DE69411268T2

DE69411268T2 - Verfahren zur schnellen quantifizierung von microorganismenwachstum

Info

Publication number: DE69411268T2
Application number: DE69411268T
Authority: DE
Inventors: Scott D. Saint Paul Mn 55133-3427 Morgan
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1993-05-14
Filing date: 1994-04-05
Publication date: 1999-03-04
Anticipated expiration: 2014-04-06
Also published as: EP0698084B1; JPH08510123A; AU6700494A; JP3749933B2; WO1994026870A1; DE69411268D1; EP0698084A1; US5510246A

Description

Verfahren zur schnellen Quantifizierung von Mikroorganismenwachstum

Die Erfindung betrifft eine automatisierte Zählung von Mikroorganismuskolonien auf einer inokulierten Oberfläche. Insbesondere sorgt das erfindungsgemäße Verfahren für eine Früherkennung und Zählung von Mikroorganismuskolonien auf einer inokulierten Oberfläche durch den Nachweis früher Veränderungen vorgegebener Anzeichen von Koloniewachstum.
Es sind verschiedene Verfahren und Vorrichtungen zum Zählen von Mikroorganismuskolonien bekannt, die beispielsweise in Petrischalen gezüchtet werden. Bekannt ist das manuelle Zählen von Kolonien durch ausgebildetes Laborpersonal. Dieses Verfahren hat viele Nachteile, einschließlich der Kosten, die mit dem Einsatz qualifizierter Techniker zur Ausführung der zeitraubenden, schwierigen Aufgabe der manuellen Zählung verbunden sind, sowie der begrenzten Genauigkeit der erhaltenen Zählwerte.
Diese Probleme werden weiter kompliziert, wenn eine Früherkennung von Mikroorganismuskolonien in kultivierten Petrischalen erforderlich ist. Die Früherkennung ist für Hersteller sehr nützlich, da sie dem Hersteller gestattet, die Produktion von wahrscheinlichen Ausschuß- oder Abfallprodukten abzubrechen und außerdem die Weiterverarbeitung derjenigen verunreinigten Produkte zu vermeiden, die zu zusätzlichen Kosten führen würde.
Ein Beispiel einer vorteilhaften Anwendung der Früherkennung liegt im Testen von Mikroorganismen in Nahrungsmittelprodukten. Es werden Proben der Produkte entnommen und Züchtungsvorrichtungen inokuliert und über eine Zeit von 24 oder mehr Stunden inkubiert, um Zählungen von Mikroorganismuskolonien zu erhalten, die den Verunreinigungsgrad im Produkt anzeigen. Wenn die Proben eine zu starke Verunreinigung enthalten, muß das Produkt oft verworfen werden. Eine zuverlässige Früherkennung und Quantifizierung einer zu starken Verunreini gung im Bereich von 6 bis 12 Stunden nach der Inokulation würde von den Herstellern begrüßt werden, da sie ihnen gestatten würde, verunreinigte Produkte bei der Verarbeitung frühzeitig zu identifizieren, dadurch zusätzliche Kosten, die beim Verarbeiten eines Produkts entstehen, das dann verworfen wird, und eine mögliche Verunreinigung weiterer Produkte durch Behandlung in verunreinigten Verarbeitungsanlagen zu vermeiden.
Die Früherkennung einer zu starken Verunreinigung kann zwar unter Verwendung von Züchtungsvorrichtungen durch Techniker ausgeführt werden, aber die Ausführung von Zählungen durch Techniker ist gegenüber automatischen Nachweissystemen mit Nachteilen verbunden.
Ein wichtiger Indikator eines frühen Koloniewachstums ist die Wachstumsrate oder -änderung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ablesungen der Züchtungsvorrichtungen. Für einen menschlichen Techniker ist es schwierig, wenn nicht unmöglich, die Wachstumsrate genau abzuschätzen oder die winzigen Änderungen von Wachstumsanzeichen für möglicherweise Hunderte von Züchtungsvorrichtungen zu unterscheiden, die alle durch einen einzigen Techniker überwacht würden. Außerdem ist der Einsatz von Technikern für Koloniezählungen typischerweise teurer, und in Anbetracht der zusätzlichen, mit der Früherkennung verbundenen Schwierigkeiten ließe sich erwarten, daß diese Kosten sogar noch höher sind.
Automatisierte Systeme zum Zählen von Mikroorganismuskolonien sind aber typischerweise auf die Erzeugung von Gesamtzählwerten voll inkubierter Wachstumsmedien ausgelegt, d. h. von Wachstumsmedien, die 24 Stunden oder länger inkubiert wurden. Die bekannten Systeme können in zwei Grundkategorien unterteilt werden.
Die erste Kategorie umfaßt Systeme, die Kameras oder Videoausrüstungen in Verbindung mit festverdrahteten Schaltungen oder Digitalrechnern verwenden, um die Anzahl von Kolonien in einer Züchtungsvorrichtung zu zählen oder Gesamtverunreinigungsgrade in Züchtungsvorrichtungen durch Messung der Gesamtlichtabsorption der Züchtungsvorrichtungen nachzuweisen. Beispiele derartiger Systeme werden in der EP-A-0 301 600, der US-A-3 811 036 (Perry), der US-A-5 003 611 (Miyake u. a.)und der FR-A-2 602 074 beschrieben.
Diese Systeme sind für die Zählung von Kolonien in Züchtungsvorrichtungen konstruiert, die über eine längere Zeit inkubiert wurden, wie z. B. 24 oder mehr Stunden, wie oben erörtert. Die Systeme sind nicht dafür ausgelegt, zuverlässige Frühzählungen an einer Züchtungsvorrichtung zu liefern.
Die zweite Kategorie automatisierter Zählsysteme verwendet typischerweise eine Matrix von Photodetektoren und festverdrahtete Schaltung zur Ausführung des Zählverfahrens. Diese Systeme liefern typischerweise Signale, die anzeigen, daß eine Kolonie entweder existiert oder nicht existiert. Sie liefern keine Information bezüglich der Stärke einer Kolonie oder ihrer Wachstumsrate zwischen den Intervallen. Da die Systeme nicht in der Lage sind, Angaben über die veränderlichen Intensitäten der Indikatoren zu liefern, die zur Bestimmung des Koloniewachstums verwendet werden, sind sie für die Früherkennung und Zählung von Mikroorganismuskolonien nicht besonders brauchbar.
Da die bekannten automatisierten Zählsysteme so konstruiert sind, daß sie Kolonien an einer voll inkubierten Züchtungsvorrichtung zählen, Gesamtverunreinigungsgrade in Züchtungsvorrichtungen durch Messung der Gesamtlichtabsorption der Züchtungsvorrichtungen erfassen oder lediglich Kolonien zählen, ohne die Intensität der Anzeichen eines Koloniewachstums zu messen, ist kein automatisiertes Verfahren zur Erzeugung einer zuverlässig genauen, frühen Zählung von Mikroorganismuskolonien bekannt.
Eine zuverlässige Früherkennung und Zählung kann jedoch durch Überwachung winziger Veränderungen eines oder mehrerer vorgegebener Anzeichen des Koloniewachstums ausgeführt werden. Zu derartigen Anzeichen können nicht sichtbare Indikatoren gehören, wie z. B. die von Mikroorganismuskolonien während des Wachstums produzierten Säuren oder Enzyme, und andere Anzeichen, die mit bloßem Auge sichtbar oder nicht sichtbar sein können.
Infolgedessen gibt es einen Bedarf für ein Verfahren, das einen frühen Nachweis und eine Quantifizierung von Mikro organismuskolonien in inokulierten Züchtungsvorrichtungen durch Nachweis frühzeitiger Veränderungen vorgegebener Anzeichen eines Koloniewachstums liefert.
Das erfindungsgemäße Verfahren stützt sich auf Veränderungen vorgegebener Anzeichen des Koloniewachstums in den frühen Inkubationsstadien, um die erfindungsgemäßen Vorteile einer Früherkennung bereitzustellen. Während der Abbildungsschritte erfaßte Daten werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verarbeitet, um den Nachweis geringfügiger Veränderungen der vorgegebenen Anzeichen zu verbessern.
Die bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Züchtungsvorrichtungen erzeugen eine spezifische Farbänderung, die durch die Gegenwart von Säure verursacht wird, welche durch Mikroorganismuskolonien während des Wachstums gebildet wird. Diese Farbänderung dient am Anfang der Inkubationszeit als Indikator des Koloniewachstums.
Das bei der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren zur Datenerfassung und -verarbeitung bietet bestimmte Vorteile für die Früherkennung des Koloniewachstums, die bei bekannten automatisierten Systemen und Nachweisverfahren nicht verfügbar sind und die auch nicht in angemessener Weise durch menschliche Techniker kopiert werden können.
Bei dem bevorzugten Verfahren ist jede Mikroorganismuskolonie von Säurebereichen umgeben, und die mit jeder Säurezone verbundene Farbänderung wird unter Verwendung empfindlicher Videogeräte nachgewiesen. Die erfaßten Daten werden dann nach dem erfindungsgemäßen Bildverarbeitungsverfahren verarbeitet und liefern eine zuverlässige, frühzeitige Quantifizierung von Mikroorganismuskolonien.
Diese und verschiedene andere Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gehen aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen hervor.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des Bildverarbeitungssystems zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer PETRI- FILMTM-Schale, die bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
Fig. 3 zeigt ein Ablaufdiagramm, das eine bevorzugte Ausführungsform des Datenerfassungsteils des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt.
Fig. 4 und 5 zeigen Ablaufdiagramme, die Teile einer bevorzugten Ausführungsform des Bildverarbeitungsteils des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen.
Fig. 6A und 6B zeigen schematische Darstellungen eines skalierten Zeitverlaufsbildes, das nach einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung verarbeitet wird.
Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung des Bildes von Fig. 6B, das weiterverarbeitet wurde.
Fig. 8 zeigt eine schematische Darstellung des Bildes von Fig. 7, das weiterverarbeitet wurde.
Nachstehend werden das bevorzugte sowie alternative erfindungsgemäße Verfahren beschrieben. Dabei wird auf Fig. 1-8 Bezug genommen, die verschiedene Merkmale des bevorzugten und alternativer Verfahren darstellen.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Komponenten eines bevorzugten Systems zur Ausführung des bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahrens. Gemäß der Darstellung weist das System 10 einen Hauptprozessor 12 und ein dazugehöriges Ausgabegerät 14 auf, wie z. B. einen Bildschirm und/oder einen Drucker. Der Hauptprozessor 12 steuert eine Stromquelle 18, welche die Lichtquellen 16 steuert. Der Hauptprozessor 12 steuert außerdem eine Videokamera 20 mit einem Objektiv 22 und einem Filtervorsatz 24. Unterhalb der Kamera 20 ist ein Träger 30 angeordnet, der so konstruiert ist, daß er mehrere Züchtungsvorrichtungen 32 aufnimmt, auf denen Mikroorganismen gezüchtet werden.
Die Lampen 16, die zur Beleuchtung der oberen Fläche des Trägers 30 verwendet werden, sind vorzugsweise normale ge radlinige 15 W Leuchtstoffröhren, die von General Electric geliefert werden; allerdings könnten nach Wunsch auch viele andere Lichtquellen eingesetzt werden. Eine ins Auge gefaßte alternative Lichtquelle wären kreisringförmige Leuchtstoffröhren.
Die Stromquelle 18 ist ein Lampenregler, der die den Lampen 16 zugeführte Elektroenergie so regelt, daß eine welligkeitsfreie Beleuchtung mit kontinuierlicher Intensität bereitgestellt wird. Die bevorzugte Stromquelle 18 führt der Leuchtstoffröhre 16 Elektroenergie mit einer Frequenz von 50 Hz zu. Die bevorzugte Stromquelle ist eine Mercron® FX0416-2, beziehbar von Mercron, Richardson, Texas.
Die zur Ausführung des bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Kamera 20 ist ein Modell Nr. MCD220 von Spectrasource Instruments, Westlake Village, Californien. Diese Kamera 20 wird Peltier-gekühlt, um das thermische Rauschen zu minimieren, liefert Bilder an den Hauptprozessor 12 mit 12 Bit pro Pixel und hat eine Auflösung von 192 mal 165 Pixel. Das bevorzugte Objektiv 22 ist ein normales, mit der bevorzugten Kamera 20 kombinierbares Zoom-Objektiv mit C-Fassung. Das Objektiv 22 wird im gewünschten Blickwinkel auf Schärfe eingestellt.
Der Hauptprozessor 12 ist vorzugsweise ein IBMkompatibler PC mit 486er Prozessor; obwohl jeder geeignete Mikroprozessor mit ausreichender Rechenkapazität und Fähigkeit zur Steuerung und zum Datenabruf eingesetzt werden könnte.
Da das bevorzugte Verfahren mit der Erfassung bestimmter Wellenlängen von reflektiertem Licht verbunden ist, wird das Objektiv 22 außerdem vorzugsweise mit einem Paar Bandfiltern 24 geliefert, die zwischen der Kamera 20 und den Züchtungsvorrichtungen 32 eingesetzt werden können, um das von den Züchtungsvorrichtungen 32 reflektierte Licht zu filtern. Beim bevorzugten Verfahren sind die Bandfilter 24 von Corion, in Holliston, MA, beziehbar.
Die bevorzugten Filter, die zur Ausführung der bevorzugten Verfahren verwendet werden, sind ein Rotfilter mit einem spektralen Maximum bzw. Peak bei 650 nm und einer Bandbreite von 40 nm. Das zweite bevorzugte Filter ist ein Grün filter mit einem spektralen Maximum bei 550 nm und einer Bandbreite von 40 nm. Die Bandbreite der Filter ist so gewählt, daß die Integrationszeit der Kamera 20 minimiert wird, während das Signal-Rausch-Verhältnis, d. h. der Kontrast, für die Abbildung optimiert wird.
Wie weiter unten diskutiert, ist die Auswahl der Filter 24 von den Eigenschaften abhängig, welche die auf den Züchtungsvorrichtungen 32 vorhandenen Kolonien aufweisen, und es können alternative Filter (oder gar keine Filter) eingesetzt werden, um auf der Grundlage der vorgegebenen Anzeichen eines Koloniewachstums brauchbare Bilder zu erhalten. Die endgültige Filterauswahl ist dem Fachmann bekannt und wird nicht weiter beschrieben.
Der Träger 30, der so konstruiert ist, daß er mehrere Züchtungsvorrichtungen 32 aufnimmt, ist vorzugsweise aus opakem Material geformt. In den bevorzugten Ausführungsformen entspricht das opake Material entweder der Hintergrundfarbe der abgebildeten Bereiche auf jeder Züchtungsvorrichtung 32 oder ist einfach schwarz, um das Überstrahlen in den Bildern zu minimieren.
Die Verwendung eines Trägers 30 mit mehreren Züchtungsvorrichtungen ist insofern vorteilhaft, als das System 10 die mehreren Züchtungsvorrichtungen 32 ohne Handhabung durch die Bedienungskräfte überwachen kann, die zu Fehlern bei der Justierung und/oder zu einer zusätzlichen Verunreinigung der Züchtungsvorrichtungen 32 durch die Handhabung führen kann. Der Träger 30 verhindert außerdem eine Verschiebung des Züchtungsmediums, die zu fehlerhaften Ergebnissen führen könnte. Es versteht sich jedoch, daß der Träger 30 wahlfrei ist, im bevorzugten System 10 aber wegen der oben beschriebenen Vorteile verwendet wird.
In einer Ausführungsform weist der Träger 30 Justiermarken 34 auf, die in unmittelbarer Nähe der Züchtungsbereiche in jeder Züchtungsvorrichtung 32 angebracht sind. Die Justiermarken 34 dienen als Justierungspunkte für das Abbildungssystem 10, um bei einer Bewegung des Trägers 30 zwischen Datenerfassungszeitpunkten für eine in hohem Maße reproduzierbare Genauigkeit zwischen aufeinanderfolgenden Abbildungen zu sorgen.
Unterhalb des Trägers 30 ist eine Heizmatte 36 angeordnet, die Wärme zur Inkubation der Züchtungsvorrichtungen 32 liefert. Die gesamte Anordnung des Trägers 30 und der Heizmatte 36 ist zur genauen und reproduzierbaren Verschiebung zwischen Datenerfassungspunkten für jede der Züchtungsvorrichtungen 32 auf dem Träger 30 vorzugsweise auf einem xy- bzw. Koordinatentisch (nicht dargestellt) montiert.
Obwohl zur Justierung durch die Abbildungseinrichtung die Justiermarken 34 benutzt werden können, wird anstelle der Justiermarken 34 die reproduzierbare Positionierung des xy- Tisches verwendet, um eine Justierung zwischen Datenerfassungspunkten zu erreichen. Der bevorzugte xy-Tisch sorgt für eine reproduzierbare Justierung mit einer Genauigkeit von weniger als einer Pixelbreite in x- und y-Richtung.
Das bevorzugte System 10 und das bevorzugte Verfahren zum Zählen von Mikroorganismen auf Züchtungsvorrichtungen sind beide hauptsächlich für Züchtungsvorrichtungen zum einmaligen Gebrauch ausgelegt, wie z. B. für PETRIFILM®-Schalen, beziehbar von der 3M Company, St. Paul, Minnesota. Insbesondere ist das bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren für die Verwendung mit einer Version von PETRIFILN -Schalen ausgelegt, die zum Nachweis des Vorhandenseins von Mikroorganismen in Proben von Nahrungsmitteln und anderen Produkten verwendet werden. Die bevorzugten Schalen sind so konstruiert, daß sie sichtbare Farbänderungen in Bereichen mit höherem pH-Wert erzeugen, die eine wachsende Mikroorganismuskolonie umgeben. In den bevorzugten Schalen entstehen die Farbänderungen durch eine im Züchtungsbereich der Schale eingebrachte Phenolrot-Schicht, die als Reaktion auf eine durch die Kolonien produzierte Säure einen gelb gefärbten Bereich auf dem roten Hintergrund erzeugt.
Es versteht sich jedoch, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit entsprechenden Modifikationen am Abbildungssystem 10 auch andere Züchtungsvorrichtungen 32, wie z. B. PETRIFILM®-Coliform-Count-Schalen (PCC-Schalen) oder normale Pe trischalen, anstelle der bevorzugten Schalen verwendet werden könnten.
Eine Ausführungsform einer PETRIFILM®-Schale 32 (weiter oben auch als Züchtungsvorrichtung bezeichnet) zur Verwendung bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist in Fig. 2 abgebildet. Die Schale 32 weist eine Unterlage 42 auf, auf der eine Sperre bzw. ein Damm 44 angeordnet ist. Der Damm 44 dient zur Bereitstellung einer Vertiefung bzw. Mulde für den Züchtungsbereich 48 der Schale 32. Entlang einem Ende der Schale 32 ist vorzugsweise eine flexible Abdeckung 46 angebracht.
Wegen einer vollständigeren Beschreibung von Züchtungsvorrichtungen zum einmaligen Gebrauch für Mikroorganismen, wie z. B. PETRIFILM®-Schalen, wird der Leser auf die US-A-4 565 783, Hansen u. a., verwiesen, in der solche Vorrichtungen offenbart werden. Die bevorzugte Chemie von PETRIFILM®-Schalen wird vollständiger in der US-A-5 364 766, eingereicht am 14. Mai 1993 von Mach u. a., beschrieben.
Der oben beschriebene Träger 30 ist besonders gut verwendbar für die gegenwärtige handelsübliche Ausführungsform der PETRIFILM®-Schale 32, da die Farbe des Schaumstoffdamms 44 weiß ist, was wegen seines hohen Reflexionsvermögens im Verhältnis zum Züchtungsbereich 48 zum "Überstrahlen" oder zur "Schlierenbildung" der durch die Kamera 20 erzeugten Bilder führen kann. Das Überstrahlen kann die Qualität der Abbildung und jeder späteren Bildverarbeitung stark beeinträchtigen. Aus diesem Grunde wird der Schaumstoffdamm unter Verwendung des Trägers 30 bei dem bevorzugten Verfahren maskiert, um das Überstrahlen zu minimieren.
Im Gebrauch werden die Züchtungsvorrichtungen 32, wie z. B. die oben beschriebenen PETRIFILM®-Schalen, zum Testen von Nahrungsmittelproben und anderen Substanzen auf Verunreinigung durch Mikroorganismen verwendet. Bei diesem Verfahren wird der Züchtungsbereich 48 der Schale 32 unter Anwendung normaler Inokulationsverfahren mit dem zu testenden Material inokuliert, und die Schale 32 wird inkubiert, um die Anzahl der in der getesteten Probe enthaltenen Mikroorganismen zu bestimmen. Bei ihrem Wachstum produzieren die Mikroorganismen Säuren, die eine chemische Reaktion in dem in der bevorzugten Schale 32 befindlichen Phenolrot-Indikator hervorrufen. Die Änderung führt schließlich zum Auftreten gelber Bereiche auf der normalerweise roten Züchtungsfläche 48. Die gelben Bereiche können dann gezählt werden, um einen Verunreinigungsgrad in der getesteten Probe zu bestimmen.
Gegenwärtige Testverfahren basieren auf einer Inkubationszeit von 24 Stunden, um eine genaue Anzeige des Koloniezählwerts auf jeder der Züchtungsvorrichtungen 32 zu liefern. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Fähigkeit zur Früherkennung von verunreinigten Proben durch Filtern der erfaßten Bilder und deren Verarbeitung zur Verstärkung der in den Anfangsstadien des Koloniewachstums erzeugten Farbänderungen. Mit Früherkennung ist gemeint, daß eine genaue Zählung von Mikroorganismuskolonien innerhalb von sechs bis zwölf Stunden nach der Inokulation verfügbar sein sollte.
Die Züchtungsvorrichtungen 32 bei dem bevorzugten Verfahren verwenden zwar die Phenolrot-Indikatorchemie auf den bevorzugten Schalen 32; es versteht sich aber, daß bei entsprechenden Modifikationen am System 10 und am Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung viele andere Züchtungsvorrichtungen, wie z. B. normale Petrischalen und Agar, eingesetzt werden könnten.
Außerdem könnten andere Indikatoren des Mikroorganismenwachstums verwendet werden, um frühzeitige Koloniezählungen mit dem Algorithmus des bevorzugten Verfahrens zu liefern. Andere Typen von Indikatorsystemen könnten alternative kolorimetrische Indikatoren aufweisen, wie z. B. Neutralrot, Phenolrot, Bromthymolblau, Bromkresolpurpur, Chlorphenolrot, Bromkresolgrün und Hydroxypyranintrisulfonsäure (HPTS). Andere, nichtkolorimetrische Indikatoren, wie z. B. Fluoreszenz unter Verwendung von 4-Methylumbelliferon (4-MU), könnten bei entsprechender Beleuchtungs-, Filtrations- und Datenerfassungsausrüstung gleichfalls verwendet werden. Ferner basiert zwar das bevorzugte Verfahren auf sichtbarem Licht; es versteht sich aber, daß jede Strahlung, einschließlich der UV- und IR- Bereiche, als Basis zu Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen könnten.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung irgendeines der obigen Anzeichen für ein Koloniewachstum könnte mit Anpassungen des Verfahrens zur Erfassung der Bilddaten realisiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch so gestaltet, daß es auf jede geeignete erfaßte Bilddatenmenge anwendbar ist, die ein frühes Koloniewachstum anzeigt.
Der folgende Teil der Beschreibung des bevorzugten Verfahrens wird der Klarheit halber in einen Datenerfassungsteil und einen Bildverarbeitungsteil unterteilt.

Datenerfassung

Wie aus Fig. 1 erkennbar, werden bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren eine Anzahl von Züchtungsvorrichtungen 32 inokuliert und zur Inkubation in den Träger 30 gesetzt. Bei dem bevorzugten Verfahren werden die Züchtungsvorrichtungen 32 mit Nahrungsmittelproben oder ähnlichen Produkten inokuliert, die auf Verunreinigung durch Mikroorganismen zu testen sind.
Das bevorzugte Früherkennungssystem liefert eine vollständige Koloniezählung innerhalb von 12 Stunden nach der Inokulation, noch besser innerhalb einer Zeitspanne von sechs bis acht Stunden nach der Inokulation. Bei dem bevorzugten Verfahren werden die Züchtungsvorrichtungen 32 zunächst etwa 2 Stunden inkubiert, zu welchem Zeitpunkt mit Hilfe des oben beschriebenen Abbildungssystems 10 von jeder Züchtungsvorrichtung 32 Bilder aufgenommen werden.
Fig. 3 stellt die Datenerfassungsschritte des bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Bei dem Verfahren wird ein Maskenbild aufgenommen (siehe Schritt 52), um den Züchtungsbereich 48 von der Maske des Trägers 30 oder, wenn keine Maske verwendet wird, von dem Schaumstoffdamm 44 zu unterscheiden.
Das Maskenbild kann auch benutzt werden, um auszuschließen, daß ein Rauschen im Züchtungsbereich 48 fälschlich als ein Anzeichen für Koloniewachstum identifiziert wird. Ein Rauschen könnte aus Hohlräumen bzw. Fehlstellen in den Züch tungsmedien, Blasen, Nahrungsmittelteilchen, nicht inokulierten Bereichen, Staub und anderen Objekten oder Zuständen bestehen, die zu einer Diskontinuität im Hintergund des Züchtungsbereichs 48 führen. Um die Erkennung des Rauschens mit Hilfe des Maskenbildes zu verbessern, weist das System 10 außer der Beleuchtung von oben, die für das Maskenbild und die Koloniebilder (weiter unten beschrieben) benutzt wird, vorzugsweise eine Beleuchtung von unten auf.
Im wesentlichen dient das Maskenbild bei dem bevorzugten Verfahren jedoch zur Unterscheidung des inokulierten Bereichs 48 von dem umgebenden Träger 30 oder dem Schaumstoffdamm 44. Diese Unterscheidung bewirkt das Maskenbild durch Anzeige der äußeren Begrenzung des inokulierten Bereichs 48 jeder Züchtungsvorrichtung.
Zur Bereitstellung eines geeigneten Bildes verwendet das durch die Kamera 20 aufgenommene Maskenbild bei dem bevorzugten Verfahren ein Rotfilter 24 mit einem spektralen Maximum bei 650 nm und einer Bandbreite von 40 nm. Ein Rotfilter wird verwendet, weil der Züchtungsbereich 48 der bevorzugten Schalen 32 rot ist (wegen des Phenolrots auf der Schale 32), und der Züchtungsbereich 48 als solcher weiß erscheint, wenn er durch das bevorzugte Rotfilter betrachtet wird.
Bei dem bevorzugten Verfahren nimmt die Kamera 20 das Maskenbild mit einer Integrationszeit von etwa 3 Sekunden auf, wobei die Blende des Objektivs 22 entsprechend eingestellt ist, um den höchsten Kontrastwert im Bild bei notwendiger Einhaltung einer kurzen Integrationszeit auszugleichen.
Die Bestimmung einer Integrationszeit wird durch eine Anzahl von Variablen beeinflußt, zu denen die Intensität der Lichtquelle 16 und die Bandbreite des Filters 22 gehören. Die Integrationszeit ist vorzugsweise so kurz wie möglich (unter Berücksichtigung der obigen Überlegungen), um die Wirkung des thermischen Rauschens auf den Ladungsspeicherbaustein (CCD) in der Kamera 20 zu minimieren.
Die bevorzugte Kamera 20 erfaßt jedes der Bilder in einer Matrix von 192 · 165 Pixeln. Die bevorzugte Kamera 20 liefert jedes Bild mit 12 Bit pro Pixel, was zur Folge hat, daß jedem Pixel in Abhängigkeit von der Lichtintensität, die in jedem Pixel der Kamera 20 erfaßt wird, ein Wert von 0 bis 4095 zugeordnet wird. Pixel mit einem Wert 0 entsprechen einem schwarzen Objekt (das im wesentlichen kein Licht auf das entsprechende Pixel in der Kamera 20 zurückwirft), und Pixel mit einem Wert 4095 entsprechen einem vollständig weißen Objekt (das eine vollständige Sättigung des entsprechenden Pixels in der Kamera 20 bewirkt).
Wegen der Rotfilterung im Maskenbild erscheint der Maskenabschnitt des Trägers 30 für die Kamera 20 schwarz, wobei die Pixel allgemein Werte nahe null aufweisen. Die Filterung für das Maskenbild wird so gewählt, daß der Kontrast zwischen dem Züchtungsbereich 48 und der Maske des Trägers 30 verstärkt wird. Daraus ergibt sich vorzugsweise ein deutlicher Unterschied in den Pixelwerten zwischen dem Züchtungsbereich und der Maske, wodurch das System 10 zwischen den beiden Bereichen unterscheiden kann.
Im bevorzugten Maskenbild wird Pixeln mit Werten von 1000-1500 oder darunter ein Wert von 9999 zugeordnet, wodurch angezeigt wird, daß sie auf der Maske des Trägers 30 liegen. Es versteht sich, daß der Wert, der verwendet wird, um zu ermitteln, ob ein Pixel auf der Maske liegt, sich in Abhängigkeit von den verschiedensten Faktoren ändern kann, wie z. B. von der Integrationszeit, der Filterung, der Beleuchtung, dem Kontrast zwischen der Maske und dem Züchtungsbereich 48. Der exakte Wert kann entweder vorgegeben oder für jede Züchtungsvorrichtung 32 durch geeignete statistische oder andere Verfahren auf der Basis konkreter Daten festgesetzt werden.
Wenn den Pixeln, die der Maske entsprechen, ein Wert 9999 zugeordnet wird, kann das Maskenbild bei der Verarbeitung der Koloniebilder verwendet werden, um anzuzeigen, welche Pixel ungeachtet ihres Wertes nicht als Indikatoren für ein Koloniewachstum zu berücksichtigen sind. Das Maskenbild kann außerdem zum Justieren der Koloniebilder benutzt werden. Es kann zum Justieren dienen, indem es die Begrenzung zwischen der Maske (oder dem Schaumstoffdamm 44) und dem Züchtungsbereich 48 anzeigt. Wenn das Maskenbild zum Justieren benutzt wird, ist die Maske vorzugsweise nichtkreisförmig, damit das System eine Drehung zwischen Koloniebildern ausgleichen kann.
Obwohl das System die Justiermarken 34 auf dem Träger 30 (wie oben beschrieben) oder die Ränder des Züchtungsbereichs 48 verwenden kann, basiert das bevorzugte Verfahren auf der Genauigkeit des xy-Tisches, der zum Verschieben des Trägers 30 unter der Kamera 20 verwendet wird. Der xy-Tisch hat eine reproduzierbare Positioniergenauigkeit, die bei Verwendung der bevorzugten Kamera 20 sowohl in x- als auch in y- Richtung weniger als die Abmessungen eines Pixels beträgt, und infolgedessen wäre eine zusätzliche Justierung überflüssig.
Nach dem Erfassen des Maskenbildes wird bei dem bevorzugten Verfahren zwei Stunden nach der Inokulation ein erstes Koloniebild erfaßt (siehe Schritt 54 in Fig. 3). Das erste Koloniebild wird erfaßt, nachdem die Züchtungsvorrichtung 32 mindestens über eine Anfangsperiode inkubiert worden ist, um das Züchtungsmedium einen relativen Gleichgewichtszustand erreichen zu lassen.
Bei dem bevorzugten Verfahren wird das erste Koloniebild nach einer anfänglichen 2-stündigen Inkubationszeit erfaßt, wobei ein Grünfilter 24 benutzt wird, das vor dem Objektiv 22 der Kamera 20 angebracht ist. Das Grünfilter hat vorzugsweise ein spektrales Maximum bei 550 nm und eine Bandbreite von 40 nm. Das Grünfilter ist empfindlich für die gelbe Farbe, die durch Mikroorganismuskolonien erzeugt wird, welche auf den bevorzugten Züchtungsvorrichtungen 32 wachsen, die bei dem bevorzugten Verfahren verwendet werden.
Bei der Aufnahme des grüngefilterten ersten Koloniebildes wird die bevorzugte Kamera 20 vorzugsweise mit einer Integrationszeit von 40 Millisekunden und einer entsprechenden Blendeneinstellung auf maximalen Kontrast betrieben. Für die Aufnahme des grüngefilterten ersten Koloniebildes gelten die gleichen Überlegungen bezüglich der Maximierung des Bildkontrasts und der Minimierung des von der Kamera 20 erzeugten Rauschens wie bei der Aufnahme des rotgefilterten Maskenbildes.
Bei dem bevorzugten Verfahren sind die Rot- und Grünfilter 24 beide in einem Filterrad (nicht dargestellt) montiert, das sie vor dem Objektiv verschiebt, um die gewünschte Filterung bereitzustellen. Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt und werden hier nicht näher erläutert.
Unter Verwendung des bevorzugten Grünfilters und der Kamera wird das erste Koloniebild aufgenommen, und in Abhhängigkeit von der an jedem Pixel in der Kamera 20 erfaßten Lichtintensität wird jedem Pixel im Bild ein Wert zwischen 0 und 4095 zugeordnet. Wie bei dem rotgefilterten Maskenbild entsprechen Pixel mit einem Wert 0 einem schwarzen Objekt (das im wesentlichen kein Licht auf das entsprechende Pixel in der Kamera 20 zurückwirft), und Pixel mit einem Wert 4095 entsprechen einem völlig weißen Objekt (das eine völlige Sättigung des entsprechenden Pixels in der Kamera 20 bewirkt).
Das bevorzugte grüngefilterte Bild kann außerdem zur Feststellung eines Rauschens im Züchtungsbereich 48 verwendet werden. Das Rauschen kann aus Hohlräumen oder Rissen im Wachstumsmedium, bei der Inokulation entstandenen Blasen, Teilchen des Inokulationsmaterials usw. bestehen. Zum Minimieren von Hohlräumen und Rissen im Wachstumsmedium, die während der Inkubation auftreten können, kann es vorteilhaft sein, für eine feuchte Umgebung zu sorgen oder die Ränder der PETRIFILMTM- Schale während der Inkubation abzudichten, um die Verdunstung aus dem Züchtungsbereich 48 zu begrenzen.
Außerdem kann es vorteilhaft sein, in Verbindung mit dem Grünfilter zur Erfassung des Koloniebildes sowie in Verbindung mit dem Rotfilter zur Erfassung des Maskenbildes ein Polarisationsfilter zu verwenden. Ein Polarisationsfilter kann die Reflexionen verringern, die durch die flexible Abdeckung 46 auf der Vorrichtung 32 (siehe Fig. 2) verursacht werden. Zum Beispiel können über der Lichtquelle eine Polarisationsfolie und über dem Kameraobjektiv ein Polarisationsfilter angebracht werden. Als Alternative kann eine reflexmindernde flexible Abdeckung 46 für die Züchtungsvorrichtung 32 vorgesehen werden.
Alternativ kann zu jedem Zeitpunkt mit Hilfe eines 450 nm-Filters mit 40 nm Bandbreite (bei dem bevorzugten Verfahren) ein zusätzliches Rauschbild aufgenommen werden. Für jedes Rauschbild gelten die gleichen Überlegungen, wie sie bezüglich des Maskenbildes und des Koloniebildes diskutiert wurden (z.
B. Ausgleich der Integrationszeit und des Kontrasts usw.). Das bevorzugte 450 nm-Filter wird gewählt, weil es empfindlich gegenüber Änderungen in der Geldicke (d. h. im Züchtungsmedium) ist, insbesondere gegenüber Rißbildung und Hohlräumen. Das 450 nm-Filter und das Bild sind jedoch nicht empfindlich gegenüber den Farbänderungen, die zum Nachweis des Mikroorganismenwachstums benutzt werden.
Nach der Erfassung des ersten Koloniebildes wird die Züchtungsvorrichtung 32 über ein vorgegebenes Zeitintervall inkubiert (siehe Schritt 56 in Fig. 3), wonach unter Verwendung des Grünfilters ein zweites Koloniebild erfaßt wird (Schritt 58). Das bevorzugte Zeitintervall zwischen Koloniebildern beträgt 60 Minuten. Folglich wird das zweite Koloniebild 3 Stunden nach der Inokulation der Züchtungsvorrichtungen 32 erfaßt. Die Länge der Intervalle kann variieren, beispielsweise in Abhängigkeit von der Wachstumsgeschwindigkeit von Mikroorganismuskolonien, der Empfindlichkeit des pH-Indikators, dem pH-Wert des Inokulationsmaterials und der Empfindlichkeit des Abbildungssystems 10. Bevorzugt wird die niedrigste Frequenz (entsprechend dem längsten Intervall), die eine akzeptierbare Genauigkeit liefert, da die Anzahl der Züchtungsvorrichtungen 32, die das System 10 überwachen kann, umgekehrt proportional zur Frequenz der Datenerfassung für jede Züchtungsvorrichtung 32 ist.
Wie das erste Koloniebild besteht auch das zweite Koloniebild aus Pixeln mit Werten von 0-4095, mit Ausnahme derjenigen Pixel, denen in dem oben aufgenommenen rotgefilterten Maskenbild ein Wert von 9999 zugeordnet wurde.

Bildverarbeitung

Nach der Erfassung der ersten und zweiten Koloniebilder wird der Bildverarbeitungsteil des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt, um die Bilder zu analysieren und die auf den Züchtungsvorrichtungen 32 auftretenden Mikroorganismuskolonien zu zählen. Die Schritte in dem bevorzugten Bildverarbeitungsverfahren sind in den Ablaufdiagrammen von Fig. 4 und 5 abgebildet.
Nachstehend wird zwar nur eine Iteration des Bildverarbeitungsteils des bevorzugten Verfahrens beschrieben, aber es versteht sich, daß das Verfahren zur Analyse einer Serie von Koloniebildern benutzt wird, die in einer beliebigen Anzahl aufeinanderfolgender Zeitintervalle erfaßt werden, wie oben diskutiert.
Der bevorzugte Bildverarbeitungsteil des bevorzugten Verfahrens beginnt mit dem Schritt 60, in dem festgestellt wird, ob eine Züchtungsvorrichtung ein Ergebnis liefern wird, das "zu zahlreich für eine Zählung" (TNTC) ist. Die TNTC- Feststellung erfolgt durch Bestimmen eines mittleren Pixelwertes für alle Pixel im ersten Koloniebild und eines mittleren Pixelwertes für das zweite Koloniebild (der nicht die Pixel einschließt, denen in dem rotgefilterten Maskenbild ein Wert von 9999 zugeordnet wurde).
Die mittleren Pixelwerte für die ersten und zweiten Koloniebilder werden miteinander verglichen, und wenn die Differenz zwischen den Pixelwerten einen vorgegebenen TNTC- Schwellenwert übersteigt, wird festgestellt, daß die Züchtungsvorrichtung ein TNTC-Ergebnis liefern wird.
Der bevorzugte TNTC-Schwellenwert beträgt 15%, d. h. wenn der mittlere Pixelwert des zweiten Koloniebildes um 15% oder mehr über dem mittleren Pixelwert des ersten Koloniebildes liegt, dann wird eine TNTC-Feststellung getroffen. Es versteht sich, daß der TNTC-Schwellenwert in Abhängigkeit von einer Anzahl von Faktoren variiert, wie z. B. von dem Zeitintervall zwischen den Datenerfassungspunkten, der Chemie der Kolonie-Indikatoren usw.
Angenommen, die ersten und zweiten Koloniebilder liefern keinen Hinweis auf eine TNTC-Feststellung, dann wird im nächsten Schritt 62 des Bildverarbeitungsteils des bevorzugten Verfahrens der Wert jedes Pixels im ersten Koloniebild von dem entsprechenden Pixelwert im zweiten Koloniebild subtrahiert.
Das Ergebnis dieses Subtraktionsschrittes 62 ist ein Rohzeitverlaufsbild, das die Intensitätsdifferenz für jedes Pixel in den Koloniebildern anzeigt, die in aufeinanderfolgenden Zeitintervallen erfaßt wurden, welche den Zeitpunkten entsprechen, zu denen die ersten und zweiten Koloniebilder aufge nommen wurden. In dem bevorzugten Verfahren werden Pixel, denen in dem rotgefilterten Maskenbild ein Wert von 9999 zugeordnet wurde, im Rohzeitverlaufsbild maskiert, indem ihr Wert auf 9999 gesetzt wird.
Der nächste Schritt 64 besteht im Umskalieren derjenigen Pixel im Rohzeitverlaufsbild mit Werten zwischen 50 und 600. Der untere Wert (50) wird nachstehend als MINDIFF; der obere Wert (600) als MAXDIFF bezeichnet. Die Pixel innerhalb der Werte MINDIFF und MAXDIFF werden linear so umskaliert, daß sie die Werte zwischen 0 und 4095 annehmen. Mit anderen Worten, die MINDIFF-Pixel (mit einem Wert von 50) werden umskaliert und auf 4095 gesetzt, und die MAXDIFF-Pixel (mit einem Wert von 600) werden umskaliert und auf 0 gesetzt. Die Pixel mit Werten zwischen den Extremwerten des Bereichs werden linear skaliert, so daß sie innerhalb des Bereichs 0-4095 liegen.
Außerdem wird denjenigen Pixeln im Rohzeitverlaufsbild, die zwischen dem ersten und dem zweiten Koloniebild eine Differenz unterhalb des MINDIFF-Wertes aufweisen, sämtlich ein Wert von 4095 (entspricht weiß) zugeordnet, der seinerseits dem Bildhintergrund entspricht. Sie werden dem Hintergrund zugeordnet, weil festgelegt wird, daß eine Differenz unterhalb des gewählten MINDIFF-Wertes für die durch das System 10 zugeordneten Pixelwerte innerhalb der Fehlergrenze (des Grundrauschens) liegt. So gesehen, ist die Differenz von Pixelwerten zwischen den ersten und zweiten Koloniebildern klein genug, um jede Differenz in den Pixelwerten zu vernachlässigen und sie dem Hintergrund des Züchtungsbereichs zuzuordnen.
Die Pixel mit einer Differenz, die größer als der MAXDIFF-Wert ist, werden sämtlich auf 0 (entspricht schwarz) gesetzt, da bei dem bevorzugten Verfahren diese Differenz in den Pixelwerten anzeigt, daß während des gerade analysierten Zeitintervalls an dieser Stelle eine signifikante Säurekonzentration erzeugt wurde. Diese Änderung zeigt typischerweise den Mittelpunkt einer wachsenden Mikroorganismuskolonie an.
Der oben beschriebene lineare Umskalierungsschritt 64 liefert ein Graustufenbild, das die Änderungen anzeigt, die in dem Intervall zwischen den ersten und zweiten Koloniebildern aufgetreten sind. Das linear umskalierte Bild wird als "ska liertes Zeitverlaufsbild" bezeichnet. Dieses skalierte Zeitverlaufsbild wird dann weiterverarbeitet, um einen Koloniezählwert zu bestimmen, wie nachstehend erörtert.
Eine Alternative zu dem oben beschriebenen linearen Umskalieren der Pixelwerte wäre die Verwendung einer Nachschlagetabelle und die Zuordnung von Werten im Bereich von 4095-0 zu Pixeln im Rohzeitverlaufsbild, die innerhalb des Bereichs von MINDIFF bis MAXDIFF liegen, auf der Basis einer vorgegebenen Tabelle. Die Verwendung einer Nachschlagetabelle ist jedoch im allgemeinen für Sichtanzeigezwecke langsamer als das oben beschriebene lineare Umskalierungsverfahren, und folglich wird in dem bevorzugten Verfahren das lineare Umskalieren verwendet.
Es versteht sich, daß die zum Umskalieren des Rohzeitverlaufsbildes verwendeten MINDIFF- und MAXDIFF-Werte in Abhängigkeit von vielen Faktoren variieren können, wie z. B. von der Wachstumsgeschwindigkeit von Mikroorganismuskolonien, der pH-Empfindlichkeit des Indikators, dem pH-Wert des Inokulationsmaterials und der Empfindlichkeit des Abbildungssystems 10. So gesehen, versteht es sich, daß der MINDIFF-MAXDIFF-Bereich angepaßt werden kann und daß ein optimaler Bereich im allgemeinen durch Experimentieren bestimmt werden muß.
Ferner versteht sich, daß der lineare Umskalierschritt fakultativ ist und beim bevorzugten Verfahren verwendet wird, um die Sichtanzeige des Zeitverlaufsbildes auf einem Monitor zu verbessern. Wenn folglich das System so gestaltet würde, daß es nur Zählwerte von Mikroorganismuskolonien liefert, ohne Bilder darzustellen, dann könnte das Rohzeitverlaufsbild ohne Umskalieren verarbeitet werden.
Nachdem das beim bevorzugten Verfahren verwendete skalierte Zeitverlaufsbild erzeugt worden ist, wird im nächsten Schritt 66 das skalierte Zeitverlaufsbild verarbeitet, um zu ermitteln, welche Pixel die Mittelpunkte von Säurezonen sind und folglich in den Mittelpunkten von Kolonien liegen. Die in den Mittelpunkten von Kolonien ermittelten Pixel werden als "Trefferpixel" bezeichnet. Nachdem die Trefferpixel identifiziert worden sind, werden sie im Schritt 68 so ausgedehnt, daß sie eine Pixelmatrix im skalierten Zeitverlaufsbild umfassen.
Diejenigen Matrizen, die einander überlappen, werden dann im Schritt 70 zu Gruppen bzw. Clustern zusammengefaßt (geclustert), und um jeden Cluster herum werden im Schritt 72 Kreise gebildet, um die Begrenzungen individueller Mikroorganismuskolonien zu identifizieren.
Nach der ersten Iteration, in der nur neue Säurezonen, die neuen Kolonien entsprechen, erfaßt werden, weisen spätere Iterationen außerdem den Schritt 74 zur Vergrößerung vorher identifizierter Kolonien unter Verwendung eines Vergrößerungsschemas auf, wie weiter unten näher erläutert wird.
Der bevorzugte Verfahrensabschnitt zum Nachweis neuer Kolonien ist sowohl im Ablaufdiagramm von Fig. 4 als auch in den schematischen Darstellung von Fig. 6A und 6B dargestellt. Der erste Schritt 66 besteht darin, daß jedes Pixel in dem skalierten Zeitverlaufsbild getestet wird, um festzustellen, ob es ein Trefferpixel ist. Diejenigen Pixel, denen im Maskenbild ein Wert von 9999 zugeordnet ist, werden nicht geprüft, da sie auf der Maske des Trägers 30 liegen, die jeden Züchtungsbereich 48 umgibt.
Wenn ferner Rauschbilder erfaßt werden (bei dem bevorzugten Verfahren mit Hilfe eines 450 nm-Filters), dann werden diese ähnlich wie die Koloniebilder verarbeitet, um festzustellen, ob zwischen Datenerfassungspunkten im Züchtungsmedium irgendwelche Änderungen aufgetreten sind (hauptsächlich infolge Trocknung). Dazu wird ein erstes Rauschbild von einem zweiten Rauschbild subtrahiert, um ein Zeitverlaufsrauschbild zu erzeugen. Denjenigen Pixeln, die eine Differenz oberhalb eines "Rausch"-Schwellenwertes aufweisen, wird ein Wert von 9999 zugeordnet, der anzeigt, daß sie in Bereichen liegen, die als verrauscht betrachtet werden. Das Bild, das die Position eines Rauschens im Züchtungsbereich 48 anzeigt, wird in Verbindung mit dem Maskenbild verwendet, um anzuzeigen, welche Pixel bei der Bestimmung von Zählwerten von Mikroorganismuskolonien ignoriert werden sollten. Bei dem bevorzugten Verfahren beträgt der Rausch-Schwellenwert 25, wobei es jedoch sich versteht, daß der Wert veränderlich ist und typischerweise durch Experimentieren eingestellt werden muß.
Der Schritt 66 wird nachstehend ausführlicher beschrieben. Im wesentlichen wird jedes Pixel im skalierten Zeitverlaufsbild getestet, um festzustellen, ob es der Mittelpunkt eines lokalen Minimums ist oder nicht (das bei dem bevorzugten Verfahren einem lokalen Maximum im Rohzeitverlaufsbild entspricht, welches eine signifikante Änderung zwischen den ersten und zweiten Koloniebildern anzeigt). Handelt es sich um ein lokales Minimum, dann würde dadurch angezeigt, daß das Pixel in oder nahe dem Zentrum einer neuen Kolonie liegt und bei dem bevorzugten Verfahren als Trefferpixel zu identifizieren ist.
Wie aus der schematischen Darstellung von Fig. 6A erkennbar, wird bei dem bevorzugten Verfahren jedes Pixel 100 zuerst an einem Säurezonen-Schwellenwert getestet, um sicherzustellen, daß nur Pixel mit einem bestimmten "Dunkelheits"- bzw. Schwärzungsgrad getestet werden. Diese Filterung trägt dazu bei, die Verarbeitungsanforderungen zu minimieren, da Pixel am oder über dem Säurezonen-Helligkeitsschwellenwert im allgemeinen nicht in einer Säurezone liegen und beim Testen dieser Pixel keine Verarbeitungszeit verschwendet wird.
Bei dem bevorzugten Verfahren ist der Säurezonen- Schwellenwert kleiner oder gleich 3600. Der Wert 3600 wurde durch Experimentieren festgesetzt, und es versteht sich, daß er wahrscheinlich variiert, beispielsweise in Abhängigkeit von der Wachstumsgeschwindigkeit von Mikroorganismuskolonien, der Empfindlichkeit des pH-Indikators, dem pH-Wert des Inokulationsmaterials und der Empfindlichkeit des Abbildungssystems 10.
Pixel im skalierten Zeitverlaufsbild mit einem Wert, der kleiner oder gleich dem Säurezonen-Schwellenwert ist, sind hinreichend dunkel und sollten getestet werden, um festzustellen, ob sie lokale Minima sind, wie nachstehend näher erläutert wird.
Nachdem festgestellt wurde, daß ein Pixel 100 die obigen Kriterien erfüllt, werden die vier nächsten nördlichen (N&sub1;), südlichen (S&sub1;), östlichen (E&sub1;) und westlichen (W&sub1;) Nachbarn des Pixels 100 gleichfalls getestet, um festzustellen, ob sie auch ausreichend dunkel sind, um ein weiteres Testen des Pixels 100 zu rechtfertigen. Bei dem bevorzugten Verfahren werden diese Pixel (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) getestet, um festzustellen, ob mindestens drei der vier Pixel Werte aufweisen, die kleiner oder gleich dem Säurezonen-Schwellenwert sind, d. h. bei dem bevorzugten Verfahren kleiner oder gleich 3600.
Wenn mindestens drei dieser Nachbarpixel (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) einen Wert aufweisen, der kleiner oder gleich dem Säurezonen-Schwellenwert ist, dann ist ein weiteres Testen des Zentralpixels 100 gerechtfertigt. Wenn dieser Test fehlschlägt, dann wird das Pixel 100 übergangen und kann nicht als Trefferpixel markiert werden.
Ist das zweite oben beschriebene Kriterium erfüllt, dann werden alle vier Nachbarpixel (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) nochmals getestet, um festzustellen, ob sie größer oder gleich dem Wert des Zentralpixels 100 sind. Wenn alle vier nächsten Nachbarpixel (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) Werte aufweisen, die größer oder gleich dem Wert des Zentralpixels 100 sind, dann wird festgestellt, daß das Zentralpixel 100 das dunkelste von den getesteten Pixeln und daher ein lokales Minimum ist, das dem Zentrum einer Kolonie entsprechen könnte. Wird dieser Test nicht erfüllt, dann kann das Pixel 100 nicht als Trefferpixel markiert werden.
Wenn alle vier nächsten Nachbarpixel Werte aufweisen, die größer oder gleich dem Zentralpixel 100 sind, dann wird ein weiterer Test ausgeführt, um sicherzustellen, daß das Zentralpixel 100 ein mögliches lokales Minimum ist. Dieser Test verwendet Pixel (N&sub2;, S&sub2;, E&sub2;, W&sub2;), die einen Schritt von den nächsten Nachbarn (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) des Zentralpixels 100 entfernt sind. Diese Pixel (N&sub2;, S&sub2;, E&sub2;, W&sub2;) werden getestet, um sicherzustellen, daß alle vier Werte aufweisen, die größer oder gleich ihren nächsten Nachbarn (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) sind, die an das Zentralpixel 100 angrenzen.
Wenn mindestens eines der Pixel (N&sub2;, S&sub2;, E&sub2;, W&sub2;) einen Wert aufweist, der größer oder gleich seinem entsprechenden nächsten Nachbarn (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) ist, dann existiert in mindestens einer Richtung ein Pixelwertgefälle vom Zentralpixel 100 nach außen. Dadurch wird das Zentralpixel 100 als dunkler Fleck identifiziert, und zwei Pixel in mindestens einer Rich tung nach außen weisen geringere Dunkelheits- bzw. Schwärzungsgrade auf.
Wenn alle obigen Tests erfüllt sind, werden alle Nachbarn (N&sub1;, S&sub1;, E&sub1;, W&sub1;) nochmals getestet, um sicherzustellen, daß keiner von ihnen einen Wert von 9999 aufweist. Wenn irgendeines der getesteten Pixel einen Wert von 9999 aufweist, dann wird das Zentralpixel 100 nicht als Trefferpixel markiert, da es auf dem Rand des Züchtungsbereichs in der Nähe der Maske oder in der Nähe eines Rauschbereichs liegt, wobei es sich in beiden Fällen um Fehlablesungen handeln kann, die zur irrtümlichen Bestimmung lokaler Minima führen.
Das bevorzugte Verfahren stützt sich zwar auf das Testen von Pixeln in den vier Kompaßrichtungen, wie oben beschrieben; es versteht sich aber, daß nach dem oben beschriebenen Prinzip des Verfahrens auch Pixel in beliebigen anderen Richtungen getestet werden könnten und die vorliegende Erfindung nicht auf das genaue, oben beschriebene Verfahren beschränkt werden sollte.
Schließlich wird der Abstand vom Zentralpixel 100 zum Rand der nächsten vorher bestimmten Kolonie (falls vorhanden) berechnet. Ist dieser Abstand größer als ein vorgegebener Mindestabstand (MINDIST), dann kann das Zentralpixel 100 als Trefferpixel identifiziert werden. Ist der Abstand kleiner oder gleich MINDIST, dann kann das Zentralpixel 100 nicht als Trefferpixel identifiziert werden, da es zu dicht an einer vorhandenen Mikroorganismuskolonie liegt.
Bei dem bevorzugten Verfahren wird MINDIST auf 3,1 Pixel festgesetzt. Dieser Wert wurde durch Experimentieren ermittelt, um eine Fehlbestimmung mehrerer lokaler Minima in der expandierenden Säurezone einer Kolonie zu minimieren. So gesehen, versteht es sich, daß sich der Wert MINDIST in Abhhängigkeit von einer Anzahl von Faktoren ändern kann, wie z. B. von der Geschwindigkeit des Koloniewachstums, der Empfindlichkeit des Indikators, der Empfindlichkeit des Systems, der Bilderfassungsfrequenz usw.
Sind alle obigen Tests erfüllt, dann wird im Schritt 66 das Zentralpixel 100 als Trefferpixel markiert. Wir nehmen nun Bezug auf Fig. 6B, welche die Ergebnisse des obigen Verfahrens darstellt, in dem unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens eine Anzahl von Trefferpixeln 100, 110, 120, 130, 140 als lokale Minima identifiziert worden sind.
Ein Beispiel des Gruppierungs- bzw. Clusterbildungsverfahrens, bei dem Trefferpixel 100, 110, 120, 130, 140 zur Identifikation von Kolonien verwendet werden, ist in der schematischen Darstellung von Fig. 7 erkennbar. Genauer gesagt, das Pixel 100 wird so erweitert, daß es die Matrix 102 umfaßt, und das Pixel 110 wird so erweitert, daß es die Matrix 112 umfaßt. Ebenso wird auch jedes der übrigen Pixel 120, 130 bzw. 140 zu einer entsprechenden 3·3-Matrix 122, 132 bzw. 142 erweitert.
Wie abgebildet, überlappen sich die beiden Matrizen 102 und 112, und folglich werden die Trefferpixel 100 und 110 zu einem Cluster zusammengefaßt. Da zum Ausführen der Erweiterung eine 3·3-Matrix verwendet wird, wird jedes Trefferpixel 100, 110, 120, 130, 140 auf der Basis des Zusammenhangs mit 8 Nachbarn mit seinen überlappenden Nachbarn (falls vorhanden) zu einem Cluster zusammengefaßt.
Nachdem die Trefferpixel 100, 110, 120, 130, 140 erweitert und geclustert worden sind, wird jeder Cluster durch einen approximierten Kreis umfaßt. Die Kreise dienen zur Identifikation der Grenzen identifizierter Kolonien 1, 2 und 3. Die Kreise sind vorzugsweise ein wenig größer als die eigentlichen Kolonien, um einen zu hohen Zählwert der Kolonien in einer expandierenden Säurezone auf einer Züchtungsvorrichtung 32 zu verhindern.
An diesem Punkt hat der Algorithmus die Mikroorganismuskolonien 1, 2 und 3 identifiziert. Bei dem bevorzugten Verfahren, das Intervalle von 60 Minuten verwendet und nach 2 Stunden mit der Abbildung beginnt, wurde dieser Koloniezählwert zu einem Zeitpunkt 3 Stunden nach der Inkubation ermittelt (was dem Zeitpunkt entspricht, zu dem das zweite grüngefilterte Koloniebild erfaßt wurde).
Das bevorzugte Verfahren weist außerdem einen Grenzwert für die maximale Anzahl identifizierbarer Kolonien auf (bezeichnet als MAXNO). Ein Maximum wird festgesetzt, weil die Züchtungsvorrichtung als TNTC-Vorrichtung (d. h. zu zahlreich für eine Zählung) anzuzeigen ist, wenn eine größere Anzahl von Kolonien als MAXNO gezählt wird. Die TNTC-Feststellung alarmiert den Bediener, daß eine hochgradig verunreinigte Probe gefunden worden ist. Der konkrete Wert von MAXNO beim bevorzugten Verfahren beträgt 100. Er wird durch Experimentieren bestimmt und kann in Abhhängigkeit von vielen verschiedenen Faktoren variieren, wie z. B. von der Größe der Züchtungsvorrichtung, der Auflösung des Abbildungssystems 10 usw.
Das bevorzugte erfindungsgemäße Bildverarbeitungsverfahren umfaßt außerdem die Vergrößerung von Kolonien, die in früheren skalierten Zeitverlaufsbildern identifiziert wurden. Wenn zum Beispiel die Kolonien 1, 2 und 3 in einem ersten skalierten Zeitverlaufsbild als zwischen den Stunden 2 und 3 (nach der Inokulation) auftretend identifiziert würden, dann würde ein nachfolgendes skaliertes Zeitverlaufsbild unter Verwendung der zu den Stunden 3 und 4 erfaßten grüngefilterten Koloniebilder erzeugt werden. Dieses nachfolgende skalierte Zeitverlaufsbild würde dann verwendet, um festzustellen, ob irgendeine der in dem anfänglichen skalierten Zeitverlaufsbild identifizierten Kolonien vergrößert werden sollte.
Der Vergrößerungsteil des Verfahrens umfaßt im wesentlichen das Testen der Pixel am Rande bekannter Kolonien (die im ersten skalierten Zeitverlaufsbild identifiziert wurden), um festzustellen, ob sie ein Koloniewachstum in dem Zeitintervall anzeigen, das zur Entwicklung des nachfolgenden skalierten Zeitverlaufsbildes verwendet wurde.
Bei dem bevorzugten Vergrößerungsverfahren wird eine Prioritätenliste verwendet, um die Ausdehnung von Kolonien bis zu einem Punkt, wo sie andere, dicht benachbarte Kolonien in sich aufnehmen, zu vermeiden. Jede neue Kolonie wird bei der Identifikation gemäß der obigen Beschreibung an das untere Ende einer Prioritätenliste angefügt, die am Anfang des Verfahrens eine numerische Reihenfolge aufweist.
Zum Beispiel würde die Kolonie 1 zuerst analysiert, um festzustellen, ob sie sich ausgedehnt hat. Bei dem bevorzugten Verfahren weist der erste Test die Bestimmung des Wertes von vier inneren Pixeln 150a, 152a, 154a und 156a auf, die gerade noch innerhalb des Umfangs des Kreises liegen, der jede Kolonie begrenzt.
Die vier inneren Pixel sind so gewählt, daß sie im allgemeinen, vom Mittelpunkt des die Kolonie 1 begrenzenden Kreises aus gesehen, in den NSEW-Richtungen liegen, wobei es sich jedoch versteht, daß eine beliebige Pixelzahl in einer beliebigen Anzahl von Richtungen getestet werden könnte.
Der nächste Schritt umfaßt die Bestimmung des Wertes jedes äußeren Pixels 150b, 152b, 154b und 156b, die jeweils (in radialer Richtung) unmittelbar außerhalb der oben identifizierten Pixel 150a, 152a, 154a und 156a liegen. Die äußeren Pixel liegen vorzugsweise unmittelbar außerhalb des Umfangs der gerade zu testenden Kolonie.
Die Werte jedes Pixelpaares werden miteinander verglichen, um festzustellen, ob sich die Kolonie in Richtung der identifizierten Pixel ausdehnt. Wenn die äußeren Pixel (150b, 152b, 154b und 156b) einen Wert haben, der größer oder gleich dem Wert ihrer entsprechenden inneren Pixel (150a, 152a, 154a und 156a) ist, dann dehnt sich die Kolonie in diesen Richtungen aus.
Bei dem bevorzugten Verfahren müssen mindestens zwei der vier Pixelpaare eine Ausdehnung aufweisen, bevor die Kolonie vergrößert wird. Wie in Fig. 8 abgebildet, erfüllt die Kolonie 1 diesen Test, da alle inneren und äußeren Pixelpaare ein Ausdehnung aufweisen. Die Kolonie 1 wird daher bei dem bevorzugten Verfahren so nach außen erweitert, daß ihr Radius um ein Pixel vergrößert wird. Dieser Wert kann in Abhhängigkeit von vielen Faktoren, wie z. B. erwarteten Wachstumsgeschwindigkeiten, Intervallen zwischen der Datenerfassung usw., vergrößert werden.
Zu diesem Zeitpunkt würde die Kolonie 1 an das untere Ende der Prioritätenliste verschoben, die jetzt in der Reihenfolge 2-3-1 angeordnet wäre. Die Kolonie 2 würde dann unter Verwendung der inneren und äußeren Pixel 160a/160b, 162a/162b, 164a/164b und 166a/166b analysiert, um festzustellen, ob sie den Test für eine Vergrößerung erfüllt. Wie in Fig. 8 angedeutet, erfüllt die Kolonie 2 den Test nicht und wird nicht vergrößert, und bleibt daher am oberen Ende der Prioritätenliste.
Dann würde Kolonie 3 analysiert, um festzustellen, ob sie sich ausgedehnt hat. Wie dargestellt, zeigen zwei Paare innerer und äußerer Pixel 170a/170b und 176a/176b eine Ausdehnung an, und folglich wird Kolonie 3 so vergrößert, daß sie die Ausdehnung umfaßt. Nach der Vergrößerung würde die Kolonie 3 an das untere Ende der Prioritätenliste gesetzt, deren Reihenfolge jetzt 2-1-3 lauten würde.
Das bevorzugte Verfahren begrenzt außerdem den Radius jeder Kolonie auf einen Wert, der als RADMAX bezeichnet wird. Bei dem bevorzugten Verfahren wird RADMAX auf 50 Pixel festgesetzt, wobei es sich aber versteht, daß sich der Wert in Abhhängigkeit von vielen Faktoren, wie z. B. der Auflösung des Abbildungssystems, der Größe der Züchtungsvorrichtungen, den Wachstumsgeschwindigkeiten der Mikroorganismen usw., ändern kann.
An dieser Stelle des Algorithmus würden als Gesamtzählwert 3 Kolonien angezeigt. Es wird in Betracht gezogen, daß nur diejenigen Kolonien, die sich zwischen den Intervallen ausdehnen, wie z. B. die Cluster 1 und 3, als bestätigte Kolonien identifiziert werden könnten. Die Kolonie 2, die identifiziert wurde, aber noch kein Wachstum gezeigt hat, könnte als unbestätigte Kolonie identifiziert werden, die später nach einer Wachstumsanzeige bestätigt werden könnte. Bei dem bevorzugten Verfahren werden jedoch alle Kolonien im Gesamtzählwert gezählt, gleichgültig ob sie eine Vergrößerung aufweisen oder nicht.
Nach der Anzeige eines Koloniezählwerts würde das System 10 wieder zurücksetzen und die Züchtungsvorrichtungen 32 für das nächste Zeitintervall inkubieren, wonach das Verfahren zur Erfassung eines Koloniebildes zusammen mit den Schritten zur Verarbeitung dieses Bildes wiederholt würde, um neue Kolonien zu identifizieren und existierende Kolonien auszudehnen.
Es versteht sich, daß zwar nur eine Iteration des obigen Verfahrens beschrieben wird, zu verschiedenen Zeiten erfaßte Daten aber weitgehend auf die gleiche Weise wie oben beschrieben verarbeitet würden. Die einzige Änderung von Bedeutung wäre, daß Pixel, die innerhalb von Kolonien liegen, welche in einer Iteration des Verfahrens identifiziert (und zum Erreichen des Gesamtzählwertes verwendet) werden, in späteren Bildern ignoriert werden können, um die Verarbeitung durch das System zu beschleunigen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis und zum Zählen von Mikroorganismuskolonien in einem inokulierten Wachstumsmedium innerhalb von 6 bis 12 Stunden nach der Inokulation, umfassend die Schritte:

a) Abbildung einer Züchtungsvorrichtung mit einem inokulierten Wachstumsmedium zum Erhalt eines Maskenbildes,

b) Verarbeitung des Maskenbildes zur Identifizierung von Pixeln in dem Maskenbild, die außerhalb des inokulierten Wachstumsmediums liegen,

c) Verarbeitung des Maskenbildes zur Identifizierung von Hintergrundpixeln in dem Maskenbild,

d) Zuordnung eines Hintergrundwertes zu den in den Schritten (b) und (c) identifizierten Pixeln,

e) Abbildung der Züchtungsvorrichtung und Ausschließen der Pixel mit einem Hintergrundwert zum Erhalt eines ersten Koloniebildes,

f) Inkubation des Wachstumsmediums für einen bestimmten Zeitraum,

g) Abbildung der Züchtungsvorrichtung und Auschließen der Pixel mit einem Hintergrundwert zum Erhalt eines zweiten Koloniebildes,

h) Verarbeitung der ersten und zweiten Koloniebilder zur Erzeugung eines Rohzeitverlaufsbildes, wobei die Bearbeitung die Subtraktion des ersten Koloniebildes vom zweiten Koloniebild zur Erzeugung eines Rohzeitverlaufsbildes umfaßt;

i) Umskalierung des Rohzeitverlaufsbildes zur Herstellung eines skalierten Zeitverlaufsbildes,

j) Verarbeitung des skalierten Zeitverlaufsbildes zur Identifizierung von Trefferpixeln, wobei die Verarbeitung des skalierten Zeitverlaufsbildes umfaßt:

1) Identifizieren von lokalen Minima,

2) Testen eines Wertes bei einem Zentralpixel auf Übereinstimmung mit einem Schwellenwert,

3) Testen von mindestens zwei Nachbarpixeln zur Sicherstellung, daß die unmittelbaren Nachbarpixel einen Wert haben, der größer ist als der Wert des Zentralpixels, wobei die Nachbarpixel dem Zentralpixel direkt benachbart sind,

4) Testen von Pixeln, die übernächste Nachbarn sind, wobei diese Pixel jedem der Nachbarpixel benachbart und dem Zentralpixel gegenüberliegend angeordnet sind, wobei die Pixel getestet werden zur Sicherstellung, daß sie einen Wert besitzen, der größer als der Wert ihrer benachbarten Nachbarpixel ist, und

5) Markierung jedes Zentralpixels, das die oben erwähnten Tests erfüllt, als ein Trefferpixel.

k) Zusammenfassung der Trefferpixel zur Identifizierung von Mikroorganismuskolonien, die in dem Wachstumsmedium zwischen dem ersten und zweiten Koloniebild erscheinen, und

l) Bereitstellung einer Gesamtzahl von Mikroorganismuskolonien in dem Wachstumsmedium.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Zusammenfassens der Trefferpixel zur Identifizierung von Mikroorganismuskolonien ferner die Verbreiterung von jedem der Trefferpixel zur Umfassung einer Matrix und die Zusammenfassung der einander überlappenden Matrices umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend den Schritt der Vergrößerung zuvor identifizierter Mikroorganismuskolonien unter Verwendung des skalierten Zeitverlaufsbildes.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt der Vergrößerung ferner umfaßt:

1) Vergleich der Werte von inneren Pixeln, die auf einem Rand der zuvor identifizierten Mikroorganismuskolonien liegen, mit dem Wert der entsprechenden äußeren Pixel, die benachbart zu den inneren Pixeln und außerhalb des Randes liegen, und

2) Vergrößerung der zuvor identifizierten Mikroorganismuskolonien, die mindestens zwei innere Pixel mit einem Wert aufweisen, der geringer als der der entsprechenden äußeren Pixel ist.

5. Verfahren zum Nachweis und Zählen von Mikroorganismuskolonien in einem inokulierten Wachstumsmedium innerhalb von 6 bis 12 Stunden nach der Inokulation, umfassend die Schritte:

a) Abbildung des Wachstumsmediums zum Erhalt eines ersten Koloniebildes,

b) Inkubation des Wachstumsmediums für einen bestimmten Zeitraum,

c) Abbildung des Wachstumsmediums zum Erhalt eines zweiten Koloniebildes,

d) Verarbeitung der ersten und zweiten Koloniebilder durch Subtraktion des ersten Koloniebildes von dem zweiten Koloniebild zur Erzeugung eines Rohzeitverlaufsbildes,

e) Verarbeitung des Rohzeitverlaufsbildes zur Identifizierung von Trefferpixeln, die lokale Maxima in dem Rohzeitverlaufbild sind, wobei die Verarbeitung ferner die Schritte umfaßt:

1) Testen eines Wertes bei einem Zentralpixel auf Übereinstimmung mit einem Schwellenwert,

2) Testen von mindestens zwei Nachbarpixeln zur Sicherstellung, daß die unmittelbaren Nachbarpixel einen Wert haben, der geringer ist als der Wert des Zentralpixels, wobei die Nachbarpixel direkt dem Zentralpixel benachbart sind,

3) Testen von Pixeln, die übernächste Nachbarn sind, wobei diese Pixel jedem der Nachbarpixel benachbart und dem Zentralpixel gegenüberliegend angeordnet sind, wobei die Pixel getestet werden zur Sicherstellung, daß sie einen Wert besitzen, der geringer als der Wert ihrer benachbarten Nachbarpixel ist,

4) Markierung jedes Zentralpixels, das die oben erwähnten Tests erfüllt, als ein Trefferpixel,

f) Zusammenfassung der Trefferpixel zur Identifizierung von Mikroorganismuskolonien, die in dem Wachstumsmedium zwischen dem ersten und zweiten Koloniebild erscheinen, und

g) Bereitstellung einer Gesamtzahl von Mikroorganismuskolonien in dem Wachstumsmedium.

6. Verfahren nach Anspruch 5, ferner umfassend den Schritt der Vergrößerung zuvor identifizierter Mikroorganismuskolonien unter Verwendung des Rohzeitverlaufsbildes.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Schritt der Vergrößerung ferner umfaßt:

1) Vergleich des Wertes der inneren Pixel, die auf einem Rand der zuvor identifizierten Mikroorganismuskolonien liegen, mit dem Wert der entsprechenden äußeren Pixel, die benachbart zu den inneren Pixeln und außerhalb des Randes liegen, und

2) Vergrößerung der zuvor identifizierten Mikroorganismuskolonien, die mindestens zwei innere Pixel mit einem Wert aufweisen, der größer als der der entsprechenden äußeren Pixel ist.