DE69334148T2

DE69334148T2 - HIV-Peptide

Info

Publication number: DE69334148T2
Application number: DE69334148T
Authority: DE
Inventors: Robert J. De Leys
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1992-03-06
Filing date: 1993-03-08
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2013-03-09
Also published as: JP3443809B2; JP2004002379A; DE69324751D1; WO1993018054A2; AU3746393A; DK0891982T3; BR9305435A; US5891640A; DK0589004T3; ES2133392T5; JPH06505806A; US6165730A; KR100259223B1; WO1993018054A3; GR3030595T3; EP0589004B2; ES2133392T3; CA2102301C; EP0891982A3; PT891982E

Description

Bei dem der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden technischen Problem handelt es sich darum, immunologisch wichtigen Epitopen an viralen Proteinen entsprechende Peptide bereitzustellen, sowie um die Verwendung der Peptide in diagnostischen oder immunogenen Zusammensetzungen.
Verschiedene Patentanmeldungen waren auf das Problem des Findens von diagnostisch nützlichen Epitopen des AIDS-Virus (human immunodeficiency virus; HIV) gerichtet. Ein wichtiger immundominanter Bereich, der cyclische HIV-1- und HIV-2-Peptide enthält, wurde in der Patentanmeldung EP-A-0 326 490 gefunden. In EP-A-0 379 949 wurde festgestellt, dass dieser Bereich mit HIV-spezifischen Antikörpern in Fällen, in welchen ein Biotinmolekül an diese cyclischen HIV-Peptide gekuppelt wurde, sogar noch reaktiver war. SU-A-161 22 64 beschreibt auch die Verwendung eines biotinylierten Peptids in einem Festphasenimmunassay zum Nachweis von HIV-Antikörpern.
Andere Anmeldungen suchten nach nützlichen HIV-Epitopen im hypervariablen V3-Schlingenbereich von gp120 (wie EP-A-0448 095 und EP-A-0 438 332 ).
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen, die Peptide enthalten, von welchen bestimmt wurde, dass sie immunologisch wichtigen Epitopen an Proteinen entsprechen, zu diagnostischen Zwecken bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es auch, Zusammensetzungen, die Peptide enthalten, von welchen bestimmt wurde, dass sie immunologisch wichtigen Epitopen an Proteinen entsprechen, zu Impfzwecken bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wurde eine Reihe von Peptiden identifiziert und durch Festphasenpeptidsynthese hergestellt, die immunologisch wichtige Bereiche von viralen Proteinen darstellen. Diese Peptide wurden für den Nachweis von Antikörpern für HIV als sehr nützlich identifiziert. In einigen bevorzugten Anordnungen wurde auch gefunden oder zumindest erwartet, dass diese Peptide beim Stimulieren der Produktion von HIV-Antikörpern in gesunden Tieren, wie BALB/C-Mäusen, und in einer Impfzusammensetzung zum Verhindern einer HIV-Infektion nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Fragmente von beliebigen der nachstehend angegebenen Peptidsequenzen, wobei die Fragmente im Wesentlichen die gesamte immunologische Empfindlichkeit der Peptidsequenzen, von welchen sie abgeleitet sind, beibehalten.
Die Synthese der Peptide kann in Lösung oder auf einem festen Träger erzielt werden. Syntheseprotokolle setzen im Allgemeinen t-Butyloxycarbonyl- oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-geschützte aktivierte Aminosäuren ein. Die Vorgehensweisen zum Durchführen der Synthese, die Aminosäureaktivierungstechniken, die Typen der Seitenkettenherstellung und die Abspaltungsvorgehensweisen, die verwendet werden, sind z.B. in Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Company, 1984; und Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989, reichlich beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft wie nachstehend erwähnte Peptide, die biotinyliert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide der folgenden Formel: (A-)-(B)-(X)-Y-(Aminosäuren)-Y-(X)-Z wobei

– (Aminosäuren) dazu verwendet wird, Leu-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Cys (SEQ ID NR 1, gp41, Isolat Ant70) oder Gln-Ile-Asp-Ile-Gla-Glu-Met-Arg-Ile-Gly-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Ser-Met-Gly-Ile-Gly-Gly (SEQ ID NR 2, Teil-V3-Schlingensequenz Ant 70) zu bezeichnen und wobei die Aminosäuren selektiv derart ausgewählt werden, dass sie immundominante Epitope sind, die durch einen großen Prozentanteil der tatsächlichen positiven Seren erkannt werden oder in der Lage sind, andere Antigene im Test zu ergänzen, um die Nachweisrate zu erhöhen, und wobei B mit den ausgewählten Aminosäuren wechselwirkt, um eine Verbindung mit größerer diagnostischen Empfindlichkeit herzustellen;
– A, falls vorliegend, wie durch die Klammern angegeben, (eine) Aminosäure(n), eine Aminogruppe oder eine chemische Modifikation der endständigen Aminogruppe der Peptidkette darstellt;
– Z (eine) Aminosäure(n), eine OH-Gruppe, eine NH₂-Gruppe oder eine Bindung unter Beteiligung von einer dieser beiden chemischen Gruppen darstellt;
– B Biotin darstellt;
– X eine biotinylierte Verbindung darstellt, die während des Syntheseverfahrens eingebracht wird;
– Y eine kovalente Bindung oder eine oder mehrere chemische Einheiten darstellt, die einzeln oder zusammen einen Verbindungsarm bilden, der die Aminosäuren Peptids angemessen von der biotinylierten Einheit B oder X abtrennt, wobei die Funktion ist, die sterische Hinderung, die die Bindung der biotinylierten Einheit B oder X an Avidin oder Streptavidin stören kann, zu minimieren, wobei, wenn Y keine kovalente Bindung ist, sie vorteilhafterweise mindestens eine chemische Einheit ist und aus so viel wie 30 chemischen Einheiten bestehen kann, jedoch am häufigsten aus 1 bis 10 chemischen Einheiten, die gleich oder verschieden sein können, stärker bevorzugt aus Glycinresten, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminovalerinsäure oder 6-Aminohexansäure besteht;
– B und X in Klammern eingeschlossen sind, um anzugeben, dass die Gegenwart von Biotin oder einer biotinylierten Verbindung in diesen Positionen optional ist, wobei es die einzige Bedingung ist, dass B oder X in mindestens einer der dargestellten Positionen vorliegt.

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es, die Antigenität dieser HIV-Peptide zu erhöhen, die jedoch selbst dann an einen Träger gebunden werden können, wenn sie nicht biotinyliert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur in-vitro-Bestimmung von Antikörpern unter Verwendung der vorstehend definierten Peptide.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur in-vitro-Bestimmung von Antikörpern unter Verwendung der vorstehend definierten biotinylierten Peptide, wobei die biotinylierten Peptide vorzugsweise in Form von Komplexen von Streptavidin und biotinylierten Peptiden oder Komplexen von Avidin und biotinylierten Peptiden vorliegen. Im Komplex von Streptavidin und biotinylierten Pepti den oder Avidin und biotinylierten Peptiden können die Peptide entweder N-terminal, C-terminal oder intern biotinyliert sein.
Diese Vorgehensweise zur Bestimmung von Antikörpern ist in Bezug auf die Peptidlänge nicht beschränkt und umgeht die Schwierigkeiten, die dem Beschichten von Peptiden direkt auf die feste Phase zur immunologischen Bewertung innewohnen.
Die Verwendung von biotinylierten Peptiden im Verfahren der Erfindung führt ein derartiges Verankern der Peptide an einem festen Träger durch, dass sie ihre essenziellen Aminosäuren zur Erkennung durch Antikörper frei lässt.
Der Ausdruck „Verankern eines Peptids an einen festen Träger" bedeutet die Anlagerung des Peptids an einen Träger über kovalente Bindungen oder nicht-kovalente Wechselwirkungen derart, dass das Peptid immobilisiert wird.
Der feste Träger kann Nitrocellulose, Polystyrol, Nylon oder jedes beliebige andere natürliche oder synthetische Polymer sein.
Der Ausdruck „ihre essenziellen Aminosäuren werden zur Erkennung durch Antikörper frei gelassen" bedeutet, dass Aminosäureseitenketten des Peptids angemessen weder in irgendeiner Weise chemisch modifiziert noch an der Wechselwirkung zwischen dem Peptid und der festen Phase beteiligt sind.
Die Verwendung von biotinylierten Peptiden im Verfahren der Erfindung ermöglicht, dass die biotinylierten Peptide frei sind, um einen breiten Bereich an Kon formationen anzunehmen, unter welchen mindestens eine zur Bindung von Antikörpern an die biotinylierten Peptide geeignet ist.
Jedes beliebige der beanspruchten +-biotinylierten Peptide kann kann zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt werden. Jedoch sind einige davon in der Lage, an einem festen Träger verankert zu werden und mit Antikörpern, die das Epitop in diesem Peptid selbst dann spezifisch erkennen, wenn sie nicht biotinyliert sind und an einem Komplex von Avidin oder Streptavidin nicht beteiligt sind, zu reagieren. In diesem Fall führt die Verwendung von biotinylierten Peptiden zu einer offensichtlichen Zunahme der Antigenität von Peptiden in Bezug auf die Antigenität, die beobachtet wird, wenn die Peptide nicht biotinyliert sind. Der Ausdruck „offensichtlich" bedeutet, eine beobachtete Veränderung anzuzeigen, die unter ähnlichen Testbedingungen ohne Berücksichtigung der absoluten Ursache der beobachteten Veränderung erhalten wird.
Mit „Antigenität" ist die Eigenschaft eines Peptids gemeint, durch einen Antikörper gebunden zu werden.
Mit "Zunahme an Antigenität" ist gemeint, dass ein positives Signal für eine Verdünnung erhalten wird, das mindestens das Zweifache der Verdünnung der nicht-biotinylierten Peptide beträgt. Das positive Signal ist von derselben Größenordnung wie dasjenige, das für nicht-biotinylierte Peptide erhalten wird.
Mit anderen Worten kann der Erhalt eines positiven Signals mit einer, verglichen mit der Menge an nicht-biotinyliertem Peptid, kleineren Menge an biotinyliertem Peptid erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur in-vitro-Bestimmung von HIV-Antikörpern oder zur Diagnose einer HIV-Infektion unter Verwendung einer wie vorstehend definierten Peptidzusammensetzung in einer Immunassayvorgehensweise, wobei die verwendeten biotinylierten Peptide in Form von Komplexen von Streptavidin und biotinylierten Peptiden oder Avidin und biotinylierten Peptiden vorliegen.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Durchführen der in-vitro-Bestimmung von Antikörpern erfolgt mithilfe eines Enzym-verknüpften Immunsorbant-Assays (ELISA). Dieser Assay setzt eine feste Phase ein, die im Allgemeinen eine Polystyrolmikrotiterplatte oder -perle ist. Die feste Phase kann jedoch ein beliebiges Material sein, das in der Lage ist, ein Protein entweder chemisch über eine kovalente Bindung oder durch passive Adsorption zu binden. In dieser Hinsicht werden auch Membranen auf Nylonbasis als besonders vorteilhaft betrachtet. Die feste Phase wird mit Streptavidin oder Avidin überzogen und nach einer geeigneten Dauer wird überschüssiges ungebundenes Protein durch Waschen entfernt. Jegliche unbelegte Bindungsstellen an der festen Phase werden dann mit einem irrelevanten Protein, wie Rinderserumalbumin oder Casein, geblockt.
Eine das Gemisch oder die Auswahl von (biotinylierten) Peptiden der Erfindung enthaltende Lösung wird anschließend mit der (Streptavidin- oder Avidinüberzogenen) Oberfläche in Kontakt gebracht, und man lässt sie zur Bindung kommen. Ungebundenes Peptid wird durch Waschen entfernt. Alternativ dazu lässt man biotinylierte Peptide entweder mit Avidin oder Streptavidin Komplexe bilden. Die erhaltenen Komplexe werden zum Überziehen der festen Phase verwendet. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer wird ungebundener Komplex durch Waschen entfernt. Eine geeignete Verdünnung eines Antiserums oder einer anderen Körperflüssigkeit wird mit der festen Phase, an welche das Peptid gebunden ist, in Kontakt gebracht. Die Inkubation wird für eine Zeitdauer durchgeführt, die zum Stattfindenlassen der Bindungsreaktion nötig ist. Anschließend werden ungebundene Bestandteile durch Waschen der festen Phase entfernt. Der Nachweis von Immunkomplexen wird unter Verwendung von heterologen Antikörpern, die spezifisch an die im Testserum vorliegenden Antikörper binden und die mit einem Enzym konjugiert worden sind, vorzugsweise, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, entweder mit Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder β-Galactosidase, die in der Lage ist, ein farbloses oder nahezu farbloses Substrat oder Cosubstrat in ein stark gefärbtes Produkt oder in ein Produkt, das in der Lage ist, einen gefärbten Komplex mit einem Chromogen zu bilden, das visuell nachgewiesen oder spektrophotometrisch gemessen werden kann, umzuwandeln, erzielt.
Andere auf dem Fachgebiet bekannte Nachweissysteme können jedoch eingesetzt werden und schließen diejenigen ein, in welchen die gebildete Produktmenge elektrochemisch oder luminometrisch gemessen wird. Das Nachweissystem kann auch radioaktiv markierte Antikörper einsetzen, wobei in diesem Fall die Menge an Immunkomplex durch Szintillationszählung oder Zählung quantifiziert wird. Grundsätzlich kann jeder Typ an immunologischem Test zum Nachweis von Antikörpern verwendet werden, sofern der Test den Komplex entweder zwischen Streptavidin oder Avidin und (einem) biotinylierten, wie beschrieben synthetisierten Peptid(en) verwendet.
Auch eingeschlossen sind Konkurrenzassays, in welchen man Komplexe von Streptavidin oder Avidin und biotinylierten Peptiden in Lösung mit dem Festphasen-gebundenen Antigen um die Antikörperbindung konkurrieren lässt, oder Assays, in welchen man freies Peptid in Lösung mit den Festphasen-gebundenen Komplexen von Streptavidin oder Avidin und biotinylierten Peptiden konkurrieren lässt. Beispielsweise sind die vielen Typen an immunologischen Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung von Antikörpern und Antigen detailliert erörtert (Tijssen, P., Practise and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Press, Amsterdam, Oxford, New York, 1985).
Die immunologischen Assays können auf einzelne (biotinylierte) Peptide beschränkt werden. Vorzugsweise wird jedoch ein Gemisch aus (biotinylierten) Peptiden verwendet, das mehr als ein Epitop einschließt, das von dem (den) infektiösen Mittel(n), an welchem die Gegenwart von spezifischen Antikörpern zu messen ist, abgeleitet ist.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren zum Durchführen der in-vitro-Bestimmung des Antikörpernachweises ist der Linienimmunassay (LIA).
Dieses Verfahren des Antikörpernachweises besteht im Wesentlichen aus den folgenden Schritten:

– die Antigene, möglichst in Form von Komplexen von biotinylierten Peptiden und Streptavidin oder Avidin, die zu testen oder zu verwenden sind, werden als parallele Linien auf eine Membran aufgebracht, die in der Lage ist, das zu testende Antigen kovalent oder nicht-kovalent zu binden,
– nicht belegte Bindungsstellen auf der Membran werden mit einem irrelevanten Protein, wie Casein oder Rinderserumalbumin, geblockt,
– die Membran wird in Streifen in einer Richtung senkrecht zu der Richtung, in welcher die Antigen-(biotinyliertes Peptid-)-Linien zugeführt werden, geschnitten,
– eine geeignete Verdünnung eines Antiserums oder einer anderen Körperflüssigkeit (nachzuweisende Antikörper enthaltend) werden mit einem Streifen in Kontakt gebracht, an welchen die Antikörper gebunden sind, und man lässt dies für eine Zeitdauer, die zum Stattfindenlassen der Bindungsreaktion ausreichend ist, inkubieren,
– ungebundene Bestandteile werden durch Waschen des Streifens entfernt,
– der Nachweis von Immunkomplexen wird durch Inkubieren des Streifens mit heterologen Antikörpern, die spezifisch an die Antikörper im Testserum binden und an ein Enzym, wie Meerrettichperoxidase, konjugiert worden sind, erzielt,
– die Inkubation wird für eine Zeitdauer durchgeführt, die zum Stattfindenlassen der Bindung ausreichend ist,
– die Gegenwart von gebundenem Konjugat wird durch die Zugabe des (der) erforderlichen Substrats oder Cosubstrate, die durch die Wirkung des Enzyms in ein gefärbtes Produkt umgewandelt werden, nachgewiesen,
– die Reaktionen werden visuell nachgewiesen oder können durch Densitometrie quantifiziert werden.

Wie im Abschnitt Beispiele aufgezeigt, betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer wie vorstehend definierten Peptidzusammensetzung zur Immunisierung gegen eine HIV-Infektion.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der in der Erfindung verwendeten biotinylierten Peptide, was die Verwendung von N-α-Fmoc-X(N-γ-Biotin-)- oder N-α-Fmoc-X(N-γ-Biotin-)-Derivat beinhaltet, wobei

– X
darstellt, wobei n mindestens 1, jedoch weniger als 10 und vorzugsweise zwischen 2 und 6 beträgt, eine Aminogruppe an das Cα-Atom angelagert ist, während die andere an Kohlenstoff-Cy angelagert ist, bei welchem es sich um den am weitesten entfernten Kohlenstoff in der Seitenkette handelt; oder deren Ester, die mit einen Alkohol ROH erhalten werden, und insbesondere Pentafluorphenylester;
– y die Position y in Bezug auf das Kohlenstoffatom, das die COOH-Gruppe im Rest trägt, darstellt.

Dieses Biotinderivat wird Zwischenprodukt genannt, und die vorstehend definierten Zwischenprodukte sind neue Verbindungen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung bestimmt werden.
In einem vorteilhaften Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung kann das Zwischenprodukt durch eine der folgenden Formeln dargestellt werden:
N-α-Fmoc-(N-γ-Biotin) ist N-α-Fmoc-Lysin(ε-Biotin) oder N-α-Fmoc-Ornithin(N-β-Biotin).
Die N-terminalen biotinylierten Peptide können gemäß dem Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfasst:

– Addition von aufeinander folgenden Aminosäuren, die an dem Harz ordnungsgemäß geschützt sind, um Fmoc-AA_n.....AA₁-Harz zu erhalten,
– Abspaltung der NH₂-terminalen Schutzgruppe, z.B. mithilfe von Piperidin,
– Addition des Zwischenprodukts:
durch seine COOH-Gruppe an die NH₂-terminale Gruppe zum Erhalt von:
– Abspaltung der NH₂-terminalen Schutzgruppe der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen Peptids, das an seinem Amino-Terminus biotinyliert ist, wobei die Schritte der Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen und der Peptidspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchgeführt werden können, und insbesondere
– Abspaltung der NH₂-terminalen Schutzgruppe der Zwischengruppe, z.B. mithilfe von Piperidin,
– Abspaltung vorn Harz, z.B. mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure, in Gegenwart von Radikalfängern, wie Ethandithiol, Thioanisol oder Anisol,
– Extraktion des Peptids mit einen Lösungsmittel, wie Diethylether, zum Entfernen des Hauptteils der Säure und der Radikalfänger,
– Reinigung, wie mit HPLC, zum Erhalt von:

Biotin kann unter Verwendung auch von herkömmlichen Aktivierungsvorgehensweisen günstigerweise an den freien Amino-Terminus einer sonst vollständig geschützten Peptidkette gekuppelt werden. Da Biotin eine Carboxygruppe und keine Aminogruppen besitzt, fungiert Biotin im Wesentlichen als Kettenterminator. Bevorzugte Aktivierungsmittel zur in-situ-Aktivierung schließen Benzotriazol-1-yl-oxy-tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP), o-Benzotriazol-1-yl-N,N,N'N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und o-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Aktivierungsvorgehensweisen unter Einsatz dieser und verwandter Verbindungen sind dem Fachmann der Festphasenpeptidsynthese bekannt, und die Kupplung von Biotin bringt kein erhebliches Abweichen von Standardkupplungsprotokollen mit sich.
Biotin in einer voraktivierten Form kann ebenfalls verwendet werden. Entweder wird N-Hydroxysuccinimidobiotin oder Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester günstigerweise eingesetzt, und beide sind im Handel erhältlich. Dieses Kupplungsverfahren ist von Lobl, T.J., Deibel, M.R., und Yern, A.W., Anal. Biochem. (1988) 170 (2):502–511 beschrieben worden. Nach der Zugabe des N-terminalen Biotins wird das Peptid von dem Harz in Gegenwart von Radikalfängern abgespalten, wobei deren Auswahl von den üblichen Erwägungen der Peptidaminosäurezusammensetzung und der Beschaffenheit der verwendeten Schutzgruppen abhängt.
Die Carboxy-terminalen biotinylierten Peptide, die an dem Verfahren der Erfindung beteiligt sind, können gemäß einem Verfahren hergestellt werden, das Folgendes umfasst:

– Kuppeln einer Carboxy-aktivierten Form des wie vorstehend definierten Zwischenprodukts an eine abspaltbare Verbindungsgruppe, die am Harz angelagert ist, z.B. zum Erhalt der folgenden Verbindung:
– Abspaltung der α-Aminogruppe der Zwischenverbindung, z.B. mithilfe von Piperidin zum Erhalt von:
– aufeinander folgende Addition der anschließenden Aminosäuren AA₁....AA_n, die ordnungsgemäß geschützt sind, an
zum Erhalt von:
– Abspaltung der NH₂-terminalen Schutzgruppe, z.B. mithilfe von Piperidin,
– Abspaltung der Schutzgruppen der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen Peptids, das an seinem Carboxy-terminalen Ende biotinyliert ist, wobei die Schritte der Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppe und der Peptidspaltung leicht gleichzeitig oder getrennt durchgeführt werden können, und insbesondere
– Abspaltung der NH₂-terminalen Schutzgruppe, z.B. mithilfe von Piperidin,
– Abspaltung vom Harz, z.B. mit Trifluoressigsäure in Gegenwart von Radikalfängern, wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol,
– Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel, wie Diethylether, zum Entfernen des Hauptteils der Säure und der Radikalfänger,
– Reinigung, wie mit HPLC, zum Erhalt von:

Die intern biotinylierten Peptide können gemäß einem Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfasst:

– Addition von aufeinander folgenden Aminosäuren, die ordnungsgemäß geschützt sind, an das Harz, um Fmoc-AA_n....AA₁-Harz zu erhalten,
– Abspaltung der NH₂-terminalen Schutzgruppe,
– Addition des Zwischenprodukts:

durch seine COOH-Gruppe an die NH₂-terminale Gruppe zum Erhalt von:
– Abspaltung der α-Aminogruppe der Zwischenverbindung, z.B. mithilfe von Piperidin, zum Erhalt von:
– Addition der nachfolgenden Aminosäuren, die ordnungsgemäß geschlitzt sind, an das Harz zum Erhalt von:
– Abspaltung der NH₂-terminalen Schutzgruppe der erhaltenen Verbindung, Abspaltung vom Harz, Extraktion und Reinigung des erhaltenen Peptids, das an seinem Amino-Terminus biotinyliert ist, wobei die Schritte der Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppe und der Peptidspaltung leicht gleichzeitig oder separat durchgeführt werden können, und insbesondere
– Abspaltung des NH₂-Terminus, z.B. mithilfe von Piperidin,
– Abspaltung vom Harz, z.B. mit Trifluoressigsäure in Gegenwart von Radikalfängern, wie Ethandithiol oder Thioanisol oder Anisol,
– Extraktion des Peptids mit einem Lösungsmittel, wie Diethylether, zum Entfernen des Hauptteils der Säure und der Radikalfänger,
– Reinigung, wie mit HPLC, zum Erhalt von:

Unter bestimmten Umständen kann es sich als besonders vorteilhaft erweisen, ein Peptid intern oder an seinem Carboxy-Terminus biotinylieren zu können. Derartige Fälle ergeben sich z.B., wenn die Aminosäuresequenz eines Peptids der Amino-terminalen Sequenz eines Proteins entspricht. Die Anlagerung eines Biotins an den Amino-Terminus eines derartigen Peptids führt zu einer Struktur, die sich von derjenigen, die im nativen Protein zu finden ist, deutlich unterscheidet, und kann infolgedessen die Bindungseigenschaften der biochemischen Eigenschaften des Peptids nachteilig beeinflussen. Es ist auch möglich, dass selbst bei Peptiden, die den internen Proteinsequenzen entsprechen, ihre Erkennung durch Bindungsproteine oder Immunglobuline davon abhängen kann, an welchem Ende des Peptids es sich befindet und in welcher Weise es zur Bindung präsentiert wird. Die Wichtigkeit der Peptidorientierung ist von Dyrberg, T. und Oldstone, M.B.A., J. Exp. Med. (1936) 164:1344–1349, beschrieben worden.
Um in der Lage zu sein, eine Biotinyleinheit in ein Peptid in einer positions- und sequenzunabhängigen Weise einzubringen, wurden Versuche unternommen, ein geeignetes Reagens zu synthetisieren, das unter Verwendung von herkömmlichen Vorgehensweisen gekuppelt werden kann. Ein herkömmliches Reagens zur C-terminalen oder internen Biotinylierung ist N-ε-Biotinyllysin. Mit der Maßgabe, dass die α-Aminogruppe dieser Verbindung geeignet geschützt (Fmoc und tBoc) ist, kann dieses Reagens zum Einbringen eines Biotins überall in der Peptidkette, einschließlich des Amino-Terminus, durch in der Festphasenpeptidsynthese verwendeten Standardvorgehensweisen verwendet werden. Die Synthese des t-Bocgeschützten Derivats ist beschrieben worden (Bodansky, M., und Fagan, D.T., J. Am. Chem. Soc. (1977) 99:235–239) und wurde zum Synthetisieren von kurzen Peptiden zur Verwendung beim Untersuchen der Enzymaktivitäten von bestimmten Transcarboxylasen verwendet.
Anders als beim t-Boc-Derivat ist die Synthese von N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) nicht beschrieben worden und angesichts des zunehmenden Interesses an Synthesestrategien auf Fmoc-Basis wird diese Verbindung als besonders vorteilhaft betrachtet.
Es gibt eine Anzahl von möglichen Wegen, die eingeschlagen werden können, um zu der gewünschten Fmoc-geschützten Verbindung zu gelangen. Diese sind in 1 dargestellt. In der ersten Vorgehensweise kann im Handel erhältliches N-α-Fmoc-Lys(N-ε-tBoc) als Ausgangsmaterial verwendet werden. Der N-ε-tBoc-Schutz wird unter Verwendung von Trifluoressigsäure und einem Radikalfänger, wie Wasser, entfernt. Ein leichter molarer Überschuss des so erhaltenen N-α-Fmoc-Lysins wird dann mit Carboxy-aktiviertem Biotin umgesetzt. Das erhaltene Produkt kann durch selektive Extraktionen und Standardchromatographietechniken leicht gereinigt werden. In einer alternativen Vorgehensweise kann N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) aus im Handel erhältlichem N-ε-Biotinyllysin (Biocytin) durch Umsetzung mit Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat hergestellt werden. Zahlreiche Beispiele für diese Reaktionen, die als Richtlinien verwendet werden können, sind in Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989, angegeben.
Die in 1 (Verfahren A) dargestellte Strategie kann auch zum Synthetisieren von N-α-Fmoc-Ornithin(N-β-Biotin) aus im Handel erhältlichem N-α-Fmoc-Ornithin(N-β-tBoc) angewandt werden. Das Ornithinderivat unterscheidet sich vom Lysinderivat nur in der Länge der Seitenkette, die für das Ornithinderivat um ein Kohlenstoffatom kürzer ist. Das N-α-Fmoc-Lys kann bequem in die Peptidkette unter Verwendung der Probenreagenzien(???) für die für freies Biotin beschriebene in-situ-Aktivierung eingebracht werden.
Alternativ dazu kann N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin)-o-pentafluorphenylester bequem aus N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) und Pentafluorphenyltrifluoracetat unter Verwendung der Basen-katalysierten Umesterungsreaktion, beschrieben von Green, M. und Berman, J., Tetrahedron Lett. (1990) 31:5851–5852, zur Herstellung von o-Pentafluorphenylstern von Aminosäuren synthetisiert werden. Dieser Aktivester kann direkt zum Einbringen von N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) in die Peptidkette verwendet werden. Die Klasse der vorstehend definierten Zwischenprodukte kann gemäß einem Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfasst:

– Umsetzung einer vorstehend beschriebenen Diaminomonocarbonsäure mit Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat oder Fluorenylmethylchlorformiat unter Bedingungen eines sorgfältig kontrollierten pH-Werts unter Erhalt eines einfach geschützten N-α-Fmoc-Derivats,
– oder, alternativ dazu, Verwendung von im Handel erhältlichen N-α-Fmoc-geschützten Diaminomonocarbonsäuren, wobei die Seitenkettenaminogruppe mit einer anderen Schutzgruppe als die zum Schützen der α-Aminogruppe verwendeten Fmoc-Gruppe versehen ist, wobei die Seitenkettenaminoschutzgruppe leicht unter Bedingungen, die die N-α-Fmoc-Gruppe intakt lassen, selektiv entfernt werden kann,
– Reinigung des einfach geschützten N-α-Fmoc-Diaminomonocarbonsäurederivats durch selektive Extraktionen und Chromatographie,
– Umsetzung des erhaltenen Derivats mit einem Carboxy-aktivierten Derivat von Biotin, wie N-Hydroxysuccinimidbiotin, zum Erhalt des (N-α-Fmoc)-(N-γ-Biotin)-Derivats, welches das gewünschte Zwischenprodukt ist,
– Reinigung des Zwischenprodukts durch selektive Extraktionen, Ausfällungen oder Chromatographie.

Sind die biotinylierten Peptide, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden, mit Verbindungsarmen zu versehen, können diese chemischen Einheiten günstigerweise entweder am N- oder C-Terminus einer Peptidsequenz während der Festphasensynthese unter Verwendung von Standardkupplungsprotokollen angelagert werden, sofern die Aminogruppen dieser Verbindungen mit geeigneten vorübergehenden Aminoschutzgruppen versehen sind.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN UND TABELLEN:
Sämtliche Proben und Seren, die in den Figuren und Tabellen erwähnt sind, sind willkürlich ausgewählte Proben und Seren, die Antikörper enthalten, die infolge einer natürlich vorkommenden Infektion durch ein virales Mittel produziert werden.
1 stellt die Strategien der Synthese von N-α-Fmoc-Lysin(N-ε-Biotin) dar.
Insbesondere entspricht Verfahren A der Synthese von N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) aus N-ε-Fmoc-Lys(N-ε-tBoc) und entspricht Verfahren B der Synthese von N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin) aus N-ε-Biotinyllysin.
2 stellt das Diagramm dar, das in einer Umkehrphasenchromatographie der bei der Herstellung der vorstehend definierten Zwischenprodukte beteiligten Vorläufer und der Zwischenverbindungen erhalten wird.
Die Umkehrphasenchromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

– Gradientspezifikationen: Puffer A: 0,1% TFA in H₂O, Puffer B: 0,1% TFA in Acetonitril, Säule: C2/C18-Umkehrphase (Pharmacia, Pep-S), Nachweiswellenlänge: 255 Nanometer;
– Gradient: 0% B von 0 bis 1 Minute, 0% B bis 100% B von 1 bis 60 Minuten, 0% B von 60 bis 70 Minuten.

Das erste Diagramm entspricht Verfahren A (siehe 1), und das zweite Diagramm entspricht Verfahren B (siehe 1).
Tabelle 1 stellt die Gesamterkennung von HIV-V3-Schlingenpeptiden dar.
Tabelle 2 stellt die Erkennung von HIV-Peptiden gemäß der geographischen Region dar.
Sämtliche Aminosäuresequenzen sind im herkömmlichen und allgemein akzeptierten Dreibuchstabencode und, wo angezeigt, im Einbuchstabencode angegeben. Die Peptidsequenzen sind von links nach rechts angegeben, was konventionell die Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus darstellt.
Eine Anzahl von nicht herkömmlichen Codes wird ebenfalls zum Darstellen von chemischen Gruppen oder Modifikationen verwendet und ist wie folgt definiert:

Gruppe Code

AC Acetyl

Bio D-Biotinyl

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

tBoc tertiäres Butyloxycarbonyl
BEISPIEL 1: PEPTIDSYNTHESE
Sämtliche beschriebenen Peptide wurden an einem TentaGel S-RAM (Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland), einem Polystyrol-Polyoxyethylen-Pfropf-Copolymer, funktionalisiert mit der säurelabilen Verbindungsgruppe 4-(α-Fmoc-Amino-2',4'-dimethoxybenzyl)phenoxyessigsäure (Rink, Tetrahedron Lett. (1987) 28:3787) synthetisiert, um durch Spaltung Peptid-Carboxy-terminale Amide zu bilden. Seitenkettenschutz auf t-Butylbasis und Fmoc-α-Aminoschutz wurde verwendet. Die Guanidingruppe von Arginin wurde mit der 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl-Einheit geschützt. Die Imidazolgruppe von Histidin wurde entweder mit tBoc oder Trityl geschützt, und die Sulfhydrylgruppe von Cystein wurde mit einer Tritylgruppe geschützt. Kupplungen wurden unter Verwendung von vorgeformten o-Pentafluorphenylestern, außer im Falle von Arginin, wo TBTU als Aktivierungsmittel verwendet wurde, in Gegenwart von 1,5 Äquivalenten der Base N-Methylmorpholin, durchgeführt. Gegebenenfalls wurden Glutamin und Asparagin ebenfalls unter Verwendung der TBTU-Aktivierung gekuppelt. In diesen Fällen wurden die Trityl-geschützten Derivate dieser Aminosäuren eingesetzt. Biotin wurde entweder unter Verwendung von TBTU oder HBTU gekuppelt. Alle Synthesen wurden auf einen Milligen 9050 PepSynthesizer (Novato, Kalifornien) unter Verwendung von kontinuierlichen Fließvorgehensweisen durchgeführt. Nach der Abspaltung mit Trifluoressigsäure in Gegenwart von Radikalfängern und Extraktion mit Diethylether wurden alle Peptide durch C18-Umkehrphasenchromatographie analysiert.
BEISPIEL 2: SYNTHESE VON N-α-Fmoc-Lys(N-ε-Biotin)
A. Verfahren A
Im Handel erhältliches N-α-Fmoc-L-Lysin(N-ε-tBoc) (1,5 Gramm) wurde mit 20 Milliliter 95%iger Trifluoressigsäure, 5% H₂O für eine Dauer von 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Der Hauptteil der Säure wurde dann unter einem Stickstoffstrom abgedampft. Zehn Milliliter Wasser wurden zugesetzt, und die Lösung wurde 3-mal mit Diethylether extrahiert. Die wässrige Phase wurde dann zur Trockne im Vakuum über Phosphorpentoxid eingedampft. Das erhaltene Pulver (N-α-Fmoc-L-Lysin) wurde durch Umkehrphasenchromatographie analysiert und zeigte ein homogenes Produkt, das, wie erwartet, hydrophiler als das Ausgangsmaterial war.
N-α-Fmoc-Lysin (190 mg, 0,49 mmol) wurde in 8 Milliliter 0,1 M Boratpuffer, pH 8,7 gelöst. N-Hydroxysuccinimidbiotin (162 mg, 0,47 mmol) wurde in 4 Milliliter Dimethylformamid gelöst und der Lösung von N-α-Fmoc-Lysin zugesetzt. Der pH-Wert wurde überwacht und gegebenenfalls mit NaOH titriert. Nach 2 Stunden wurde die Lösung mit HCl auf pH 2,0 angesäuert, wobei zu diesem Zeitpunkt ein weißer Niederschlag erhalten wurde.
Nach der Extraktion mit Ethylacetat und Zentrifugation wurde der weiße Niederschlag an der H₂O:Ethylacetat-Grenzfläche gefunden. Beide Phasen wurden entfernt, und der Niederschlag wurde zweimal mit 10 mM HCl, einmal mit Ethylacetat, gefolgt von zwei Extraktionen mit Diethylether, extrahiert. Der Niederschlag wurde in DMF gelöst und durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das kristalline Pulver wurde dann im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das erhaltene Produkt wurde durch Umkehrphasenchromatographie analysiert und zeigte einen Hauptpeak, der, wie erwartet, später eluierte als N-α-Fmoc-Lys. Ein sehr kleiner Peak von N-α-Fmoc-Lys wurde ebenfalls beobachtet (2a).
B. Verfahren B
Im Handel erhältliches N-ε-Biotinyllysin (Biocytin, Sigma, 249 mg, 0,67 mmol) wurde in 8 Milliliter 1 M Na₂CO₃ gelöst und auf Eis gekühlt. Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (222 mg, 0,66 mmol) wurde in 2 Milliliter Aceton gelöst und über eine Zeitdauer von 30 Minuten unter kräftigem Rühren der Biotinyllysinlösung zugesetzt. Das Rühren wurde für eine Dauer von 5 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 1 M Na₂CO₃ nach Bedarf zwischen 8 und 9 gehalten. Das Aceton wurde dann unter Vakuum abgedampft, und 1,0 M HCl wurde zugesetzt, bis der pH-Wert der Lösung etwa 2 betrug. Nach Ansäuerung der Lösung erschien ein weißer Niederschlag, der zweimal mit 10 mM HCl, zweimal mit Ethylacetat und zweimal mit Diethylether gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde in DMF gelöst und durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das kristalline Pulver wurde dann gründlich im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Das erhaltene Produkt wurde durch Umkehrphasenchromatographie analysiert und zeigte einen Hauptpeak, der mit derselben Retentionszeit (30,5 Minuten) wie das unter Verwendung von Verfahren 1 erhaltene Produkt eluierte (2b).
BEISPIEL 3: VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON PEPTIDEN, DIE IMMUNOLOGISCH WICHTIGEN EPITOPEN ENTSPRECHEN, IN EINEM ENZYM-VERKNÜPFTEN IMMUNSORBENT-ASSAY (ELISA) UNTER VERWENDUNG VON SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN
Waren die Peptide direkt aufzutragen, wurden Stammlösungen der Peptide in Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt und auf Polystyrolmikrotiterplatten mit einer Peptidkonzentration von 2 bis 5 Mikrogramm pro Milliliter für eine Dauer von 1 Stunde bei 37°C aufgetragen.
In Fällen, in welchen biotinylierte Peptide zu bewerten waren, wurden Platten zuerst mit Streptavidin in Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, mit einer Konzentration von 3 Mikrogramm pro Milliliter für eine Dauer von 1 Stunde bei 37°C überzogen. Die Platten wurden dann gewaschen, um überschüssiges, ungebundenes Protein zu entfernen. Eine Arbeitslösung des biotinylierten Peptids mit 1 Mikrogramm pro Milliliter in Natriumcarbonatpuffer wurde dann den Mulden der Mikrotiterplatte zugesetzt und für eine Dauer von 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Nachdem die Platten mit Antigen überzogen waren, wurden jegliche freien Bindungsstellen auf dem Kunststoff mit Casein geblockt. Nach Waschen wurde eine Verdünnung der geeigneten Antiseren, gewöhnlich 1:100, den Mulden der Platten zugesetzt und für eine Dauer von 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Nach dem Waschen zum Entfernen von ungebundenem Material wurde die spezifische Antikörperbindung durch Inkubieren der Platten mit Ziegen-Anti-Human-Immunglobulin-Antikörpern, konjugiert an das Enzym Meerrettichperoxidase, nachgewiesen. Nach der Entfernung von ungebundenem Konjugat durch Waschen wurde eine Lösung, enthaltend H₂O₂ und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin zugesetzt.
Die Reaktionen wurden nach einer geeigneten Dauer durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt. Positive Reaktionen ließen eine gelbe Farbe entstehen, die unter Verwendung eines herkömmlichen Mikrotiterplattenlesegeräts quantifiziert wurde. Absorptionsmessungen wurden bei einer Wellenlänge von 450 Nanometer durchgeführt, und alle Daten sind als Wert der optischen Dichte bei dieser Wellenlänge ausgedrückt.
Sämtliche Peptide wurden mit Gly-Gly-Abstandhaltern und einem Biotin an dem Amino-Terminus versehen. Die Peptide wurden in einem Linienimmunassayversuch (LIA) bewertet und mit den kürzeren Kernpeptiden verglichen. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Die längeren Kernpeptide sind sehr vorteilhaft mit den kürzeren Peptiden vergleichbar und geben übereinstimmend eine intensivere Reaktion. Dies könnte dadurch erklärt werden, dass (i) die längeren Peptide zwei oder mehr Epitope einbringen, die vorher über zwei separate Peptide verteilt waren, und/oder (2)?(ii) eine Konformationsverleihung vorliegt, die in den längeren Peptiden ausgeprägter sein kann.
BEISPIEL 4: VERWENDUNG VON BIOTINYLIERTEN PEPTIDEN VON DEM V3-SCHLINGENBEREICH VON GP120 VON VERSCHIEDENEN HIV-1-ISOLATEN IN EINEM LINIENIMMUNASSAY ZUM NACHWEIS VON HIV-ANTIKÖRPERN
Zum Bestimmen des allgemeinen diagnostischen Werts des V3-Schlingenbereichs von gp120 wurden neun Peptide, die von diesem Bereich von neun unterschiedlichen HIV-1-Isolaten abgeleitet waren, synthetisiert und in einem LIA eingeschlossen. Alle neun Peptide wurden mit einem Gly-Gly-Abstandhalter und einem N-terminalen Biotin versehen.

Die abgeglichenen Peptid-(Einbuchstabenaminosäurecode)-Sequenzen sind wie folgt:

CON	NNTRKSIHI--GPGRAFYTTGEIIG	23 (SEQ ID NR 3)
SF2	NNTRKSIYI--GPGRAFHTTGRIIG	23 (SEQ ID NR 4)
SC	NNTTRSIHI--GPGRAFYATGDIIG	23 (SEQ ID NR 5)
MN	YNKRKRIHI--GPGRAFYTTKNIIG	23 (SEQ ID NR 6)
RF	NNTRKSITK--GPGRVIYATGQIIG	23 (SEQ ID NR 7)
MAL	NNTRRGIHF--GPGQALYTTG-IVG	22 (SEQ ID NR 8)
BH	NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKI-G	24 (SEQ ID NR 9)
ELI	QNTRQRTPI--GLGQSLYTT-RSRS	22 (SEQ ID NR 10)
ANT70	QIDIQEMRI--GP-MAWYSMG-IGG	21 (SEQ ID NR 2)

Die Peptide wurden mit Streptavidin in einem leichten molaren Überschuss gegenüber Biotinbindungsstellen gemischt und die Komplexe aus Peptiden und Streptavidin wurden vom ungebundenen Material über Sephadex G-25 abgetrennt. Material, das im Hohlraumvolumen eluierte, wurde bei der Vorbereitung des LIA verwendet.
Insgesamt 332 Seren wurden getestet, die von verschiedenen geographischen Regionen erhalten worden waren. Da es bekannt ist, dass in Europa oder Nordamerika isolierte Virusstämme eine geringere Variierbarkeit von Stamm zu Stamm als afrikanische Isolate aufweisen, waren geographische Unterschiede in der V3-Schlingensequenzerkennung zu erwarten. Die Reaktionen von verschiedenen Linien wurden als positiv (i) oder negativ (o) bewertet (Daten nicht dargestellt).
Eine vollständige Bewertung der Seren ist in Tabelle 1 angegeben. Insgesamt ergaben 307 der 332 Seren eine Reaktion auf mindestens ein Peptid an denn V3-Schlingen-LIA. Diejenigen Seren, die keine Reaktion auf ein beliebiges Peptid am V3-Schlingen-LIA zeigten, wurden durch Western Blot getestet, um zu bestimmen, ob die Seren tatsächlich für Anti-HIV-I-Antikörper positiv waren. Es wurde gefunden, dass 6 Seren tatsächlich negativ waren. Die Gesamtanzahl an positiv getesteten Seren betrug deshalb 326. Es gab jedoch 19 Seren, die Antikörper für gp120 enthielten, die keinerlei Reaktion mit einer der V3-Schlingen-LIA zeigten, wobei der Prozentanteil an Seren, die eine positive Reaktion ergaben, global gesehen 94% betrug. Es gab jedoch erhebliche geographische Unterschiede. Diese Unterschiede sind in Tabelle 2 dargestellt.
Der Gesamtprozentanteil an Seren aus den unterschiedlichen geographischen Regionen, die mindestens eine positive Reaktion ergaben, kann wie folgt zusammengefasst werden:
Europäische 100%
Afrikanische 94%
Brasilianische 92%
Zusätzliche Bewertungen mit europäischen Proben weisen darauf hin, dass dieser Prozentanteil tatsächlich etwas weniger als 100% beträgt (Daten nicht dargestellt). Afrikanische Proben, die keine Reaktion im LIA zeigten, wurden durch Western Blot nicht getestet, um die Gegenwart von anderen HIV-Antikörpern zu bestätigen.

Dass die europäischen Seren gut abschneiden würden, war zu erwarten. Die für die afrikanischen Seren erhaltene niedrigere Bewertung war ebenfalls nicht völlig unerwartet, da man weiß, dass in Afrika eine größere virale Heterogenität herrscht. Da V3-Schlingensequenzen von afrikanischen HIV-Stämmen noch nicht so umfassend charakterisiert worden sind wie die europäischen oder nordamerikanischen Stämme, ist es klar, dass wir entweder keine repräsentative Sequenz besitzen oder dass der Versuch, afrikanische Stämme in Bezug auf eine übereinstimmende Sequenz hin zu charakterisieren, keine mögliche Praxis ist, da eine zu große Sequenzdivergenz vorliegt. Die mit den brasilianischen Seren erhaltenen Ergebnisse waren unerwartet, da bisher nichts in Bezug auf die HIV- Variierbarkeit in Brasilien berichtet wurde. Nach diesen Ergebnissen scheint die Situation in Brasilien der Situation in Afrika mehr zu ähneln als der Situation in Nordamerika oder Europa. Tabelle 1

	CON	SC	MN	SF2	BH	RF	MAL	ELI	70
GesamtSUMME	287	261	275	258	108	146	140	24	6
ZÄHLUNG	326	326	326	326	326	326	326	326	326
gp120
positiv
% reaktiv	88	80	84	79	33	45	43	7	2
FEHLER??
GesamtSUMME	287	261	275	258	108	146	140	24	6
ZÄHLUNG	307	307	307	307	307	307	307	307	307
HIV-V3
positiv
% reaktiv	93	85	90	84	35	48	46	8	2

Tabelle 2

EUROPÄISCH	%	AFRIKANISCH	%	BRASILIANISCH
Übereinstimmung	98	Übereinstimmung	89	Übereinstimmung	82
HIV-1 (SC)	98	HIV-1 (MN)	85	HIV-1 (MN)	78
HIV-1 (SF2)	98	HIV-1 (SF2)	79	HIV-1 (SC)	75
HIV-1 (MN)	97	HIV-1 (SC)	73	HIV-1 (SF3)	72
HIV-1 (RF)	75	HIV-1 (MAL)	60	HIV-1 (RF)	38
HIV-1 (MAL)	68	HIV-1 (RF)	34	HIV-1 (MAL)	30
HIV-1 (IIIB)	61	HIV-1 (IIIB)	27	HIV-1 (IIIB)	26
HIV-1 (ELI)	8	HIV-1 (ELI)	13	HIV-1 (ELI)	5
ANT 70	2	ANT 70	2	ANT 70	2

Claims

Peptid mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (A)-(B)-(X)-Y-Leu-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Cys-Y-(X)-Z (SEQ ID Nr. 1) und (A)-(B)-(X)-Y-Gln-Ile-Asp-Ile-Gln-Glu-Met-Arg-Ile-Gly-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Ser-Met-Gly-Ile-Gly-Gly-Y-(X)-Z (SEQ ID Nr. 2) wobei – A, falls vorliegend, wie durch die Klammer angegeben, (eine) Aminosäure(n), eine Aminogruppe oder eine chemische Modifikation des Aminoterminus der Peptidkette darstellt; – Z (eine) Aminosäure(n), eine OH-Gruppe, eine NH₂-Gruppe oder eine Bindung unter Beteiligung von einer dieser beiden chemischen Gruppen darstellt; – B Biotin darstellt; – X eine biotinylierte Verbindung darstellt, die während des Syntheseverfahrens eingebracht wurde; – Y eine kovalente Bindung oder eine oder mehrere chemische Einheiten darstellt, die einzeln oder zusammen einen Verbindungsarm bilden, der die Aminosäuren des Peptids angemessen von der biotinylierten Einheit B oder X abtrennen, wobei die Funktion ist, die sterische Hinderung, die die Bindung der biotinylierten Einheit B oder X an Avidin oder Streptavidin stören kann, zu minimieren, wobei, wenn Y keine kovalente Bindung ist, sie vorteilhafterweise mindestens eine chemische Einheit ist und aus so viel wie 30 chemischen Einheiten bestehen kann, jedoch am häufigsten aus 1 bis 10 chemischen Einheiten, die gleich oder verschieden sein können, stärker bevorzugt aus Glycinresten, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure, 5-Aminovalerinsäure oder 6-Aminohexansäure besteht; – B und X in Klammer eingeschlossen sind, um anzugeben, dass die Gegenwart von Biotin oder einer biotinylierten Verbindung in diesen Positionen optional ist, wobei es die einzige Bedingung ist, dass B oder X in mindestens einer der dargestellten Positionen vorliegt; oder Fragmente von beliebigen der vorstehend angegebenen Peptide, wobei die Fragmente Antikörper gegen HIV mit im Wesentlichen derselben Aktivität wie die Sequenzen, von welchen sie abgeleitet sind, erkennen.
Peptid nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Leu-Trp-Gly-Cys-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Cys (SEQ ID Nr. 1) oder Gln-Ile-Asp-Ile-Gln-Glu-Met-Arg-Ile-Gly-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Ser-Met-Gly-Ile-Gly-Gly (SEQ ID Nr.2)
Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid vorzugsweise während der Peptidsynthese biotinyliert ist, wobei das Peptid N-terminal, C-terminal oder intern biotinyliert ist.
Peptid nach Anspruch 3, das an Streptavidin oder Avidin gekoppelt ist, wobei das Streptavidin oder Avidin selbst möglicherweise an eine feste Phase gekoppelt ist.
Peptid nach Anspruch 3, wobei das Peptid über seine Biotoingruppe an auf einer Nylonmembran vorliegendes Streptavidin gekoppelt ist.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen an einen festen Träger verankert ist.
Verfahren zum Nachweisen von in einer biologischen Probe vorliegenden Antikörpern gegen HIV, umfassend: (i) Inkontaktbringen der auf die Gegenwart von HIV zu analysierenden biologischen Probe mit (einem) Peptid(en) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, (ii) Nachweisen des zwischen den Antikörpern und dem (den) Peptid(en) gebildeten Immunkomplexes.
Verfahren zum Nachweisen des in einer Probe vorliegenden HIV-Typs, umfassend: (i) Inkontaktbringen der auf die Gegenwart von HIV zu analysierenden biologischen Probe mit (einem) Peptid(en) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, (ii) Nachweisen des zwischen den Antikörpern und dem (den) Peptid(en) gebildeten Immunkomplexes.
Immunologischer Test zum Nachweisen von HIV-Antikörpern unter Einsatz eines (von) Peptids (Peptiden) nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Immunologischer Kompetitionstest zum Nachweisen von HIV-Antikörpern unter Einsatz eines Peptids nach Anspruch 1 bis 3, wobei das Peptid mit einem Antigen oder einem an eine feste Phase angelagerten Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 konkurrieren kam.
Immunologischer Test zum Nachweisen von HIV-Antikörpern nach Anspruch 9 bis 10, wobei die Peptide in Form von parallelen Linien an eine Membran angelagert sind.
Immunologischer Test zum gleichzeitigen Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern gegen verschiedene HIV-Genotypen in einer Probe unter Einsatz eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6.