert, das auf der Oberfläche eines Organismus freiliegt, kann innerhalb des Organismus verpackt sein, um die Gewinnung nach der Selektion des ersten sbp-Elements zu vereinfachen, welches das zweite sbp-Element von Interesse binden kann.
• Die Selektion eines ersten sbp-Elements aus einem Repertoire erfolgt vorzugsweise durch Bindung an das zweite sbp-Element von Interesse.
• Nach der Selektion eines ersten sbp-Elements, das auf der Oberfläche eines Organismus freiliegt, der ein Nukleinsäuremolekül enthält, das für das erste sbp-Element kodiert, kann die Nukleinsäure aus dem Organismus gewonnen und verwendet werden; es können auch andere Nukleinsäuremoleküle mit der gleichen Sequenz, andere Nukleinsäuremoleküle, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, oder eine Mutante oder ein Derivat davon zur Produktion des ersten sbp-Elements mit einer Bindungsstelle verwendet werden, die das zweite sbp-Element von Interesse binden kann.
• Individuelle erste sbp-Elemente mit der gewünschten Spezifität, z. B. für ein Antigen, können aus der komplexen Bibliothek unter Anwendung herkömmlicher Screening-Verfahren isoliert werden (z. B. beschrieben von E. Harlow und D. Lane, 1988, s.o.; E. Gherardi et al., J. Immunol. Meth. 126, 61-68 (1990)).
• Die Selektion ist oft die Elution aus einer Affinitätsmatrix mit einem Liganden. Die Elution mit steigenden Liganden-Konzentrationen sollte freiliegende Bindungsmoleküle stärkerer Affinität eluieren.
• Von einer Affinitätsmatrix, die das stark gebundene erste sbp-Element bewahrte, das auf der Oberfläche eines Organismus freiliegt, wurde die DNA extrahiert, z. B. durch Kochen in SDS-Lösung. Extrahierte DNA kann dann direkt dazu verwendet werden, E. coli- Wirtszellen zu transformieren. Alternativ dazu können die Kodiersequenzen amplifiziert werden, z. B. unter Anwendung von PCR mit geeigneten Primern, und dann in einen Vektor zur Expression insertiert werden.
• Wenn man die Selektion aus einer Population von Phagen, die ein Proteinmolekül mit hoher Affinität für seinen Liganden freilegen, vornehmen möchte, besteht eine bevorzugte Strategie darin, eine Population von Phagen an eine Affinitätsmatrix zu binden, die eine geringe Menge an Ligand enthält. Es existiert Kompetition zwischen Phagen, die Proteine hoher und niedriger Affinität aufweisen, um die Bindung an den Liganden auf der Matrix. Phagen, die hochaffines Protein aufweisen, werden bevorzugt gebunden, und Protein mit geringer Affinität wird weggewaschen. Das Protein mit hoher Affinität wird dann durch Elution mit dem Liganden oder durch andere Vorgangsweisen gewonnen, welche die Phagen aus der Affinitätsmatrix eluieren.
• Für die Gewinnung der verpackten DNA aus dem Affinitätsschritt kann die Packung einfach in Gegenwart eines homologen sbp-Elements, das mit der Packung um die Bindung an ein komplementäres sbp-Element konkurriert, eluiert werden; oder sie könnte durch Kochen oder durch proteolytische Spaltung des Proteins entfernt werden. Es sind Fachleuten auf dem Gebiet auch andere Verfahren bekannt, z. B. die Zerstörung der Bindung zwischen dem Substrat und dem komplementären sbp-Element zur Freisetzung der verpackten DNA und des sbp-Elements. Das Ziel besteht jedenfalls darin, die DNA aus der Packung zu erhalten, so dass sie direkt oder indirekt zur Expression des dadurch kodierten sbp-Elements verwendet werden kann.
• Wie an anderer Stelle erörtert, kann die Bindung des selektierten ersten sbp-Elements an das zweite sbp-Element im Vergleich zur Bindung des gleichen ersten sbp-Elements ohne die chemische Gruppe, die an einer Aminosäure (oder mehreren Aminosäuren) in der Bindungsstelle kovalent gebunden ist, verstärkt werden. Die Bindung kann von der Gegenwart der chemischen Gruppe abhängen.
• Ein Verfahren zur Bereitstellung eines diversen Repertoires eines ersten spezifischen sbp-Elements gemäß der Erfindung umfasst den Schritt des chemischen Modifizierens erster sbp-Elemente zur Einführung einer chemischen Gruppe, die kovalent an einen Aminosäurerest an der Bindungsstelle jedes ersten sbp-Elements gebunden ist. Die Bereitstellung des Repertoires des ersten sbp-Elements vor dem Schritt der chemischen Modifizierung kann die Expression aus einer Population von Nukleinsäuremolekülen umfassen, die kollektiv für das Repertoire kodieren. Die Bereitstellung der Population von Nukleinsäuremolekülen kann einen Schritt der Mutation von Nukleinsäure umfassen, die für das erste sbp-Element oder einen Polypeptidkomponenten-Teil davon kodiert (z. B. eine Polypeptidkette eines heterodimeren Bindemittels, wie z. B. eines Fab- Fragments), um ein Codon einzuführen, das für den Aminosäurerest kodiert. Ebenso kann die Nukleinsäure konstruiert werden, indem z. B. in kombinatorischer Weise Genfragmente verbunden werden. Dies kann mittels PCR erfolgen.
• Ein Ansatz zielt darauf ab, eine semisynthetische Bibliothek auf Phagen zu schaffen, indem vor jedem Selektionsschritt synthetische Gruppen in die gesamte Phagen-Bindungsprotein-Population kovalent eingebaut werden. Isolierte semisynthetische Phagen-Antikörper mit Bindungsaktivität tolerieren oder erfordern sogar die Gegenwart der synthetischen Gruppe in ihren Antigen-Bindungsstellen. Im letzteren Fall können diese Antikörper-Fragmente die besten Kandidaten zur Verwendung in einphasigen Immunassays und in der Katalyse sein. In Beispiel 1 berichten die Anmelder über die Untersuchung der Reaktivität einer einzelnen Cystein-freien Thiol-Funktionalität in der Leichtketten-CDR3 eines scFv, exprimiert als lösliches Protein oder als Fusionsprodukt mit filamentösem Phagen. Nach der Bewertung der Spezifität der Semisynthese selektierten die Anmelder in Beispiel 2 semisynthetische scFv-Aktivitäten gegen phOx mit zwei unterschiedlichen synthetischen Gruppen unter Anwendung von Disulfidersetzung oder Alkylierungsreaktion. Durch Wiederholung dieser chemischen Modifizierung einer scFv-Bibliothek vor jedem Selektionsschritt gegen das an einen Träger konjugierte Hapten 2-Phenyloxyzol- 5-on (phOx) stellten die Anmelder fest, dass mehrere Klonen, die nach vier Selektionsrunden eluierten, die Gegenwart der kovalent, gebundenen Gruppe erfordern, um ein verstärktes ELISA-Signal gegen das Antigen zu erzeugen. Ein mit dem 7-Nitrobenz-2-oxa- 1,3-diazol- (NBD-) Fluorophor selektierter Klon wurde höher charakterisiert: ein viel stärkeres ELISA-Signal wurde mit Antigen erhalten, wenn das Fluorophor in die Antigen-Bindungsstelle eingebaut war.
• Die Beispiele beschreiben die Verwendung einer einzelnen chemisch modifizierten Leichtkette in Kombination mit einem Repertoire an Schwerketten. Dies wäre problemlos auf Einbau von Gruppen in ein Repertoire von unterschiedlichen Leichtketten oder Schwerketaen in einem auf Phagen freiliegenden synthetischen Repertoire erweiterbar. Obwohl dlie einfachste Position zum Einbau von Cysteinen die CDR3 der Schwer- oder Leichtkette ist, könnten sie im Prinzip an jeder beliebigen Position in den Ketten unter Anwendung von Mutagenese oder Verbindung von Genfragmenten eingebaut werden. Obwohl Gysteine auch an anderer Stelle in einer VH-Domähne anwesend sein können, können sie Disulfidbindungen bilden und für die chemische Modifizierung nicht zur Verfügung stehen.
• Das obige grundlegende System kann verfeinert werden. Die eingeführte Gruppe kann durch eine spaltbare Gruppe wie etwa eine Disulfidbindung oder ein vizinales Diol mit dem freiliegenden Bindungsprotein verknüpft werden. Während der Selektion von Phagen mit der eingeführten Gruppe in der Bindungsstelle können Phagen vom komplementären zweiten sbp-Element unter Verwendung des Spaltungsreagens eluiert werden. Jene Phagen, in denen die Bindung von der Gegenwart der eingeführten Gruppe abhängt, sollten vorzugsweise eluiert werden, während jene, deren Bindung unabhängig ist, zurückgehalten werden.
• Die Linkerlänge zwischen der eingeführten Gruppe und der Bindungsstelle kann variieren. Dies ermöglicht die Erforschung des Raums der Bindungsstelle, um die Position der eingeführten Gruppe zu lokalisieren, die es ihr am besten ermöglicht, ihre Funktion, z. B. als Reporter oder katalytische Gruppe, zu erfüllen.
• Cysteingruppen können an mehr als einer Stelle auf dem Molekül eingeführt werden, z. B. an unterschiedlichen CDR-Resten in einem Antikörper oder Antikörperfragment. Die Modifikation kann z. B. sowohl auf Schwer- als auch Leichtketten erfolgen, wodurch Derivatisierung mit zwei eingeführten Gruppen möglich ist. Cysteine können an spezifischen Punkten innerhalb variierender CDRs eingeführt werden, indem für Cystein kodierende Codons eingebaut werden, beispielsweise an spezifischen Positionen innerhalb willkürlicher Oligonukleotide. Selbst wenn dies in einigen Fragmenten zur Derivatisierung an mehr als einer Stelle führt, erlaubt eine Selektion durch Bindung an Antigen die Selektion jener Fragmente, bei denen die Derivatisierung mit der Bindung verträglich ist. Es besteht auch die Möglichkeit des Einbaus zweier (oder mehrerer) Reste zur Modifizierung mit dem gleichen Reagens oder zweier (oder mehrerer) Reagenzien;
• noch bevorzugter können unterschiedliche Reste mit unterschiedlichen Reagenzien modifiziert werden, um unterschiedliche chemische Gruppen in die Bindungsstelle einzubauen. Dies eignet sich z. B. für katalytische Antikörper, wo die Gegenwart zweier chemischer Gruppen, wie etwa Flavin und Häm, die Katalyse einer Redoxreaktion fördern könnte.
• In einer weiteren Ausführungsform kann die Modifikation auf einer Proteinkette, z. B. einer Leichtkette, in Lösung durchgeführt werden, z. B. unter Anwendung der von M. Figini et al., J. Mol. Biol. 239, 68-78 (1994); beschriebenen Methoden. Die Leichtkette kann dann mit einer Population von Schwerketten auf Phagen und selektierten Antigen- Bindemitteln assoziiert werden. Diese Assoziation wird in jeder Selektionsrunde vor dem In-Kontakt-Bringen der Phagenpopulation mit dem Antigen wiederholt.
• Die Erfindung bietet eine neuartige Möglichkeit der Einführung von Metallionen an der Bindungsstelle eines ersten Elements eines spezifischen Bindungspaars. Chelatbildende Gruppen, wie z. B. Iminodiessigsäure, können an der Bindungsstelle, z. B. an einem Cysteinrest, eingebaut und dann eine metallhältige Lösung zugegeben werden. Die Verwendung eines Spacerarms würde größere Flexibilität verleihen, um das Metallion für die Katalyse zu positionieren, als die direkte Verwendung von Aminosäureresten zur Chelatbildung, wie es von anderen Forschern bereits gemacht wurde (Roberts et al., 1990, s.o.; Gregory et al., 1993; Barabas et al., 1993).
• Es gibt andere Möglichkeiten zur Modifizierung der Bindungsstelle von Polypeptiden. Es existieren einige Aminosäurereste, die mittels Molekülen, die spezifische funktionelle Gruppen enthalten, spezifisch derivatisiert werden können. Beispielsweise können Aminogruppen mit N-Hydroxysuccinimid-Estern, Carboxylgruppen mit Carbodiimiden, Histidine und Cysteine mit Halogenmethyfketonen und Arginin mit Glyoxalen modifiziert werden (siehe z. B. A. R. Fersht, Enzyme Structure and Mechanism, 2. Ausgabe, 1985, 248-251, W. H. Freeman, New York). Das Problem bei der Modifikation dieser Reste besteht darin, wie man jene an der Bindungsstelle modifiziert, da sie an anderen Stellen vorhanden sein können. In vielen Fällen ist es möglich, jene zu modifizieren, die sich nicht an der Bindungsstelle befinden, ohne die Aktivitität zu beeinflussen. Dies ist ein gängiges Verfahren zur Bestimmung, welche Aminosäurereste sich an der katalytischen Stelle von Enzymen befinden (Fersht et al., 1985, s.o.), da nur die Modifikation dieser Stellen die Aktivität beeinflusst.
• Einige Reagenzien, die zur Modifikation spezifischer Aminosäurereste verwendet werden können, werden von T. Imoto und H. Yamada in "Protein Function: A Practical Approach, 247-277 (1989), genannt. Zur Einführung spezifischer funktioneller Gruppen in Polypeptide kann die reaktive Gruppe dieser Reagenzien mit der funktionellen Gruppe in einem modifizierenden Reagens kombiniert werden. Wenn es z. B. gewünscht wird, ein Protein mit dem Fluorphor 7-Amino-4-methylcumann-3-essigsäure zu modifizieren, kann der N-Hydroxysuccinimidylester des Moleküls dazu dienen, Aminogruppen zu modifizieren, während N-[6-(-Amino-4-methylcumann-3-acetamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid zur Modifikation von Cysteingruppen herangezogen werden kann.
• Spezifische Modifikation an einer Antigen-Bindungsstelle von Resten, die häufiger als Cystein vorkommen, z. B. Lysin, Glutamat, Histidin oder Tyrosin, kann unter Verwendung mutierter synthetischer Segmente, wie z. B. von V-Genen, erfolgen, um die Bibliothek zu konstruieren. Wenn beispielsweise gewünscht vird, ein Lysin in CDR3 der Schwerkette spezifisch zu modifizieren, kann die Bibliothek aus Gensegmenten von VH- und /L-Domänen konstruiert werden, wo alle Lysinreste zu einer anderen Aminosäure mutiert wurden, wie z. B. Arginin. Das Lysin in VH CDR3 kann dann spezifisch chemisch modifiziert werden.
• Eine weitere mögliche Methodologie ist die Verwendung von Transglutaminase, die eine Acyl-Übertragungsreaktion zwischen der γ-Carboxamidgruppe von Glutaminresten und primären Aminen katalysiert (E. Bendixen et al., J. Biol. Chem 268, 21962-21967 (1993); K. N. Lee et al., Biochim. Biophys. Acta 1201, 1-6 (1993); T. Kanaji et al., J. Biol. Chem. 268, 11565-11572 (1993)). Dieses Enzym könnte daher Aminosäurereste aus einem Peptid über eine Peptid-Lysin-γ-Aminogruppe in einen Glutaminrest an der Bindungsstelle einführen oder über eine Peptid-Glutamingruppe in eine Lysingruppe an der Antigen-Bündungssteile einführen. Das Enzym könnte auch die Derivatisierung von Glutaminresten an der Bindungsstelle mit einem primären Amin katalysieren. Da Glutaminreste und Lysinreste in Antikörpern häufig vorkommen, wäre es wiederum vorteilhaft, die Bibliothek aus Gensegmenten aufzubauen, deren Reste zu anderen Resten mutiert wurden (außer bei jenen, wo die Modifikation gewünscht war).
• Ein weiterer Ansatz ist die Einführung chemischer Gruppen in den N- oder C-Terminus von auf Phagen freiliegenden Polypeptiden mittels Proteolyseumkehr oder chemischer Konjugation oder einer Kombination dieser zwei Verfahren (I. Fisch et al., Bioconj. Chem. 3, 147-153 (1992); H. F. Gaertner et al., Bioconjug. Chem. 3, 262-268 (1992); H. F. Gaertner et al., J. Biol. Chem 269, 7224-7230 (1994); J. Bongers et al., Biochim. Biophys. Acta 50, 157-162 (1991); R. Offord, Protein Engineering, 4, 709-710 (1991)). Diese Methoden dienten dazu, nicht-kodierte Elemente in Protein und Peptidmoleküle einzuführen. Die Anwendung dieser Verfahren zur Derivatisierung von Repertoires kann sich besonders für die Selektion von Enzymen und Rezeptor-Bindungspeptiden eignen, die Substrat oder Rezeptor nur dann binden, wenn sie mit der chemischen Gruppe modifiziert sind.
• Beispiele für Fluorophore, die eingefürht werden können, sind Fluorescein, Phycoerythrin, Cumann, NBD, Texasrot und chelatierte Lanthanidionen. Beispiele für katalytische Gruppen, die eingeführt werden können, sind Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Flavin-Mononukleotid (FMN), Cytochrome und chelatierte Metallionen, wie etwa Zink und Kupfer.
• Die vorliegende Anmeldung zeigt, dass chemische Elemente in auf Phagen freiliegende Bibliotheken eingebaut werden können, um die Diversität freiligender Bibliotheken gegenüber jener zu erhöhen, die durch genetische Kodierung erzielt werden kann. Dies kann den Schutzumfang des "Protein Engineering" von Antikörpern und anderen Proteinen, wie z. B. Enzymen, wo die Katalyse fördernde Nicht-Proteingruppen eingebaut werden können, oder von Rezeptormolekülen ausweiten.
• Andere Aspekte und Modifikationen der Erfindung sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig. Es folgt eine Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die Abbildungen.
• Fig. 1 zeigt ELISA-Signale einzelner Phagen aus Bibliothek 1, die nichtmodifiziert oder mit NBD-1A oder F-IA derivatisiert sind.
• Fig. 2 zeigt ELISA-Signale einzelner Phagen aus Bibliothek 2, die nichtmodifiziert oder mit NBD-1A oder F-IA derivatisiert sind.
• Fig. 3 zeigt ELISA-Signale einzelner Phagen aus Bibliothek 3, die nichtmodifiziert oder mit NBD-1A oder F-IA derivatisiert sind.
• Fig. 4 zeigt die Auswirkung der Modifikation löslicher scFv-Fragmente mit IA-NBD auf das ELISA-Signal, das für die zwei Klone SSL-32 und SSL-34 erhalten wurde. Lösliche einkettige Fv-Fragmente wurden durch FPLC-Gelfiltration auf Superdex 75 gereinigt, um monomere Fragmente zu ergeben, und mit IA-NBD (schwarzer Balken) modifiziert oder nichtmodifiziert belassen (schraffierter Balken).
• Fig. 5 zeigt die Spezifität löslicher scFv-Fragmente, die aus Klon SSL-34 stammen (bestimmt durch das erhaltene ELISA-Signal). Lösliche scFv-Fragmente wurden durch FPLC- Gelfiltration auf Superdex 75 gereinigt, um monomere Fragmente zu ergeben, und mit IA-NBD modifiziert (linker Teil) oder nichtmodifiziert belassen (rechter Teil). Die Antigene sind (von links nach rechts) phOx-BSA (schwarzer Balken), phOx-CSA, phOx-KLH und phOx-Polylysin, BSA.
• Alle im Text erwähnten Dokumente sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Beispiel 1: Einführung und Modifikation eines Cysteinthiols an der Antigen-Bindungsstelle eines Anti-NIP-Antikörpers als Modell
• Die in diesem Beispiel beschriebene Arbeit zeigt, dass ein Cysteinthiol an der Bindungsstelle eines Antikörpermoleküls eingebaut und spezifisch modifiziert werden kann, um eine chemische Gruppe einzuführen.
• Unter den Aminosäureketten ist das Cysteinylthiol im Allgemeinen die nukleophilste Gruppe und daher ein wertvoller Kandidat für eine schonende stellenspezifische Derivatisierung über Disulfidersetzung oder durch Alkylierung. In Abwesenheit von Denaturierungsmitteln bilden die internen Cysteine von Antikörperfragmenten Disulfidbrücken, die gegenüber Reduktion mit 20 mM DTT bei Raumtemperatur resistent sind. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Einführung eines oberflächenzugänglichen Cysteins durch stellengerüchtete Mutagenese ein Antikörperfragment produziert, das ein einzelnes Thiol zur Modifikation trägt. Die Anmelder nahmen an, dass die internen Cysteine nicht reagieren und den Faltungsweg nicht beeinträchtigen. Das Haupt-Hüllenprotein cpVIII weist keine Cysteinylreste auf, aber das Neben-Hüllenprotein cpIII, mit dem scFv genetisch fusioniert ist, enthält 8 Cysteine, die gleichmäßig in den zwei postulierten Domänen verteilt sind. Obwohl die Anmelder hofften, dass diese Cysteine Disulfidbindungen bilden, war nicht bekannt, ob sie reaktiv sein würden oder ob die Modifikation die Infektiosität des Phagen beeinträchtigen würde.
• Die Anmelder führten erste Studien mit dem NIP12 scFv als Modell durch. Die folgenden Methoden wurden angewandt:
Konstruktion einer Cys-enthaltenden Version von pHEN1-Vλ.
• Der Ser93-Rest der im pHEN1-Vλ3-Vektor kodierten variablen Vλ3-Leichtketten-Domäne wurde durch in vitro-Mutagenese (Amersham International) unter Verwendung des Primers 5'-ACC ACT GCT GTC CCG GCA GTT ACA GTC ATA GTC-3' in einen Cys- Rest übergeführt. Dieser neue Vektor wurde als pHEN1-Vλ-C93 bezeichnet.
Konstruktion einer Cys-enthaltenden Version von NIP12 scFv
• Die variable NIP12-Schwerkettendomäne wurde als Ncol-Xhol-Fragment aus dem entsprechenden Klon geschnitten, der gegen das 3-Iod-4-hydroxy-5-nitrophenylacetat-Hapten (NIP) affinitätsselektiert wurde. Dieser NIP12-Klon stammt aus einer Bibliothek, in der 49 Human-VH-Keimliniensequenzen durch PCR mit einer synthetischen Bibliothek randomisierter CDR3 (der Länge 5 und 8) verbunden und in den pHEN1-Vλ-Phagemid- Vektor (Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381-388 (1992)) kloniert wurden. Das NIP12-Schwerkettenfragment wurde dann zwecks löslicher Expression von NIP12- C93 scFv, einem Protein, das mit NIP12 scFv identisch ist, außer dass es den konstruierten Cysteinrest an Position 93 in der VX3-Leichtkette trägt, in die entsprechenden Stellen von pHEN1-VX3-C93 rekloniert.
• Zum Phagen-Freilegen des NIP 12 scFv und seiner Cysteinmutante reklonierten die Anmelder die zwei Gene getrennt als Sfil-Notl-Fragmente in die entsprechenden Stellen des fd-Tet-SfiINotl-Phagenvektors. Es wurde der mehrwertige Freilegungs-fd-Vektor und nicht das einwertige Freilegungs-pHEN 1-Phagemid ausgewählt, um die Western Blot- Analyse von Phagenproteinen zu erleichtern. Der Prozentsatz von cpIII-fusioniertem scFv steigt auf etwa 90% mit dem fd Vektor, während er mit dem pHEN1-Phagemid 10 % nicht übersteigt.
• Das NIP-Bindungs-Antikörperfragment wurde durch Affinitätssektion gemäß dem Verfahren von Hoogenboom & Winter (1992; s.o.) isoliert. Es stammt aus einer scFv-Bibliothek, die durch Verbindung einer einzelnen Human-Vλ3-Leichtkette mit einem synthetischen Repertoire in vitro angeordneter menschlicher VH-Keimliniengene zusammengesetzt ist. Da die variable Leichtdomäne in der Bibliothek konstant gehalten wird, wurde der Cysteinylrest in dieses Segment eingeführt. Da die CDR3 der Leichtkette üblicherweise einen größeren Teil als CDR1 und CDR2 der Antigen-Bindungsstelle bildet, wurde beschlossen, das L-CDR3-Serin 93 zu einem Cystein zu mutieren. Da die CDR3 beider VX3-Kol-Leichtketten 10 Reste umfasst, postulierten die Anmelder auf der Basis der räumlichen Konformation der Kol L-CDR3, dass die Seitenkette von Rest 93 im rechten Winkel zur Bindungsspalte liegt und für Lösungsmittel zugänglich ist.
• Es wurden sowohl NIP12 als auch dessen Mutante NIP12-C93 scFv hergestellt. Das Gen der Letzteren wurde durch Herausschneiden aus dem pHEN1-Vλ3-Klonierungsvektor mittels Ncol-Xhol-Spaltung und Reklonieren in die entsprechenden Stellen von pHEN1- Vλ3-C93 (des gleichen Vektors wie pHEN1-Vλ3 mit der Ser93-zu-Cys93-Mutation im Leichtketten-Vλ3, eingeführt durch stellengerichtete Mutagenese) zusammengesetzt. Die Ausbeuten an gereinigtem Protein waren bei den beiden Klonen ähnlich (etwa 1,5 mg pro Liter Kultur), und dasselbe trafauf ihre Retentionszeiten auf der Superdex G-75-Säule zu. Das lösliche ELISA-Signal auf der NIP-beschichteten Platte war bei der Proteinmutante etwas weniger intensiv als bei NIP12. Die Einführung eines fünften Cysteins in ein scFv wird somit toleriert.
• Die Lösungsmittelzugänglichkeit des konstruierten Thiols wurde dann durch chemische Modifizierung untersucht, die zu der in Bibliotheken angewandten analog war. Der Inkubation mit einem großen Überschuss an ¹&sup4;C-lodacetamid in einem Molverhältnis von 70 : 1 (lodacetamidacFv) ging ein Reduktionsschritt mit DTT voran (DTT: scFv-Molverhältnis = 7 : 1), um die mutmaßliche Fraktion blockierter Cysteinyl 93-Reste freizusetzen. NIP12-C93 scFv enthielt ¹&sup4;C-lodacetamid, während fast keine Radioaktivität im Vergleichsprotein (NIP12) eingebaut war. Ähnliche Ergebnisse wurden mit sperrigeren Alkylierungsreagenzien erzielt, die entweder Fluorescein (1A-F) oder 7-Nitrobenz-2-oxa- 1,3-diaozol (IA-NBD) trugen. Um die Vollständigkeit der Modifikation zu bestimmen, wurde mit IA-F modifiziertes NIP12-C93 scFv auf einem nativen 12% Polyacrylamidgel (35 mM HEPES, 43 mM Imidazol, pH 7,50) analysiert. Da Fluorescein bei pH 7,50 eine negative Ladung trägt, wandern nichtmodifizierte und modifizierte Proteine mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zur Anode. Die Reaktion ist innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen.
• Beim Freiliegen auf Phagen werden cpIII-fusioniertes NIP12 und NIP12-C93 gleichermaßen exprimiert, was durch Western Blots unter Verwendung von Antiserum gegen Gen III-Protein detektiert wurde. Da ähnliche Phagentiter beobachtet werden, zogen die Anmelder den Schluss, dass die Gegenwart eines zusätzlichen Cysteins auf der Phagenoberfläche die Morphologie und Infektiosität nicht beeinflusst. Die Phagen-ELISA-Signale stimmten auch mit den oben erwähnten löslichen ELISA-Ergebnissen überein.
• Aufgruncl ihrer Unlöslichkeit bei höheren Konzentrationen überschreiten Phagenteilchen üblicherweise nicht den Wert von 10¹² TU (für den fd-Vektor) bis 10¹³ TU (für Phagemid) pro ml. Im Vergleich zur löslichen scFv-Konzentration, die bei der Modifikation verwendet wird (± 5 pM) sind mit cpIII fusionierte scFv somit deutlich weniger konzentriert (± 2 nM sowohl für fd-Phagen als auch Phagemid, da das Letztere nur 10% von cpIII-fusioniertem scFv verpackt). Daher wurde beschlossen, die Konzentration des Modifikationsreagens auf 30 > uM zu senken. Es herrscht nach wie vor ein großer Überschuss (etwa 1,5 · 10&sup4; Mal), doch da die reagierenden Gruppen (lodacetamid und Disulfidersatz) thiolspezifisch sind, konnte die Reaktion auf 2 Stunden begrenzt werden. Diese Spezifität der Semisynthese auf Phagenantikörper wurde im folgenden Experiment aufgezeigt: 1 ml fd-Phagen-Phagenstammlösung, die entweder NIP12 scFv oder NIP12-C93 freiliegend aufwiesen, wurden zunächst unter reduzierenden Bedingungen (1 mM DTT 30 min lang) inkubiert, dann zweimal gefällt, um jegliche Spuren von DTT zu entfernen, und schließlich mit 30 uM lodacetyl-LC-Biotin 2 Stunden lang bei 4ºC umgesetzt. Die Western Blot-Analyse ergab, dass das Modifikationsreagens deutlich in das mit cpIII fusionierte NIP12-C93-Protein eingearbeitet war, doch das Ausmaß der Reaktion konnte nicht präzise festgestellt werden. Ferner wurde aufgezeigt, dass die Reaktionsbedingungen die Phagen-Infektiosität nicht verändern - eine wichtige Beobachtung im Hinblick auf die semisynthetische Phagen-Antikörper-Auswahl (Daten nicht dargestellt).
Beispiel 2: Erzeugung eines chemosynthetischen Antikörper-Repertoires und Selektion von Antikörpern, die sich an 2-Phenyloxazol-5-on binden
• In der in diesem Beispiel beschriebenen Arbeit wurde eine chemosynthetische Bibliothek mit einer fixen Leichtkette und einem Repertoire an Schwerketten hergestellt und dann Antikörper, die für 2-Phenyloxazol-5-on spezifisch sind, selektiert.
• Da die Einführung der chemischen Gruppe in Phagen erwiesenermaßen stellenspezifisch ist, untersuchten die Anmelder, ob auf Phagen freiliegende Bindungsaktivitäten auf der Basis ihrer nicht-kodierten chemischen Diversität selektiert werden könnten.
• Bei diesem Verfahren erfolgt vor jedem Selektionsschritt die Semisynthese an der gesamten Phagen-Antikörper-Bibliothek, die nach der vorhergehenden Selektionsrunde amplifiziert ist.
• Zunächst wurde die gleiche Bibliothek wie jene von Hoogenboom & Winter (1992; s.o.) konstruiert (mit der Ausnahme der Serin 93-zu-Cystein 93-Mutation in den variablen Leichtketten-VX3-Domänen). Es wurde, kurz gesagt, die in pHEN1-VX3 klonierte synthetische VH-Bibliothek durch Ncol-Xhol-Spaltung herausgeschnitten und in die gleichen Stellen von pHEN1-Vλ3-C93 rekloniert. Nach Elektroporation von E. coli TG1 mit der ligierten DNA wurde eine Bibliothek von 2,6 · 10&sup7; Klonen erhalten, worin mehr als 83% der Klone das Insert aufwiesen. Die dazu angewandten Techniken werden nachstehend beschrieben.
Konstruktion einer synthetischen Cys-enthaltenden Bibliothek
• Die von Hoogenboom & Winter (1992; s.o.) beschriebenen zwei unselektierten synthetischen Bibliotheken (jeweils 1,0 · 10&sup7; Kombinationen) wurden vermischt und Plasmid- DNA in CsCl-Qualität hergestellt. Durch Ncol-Xhol-Spaltung wurde das synthetische Schwerketten-Bibliothek-Fragment aus dieser DNA geschnitten, auf Agarosegel gereinigt und in den pHEN1-Vλ3-C93-Expressionsvektor ligiert, der davor mit Ncol und Xhol gespalten worden war. Die ligierte DNA wurde dann durch GeneClean (Bio101) gereinigt und in E. coli TG1 elektroporiert. Eine Bibliothek von 2,6 · 10' Klonen wurde erhalten, in der mehr als 83% der Klone Inserts aufwiesen.
Herstellung semisynthetischer Phagen-Antikörper
• a. Phagen-Antikörper-Kultur: In 50 ml 2XTY-Amp-Glu1% wurden Phagemidteilchen aus der sich exponentiell vermehrenden Bibliothek durch 30-minütige Superinfektion bei 37 ºC mit VCSM13-Helferphagen (in einem Verhältnis von 20 Phageneinheiten pro Zelle) gewonnen. Zellen wurden dann abzentrifugiert (4.000 U/min. 15 min) und in 250 ml vorgewärmtem (37ºC) 2XTY-Amp-Kan-Medium resuspendiert. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC unter Rühren wurde die Kultur 16-18 Stunden lang bei 30ºC unter Rühren gezüchtet. Für in fd-Vektor kloniertes scFv wurden 250 ml 2XTY-Tet mit 100 ul einer Übernachtkultur geimpft und etwa 20 Stunden bei 30ºC gezüchtet.
• b. Phagen-Antikörper-Reinigung: Nach der Entfernung der Zellen (7.000 U/min. 25 min) wurden die Phagenteilchen durch eine erste PEG/NaCl-Fällung (7.000 U/min. 25 min) aufkonzentriert und in 5 ml einer frischen und entgasten 1 mM DTT-Lösung resuspendiert. Dieser Schritt stellt sicher, dass alle Cysteine 93, die durch SH-enthaltende Moleküle blockiert sind, nun durch die Temperatur freigesetzt werden; die Phagen wurden PEG/NaCl-gefällt (4.000 U/min. 15 min) und das Phagenpellet sorgfältig zweimal mit 1 ml entgastem Reaktionspuffer (10 mM Phosphat, 10 mM EDTA, pH 7,80) gewaschen, bevor Resuspension in 5 mf des gleichen Puffers erfolgte. Eine dritte PEG/NaCl-Fällung, gefolgt von zwei Waschgängen mit Reaktionspuffer, wurde eingeführt, um die verbleibenden Spuren von DTT zu beseitigen. Das endgültige Pellet (etwa 1,0 bis 3,0 · 10'3 TU) wurde dann in 1-2 ml entgastem Reaktionspuffer resuspendiert.
• c. Semisynthese auf Phagen-Antikörper: 1,6 mM-Lösungen synthetischer Gruppen wurden frisch in Dimethylformamid (DMF) für die lodacetyl-LC-Biotin- (Pierce), Iodacetamid-NBD- (IA-NBD-) und lodacetamid-Fluorescein- (IA-F) Sonden (Molecular Probes) oder in Reaktionspuffer für das 2-Pyridyldithioethylenamin-Mittel (PDEA; Pharmacia Biosensor) hergestellt. 20 pl der synthetischen Gruppe wurden dann mit 1 ml konzentrierter Phagen-Antikörper-Stammlösung vermischt und das Reaktionsgemisch 2 Stunden lang bei 4ºC im Dunkeln belassen. Die Reaktion wurde dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gequericht, indem 2 ul einer frischen 0,1 M DTT-Lösung zugegeben wurden. Vor der Selektion oder dem ELISA-Test wurde das überschüssige gequerichte Reagens durch PEG/NaCl-Fällung der Phagenteilchen nicht entfernt.
Selektion semisynthetischer Phagen-Antikörper
• Für die Selektion wurde die Arbeitsvorschrift von Marks et al. (). Mol. Biol. 222, 581- 597 (1991)) befolgt, außer dass eine 100 ug/ml phOx-BSA-Lösung in PBS zum Beschichten der Immunröhrchen (Nung Maxisorp) verwendet wurde und alle Phagen-Antikörper- Inkubationen bei Raumtemperatur im Dunkeln erfolgten. 4 Runden der Selektionsgewinnung wurden durchgeführt, um phOx-Binder zu erhalten.
Herstellung semisynthetischer scFv
• a. scFv-Kultur: Die Arbeitsvorschrift von Marks et al. (1991; s.o.) wurde angewandt.
• b. scFv-Reinigung: Da die drei zu reinigenden scFv Human-VH3-Domänen enthielten (NIP12, NIP12-C93 und OXs32), wurde die Arbeitsvorschrift von Hoogenboom & Winter (1992; s.o.) befolgt. Monomere scFv-Fraktionen wurden durch Gelfiltration auf einer Superdex 75-Säule (Pharmacia) gereinigt und bei 4ºC in PBS, 0,02 NaN&sub3; bis zur Modifizierung gelagert.
• c. Semisynthese auf scFv: Die Modifikations-Arbeitsvorschrift begann mit dem Reduzieren der blockierten Cysteine 93. Das scFv (100 ug in 600 ul entgastem Reaktionspuffer) wurde mit 10,4 ul einer frischen 2,5 mM DTT-Lösung in entgastem Reaktionspuffer (DTT:scFv-Molverhältnis = 7 : 1) inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gehalten. In der Zwischenzeit wurden 3,5 mM-Lösungen des Modifizierungsreagens in entgastem Reaktionspuffer für den ¹&sup4;C-lodacetamid- (4,3 uM/ml, 0,25 mCi/ml, Amershann) oder in DMF für die IA-NBD- und IA-F-Fluoreszenzmittelreporter frisch zubereitet. Nach 1,5-stündiger Reduktion wurden 75 ul dieser Modifizierungslösungen (Reagens-scFv-Molverhältnis = 70 : 1) dem Reaktionsgemisch zugegeben, das dann 2 Stunden bei 4ºC im Dunkeln inkubiert wurde. Die Reaktion wurde dann mit 5,2 ul einer frischen 0,25 M DTT-Lösung (DTT-Reagens-Molverhältnis = 5 : 1) gequericht. Nach Abschluss der Reaktion (± 1 Stunde bei Raumtemperatur) wurde DC mit CHCl&sub3; : CH&sub3;OH = 9 : 1 als Laufmittel durchgeführt. Bis zur Verwendung wurde die semisynthetische scFv-Lösung bei 4ºC im Dunkeln gehalten.
• Für die Flluoreszenzanalyse war es erforderlich, einen Großteil des gequerichten Reagens zu entfernen. Daher wurde das Reaktionsgemisch durch Gelfiltration auf G-25 Sephadex "fine" (9 ml Bettvolumen), äquilibriert mit PBS, gereinigt. Das semisynthetische scFv vurde in 2 ml gesammelt und als solches für die Fluoreszenztitration eingesetzt.
Semisynthetischer Phagen-Antikörper und scFv-ELISA
• Semisynthetische Phagen-Antikörper-Stammlösungen wurden zunächst auf das 100fache verdünnt, bevor die ELISA-Analyse nach dem Verfahren von Clackson et al. (1991) erfolgte. Semisynthetische scFv-ELiSA-Tests erfolgten gemäß dem Verfahren von Marks et al. (1991; s.o.). Für die nichtmodifizierten Klone wurden die gereinigten Phagenteilchen oder scFv mit einem Überschuss an DTT-gequerichtem Reaktanden vor der Analyse vermischt. ElISA-Platten wurden mit einer 100 ug/ml phOx-BSA-Lösung in PBS über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Für den Spezifitäts-ELISA (BSA, Eialbumin, phOx-KLH, phOx-CSA, phOx-Polylsyin, Chymotrypsin A, Insulin und Hühnereiweiß-Lysozym (HEL)) wurde die gleiche Antigen-Konzentration eingesetzt, außer dass bei HEL mit 3 mg/ml beschichtet wurde.
Western Blot-Analyse
• SDS-10% Polyacrylamid-Minigele wurden mit etwa 10¹&sup0; TU scFv fd-Phagenteilchen oder 1-5 ug gereinigtem scFv laufen gelassen. Durch Elektroblotting wurden die Proteine auf lmmobilon-P-Membran (Millipore) übertragen. Der Blot wurde dann mit PBS, 3 % BSA 30 min lang blockiert. Für die Analyse von cpIII und cpIII-fusioniertem scFv wurde der Blot mit Kaninchen-Antiserum gegen das cpIII-Protein inkubiert, gefolgt von Mäuse-Anti-Kaninchen-Antikörper (konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase von Sigma). Schließlich wurde DAB als kolorimetrisches Substrat zur Detektion verwendet. Für die Detektion von biotinyliertem cpIII-fusioniertem scFv durch Chemosynthese wurde Streptavidin-alkalische Phosphatase verwendet.
• Die erzielten Ergebnisse werden nachstehend beschrieben.
• Mit der oben beschriebenen chemosynthetischen Bibliothek, die Cystein an der CDR3 der fixen Leichtkette aufweist, wurden drei unterschiedliche Selektionen gegen phOx parallel laufen gelassen (eine negative Vergleichsbibliothek und zwei semisynthetische Bibliotheken). Nach der Reduktion mit DTT wurde die erste Bibliothek (Lib1; negativer Vergleich) weiter modifiziert, während die zweite Bibliothek (Lib2) mit dem alkylierenden IA-NBD-Fluorphor und die dritte (Lib3) mit dem Disulfidersetzer 2-Pyridyldithioethylenannin-Reagens (PDEA) umgesetzt wurde. Nur Lib2 wurde nach Modifikation mit dem Fluorophor mit DTT gequericht. Es wurden vier Modifikations-Selektions-Amplifikations-Runden durchgeführt. Zwischen der ersten und der vierten Runde nahm die Anzahl an an Phagenteilchen gebundenen, mit phOx beschichteten Immunröhrchen um einen Faktor von 133 für Lib1, 297 für Lib2 und 17 für Lib3 zu.
• Weder lösliches Cys93 scFv noch Phagen aufweisendes Cys93 scFv kann in rohem Kulturüberstand wirkungsvoll modifiziert werden. Um daher die Suche nach Antikörpern zu beschleunigen, in denen die Antigenbindung von der eingeführten chemischen Gruppe abhing, wurden polyklonale Phagen-ELISA-Tests mit gereinigten Phagenteilchen (10 ml-Kulturen) aus Bibliotheken abnehmender Größe (zunächst die ganze Bibliothek, dann Mini-Bibliotheken aus 28 bis 210 Klonen) durchgeführt. Um die Bedeutung der eingeführten Gruppe für die Bindungsaktivität zu definieren, wurden ELISA-Versuche als negativer Vergleich mit polyklonalen Phagenteilchen durchgeführt, die entweder nichtmodifiziert oder mit einer anderen synthetischen Gruppe (üblicheweise F-IA) modifiziert waren. Individuelle, aus viel versprechenden Mini-Bibliotheken selektierte Klone (Daten nicht dargestellt) wurden durch Phagen-ELISA weiter analysiert (Fig. 1 bis 3).
• Aus Lib1 wurden 16 Klone (Fig. 1) auf ihre Bindungsaktivität an phOx analysiert. Viele davon (14/16) lieferten ein positives ELISA-Signal. Wie erwartet banden sich die meisten nichtmodifizierten Klone besser an phox ohne Modifikation, als wenn sie mit IA-NBD oder IA-F modifiziert varen. Es zeigten sich zwei ELISA-Muster: eine erste Gruppe (8/14), in der die Klone chemische Modifikation bis zu einem bestimmten Ausmaß tolerieren, und eine zweite Gruppe (6/14) von Klonen, die eine stärkere Präferenz zeigen, nicht modifiziert zu werden (insbesondere in Bezug auf IA-NBD-Modifikation). Beispielsweise waren ELISA-Signale der IA-NBD modifizierten Klone 9 und 14 etwa 2, 3 Mal weniger intensiv, als wenn die Klone nicht modifiziert waren.
• Wie aus Fig. 2 ersichtlich, wurden 20 Klone aus Lib2 analysiert. Wiederum war eine Mehrheit von ihnen (16/20) an phOx gebunden, und es wurden zwei Gruppen mit interessanten Bindungsmerkmalen detektiert. Eine Gruppe von Klonen (9/16) zeigte keine Präferenz, mit IA-NBD modifiziert zu werden. Sie konnten sich ebenso gut an phox binden als nichtmodifizierte oder mit IA-F modifizierte Phagenteilchen. In der zweiten Gruppe (7/16) wiese alle mit IA-NBD modifizierten Klone eine viel stärkere Präferenz für die Bindung an phOx auf. Diese Tendenz erhöhte sich von einem Faktor des 2,3fachen (Klon 32) auf einen Faktor des 6,8fachen (Klon 36). Betreffend das Letztere bewirkte keine Modifikation oder IA-F-Modifikation ein Absinken des ELISA-Signals auf den Hintergrundwert. Daher ist IA-NBD Teil der Antigen-Bindungssteile.
• Die Phagen-ELISA-Signale von 12 Lib3-Klonen sind in Fig. 3 dargestellt. Wiederum konnten die Klone in zwei Gruppen unterteilt werden. Die Mehrheit der Klone (10/12, erste Gruppe) zeigte keine ausgeprägte Präferenz für oder gegen Modifikation. Die zweite Gruppe enthielt nur zwei Klone, bei denen PDEA die Bindungseigenschaften beeinflusste: die PDEA-Modifikation verstärkte ihre ELISA-Signale um einen maximalen Faktor des 3,4fachen. Die Tatsache, dass weniger Klone (16%) PDEA-abhängige ELISA- Signale lieferten als IA-NBD-abhängige Klone (43%), kann eher auf die Größe der in das scFv insertierten synthetischen Gruppen zurückgeführt werden (groß bei IA-NBD, klein bei PDEA) als auf die reaktiven Gruppen (Alkylierung für IA-NBD, Disulfidersetzung für PDEA).
• Die ELISA-Signale von Lib1- und Lib2-Klonen zeigten deutlich, dass bei einigen Klonen die kovalent gebundene synthetische Gruppe ein integraler Bestandteil der Antigen-Bindungsstelle ist. In einigen Antikörperklonen ist die Gegenwart der eingeführten chemischen Gruppe für die starke Bindung des Haptens nicht wesentlich, doch in anderen ist sie wesentlich, damit starke Bindung eintritt. Solche Klone aus chemosynthetischen Repertoires sind besonders wertvoll, wenn z. B. Reportergruppen eingebaut sind.
• Kein Klon, der eine ausgeprägte ELISA-Präferenz zeigt, nicht modifiziert zu werden, wurde in den zwei semisynthetischen Bibliotheken (Lib2 und Lib3) festgestellt.
• Die Selektionen der semisynthetischen Bibliothek produzierten somit Phagen-Antikörper mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften und unterschiedlichen Toleranzen gegenüber Modifikation (Tabelle 1). Individuelle Klone unterschiedlicher ELISA-Profile wurden hinsichtlich DNA-Sequenzierung selektiert und die VH-CDR3-Sequenz sowie das VH-Keilmlinien-Gen bestimmt (Tabelle 1). Die VH-CDR3-Sequenzen der Klone, die gegenüber der Gegenwart oder dem Typ der Modifikation indifferent sind, zeigen starke Ähnlichkeit mit jenen, die von Hoogenboom & Winter (1992; s.o.) aus dem synthetischen Repertoire gewonnen wurden. Beispielsweise sind die VH-CDR3-Sequenzen von Klon SSL14 aus der nichtmodifizierten Bibliothek und der Klon SSL-41 aus der mit PEDA modifizierten Bibliothek (LSGVRDFY) mit ctGx-18 aus der ursprünglichen Studie identisch. Ebenso sind die Klone SSL-18 aus der mit NBD modifizierten Bibliothek und SSL-44 aus der mit PDEA modifizierten Bibliothek (SMGAKFDY) mit αOx-1 nahezu identisch (SMGSKFDY). Im Gegensatz dazu weisen die Klone mit der stärksten Präferenz für die Modifikation, nämlich die Klone SSL-34 (GLLST) aus der mit NBD modifizierten Bibliothek und SSL-42 (TRFATDY) aus der mit PDEA selektierten Bibliothek, keinerlei Ähnlichkeiten mit den Klonen aus der ursprünglichen Studie auf, obwohl die Probengröße zu gering ist, um definitive Schlüsse zu ziehen.
• Eine weitere Analyse der semisynthetischen Klone erfolgte aus den Klonen SSL-32 und SSL-34 aus der mit IA-NBD selektierten Bibliothek, da diese Klone eine ausgeprägte Modifikationspräferenz aufwiesen. Der Ursprung der Klone war VH3, und sie wurden auf Protein gereinigt. Eine Sepharose aus Kulturüberstand enthielt lösliche scFv-Fragmente. Das gereinigte Material wurde mit IA-NBD modifiziert und mittels ELISA analysiert, ohne dass ungebundenes gequerichtes IA-NBD entfernt wurde, oder es wurde das Protein mittels FPLC-Gelfiltration mittels Superdex 75 größenfraktioniert, um monomere scFv- Fragmente frei von jeglichen ungebundenen kontaminierenden Substanzen zu erhalten. Der Modifikationsvorgang schien keine Veränderung in der Multimerisierung des Antikörpers herbeizuführen (beurteilt anhand der FPLC-Spur von nichtmodifiziertem und modifiziertem Protein; Daten nicht dargestellt).
• Die Bindungsspezifität des modifizierten und nichtmodifizierten scFv-Materials wurde mittels ELiSA auf mit phOx-BSA, einigen irrelevanten Antigenen und einigen anderen phOx-Protein-Konjugaten beschichteten Mikrotiterplatten bestimmt. Es stellte sich heraus, dass sich das lösliche SSL-32 scFv an phOx-BSA als nichtmodifiziertes scFv bindet (in ähnlichem Ausmaß wie der Phagen-Antikörper); es wurde nicht weiter charakterisiert (Fig. 4). Die Bindung des SSL-34-Klons an phOx-BSA benötigte absolut die Modifikation mit IA-NBD (Fig. 4). In beiden Fällen spiegelten also die Bindungseigenschaften für nichtmodifizierfe und mit NBD modifizierte Fragmente jene für den Phagen-Antikörper wider. Das stärkere ELISA-Signal für beide Klone (modifiziert mit NBD) war nicht das Ergebnis höherer Multimerisierung, was durch FPLC-Gelfiltrationsanalyse ermittelt wurde.
• Die Tatsache, dass das SSL-34-Klon die NBD-Modifikation absolut erforderte, wurde näher analysiert. Keine detektierbare Bindung auf irgendeinem irrelevanten Antigen oder, was wichtiger ist, auf irgendeinem anderen phOx-Protein-Konjugat wurde für den mit IA-NBD modifizierte Klon festgestellt (Fig. 5). Die Differenzierung hinsichtlich der Bindung von phOx-BSA im Vergleich zu phOx-poly-L-lysin, phOx-KLH (Napfschnecken- Hämocyanin) und phOx-CSA (Hühnerserum-Albumin) lässt deutlich erkennen, dass mit NBD modifizierter SSL-34 eine einzelne phox-derivatisierte Stelle, die nur bei BSA auftritt, erkennt.
• Diese Ergebnisse der Erzeugung einer semisynthetischen Bibliothek von Antikörpern, die nicht-kodierte synthetische Gruppen als Teil der Antigen-Bindungsstelle enthalten, zeigen, dass Antikörper mit neueartigen Antigen-Bindungsanforderungen isoliert werden können und dass die Diversität von Antikörper-Bindungsstellen über jenes Niveau gesteigert werden kann, das mit natürlichen Antikörpern möglich ist.
• Die Diversität der hierin selektierten semisynthetischen Klone ist eher begrenzt, und Verbesserungen hinsichtlich der Bibliothek können durch Einschluss längerer VH- CDR3-Secluenzen, Verwendung unterschiedlicher Leichtketten und chemische Modifikation mit einer Population verschiedener Cofaktoren chemischer Gruppen erzielt werden. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass die Position und Anzahl modifizierbarer (z. B. Cystein-) 'Reste einen entscheidenden Einfluss auf die Eigenschaften der chemosynthetischen Bibliothek ausüben; sie können in kontrollierter Weise variiert werden. Tabelle 1. Sequenz und Modifikationstoleranz einer Untergruppe chemosynthetischer Klone.

Claims (32)

1. Diverses Repertoire von ersten spezifischen Bindungspaar- (sbp-) Elementen, die jeweils eine Bindungsstelle für ein zweites sbp-Element aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass jede Bindungsstelle eine chemische Gruppe umfasst, die kovalent an einen Aminosäurerest innerhalb der Bindungsstelle gebunden ist, worin die Kombination aus Aminosäurerest und chemischer Gruppe nicht durch Nukleinsäure kodierbar ist.

2. Repertoire nach Anspruch 1, worin das erste sbp-Element an eine Oberflächenkomponente eines Organismus fusioniert ist.

3. Repertoire nach Anspruch 2, worin der Organismus ein Bakteriophage ist.

4. Repertoire nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das erste sbp-Element eine erste Polypeptiddomäne, die eine Bindungsregion einer variablen Immunglobulin- Schwerketten-Domäne (VH) umfasst, sowie eine zweite Polypeptiddomäne aufweist, die eine Bindungsregion einer variablen Immunglobulin-Leichtketten-Domäne (VL) umfasst, wobei die erste und die zweite Polypeptiddomäne die Bindungsstelle bilden.

5. Verfahren zum Bereitstellen eines diversen Repertoires eines ersten spezifischen Bindungspaar- (sb-) Elements, gekennzeichnet durch einen Schritt der chemischen Modifizierung erster sbp-Elemente im Repertoire, um eine chemische Gruppe einzuführen, die kovalent an einen Aminosäurerest in der Bindungsstelle jedes ersten sbp-Elements gebunden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Bereitstellen des Repertoires des ersten sbp-Elements vor dem Schritt der chemischen Modifizierung die Expression ausgehend von einer Population von Nukleinsäuremolekülen umfasst, die kollektiv für das Repertoire kodieren.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Bereitstellen der Population von Nukleinsäuremolekülen einen Schritt der Mutation von Nukleinsäure, die für erstes spb-Element kodiert, oder eines Polypeptidkomponententeils davon umfasst, um ein Codon einzuführen, das für den Aminosäurerest kodiert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin der Aminosäurerest in jedem ersten sbp-Element selektiv modifiziert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin die Population von Nukleinsäuremolekülen durch Verbinden von Genfragmenten bereitgestellt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, worin die chemische Modifizierung in vitro durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, das nach der chemischen Modifizierung einen Schritt der Selektion eines ersten sbp-Elements mit einer Bindungsstelle umfasst, die ein zweites sbp-Element von Interesse binden kann.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Selektion mittels Bindung an ein zweites sbp-Element von Interesse erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin die Bindung des selektierten ersten sbp-Elements an das zweite sbp-Element von Interesse im Vergleich zur Bindung dieses ersten sbp-Elements ohne die chemische Gruppe verstärkt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin die Bindung des selektierten ersten sbp-Elements an das zweite sbp-Element von Interesse von der Gegenwart der kovalent an die Aminosäure gebundenen chemischen Gruppe abhängig ist.

1 S. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin die ersten sbp-Elemente an eine Oberflächenkomponente eines Organismus fusioniert exprimiert werden, so dass jeder Organismus in einer Population davon dadurch ein erstes sbp-Element an seiner Oberfläche freiliegend aufweist, wobei jeder Organismus in der Population ein Nukleinsäuremolekül enthält, das für das an seiner Oberfläche freiliegende erste sbp-Element kodiert.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der Organismus ein Bakteriophage ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin auf die Selektion eines ersten sbp-Elements mit einer Bindungsstelle, die ein zweites sbp-Element von Interesse binden kann, die Gewinnung einer Sequenz von Nukleotiden aus dem Organismus folgt, der das selektierte erste sbp-Element an seiner Oberfläche freiliegend aufweist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die Sequenz von Nukleotiden zur Produktion eines ersten sbp-Elements mit einer Bindungsstelle verwendet wird, die zweites sbp-Element von Interesse binden kann.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 18, worin das erste sbp-Element eine erste Polypeptiddomäne aufweist, die eine Bindungsregion einer variablen Immunglobulin-Schwerketten-Domäne (VH) und eine zweite Polypeptiddomäne aufweist, die eine Bindungsregion einer variablen Immunglobulin-Leichtketten-Domäne (VL) umfasst, wobei die erste und die zweite Polypeptiddomäne die Bindungsstelle bilden.

20. Verfahren zum Bereitstellen eines genetisch diversen Repertoires eines ersten spezifischen Bindungspaar- (sbp-) Elements, das eine Bindungsstelle für komplementäres zweites sbp-Element aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

das Bereitstellen einer Population von Nukleinsäuremolekülen, die kollektiv für ein genetisch diverses Repertoire von ersten spb-Elementen kodieren, wobei die Bindungsstelle der kodierten ersten sbp-Elemente jeweils einen Aminosäurerest aufweist, der selektiv modifizierbar ist, um eine kovalent gebundene chemische Gruppe in die Bindungsstelle einzuführen;

die Expression ausgehend von der Nukleinsäure, um ein Repertoire erster sbp- Elemente bereitzustellen.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Bereitstellen der Population von Nukleinsäuremolekülen einen Schritt der Mutation von Nukleinsäure, die für erstes sbp-Element kodiert, oder eines Polypeptidkomponententeils davon umfasst, um ein Codon einzuführen, das für den Aminosäurerest kodiert.

22. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Population von Nukleinsäuremolekülen durch Verbinden von Genfragmenten bereitgestellt wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, umfassend die chemische Modifizierung erster sbp-Elemente im Repertoire davon am Aminosäurerest, um eine kovalent gebundene chemische Gruppe in die Bindungssteile einzuführen.

24. Verfahren nach Anspruch 23, das nach der chemischen Modifizierung einen Schritt der Selektion von erstem spb-Element mit einer Bindungsstelle umfasst, die ein zweites sbp-Element von Interesse binden kann.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Selektion mittels Bindung an ein zweites sbp-Element von Interesse erfolgt.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, worin die Bindung des selektierten ersten · sbp-Elements an das zweite sbp-Element von Interesse im Vergleich zur Bindung dieses ersten sbp-Elements ohne die chemische Gruppe verstärkt ist.

27. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, worin die Bindung des selektierten ersten sbp-Elements an das zweite sbp-Element von Interesse von der Gegenwart der kovalent an die Aminosäure gebundenen chemischen Gruppe abhängt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, worin die ersten sbp-Elemente an eine Oberflächenkomponente eines Organismus fusioniert exprimiert werden, so dass jeder Organismus in einer Population davon dadurch ein erstes sbp-Element an seiner Oberfläche freiliegend aufweist, wobei jeder Organismus in der Population ein Nukleinsäuremolekül enthält, das für das an seiner Oberfläche freiliegende erste sbp-Element kodiert.

29. Verfahren nach Anspruch 28, worin der Organismus ein Bakteriophage ist.

30. Verfahren nach Anspruch 29, worin auf die Selektion eines ersten sbp-Elements mit einer Bindungsstelle, die ein zweites sbp-Element von Interesse binden kann, die Gewinnung einer Sequenz von Nukleotiden aus dem Organismus folgt, der das selektierte erste sbp-Element an seiner Oberfläche freiliegend aufweist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, worin die Sequenz von Nukleotiden zur Herstellung eines ersten sbp-Elements mit einer Bindungsstelle verwendet wird, die zweites sbp-Element von Interesse binden kann.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 31, worin das erste sbp-Element eine erste Polypeptiddomäne aufweist, die eine Bindungsregion einer variablen Immunglobulin-Schwerketten-Domäne (VH) und eine zweite Polypeptiddomäne aufweist, die eine Bindungsregion einer variablen lmmunglobulin-Leichtketten-Domäne (VL) umfasst, wobei die erste und die zweite Polypeptiddomäne die Bindungsstelle bilden.