DE69333145T2

DE69333145T2 - Methode zur kontrollierten herstellung von polypeptiden in bakterien

Info

Publication number: DE69333145T2
Application number: DE69333145T
Authority: DE
Inventors: Steven Bass; R. James SWARTZ
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-19
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2013-11-20
Also published as: CA2145388A1; AU5615194A; AU671512B2; ES2204911T3; US5304472A; JPH08503612A; IL107564A; CA2145388C; ATE247167T1; EP0669980A1; JP3503705B2; DK0669980T3; DE69333145D1; IL107564A0; EP0669980B1; WO1994012636A1; PT669980E

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nucleinsäuremolekül und Wirtszellen, die zur Kontrolle der Produktion von Polypeptiden in bakteriellen Wirtszellkulturen zweckdienlich sind. Spezieller betrifft die Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das für PstS-Varianten kodiert, die Mutationen in der Phosphatbindungsregion des nativen PstS-Proteins aufweisen, die die Regulation der Induktion der Polypeptidsynthese in Bakterienzellen ermöglichen.
Beschreibung des verwandten Standes der Technik
Das pstS- (phoS-) Gen kodiert für ein Phosphat-bindendes periplasmatisches Protein, das Teil des hochaffinen Phosphattransportsystems ist und die Phosphataufnahme in gewissen prokaryotischen Organismen, wie z.B. E. coli, mit einer Dissoziationskonstante von unter 1 μM vermittelt. Medvecczky und Rosenberg, Biochem. Biophys. Acta 211, 158-168 (1970). Die molekulare Struktur des Phosphattransportproteins wird von Luecke und Quiocho, Nature 347, 402-406 (1990), bereitgestellt.
Das pstS-Gen gehört zum Phosphatregulon, dessen Expression durch Phosphatmangel induziert und durch das PhoB-Protein positiv reguliert wird. Die Phosphat- (pho-) Box ist eine Konsensussequenz die von den regulatorischen Regionen der Gene im Pho- oder pst-Regulon gemeinsam benutzt wird. Mehr als zwanzig Gene, einschließlich pstA, pstS, phoE, pstB, phoU und ugpAB werden von Phosphat reguliert. Wenn die Phosphatkonzentration der Medien unter ungefähr 0,1 μM bis 0,2 mM fällt (Torriani, Biochem. Biophys. Acta 38, 460-469 (1960)) oder in einer pstS-Mutante (Amemura et al., siehe oben) wird die Expression dieser Gene von einem Regulationssystem induziert, das die positiven Regulatoren PhoB und PhoR erfordert.
Für einen Überblick des Phosphatregulons in E. coli siehe Shinagawa et al., „Structure and Function of the Regulatory Genes for the Phosphate Regulon in Escherichia coli", in: Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms, Torriani-Gorini et al. (Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington, DC, S. 20-25 (1987); Wanner, "Phosphate Regulation of Gene Expression in Escherichia coli", in: F.C. Neidhardt et al. (Hrsg.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Bio-logy, American Society for Microbiology, Washington, DC, S. 1326-1333 (1987); Torriani, BioEssays 12, 371-376 (1990); Matin et al., Annu. Rev. Microbiol. 43, 293-316 (1989).
Das das pstS-Gen enthaltende DNA-Fragment ist aus der chromosomalen DNA des E. coli-Stamms K-12 isoliert worden. Iwakura et al., J. Biochem. 92, 615-622 (1982). Später ist die vollständige Nucleotidsequenz des pstS-Gens und prepstS-Gens und die von ihnen kodierte Aminosäuresequenz von Magota et al., J. Bacteriol. 157, 909-917 (1984), publiziert worden. Siehe auch Surin et al., siehe oben. Das pre-PstS-Protein enthält eine Peptidverlängerung, die sich aus 25 Aminosäureresten am Aminoterminus des PstS-Proteins zusammensetzt, welche die allgemeinen Charakteristika eines Signalpeptids aufweist. Das reife PstS-Protein setzt sich aus 321 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von ungefähr 34.422-34.427 auf. Die Regulationsregion des pstS-Gens enthält eine charakteristische Shine-Dalgarno-Sequenz an einer passenden, der Translationsinitiationsstelle vorausgehenden Stelle, sowie drei mögliche Pribnow-Boxen und eine -35-Sequenz. Die Sequenzen des strukturellen pstS-Gens und der Promotorregion werden ebenfalls von Surin et al., ). Bacteriol. 157, 772-778 (1984), beschrieben, die eine alternative Promotorregion auf Basis der Homologie mit den Promotorregionen der pstA- und pstE-Gene ermitteln. Der Promotor des pstS-Gens wurde auch von Kimura et al., Mol. Gen. Genet. 215, 374-380 (1989), untersucht.
Die Funktion des pstS-Proteins ist der Transport von anorganischem Phosphat aus dem Periplasma in die Zelle als Phosphat-spezifisches Transportprotein. Der Transport wird erreicht, wenn das PstS-Protein über dessen Phosphatbindungsdomäne an Phosphat bin det. Für E. coli umfasst diese Domäne die Gerüstreste 10. 11, 38, 140 und 141 und die Seitenketten der Reste 10, 38, 56, 135, 139 und 141. Andere Reste könnten ebenfalls indirekt die Phosphatbindung beeinflussen, die assoziierte Konformationsverschiebung von offenem zu geschlossenem Komplex, wenn Phosphat an PstS gebunden wird und/oder der assoziierte Signalisierungsweg.
Es hat sich erwiesen, das allen definierten pstS-Mutationen in der PST-Region das periplasmatische Phosphatbindungsprotein fehlt und daher wurde dieser Locus aus das Strukturgen des Bindungsproteins angesehen. Levitz et al., Mol. Gen. Genet. 200, 118-122 (1985).
Der Alkalische-Phosphatase- (phoA-) Promotor ist häufig als Promotor für das Exprimieren homologer sowie heterologer DNA in Bakterienzellen verwendet worden. Siehe z.B. JP 61/280292, veröffentlicht am 10. Dezember 1986. Bei der Produktion von Polypeptiden unter Nutzung der Alkalischen Phosphatase oder des pstS-Promotors erfolgt Zellwachstum anfänglich mit niedrigem anorganischem Phosphat im Medium. Diese Zellen verwerten das Phosphat im Medium, so dass die Induktion der Expression des für das Polypeptid kodierenden Gens in der späten log-Phase des Zellwachstums erfolgt, wenn der Phosphatgehalt unter einen Schwellwert sinkt. Die Zellen erleiden dann einen vollständigen Phosphatmangel, was einen Wachstumsstillstand, eine mehrfachen Anstieg des Zellproteinabbaus und eine Hemmung der RNA-Synthese bewirkt. St. John und Goldberg, J. Bacteriol. 143, 1223-1233 (1980). Zusätzlich kann das Ausmaß der Expression und die Proteinproduktionsrate wegen der Notwenigkeit des nahezu vollständigen Fehlens von anorganischem Phosphat im Medium nicht kontrolliert werden.
WO 86/04089 betrifft einen E. coli-Stamm, der eine Mutation im PhoS-Gen trägt und mit dem für Alkalische Phosphatase kodierenden Gen transformiert worden ist. Der Anstieg der Phosphatkonzentration im Medium führte zu einer Abnahme der spezifischen Aktivität der Alkalischen Phosphatase.
Zahlreiche Verfahren sind untersucht erkundet worden, die das pst-Regulon verwenden um die Expressionsstärke zu erhöhen. Beispielsweise soll ein Expressionsvektor, der ein für an ein Replikon gebundenes PstS kodierendes Gen enthält, die Expressionsstärken von Genen von Interesse in Bakterien erhöhen. US-Patent Nr. 4.703.005, erteilt am 27. Oktober 1987. Zusätzlich wird ein Fusionspolypeptid der Sequenz PstS-Sc-X-, worin Sc eine für eine Spaltstelle kodierende Sequenz und X das für eine spezifiziertes Protein kodierende Gen ist, in der Fr. Patentanmeldung Nr. 2.599.380, publiziert am 4. Dezember 1987, offenbart.
Mutanten von Phosphat-spezifischen Transportproteinen sind ebenfalls publiziert worden. Beispielsweise sind E. coli-Stämme beschrieben worden, die pstA-Mutanten enthalten, die durch Mischen der Bakterien mit N-Nitrosoverbindungen hergestellt wurden. Israeliches Patent Nr. 60714/3, datiert mit 31. Juli 1980. Ferner sind Stämme von E. coli publiziert worden, die spezifisch Alkalische Phosphatase ausscheiden, die eine Mutation im Pst-Regulon aufweisen (eine Mutation der pstS-Form enthaltend) und durch ein Plasmid transformiert werden, das ein E coli-DNA-Fragment enthält, das der 8.5-Minute-Region der Genkarte entspricht. WO 86/04089, publiziert am 17. Juli 1986. In solchen Stämmen produzierte E. coli-PhoA-Mutanten sind ebenfalls beschrieben worden. IL 60.714, publiziert am 31. Juli 1980. Mutierte, von E. coli produzierte Alkalische-Phosphatase-Enzyme mit zumindest einer Aminosäuremutation, die gegenüber der Enzym der Wildform erhöhte enzymatische Aktivität aufweisen, sind offenbart worden. EP 441.252 , publiziert am 14. August 1991.
Zusätzlich wurde die PstS-Funktion durch Analyse von 12 pstS-Mutanten untersucht worden, von denen acht eine Änderung von Thr-10 zu Ile-10 aufwiesen, von denen zwei eine Änderung von Ser-254 zu Phe-254 aufwiesen, wobei eine davon zwei Änderungen von Thr-10 zu Ile-10 und Gly-140 zu Glu-140 aufwies und eine davon drei Änderungen von Thr-10 zu Ile-10, Thr-253 zu Ile-253 und Ser-254 zu Phe-254 aufwies. Die Autoren postulierten aus den Ergebnissen, dass Thr-10 und Ser-254 an der Wechselwirkung mit den Membrankomponenten des Pst-Systems beteiligt sind, wogegen Gly- 140 an der Bindung von Phosphat beteiligt ist, oder dass alternativ dazu mehr als eine Phosphatbindungsdomäne im Phosphat bindenden Protein vorliegen könnten und Thr-10 oder Ser-254 ebenfalls an der Phosphatbindung beteiligt sein könnten. Nakata et al., „Genetic and Biochemical Analysis of the Phosphate-Specific Transport System in Escherichia coli", in: Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms, Torriani-Gorini et al. (Hrsg.), S. 150-155, siehe oben.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren, die für spezifische PstS-Varianten kodieren, die, wenn sie in das Chromosom bakterieller Zellen als Ersatz für das pstS-Gen der Wildform integriert werden, das Wachstum von Bakterienzellen, die mit für ein Polypeptid von Interesse kodierender DNA unter der Kontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors transformiert sind, in Gegenwart von anorganischem Phosphat in allen Wachstumsphasen ermöglicht.
Es ist ein weiteres Ziel, die neuen Nucleinsäuremoleküle hierin einzusetzen, um die Transkriptionsrate der für ein Polypeptid von Interesse kodierenden Nucleinsäure zu kontrollieren und daher das Ausmaß der Induktion des Alkalische-Phosphatase-Promotors in Bakterienzellen zu kontrollieren.
Es ist noch ein weiteres Ziel, die Proteolyse von Polypeptiden zu minimieren, die von Bakterienzellen unter Transkriptionskontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors produziert werden.
Es ist noch ein weiteres Ziel, die Stärke der Induktion des Alkalische-Phosphatase-Promotors zu kontrollieren, um die durch schnelle Induktion des Promotors verursachte Zelltoxizität zu minimieren.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden dem gewöhnlich Fachkundigen nach Prüfung der Patentbeschreibung als Ganzes deutlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Demgemäß stellt die vorliegenden Erfindung in einer ihrer Ausführungsformen ein Nucleinsäuremolekül bereit, das für eine aus der aus T10F PstS, T10L PstS, T10M pstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS und T141H PstS bestehenden Gruppe gewählten E. coli-PstS-Variante kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung E. coli-Wirtszellen bereit, die das obige Nucleinsäuremolekül unter Transkriptionskontrolle des E. coli-pstS-Genpromotors, vorzugsweise in das Chromosom davon integriert umfasst. Diese Wirtszellen umfassen wahlweise weiters ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid von Interesse unter der Transkriptionskontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors kodiert.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids von Interesse bereit, welches das Kultivieren von Bakterienzellen umfasst, denen ihr natives pstS-Gen fehlt und die ein Nucleinsäuremolekül umfassen, das für eine PstS-Variante kodiert, die eine Aminosäurevariation innerhalb der Phosphatbindungsregion des entsprechenden native PstS aufweist, wobei das Nucleinsäuremolekül unter Transkriptionskontrolle des pstS-Genpromotors der Wildform steht und wobei die Bakterienzellen ferner ein Nucleinsäuremolekül umfassen, das für das Polypeptid von Interesse unter Transkriptionskontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors kodiert, worin das Kultivieren in einem Kulturmedium bei einer Konzentration von anorganischem Phosphat im Medium stattfindet, die während aller Zellwachstumsphasen über dem Niveau liegt, bei dem die Zellen an Phosphatmangel leiden und unter Bedingungen stattfindet, die eine Expression der für das Polypeptid von Interesse kodierenden Nucleinsäure ermöglicht.
Vorzugsweise ist die pstS-Variante homolog zum nativen pstS-Gen in den Wirtszellen. Ferner sind die Bakterienzellen vorzugsweise E. coli und es ist Threonin durch einen hy drophoben Rest an Position 10 oder Asparaginsäure durch Serin an Position 56 der Phosphatbindungsregion des nativen E. coli-PstS substituiert. Vorzugsweise ist die Aminosäurevariation im Nucleinsäuremolekül eine Substitution und das Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül.
Alternativ dazu stellt die Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle der Expressionsrate eines Polypeptids in Bakterienzellen bereit, welches das Kultivieren von Bakterienzellen umfasst, denen ihr natives pstS-Gen fehlt und umfasst ein Nucleinsäuremolekül, das für eine PstS-Variante kodiert, die eine Aminosäurevariation innerhalb der Phosphatbindungsregion des entsprechenden nativen PstS aufweist, wobei das Nucleinsäuremolekül unter Transkriptionskontrolle des pstS-Genpromotors der Wildform steht und wobei die Bakterienzellen ferner ein Nucleinsäuremolekül umfassen, das für das Polypeptid von Interesse unter Transkriptionskontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors kodiert, worin das Kultivieren unter Bedingungen stattfindet, wodurch die Konzentration von anorganischem Phosphat im Kulturmedium während der Produktionsphase des Zellwachstums kontrolliert wird, so dass das Polypeptid unter Transkriptionskontrolle des partiell induzierten Alkalische-Phosphatase-Promotors produziert wird.
Die PstS-Varianten hierin ermöglichen die Herstellung von bakteriellen Wirtszellen, die eine erhöhte Ausbeute von intaktem Polypeptid hervorbringen. Ferner ermöglicht die Induktion bei höherer Phosphatkonzentration die Verwendung eines reicheren Mediums, was eine höhere Zelldichte ermöglicht. Das Verfahren stellt ferner ein Verfahren der Expressionskontrolle der für das Polypeptid kodierenden Nucleinsäure durch Kontrolle der Phosphatkonzentration im Polypeptidproduktionsstadium des Zellwachstums bereit.
Darüber hinaus ermöglicht das mutierte PstS-Proteinsystem eine bessere Regulation der Induktionsstärke des Alkalische-Phosphatase-Promotors, so dass Zelltoxizität verhindert wird, indem langsame Phosphatzufuhr und/oder On-line-Messung und Kontrolle der Phosphatkonzentration im Überstand eingesetzt werden.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 stellt die Nucleotidsequenz und translatierte Aminosäuresequenz des pstS-Strukturgens von E. coli dar (Seq.-ID Nr. 1 bzw. Seq.-ID Nr. 2).
2 stellt das beim Erzeugen der pstS-Mutanten verwendete Plasmid dar.
3A stellt dar, dass die Überexpression von PstS die PhoA-Induktion herabsetzt. Die offenen Kreise stellen den Wildform-W3110-E. coli-Stamm 1A2, die großen offenen Quadrate den pstS-W3110-Stamm 13G8 dar, die vollen Kreise stellen den pstS-Stamm 13G8 dar, der mit pSB20, einem Multicopy-Plasmid, welches das pstS-Gen der Wildform enthält, transformiert ist, die Rhomben stellen die T10A PstS-Mutante an pSB20, die vollen Quadrate die S38A PstS-Mutante an pSB20, die kleinen offenen Quadrate die D56A PstS-Mutante an pSB20, die vollen Dreiecke die R135A PstS-Mutante an pSB20, die offenen Dreiecke die D137A PstS-Mutante an pSB20, „x" die S139A PstS-Mutante an pSB20 und „+" die T141A PstS-Mutante an pSB20 dar. 3B stellt dieselben Daten wie 3A dar, erweitert jedoch den -10-35-Bereich des p-Nitrophenylphosphat- (PNPP-) Umsatzes, so dass die Induktion der Mutanten im Detail zu erkennen ist. Die Symbole in 3B sind dieselben wie jene in 3A.
4 stellt PhoA-Induktionsprofile von Multicopy-PstS-Mutanten dar, die durch Screening aus zufälligen Anordnungen der für Rest Thr10 kodierenden Codons erhalten wurden. In dieser Figur stellen die „+" die T10F PstS-Mutante, die vollen Rauten die T10G PstS-Mutante, die „x" die T10C PstS-Mutante, die offenen Rauten die T10L PstS-Mutante, die vollen Quadrate die T10Y PstS-Mutante, die kleinen offenen Quadrate die T10A PstS-Mutante, die vollen Dreiecke die T10M PstS-Mutante, die offenen Kreise den 1A2-Stamm der Wildform, die offenen Dreiecke den 13G8 PstS-Stamm und die großen offenen Quadrate den mit pSB20 transformierten pstS-Stamm dar.
5 stellt PhoA-Induktionsprofile weiterer Multicopy-PstS-Mutanten dar, die durch Screening statistischer Mutantenbibliotheken von Ser38, Asp56, Ser139 und Thr141 erhalten wurden. In dieser Figur stellen die „+" die S139T PstS-Mutante, die Rauten die S139L PstS-Mutante, die vollen Quadrate die T141H PstS-Mutante, die großen vollen Dreiecke die D56S PstS-Mutante, die „x" die D56A PstS-Mutante, die kleinen offenen Quadrate die D56V PstS-Mutante, die kleinen offenen Kreise die D56L PstS-Mutante, die kleinen vollen Dreiecke die S38F PstS-Mutante, die großen offenen Kreise den 1A2-Stamm der Wildform, die offenen Dreiecke den 13G8 pstS-Stamm und die großen offenen Quadrate den mit pSB20 transformierten pstS-Stamm dar.
6A vergleicht die Wirkungen verschiedener Mutationen an Resten Thr10, Asp56 und Thr141 PstS auf die PhoA-Induktion. Die offenen Kreise stellen den 1A2-Stamm der Wildform, die offenen Dreiecke den pstS-Stamm 13G8, die offenen Quadrate den mit Plasmid pSB20 transformierten PstS-Stamm, die offenen Rauten die T10A PstS-Mutante, die „+" die T10M-Mutante, die vollen Quadrate die T10Y PstS-Mutante, die „x" die D56A PstS-Mutante, die vollen Kreise die D56S PstS-Mutante, die vollen Rauten die T141A PstS-Mutante und die vollen Dreiecke die T141H PstS-Mutante dar. 6B stellt dieselben Daten wie 6A dar, erweitert jedoch den -10-70-Bereich des PNPP-Umsatzes, so dass die Induktion der Mutanten im Detail zu erkennen ist. Die in 6B verwendeten Symbole sind dieselben wie jene, die in 6A verwendet werden.
7 stellt PhoA-Induktionsprofile von Einzelkopie-PstS-Chromosom-Mutantenstämmen dar, wobei die offenen kreise den 1A2-Wildform-W3110-E. coli-Stamm, die offenen Dreiecke die pstS-Mutante 13G8, die vollen Kreise die T10M PstS-Mutante, die offenen Quadrate die T10Y PstS-Mutante, die vollen Quadrate die D56S PstS-Mutante und die vollen Dreiecke die T141H PstS-Mutante darstellen.
8 stellt die Konstruktion des Plasmids pLS32 dar, einem Zwischenplasmid beim Herstellen von pLS32Tsc, das ein für IGF-I kodierendes Gen enthält und seinerseits ver wendet wird, um pBKIGF-2 herzustellen, dem für IGF-I kodierenden Expressionsvektor, der in den untenstehenden Beispielen verwendet wird.
9 stellt die Konstruktion von pAPIamB dar, einem weiteren Zwischenplasmid bei Herstellen von pLS32Tsc und beim Herstellen eines zusätzlichen Zwischenplasmids, pLamBIGF.
10 stellt die Konstruktion von pLS32IamB dar, noch einem weiteren Zwischenplasmid bei der Konstruktion von pLS32Tsc.
11 stellt die Konstruktion von pLS33IamB dar, einem weiteren Zwischenplasmid bei der Herstellung von pLS32Tsc.
12 stellt die Konstruktion von pLS33Tsc dar, einem weiteren Zwischenplasmid bei der Herstellung von pLS32Tsc und pBKIGF-2.
13 stellt die Konstruktion von pLSTsc aus pLS33Tsc und pLS32IamB dar.
14 stellt die Nucleotidsequenz des Expressionskassette und die Aminosäuresequenz dar, die von der IamB-Signalsequenz und dem IGF-I-Gen in Plasmid pLS32Tsc kodiert wird (Seq.-ID Nr. 27 bzw. Seq.-ID Nr. 28).
15 zeigt eine Restriktionskarte für Plasmid p200, das zum Produzieren von pLamBIGF verwendet wird, einem Zwischenplasmid bei der Produktion von pLBIGFTsc, das zum Herstellen von pBKIGF-2 verwendet wird.
16 stellt die Nucleotidsequenz des EcoRI-EcoRI-Fragments (von Positionen 1 149 bis 1633) von p200 dar, das die MF alpha I prepro- und IGF-I-Gensequenzen enthält (Seq.-ID Nr. 29).
17 stellt die Konstruktion von pLamBIGF aus drei Plasmidfragmenten und einem Stück synthetischer DNA dar (Seq.-ID Nr. 30 und Seq.-ID Nr. 31).
18 stellt die Konstruktion des Zwischenplasmids pLBIGFTsc aus pLamBIGF dar.
19 stellt die Konstruktion des Zwischenplasmids pRanTsc dar, das bei der Produktion von pBKIGF-2 verwendet wird.
20 stellt die Konstruktion von pBKIGF-2 aus pLS32Tsc, pLBIGFTsc, pLS33Tsc und pRanTsc dar.
21 zeigt die letztlich in Schüttelkolbenkulturen erhaltene Zelldichte für verschiedene mit pBKIGF-2 transformierte E. coli-Stämme als Funktion der anfänglichen Phosphatkonzentration im Medium. Die offenen Quadrate stellen Stamm 9E4 der Wildform (pstS+), die vollen Quadrate den Mutantenstamm 39B4(T10M), die offenen Dreiecke den Mutantenstamm 39B5(T10Y), die offene Kreise den Mutantenstamm 39B6(T141H) und die vollen Dreiecke den Mutantenstamm 39B7(D56S) dar.
22 stellt die Konzentration des mittels HPLC ermittelten, Zell-assoziierten IGF-I als Funktion der anfänglichen Phosphatkonzentration dar. Die Symbole sind wie in der Legende für 21 definiert.
23 stellt die Gesamt-IGF-I-Konzentration als Funktion der Hochzelldichte-Fermentations-Laufzeit für vier der pstS-Mutanten gegenüber dem Wirt der Wildform dar, wobei alle mit pBKIGF-2 transformiert waren. Die offenen Quadrate stellen den Stamm der Wildform 94E (pstS+), die vollen Rauten den Mutantenstamm 39B4(T10M), die offenen Kreise den Mutantenstamm 39B5(T10Y), die offenen Dreiecke den Mutantenstamm 39B6(T141H) und die vollen Quadrate den Mutantenstamm 39B7(D56S) dar. 24 zeigt die Wirkung erhöhter Phosphatzufuhrraten auf die IGF-I-Produktion durch Wirts organismen, die der Wildform- (volle Balken) und mutierte (diagonale Balken, 39B7-(D56S)) pstS-Proteine aufweisen.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
A. Definitionen
Im Allgemeinen sind die folgenden Begriffe und Phrasen wie angegeben definiert, wenn sie in der Beschreibung, in den Beispielen und Ansprüchen verwendet werden: Der Begriff „PstS" bezieht sich auf das Protein, das vom pstS-Gen kodiert wird, das sich in Bakterienzellen, insbesondere in Enterobacteriaceae-Zellen, einschließlich E. coli-Zellen findet. Dieses Protein ist als das Phosphatbindungsprotein der Bakterienzellen bekannt und enthält eine Phosphatbindungsregion.
Die „Phosphatbindungsregion" ist die Region des Proteins, die an anorganisches Phosphat bindet. Diese Region umfasst die Domäne, worin sich Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Molekülen bilden. In E. coli PstS ist diese Region:
Die Region umfasst ferner andere Reste, die die Phosphatbindung, die assoziierte Konformationsverschiebung von offenem zu geschlossenem Komplex, wenn das Phosphat gebunden wird, und/oder den assoziierten Signalweg indirekt beeinflussen. Folglich könnten Mutationen in PstS-Resten, die nicht direkt mit Phosphat in Kontakt stehen (oder durch Stop-Codons oder Rasterverschiebungen trunkierte Proteine), ähnliche Phänotypen wie Mutationen in PstS-Resten aufweisen, die direkt an das Phosphat binden.
„PstS-Varianten" sind als Moleküle definiert, in denen die Aminosäuresequenz des entsprechenden nativen (Wildform) PstS-Proteins in dessen Phosphatbindungsregion auf solche Weise modifiziert worden ist (entweder durch eine vorherbestimmte oder durch eine Zufallsmutation), dass das PstS-Protein bei Phosphatkonzentrationen höher als ungefähr 10 μmolar nicht länger als Repressor funktionstüchtig ist. Furlong, „Osmotic-Shock-Sensitive Transport Systems", in: F.C. Neidhardt et al. (Hrsg.), Escherichia coli and Salmonella thyphimurium: Cellular and Molecular Biology, Bd. 1, American Society for Microbiology, Washington, DC, S. 768-796 (1987), insbesondere S. 772-773. Folglich vermindert die Mutation die Affinität des Bindungsproteins für Phosphat. Aminosäuresequenzvarianten von PstS umfassen beispielsweise Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann ebenfalls durchgeführt werden, um zum letztlichen Konstrukt zu gelangen unter der Voraussetzung, dass das letztliche Konstrukt die gewünschte Eigenschaft besitzt, die Polypeptidinduktion durch die bakteriellen Wirtszellen bei Phosphatkonzentrationen im Medium zu ermöglichen, die über der Mangelkonzentration liegen.
Die Ausdruck „hydrophobe Reste" bezieht sich auf die Reste Norleucin, Cystein, Methinnin, Alanin, Valin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan und Isoleucin. „Polypeptid von Interesse" bezieht sich allgemein auf Peptide und Proteine mit mehr als ungefähr 10 Aminosäuren. Die Polypeptide können homolog zur bakteriellen Wirtszelle sein oder können, vorzugsweise, heterolog zur bakteriellen Wirtszelle sein, wie z.B. Hefe-Polypeptide oder bevorzugter Säugetier-Polypeptide. Beispiele bakterieller Polypeptide umfassen z.B. Alkalische Phosphatase und β-Lactamase. Beispiele von Säugetier-Polypeptiden umfassen Moleküle, wie z.B. Renin, ein Wachstumshormon, ein schließlich Human-Wachstumshormon, des-N-Methionyl-Human-Wachstumshormon und Rinder-Wachstumshormon; Wachstumshormon freisetzender Faktor; Parathyroidhormon; Thyroid-stimulierendes Hormon; Thyroxin; Lipoproteine; α1-Antitrypsin; Insulin A-Kette; Insulin B-Kette; Proinsulin; Follikel-stimulierendes Hormon; Calcitonin; leutinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren, wie z.B. Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von-Willebrand-Faktor; Antigerinnungsfaktoren, wie z.B. Protein C; atrialnaturietischer Faktor; Lungensurfaktant; ein Plasminogenaktivator, wie z.B. Urokinase oder Human-Urin- oder Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Thrombin; hämopoetischer Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor-Alpha und -Beta; Enkephalinase; ein Serumalbumin, wie z.B. Human-Serumalbumin; Mullerian-inhibierende Substanz; Relaxin A-Kette; Relaxin B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; ein mikrobielles Protein, wie z.B. Beta-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor; Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Thrombopoietin; Protein A oder D; Rheumatoidfaktoren; ein neurotropher Faktor, wie z.B. Knochen-hergeleiteter Neurotrophinfaktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder ein Nervenwachstumsfaktor, wie z.B. NGF-β; Blutplättchen-hergeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF); Fibroblastenwachstumsfaktor, wie z.B. aFGF und bFGF; epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); transformierender Wachstumsfaktor (TGF), wie z.B. TGF-Alpha und TGF-Beta, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; Insulin-artiger Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I und IGF-II); Insulin-artige Wachstumsfaktor bindende Proteine; CD-Proteine, wie z.B. CD-4, CD-4, CD-8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein Knochen-morphogenetisches Protein (BMP); Somatotropine; ein Interferon, wie z.B. Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma; Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z.B. IL1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zellen-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; Abbau-beschleunigender Faktor; Virusartigen, wie z.B. ein Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Adressine; regulatorische Proteine; Antikörper und Fragmente beliebiger oben aufgezählter Polypeptide. Die bevorzugten Polypeptide von Interesse sind jene, die in Bakterienzellen mit einem Minimum an Proteolyse und einem Maximum an richtig neugefal tetem oder aktivem Material exprimiert werden und müssen für ihre beabsichtigte Nutzung nicht glykosyliert sein. Beispiele solcher Säugetier-Polypeptide umfassen IGF-I, Wachstumshormon, DNase, Relaxin, Wachstumshormon freisetzender Faktor, Insulin, Urokinase, Immunotoxine und Antigene. Insbesondere bevorzugte Säugetier-Polypeptide umfassen IGF-I und Wachstumshormon.
„Produktionsphase des Zellwachstums" bezieht sich auf den Zeitraum während des Zellwachstums im Anschluss an die Induktion des Promotors, wenn das Polypeptid von Interesse produziert wird.
„Partiell induziert" bezieht sich, wie auf den Alkalische-Phosphatase-Promotor angewendet, auf einen Zustand, in dem nicht eine vollständige Induktion des Alkalische-Phosphatase-Promotors, sondern nur. eine partielle Induktion dessen erzielt wird. Auf diese Weise wird die Transkriptionsrate der erwünschterweise zu exprimierenden Nucleinsäure kontrolliert.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operativ gebundenen, kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig ist. Die Kontrollsequenzen, die für Bakterien geeignet sind, umfassen den Alkalische-Phosphatase-Promotor, wahlweise eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle.
Eine Nucleinsäure ist „operativ gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operativ an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operativ gebunden", dass die zu bindenden DNA-Sequenzen zusammenhängend und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Bindung wird durch Ligation an günstigen Restriktionsstellen erzielt. Wenn solche Stellen nicht existieren, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" austauschbar verwendet, und alle solche Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Folglich umfassen die Begriffe „Transformanten" und „transformierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und davon hergeleitete Kulturen ohne Rücksicht auf die Anzahl von Transfers. Es versteht sich weiters, dass aufgrund von beabsichtigten oder unbeabsichtigten Mutationen für gewöhnlich nicht die gesamte Nachkommenschaft im DNA-Gehalt genau identisch ist. Mutanten-Nachkommenschaft, die dieselbe Funktion oder biologische Aktivität aufweisen, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden ist, sind mit umfasst. Wo eindeutige Bezeichnungen beabsichtigt sind, geht das aus dem Kontext klar hervor.
Die Technik der „Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" bezieht sich wie hierin verwendet allgemein auf ein Verfahren, worin geringste Mengen eines speziellen Teils von Nucleinsäure, RNA und/oder DNA wie in US-Patent Nr. 4.683.195, erteilt am 28. Juli 1987, beschrieben amplifiziert werden. Im Allgemeinen muss Sequenzinformation aus den Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus bekannt sein, so dass Oligonucleotidprimer entworfen werden können; diese Primer werden eine identische oder ähnliche Sequenz zu entgegengesetzten Strängen des zu amplifizierenden Templats aufweisen. Die 5'-terminalen Nucleotide der beiden Primer können sich mit den Enden des amplifizierten Materials decken. PCR kann verwendet werden, um spezielle RNA-Sequenzen, spezielle DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA und aus Zell-Gesamt-RNA, Bakteriophagen und Plasmidsequenzen transkribierte cDNA usw. zu amplifizieren. Siehe allgemein Multis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987); Erlich (Hrsg.), PCR Technology, Stockton Press, NY (1989). Für einen neueren Überblick über PCR-Fortschritte siehe Erlich et al., Science 252, 1643-1650 (1991).
Wie hierin verwendet, wird PCR als ein, jedoch nicht als einziges Beispiel eines Nucleinsäurepolymerasereaktionsverfahrens zur Amplifikation einer Nucleinsäuretestprobe betrachtet, das die Verwendung einer bekannten Nucleinsäure als Primer und einer Nucleinsäurepolymerase zur Amplifikation oder Erzeugung eines speziellen Nucleinsäurestücks umfasst.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Phosphatmangelkonzentration" oder Konzentration, bei der Zellen an Phosphatmangel leiden" auf eine Konzentration von anorganischem Phosphat (z.B. Salze der Phosphorsäure, wie z.B. Natriumphosphat, Kaliumphosphat oder mit komplexen Stickstoffquellen, wie z.B. Caseinhydrolysaten oder Hefeextrakten assoziiertes Phosphat) im Kulturmedium, die so niedrig ist, dass die Zellen als frei von Phosphationen betrachtet werden, was einen reversiblen Anstieg der Proteinabbaurate, eine Hemmung de RNA-Synthese, eine Verminderung des Zellwachstums und eine ATP-Verminderung bewirkt. Dies wird ausführlicher in St. John und Goldberg, siehe oben, beschrieben. Die Mangelkonzentration ist von der Phosphatkonzentration zu unterscheiden, die zur Induktion/Repression des phoA-Promotors notwendig ist. Ein völliger Mangel ist nicht erforderlich, um diesen Promotor zu induzieren. Von pstS wird angenommen, dass er der Sensor von Phosphatkonzentrationen der Zelle ist und induziert daher indirekt die phoA-Expression. Die gewünschte anorganische Phosphatkonzentration zum Induzieren der Polypeptidproduktion wird von solchen Faktoren wie der Art des produzierten Polypeptids, der Art der Wirtszelle, der Art des Mediums und den eingesetzten Kulturbedingungen abhängen. Eine beispielhafte Konzentration zu diesem Zweck ist 0,1-10 μmolar.
B. Ausführungsformen der Erfindung
Zum Zwecke dieser Erfindung enthält eine PstS-Variante eine oder mehrere Aminosäuremutationen innerhalb ihrer Phosphatbindungsregion und stammt vorzugsweise aus E. coli. Solche Varianten können durch beliebige Mittel hergestellt werden, z.B. rekombinant, synthetisch oder teilweise synthetisch. Aminosäuresequenzvarianten von PstS werden zweckmäßigerweise durch Einführen geeigneter Nucleotidveränderungen in die pstS-DNA hergestellt. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der für E. coli PstS in 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Jegliche Kombination von Deletion, Insertion und Substitution wird durchgeführt, um zum letztlichen Konstrukt zu gelangen unter der Voraussetzung, dass das letztliche Konstrukt die gewünschten Eigenschaften besitzt. Ausgeschlossen vom Schutzumfang dieser Erfindung sind pstS-Varianten, die gegenüber dem Stand der Technik nicht neu oder nahe liegend sind.
Für den Entwurf von Aminosäuresequenzvarianten von PstS werden die optimalen Induktionseigenschaften vom Ort der Mutationsstelle innerhalb der Phosphatbindungsregion und der Natur der Mutation abhängen. Die Stellen zur Mutation können einzeln oder in Folge modifiziert werden, z.B. durch (1) Substituieren zunächst mit einer konservativen Aminosäureauswahl und dann mit einer drastischeren Auswahl in Abhängigkeit von den erzielten Ergebnissen, (2) Deletieren des Target-Rests oder (3) Insertieren von Resten derselben oder einer anderen Klasse in Nachbarschaft zur Ortsstelle, oder Kombinationen der Optionen 1-3.
Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, muss die Natur der Mutation an sich nicht vorherbestimmt sein. Um beispielsweise die Leitungsfähigkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, wird Zufallsmutagenese in geeigneter Weise am Target-Codon oder an der Target-Region durchgeführt und die exprimierten PstS-Varianten auf optimale Induktionseigenschaften gescreent.
Aminosäuresequenzdeletionen innerhalb der Phosphatbindungsdomäne von PstS liegen im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 5 Resten und sind typischerweise zusammenhängend. Zusammenhängende Deletionen werden für gewöhnlich mit gerader Resteanzahl durchgeführt, jedoch liegen einzelne oder ungeradzahlige Deletionen im Schutzumfang hiervon.
Aminosäuresequenzinsertionen sind Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrfacher Aminosäurereste innerhalb der Phosphatbindungsdomäne und liegen im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 1 bis 5 Resten, insbesondere sind 1-3 bevorzugt. Insertionen werden vorzugsweise mit gerader Resteanzahl durchgeführt, jedoch ist dies nicht erforderlich.
Eine dritte Gruppe von Varianten, die hierin bevorzugt ist, sind Aminosäuresubstitutionsvarianten. Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest innerhalb der Phosphatbindungsregion des nativen PstS-Moleküls entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle insertiert.
Wesentliche Modifizierungen der Phosphatbindungsfähigkeit des PstS-Proteins werden durch Auswahl von Substitutionen erzielt, die sich in ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des PstS-Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) des Hauptteils der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich auftretende Reste werden auf Basis der gemeinsamen Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, Cys, Met, Ala, Val, Leu, Tyr, Phe, Trp, Ile;
(2) neutral hydrophil: Ser, Thr;
(3) sauer: Asp, Glu;
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg; und
(5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro.

Vorzugsweise sind die Varianten hierin jene, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste an der entscheidenden Phosphatbindungsregion des nativen Gegenstück-Proteins mit einer oder mehreren anderen Aminosäuren ersetzt ist. Für E. coli-pstS-Varianten wird vorzugsweise der Serinrest an Position 139 durch Thr, Pro oder Leu substituiert, der Threoninrest an Position 141 durch den Rest His substituiert, der Threoninrest an Position 10 durch die Reste Phe, Leu, Met, Tyr, Ala, Cys oder Gly substituiert und/oder der Asparaginrest an Position 56 des nativen PstS durch die Reste Val, Ala, Leu oder Ser substituiert. Die hierin insbesondere bevorzugten E. coli-PstS-Varianten sind jene, worin der Threoninrest an Position 10 durch eine hydrophobe Aminosäure substituiert ist, insbesondere bevorzugt T10M PstS und T10Y PstS und die Varianten D56S PstS und T141H PstS unter Verwendung der unten bezeichneten Nomenklatur. Solche Aminosäureänderungen können auch kombiniert werden um ein Variantenmolekül mit mehr als einer veränderten Aminosäure bereitzustellen.
Nucleinsäuremoleküle, die für Aminosäuresequenzvarianten von PstS kodieren, werden mittels einer Vielzahl fachbekannter Verfahren hergestellt. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die Herstellung durch Oligonucleotid-vermittelte (oder ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning-Mutagenese, Zufallsmutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer vorher hergestellten Variante oder einer Nicht-Varianten-Version von PstS.
Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese stellt ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten des pstS-Gens dar, obgleich andere Verfahren wie gewünscht eingesetzt werden können. Diese Technik ist wie von Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982), beschrieben auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Kurz gesagt wird pstS-DNA durch Hybridisieren eines für die gewünschte Mutation kodierenden Oligonucleotids an ein DNA-Templat verändert, wo das Templat eine einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, das/der die unveränderte oder native DNA-Sequenz von pstS enthält. nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen gesamten zweiten komplementären Strang des Templats zu synthetisieren, der folglich den Oligonucleotidprimer inkorporieren und für die gewählte Veränderung in der pstS-DNA kodieren wird.
Im Allgemeinen werden Oligonucleotide von zumindest 25 Nucleotiden Länge verwendet. Ein optimales Oligonucleotid wird 12 bis 15 Nucleotide aufweisen, die an einer der beiden Seiten des/der für die Mutation kodierenden Nucleotids/e zum Templat vollkommen komplementär sind. Dies sorgt dafür, dass die Oligonucleotide in geeigneter Weise an das einzelsträngige DNA-Templatmolekül hybridisieren werden. Die Oligonucleotide werden unter Anwendung fachbekannter Verfahren, wie jenes von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978), beschriebene leicht synthetisiert.
Das DNA-Templat kann durch jene Vektoren erzeugt werden, die entweder von Bakteriophagen M13-Vektoren (im Handel erhältliche M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind geeignet) oder jenen Vektoren hergeleitet sind, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung wie von Viera et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987), beschrieben enthalten. Folglich kann die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren insertiert werden, um einzelsträngiges Templat zu erhalten. Die Produktion des einzelsträngigen Templats wird im Abschnitten 4.21-4.41 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989).
Alternativ dazu kann ein einzelsträngiges DNA-Templat durch Denaturieren doppelsträngiger Plasmid- (oder anderer) DNA unter Anwendung von Standardtechniken erzeugt werden.
Ein zweckdienliches Verfahren zur Identifizierung bestimmter Reste oder Regionen des PstS-Proteins, die bevorzugte Orte zur Mutagenese sind, wird „Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt und von Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), beschrieben. Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Target-Resten identifiziert (z.B. geladene Reste, wie z.B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere bevorzugt Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit dem umgebenden wässrigen Umgebung in oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Jene Domänen, die funktionelle Sensitivität auf Substitutionen zeigen, werden dann durch Einführen weiterer oder anderer Varianten an oder anstatt der Substitutionsstelle verbessert. Folglich muss, während die Stelle zum Einführen einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, die Natur der Mutation an sich nicht vorherbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, wird Alanin-Scanning oder Zufallsmutagenese am Target-Codon oder and er Target-Region durchgeführt und die exprimierten PstS-Varianten auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität hin gescreent.
Zur Veränderung der nativen DNA-Sequenz (um beispielsweise Aminosäuresequenzvarianten zu erzeugen) ist das bevorzugte Verfahren die Kombination von Oligonucleotid-gerichteter Mutagenese und Zufallsmutagenese wie beschrieben von Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367 (1987). In diesem Verfahren wird Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese eingesetzt, um bestimmte Codons des pstS-Gens der Wildform zu randomisieren, um für alle möglichen Reste zu kodieren. Ein Pool von Oligonucleotiden mit komplementärer Sequenz (ungefähr 10-15 Basen) die das Codon flankiert, wird verwendet. Das Codon der Wahl wird durch die Nucleotide NNS ersetzt, wobei N ein beliebiges Nucleotid und S gleich G oder C ist, um einen Pool von Oligonucleotiden zu liefern, die für alle möglichen Aminsäuren in 32 Codons kodieren.
In diesem bevorzugten Verfahren wird ein pBR322-hergeleitetes Plasmid mit einem einzelsträngigen Replikationsstartpunkt als ein einzelsträngiges Plasmid-Templat in einem E. coli-dut-ung-Stamm, wie z.B. CJ236 hergestellt (Kunkel et al., siehe oben). Diese beiden Mutationen um Stamm bewirken den Einbau von einem oder mehreren Uracil-Nucleotiden in die einzelsträngige DNA anstelle von Thymin. Die statistischen Oligonucleotide werden anneliert, mit E. coli-Phage T7-DNA-Polymerase aufgefüllt, ligiert und in einen E. coli-Stamm der Wildform, wie z.B. W3110 oder Stamm 13G8 (W3110 tonAΔ PhoS64) transformiert. Der letztere Stamm ist pstS-Minus und von CGSC6777 (C75-b) hergeleitet, der sich von C75 herleitet und wird von Amemura et al., J. Bacte riol. 152, 692-701 (1982). Der Stamm der Wildform korrigiert den Uracil-Fehleinbau unter Verwendung des synthetischen Mutantenstrangs als Templat, um ungefähr 90% Mutanten herzustellen.
DNA, die für PstS-Mutanten mit mehr als einer zu substituierenden Aminosäure kodiert, kann auf eine von mehreren Weisen erzeugt werden. Wenn die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander liegen, können sie gleichzeitig unter Verwendung von einem Oligonucleotid mutiert werden, dass für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Wenn jedoch die Aminosäuren sich in einigem Abstand voneinander befinden (getrennt durch mehr als ungefähr zehn Aminosäuren), ist es schwieriger, ein einziges Oligonucleotid zu erzeugen, dass für alle der gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren eingesetzt werden.
Im ersten Verfahren wird ein gesondertes Oligonucleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig zur einzelsträngigen Templat-DNA anneliert und der zweite DNA-Strang, der aus dem Templat synthetisiert wird, wird für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodieren. Das alternative Verfahren umfasst zwei oder mehrere Mutagenese-Umläufe, um die gewünschte Mutante herzustellen. Der erste Umlauf erfolgt wie für die Einzelmutanten beschrieben: DNA der Wildform wird für das Templat verwendet, ein für die erste(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierendes Oligonucleotid wird an dieses Templat anneliert und das Heteroduplex-DNA-Molekül wird dann erzeugt. Der zweite Mutagenese-Umlauf nützt die im ersten Mutagenese-Umlauf hergestellt mutierte DNA als Templat. Folglich enthält dieses Templat bereits eine oder mehrere Mutationen. Das für die zusätzliche(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierende Oligonucleotid wird dann an dieses Templat anneliert und der erhaltene DNA-Strang kodiert nun für Mutationen aus dem ersten sowie zweiten Mutagenese-Umlauf. Die resultierende DNA kann als Templat in einem dritten Mutagenese-Umlauf verwendet werden usw.
PCR-Mutagenese ist ebenfalls zum Herstellen von PstS-Aminosäurevarianten geeignet. Obwohl sich die folgende Diskussion auf DNA bezieht, versteht es sich, dass diese Technik auch mit RNA Anwendung findet. Die PCR-Technik bezieht sich allgemein auf das folgende Verfahren (siehe Erlich, siehe oben, das Kapitel von R. Higuchi, S. 61-70): Wenn kleine Mengen Templat-DNA als Startmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich in ihrer Sequenz von der entsprechenden Templat-DNA geringfügig unterscheiden, verwendet werden, um relativ große Mengen eines speziellen DNA-Fragments zu erzeugen, das sich von der Templat-Sequenz nur an den Positionen unterscheidet, wo sich die Primer vom Templat unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so entworfen, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muss mit einem Sequenzabschnitt des entgegengesetzten Strangs des Plasmids identisch sein, jedoch kann diese Sequenz irgendwo entlang der Plasmid-DNA lokalisiert sein. Es wird jedoch bevorzugt, dass die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden von der des ersten lokalisiert ist, so dass am Ende die gesamte amplifizierte, von den Plasmiden begrenzte DNA-Region leicht sequenziert werden kann. Die PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars wie dem gerade beschriebenen resultiert in einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der durch den Primer festgelegten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheiden, da das Templat-Kopieren etwas fehleranfällig ist.
Wenn das Verhältnis Templat zu Produkt extrem niedrig ist, inkorporiert die überwiegende Mehrheit der Produkt-DNA-Fragmente die gewünschte(n) Mutation(en). Das Produktmaterial wird verwendet, um die entsprechende Region im Plasmid unter Anwendung standardmäßiger DNA-Technologie zu ersetzen, die als PCR-Templat diente. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig entweder unter Verwendung eines zweiten mutierten Primers oder mittels Durchführung einer zweiten PCR mit anderen mutierten Primern und gleichzeitiges Ligieren der beiden resultierenden RCR-Fragmente an das Vektorfragment in einer drei- (oder mehr-) teiligen Ligation eingeführt werden.
In einem bestimmten Beispiel der PCR-Mutagenese wird Templat-Plasmid-DNA (1 μg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die eine einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region aufweist. Von diesem Material werden 100 ng einem PCR-Gemisch, das PCR-Puffer, der die vier Desoxynucleotidtriphosphate enthält und in den GeneAmp^®-Kits (erhältlich von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) enthalten ist, und 25 pmol jedes Oligonucleotidprimers enthält, auf ein Endvolumen von 50 μl zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Das Reaktionsgemisch wird für fünf Minuten bei 100°C denaturiert, kurz auf Eis gegeben und dann wird 1 μl Thermus aquaticus- (Taq-) DNA-Polymerase (5 Units/μl, bezogen von Perkin-Elmer Cetus) unter die Mineralölschicht zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen DNA-Thermocycler (bezogen von Perkin-Elmer Cetus) eingesetzt, der wie folgt programmiert wurde:
2 Minuten 55°C
30 Sekunden 72°C, dann 19 Zyklen des Folgenden:
30 Sekunden 94°C,
30 Sekunden 55°C und
30 Sekunden 72°C
Am Ende des Programms wird das Reaktionsfläschchen vom Thermocycler entfernt und die wässrige Phase in ein neues Fläschchen übertragen, mit Phenol/Chloroform (50:50 Volumenanteile) extrahiert und in Ethanol präzipitiert und die DNA mittels Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird anschließend den geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von Varianten, Kassettenmutagenese, basiert auf der von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), beschriebenen Technik. Das Startmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor), das die zu mutierende pstS-DNA umfasst. Es muss eine einzigartige Restriktionsendonucleasestelle an jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) vorhanden sein. Wenn keine solchen Restriktionsstellen existieren, können sie unter Anwendung des oben beschriebenen Oligonucleotid-gerichteten Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an geeigneten Orten in der pstS-DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen gespalten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, dass für die DNA-Sequenz zwischen den Restriktionsstellen kodiert, jedoch die gewünschte(n) Mutation(en) enthält, wird mittels Standardverfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden gesondert synthetisiert und dann mittels Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als die Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so entworfen, dass sie 3'- und 5'-Enden enthält, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt an das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte pstS-DNA-Sequenz.
Für die PstS-Variante kodierende Nucleinsäure kann auch chemisch synthetisiert und durch jede einer Anzahl von Techniken assembliert werden, bevor sie in einer Wirtszelle exprimiert wird. (siehe z.B. Caruthers, US-Patent Nr. 4.500.707; Balland et al., Biochimie 67, 725-736 (1985); Edge et al., Nature 292, 756-762 (1982)).
Zum Zwecke der Kurzbezeichnungen der hierin beschriebenen PstS-Varianten sei angemerkt, dass Zahlen sich auf den/die Aminosäure-Rest/Position entlang der Aminosäuresequenzen des reifen PstS-Proteins beziehen. Die Aminosäurebezeichnung verwendet das Einzelbuchstabenalphabet der Aminosäuren, d.h.
Die Bezeichnung für eine Substitutionsvariante hierin besteht aus einem Buchstaben gefolgt von einer Zahl gefolgt von einem Buchstaben. Der erste Buchstabe (ganz links) bezeichnet die Aminosäure im reifen PstS-Protein der Wildform. Die Zahl bezieht sich auf die Aminosäureposition, wo die Aminosäuresubstitution angebracht wird und der zweite (an der rechten Seite) Buchstabe bezeichnet die Position, die verwendet wird, um die Aminosäure der Wildform zu ersetzen. Die Bezeichnung für eine Insertionsvariante besteht aus dem Buchstaben i, gefolgt von einer Zahl, die die Position des Restes im reifen PstS-Protein der Wildform abgibt, vor der die Insertion beginnt, gefolgt von einem oder mehreren Großbuchstaben, die die durchzuführende Insertion (Grenzen eingeschlossen) bezeichnet. Die Bezeichnung für eine Deletionsvariante besteht aus dem Buchstaben d, gefolgt von der Zahl der Startposition der Deletion bis zur Zahl der Endposition der Deletion, wobei die Positionen auf dem reifen PstS-Protein der Wildform beruhen. Mehrfachmutationen sind in der Schreibweise durch einen Beistrich getrennt, um sie leichter lesen zu können.
Beispiele der Nomenklatur für E. coli-PstS-Protein sind die folgenden: eine Substitutionsvariante, wo das Threonin an Position 10 des PstS-Proteins der Wildform durch einen Methioninrest ist, wird T10M PstS bezeichnet. Eine Substitutionsvariante mit mehrfachen Substitutionen M und S an Positionen 10 und 56 des PstS-Proteins der Wildform wird T10M,D56S PstS bezeichnet. Eine Insertionsvariante, wo Cystein und Valin nach dem Threonin an Position 10 des PstS der Wildform insertiert ist, wird iT10CV PstS bezeichnet. Eine Deletionsvariante, wo die Aminosäure (Threonin) an Position 10 aus dem reifen PstS der Wildform deletiert ist, wird dT10 PstS bezeichnet. Wie in den obigen Beispielen angegeben, folgt nach jeder Mutante „PstS".
Von den meisten Deletionen und Insertionen und insbesondere Substitutionen wird nicht erwartet, dass sie drastische Veränderungen der Eigenschaften des PstS-Moleküls hervorrufen. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor ihrer Durchführung vorherzusagen, wird der Fachkundige erkennen, dass die Wirkung durch routinemäßige Screeningtests beurteilt werden kann.
Eine DNA-Variante kann typischerweise durch Zufalls- und/oder ortsgerichtete Mutagenese der nativen, für PstS kodierenden Nucleinsäure und Transfektion oder Integration des pstS-Variantengens in die Chromosomen eines bakteriellen Wirten oder durch Zufallsmutagenese eines das native pstS-Gen enthaltenden Wirten hergestellt werden. Die Nucleinsäurevariante kann dann in einem geeigneten Screeningtest auf die gewünschte Eigenschaft hin gescreent werden.
Beispielsweise werden in einer der Ausführungsformen die mutierten Gene auf Alkalische-Phosphatase-Aktivität bei hoher Phosphatkonzentration (ungefähr 3 mM Phosphat) gescreent, indem der Mutantenpool in einen pstS- W3110-Stamm, wie z.B. den oben beschriebenen Stamm 13G8 oder C75 (Amemura et al., siehe oben) transformiert und auf LB-BCIP-Platten ausgestrichen werden. Plasmide werden aus blauen Kolonien isoliert und das pstS-Gen dann sequenziert, um spezifische Mutationen zu ermitteln.
Alternativ dazu werden Einzeltranformanten in 96-Napf-Platten in doppelter Ausführung, die entweder hohe (2-5 mM) oder niedrige (0,3 mM) Phosphatkonzentrationen enthalten, über Nacht gezüchtet. Dann werden Aliquote auf PhoA-Aktivität durch PNPP-Hydrolyse getestet. Mutanten mit erhöhter Aktivität, insbesondere jene mit höherer Aktivität bei hoher Phosphatkonzentration, werden sequenziert und weiter auf Aktivität charakterisiert.
Aus irgendeinem der beiden Screenings gewählte Mutanten werden weiter charakterisiert, indem sie in 96-Napf-Platten, die eine Reihe von Phosphatkonzentrationen von 0,02 bis 50 mM enthalten, gezüchtet und Aliquote auf PhoA-Aktivität getestet werden.
Die aus diesem Screening gewählten Mutanten werden in den chromosomalen pstS-Locus integriert, um das Gen der Wildform zu ersetzen und um unter der Transkriptionskontrolle des PstS-Promotors der Wildform zu sein. Die integrierten Stämme werden durch Testen der PhoA-Spiegel charakterisiert. Jene Stämme, die diesen letzten Test bestehen, können dann in Schüttelkolbenkulturen mit variierenden Phosphatanfangskon zentrationen beurteilt werden, um wie jeweils anwendbar auf die Expression von entweder homologen oder heterologen Proteinprodukten zu testen. Zusätzlich oder alternativ dazu können die neuen Organismen in Hochzelldichtefermentationen beurteilt werden, wo verschiedene Phosphatzufuhrraten eingesetzt werden, nachdem die anfängliche Phosphatbeladung verbraucht ist. Als letzter Test und letzte Optimierung können diese Stämme dann in einem Fermenter verwendet werden, wo die Phosphatkonzentrationen aufgezeichnet und Online reguliert werden können. Wenn das Polypeptid von Interesse homolog zu den Bakterienzellen mit dem mutierten Gen, z.B. PhoA ist, dann werden die Zellen durch Testen der Mengen dieses Polypeptids charakterisiert werden. Wenn das Polypeptid von Interesse heterolog zu den Bakterienzellen ist, werden die Zellen mit der für dieses Polypeptid kodierenden Nucleinsäure transformiert und die Zellen auf Mengen dieses unter Transkriptionskontrolle des phoA-Promotors produzierten Polypeptids getestet.
In der letzteren Anwendung wird die Phosphatkonzentration des Mediums, in dem die veränderten bakteriellen Wirtszellen kultiviert werden, online (d.h. durch fortlaufendes Probenziehen) gemessen, wobei mit einem Überschuss an Phosphat (40 mM) im Medium begonnen wird. Dann wird die Phosphatkonzentration auf ungefähr 0,2 bis 5 mM Phosphat verarmt und die Induktionsrate des PhoA-Promotors durch Techniken gemessen, die dem Fachkundigen bekannt sind. Die bevorzugten PstS-Mutanten sind jene, worin die Polypeptidinduktion bei dieser Phosphatkonzentration die letztliche Polypeptidausbeute erhöht oder die relative Menge von intaktem Polypeptid oder die Zelldichte erhöht.
Wenn die für die PstS-Variante kodierende Nucleinsäure außerhalb der bakteriellen Wirtszelle produziert wird, die letztlich das Polypeptid von Interesse produziert, wird die Nucleinsäure in eine geeignete Bakterienzelle unter Anwendung irgendeines geeigneten Verfahrens eingeführt, einschließlich durch Transfektion und Transformation durch einen für die PstS-Variante kodierenden Vektor und vorzugsweise durch Integration in das Chromosom der Bakterienzellen durch ein beliebiges fachbekanntes Verfah ren. Ein Beispiel der Insertion des pstS-Gens in das Wirtsgenom umfasst jenes, das die E. coli-Spezies als Wirt verwendet. In diesem Fall ist im Vektor zur Transformation eine DNA-Sequenz umfasst, die komplementär zu einer Sequenz ist, die sich in genomischer E. coli-DNA findet. Die Transfektion von E. coli mit diesem Vektor resultiert in der homologen Rekombination mit dem Genom und der Insertion des pstS-Variantengens. Der Wirt für diesen Zweck ist entweder pstS-Minus oder einer, in dem das pstS-Gen der Wildform durch das pstS-Variantengen bei dessen Integration ersetzt wird.
Die das mutierte pstS-Gen enthaltenden Bakterienzellen können von Natur aus das Polypeptid von Interesse tragen. Beispielsweise ist Alkalische Phosphatase ein Protein, das zu E. coli homolog ist und kann ohne weitere Transfektion der Zelle mit Vektor-DNA induziert werden. Für heterologe Polypeptide, wie z.B. IGF-I und Wachstumshormon wird die heterologe Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) in geeigneter Weise in einen replizierbaren Vektor zur Expression in das Bakterienkulturmedium unter der Kontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors insertiert. Es sind viele Vektoren für diesen Zweck verfügbar und die Wahl des geeigneten Vektors wird von der Größe der in den Vektor zu insertierenden Nucleinsäure und der individuellen, mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle abhängen. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten in Abhängigkeit von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtszelle, mit der er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten für bakterielle Transformation umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf eine oder mehrere der folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene und einen Alkalische-Phosphatase-Promotor.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die aus mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies hergeleitet sind, in Verbindung mit bakteriellen Wirten verwendet. Der Vektor trägt für gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie Markersequenzen, die dazu fähig sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem aus einer E. coli-Spezies hergeleiteten Plasmid (siehe z.B. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein Phage muss ferner Promotoren enthalten, die vom Mikroorganismus zur Expression der selektierbaren Markergene verwendet werden können, oder muss so modifiziert werden, dass er diese enthält.
Die für das Polypeptid von Interesse hierin kodierende DNA kann nicht nur direkt exprimiert werden, sondern auch als Fusion mit einem anderen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid, die eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder sie kann Teil der Polypeptid-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die gewählte heterologe Signalsequenz sollte eine sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Für bakterielle Wirtszellen, die die native Polypeptidsignalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz mit einer bakteriellen Signalsequenz substituiert, die beispielsweise aus der aus Alkalische Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder hitzestabilen Enterotoxin II-Leadern bestehenden Gruppe gewählt ist.
Expressions- sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die den Vektor befähigt, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die den Vektor befähigt, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren und umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet.
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, der auch selektierbarer Marker genannt wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum von transformierten Wirtszellen notwendig ist, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden. Nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformierte Wirtszellen werden im Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin verleihen, (b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Nährmedien nicht verfügbar sind, z.B. für Bacilli das Gen, das für D-Alanin-Racemase kodiert. Eines der Beispiele eines Selektionsschemas nützt ein Medikament, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert worden sind, produzieren ein Protein, das Medikamentresistenz verleiht und überleben daher das Selektionsregime. Der Expressionsvektor zur Produktion eines heterologen Polypeptids enthält einen Alkalische-Phosphatase-Promotor, der vom bakteriellen Wirtsorganismus erkannt wird und operativ an die Nucleinsäure gebunden ist, die für das Polypeptid von Interesse kodiert. Dieser Promotor ist induzierbar, d.h. er initiiert erhöhte Transkriptionsspiegel aus DNA unter seiner Kontrolle als Reaktion auf eine verminderte Konzentration an anorganischem Phosphat im Kulturmedium. Der phoA-Promotor kann aus der bakteriellen Ausgangs-DNA durch Restriktionsenzymverdau entfernt und in den die gewünschte DNA enthaltenden Vektor insertiert werden.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form neu ligiert, um die benötigten Plasmide zu erzeugen.
Zur Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31.446) oder andere Stämme zu transformieren und erfolgreiche Transformanten werden, wo angemessen, durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder mit dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977), oder Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder mit dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Die bakteriellen Wirtszellen, die zum Exprimieren der für das Polypeptid von Interesse kodierenden Vektoren verwendet werden, sind jene, die in der Natur ein natives pstS-Gen enthalten. Für das Verfahren hierin fehlt dieses native Gen und wird durch das pstS-Variantengen ersetzt, das vorzugsweise homolog zum nativen pstS-Gen ist, das normalerweise in den Wirtzellen zugegen ist. Geeignete Bakterien zu diesem Zweck umfassen Eubakterien, insbesondere Enterobacteriaceae, wo sich das pstS-Gen so weit findet. Beispiele von Bakterien, die zu den Enterobacteriaceae gehören, umfassen Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia und Shigella. Einer der bevorzugten E. coli-Wirte ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obgleich andere Stämme, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) geeignet sind. Diese nicht Beispiele dienen der Erläuterung und sind nicht einschränkend. Mutantenzellen von irgendwelchen der oben erwähnten Bakterien können ebenfalls verwendet werden. Es ist selbstverständlich notwendig, geeignete Bakterien auszuwählen, wobei die Replizierbarkeit des Replikons in den Zellen eines Bakteriums berücksichtigt wird. Beispielsweise können E. coli, Serratia- oder Salmonella-Spezies in geeigneter Weise als Wirt verwendet werden, wenn wohlbekannt Plasmide, wie z.B. pBR322, pBR325, pACYA177 oder pKN410 verwendet werden, um das Replikon bereitzustellen.
E. coli-Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Elternwirt, da er ein gebräuchlicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme ausscheiden. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den für Proteasen kodierenden Genen zu bewirken, wobei Beispiele solcher Wirte E. coli W3110 Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist, dessen Herstellung unten beschrieben wird, und E. coli W3110 Stamm 27C7, der den vollständigen Genotyp tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kan' aufweist, umfassen. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 in der American Type Culture Collection als ATXX Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann der Stamm von E. coli, der die in US-Patent Nr. 4.946.783, erteilt am 7. August 1990, offenbarte mutierte periplasmatische Protease aufweist, eingesetzt werden.
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren dieser Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion des Alkalische-Phosphatase-Promotors modifiziert sind.
Transformation meint das Einführen von DNA in einen Organismus, so dass die DNA replizierbar ist, und zwar entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird Transformation unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung, wie sie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben wird, wird allgemein für Bakterienzellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Ein weiteres Transformationsverfahren setzt Polyethylenglykol/DMSO ein, wie in Chung und Miller, Nucleic Acids Res. 16, 3580 (1988), beschrieben wird.
Zur Produktion des Polypeptids von Interesse dieser Erfindung verwendete Bakterienzellen werden in geeigneten Medien gezüchtet, in denen der Alkalische-Phosphatase-Promotor partiell oder vollständig induziert werden kann, wie allgemein z.B. in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben wird. Das Kultivieren muss niemals in Abwesenheit von anorganischem Phosphat oder bei Phosphatmangelkonzentrationen stattfinden. Zunächst enthält das Medium anorganisches Phosphat in einer Menge über der Konzentration der Induktion der Proteinsynthese und ausreichend für das Wachstum des Bakteriums. Sowie die Zellen wachsen und Phosphat verwerten, vermindern sie die Phosphatkonzentration im Medium, wodurch die Induktion der Synthese des Polypeptids verursacht wird.
Jegliche andere notwendige Ergänzungen neben Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganischen Phosphatquellen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen für sich alleine oder als Gemisch mit einer anderen Ergänzung oder einem anderen Medium, wie z.B. einer komplexen Stickstoffquelle aufgenommen werden.
Wenn das Polypeptid Alkalische Phosphatase ist, wird die Zusammensetzung der Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphatquellen des Nährmediums vorzugsweise dermaßen sein, dass während der Phase intensiver Polypeptidakkumulierung der Glucosegehalt des Mediums ungefähr 0%, der Phosphatgehalt mehr als ungefähr 0,5 mM und weniger als ungefähr 5 mM, und zwar abhängig von der der eingesetzten PstS-Variante, und die Stickstoffkonzentration nicht mehr als ungefähr 30 μg/ml beträgt. Die Glucosezufuhr wird vorzugsweise während der Translationsphase durchgeführt. Das Fermentationsmedium wird vorzugsweise intensiv gemischt und die Fermentation vorzugsweise bei ungefähr 25-40°C, bevorzugter bei ungefähr 37°C durchgeführt.
Die Genexpression kann in einer Probe direkt gemessen werden, zum Beispiel durch herkömmliches Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren. Verschiedenste Marker können eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P. Jedoch können auch andere Techniken eingesetzt werden, wie z.B. das Verwenden von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle zur Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer breiten Vielfalt von Mackern, wie z.B. Radionukliden, Fluoreszierern, Enzymen oder dergleichen markiert werden können.
Das Polypeptid von Interesse wird vorzugsweise aus dem Periplasma oder Kulturmedium als sekretiertes Polypeptid gewonnen, obgleich es auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann, wenn es ohne ein Sekretionssignal direkt exprimiert wird.
Es wird häufig bevorzugt, das Polypeptid von Interesse aus rekombinanten Zellproteinen zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die bezüglich des Polypeptids von Interesse im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um Zelltrümmerteilchen zu entfernen. Die Membran- und lösliche Proteinfraktionen können dann erforderlichenfalls getrennt werden. Das Polypeptid kann dann aus der löslichen Proteinfraktion und aus der Membranfraktion des Kulturlysats gereinigt werden, und zwar in Abhängigkeit davon, ob das Polypeptid membrangebunden, löslich oder in aggregierter Form vorhanden ist. Das Polypeptid wird daraufhin solubilisiert und erforderlichenfalls gefaltet und von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren für geeignete Reinigungsverfahren beispielgebend sind: Fraktionierung an Immunaffinitäts- oder Ionentauschersäulen; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silika oder einem Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammonsulfatpräzipitation; und Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75.
Die Erfindung hierin stellt auch ein Verfahren zur Kontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors bereit, so dass er nur partiell induziert wird, so dass man die Expressionsrate des Polypeptids regulieren kann. Dies war in der Vergangenheit nicht erzielbar, da die anorganische Phosphatkonzentration extrem niedrig zu sein hatte, um den Promotor zu induzieren, und es ist nicht praktikabel, solch niedrige Konzentrationen zu steuern. Mit Organismen, die pstS-Protein mit verminderter Affinität für Phosphat aufweisen, wird die Konzentration des anorganischen Phosphats in geeigneter Weise gesteuert, indem die Zufuhrrate von anorganischem Phosphat oder einer anorganisches Phosphat enthaltenden Quelle, wie z.B. einer komplexen Stickstoffquelle in das Medium gesteuert wird.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung und schränken die Erfindung nicht ein.
Beispiel 1
Herstellung und Charakterisierung von Mutantenstämmen
Herstellung von Mutantenstämmen
Die oben beschriebene, das GeneAmp-Set von Perkin-Elmer Cetus einsetzende Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um ein 1,3 Kb-DNA-Fragment zu erzeugen, das das pstS-Gen mit seinem eigenen Promotor enthält. Die publizierte Sequenz des pstS-Gens (Surin et al. (1984), siehe oben, und Magota et al., siehe oben; gezeigt in 1) wurde verwendet, um die folgenden Primer für die PCR zu entwerfen. Unterstrichene Nucleotide wurden der natürlichen pstS-Sequenz angefügt, um Restriktionsstellen (EcoRI bzw. Aval) zur Klonierung einzuführen:
Chromosomale DNA wurde aus E. coli-Stamm W3110 im Wesentlichen wie von Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1984), beschrieben hergestellt. Die PCR-Produkte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert, in Ethanol präzipitiert, mit EcoRI und Aval (New England Biolabs) geschnitten, dann aus einem 1 %-igen niedrigschmelzenden Agarosegel gemeinsam mit dem Gerüst eines auf ähnliche Weise geschnittenen Plasmids phGHr isoliert. Fuh et al., J. Biol. Chem. 265, 3111-3115 (1990). Die Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert, um das in 2 gezeigte Plasmid pSB20 zu erhalten. pSB20 ist ein Abkömmling von pBR322, das einen Replikationsstartpunkt aus dem Phagen f1 (Fuh et al., siehe oben) und ^–1320 bp des E. coli pstS-Gens, einschließlich seines Promotors und Terminators aufweist. pSB20 wurde wie oben on E. coli-Stamm 13G8 transformiert und auf LB-BCIP-Platten (Sigma) plus Carbenicillin (50 μg/ml) ausplattiert. Weiße Kolonien zeigten Komplementierung der chromosomalen pstS-Mutation durch das für PstS kodierenden Plasmid an. Die DNA-Sequenzierung (Sanger et al., siehe oben) des pstS-Gens am gewonnenen Plasmid stimmte mit der publizierten Sequenz überein.
Die wie in Zoller und Smith, siehe oben, beschriebene Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese wurde mit Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, siehe oben) und statistischer Oligonucleotidsynthese unter Anwendung der Technik von Kunkel et al., siehe oben, kombiniert, um die in diesem Beispiel eingesetzten Mutanten herzustellen. Diese Verfahren wurden mit den in Tabelle 1 gezeigten Oligonucleotiden verwendet, um die Codons der pstS-Sequenz der Wildform der geeigneten Reste (fett gedruckt) auf Alanin oder statistisch zu verändern, um alle möglichen Reste zu kodieren (N ist G, A, T oder C; S ist G oder C) und neue Restriktionsstellen (unterstrichen) einzuführen. Die Gegenwart aller Mutationen wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Ein Pool von Oligonucleotiden mit das Codon der Wahl flankierenden komplementären Sequenzen (10-15 Basen) wurde verwendet. Das Codon der Wahl wurde in der Synthese durch NNS ersetzt, um einen Pool von Oligonucleotiden herzustellen, der für alle möglichen Aminosäuren in 32 Codons kodiert.
Tabelle 1 Sequenzen der in der Mutagenese verwendeten Oligonucleotide
Das einzelsträngige Plasmidtemplat wurde in einem E. coli dut-ung-Stamm CJ236 wie von Kunkel et al., siehe oben, beschrieben hergestellt. Die Mutationen in diesem Stamm führten zur Inkorporation von einem oder mehreren Uracilnucleotiden in die einzelsträngige DNA anstelle von Thymin. Jedes der statistischen Oligonucleotide aus dem oben beschriebenen Pool wurde anneliert, mit E. coli-Phage-T7-DNA-Polymerase aufgefüllt, ligiert und in Stamm 13G8 transformiert. Der Stamm der Wildform korrigiert den Uracil-Fehleinbau unter Verwendung des synthetischen (mutierten) Strangs als Templat, um ungefähr 90% Mutanten zu liefern.
Die Zufallsmutanten wurde bei hoher Phosphatkonzentration (ungefähr 3 mM Pi) durch Transformieren des Mutantenpools in den pstS- W3110-Stamm 13G8 und Ausplattieren auf LB-BCIP-Carbenicillin-Platten auf PhoA-Aktivität gescreent. Plasmide wurden aus blauen Kolonien isoliert und das pstS-Gen sequenziert, um spezifische Mutationen zu bestimmen. Alternativ dazu wurden, wie unten beschrieben, einzelne Transformanten über Nacht in 96-Napf-Platten doppelter Ausführung, die entweder hohe (2-5 mM) oder niedrige (0,3 mM) Phosphatkonzentrationen enthielten, gezüchtet und dann Aliquote durch Hydrolyse vo PNPP (Sigma) auf PhoA-Aktivität getestet. Mutanten mit erhöhter Aktivität wurden sequenziert und weiter charakterisiert.
Die aus den ersten Screenings selektierten Mutanten-pstS-Gene, d.h. T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS und T141H PstS wurden durch Züchten der Zellen in 0,2 ml/Napf Minimalmedium (0,4% Glucose, 1,6 mM MgSO₄, 20 nM NH₄Cl, 50 mM KCl, 20 mM NaCl, 120 mM Triethanolamin-NCl (pH 7,4)) enthaltenden 96-Napf-Platten mit einer geeigneten Konzentration von zugesetztem KH₂PO₄ von 0 bis 50 mM weiter charakterisiert. Das Zellwachstum wurde durch Messen der Absorption bei 620 nm beobachtet. Die Zellen wurden nach Wachstum über Nacht bei 37°C unter Schütteln pelletiert, in 0,2 ml 0,15 M NaCl resuspendiert und dann Aliquote 1:10 in eine andere 96-Napf-Platte verdünnt, die 1 M Tris-NCl (pH 8,0), 1 mM PNPP und 1 % Natriumdodecylphosphat (SDS) enthielt. Alkalische-Phosphatase-Aktivität wurde als Nydrolyserate des chromogenen Substrats PNPP durch Anstieg der Absorption bei 405 nm bestimmt. Die PhoA-Aktivität wurde durch Ausdrücken der Änderung als OD₄₀₅/OD₆₂₀ auf Zellwachstum normalisiert.
Die mutierten, für T10M, T10Y, D56S und T141H kodierenden pstS-Gene wurden in das E. coli-Chromosom am pstS-Lotus integriert, um das pstS-Gen der Wildform zu ersetzen, indem ein poIA-Stamm im Wesentlichen wie in Gutterson und Koshland, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4894-4898 (1983), beschrieben verwendet wurde (siehe 1 davon).
Das Verfahren nutzt die Tatsache, dass CoIE1-hergeleitete Plasmide, wie z.B. pBR322 DNA-Polymerase I (das poIA-Genprodukt) erfordern, um sich extrachromosomal zu replizieren. Der poIA-Stamm A410 (Russel und Holmgren, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 990-994 (1988)) wurde transformiert (Chung und Miller, siehe oben), und zwar auf Carbenicillin-Resistenz mit dem das mutierte pstS-Gen von Interesse enthaltenden Plasmidklon. Homologe Rekombination zwischen den klonierten und chromosomalen pstS-Genen führt zur Integration des gesamten Plasmids in das chromosomale pstS-Gen. Rekombination kann entweder links oder rechts der Mutation stattfinden, was zwei mögliche chromosomale DNA-Strukturen mit integriertem Plasmid zur Folge hat. Die Plasmid-Integrate werden durch Selektion auf Carbenicillin-Resistenz erhalten.
Die Integration in das pstS-Gen wurde mittels P1-Cotransduktion (Silhavy et al., siehe oben) der Carbenicillin-Resistenz mit den Tetracyclin-Resistenzgenen der nahe dem pstS-Gen lokalisierten Tn10-Insertionen (zie-296::Tn10 und ilv-500::Tn10) bestätigt. Singer et al., Microbiol. Revs. 53, 1-24 (1989). P1-Tansduktion wurde dann verwendet, um das integrierte Plasmid in den Wildform-Stamm W3110 durch Selektion auf Carbenicillin zu transferieren. Die Plasmide können sich replizieren und von Chromosom ablösen, wobei das Wildform- oder mutierte pstS-Gen im Chromosom und das Gegenstück am frei replizierenden Plasmid verbleibt. Diese Transdukanten wurden auf 100 μg/ml Santonin enthaltender LB-Bouillon gezüchtet, um die Zellen von den abgelösten Plasmiden zu befreien (Bharathi und Polase, FEMS Microbiol. Letts. 68, 213-216 (1990)), und dann an LB-BCIP-Platten ausplattiert. Blaue Kolonien wurden isoliert, die das mutierte pstS-Gen im Chromosom enthielten und sind frei von Plasmid (Carbenicillin-empfindlich).
Screening von Mutantenstämmen
Expression der PhoA-Aktivität wurde verwendet, um die Wirkungen der pstS-Mutationen auf die Induktion der Phosphat-regulierten Gene zu ermitteln. Die 3-7 zeigen die Induktion der PhoA-Aktivität als Reaktion auf die Variation der Phosphatkonzentration im Medium. In pstS+ -Zellen der Wildform ist das phoA-Gen reprimiert bis die anfänglich Phosphatkonzentration unter 0,4 mM abfällt. Überproduktion von PstS in Zellen mit dem pstS-Gen an einem pBR322-hergeleiteten Plasmid verminderte die Stärke der PhoA-Induktion drastisch, jedoch wurde ein ähnliches Profil erhalten.
Alanin-Substitutionen an jeder der sechs Seitenketten, die mutmaßlich mit dem gebundenen Phosphat wechselwirken, hatten kaum eine Wirkung auf dieses Induktionsprofil. Substitution von Thr10, Ser38 oder Asp56 mit Alanin bewirkte eine gewisse PhoA-Expression bei höherer Pi-Konzentration als in der Wildform, jedoch keine vollständige Induktion (3).
3A zeigt, dass Überexpression von PstS durch den Wildform-Stämme W3110 und 13G8 verminderte die PhoA-Induktion 3B zeigt PhoA-spezifische Aktivität in verschiedenen pstS-Alanin-Mutantenstämmen mit der höchsten PNPP-Umsatzrate, wenn die Phosphatkonzentration in den Medien auf die beste zum Zwecke dieser Erfindung erhöht wird.
Die Kristallstruktur zeigt, dass die Seitenkette von Asp137 mit der Arg135-Seitenkette über Wasserstoffbrücken gebunden ist und scheint Arg135 in Richtung des gebundenen PO₄ zu richten. Um die Bedeutung dieser Wechselwirkung bei der PO₄-Bindung zu testen wurde Asp137 auch mit Alanin substituiert. Überraschenderweise schien die Entfernung einer der beiden Seitenketten eine geringe Wirkung auf die PO₄-Bindung in diesem System zu haben.
Da Alanin-Substitutionen eine geringe Wirkung auf die PhoA-Induktion bei variierenden Phosphatkonzentrationen hatte, wurde gefolgert, dass die Substitution dieser Reste mit größeren Seitenketten größeren Wirkungen durch sterische Hinderung der Phosphatbindung haben würde.
Die für die Reste Thr10, Ser38, Asp56, Ser139 und Thr141 kodierenden Codons wurden ein Mal randomisiert, um Pools für alle Reste zu kodieren. Diese Pools wurden nach Wachstum in niedrig- und hochkonzentrierten Phosphatmedien auf erhöhte phoA-Aktivität hin gescreent. Tabelle II zeigt die spezifischen Fehlsinn-Mutationen in den pstS-Genen aus blauen Kolonien und wie viele Male sie isoliert wurden.
Tabelle II Aminosäuresubstitutionen sequenzierter pstS-Fehlsinn-Mutationen
4 zeigt PhoA-Induktionsprofile von am Rest Thr10 randomisierten und aus dem Screening isolierten Vielfachkopie-PstS-Mutanten. Von den Mutanten schienen T10Y und T10M die höchste PNPP-Umsatzrate aufzuweisen.
5 stellt PhoA-Induktionsprofile von weiteren Vielfachkopie-PstS-Mutanten dar, die durch Screening von Randomisierungen von Codons erhalten wurden, die für Ser38, Asp56, Ser139 und Thr141 kodieren. Von diesen Mutanten schienen D56S und T141H die höchste PNPP-Umsatzrate bei höheren Phosphatkonzentrationen aufzuweisen.
Wie 3A zeigt 6A, dass die Überexpression von PstS die PhoA-Induktion verminderte. 6B zeigt verschiedene randomisierte pstS-Mutanten, wobei T141H und D56S eine erhöhte PNPP-Umsatzrate bei höheren Phosphatkonzentrationen aufweisen.
7 zeigt PhoA-Induktionsprofile von Einzelkopie-pstS-Mutantenstämmen mit in das Chromosom integrierter Mutation. Diese Mutanten (T10M PstS, T10Y PstS, D56S PstS und T141H PstS) lieferten alle PhoA-Induktion bei höheren Phosphatkonzentrationen im Vergleich zum Wildform-Stamm W3110, sind jedoch bei noch höheren Phosphatkonzentrationen nach wie vor reguliert, was die Kontrolle des Systems ermöglicht.
Beispiel II Schüttelkolbenexperimente mit Mutantenstämmen Eingesetzte Stämme
Der anfängliche E. coli K-12-Wirtsstamm 9E4 (W3110tonA ptr3) wurde in mehreren Schritten unter Anwendung von Techniken konstruiert, die Transduktionen mit dem Phagen P1kc, der sich von P1 herleitet (Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)) und Transposongenetik (Klecker et al., J. Mol. Biol. 116, 125-159 (1977)) umfassen.
Der verwendete Anfangswirt war E. coli K12 W3110, der ein F-, λ- K12-Stamm ist (Bachmann, Bact. Rev. 36, 525-557 (1972); Bachmann, „Derivatives and Genotypes of Some Mutant Derivatives of Escherichia coli K-12", in: F.C. Niedhardt et al. (Hrsg.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Bd. 2, American Society for Microbiology, Washington, DC, S. 1 190-1219 (1987)).
Zuerst wurde das tonA-Gen (fhuA) (Kadar et al., J. Bact. 143, 256-264 (1980); Bachmann, Microbiol. Rev. 47, 180-230 (1983); Bachmann, „Linkage Map of Escherichia coli K-12", in: F.C. Niedhardt et al. (Hrsg.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 7. Aufl., American Society for Microbiology, Washington, DC, S. 807-876 (1987)) durch Insertion und anschließendes ungenaues Ausschneiden eines Tn10-Transposons in das tonA-Gen aus W3110 entfernt.
Im ersten Schritt dieses Verfahrens wurde E. coli W3110 mit λ::Tn10 transduziert, um einen Tn10-hop-Pool von E. coli W3119 zu erzeugen (Kleckner et al. siehe oben).
Der E. coli W3110::Tn10-hop-Pool wurde in L-Bouillon bei 37°C auf eine Zelldichte von ungefähr 1 × 10⁹/ml gezüchtet. Insgesamt 0,5 ml der Kultur wurden zentrifugiert und das Pellet in 0,2 ml eines 7,0 × 10⁹ pfu enthaltenden λphi80-Lysats resuspendiert. Der Phage wurde für 30 Minuten bei 37°C adsorbieren gelassen. Die Suspension wurde dann auf EMB-Platten verteilt, die mit Tetracyclin (15 μg/ml) ergänzt waren. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Kolonien in 3 ml L-Bouillon vereinigt, über Nacht bei 37°C gezüchtet, zweimal gewaschen und in L-Bouillon resuspendiert. Ein Bakteriophagen-P1kc-Lysat wurde an dieser Kultur durchgeführt (J.N. Miller, Experiments in Molecular Biology, siehe oben, Seite 304).
E. coli AT982 (Nr. 4546, E. coli Genetic Stock Center, New Naven, Conn.) wurde mittels dieses P1kc-Lysats auf Tetracyclin-Resistenz transduziert. Transduktanten wurden an L-Bouillon-Platten selektiert, die mit Tetracyclin (15 μg/ml) und 40 μg/ml Diaminopimelinsäure (dap) ergänzt waren. Die resultierenden Transduktanten wurde auf Tetracyclin-Resistenz und Regeneration des dap-Gens (dap⁺, tet^R) gescreent. Transduktanten mit dem dap⁺, tet^R-Genotyp wurden dann auf λphi80-Resistenz getestet.
P1kc-Lysate wurden dann an mehreren dap⁺, tet^R, λphi80-resistenten Stämmen hergestellt. Die Lysate wurden verwendet, um E. coli W3110 auf Tetracyclin-Resistenz zu transduzieren.
Tetracyclin-empfindliche Isolate wurden aus den W3110 tonA::Tn10-λphi80R-Transduktanten selektiert. (Maloy und Nunn, J. Bacteriol. 145, 1110 (1981)). Diese Isolate wurden auf λphi80-Resistenz und Tetracyclin-Empfindlichkeit nach Einzelkoloniereinigung überprüft.
DNA wurde aus mehreren Tetracyclin-empfindlichen λphi80-resistenten Mutanten isoliert und mit SstII verdaut. Die SstII-verdaute DNA wurde mittels Southern-Blotverfahren charakterisiert, wobei radioaktiv markierte und SstII-verdaute λ::Tn10-DNA als Sonde verwendet wurde, um zu ermitteln, ob das Tn10 ausgeschnitten worden ist (Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980)). Von einem der Tetracyclin-empfindlichen Isolate konnte gezeigt werden, dass er zwei der Tn10-Hybridisierungsbanden im Vergleich zur Hybridisierung zwischen DNA aus λ::Tn10 und den elterlichen W3110 tonA::Tn10λphi80R verloren hatte. Eine dritte Hybridisierungsbande hatte eine veränderte Mobilität, was darauf hinweist, dass eine durch das ungenaue Ausschneiden von Tn10 verursachte Deletion aufgetreten ist.
SDS-Gelelektrophorese von Präparaten der äußeren Membran aus dem Stamm mit einer ungenauen Tn10-Enfernung offenbarte, dass die Bande von der angenommen wurde, das von tonA kodierte Protein zu sein, eine veränderte elektrophoretische Mobilität im Vergleich zum Protein der Wildform aufwies, das vom tonA-Gen kodiert wird. Das resultierende Protein war als λphi80-Phagenrezeptorprotein nicht funktionstüchtig. Ein zweiter unabhängiger Stamm, der ebenfalls der ungenauen Entfernung von Tn10 unterzogen worden ist, zeigte am SDS-Gel kein von tonA kodiertes Protein.
Keiner dieser Stämme zeigte eine Reversion zu Tetracyclin-Resistenz oder zu λphi80-Empfindlichkeit, was darauf hinweist, dass ein ungenaues Ausschneiden des gesamten oder eines Teils des Tn10-Transposons gemeinsam mit einer teilweisen oder vollständigen Deletion des tonA-Gens aufgetreten ist. Folglich wurde das vom tonA-Gen kodierte Protein (MG 78.000) aus der äußeren Membran eliminiert, was den W3110 tonA-Stamm gegen mehrere Bakteriophagen resistent machte. Der resultierende Stamm, 1A2 genannt, ist gegen die Bakteriophagen T1 und Φ80 resistent.
Das ptr3-Gen (Cheng et al., J. Bacteriol. 140, 125-130 (1979)) wurde in Stamm 1A2 wie folgt eingeführt. Zuerst wurde die thyA8-Mutation in 1A2 durch Selektieren auf Trimethoprim-Resistenz isoliert, um Stamm 9E1 zu bilden. Dann wurde der argA81::tn10-Lo cus aus 9D9 (erhalten von B. Bachman, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.) durch Transduktion mit dem Phagen P1kc in 9E1 transportiert, um 9E3 zu bilden. Der ptr3-Lotus liegt zwischen thyA8 und argA81. Transduktion mit an einer ptr3-Mutante (9D7, J. Bact. 140, 125 (1979)) gezüchtetem Phagen P1 resultierte in der Einführung der ptr3-Mutation gleichzeitig mit der Umwandlung von thyA8 und arg-A81::Tn10 in Loci der Wildform. Dem 9E4 genannten Stamm fehlt die periplasmatische Protease III. Die Schlussfolgerung, dass die ptr3-Mutation in 9E4 umfasst ist, wird durch stark verbesserte IGF-I-Akkumulierung im resultierenden Stamm unterstützt.
Von 9E4 hergeleitete Stämme mit bekannten Mutationen im pstS-Gen wurden wie in Beispiel I beschrieben hergestellt und werden wie unten bezeichnet mit Katalognummern versehen:
Expressionsvektorkonstruktion
Die obigen Stämme wurden mit dem IGF-I-Expressionsplasmid pBKIGF-2 unter Anwendung standardmäßiger Transformationstechniken transformiert. Die zur Expression des IGF-I-Gens in E. coli erforderlichen Transkriptions- und Translationssequenzen werden von Alkalische-Phosphatase-Promotor und der trp-Shine-Delgarno-Sequenz bereitgestellt. Der Lambda-t_D-Transkriptionsterminator befindet sich neben dem IGF-I-Terminationscodon. Die Sekretion des Proteins aus dem Zytoplasma wird von der IamB-Signalsequenz oder alternativ dazu von der STII-Signalsequenz gesteuert. Die Mehrheit des rhIGF-I findet sich im peripiasmatischen Zellraum. Plasmid pBKIGF-2 verleiht dem transformierten Wirt Tetracyclin-Resistenz.
Plasmid pBKIGF-2 wurde in mehreren Schritten konstruiert, wobei pLS32Tsc, pLBIGFTsc, pLS33Tsc und pRanTsc als Zwischenplasmide verwendet wurden.
Schritt A: pLS32Tsc
Schritt 1: pLS32
Das Plasmid pLS32 resultiert in der Fusion der für IGF-I kodierenden Sequenz an die kodierende Sequenz der hitzestabilen Enterotoxin II (STII-) Signalsequenz. Es wurde durch Ligieren von vier DNA-Fragmenten wie in 8 gezeigt hergestellt. Das erste davon war der Vektor pTF2A12 (Paborsky et al., Biochemistry 28, 8072-8077 (1989)), aus dem des kleine, das Gewebefaktor-Gen enthaltende NsiI-BamHI-Fragment entfernt worden ist. Die STII-Signalsequenz wird von Picken et al., Infect. Immun. 42, 269-275 (1983), beschrieben.
Das zweite Fragment war eine synthetische Doppelhelix von 55 bp, die für die ersten 18 Aminosäuren von reifem IGF-I kodiert. Diese Doppelhelix hat die folgende Sequenz:
(Seq.-ID Nr. 17 bzw. 18)
Das dritte Stück der Ligation war ein 154 bp-BstEII-HindIII-Fragment aus pK1ZZIGF-I, das für die verbleibenden Aminosäuren 19-70 des IGF-I kodiert. pK1ZZIGF-I ist ein Kanamycin-resistentes Plasmid, das einen ab einen Protein A-Promotor angehefteten Iac-Promotor enthält, der seinerseits an ein Protein A-Signal gebunden ist, fusioniert an zwei Konsensus-Z-Regionen aus Protein A, die IgGs binden und Proteine sekretieren, abgeheftet unter Verwendung von zwei Codons, die für eine Asn-Gly-Schnittstelle an ein synthetisches IGF-I-Gen kodieren. Es enthält ferner eine F-Region, um eine hohe Kopiezahl zu liefern. Dieses Plasmid ist ähnlich dem pZZ-IGF-I, das in 6 gezeigt und in der EP-Publikation Nr. 230.869, publiziert am 5. Augus 1987, beschrieben ist, wo das Ampicillin-Gen durch ein Kanamycin-Gen ersetzt ist.
Das letzte Fragment war ein 291 bp-HindIII-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pLS8. Dieses letzte Fragment ist schlicht die kodierende Sequenz für den Start des Tetracyclin-Gens von pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 43, 77-90 (1978)), in dem eine HindIII-Restriktionsstelle unmittelbar stromauf des Methionin-Startcodons eingebaut wurde.
Das resultierende Plasmid pLS32 exprimiert und sekretiert effizient rhIGF-I in die Medien. Die folgenden beiden Konstruktionsschritte wurden durchgeführt, um die STII-Signalsequenz durch die IamB-Signalsequenz zu ersetzen, was die Ausbeute verbessert.
Schritt 2: pAPIIamB
Das Plasmid pAPIIamB wurde wie in 9 gezeigt durch Ligieren zweier DNA-Fragmente konstruiert und resultiert im Einsetzen der für das IamB-Signal kodierenden Sequenz stromab des AP-Promotors und der trp-Shine-Delgarno-Sequenz. In der Ligation umfasst war der Vektor pRA1, in dem das kleine XbaI-BgIII-Fragment entfernt worden ist. Dieses Plasmid ist ein Derivat von phGH1 (Chang et al., Gene 55, 189-196 (1987)), wobei das letztere Plasmid den AP-Promotor, das STII-Signal und für hGH kodierende DNA enthält. pRA1 unterscheidet sich von phGH1 dahingehend, dass es für die Relaxin A-Kette und nicht hGH kodierende DNA (deren Sequenz in US-Patent Nr. 4.758.516 beschrieben ist) und es enthält eine zweckdienliche BgIII-Restriktionsstelle stromab des Promotors und der Ribosombindungsstelle. Das zweite Stück in der Ligation war eine synthetische DNA-Doppelhelix von 80 bp mit der folgenden Sequenz, die für die IamB- Signalsequenz kodiert und wird von Clement und Hofnung, Cell 27, 507-514 (1981), beschrieben:
(Seq.-ID Nr. 19 bzw. 20)
Schritt 3: pLS32IamB
Das Plasmid pLS32IamB resultiert in der Fusion der IamB-Signalsequenz an die für IGF-I kodierende Region und wurde wie in 10 durch Ligation von drei DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS32, in dem das kleine XbaI-BstEII-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein 75 bp-XbaI-EaeI-Fragment aus pAPIamB, das für die IamB-Signalsequenz kodiert. Das dritte war eine synthetische DNA-Doppelhelix von 55 bp, die für die ersten 18 Aminosäuren des reifen IGF-I kodiert und weist die folgende Sequenz auf:
(Seq.-ID Nr. 21 bzw. 22)
Die folgenden Schritte führen den Transkriptionsterminator in das Plasmid ein. Diese Plasmidveränderungen lieferten eine verbesserte Produktausbeute.
Schritt 4: pLS33IamB Das Plasmid pLS33IamB ist ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von pLS32Tsc und wurde wie in 11 durch Ligieren dreier DNA-Fragmente konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS32, in dem das kleine XbaI-BstEII-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein 75 bp-XbaI-EaeI-Fragment aus pAPIamB, das für die IamB-Signalsequenz kodiert. Das dritte war eine synthetische DNA-Doppelhelix von 46 bp mit der folgenden Sequenz:
(Seq.-ID Nr. 23 bzw. 24)
Die obige Sequenz kodiert für Aminosäuren 4-18 des reifen IGF-I.
Schritt 5: pLS33Tsc
Das Plasmid pLSTsc resultiert in der Einfügung des Lambda-t_D-Transkriptionsterminators unmittelbar stromab der für IGF-I kodierenden Sequenz. Drei DNA-Fragmente wurden wie in 12 gezeigt ligiert, um dieses Plasmid zu konstruieren. Das erste Stück war der Vektor pLS18, in dem das kleine XbaI-BamHI-Fragment entfernt worden ist. pLS18 ist ein Derivat von phGH1 (Chang et al., siehe oben), das für Human-DNase und nicht für hGH kodierende DNA enthält (wie offenbart in WO 90/07572, publiziert am 12. Juli 1990). phGH1 könnte verwendet werden, um dasselbe Fragment zu erzeugen. Das Fragment enthält die Sequenz von der BamHI-Stelle zum 3'-Ende des Tetracyclin-Gens, wodurch ungefähr 300 bp am 5'-Ende des Gens fehlen.
Der zweite Teil der Ligation war eine 288 bp-XbaI-HindIII-Fragment aus pLS33IamB, in dem die HindIII-Restriktionsstelle durch Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow) geglättet worden ist.
Der dritte Teil der Ligation war ein 412 bp-StuI-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pdH108-4. Dieses Fragment enthält den Lambda-t_D-Transkriptionstermiantor (Scholtissek und Grosse, Nuc. Acids Res. 15, 3185 (1987)) und Basenpaare 2-375 von pBR322 (Sutcliffe, siehe oben), worin die Basenpaare 2-375 sich stromab oder 3' der Transkriptionsterminators befinden. Die Sequenz der Terminatorregion dieses Fragments lautet wie folgt:
(Seq.-ID Nr. 25 bzw. 26)
Schritt 6: pLS2Tsc
Das endgültige Plasmid pLS32Tsc wurde wie in 13 durch Ligieren zweier DNA-Fragmente konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS33Tsc, aus dem das kleine EcoRI-BstEII-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein 550 bp-EcoRI-BstEII-Fragment aus pLS32IamB, das den AP-Promotor, die trp-Shine-Delgarno-Sequenz und die kodierende Sequenz für die IamB-Signalsequenz, fusioniert an die ersten 18 Aminosäuren von IGF-I enthält. Das resultierende Plasmid wurde durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert. Der gesamte Promotor und die kodierende Sequenz von pLS32Tsc wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert, wobei die Sequenz in 14 angegeben ist (Seq.-ID Nr. 27). Ebenfalls in 14 bereitgestellt ist die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 28), die von der IamB-Signalsequenz und IGF-I-DNA in pLS32Tsc kodiert wird.
Schritt B: pLBIGFTsc
Schritt 1: pLamBIGF
Für den ersten Teil der Ligation wurde das EcoRI-PstI-Vektorfragment aus pBR322 isoliert. Für den zweiten Teil der Ligation wurde ein PstI-NcoI-Fragment von 1244 bp aus pAPLamB isoliert. Für den dritten Teil der Ligation wurde das 196 bp-HaeII-EcoRI-Fragment, welches das IGF-I-Gen mit Ausnahme des Anfangs des 5'-Endes enthält, aus Plasmid p200 isoliert. p200 ist ein von pBR322 hergeleitetes Plasmid, das in der Reihenfolge 5' nach 3' den Chelatin-Promotor, die MF Alpha 1-Prepro-Signalsequenz, für reifes IGF-I kodierende DNA und den 2-Micron-Terminator aufweist. Es enthält den ColE1-Replikationsstartpunkt für Bakterien und den 2-Micron-Startpunkt für Hefe. Ein Restriktionsenzymplasmiddiagramm von p200 wird in 15 bereitgestellt. Die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 29) des Fragments von EcoRI (beginnend an Position 1149) nach EcoRI (beginnend an Position 1628) von p200, welches das MF Alpha I-Prepro- und IGF-I-Gen enthält, wird in 16 bereitgestellt. Die HaeII-, PstI-, BamHI- und SaII-Restriktionsstellen, die ebenfalls in 15 dargestellt sind, sind in der Sequenz durch Unterstreichung gekennzeichnet. Ein Stück synthetischer DNA, das die Signalsequenz mit dem IGF-I-Gen verbindet (NcoI nach HaeII) wurde mit der folgenden Sequenz hergestellt:
Die drei Plasmidfragmente und die synthetische DNA wurden miteinander ligiert, um pLamBIGF zu bilden, wie in 17 gezeigt ist.
Schritt 2: pLBIGFTsc
Das XbaI-BamHI-Vektorfragment wurde aus pLS18 als das erste Ligationsfragment isoliert. Der zweite Teil der Ligation war ein 412 bp-StuI-BamHI-Fragment aus dem oben beschriebenen Plasmid pdH108-4. Der dritte Teil der Ligation wurde durch einen EcoRI-Verdau von pLamBIGF, gefolgt von Behandlung mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment, gefolgt von XbaI-Verdau hergestellt. Das resultierende 302 bp-Fragment wurde isoliert. Diese drei Fragmente wurden ligiert, um pLBIGFTsc zu liefern, wie in 18 gezeigt ist.
Schritt C: pRanTsc
Das XbaI-BamHI-Fragment aus pLS18 wurde als das erste Ligationsfragment isoliert. Der zweite Teil der Ligation war ein 412 bp-StuI-BamHI-Fragment aus dem oben beschriebenen Plasmid pdH108-4. Der dritte Teil der Ligation wurde aus pRANTES hergestellt. pRANTES ist ein Plasmid auf Basis von pBR322 und enthält ein Fragment eines XbaI-Linkers, gefolgt von einem STII-Signal, gefolgt von der für RANTES kodierenden cDNA (wie publiziert von Schall et al., J. Immunol. 141, 1018 (1988)), gefolgt vom BamHI-Linker. Das dritte Fragment wurde durch Verdau von pRANTES mit BamHI, gefolgt von Behandlung mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment, gefolgt von XbaI-Verdau hergestellt. Das resultierende 303 bp-Fragment wurde isoliert. Diese drei Fragmente wurden ligiert, um pRanTsc zu bilden, wie in 19 gezeigt ist.
Schritt D: pBKIGF-2
Wie in 20 gezeigt wurde das EcoRI-PstI-Fragment von 540 bp, das den Alkalische-Phosphatase-Promotor, die IamB-Signalsequenz und für die ersten 15 Aminosäuren von IGF-I kodierende DNA enthält, aus pLS32Tsc herausgeschnitten. Das Pst-Bsp12861-Fragment (^–70 bp), das die für Aminosäuren 16-38 von IGF-I kodierende DNA enthält, aus pLBIGFTsc herausgeschnitten. Das Bsp12861-HindIII-Fragment (^–179 bp), das die für Aminosäuren 39-70 von IGF-I kodierende DNA, den Lamba-Terminator und den 5'-Teil (^–30 bp) des Tc-Promotors enthält, aus pLS33Tsc herausgeschnitten. Schließlich wurde das EcoRI-HindIII-Vektorfragment von ^–4331 bp (pBR322-basierend) aus pRanTsc herausgeschnitten. Diese vier Fragmente wurden ligiert, um pBKIGF-2 zu liefern, das den AP-Promotor, die IamB-Signalsequenz, die für das gesamte IGF-I-Protein kodierende DNA, den Transkriptionsterminator, den Tc-Promotor und die Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenzmarken enthält.
Kultivierung
Die fünf transformierten Stämme wurden wie folgt in Schüttelkolbenkulturen beurteilt. Ungefähr 0,3 ml einer in LB-Medium plus 10 μg/ml Tetracyclin über Nacht gezüchteten Kultur wurden in 20 ml Niedrig-Phosphat-Medium inokuliert, so dass die anfängliche Zelldichte 0,05 (A550) und der Phosphatübertrag weniger als 0,04 mM betrug. Das Niedrig-Phosphat-Medium enthielt erforderliche Mineralsalze und 1,1 % Hycase SF plus 0,06% Hefeextrakt. Die anfängliche Phosphat-Gesamtkonzentration wurde auf 0,2 mM geschätzt. Die Zusammensetzung des Mediums war die folgende: 10 μg/ml Tetracyclin, 1,5 g/l Glucose, 1,6 mM MgSO₄, 20 mM NH₄Cl, 50 mM KCl, 20 mM NaCl und 120 mM Triethanolamin, pH 7,4. Für die Kulturen mit höherer Phosphat-Anfangskonzentration wurde anorganisches Phosphat zugesetzt, um die angegebene anfängliche Phosphat-Gesamtkonzentration zu erzielen.
Die Kulturen wurden bei 37°C in 125 ml-Kolben mit Strombrechern für 24 Stunden geschüttelt, wobei sie zu diesem Zeitpunkt ihre maximale Zelldicht erreicht wurde. Die Zelldichte (A550) wurde gemessen und es wurden Zellproben zur Analyse der gesamten zellassoziierten IGF-I-Konzentration gezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation isoliert und das zellassoziierte IGF-I mit 6 M Harnstoff, 10 mM DTT, 5 mM EDTA und 50 mM Tris-Puffer, pH 8,0, solubilisiert und extrahiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert und vor der HPLC-Analyse filtriert. Die HPLC-Analyse wurde mit zwei PLRP-S-Säulen von Polymer Labs in Serie bei 50°C unter Verwendung von 0,1% Trifluoressig säure und einem Acetonitril-Konzentrationsgradienten zwischen 32% und 45% mit einer Flussrate der mobilen Phase von 1,5 ml/min durchgeführt.
Ergebnisse
21 zeigt die Endzelldichte, die für die verschiedenen Organismen als Funktion der anfänglichen Phosphatkonzentration im Medium erhalten wurde. Wie zu erwarten war, wuchsen die Organismen mit den mutierten PstS-Proteinen nicht so gut auf Medien mit niedrigen Phosphatkonzentrationen, obwohl alle der Organismen ungefähr dieselbe Zelldichte bei hoher Phosphatkonzentration erreichten. 22 präsentiert die HPLC-Ergebnisse für zellassoziierte IGF-I-Konzentrationen. Diese Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass die verminderte Affinität des PstS-Proteins für Phosphat eine höhere IGF-I-Akkumulierung bei den höheren Phosphatkonzentrationen (0,6 und 1,2 mM Anfangs-PO₄) erlaubte, als vom Organismus mit dem pstS-Protein der Wildform produziert werden kann. Der beste Produzent der in diesem Experiment untersuchten war T10Y PstS.
Beispiel III
Hochzelldichte-Fermentationen mit Mutantenstämmen
Um den Nutzen der pstS-Mutanten praxisnah zu testen, wurden Fermentationsexperimente durchgeführt. Das Ziel war das Testen der Wirkung verminderter PstS-Affinität für Phosphat auf die Produktion des heterologen Produkts IGF-I in einer industriell bedeutungsvollen Hochzelldichtefermentation. Es wird erwartet, dass der maximale Nutzen durch Kontrolle des Phosphatzufuhrstrom auf Basis der Online-Messungen der Phosphatkonzentration im Wachstumsmedium zu realisieren wäre. Jedoch wäre eine einfacher zu implementierende Ausführungsweise für die Erfindung die Verwendung einer konstanten, jedoch höheren Rate der Phosphatzufuhr mit den pstS-Mutanten als mit dem Organismus der Wildform. Diese Art des Experiments wird in den folgenden Ansätzen beschrieben.
Die in Beispiel II für Schüttelkolbenexperimente eingesetzten Zellstämme wurden mittels standardmäßigen Transformationstechniken mit pBKIGF-2 transformiert. Transformanten wurden selektiert und an 20 mg/l Tetracyclin enthaltenden LB-Platten gereinigt. Dieses Medium hatte die folgende Zusammensetzung: 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid und 20 mg/l Tetracyclin-HCl.
Eine transformierte Kolonie jeder Zellart wurde verwendet, um sterile, 20 mg/l Tetracyclin enthaltende LB-Bouillon zu inokulieren. Die Kolbenkulturen wurden bei 35-39°C kultiviert bis die optische Dichte bei 550 nm ungefähr 1,0 erreichte. Steriles DMSO wurde den Kulturen zugesetzt, um eine DMSO-Endkonzentration von 10% (v/v) zu ergeben. Aliquote von 1-2 ml wurden in sterile Fläschchen abgefüllt und bei –60°C oder darunter gelagert.

Die Fermenterinokula zum Produzieren von rhIGF-I wurden durch Inokulieren von 1 ml jeder gefrorenen 1-OD- (A550) Kultur in 500 m) 5 μg/ml Tetracyclin enthaltendem LB-Medium hergestellt. Diese Kulturen wurden für 8 Stunden in einem geschüttelten 2-Liter-Kolben mit Strombrechern bei 37°C inkubiert und, bis die Kulturen ungefähr 3 OD erreichten. Der Schüttelkolben wurde dann verwendet, um einen 10-Liter-Fermenten zu inokulieren, der 6 Liter Kulturmedium enthielt, das folgendermaßen zusammengesetzt war:

Bestandteil	Menge/Liter
Glucose	2,5 g
Ammoniumsulfat	2-6 g
Ammoniumhydroxid	wie erforderlich, den pH auf 7,1 bis 7,5 einzustellen
Natriumphosphat, monobasisch, Dihydrat
Kaliumphosphat, dibasisch
Natriumcitrat, Dihydrat	0,5-1,5 g
Kaliumchlorid	1-2 g
25% Pluronic Polyol L61	0,2 ml anfänglich und wie zur Schaumkontrolle erforderlich
Magnesiumsulfat, Heptahydrat	1-3 g
Tetracyclin HCl	8,3 mg
Hefeextrakt	12,5 g
NZ-Amin-AS	12,5 g
Isoleucin	0-10 g
Eisen(III)chlorid, Heptahydrat	10-30 mg
Zinksulfat, Heptahydrat	2-5 mg
Cobaltchlorid, Hexahydrat	2-5 mg
Natriummolybdat, Dihydrat	2-5 mg
Kupfersulfat, Pentahydrat	2-5 mg
Borsäure	0,5-2 mg
Magnesiumsulfat, Monohydrat	1-3 mg

Der Fermentationsprozess wurde bei 37°C unter kräftigem Rühren und Belüftung bei pH 7,3 durchgeführt, wobei der pH mittels Ammoniumhydroxid-Zugaben reguliert wurde. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 650-1.000 U/min und die Belüftungsrate auf 0,7-1,5 Volumina Luft je Volumen Kultur pro Minute eingestellt. Nach dem die Anfangsglucose verbraucht war, wurde eine sterile 50%-ige Glucoselösung zugeführt, um die Kultur nahe ihrer maximalen Wachstumsrate während der Anfangsphase der Fermentation zu halten, und zwar mit einer Rate, die ausreichend schnell war, um schnelles Wachstum zu ermöglichen, jedoch nicht so schnell, dass die Gelöstsauerstoff auf unter 30% der Luftsättigung während der späteren Phase der Fermentation abfällt (wenn sich signifikante Zellmasse angesammelt hat).
Bei ungefähr 40 OD (6-9 Stunden nach Inokulierung) wurde eine Zufuhr von komplexem Stickstoff begonnen. Drei unterschiedliche Feeds wurden verwendet und im ungefähren Verhältnis zur zugeführten Phosphatmenge mit 1X, 2X und 4X bezeichnet. Die folgende Tabelle beschreibt die drei Feeds:
Ungefähr 12 Stunden nach der Inokulierung war das Phosphat im Medium verbraucht und es wurde die Produktion von IGF-I induziert. Die Fermentationen wurden bis 40 Stunden nach Inokulierung fortgesetzt, wobei alle zwei Stunden Proben gezogen wurden, um das akkumulierte Gesamt-IGF-I zu ermitteln. Proben der Gesamtbouillon wurden mit 6 M Guanidin-HCl und 100 mM DTT in 50 mM Tris-Puffer, pH 9,0, extrahiert. Das extrahierte IGF-I wurde mittels HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule von Bakerbond mit einem 34-35%-Acetonitril-Gradienten in 0,1 % Trifluoressigsäure bei 2 ml/min und 50°C getestet.
23 präsentiert Ergebnisse, die mit dem 2X-Feed für vier der pstS-Mutanten gegenüber dem Wirt der Wildform erhalten wurden. Es war ein signifikanter Gewinn an Gesamt-IGF-I-Akktumulierung mit allen untersuchten Mutanten zu verzeichnen.
Für die weitere Charakterisierung der Leistungsfähigkeit der mutierten Organismen wurde der transformierte 39B7-Wirt mit einer D56S-pstS-Mutation gegenüber dem Wirt mit dem pstS-Protein der Wildform bezüglich des Spitzenwerts des Gesamt-IGF-I bei drei verschiedenen Raten der Phosphatzufuhr, nämlich 14, 27 und 57 μmol/min evaluiert. 24 zeigt, dass bei allen drei Phosphatzufuhrraten 39B7/pBKIGF-2 mehr Produkt bildete. Für den Wirt der Wildform verminderten höhere Phosphatzufuhrraten die IGF-I-Akkumulierung. Für die Mutante trat die höchste IGF-I-Akkumulierung mit der mittleren Zufuhrrate auf, was mit der vom PstS-Protein mit einer niedrigeren Affinität für Phosphat bewirkten Kontrolle im Einklang steht. Bei dieser Zufuhrrate war die IGF-I-Akkumulierung um 78% höher für die Mutante 39B7 als für die Wildform 9E4 und war um 58% höher als die für den Wirt der Wildform bei ihrer optimalen Phosphatzufuhrrate, 14 μmol/min, erhaltene IGF-I-Akkumulierung.
Zusammenfassend ist das periplasmatische, Phosphat bindende Protein PstS eine Komponente des aktiven Transportsystems für Phosphat in E. coli, das bei der Regulation von mehr als zwanzig Genen, die als pho-Regulon bezeichnet werden, beteiligt ist, die bei Phosphatlimitierung induziert werden. Die PstSCAB- und PhoU-Proteine agieren als negative Regulatoren dieser Gene unter Bedingungen hoher Phosphatkonzentration.
Die Rolle der Phosphatbindung durch PstS bei der Regulation des pho-Regulons wurde durch Testen der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (phoA) in Stämmen bestimmt, die Mutationen in der Phosphat bindenden Tasche von PstS enthalten, die an einer Reihe von Phosphatkonzentrationen gezüchtet wurden. Die Kristallstruktur von PstS impliziert die Beteiligung der Seitenketten von sechs Resten an der Phosphatbindung. Die Bedeutung dieser Reste wurde anfangs mittels Alanin-Scanning-Mutagenese ermittelt. Die Expression von PhoA blieb relativ unverändert, daher wurden diese Reste dann ein zeln zu allen möglichen Substitutionen randomisiert und die Mutantenpools wurden nach Wachstum in Hoch-Phosphat-Medien auf erhöhte PhoA-Aktivität hin gescreent. Mutationen in pstS wurden isoliert, die eine erhöhte Expression von phoA bei höheren Phosphatkonzentrationen bewirkten. Diese Mutationen ermöglichen auch eine höhere Expression und Akkumulierung heterologer Produkte, z.B. IGF-I, in Hochzelldichtefermentationen industrieller Bedeutung. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, das für eine E.coli-PstS-Variante kodiert, die aus der aus T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS und T141H PstS bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, die für T10M PstS, T10Y PstS, D56S PstS oder T141H PstS kodiert.
E.coli-Wirtszelle, die ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 unter der Transkriptionskontrolle des E.coli-pstS-Gen-Promotors der Wildform umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 3, worin das Nucleinsäuremolekül in ihr Chromosom integriert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 3, die weiters ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, unter der Transkriptionskontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors umfasst.
Verfahren zur Produktion eines Polypeptids von Interesse, welches das Kultivieren bakterieller Zellen umfasst, denen ihr natives pstS-Gen fehlt und die ein Nucleinsäuremolekül umfassen, das für eine PstS-Variante kodiert, die eine Aminosäurevariation innerhalb der Phosphat-Bindungsregion des entsprechenden nativen PstS aufweist, worin die Variante verringerte Affinität für Phosphat aufweist, wobei das Nucleinsäuremolekül unter der Transkriptionskontrolle des pstS-Gen-Promotors der Wildform steht und wobei die bakteriellen Zellen auch ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid von Interesse kodiert, unter der Transkriptionskontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors umfassen, worin das Kultivieren in einem Kulturmedium bei einer Konzentration an anorganischem Phosphat im Medium erfolgt, die während aller Zellwachstumsphasen oberhalb von 0,1 bis 10 μM liegt, und unter Bedingungen erfolgt, die die Expression der für das Polypeptid von Interesse kodierenden Nucleinsäure ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Konzentration an anorganischem Phosphat in allen Zellwachstumsphasen oberhalb von etwa 0,5 mM liegt und worin die pstS-Variante zum nativen pstS-Gen in den Wirtszellen homolog ist.
Verfahren nach Anspruch 6, das weiters das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Polypeptid aus dem Periplasma oder dem Kulturmedium gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Polypeptid Alkalische Phosphatase ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Polypeptid zu den Wirtszellen heterolog i st.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Polypeptid ein Säugetier-Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die bakteriellen Zellen Enterobacteriaceae-Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Aminosäurevariation im Nucleinsäuremolekül eine Aminosäuresubstitution ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die bakteriellen Zellen E.coli sind und ein hydrophober Rest statt des Threonins an Position 10 der Phosphat-Bindungsregion von nativem E.coli PstS substituiert oder Serin statt der Asparaginsäure an Position 56 der Phosphat-Bindungsregion von nativem E.coli PstS substituiert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das für eine PstS-Variante kodierende Nucleinsäuremolekül für eine E.coli PstS-Variante, die aus der aus T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS und T141H PstS bestehenden Gruppe ausgewählt ist, unter der Transkriptionskontrolle des E.coli-pstS-Gen-Promotors der Wildform kodiert.
Verfahren zur Steuerung der Expressionsrate eines Polypeptids in bakteriellen Zellen, welches das Kultivieren bakterieller Zellen umfasst, denen ihr natives pstS-Gen fehlt und die ein Nucleinsäuremolekül umfassen, das für eine PstS-Variante kodiert, die eine Aminosäurevariation innerhalb der Phosphat-Bindungsregion des entsprechenden nativen PstS aufweist, worin die Variante verringerte Affinität für Phosphat aufweist, wobei das Nucleinsäuremolekül unter der Transkriptionskontrolle des pstS-Gen-Promotors der Wildform steht und wobei die bakteriellen Zellen auch ein für das Polypeptid von Interesse kodierendes Nucleinsäuremolekül unter der Transkriptionskontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors umfassen, worin das Kultivieren unter Bedingungen erfolgt, wodurch die Konzentration an anorganischem Phosphat im Kulturmedium während der Zellwachstums-Produktionsphase so reguliert wird, dass das Polypeptid unter der Transkriptionskontrolle eines partiell induzierten Alkalsche-Phosphatase-Promotors produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Konzentration an anorganischem Phosphat durch Regulierung der Zufuhrrate von anorganischem Phosphat oder einer komplexen Stickstoffquelle, die anorganisches Phosphat enthält, in das Medium reguliert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Zellen Enterobacteriaceae-Zellen sind und die Aminosäurevariation im Nucleinsäuremolekül eine Aminosäuresubstitution ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das für eine PstS-Variante kodierende Nucleinsäuremolekül für eine E.coli-PstS-Variante, die aus der aus T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS und T141H PstS bestehenden Gruppe ausgewählt ist, unter der Transkriptionskontrolle des E.coli-pstS-Gen-Promotors der Wildform kodiert.