DE69424576T2

DE69424576T2 - Biologisch aktive tgf-beta1 und tgf-beta2 peptide

Info

Publication number: DE69424576T2
Application number: DE69424576T
Authority: DE
Inventors: Yasushi Ogawa; David Schmidt
Original assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Celtrix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-01-26
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 2001-01-18
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: US5658883A; JPH08510443A; JP3763479B2; US5420243A; WO1994017099A3; EP0791011A2; WO1994017099A2; AU6093294A; EP0791011B1; CA2153789A1; DE69424576D1; AU685084B2; ES2146253T3; CA2153789C

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch aktive Peptide, die Regionen der Aminosäuresequenz des transformierenden Wachstumsfaktors β1 oder β2 entsprechen und die zur Nachahmung der Aktivität der entsprechenden TGF-βs mit voller Länge befähigt sind.

Hintergrund der Erfindung

PCT WO 84/001106, angemeldet am 23. September 1983, beschreibt den transformierenden Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1) und seine Verwendung zur Anregung der Zellproliferation und Gewebereparatur, Wundheilung und Behandlung von Traumata.
U.S. Patent Nr. 4 843 063 beschreibt zwei in Säugetierknochen gefundene, Knorpel-induzierende Faktoren, CIF-A und CIF-B, die (1) Cofaktoren für die Induktion der Knorpelbildung in vivo sind; (2) die die Ablagerung von Bindegewebe in vivo in Abwesenheit eines zugesetzten Akfivierungsmittels oder Cofaktors fördern; und (3) in dem zur Charakterisierung von TGF-β benutzten Verankerungs-unabhängigen Zellwachstumstest wirksam sind. Der Test wird hierin als TGF-β-Test bezeichnet und ist in Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrate for Serum-free Animal Cell Culture (1984) S. 181-194, Alan R. Liss, Inc. beschrieben.
U.S. Patent Nr. 4 806 523, angemeldet am 6. März 1986, offenbart, dass CIF-A und CIF-B beide entzündungshemmende Aktivität besitzen und Inhibitoren der Mitogen-stimulierten T-Zellproliferation und B-Zellaktivierung sind. Es wird ebenfalls berichtet, dass CIF in den Zentren der Hämatopoese und Lymphopoese lokalisiert ist und dass CIF daher zur Behandhmg von mit einer Fehlfunktion oder Dysfunktion der Hämatopoese oder Lymphopoese verbundenen Indikationen nützlich sein kamt Seitdem ist gezeigt worden, dass CIF-A mit TGF-β1 identisch ist. CIF-B ist seitdem als neue Form des transformierenden Wachstumsfaktors vom β-Typ erkannt worden und wird nun TGF-β2 genannt.
U.S. Patent Nr. 4 822 606, angemeldet am 7. April 1986, beschreibt neue Peptide mit immunsuppressiver oder immunregulatorischer Aktivität. Diese Peptide beruhen auf einer Sequenz von 26 Aminosäuren, die unter den mit Immunsuppression assoziierten Retroviren hoch konserviert ist.
Europäische Patentanmeldung 0 353 772 A2, angemeldet am 4. August 1988, offenbart ein Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung der Proliferation von epidermalen Zellen mit TGF-β1, TGF-β2 oder deren Fragmenten.
U.S. Patent Nr. 5 061 786, angemeldet am 25. Mai 1989, offenbart ein biologisch aktives Peptid entsprechend den Resten 16-31 von TGF-β1, gegebenenfalls mit Verlängerungen des Aminoendes.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft biologisch aktive Peptide, die Regionen der Aminosäuresequenz von TGF-β1 und TGF-β2 entsprechen. Die Peptide behalten und ahmen daher die biologischen Aktivitäten der reifen aktiven TGF-βs nach. Die Peptide sind daher geeignet für alle Anwendungen, die für die TGF-βs angezeigt sind. Die Peptide behalten sowohl in monomerer als auch in polymerer Form mindestens einiges von der biologischen Aktivität des entsprechenden TGF-βs mit voller Länge. Die monomere Form des von TGF-β1 abgeleiteten Peptides besteht aus der folgenden Aminosäuresequenz:
CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGP. Die monomere Form des von TGF-β2 abgeleiteten Peptides besteht aus der folgenden Aminosäuresequenz:
CLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGA Dimere können über Disulfidbindungen zwischen den aminoterminalen, carboxyterminalen oder amino- und carboxyterminalen Cysteinresten der monomeren Untereinheiten erzeugt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Zusammensetzungen bereit, die die Peptide der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger für diese enthalten und Verfahren der Nachahmung der Wirkungen der TGF-βs, die die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten in einer wirksamen Menge umfassen.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der hier gegebenen Offenbarung leicht erkennbar.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1a-1h sind graphische Darstellungen, die die Ergebnisse des in Beispiel 2 beschriebenen Nerzlungenzellen-Proliferationstests abbilden.

Detaillierte Beschreibung

Die technischen und wissenschaftlichen Begriffe sind hierin definiert worden; die anhängenden Ansprüche sollten unter Beachtung dieser Definitionen interpretiert werden. Soweit hierin nicht genau definiert, haben alle anderen technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie von dem Fachmann, an den sich diese Erfindung richtet, gewöhnlich verstanden wird. Obwohl andere Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleichwertig den beschriebenen sind, in der Praxis oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die bevorzugten Verfahren und Materialien hierin beschrieben.
Es ist anzumerken, dass soweit in dieser Patentbeschreibung und den anhängenden Ansprüchen die Singularform "ein", "der, die" bzw. "das" verwendet wird, die Pluralform eingeschlossen ist, solange der Konten nichts anderes eindeutig vorschreibt. So schließt zum Beispiel ein Hinweis auf "ein Peptid" oder "ein aktives Peptid" Gemische von Peptiden des hier beschriebenen allgemeinen Typs ein und ein Hinweis auf das "Verfahren zur Verabreichung" schließt ein oder mehrere Verfahren zur Verabreichung des hier beschriebenen allgemeinen Typs und/oder des Typs ein, die dem Fachmann auf diesem Gebiet leicht erkennbar werden.
Die Verfahren zur Herstellung der Peptide wenden, solange nichts anderes angezeigt wird, herkömmliche Techniken der synthetischen organischen Chemie, Proteinchemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinierter DNA-Technologie an, die in der Erfahrung des Fachmanns auf diesem Gebiet liegen. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig erläutert. Siehe zum Beispiel Scopes, Protein Purification Principles and Practices, 2. Auflage (Springer-Verlag, 1987), Methods in Enzymology (Colowick and Kaplan, Herausgeber, Academic Press, Inc.); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Handbook of Experimental Immunology. Bände I-IV, (Weir and Blackwell, Herausgeber) (Blackwell Scientiflc Publications, 1986); House, Modern Synthetic Reactions, 2. Auflage, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Cal., 1972. Atherton and Sheppard, Solid Phase Pepide Synthesis: A Practical Approach (Oxford University Press, 1989); Steward and Young Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage (Pierce Chemical Co., 1984).

A. Definitionen

Zur Definition der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Begriffe verwendet, die wie nachstehend angegeben definiert sein sollen.
Die hier verwendete Aminosäuresequenz von TGF-β1 ist die von Derynck et al., Nucl. Acids Res., 15: 3188-3189 (1987) beschriebene. Die Aminosäuresequenz von TGF-β2 ist die von Madison et al. DNA, 7: 1-8 (1988) beschriebene.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "fibrinogen" auf Faktoren, die die Heilung beschädigter Bindegewebe fördern, die von verschiedenen Arten Traumata, Entzündungen und Immunreaktionen herrühren. Diese Faktoren schließen diejenigen ein, die bei der Fibroblasten- Chemotaxis, der Synthese von Kollagen, Hyaluronat und dem Gewebeinhibitor der Metallproteinase (TIMP) involiert sind.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "biologisch aktiv" auf die Fähigkeit, eine biologische Funktion zu vermitteln.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Peptid" auf ein Oligomer von mindestens zwei zusammenhängenden Aminosäureresten. Des Weiteren bezieht sich der Ausdruck "die Peptide", so wie er hier verwendet wird, auf die hierin beschriebenen Peptide, soweit nicht anders angegeben.
Wie hier verwendet, ist mit dem Begriff "Behandeln" eine Prophylaxe oder Abschwächung eines bestehenden Zustands gemeint. Dementsprechend kann die Erfindung im Fall einer Entzündung dazu verwendet werden, die Entzündung zu verhindern oder eine bestehende Entzündung zu lindern.
Wie hier verwendet, ist mit dem Begriff "Entzündung" gemeint, dass sowohl akute Reaktionen (d. h. eine Reaktion, bei der entzündliche Vorgänge aktiv sind) als auch chronische Reaktionen (d. s. Reaktionen, die durch langsames Fortschreiten und die Bildung neuen Bindegewebes gekennzeichnet sind) umfasst sind. Chronische und akute Entzündungen können durch die daran beteiligten Zelltypen unterschieden werden. Eine akute Entzündung schließt oft polymorphkernige Neutrophile ein, wohingegen eine chronische Entzündung normalerweise durch eine lymphohistiocytische und/oder granulomatöse Reaktion charakterisiert ist. Beispiele für spezielle Entzündungstypen sind diffuse Entzündung, Entzündungsherde, kruppöse Entzündung, interstitielle Entzündung, obliteriative Entzündung, reaktive Entzündung, spezifische Entzündung, toxische Entzündung und traumatische Entzündung.
So wie hier verwendet, wird eine "im wesentlichen entsprechende" TGF-β1- oder TGF- β2-Aminosäuresequenz mindestens 70% Sequenzhomologie mit der Aminosäuresequenz von TGF-β1 beziehungsweise TGF-β2 aufweisen und die funktionelle Aktivität beibehalten. Es ist weiterhin zu bevorzugen, dass irgendwelche Unterschiede in der Sequenzhomologie, die ein Peptid oder Protein mit einer "im wesentlichen entsprechenden" Sequenz besitzt, Unterschiede sind, die eine gewünschte Eigenschaft dieses Peptids oder Proteins nicht nachteilig beeinflussen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "septischer Schock" auf eine Folge von durch eine Bakterämie ausgelösten Ereignissen, während welcher Zellwandsubstanzen (Endotoxin bei gramnegativen Organismen und Peptidoglykan/Teichoinsäure-Komplex bei grampositiven Organismen) die Komplement-, Kinin und ACTHlEndorphin-Systeme aktivieren. Diese Serie metabolischer Ereignisse fuhrt letztendlich zum Schockzustand.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Patient" auf Tiere, wobei Menschen eingeschlossen sind, die an einem Zustand leiden, der durch TGF-β geheilt oder verbessert werden kann.

Allgemeine Methoden

Die TGF-βs zeigen Aktivität in dem in Methods for Preparation of Media. Supplements, and Substrate for Serum-free Animal Cell Culture (1984) S. 181-194, Alan R. Liss, Inc. beschriebenen TGF-β-Test. Der Test bestimmt die Fähigkeit, ein Verankerungs-unabhängiges Wachstum in nicht neoplastischen normalen Rattennierenfibroblasten zu induzieren, durch Messung der in Weichagar erzeugten Zellkolonien.
Die bisher isolierten TGF-βs sind hinsichtlich der TGF-β-Aktivität nicht artspezifisch. So sind die von anderen Arten abgleiteten TGF-βs darin hoch "homolog", dass sie in den Sequenzen der Aminosäurereste und in der Aktivität ähnlich sind. Von diesen Polypeptiden wird angenommen, dass sie unter den Tierarten stark konserviert sind (d. h., dass ein bestimmtes Polypeptid von verschiedenen Säugetierarten eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich zwischen den Arten hinsichtlich Aminosäurerestdeletionen, -Additionen oder -Substitutionen nur wenig unterscheidet, wenn überhaupt, wobei die Variationen die nicht artspezifischen Aktivitäten des Moleküls nicht nachteilig beeinflussen) und eine Arten-Überkreuzfunktionalität aufweisen. Dementsprechend können die Peptide aus Zellen oder Gewebe verschiedener tierischer Herkunft abgeleitet sein oder durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden. Die Peptide umfassen daher die Sequenzen der Aminosäurereste der homologen TGF-βs. Dem entsprechend können Peptide von einer Wirbeltierart zur Behandlung einer anderen Wirbeltierart verwendet werden. Die üblichsten therapeutischen Verwendungen der Peptide liegen in der Behandlung von Patienten, wie Menschen, Haustieren wie Rinder, Schafe und Schweine, Jagdtieren oder zahmen Tieren wie Hunde, Katzen und Pferde.
Die Peptide sind bei jeder Anwendung nützlich, für die ein TGF-β angezeigt ist. Die Peptide, die die TGF-Aktivitäten nachahmen, schließen die Induktion von Knorpel/Knochenbildung und zur Reparatur, Ersatz oder Vermehrung von Knorpel/Knochengewebe in Lebewesen einschließlich Menschen ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Wirksame Mengen der Peptide werden normalerweise mit pharmakologisch verträglichen Flüssigkeiten oder festen Trägern formuliert. Eine wirksame Menge der Peptide ist eine Menge die ausreichend ist, um die biologische Reaktion hervorzurufen, die erforderlich ist, um die Situation, an der der Patient leidet, zu verbessern.
Die Peptide können in derselben Weise wie andere TGF-βs dazu benutzt werden, um eine nicht artspezifische zelluläre Vermehrung zu fördern (einzuleiten und aufrecht zu erhalten). Klinische Anwendungen der Zellvermehrungsaktivität dieser Zusammensetzungen schließen eine topische Verabreichung, zum Beispiel bei Brandwunden- oder Wundheilung oder zur Gewebereparatur ein. Bei solchen Verwendungen wird eine wirksame Menge dieser Peptide mit pharmakologisch verträglichen Trägern formuliert. Eine wirksame Menge dieser Peptide ist eine Menge, die ausreichend ist, um eine Zellvermehrung in Weichteilen zu induzieren.
Topische Dosierungsformen der Peptide können zum Beispiel als Sprays, Gele, Salben oder Pflaster formuliert werden. Geeignete Dosierungsformen sind solche, die pharmakologisch verträglich sind und in die eine solche Menge der Peptide verteilt werden kann, dass eine Diffusion einer wirksamen Menge der Peptide zu der zu behandelnden Stelle erfolgen kann. Die Peptide können allein oder in Kombination in einer polymeren Substanz dispergiert oder darin inkorporiert werden und Implantate können damit beschichtet werden. Solche Implantate schließen weiche und harte Kollagen-Gewebeimplantate, Prothesen, Schwämme, Wundverbände und Nähte ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Peptide regulieren die lokalen Entzündungsreaktionen an diesen Fremdkörpern und fördern das Anfügen der Implantate, insbesondere der Prothesen. Da solche Implantate oft aus permeablen Materialien hergestellt sind, können die in den Implantaten eingebrachten Peptide aus dem Implantat diffundieren und ihre Eigenschaften entfalten.
Die Peptide können auch systemisch nützlich sein, zum Beispiel bei der Behandlung von Knochenschädigungen, wie Osteoporose oder Osteopetrose. Für eine derartige Behandlung werden die Peptide in therapeutisch wirksamen Mengen mit injizierbaren Trägern formuliert und dem Patienten parenteral verabreicht. Die Dosis liegt typischerweise im Bereich von etwa 0,001 ug/kg bis 10 g/kg mit einem bevorzugten Bereich von etwa 100 ug/kg bis 1 g/kg.
Systemische Dosierungsformen können für eine gastrointestinale Verabreichung (d. h. Flüssigkeiten, Pillen, Tabletten oder Suppositorien) oder für eine parenterale Injektion formuliert werden. Die Bestimmung der bei solchen Anwendungen verwendeten Dosierungen liegt in der Erfahrung des Fachmanns und hängt von Faktoren ab, wie der Natur des zu behandelnden Zustandes, der Größe des Patienten und dem Ansprechverhalten auf die verabreichten Peptide und sind daher vom Pflegepersonal zu bestimmen.
Die Peptide können als Onkostatlka bei jedem Typ von zellulärem Neoplasma, eingeschlossen Karzinome, Myelome, Melanome und Lymphome, verwendet werden, ohne Beschränkung darauf. Besonders bevorzugte Angriffspunkte sind Brust-, Lungen-, Dickdarm- und Ovarialkarzinome. Die Peptide können lokal oder systemisch verabreicht werden, abhängig von der Art und dem Stadium des zu behandelnden Neoplasmas. Für eine lokale Verabreichung werden eine onkostatisch wirksame Menge der Peptide oder damit formulierte Gemische mit einem pharmakologisch verträglichen Träger kombiniert und als festes oder halbfestes Implantat verabreicht, welches in einer andauernden oder kontrollierten Abgabeform vorliegen kann oder nicht. Die Peptide können für eine parenterale Verabreichung auch in einer injizierbaren Form formuliert werden.
Alternativ können die Peptide festen Tumoren, insbesondere inoperablen Tumoren zugeführt werden durch Einsatz der derzeitigen Kathetertechnologie für eine lokale Versorgung über eine arterielle Zuführung in den Tumor. Bei dieser Indikation werden die Peptide mit einem vasooclusiven Mittel, wie injizierbarem Kollagen, vermischt, welches ein Mittel zur Verminderung der Durchblutung des Tumors und gleichzeitig die lokalisierte Zuführung der Peptide liefert. Zum Verschließen des venösen Abflusses können auch Clips verwendet werden und so hohe Dosen der Peptide in der Tumormasse aufrechterhalten werden.
Für eine systemische Verabreichung werden onkostatisch wirksame Mengen der Peptide für eine Injektion in den Kreislauf mit für wasserlösliche Proteine verwendeten, pharmakologisch verträglichen Trägern vermischt, eingeschlossen physiologische Kochsalzlösung, Zuckerlösungen und ähnliche, ohne darauf beschränkt zu sein. Alternativ können die Peptide als eine dauerhaft abgebende Zusammensetzung formuliert werden, die die Peptide über eine verlängerte Zeitspanne in den Kreislauf abgibt.
Eine spezifische zielgerichtete Anwendung des Faktors auf Tumorzellen kann bei systemischen Anwendungen zum Beispiel durch Konjugation eines Peptides an den gegen das (die) Tumoroberflächenzellen-spezifische(n) Antigen(e) gerichteten Antikörper bewerkstelligt werden. Eine verstärkte Tumorzellen-Cytotoxizität kann durch kovalentes radioaktives Markieren des fibrinogenen Peptides mit ¹³¹I, einem cytotoxischen Mittel, bewerkstelligt werden. Die Peptide werden leicht iodiert und behalten ihre volle biologische Aktivität. Die Herstellung monoclonaler Antikörper, die für besondere Tumorarten, wie Brust- oder Ovarialtumore spezifisch sind, ist in dem Fachgebiet gut bekannt. Andere Onkostatlka oder chemotherapeutische Medikamente können, falls gewünscht, in der Formulierung ebenfalls enthalten sein.
Der Begriff "onkostatisch wirksam" ist gedacht für eine Dosis, die eine signifikante (> 50%) Hemmung der Tumorzellenproliferation bewirkt. Bei in vitro-Tests wird eine 50%ige Hemmung im allgemeinen bei TGF-β Konzentrationen in der Größenordnung von 0,2 ng/ml beobachtet und eine Sättigung wird bei 10 ng/ml erreicht. Die Hemmung kann in vivo durch Überwachung der Beschwerden des Tumorpatienten kontrolliert werden. Die bei vorgesehener Behandlung onkostatisch wirksame Dosis des Peptides hängt ab vom Patienten, der Art und dem Stadium des zu behandelnden Krebses und der Art und Weise der Verabreichung. Im allgemeinen liegen die Mengen, die einem erwachsenen Menschen verabreicht werden, im Bereich von etwa 0,001 ug/kg bis 10 g/kg. Eine entsprechende systemische Verabreichung umfasst den höheren Abschnitt des Bereiches (100 ug/kg bis 1 g/kg) wegen Clearence oder einer anderen in situ-Inaktivierung des Polypeptides.
Die Peptide sind sowohl bei der Behandlung lokaler als auch systemischer Entzündungen nützlich. Wenn sie als ein lokal entzündungshemmendes Mittel verwendet werden, werden die Peptide üblicherweise in wirksamen Mengen mit pharmakologisch verträglichen Trägern in Gewichtsverhätnissen im Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 20000 zum Träger formuliert.
Wenn die Peptide dazu verwendet werden, um Entzündungen an internen Stellen lokal zu behandeln, können sie allein oder in Kombination injiziert, inhaliert, operativ plaziert oder auf andere Weise lokal verabreicht werden, abhängig von der besonderen Formulierung und der Stelle, an der die Eindämmung der Entzündung stattfinden soll.
Für eine systemische Verabreichung können die Peptide mit konventionellen Trägern formuliert werden, die mit wasserlöslichen Proteinen für eine Injektion in den Kreislauf verwendet werden. Alternativ können sie als anhaltend abgebendes Implantat formuliert werden, wenn es die Indikation zur Behandlung so verlangt.
Beispiele von Formulierungen für systemische, topische oder parenterale Verabreichung können gefunden werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, Gernnaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1985, hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Die Menge der zur Behandlung einer Entzündung verabreichten Peptide hängt ab vom Patienten, dem zu behandelnden Entzündungszustand und von der Art und Weise der Verabreichung. Im allgemeinen liegen die an erwachsene Menschen verabreichten Mengen im Bereich von 1 mg bis zu 10 g. Wenn die Peptide lokal verabreicht werden, werden normalerweise Mengen im unteren Teil des Bereiches verwendet, typischerweise 1 ug bis 100 mg. Dementsprechend umfasst die systemische Anwendung typischerweise Mengen im Bereich von 100 ug/kg bis 1 g/kg.
Besonders wirksam können die Peptide bei der Behandlung von Entzündungen sein, die die Atmungsorgane erfassen. Bei dieser Anwendung können die Peptide durch Inhalieren eines geeigneten Aerosols verabreicht werden. In dieser Form würden die Peptide für eine Behandlung diffuser interstitieller Erkrankungen der Lunge nützlich sein, eingeschlossen sind (ohne darauf beschränkt zu sein) Asbestose, Sillkose oder Pneumoconiose der Bergleute; Erkrankungen, die den Atmungstrakt erfassen, eingeschlossen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, rheumatoide Arthritis, Lupus erythematodes oder Goodpasture-Syndrom, und die Behandlung der Granulomatose und der eosinophilen Granulomatose.
Die Peptide können mit Trägern in Form eines Pflasters, einer Salbe oder anderen topischen Formulierungen kombiniert werden, dabei können sie bei der Kontrolle von Entzündungen der Haut durch topische Anwendung nützlich sein. Solche Formulierungen sind besonders nützlich bei der Behandlung von Hautzuständen, eingeschlossen, ohne darauf beschränkt zu sein, Psoriasis vulgaris, Kontaktdermatitis, Hautgeschwüre und akute oder chronische ekzematöse Dermatitis.
Die Peptide können entweder allein oder kombiniert mit einem langsam abgebenden Träger verwendet werden und in oder um Gelenke, Knochen oder Muskeln zur Wundheilung oder Überwachung der mit verschiedenen Krankheiten verbundenen Entzündungen injiziert werden. Solche Erkrankungen schließen Myositis (infolge viraler, bakterieller, parasitärer, fungaler oder Autoimmunvorgänge), Myasthenia gravis, Osteomyelitis, Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Da sich gezeigt hat, dass TGF-β Moleküle bei niedrigem pH stabil und resistent gegenüber enzymatischer Verdauung sind, können diese Faktoren gastrointestinal zugeführt werden. Die Peptide sind daher besonders nützlich bei der Behandlung gastrointestinaler Erkrankungen, eingeschlossen gastritische und. Zwölffingerdarmgeschwüre, granulomatöse Gastritis, Oesophagitis, Enteritis und Colitis, ohne darauf beschränkt zu sein.
Es wurde auch gezeigt, dass die TGF-βs bei der Behandlung eines septischen Schocks wirksam sind. Internationale Veröffentlichung Nummer WO 90/000903, angemeldet am 21. Juli 1989. Die Peptide können prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden, d. h. vor oder gleichzeitig mit oder nachdem eine Infektion eingetreten ist. Die Peptide können zur Behandhmg von Patienten verwendet werden, die im Hinblick auf eine bakterielle Infektion Risikopatienten sind oder die an einer Blutvergiftung leiden. Risikopatienten schließen diejenigen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, die eine immunsuppressive Therapie empfangen und diejenigen, die an schweren Hitzeverbrennungen oder anderen ernsten Verletzungen leiden, an Mukoviszidose, Nierenversagen oder Krebs, oder die sich ausgedehnten operativen Eingriffen oder Organtransplantationen unterziehen.
Die Peptide können weiterhin dazu verwendet werden, einen Patienten mit einer Indikation zu behandeln, die mit einer Dysfunktion oder Fehlfunktion der Hämatopoese oder Lymphopoese verbunden ist. Die Peptide können diesen Patienten mittels jeder geeigneten Technik, einschließlich wie oben erörtert, systemisch oder lokal verabreicht werden, wobei für die Erfordernisse des individuellen Patienten die Methoden der Verabreichung und anderer dem Praktiker bekannte Faktoren in Betracht gezogen werden. Die Dosen werden typischerweise im Bereich von etwa 100 ug/kg bis 1 g/kg liegen.
Die Peptide können auch dazu verwendet werden, hämatopoetische Stammzellen vor einer Myelotoxizität chemotherapeutischer Arzneistoffe, wie Cyclophosphamid und Mephalan, oder Strahlentherapie zu schützen. Bei solchen Anwendungen wird eine therapeutisch wirksame Menge der Peptide üblicherweise 3-72 Stunden vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Wirkstoffs oder der Strahlentherapie gegeben. Die Art und Weise der Verabreichung ist bevorzugt interfemoral arteriell, intraperitoneal oder subkutan, und wird bevorzugt durch Injizieren vorgenommen. Zusammensetzungen und Dosen können so wie für obige Anwendungen erörtert, vorgenommen werden, wobei die Erfordernisse des individuellen Patienten, die Art des verwendeten Arzneistoffs oder der verwendeten Strahlentherapie, der Methode der Verabreichung des Mittels und andere dem Praktiker bekannte Faktoren in Betracht zu ziehen sind. Die Dosen werden typischerweise im Bereich von 100 ug/kg bis 1 g/kg liegen.
TGF-β kann auch zur Prävention einer schweren, von einer Reperfusion des ischämischen Myokards herrührenden Herzschädigung verwendet werden. Lefer et al., Science, 249: 61 (1990). Die Peptide können dazu vor oder nach dem Eintritt der Ischämie, vorzugsweise intravenös oder intrakardial verabreicht werden. Die Peptidzusammensetzungen und -dosen können so wie für obige Anwendungen erörtert, vorgenommen werden, wobei die Erfordernisse des individuellen Patienten und andere dem Praktiker bekannte Faktoren in Betracht zu ziehen sind. Die Dosen werden typischerweise im Bereich von 100 ug/kg bis 1 g/kg liegen.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, dem Fachmann auf diesem Gebiet eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu geben, wie die Peptide herzustellen, die Zusammensetzungen zu formulieren und in Verbindung mit der Erfindung zu verwenden sind; eine Begrenzung des Umfanges der Erfindung ist damit nicht beabsichtigt.

Beispiel 1 - Peptidsynthese

Die folgenden Peptide wurden synthetisiert:
TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1; entspricht den TGF-β1-Resten 16 bis 31 und hat die Aminosäuresequenz CVRQLYIDFRKDLGWK.
TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1; entspricht den TGF-β2-Resten 16 bis 31 und hat die Aminosäuresequenz CLRPLYIDFKRDLGWK
TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7; entspricht den TGF-β1-Resten 16 bis 47 und hat die Aminosäuresequenz CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGP.
TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7; entspricht den TGF-β2-Resten 16 bis 47 und hat die Aminosäuresequenz CLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGN
Die Peptide wurden mit einem Peptidsyntheseapparat "Applied Biosystems model 431A" (Applied Biosystems) unter Verwendung von Fmoc-Aminosäuren synthetisiert. Die Fmoc- Aminosäuren wurden über Reaktionen gekoppelt, die durch N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder [2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) in 1-Hydroxybenztriazol (HOBt) vermittelt wurden. Das Peptidsyntheseprotokoll wurde so modifiziert, dass bestimmte Reste doppelt gekoppelt und die Kupplungszeiten verkürzt wurden, um den vorzeitigen Abbruch der Peptidsynthese durch Diketopiperazinbildung auf ein Minimum zu reduzieren. Die Peptide wurden auf 4-Hydroxymethylphenoxymethylcopolystyrol-1% Divinylbenzolharz (HMP-Harz) synthetisiert. Die reaktiven Stellen des HMP-Harzes wurden mit Essigsäureanhydrid geschützt, worauf die Addition des ersten Restes folgte.
Das rohe Peptid (annähernd 250 umol) wurde vom Harz in 11,25 ml 89% TFA, das 0,75 g kristallines Phenol, 0,25 ml Ethylendithiol, 0,5 ml Thioanisol und Wasser enthielt, bei Raumtemperatur über 1,5 Std. abgespalten. Das Harz wurde durch Filtration durch einen Glasfilter entfernt und das Filtrat wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 30ºC auf 2 ml konzentriert. Das rohe Peptid wurde durch Zusatz von 50 ml eiskaltem Diethylether ausgefällt und durch Filtration gesammelt. Das rohe Peptid wurde in 0,1% TFA, 30% Acetonitril gelöst und gefriergetrocknet. Das getrocknete Peptid wurde bei -20ºC aufbewahrt.
Das getrocknete rohe Peptid wurde in 0,1% TFA, 18% Acetonitril gelöst und über eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (1 · 25 cm, Vydac (ein eingetragenes Warenzeichen), C18TP510) chromatographiert. Die Peptide wurden mit einem linearen Acetonitrilgradieaten in 0,1% TFA eluiert. Der Peak, der das gewünschte Peptid enthielt, wurde durch N-terminales Sequenzieren identifiziert und durch Aminosäureanalyse bestätigt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem BCA-Test (Pierce, Rockford, IL) bestimmt. Die reduzierten Formen der Cysteinreste wurden unter Verwendung von 5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure) getestet. Ellman, Arch, Biochem, Biophys., 74: 443 (1958).
Um die Peptide zu dimerisieren, wurden Disulfidbindungen wie folgt gebildet. Gereinigtes Peptid wurde in 20% Acetonitril/80% verdünntem Ammoniumhydroxid bei 5 mg/ml aufgelöst (pH-Wert mit 3% Ammoniumhydroxid auf 8,5 bis 9,5 eingestellt). Nach 1 bis 16 Std. Rühren wurde der gebildete Niederschlag durch Senken das pH-Wertes auf annähernd 2 mit 10% TFA aufgelöst. Die Reaktionsmischung wurde auf eine C18-Umkebrphasen-HPLC-Säule (1 · 25 cm, Vydac, C18TP510) aufgetragen und mit einem linearen Acetonitrilgradienten in 0,1% TFA eluiert. Die dimeren Formen der Peptide wurden identifiziert durch die Verschiebung des Peaks der Eluierungsposition relativ zu den monomeren Peptiden. Monomere und dimere Formen wurden über einen Test auf nicht disulfidgebundene Cysteinreste und durch Massenspektroskopie nachgewiesen.

Beispiel 2 - Zellproliferation - Hemmtest

über TGF-β ist bekannt, dass es die Proliferation der Lungenepithelzellen des Nerzes hemmt. Der Nerzlungenepithelzellentest wurde benutzt, die Fähigkeit der Peptide zu testen, die biologische Aktivität von TGF-β nachzuahmen.
Lungenepithelzellen des Nerzes (ATCC, Rockville, MD, MvlLu CCL64) wurden auf 0,5-1,0 · 10&sup6; Zellen/Platte in 100 mm Kulturschalen ausplattiert und in Eagle's Minimalmedium (MEM), ergänzt durch 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin, nicht-essen tielle Aminosäuren, L-Glutamin und 10% fetales Rinderserum (FBS), wachsen gelassen. Während die Zelldichte subkonfluent war, wurden die Zellen subkultiviert. Die Zellen wurden mit Trypsin abgenommen, durch 2 Min. Zentrifugieren bei 800 · g gesammelt und in dem Kulturmedium auf 20 000 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen auf 1000 Zellen (50 ul)/Vertiefung ausplattiert.
Die Peptide TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;, TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;, TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;, TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7; in monomeren und dimeren Formen wurden in Anwesenheit von sterilem Rinderserumalbumin (BSA)-Träger gefriergetrocknet. 50 ul-Proben der Peptide wurden in dem Zellkulturmedium aufgelöst und den Vertiefungen in dreifacher Ausführung zugesetzt. Rekombiniertes menschliches TGF-β2 wurde als Standard verwendet. Die Platten wurden unter einer 5% CO&sub2;/95% (Vol%)-Luftatmosphäre bei 37ºC 4 Tage inkubiert.
Die Anzahl der Zellen/ Vertiefung war in diesem Test proportional zur Aktivität des konstitutiv exprimierten Enzyms saure Phosphatase. Um die Aktivität der sauren Phosphatase zu messen, wurden die Vertiefungen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, mit 100 ul 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5/0,1% Triton X-100 (ein eingetragenes Warenzeichen)/100 mM p-Nitrophenylphosphat gefüllt und die Platten bei 37ºC 2 Stunden inkubiert. Jeder Vertiefung wurden 10 ul 1,0 N NaOH zugesetzt und nach 20 Min. bei Raumtemperatur wurde die Extinktion bei 405 nm gemessen.
Einige der synthetischen Peptide und TGF-β2 hemmen die Proliferation der Lungenepithelzellen des Nerzes in einer von der Dosis abhängigen Weise (Fig. 1), wie es durch die Abnahme der Extinktionswerte angezeigt wird. Die Hemmkurve von TGF-β2 ist zum Vergleich in jeder Figur inbegriffen. Die genäherten Konzentrationen, bei denen ein gegebenes Peptid und TGF-β2 die Zellproliferation halbmaximal (ED&sub5;&sub0;) hemmen, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1
Das TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;-Dimer hemmt die Proliferation der Lungenepithelzellen des Nerzes mit einer ED&sub5;&sub0; von 1-3 uM, vergleichbar mit den kürzlich für dieses Peptid angegebenen Werten für die spezifischen Aktivität. Chen et al, J. Bone Min. Res., 5: Abstract 26; und WO 90/14359. TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;, ein zu dem TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;-Peptid homologes Peptid war in diesem Test weder in monomerer noch in dimerer Form aktiv. Die Aktivität des synthetischen TGF-β&sub1;- Peptids stieg beträchtlich an, wenn 16 zusätzliche carboxyterminale Aminosäurereste addiert wurden, um TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7; zu erzeugen. Das Dimer von TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7; zeigte eine ED&sub5;&sub0; von etwa 150 nM. Das TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptidmonomer zeigte etwas Aktivität. Im Gegensatz zu allen Peptiden, die aufgeführt wurden, zeigte das TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptiddimer eine ED&sub5;&sub0; von etwa 4-14 nM. Zum Vergleich, Rinderknochen-TGF-β2 hemmt die Proliferation der Zellen mit einer ED&sub5;&sub0; von 0,4 bis 1,0 pM. BSA alleine war in diesem Test inaktiv. So besitzt das dimerisierte TGF- β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7; etwa 11 bis 38 mal mehr Aktivität als das dimerisierte TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;. Keines der monomeren Peptide war unter uM aktiv.
Es sollte angemerkt werden, dass die Aktivitäten dieser Peptide, wenn sie in dem Zellkulturtest ohne vorhergehende Gefriertrocknung getestet wurden, mit den Peptiden vergleichbar waren, die vor dem Test zusammen mit dem BSA-Träger gefriergetrocknet wurden.

Beispiel 3 - Hemmung der Proliferation von murinen Thymocyten

Um die Wirkung der Peptide auf die Proliferation anderer Zelltypen als den Lungenepithelzellen des Nerzes zu testen, wurden murine Thymocyten den Peptiden ausgesetzt. Die Proliferation wurde gemessen, indem die Menge des in die Thymocyten-DNA als Antwort auf die Peptide eingebauten 3H-Thymidins bestimmt wurde. Der Zellkulturtest wurde durchgeführt, wie von Ellingsworth et at, Cell. Immunol., 114: 41-54 (1988) beschrieben. Aus 4 bis 8 Wochen alten C3H/HeJ-Mäusen wurden Einzelzellsuspensionen der Thymocyten hergestellt und die Zellen wurden in Eagle's MEM, das mit 5% fetalem Kälberserum (FCS),100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ugg/ml Streptomycin, 2mM L-Glutamin und 50 uM β-Mercaptoethanol ergänzt wurde, auf 6,66 · 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Die Thymocyten wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen auf 106 Zellen pro Vertiefung (150 ul) plattiert. Die Zellen wurden mit 1,0 ug/ml Phytohämagglutinin und 8 Einheiten/ml Interleukin-1 (IL-1) (Boehtmger Mannheim, Indianapolis, IN) aktiviert. 0,02 bis 200 umol der Peptide oder 0,02 bis 50 fmol TGF-β2 wurden zugesetzt und mit Kulturmedium auf ein Gesamtvolumen von 250 ul eingestellt. Die Zellen wurden bei 37ºC 72 Std. in einem befeuchteten Inkubator in einer 5% CO&sub2;-95% Luftatmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Zellernte mit 0,5 uCl/Vertiefung von 3H-Thymidin gepulst. Die Thymocyten wurden auf Glasfaserfiltern geerntet und getrocknet. Die Menge des eingebauten ³H-Thymidins wurde mittels Flüssigkeits- Szintlllationszähhnethode bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass TGF-β2 den Einbau von ³H-Thymidin in die DNA der murinen Thymocyten mit einer ED&sub5;&sub0; von annähernd 4 pM hemmt. Das TGF-β2&sub1;&sub2;&submin;&sub4;&sub7;- Dimer war in diesem Test demnach als Inhibitor der Thymocytenproliferation mit einer ED50 von 57 nM aktiv. Jedoch weder das TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;-Dimer noch das TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;-Dimer beeinflussen den Einbau von ³H-Thymocyten bei Konzentrationen bis 0,8 uM.

Beispiel 4 - TGF-β-Rezeptor-Bindungstest

Rattenmuskelmyoblasten (L6, American Type Culture Collection) wurden in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen plattiert und in DMEM, ergänzt mit 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 10% FBS, gezüchtet bis die Zellen zu 70-90% konfluent waren. Das Medium wurde aus den Vertiefungen abgesaugt und jeder Vertiefung 1 ml eiskaltes 20 mM Glycin, 135 mM NaCl, pH 3,0 2 Min. zugesetzt. Der Puffer wurde abgesaugt und jede Vertiefung wurde zweimal mit 1 ml DMEM, 25 mM Hepes, pH 7,4, 0,1% BSA gespült. Proben von TGF-β1 und TGF-β2 (3 bis 1600 pM) und der Peptide (0,1 bis 30 uM), die jeweils 25 pM ¹²&sup5;I-TGF-β1 oder ¹²&sup5;I-TGF-β2 enthielten, wurden in DMEM, 25 mM Hepes, pH 7,4, 0,1% BSA hergestellt und den Vertiefungen 500 ul-Aliquots zugesetzt. Proben von radioaktiv markiertem TGF-β (500 ul) entweder ohne nicht markiertes TGF-β oder mit überschüssigem nicht markiertem TGF-β (20-25 nM) wurden hergestellt und den anderen Vertiefungen zugesetzt. Nach 1 Std. Inkubation bei Raumtemperatur wurde jede Vertiefung zweimal mit 1 ml abgeglichener Hank's Kochsalzlösung, 0,1% BSA gespült. Zu jeder Vertiefung wurden 500 ul 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 20 mM Hepes, pH 7,4, 0,01% BSA zugesetzt und zur Lyse der Zellen bei 37ºC 30 Min. unter Rotation inkubiert. Die Proben wurden in Gammazählfläschchen übertragen und jeweils 1 Min. gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Die Fähigkeit der Peptide, gegen die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β an L6-Ratten-muskelmyoblasten zu konkurrieren.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass bei L6-Rattenmuskelmyoblasten TGF-β1 gegen die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β1 und TGF-β2 gegen die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β2 konkurrieren, wie kürzlich von Segarini et al., J. Biol. Chem, 262: 14655-14662 (1987) berichtet wurde. Aus den Daten der konkurrierenden Bindung wurden die scheinbaren Dissoziationskonstanten zu 10 bis 30 pM für TGF-β1 und 100-130 pM für TGF-β2 bestimmt. Für TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;- und TGF- β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptidmonomere und TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;- und TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;-Peptidmonomere und -dimere wurde gefunden, dass sie bei Konzentrationen bis zu 30 uM entweder inaktiv oder schwach aktiv bei der Konkurrenz gegen die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β1 oder ¹²&sup5;I-TGF-β2 sind. TGF- β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;Dimer konkurriert jedoch gegen die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β2 mit einer scheinbaren Dissoziationskonstante von annähernd 3 uM. TGF-β1&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;-Peptiddimer konkurriert gegen die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β1 mit einer scheinbaren Dissoziationskonstante von 10&supmin;¹&sup5; uM.

Beispiel 5 - Lokalisierung der TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptidaktivität und der Disulfidbindungen

Um die für die biologische Aktivität verantwortlichen Regionen des TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptids zu lokalisieren, wurde TGF-β&sub3;&sub2;&submin;&sub4;&sub7; synthetisiert und mit TGF-β&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1; verglichen. Das TGF-β&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;- Peptid, die N-terminale Hälfte des TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptids, erwies sich bei den Nerzlungenepithelzell- und Thymocytproliferationstests sowie beim Rezeptorbindungstest, ausgeführt wie vorstehend erörtert, als inaktiv. Die dimere Form des TGF-β&sub3;&sub2;&submin;&sub4;&sub7;-Peptids wurde hergestellt durch Erzeugen einer Disulfidbindung bei Cys&sub4;&sub4; zwischen den zwei monomeren Peptiden. Tabelle 3 Konkurrenz gegen ¹²&sup5;I-TGF-β2 bei der Bindung an L6 Rattenmuskelmyoblast-TGF-β-Rezeptor
Wie in Tabelle 3 gezeigt, konkurriert das TGF-β2&sub3;&sub2;&submin;&sub4;&sub7;-Peptid als Monomer und als Dimer bei Konzentrationen bis 30 uM nicht gegen die Bindung von ¹²&sup5;I-TGF-β2 an L6 Rattenmuskelmyoblasten. Desweiteren hemmen die Peptide, wie in Tabelle 4 gezeigt, als Monomer und Dürer bei Konzentrationen bis 10 uM die Proliferation der Lungenepithelzellen des Nerzes nicht. Obwohl die TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub1;- und TGF-β2&sub3;&sub2;&submin;&sub4;&sub7;-Peptide in diesem Test nicht aktiv waren, sitzt die Aktivität des TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptids im Peptid mit der vollen Länge.
Das TGF-β&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Pepfid enthält zwei Cysteinreste, Cys&sub1;&sub6; und Cys&sub4;&sub4;. Durch Testen auf die reduzierte Form des Cysteins ist gezeigt worden, dass die zwei Monomere eher durch eine einzige Disulfidbindung verbunden sind, als durch zwei Disulfidbindungen, an denen sowohl Cys&sub1;&sub6; als auch Cys&sub4;&sub4; beteiligt sind. Die Dimerisierung kann so durch eine Disulfidbindung zwischen Cys&sub1;&sub6;-Cys&sub1;&sub6;, Cys&sub4;&sub4;-Cys&sub4;&sub4; oder Cys&sub1;&sub6;-Cys&sub4;&sub4; erfolgen. Zwei Peptide, TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Ser&sub1;&sub6; und TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;Ser&sub4;&sub4;, in denen Cys&sub1;&sub6; beziehungsweise Cys&sub4;&sub4; durch Serin substituiert wurde, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert. Jedes dieser Peptide war fähig, zu ähnlichen Peptiden zu dimerisieren, nur durch Erzeugen von Cys&sub1;&sub6;-Cys&sub1;&sub6;- oder Cys&sub4;&sub4;-Cys&sub4;&sub4;-Disulfidbindungen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Aktivitäten des TGF-β2&sub3;&sub2;&submin;&sub4;&sub7;Peptids und TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Pepfids mit Cys- zu Ser- Substitutionen. Hemmung der Proliferation von Nerzhmgenepithelzellen.
Die aus Tabelle 4 erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass das TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;Ser&sub1;&sub6;-Peptidmonomer und -dimer die Proliferation der Lungenepithekellen des Nerzes mit einer ED&sub5;&sub0; von 1,3 uM beziehungsweise 380 nM hemmen. Während das TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;Ser-Peptiddimer die Zellproliferation mit einer ED50 von 450 nM hemmt, war das Peptidmonomer bei Konzentrationen bis 10 uM Inaktiv.
So sind diese Ser-substituierten Peptide bei der Hemmung der Proliferation von Lungenepithelzellen des Nerzes deutlich weniger aktiv als das TGF-β2&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub7;-Peptiddimer. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Peptiddimer mit einer Disulfidbindung zwischen Cys&sub1;&sub6; des einen Peptids und Cys&sub4;&sub4; des anderen Peptids die Form ist, die bei der Hemmung der Proliferation von Lungenepithelzellen des Nerzes mit einer ED&sub5;&sub0; im Bereich von 4-14 nM am aktivsten ist.

Claims

1. Peptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz CLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGA (Sequenz ID Nr. 2) oder einem Homolog davon, wobei das Homolog zu mindestens 70% homolog mit der Aminosäuresequenz CLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGA (Sequenz ID Nr. 2) ist.

2. Peptid, bestehend aus einer Polymerform eines Peptids nach Anspruch 1.

3. Homodimeres Peptid, bestehend aus einer monomeren Aminosäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Monomeren über mindestens eine Interpeptid-Disulfidbindung zwischen mindestens einem Satz von Cysteinresten verknüpft sind.

4. Peptid nach Anspruch 3, wobei

(a) die aminoterminalen Cysteinreste über eine Disulfidbindung verknüpft sind,

(b) die carboxyterminalen Cysteinreste über eine Disulfidbindung verknüpft sind, oder

(c) der aminoterminale Cysteinrest eines Monomers mit dem carboxyterminalen Rest des anderen Monomers verknüpft ist.

5. Peptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGP (Sequenz ID Nr. 1) oder einem Homolog davon, wobei das Homolog zu mindestens 70% homolog mit der Aminosäuresequenz CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGP (Sequenz ID Nr. 1) ist.

6. Peptid, bestehend aus einer Polymerform eines Peptids nach Anspruch 5.

7. Homodimeres oder homotrimeres Peptid, bestehend aus einer monomeren Aminosäuresequenz nach Anspruch 5, wobei die Monomeren über mindestens eine Interpeptid-Disulfd-Verbindung zwischen mindestens einem Satz von Cysteinresten verknüpft sind.

8. Peptid nach Anspruch 7, wobei

9. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid gemäß der Definition in einem der vorangehenden Ansprüche und einen pharmakologisch verträglichen Träger dafür.

10. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in einem Verfahren für Behandlungen des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.

11. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Nachahmung der Wirkung von TGF-βs.

12. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Entzündung.

13. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in der Herstellung eines Medikaments zur Induktion von Knorpel-/Knochenbildung, zur Behandlung von zellulärem Neoplasma, zur Behandlung fester Tumoren, zur Behandlung einer Indikation, die mit einer Funktionsstörung der Hämatopoese oder Lymphopoese verbunden ist oder zum Schutz hämatopoetischer Stammzellen vor Myelotoxizität von chemotherapeutischen Wirkstoffen.