ES2659155T3

ES2659155T3 - Cepa hospedante bacteriana que expresa DSBC recombinante

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Publication number: ES2659155T3
Application number: ES12737492.4T
Authority: ES
Inventors: Mark Ellis; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2018-03-14
Anticipated expiration: 2032-07-13
Also published as: EP2731973A1; EP3339325A1; US20140141468A1; SG10201807560XA; JP2018019719A; BR112013032871A8; BR112013032871B1; CN103649124A; RS56926B1; PL2731973T3; HRP20180226T1; PT2731973T; US20170335003A1; EA031449B1; US9725516B2; MX348738B; JP6431370B2; CA2841824C; AU2012283388B2; EA201490274A1

Abstract

Una célula bacteriana gram-negativa recombinante que comprende: a) un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC; y b) uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154; c) un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene 50% o menos de la actividad proteasa de una proteína Tsp no mutada de tipo salvaje según se muestra en SEQ ID NO:26; y d) un gen spr mutado que codifica una proteína spr cuya secuencia de tipo salvaje se muestra en SEQ ID NO:24 que comprende una mutación que afecta al aminoácido C94; y en la que dicha célula bacteriana gram-negativa se selecciona de las cepas K12 y W3110 de E. coli, y en la que la célula bacteriana es isogénica con dichas cepas excepto por el polinucleótido recombinante que codifica DsbC, dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y el gen Tsp mutado y el gen spr mutado.

Description

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DESCRIPCION

Cepa hospedante bacteriana que expresa DSBC recombinante

La presente invención se refiere a un cepa hospedante bacteriana recombinante, en particular E. coli. La invención se refiere además a un método para producir una proteína de interés en dicha célula.

Antecedentes de la invención

Habitualmente se emplean células bacterianas, tales como E. coli, para producir proteínas recombinantes que no requieren glicosilación. Existen muchas ventajas en la utilización de células bacterianas, tales como E. coli, para producir proteínas recombinantes, en particular debido a la naturaleza versátil de las células bacterianas como células hospedantes, que permiten la inserción de genes por medio de plásmidos. Se ha empleado E. coli para producir muchas proteínas recombinantes, que incluyen la insulina humana.

A pesar de las muchas ventajas del uso de células bacterianas para producir proteínas recombinantes, siguen existiendo limitaciones significativas, que incluyen un fenotipo de mala salud celular.

Por consiguiente, sigue siendo necesario proporcionar nuevas cepas bacterianas que proporcionen medios ventajosos para producir proteínas recombinantes.

La generación de la inmunidad humoral y mediada por células es orquestada por la interacción de células T auxiliares activadas con células presentadoras de antígenos ("antigen-presenting cells", APC) y células T efectoras. La activación de células T auxiliares no solo depende de la interacción del receptor de células T específico de antígeno ("antigen-specific T-cell receptor", TCR) con su ligando de péptido-MHC cognado, sino que también requiere la unión y activación coordinada de una serie de moléculas de adhesión a células y coestimuladoras.

La unión natural del receptor a CD40 es por un ligando de CD40 (CD40-L = CD154), una molécula coestimuladora crucial que se expresa sobre la superficie de células T CD4+ de una manera dependiente de la activación y restringida en el tiempo. El CD154 también se expresa, después de la activación, sobre un subconjunto de células T CD8+, basófilos, células cebadas, eosinófilos, células asesinas naturales, células B, macrófagos, células dendríticas y plaquetas. El CD40 se expresa ampliamente y de forma constitutiva sobre la superficie de muchos tipos de células, incluyendo las células B y otras células presentadoras de antígenos.

La señalización a través de CD40 después de la unión a CD154 inicia una cascada de acontecimientos celulares que dan como resultado la activación de células que portan el receptor CD40 y el cebado óptimo de células T CD4+. De modo más específico, la unión de CD154 a cD40 estimula la diferenciación de células B en células secretoras de anticuerpos y células B de memoria.

El papel crucial de CD154 para regular la función de la respuesta inmunológica humoral y mediada por células ha suscitado un gran interés por el uso de inhibidores de esta vía para la inmunomodulación terapéutica. Así, se ha demostrado que los anticuerpos anti-CD154 son beneficiosos en una amplia diversidad de modelos de respuesta inmunológica a otras proteínas terapéuticas o terapia génica, alergenos, autoinmunidad y transplantes (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.474.771 y WO 2008/118356).

En la técnica es necesario producir, de modo eficaz y barato, grandes cantidades de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que interfieran con la interacción de CD40 y CD154, adecuados para aplicaciones terapéuticas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una célula bacteriana gram-negativa recombinante, según se define en las reivindicaciones 1-11. La presente invención proporciona además un método, según se define en las reivindicaciones 12-15, para producir un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154. En la presente se describe una célula bacteriana gram-negativa recombinante que comprende:

a) un polinucleótido recombinante que codifica DsbC; y

b) uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154.

De modo más específico, en la presente se describe una célula bacteriana gram-negativa recombinante que se caracteriza porque la célula:

a) comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC;

b) presenta una actividad de proteína Tsp reducida comparada con una célula de tipo salvaje; y

c) comprende uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno,

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que se une específicamente a CD154.

En una descripción adicional, la célula comprende un gen spr de tipo salvaje o un gen spr mutado, por ejemplo, capaz de suprimir el fenotipo de actividad reducida de Tsp.

La célula bacteriana gram-negativa según la presente invención muestra unos fenotipos de crecimiento y de producción de proteínas ventajosos.

De modo más específico, en la presente se describe una célula bacteriana gram-negativa recombinante que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido de DsbC que comprende un marcador de histidina (His), preferiblemente en la que el polipéptido de DsbC comprende la secuencia his-his-his-his-his-his (6x histidina).

De modo más específico, la presente descripción proporciona una célula bacteriana gram-negativa recombinante que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un polinucleótido con la secuencia según SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:51.

En la presente también se describe un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC y un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154.

De modo más específico, en la presente se describe un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido de DsbC que comprende un marcador de histidina (His), preferiblemente en el que el polipéptido de DsbC comprende la secuencia his-his-his-his-his-his (6x histidina).

De modo más específico, en la presente se describe un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un polinucleótido con la secuencia según SEQ ID nO:45 o sEq ID NO:51.

En la presente también se describe un método para producir un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, que comprende:

a) cultivar una célula bacteriana gram-negativa recombinante, según se definió anteriormente, en un medio de cultivo bajo condiciones eficaces para expresar el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y el polinucleótido recombinante que codifica DsbC; y

b) recuperar el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, del periplasma de la célula bacteriana gram-negativa recombinante y/o del medio de cultivo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la construcción de un vector para su uso en la producción de una célula según una realización de la presente invención.

La figura 2 muestra la estructura de un compuesto que comprende un fragmento Fab' modificado unido covalentemente a través de un resto cisteína a un conector de lisilo-maleimida, en la que cada grupo amino del resto lisilo lleva unido covalentemente un resto metoxi PEG, en el que n está entre aproximadamente 420 y 450.

La figura 3 muestra el perfil de crecimiento de la cepa W3110 que expresa Fab' anti-CD154 y el perfil de crecimiento de la cepa MXE016 que expresa Fab' anti-CDl54 y DsbC recombinante (W3110 ATsp, spr C94A). Puede observarse que la cepa MXE016 que expresa DsbC recombinante muestra un perfil de crecimiento y una tasa de crecimiento mejorados en la fase discontinua inicial, comparado con la cepa W3110.

La figura 4 muestra el rendimiento de Fab' total (g/l) del periplasma (símbolos negros) y del sobrenadante (símbolos blancos) de la cepa MXE016 que expresa DsbC recombinante, comparado con la cepa control W3110. La cepa que expresa DsbC muestra una mayor expresión periplásmica de Fab', comparada con W3110. Además, la cepa MXE016 que expresa DsbC muestra unos niveles extracelulares de Fab' equivalentes, comparado con la cepa W3110.

La figura 5 muestra los resultados de un análisis de HPLC en fase inversa de extracciones de fermentación. La cepa de tipo salvaje W3110 que expresa Fab' anti-CD154 muestra un nivel alto de cadenas ligeras kappa degradadas (fragmentos de cadena ligera [LC]). Por contraste, la cepa MXE016 (W3110 ATsp, spr C94A) que expresa DsbC recombinante y Fab' anti-CD154 casi no muestra fragmentos de cadena ligera debido a la ausencia de actividad Tsp proteasa.

La figura 6 muestra la recolección de Fab' anti-CD154 (g/l) de fermentaciones de la cepa W3110 y de la cepa MXE016 (W3110 ATsp, spr C94A) que expresa DsbC recombinante. La recolección procedente de la cepa MXE016 (W3110 ATsp, spr c94A) que expresa DsbC recombinante es sustancialmente mayor y muestra sustancialmente menos Fab' extracelular, lo cual resulta beneficioso porque el Fab' extracelular es un marcador del riesgo de lisis celular y el Fab extracelular no se recupera con facilidad empleando el mismo proceso que el empleado para el Fab' periplásmico.

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La figura 7 muestra la viabilidad de (a) células de la cepa W3110, y (b) células de la cepa MXE016 (W3110 ATsp, spr C94A) que expresan DsbC recombinante y que, en ambos casos (a) y (b), expresan Fab' anti-CD154 (g/l). Las células de la cepa MXE016 (W3110 ATsp, spr C94A) que expresan DsbC recombinante muestran una mayor viabilidad.

La figura 8 muestra el rendimiento de Fab' total (g/l) de fermentaciones de cepas MXE016 que expresan Fab' anti- CD154. La barra de la derecha representa una cepa MXE016 que expresa además DsbC recombinante. La cepa MXE016 que expresa DSBC recombinante muestra un rendimiento mayor.

La figura 9 muestra las secuencias polinucleotídicas y de aminoácidos de una región dentro del gen ptr que ha sido mutado.

La figura 10 muestra las secuencias polinucleotídicas y de aminoácidos de una región dentro del gen Tsp que ha sido mutado.

La figura 11 muestra las secuencias polinucleotídicas y de aminoácidos de una región dentro del gen DegP que ha sido mutado.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO:1 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:2 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:3 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:4 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:5 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:6 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:7 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de la cadena ligera variable (gL4) de un anticuerpo anti-CD154 (342).

SEQ ID NO:8 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable (gL4) de un anticuerpo anti-CD154 (342).

SEQ ID NO:9 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de la cadena pesada variable (gH1) de un anticuerpo anti-CD154 (342).

SEQ ID NO:10 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable (gH1) de un anticuerpo anti- CD154 (342).

SEQ ID NO:11 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos que comprende la región variable y constante de la cadena ligera (gL4) de un fragmento de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:12 muestra la secuencia de aminoácidos que comprende la región variable y constante de la cadena ligera (gL4) de un fragmento de un anticuerpo anti-CD154.

SEQ ID NO:13 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de un fragmento de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD154 que comprende la región variable y la región CH1 con deleciones en la región de bisagra.

SEQ ID NO:14 muestra la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cadena pesada de un anticuerpo anti- CD154 que comprende la región variable y la región CH1 con deleciones en la región de bisagra.

SEQ ID NO:15 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de un fragmento de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD154 que comprende la región variable, la región CH1 y la región de bisagra.

SEQ ID NO:16 muestra la secuencia de aminoácidos de un fragmento de cadena pesada de un anticuerpo anti- CD154 que comprende la región variable, la región CH1 y la región de bisagra.

SEQ ID NO:17 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de una cadena ligera kappa de un anticuerpo anti-CD154 (342) que incluye el péptido señal (aminoácidos 1-22).

SEQ ID NO:18 muestra la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera kappa de un anticuerpo anti-CD154 (342) que incluye el péptido señal (aminoácidos 1-22).

SEQ ID NO:19 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de la cadena pesada completa de un anticuerpo IgG4 anti-CD154 aglicosilado.

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SEQ ID NO:20 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada completa de un anticuerpo IgG4 anti- CD154 aglicosilado.

SEQ ID NO:21 muestra la secuencia polinucleotídica que codifica gL4 y gH1 (sin bisagra).

SEQ ID NO:22 muestra la secuencia polinucleotídica que codifica gL4 y gH1.

SEQ ID NO:23 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de spr de E. coli de tipo salvaje (n.° de registro de GenBank D86610).

SEQ ID NO:24 muestra la secuencia de aminoácidos de spr de E. coli de tipo salvaje (n.° de registro de GenBank D86610).

SEQ ID NO:25 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de Tsp de E. coli de tipo salvaje con la secuencia señal (n.° de registro de GenBank M75634).

SEQ ID NO:26 muestra la secuencia de aminoácidos de Tsp de E. coli de tipo salvaje con el péptido señal (n.° de registro de GenBank M75634).

SEQ ID NO:27 muestra la secuencia de aminoácidos de DsbC de E. coli (secuencia de referencia de NCBI AP_003452).

SEQ ID NO:28 muestra la secuencia polinucleotídica para el Tsp mutado inactivado.

SEQ ID NO:29 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de DegP de E. coli de tipo salvaje.

SEQ ID NO:30 muestra la secuencia de aminoácidos de DegP de E. coli de tipo salvaje.

SEQ ID NO:31 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de DegP que comprende la mutación puntual S210A y un marcador de restricción Ase I.

SEQ ID NO:32 muestra la secuencia de aminoácidos de DegP que comprende la mutación puntual S210A y un marcador de restricción Ase I.

SEQ ID NO:33 a 36 muestran secuencias intergénicas dicistrónicas (IGS) IGS1, IGS2, IGS3 e IGS4, respectivamente.

SEQ ID NO:37 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de OmpT de E. coli de tipo salvaje.

SEQ ID NO:38 muestra la secuencia de aminoácidos de OmpT de E. coli de tipo salvaje.

SEQ ID NO:39 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de OmpT mutado e inactivado de E. coli.

SEQ ID NO:40 muestra la secuencia de aminoácidos de OmpT mutado e inactivado E. coli.

SEQ ID NO:41 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de OmpT mutado de E. coli que comprende las mutaciones puntuales D210A y H212A.

SEQ ID NO:42 muestra la secuencia de aminoácidos de OmpT de E. coli que comprende las mutaciones puntuales D210A y H212A.

SEQ ID NO:43 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de DsbC de E. coli de tipo salvaje.

SEQ ID NO:44 muestra la secuencia de aminoácidos de DsbC de E. coli de tipo salvaje.

SEQ ID NO:45 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de DsbC de E. coli que carece de un sitio de restricción EcoRI con un marcador de His.

SEQ ID NO:46 muestra la secuencia de aminoácidos de DsbC de E. coli que carece de un sitio de restricción EcoRI con un marcador de His.

SEQ ID NO:47 muestra la secuencia polinucleotídica del cebador 6283 Tsp 3'.

SEQ ID NO:48 muestra la secuencia polinucleotídica del cebador 6283 Tsp 5'.

SEQ ID NO:49 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de prt de E. coli de tipo salvaje (proteasa III según el n.° de registro de GenBank X06227).

SEQ ID NO:50 muestra la secuencia de aminoácidos de ptr de E. coli de tipo salvaje (proteasa III según el n.° de registro de GenBank X06227).

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SEQ ID NO:51 muestra la secuencia polinucleotídica y de aminoácidos de DsbC de E. coli de tipo salvaje con un marcador de His.

SEQ ID NO:52 muestra la secuencia de aminoácidos de DsbC de E. coli de tipo salvaje con un marcador de His. Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

Tsp (también conocida como Prc) es una proteasa periplásmica de 60 kDa. El primer sustrato conocido de Tsp fue la proteína-3 de unión a penicilina (PBP3) (Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli, Hara et al., 4799-4813; Nagasawa et al., 5890-5893), pero después se descubrió que Tsp también es capaz de romper las proteínas de la cola de fagos y, por tanto, se renombró como proteasa específica de cola ("Tail Specific Protease", Tsp). Silber, Keiler, y Sauer, 295-299, y Silber y Sauer, 237440, describen una cepa de deleción de prc (KS1000), en la que la mutación se crea reemplazando un segmento del gen prc por un fragmento que comprende un marcador Kanr.

La reducción de la actividad Tsp (prc) es deseable para reducir la proteolisis de las proteínas de interés. La proteolisis de Fab puede manifestarse mediante la presencia de impurezas, tales como un fragmento que puede denominarse la impureza de cadena ligera.

Sin embargo, se descubrió que las células que carecen de la proteasa prc muestran un crecimiento termosensible a baja osmolaridad. Hara et al. aislaron revertidos termorresistentes que contienen mutaciones de supresor extragénicas (spr) (Hara et al., 63-72). Spr es una proteasa periplásmica unida a membranas de 18 kDa, y los sustratos de spr son Tsp y peptidoglicanos en la membrana externa implicados en la hidrólisis de la pared celular durante la división celular. El gen spr se denomina UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4 (SPR_ECOLI).

La proteína disulfuro isomerasa es una enzima que cataliza la formación y la ruptura de enlaces disulfuro entre restos cisteína dentro de las proteínas a medida que se pliegan. Se sabe que coexpresa proteínas que catalizan la formación de enlaces disulfuro para mejorar la expresión de proteínas en una célula hospedante. El documento WO 98/56930 describe un método para producir polipéptidos que contienen enlaces disulfuro heterólogos en células bacterianas, en el que una disulfuro isomerasa procariota, tal como DsbC o DsbG, se coexpresa con un polipéptido eucariota. El documento US 6.673.569 describe un operón artificial que comprende polinucleótidos que codifica cada una de DsbA, DsbB, DsbC y DsbD para su uso para producir una proteína extraña. El documento EP0786009 describe un proceso para producir un polipéptido heterólogo en bacterias, en el que la expresión del ácido nucleico que codifica DsbA o DsbC es inducida antes de la inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo.

DsbC es una proteína procariota que se encuentra en el periplasma de E. coli que cataliza la formación de enlaces disulfuro en E. coli. DsbC tiene una longitud de secuencia de aminoácidos de 236 (que incluye el péptido señal) y un peso molecular de 25,6 KDa (UniProt n.° P0AEG6). DsbC fue identificada por primera vez en 1994 (Missiakas, Georgopoulos, y Raina, 2013-2020; Shevchik, Condemine, y Robert-Baudouy, 2007-2012).

Se ha descubierto, de modo sorprendente, que la sobreexpresión de DsbC en células bacterianas gram-negativas reduce la lisis durante el cultivo de células que carecen de la proteasa Tsp. Por consiguiente, los presentes inventores han proporcionado una nueva cepa que tiene propiedades ventajosas para producir una proteína de interés.

La célula bacteriana gram-negativa que posee la anterior combinación específica de modificaciones genéticas muestra unos fenotipos de crecimiento y de producción de proteínas ventajosos.

En una realización, el genoma de la célula es preferiblemente isogénico con una célula bacteriana de tipo salvaje, excepto por la modificación requerida para reducir la actividad de proteína de Tsp comparada con una célula de tipo salvaje.

En otra realización, la célula según la presente invención presenta una actividad de proteína de Tsp reducida comparada con una célula de tipo salvaje, y comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC y una proteína de spr alterada. En esta realización, el genoma de la célula es preferiblemente isogénico con una célula bacteriana de tipo salvaje, excepto por el gen spr mutado y una modificación que conduce a la expresión reducida o ausente de la proteína de Tsp comparada con una célula de tipo salvaje.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se emplean en la presente de modo intercambiable, a menos que el contexto indique lo contrario. Un "péptido" pretende referirse a 20 o menos aminoácidos.

El término "polinucleótido" incluye un gen, ADN, ADNc, ARN, ARNm y sus análogos, que incluyen, pero no se limitan a ácido nucleico bloqueado (ANB, "locked nucleic acid"), ácido nucleico peptídico (ANP), ácido nucleico de morfolino, ácido nucleico de glicol (ANG) y ácido nucleico de treosa (ANT), etc., a menos que el contexto indique lo contrario.

Tal como se emplea en la presente, el término "comprende", en el contexto de la presente memoria descriptiva, debe interpretarse como "incluye".

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La célula no mutada o la célula control, en el contexto de la presente invención, significa una célula del mismo tipo que la célula gram-negativa recombinante de la invención, en la que la célula no ha sido modificada para que porte el polinucleótido recombinante que codifica DsbC ni uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154. Por ejemplo, una célula no mutada puede ser una célula de tipo salvaje y puede derivarse de la misma población de células hospedantes que las células de la invención antes de la modificación para introducir cualquier polinucleótido o polinucleótidos recombinantes.

Las expresiones y términos "célula", "línea celular", "cultivo celular" y "cepa" se emplean de modo intercambiable.

El término "isogénico", en el contexto de la presente invención, significa que la célula comprende la misma, o sustancialmente la misma secuencia o secuencias de ácidos nucleicos, comparada con la célula de tipo salvaje, excepto por los elementos incorporados en ella que caracterizan la invención, por ejemplo, el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y opcionalmente una modificación que conduce a la expresión reducida o ausente de la proteína de Tsp, y opcionalmente un gen spr mutado. En esta realización, la célula según la presente invención no comprende más cambios no naturales ni cambios introducidos mediante ingeniería genética en su genoma.

En la presente también se describe una célula en la que el polinucleótido que codifica DsbC y/o dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, se insertan en el genoma de la célula, y la célula según la presente invención puede tener sustancialmente la misma secuencia genómica comparada con la célula de tipo salvaje, excepto por el polinucleótido codifica DsbC y/o dichos uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, y opcionalmente una modificación que produce como resultado la expresión reducida o ausente de la proteína de Tsp o la expresión de una proteína Tsp con actividad proteasa reducida, y opcionalmente un gen spr mutado que codifica una proteína con actividad reducida, comparada con el tipo salvaje, tomando en cuenta cualquier mutación natural que pueda producirse. En una realización, en la que el polinucleótido que codifica DsbC y/o dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, se insertan en el genoma de la célula, la célula según la invención puede tener exactamente la misma secuencia genómica comparada con la célula de tipo salvaje, excepto por el polinucleótido codifica DsbC y/o dichos uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.

El polinucleótido que codifica DsbC puede estar presente en un vector de expresión adecuado transformado en la célula y/o integrado en el genoma de la célula hospedante. Cuando el polinucleótido que codifica DsbC se inserta en el genoma de la célula hospedante, la célula de la presente invención se diferencia de una célula de tipo salvaje debido al polinucleótido insertado que codifica la DsbC. En este caso, el genoma de la célula hospedante puede ser isogénico comparado con el genoma de una célula de tipo salvaje, excepto por el polinucleótido recombinante que codifica DsbC.

Preferiblemente, el polinucleótido que codifica DsbC está en un vector de expresión en la célula, por lo cual provoca una alteración mínima en el genoma de la célula hospedante.

Dichos uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, pueden estar contenidos dentro de un vector de expresión adecuado transformado en la célula y/o integrado en el genoma de la célula hospedante. En la realización en que el polinucleótido que codifica el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, se inserta en el genoma del hospedante, la célula de la presente invención se diferencia de una célula de tipo salvaje debido al polinucleótido o polinucleótidos insertados que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En esta realización, el genoma de la célula hospedante puede ser isogénico comparado con el genoma de una célula de tipo salvaje, excepto por el polinucleótido o polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica la proteína de interés está en un vector de expresión en la célula, por lo cual provoca una alteración mínima en el genoma de la célula hospedante.

En la presente también se describe una célula, en la que el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, se insertan en el genoma del hospedante. En este caso, la célula descrita se diferente de la célula de tipo salvaje debido al polinucleótido recombinante insertado que codifica DsbC y dichos uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, y opcionalmente una modificación que produce como resultado la expresión reducida o ausente de la proteína de Tsp o la expresión de una proteína Tsp con actividad proteasa reducida, y opcionalmente un gen spr mutado que codifica una proteína con actividad reducida, comparada con el tipo salvaje. En este caso, el genoma de la célula hospedante puede ser isogénico comparado con el genoma de una célula de tipo salvaje, excepto por el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y dichos uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.

En una realización preferida, el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, están presentes en

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el mismo vector de expresión o en vectores de expresión diferentes en la célula, por lo cual provocan una alteración mínima en el genoma de la célula hospedante. En la presente también se describe un caso en el que el genoma de esta célula puede ser sustancialmente idéntico o exactamente idéntico al genoma de una célula de tipo salvaje.

En una realización se proporciona una célula de E. coli recombinante que presenta una actividad Tsp reducida y opcionalmente un gen spr, o uno de sus mutantes, en la que las modificaciones en la actividad Tsp y cualquier mutación en el gen spr se realizan mediante cambios en el genoma de la célula. La célula según esta realización puede transformarse con un vector, tal como un plásmido que codifica el vector de DsbC y el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154. En una realización, el vector o plásmido no está integrado en el genoma de la célula.

La expresión "tipo salvaje", en el contexto de la presente invención, significa una cepa de células bacterianas gram- negativas tal como puede aparecer en la naturaleza o tal como puede aislarse del entorno, que no porta ningún polinucleótido recombinante ni mutaciones introducidas mediante ingeniería genética. Un ejemplo de una cepa de tipo salvaje de E. coli es la cepa K-12 y su cepa parental W3110. En la actualidad, la cepa K-12 de E. coli lleva en cultivo desde hace 90 años (Bachmann 525-57). La cepa K-12 de E. coli y sus cepas parentales, tales como W3110, son muy conocidas en la técnica. La cepa W3110 está disponible, por ejemplo, en the American Tissue Culture Collection (ATCC) con el n.° de catálogo 27325. W3110 tiene el genotipo: F-, A-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1.

Los presentes inventores han proporcionado una célula bacteriana gram-negativa recombinante adecuada para expresar un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC.

Las células según la presente invención comprenden un polinucleótido recombinante que codifica DsbC. Tal como se emplea en la presente, un "polipéptido recombinante" se refiere a una proteína que se construye o se produce empleando la tecnología del ADN recombinante. El polinucleótido que codifica DsbC puede ser idéntico al polinucleótido endógeno que codifica DsbC que se encuentra en células bacterianas de tipo salvaje. Como alternativa, el polinucleótido recombinante que codifica DsbC es una versión mutada del polinucleótido de DsbC de tipo salvaje que se ha alterado, por ejemplo, de tal forma que se elimina un sitio de restricción de la proteína DsbC, tal como un sitio EcoRI y/o el marcador de his. Un ejemplo de un polinucleótido de DsbC modificado para su uso en la presente invención se muestra en SEQ ID NO:45, que codifica la secuencia de DsbC marcada con his mostrada en SEQ ID NO:46.

DsbC se caracteriza por la presencia de un sitio activo que comprende los aminoácidos -CXXC-, en el que XX representa los aminoácidos GY. Los variantes de DsbC incluyen aquellos en los que cada X representa un aminoácido seleccionado independientemente (con la condición de que XX no represente GY). Los ejemplos de XX incluyen NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH, SH, RF, FA, GA, MA, GI o AV.

En una realización, la célula hospedante de la invención comprende un variante de DsbC, por ejemplo, en el que el sitio activo está alterado, en tal como se describió anteriormente.

En una realización, el variante de DsbC tiene al menos la actividad biológica de la proteína de tipo salvaje, por ejemplo, tal como se mide en un ensayo in vitro.

En una realización, el variante de DsbC tiene una actividad biológica mayor que la proteína de tipo salvaje, por ejemplo, tal como se mide en un ensayo in vitro.

En una realización, el variante de DsbC presenta una alteración en el sitio activo -CXXC-, en el que XX representa NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH, SH.

En una realización, la DsbC es de tipo salvaje.

Los presentes inventores han descubierto que la selección de la expresión de un polinucleótido recombinante que codifica DsbC en una célula bacteriana proporciona una célula hospedante mejorada para expresar un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154. Las células proporcionadas por la presente invención tienen una salud celular y un fenotipo de crecimiento mejorados, comparado con las células bacterianas de tipo salvaje.

Una salud celular mejorada, tal como se emplea en la presente, pretende referirse a una o más propiedades mejoradas en comparación con células que no portan las características según la presente invención, por ejemplo, una menor propensión a la lisis celular en la fase de crecimiento o después de la inducción de la expresión de una proteína heteróloga en la célula, u otra propiedad beneficiosa, tal como conocen los expertos en la técnica.

Las células según la presente invención muestran un rendimiento de producción de proteínas, tales como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, mejorado, comparado con las células bacterianas de tipo salvaje. El rendimiento de proteínas mejorado puede ser la tasa de producción de proteínas y/o la duración de la producción de proteínas de la célula. El rendimiento de proteínas mejorado puede ser el rendimiento de proteínas periplásmicas y/o el rendimiento de proteínas del sobrenadante. Las células bacterianas recombinantes pueden ser capaces de

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presentar una tasa más rápida de producción de la proteína, tal como un anticuerpo o uno de sus fragmentos, y, por tanto, puede producirse la misma cantidad de una proteína de interés en menos tiempo, comparado con una célula bacteriana no mutada. La tasa de producción más rápida de una proteína de interés puede ser especialmente significativa en el periodo inicial de crecimiento de la célula, por ejemplo, en las primeras 5, 10, 20 o 30 horas después de la inducción de la expresión de la proteína.

Las células según la presente invención preferiblemente expresan un rendimiento en el periplasma y/o el medio de aproximadamente 1,0 g/l, 1,5 g/l, 1,8 g/l, 2,0 g/l, 2,4 g/l, 2,5 g/l, 3,0 g/l, 3,5 g/l o 4,0 g/l del anticuerpo.

De forma ventajosa, la actividad reducida de la proteína de Tsp y/o la coexpresión de DsbC conduce a una menor generación de la impureza no deseada denominada en la presente el fragmento de cadena ligera (LC); véase, por ejemplo, la figura 5.

Los expertos en la técnica serán capaces de ensayar con facilidad un clon celular candidato para determinar si presenta el rendimiento deseado de una proteína de interés empleando métodos muy conocidos en la técnica, que incluyen un método de fermentación, ELISA y HPLC de proteína G. Se describen métodos de fermentación adecuados en Humphreys et al., 193-202; Backlund et al., 358-365. Los expertos en la técnica también serán capaces de ensayar con facilidad la proteína segregada para determinar si la proteína está correctamente plegada empleando métodos muy conocidos en la técnica, tales como HPLC de proteína G, dicroísmo circular, RMN, cristalografía de rayos X y métodos de medición de afinidad por epitopos.

En la presente también se describe una célula según la presente invención que también expresa o sobreexpresa, comparada con la correspondiente célula de tipo salvaje, tal como, por ejemplo, la cepa W3110 K-12 de E. coli, una o más proteínas adicionales como sigue:

• una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como FkpA, Skp, SurA, PPiA y PPiD; y/o

• una o más proteínas capaces de facilitar la secreción o translocación de proteínas, tales como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY y Lep; y/o

• una o más proteínas capaces de facilitar la formación de enlaces disulfuro, tales como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

Una o más de las anteriores proteínas puede integrarse en el genoma de la célula y/o insertarse en un vector de expresión.

En la presente también se describe una célula según la presente invención que no expresa o expresa a un nivel que es al menos 50%, 75% o 90% menor que el nivel de la correspondiente célula de tipo salvaje, tal como, por ejemplo, la cepa W3110 K-12 de E. coli, una o más de las siguientes proteínas adicionales:

• una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como FkpA, Skp, SurA, PPiA y PPiD;

• una o más proteínas capaces de facilitar la secreción o translocación de proteínas, tales como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY y Lep; y

En la presente también se describe una célula según la presente invención que también expresa o sobreexpresa una o más proteínas adicionales seleccionadas de FkpA, Skp y sus combinaciones.

En la presente también se describe una célula que comprende además uno o más de los siguientes genes mutados:

a) un gen spr mutado;

b) un gen Tsp mutado, en el que el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene una actividad proteasa reducida o es un gen Tsp mutado inactivado;

c) un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de chaperona y una actividad proteasa reducida;

d) un gen ptr mutado, en el que el gen ptr codifica una proteína de proteasa III que tiene una actividad proteasa reducida o es un gen ptr mutado inactivado; y

e) un gen OmpT mutado, en el que el gen OmpT codifica una proteína OmpT que tiene una actividad proteasa reducida, por ejemplo, tal como se muestra en SEQ ID NO:42, o es un OmpT mutado inactivado, por ejemplo, tal

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como se muestra en SEQ ID NO:40.

En la descripción básica, la célula bacteriana gram-negativa no porta un gen Tsp mutado inactivado, por ejemplo, no es deficiente en el Tsp cromosómico.

Esta última mutación tiene una importancia particular en la producción de anticuerpos y sus fragmentos que se unen específicamente a CD154, porque la actividad proteasa de Tsp puede producir la ruptura del producto de anticuerpo en las regiones de codo, generando con ello un subproducto en cantidades significativas y reduciendo el rendimiento del producto deseado.

Así, en la presente se describe un célula según la presente invención que comprende un gen Tsp mutado, en el que el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene una actividad proteasa reducida, o es un gen Tsp mutado inactivado, y también codifica una proteína DsbC además de un anticuerpo o un fragmento específico de CD154.

En la memoria descriptiva se describe además una célula que comprende también un gen spr mutado. La proteína spr es una proteasa periplásmica unida a membrana de E. coli.

La secuencia de aminoácidos de la proteína Spr de tipo salvaje se muestra en SEQ ID NO:24 con la secuencia señal en el N-terminal (aminoácidos 1-26 según el n.° de registro de UniProt P0AFV4). La numeración de los aminoácidos de la secuencia de la proteína Spr en la presente invención incluye la secuencia señal. Por consiguiente, el aminoácido 1 de la proteína Spr es el primer aminoácido (Met) que se muestra en SEQ ID NO:24.

Además, en la presente se describe una célula que comprende un gen spr mutado, y el gen spr mutado es preferiblemente el gen spr cromosómico de la célula. El gen spr mutado codifica una proteína Spr capaz de suprimir un fenotipo desventajoso asociado con una célula que comprende un gen Tsp mutado. Las células que portan un gen Tsp mutado pueden presentar una buena tasa de crecimiento celular, pero una limitación de estas células es su tendencia a lisar, en especial a altas densidades celulares. Por consiguiente, el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado es una tendencia a lisar, en especial a altas densidades celulares.

Las células que portan un gen Tsp mutado muestran un crecimiento termosensible a baja osmolaridad. Sin embargo, las mutaciones spr que portan las células de la presente invención, cuando se introducen en una célula que tiene actividad Tsp reducida, suprimen este fenotipo de crecimiento termosensible a baja osmolaridad, y la célula muestra una lisis reducida, en particular a una alta densidad celular. Este fenotipo de "crecimiento termosensible" de una célula puede ser medido con facilidad por los expertos en la técnica con una técnica de fermentación de alta densidad celular o de matraz de agitación. La supresión de la lisis celular resulta evidente por la mejor tasa de crecimiento y/o producción de proteínas recombinantes, en particular en el periplasma, que muestra una célula que porta un spr mutante y que tiene una actividad Tsp reducida, comparado con una célula que porta el Tsp mutante y un spr de tipo salvaje.

Las células según lo descrito en la presente preferiblemente comprenden un gen spr mutante que codifica una proteína spr que presenta un cambio en uno o más aminoácidos seleccionados de N3l, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147, H157 y W174, más preferiblemente en uno o más aminoácidos seleccionados de C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 y W174. Preferiblemente, el gen spr mutante codifica una proteína spr que presenta un cambio en uno o más aminoácidos seleccionados de N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 y H157, más preferiblemente en uno o más aminoácidos seleccionados de C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 y Hl57. En este caso, la proteína spr preferiblemente no presenta ningún otro cambio de aminoácido. Preferiblemente, el gen spr mutante codifica una proteína spr que presenta un cambio en uno o más aminoácidos seleccionados de N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147, más preferiblemente en uno o más aminoácidos seleccionados de S95, V98, Y115, D133, V135 y G147. En este caso, la proteína spr preferiblemente no presenta ningún otro cambio de aminoácido.

Los presentes inventores han identificado cambios en spr que son capaces de suprimir el fenotipo de crecimiento de una célula que comprende un gen Tsp mutado.

Los inventores también han descubierto que, de modo sorprendente, las células que portan un gen DsbC recombinante, un gen spr mutado y que tienen una actividad de proteína Tsp reducida, comparado con una célula de tipo salvaje, muestran una mayor tasa de crecimiento celular y una mayor duración de la supervivencia de la célula, comparado con una célula que comprende un gen Tsp mutado. De modo específico, las células que portan un gen DsbC recombinante, un cambio en la proteína spr y que tienen una actividad de proteína Tsp reducida muestran una lisis celular reducida durante el cultivo, comparado con células que portan un gen Tsp mutado.

El cambio de uno o más de los anteriores aminoácidos de spr puede ser el resultado de cualquier mutación de sentido erróneo adecuada en uno, dos o tres de los nucleótidos que codifican el aminoácido. La mutación cambia el resto aminoácido a cualquier aminoácido adecuado que produzca una proteína spr mutada capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. La mutación de sentido erróneo puede cambiar el aminoácido a otro aminoácido que tenga un tamaño diferente y/o propiedades químicas diferentes, comparado con el aminoácido de tipo salvaje.

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En la presente también se describe un cambio con respecto a uno, dos o tres de la tríada catalítica de los restos aminoácidos de C94, H145, and H157 (Aramini et al., 9715-9717).

Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender:

una mutación que afecta al aminoácido C94; o

una mutación que afecta al aminoácido H145; o

una mutación que afecta al aminoácido H157; o

una mutación que afecta a los aminoácidos C94 y H145; o

una mutación que afecta a los aminoácidos C94 y H157; o

una mutación que afecta a los aminoácidos H145 y H157; o

una mutación que afecta a los aminoácidos C94, H145 y H157.

En este caso, la proteína spr preferiblemente no presenta ningún otro cambio de aminoácido.

Uno, dos o tres de C94, H145 y H157 pueden cambiarse a cualquier aminoácido adecuado que produzca una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejemplo, uno, dos o tres de c94, H145 y H157 pueden cambiarse a un aminoácido pequeño, tal como Gly o Ala. Por consiguiente, la proteína spr puede presentar una, dos o tres de las mutaciones que producen C94A (es decir, una cisteína en la posición 94 cambia a alanina), H145A (es decir, una histidina en la posición 145 cambia a alanina) y H157A (es decir, una histidina en la posición 157 camba a alanina). Preferiblemente, el gen spr comprende la mutación de sentido erróneo que conduce a H145A, que se ha descubierto que produce una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado.

La designación de un mutante de sustitución en la presente consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra indica el aminoácido en la proteína de tipo salvaje. El número se refiere a la posición del aminoácido en que se está realizando esa sustitución de aminoácido, y la segunda letra indica el aminoácido que se emplea para reemplazar al aminoácido de tipo salvaje.

En la presente también se describe una proteína spr mutante que comprende un cambio en uno o más aminoácidos seleccionados de N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147, preferiblemente un cambio de uno o más aminoácidos seleccionados de S95, V98, Y115, D133, V135 y G147. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no presenta ninguna otra mutación. Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender:

una mutación que afecta al aminoácido N31; o

una mutación que afecta al aminoácido R62; o

una mutación que afecta al aminoácido 170; o

una mutación que afecta al aminoácido Q73; o

una mutación que afecta al aminoácido S95; o

una mutación que afecta al aminoácido V98; o

una mutación que afecta al aminoácido Q99; o

una mutación que afecta al aminoácido R100; o

una mutación que afecta al aminoácido L108; o

una mutación que afecta al aminoácido Y115; o

una mutación que afecta al aminoácido D133; o

una mutación que afecta al aminoácido V135; o

una mutación que afecta al aminoácido L136; o

• una mutación que afecta al aminoácido G140; o

• una mutación que afecta al aminoácido R144; o

• una mutación que afecta al aminoácido G147.

En una descripción, el gen spr mutante comprende múltiples mutaciones que afectan a los aminoácidos:

5 • S95 y Y115; o

• N31, Q73, R100 y G140 ; o

• Q73, R100 y G140; o

• R100 y G140; o

• Q73 y G140; o

10 • Q73 y R100;o

• R62, Q99 y R144;o

• Q99 y R144.

Uno o más de los aminoácidos N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147 pueden cambiarse a cualquier aminoácido adecuado que produzca una proteína spr capaz de suprimir 15 el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejemplo, uno o más de N31, R62, I70, Q73, S95,

V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 y R144 pueden cambiarse a un aminoácido pequeño, tal como Gly o Ala.

En la presente también se describe una proteína spr que comprende uno o más de los siguientes cambios: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D o V135G, L136P, G140C, R144C y 20 G147C. Preferiblemente, la proteína spr comprende uno o más de los siguientes cambios: S95F, V98E, Y115F,

D133A, V135D o V135G y G147C. En este caso, la proteína spr preferiblemente no presenta ningún otro cambio de aminoácido.

En un caso, la proteína spr solo presenta un cambio de aminoácido seleccionado de N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D o V135G, L136P, G140C, R144C y G147C, en 25 particular C94A. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no presenta ningún otro cambio de aminoácido.

En la presente también se describe una proteína spr que presenta múltiples cambios seleccionados de:

• S95FyY115F

• N31Y, Q73R, R100G y G140C;

• Q73R, R100G y G140C;

30 • R100G y G140C;

• Q73R y G140C;

• Q73R y R100G;

• R62C, Q99P y R144C; o

• Q99P y R144C.

35 Preferiblemente, el gen spr mutante codifica una proteína spr que presenta un cambio de aminoácido seleccionado de C94A, D133A, H145A y H157A, en particular C94A

Otro caso descrito es un gen spr mutado que codifica una proteína spr que presenta el cambio de aminoácido W174R. En una descripción alternativa, la proteína spr no presenta el cambio de aminoácido W174R.

La célula según la presente invención presenta una actividad de proteína Tsp reducida comparada con una célula de 40 tipo salvaje. La expresión "actividad de proteína Tsp reducida comparada con una célula de tipo salvaje" significa que la actividad Tsp de la célula es menor, comparada con la actividad Tsp de una célula de tipo salvaje. La célula puede modificarse mediante de cualquier medio adecuado para reducir la actividad de Tsp.

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En una realización, la actividad Tsp reducida surge de la modificación del polinucleótido endógeno que codifica Tsp y/o secuencias de expresión reguladoras asociadas. La modificación puede reducir o detener la transcripción y traducción del gen Tsp, o puede proporcionar una proteína Tsp expresada con menor actividad proteasa, comparada con la proteína Tsp de tipo salvaje.

En una realización, una secuencia de expresión reguladora asociada se modifica para reducir la expresión de Tsp. Por ejemplo, el promotor para el gen Tsp puede mutarse para evitar la expresión del gen.

En una realización preferida, la célula según la presente invención porta un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene una actividad proteasa reducida o un gen Tsp mutado inactivado. Preferiblemente, se muta el gen Tsp cromosómico.

Tal como se emplea en la presente, un "gen Tsp" significa un gen que codifica la proteasa Tsp (también conocida como Prc) que es una proteasa periplásmica capaz de actuar sobre la proteína-3 de unión a penicilina (PBP3) y las proteínas de la cola de fagos. La secuencia del gen Tsp de tipo salvaje se muestra en SEQ ID NO:25, y la secuencia de la proteína Tsp de tipo salvaje se muestra en SEQ ID NO:26.

La referencia al gen Tsp mutado o un gen Tsp mutado que codifica Tsp indica un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp con una actividad proteasa reducida o un gen Tsp mutado inactivado, a menos que se indique lo contrario.

La expresión "gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene una actividad proteasa reducida", en el contexto de la presente invención, significa que el gen Tsp mutado no posee la actividad proteasa completa, comparado con el gen Tsp no mutado de tipo salvaje.

Preferiblemente, el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos, o 5% o menos de la actividad proteasa de una proteína Tsp no mutada de tipo salvaje. Más preferiblemente, el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que no tiene actividad proteasa. En esta realización, la célula no es deficiente en Tsp cromosómico, es decir, la secuencia del gen Tsp no ha sido delecionada ni mutada para evitar la expresión de cualquier forma de proteína Tsp.

Puede introducirse cualquier mutación adecuada en el gen Tsp para producir una proteína que tenga actividad proteasa reducida. La actividad proteasa de una proteína Tsp expresada por una bacteria gram-negativa puede ser ensayada con facilidad por los expertos en la técnica mediante cualquier método adecuado en la técnica, tal como el método descrito en Keiler et al. (Keiler y Sauer, 28864-28868), en el que se ensaya la actividad proteasa de Tsp.

En Keiler et al. (supra) se ha indicado que Tsp presenta un sitio activo que comprende los restos S430, D441 y K455, y los restos G375, G376, E433 y T452 son importantes para mantener la estructura de Tsp. Keiler et al. (supra) indican que han descubierto que los genes Tsp mutados que conducen a los cambios de aminoácidos S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A y T452A no tienen actividad proteasa detectable. También indican que el gen Tsp mutado que conduce a S430C muestra aproximadamente 5-10% de la actividad del tipo salvaje. Por consiguiente, la mutación de Tsp para producir una proteína que tenga una actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de sentido erróneo que conduzca a un cambio de uno o más de los restos S430, D441, K455, G375, G376, E433 y T452. Preferiblemente, la mutación de Tsp para producir una proteína que tenga una actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de sentido erróneo que afecta a uno, dos o tres de los restos del sitio activo S430, D441 y K455.

Por consiguiente, el gen Tsp mutado puede comprender:

una mutación que afecta al aminoácido S430; o

una mutación que afecta al aminoácido D441; o

una mutación que afecta al aminoácido K455; o

una mutación que afecta a los aminoácidos S430 y D441; o

una mutación que afecta a los aminoácidos S430 y K455; o

una mutación que afecta a los aminoácidos D441 y K455; o

una mutación que afecta a los aminoácidos S430, D441 y K455.

Pueden cambiarse uno o más de los restos S430, D441, K455, G375, G376, E433 y T452 a cualquier aminoácido adecuado que produzca una proteína que tenga actividad proteasa reducida. Los ejemplos de cambios adecuados son S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A y T452A. El gen Tsp mutado puede comprender una, dos o tres mutaciones que conducen a cambios en los restos del sitio activo, por ejemplo, el gen puede comprender:

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• S430A o S430C; y/o

• D441A; y/o

• K455A o K455H o K455R.

Preferiblemente, el gen Tsp presenta una mutación que conduce a S430A o S430C.

La expresión "gen Tsp mutado inactivado", en el contexto de la presente invención, significa que el gen Tsp comprende una o más mutaciones que evitan la expresión de la proteína Tsp codificada por el gen de tipo salvaje para proporcionar una célula deficiente en la proteína Tsp. El gen inactivado puede ser parcial o completamente transcrito pero no traducido en la proteína codificada. El gen Tsp mutado inactivado puede mutarse de cualquier forma adecuada, por ejemplo, mediante una o más mutaciones de deleción, inserción, puntuales, de sentido erróneo, sin sentido y de desplazamiento de marco, para que no produzca la expresión de la proteína. Por ejemplo, el gen puede inactivarse mediante la inserción de una secuencia de ADN extraña, tal como un marcador de resistencia a antibióticos, en la secuencia codificadora del gen.

En una realización preferida, el gen Tsp no se muta mediante la inserción de una secuencia de ADN extraña, tal como un marcador de resistencia a antibióticos, en la secuencia codificadora del gen. En una realización, el gen Tsp comprende una mutación en el codón de inicio del gen y/o en uno o más codones de fin colocados cadena abajo del codón de inicio del gen y cadena arriba del codón de fin del gen, evitando con ello la expresión de la proteína Tsp. La mutación en el codón de inicio puede ser una mutación de sentido erróneo de uno, dos o tres de los nucleótidos del codón de inicio. Como alternativa, o además, el codón de inicio puede mutarse mediante una mutación de desplazamiento de marco de inserción o de deleción. El gen Tsp comprende dos codones ATG en el extremo 5' de la secuencia codificadora, y uno o ambos de los codones ATG pueden mutarse mediante una mutación de sentido erróneo. El gen Tsp puede mutarse en el segundo codón ATG (codón 3) a TCG, tal como se muestra en la figura 10. El gen Tsp puede comprender, como alternativa o además, uno o más codones de fin colocados cadena abajo del codón de inicio del gen y cadena arriba del codón de fin del gen. Preferiblemente, el gen Tsp mutado inactivado comprende una mutación de sentido erróneo en el codón de inicio y uno o más codones de fin insertados. En una realización preferida, el gen Tsp se muta para delecionar "T" del quinto codón, provocando con ello un desplazamiento de marco que produce codones de fin en los codones 11 y 16, tal como se muestra en la figura 10. En una realización preferida, el gen Tsp se muta para insertar un sitio de restricción Ase I para crear un tercer codón de fin dentro de marco en el codón 21, tal como se muestra en la figura 10.

En una realización preferida, el gen Tsp mutado inactivado tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO:25, que incluye los 6 nucleótidos ATGAAT cadena arriba del codón de inicio. Las mutaciones que se han realizado en la secuencia Tsp mutada inactivada de SEQ ID NO:25 se muestran en la figura 10. En una realización, el gen Tsp mutado tiene la secuencia de ADN de los nucleótidos 7 a 2048 de SEQ ID NO:25.

En la presente también se describe una célula que comprende un gen DegP mutado. Tal como se emplea en la presente, "DegP" significa un gen que codifica la proteína DegP (también conocida como HtrA), que tiene una función dual como chaperona y proteasa. La secuencia del gen DegP de tipo salvaje se muestra en sEq ID NO:29, y la secuencia de la proteína DegP no mutada se muestra en SEQ ID NO:30.

A bajas temperaturas, DegP actúa como chaperona, y a altas temperaturas DegP tiene preferencia por actuar como una proteasa.

En la presente también se describe una célula que comprende la mutación de DegP, en la que la mutación de DegP en la célula proporciona un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad chaperona pero no actividad proteasa completa.

La expresión "tiene actividad chaperona", en el contexto de la presente invención, significa que la proteína DegP mutada tiene la misma, o sustancialmente la misma actividad chaperona, comparada con la proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 90% o more, o 95% o más de la actividad chaperona de la proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene la misma actividad chaperona cuando se compara con la DegP de tipo salvaje.

La expresión "tiene actividad proteasa reducida", en el contexto de la presente invención, significa que la proteína DegP mutada no presenta la actividad proteasa completa cuando se compara con la proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos, o 5% o menos de la actividad proteasa de una proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP sin actividad proteasa. La célula no se deficiente en DegP cromosómico, es decir, la secuencias del gen DegP no han sido delecionadas ni mutadas para evitar la expresión de cualquier forma de proteína DegP.

Puede introducirse cualquier mutación adecuada en el gen DegP para producir una proteína que tenga actividad chaperona y una actividad proteasa reducida. La actividad proteasa y chaperona de una proteína DegP expresada

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por una bacteria gram-negativa puede ser ensayada con facilidad por los expertos en la técnica mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, en el que las actividades proteasa y chaperona de DegP se ensayan sobre MalS, un sustrato natural de DegP.

DegP es una serina proteasa y tiene un centro activo que consiste en la tríada catalítica de los restos aminoácidos His105, Asp135 y Ser210. La mutación de DegP para producir una proteína que tenga actividad chaperona y una actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de sentido erróneo que afecta a uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210.

Por consiguiente, el gen DegP mutado puede comprender:

una mutación que afecta al aminoácido His105; o

una mutación que afecta al aminoácido Asp135; o

una mutación que afecta al aminoácido Ser210; o

una mutación que afecta a los aminoácidos His105 y Asp135; o

una mutación que afecta a los aminoácidos His105 y Ser210; o

una mutación que afecta a los aminoácidos Asp135 y Ser210; o

una mutación que afecta a los aminoácidos His105, Asp135 y Ser210.

Uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210 pueden cambiarse a cualquier aminoácido adecuado que produzca una proteína que tenga actividad chaperona y una actividad proteasa reducida. Por ejemplo, uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210 pueden cambiarse a un aminoácido pequeño, tal como Gly o Ala. Otra mutación adecuada consiste en cambiar uno, dos o tres de His 105, Asp135 y Ser210 a un aminoácido que tenga propiedades opuestas, tal como cambiar Asp135 a Lys o Arg, cambiar His105 polar a un aminoácido no polar, tal como Gly, Ala, Val o Leu, y cambiar Ser210 hidrófilo pequeño a un resto hidrófobo grande o hidrófobo, tal como Val, Leu, Phe o Tyr. Preferiblemente, el gen DegP comprende la alteración S210A, tal como se muestra en la figura 11, que se ha descubierto que produce una proteína con actividad chaperona, pero no con actividad proteasa.

DegP presenta dos dominios PDZ, PDZ1 (restos 260-358) y PDZ2 (restos 359-448), que median en la interacción proteína-proteína. En una realización de la presente invención, el gen degP se muta para delecionar el dominio PDZ1 y/o el dominio PDZ2. La deleción de PDZ1 y PDZ2 produce la pérdida completa de actividad proteasa de la proteína DegP y una actividad chaperona menor, comparada con la proteína DegP de tipo salvaje, mientras que la deleción de una u otra PDZ1 o pDZ2 produce 5% de la actividad proteasa y una actividad chaperona similar a la proteína DegP de tipo salvaje.

El gen DegP mutado también puede comprender un sitio de restricción no natural silencioso, tal como Ase I, para ayudar en los métodos de identificación y selección, por ejemplo, tal como se muestra en la figura 11.

La secuencia preferida del gen DegP mutado que comprende la mutación puntual S210A y un sitio de marcador de restricción Ase I se proporciona en SEQ ID NO:31, y la secuencia de proteína codificada se muestra en SEQ ID NO:27. Las mutaciones que se han realizado en la secuencia de DegP mutada de SEQ ID NO:32 se muestran en la figura 11.

En otras descripciones de la presente, la célula comprende un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad chaperona y una actividad proteasa reducida, y una o más de las células proporcionadas por la presente invención pueden proporcionar un mayor rendimiento de proteínas correctamente plegadas procedentes de la célula, con relación a las células mutadas en las que el gen DegP ha sido mutado para inactivar DegP evitando la expresión de DegP, tales como células deficientes en DegP cromosómico. En una célula que comprende un gen DegP mutado inactivado que evita la expresión de DegP, la actividad chaperona de DegP se pierde completamente, mientras que en la célula según la presente descripción, la actividad chaperona de DegP se mantiene al mismo tiempo que se pierde la actividad proteasa completa. En estas realizaciones, una o más células según la presente descripción presentan una actividad proteasa menor para evitar la proteolisis de la proteína, al mismo tiempo que mantienen la actividad chaperona para permitir el plegamiento correcto y el transporte de la proteína en la célula hospedante.

En la presente también se describe una célula bacteriana gram-negativa según las anteriores descripciones que no porta un gen OmpT mutado inactivado, tal como una célula que es deficiente en OmpT cromosómico de SEQ ID NO:39.

En la presente también se describe una célula bacteriana gram-negativa según se describe en los párrafos anteriores, que no porta un gen DegP mutado inactivado, tal como una célula que es deficiente en degP cromosómico. En la presente también se describe una célula bacteriana gram-negativa según los párrafos

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anteriores, que no porta un gen DegP mutado.

En la presente también se describe una célula bacteriana gram-negativa según los párrafos anteriores, que no porta un gen ptr mutado inactivado, tal como una célula que es deficiente en ptr cromosómico.

En la presente también se describe una célula bacteriana gram-negativa según los párrafos anteriores, que no porta un gen spr mutado.

Puede emplearse cualquier bacteria gram-negativa adecuada como célula parental para producir la célula recombinante de la presente invención. Las bacterias gram-negativas adecuadas incluyen Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y E. coli. Preferiblemente, la célula parental es E. coli. Puede emplearse cualquier cepa adecuada de E. coli en la presente invención, pero preferiblemente se utiliza una cepa W3110 de tipo salvaje, tal como K-12 W3110.

Un inconveniente asociado con las cepas previamente creadas y empleadas para expresar proteínas recombinantes implica el uso de mutaciones de genes implicados en el metabolismo celular y la replicación del ADN, tales como, por ejemplo, phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi y pro en cepas de E. coli. Estas mutaciones pueden tener efectos perjudiciales en la célula hospedante, que incluyen efectos sobre el crecimiento celular, la estabilidad, la infiltración periplásmica, el rendimiento de expresión de la proteína recombinante y la toxicidad. Las cepas que poseen una o más de estas mutaciones genómicas, en particular las cepas que poseen un gran número de estas mutaciones, pueden mostrar una falta de aptitud que reduce la tasa de crecimiento bacteriano a un nivel que no es adecuado para la producción industrial de proteínas. Además, cualquiera de las anteriores mutaciones genómicas puede afectar a otros genes en cis y/o en trans de maneras impredecibles y perjudiciales, alterando con ello el fenotipo, la aptitud y el perfil de proteínas de la cepa. Además, el uso de células muy mutadas no es adecuado, en general, para producir proteínas recombinantes para un uso comercial, en particular productos terapéuticos, porque dichas cepas, en general, presentan unas vías metabólicas defectuosas y, por tanto, pueden tener un crecimiento bajo o nulo en medios mínimos o químicamente definidos.

En una realización preferida, las células portan solo las mutaciones mínimas para introducir el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y dichos uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, y una mutación que produce como resultado una actividad Tsp proteasa reducida y uno de sus spr mutantes.

En una realización, en la que el polinucleótido que codifica DsbC y/o dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, se insertan en el genoma de la célula, solo se realizan mutaciones mínimas en el genoma de la célula para introducir el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y/o el anticuerpo. En otra realización, en la que el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo están presentes en el mismo vector de expresión o en vectores de expresión diferentes, el genoma es preferiblemente isogénico con el genoma de una célula de tipo salvaje.

En la presente se describen además células que no portan ninguna otra mutación que pueda tener efectos perjudiciales sobre el crecimiento y/o la capacidad de una célula para expresar una proteína de interés. Por consiguiente, una o más de las células hospedantes recombinantes de la presente invención pueden mostrar una mayor expresión de proteínas y/o unas mejores características de crecimiento, comparadas con células que comprende mutaciones introducidas por ingeniería genética en la secuencia genómica. Las células proporcionadas por la presente invención también son más adecuadas para su uso para producir proteínas terapéuticas, comparadas con células que comprenden alteraciones en el genoma celular.

En una realización preferida, la célula es isogénica con una célula de E. coli de tipo salvaje, excepto por el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y una mutación que produce como resultado una actividad Tsp proteasa reducida y uno de sus genes spr mutantes.

En una realización se proporciona una célula isogénica con una cepa W3110 de E. coli, excepto que presenta una actividad Tsp reducida y un spr mutante, para su uso con un plásmido adecuado para expresar DsbC y un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154.

En la presente también se describe una célula isogénica con una cepa W3110 de E. coli, excepto por el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154.

La célula proporcionada por la presente invención comprende uno o más polinucleótidos que codifican un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo con especificidad por CD 154.

Tal como se emplea en la presente, "una célula que comprende" significa que la entidad referida está integrada en el genoma de la célula o que la célula contiene un vector, tal como un plásmido, que contiene la entidad y en general la expresa.

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El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo multivalente, multiespecífico, humanizado, totalmente humano o quimérico. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede proceder de cualquier especie, pero preferiblemente se deriva de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano o un fragmento humanizado. El fragmento de anticuerpo puede derivarse de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclase de moléculas de inmunoglobulina y puede obtenerse a partir de cualquier especie que incluye, por ejemplo, ratón, rata, tiburón, conejo, cerdo, hámster, camello, llama, cabra o ser humano. Las partes del fragmento de anticuerpo pueden obtenerse de más de una especie, por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser quiméricos. En un ejemplo, las regiones constantes proceden de una especie y las regiones variables de otra especie.

El fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 o Fv; un monómero o dímero de cadena ligera o de cadena pesada; así como un diacuerpo; triacuerpo; tetracuerpo; minicuerpo; anticuerpo de dominio o anticuerpo monocatenario, por ejemplo, un Fv monocatenario en el que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un conector peptídico, Fab-Fv, o un anticuerpo de especificidad dual, tal como un Fab-dAb, según se describe en el documento Wo 2009/040562. De modo similar, las regiones variables de cadena pesada y ligera pueden combinarse con otros dominios de anticuerpos según sea apropiado. Los fragmentos de anticuerpos son conocidos en la técnica (Holliger y Hudson, 1126-1136).

El anticuerpo que se une específicamente a CD154 es preferiblemente el anticuerpo 342 descrito en el documento WO 2008/118356 o comprende las CDR o regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo 342 descrito en el documento WO 2008/118356. El fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD154 preferiblemente se deriva del anticuerpo 342 descrito en el documento WO 2008/118356 y/o comprende las CDR o regiones variables de cadena pesada y ligera de dicho anticuerpo.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD154 comprende una cadena pesada, en la que el dominio variable comprende tres CDR, en las que las CDR se seleccionan de SEQ ID NO:1 para CDRH1, SEQ ID NO:2 para CDRH2 y SEQ ID NO:3 para CDRH3.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD154 comprende una cadena ligera, en la que el dominio variable comprende tres CDR, en las que las CDR se seleccionan de SEQ ID NO:4 para CDRL1, SEQ ID NO:5 para CDRL2 y SEQ ID NO:6 para CDRL3.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD154 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 para CDRH1, la secuencia de SEQ ID NO:2 para CDRH2 y la secuencia de SEQ ID NO:3 para CDRH3.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD154 comprende una cadena ligera comprende la secuencia de SEQ ID NO:4 para CDRL1, la secuencia de SEQ ID NO:5 para CDRL2 y la secuencia de SEQ ID NO:6 para CDRL3.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD154 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 para CDRH1, la secuencia de SEQ ID NO:2 para CDRH2 y la secuencia de SEQ ID NO:3 para CDRH3, y una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4 para CDRL1, la secuencia de SEQ ID NO:5 para CDRL2 y la secuencia de SeQ ID NO:6 para CDRL3.

El anticuerpo es preferiblemente una molécula de anticuerpo injertada con CDR y generalmente el dominio variable comprende regiones de marco aceptoras humanas y CDR donadoras no humanas.

Preferiblemente, el anticuerpo comprende el dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO:7) y el dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO:9).

Preferiblemente, el anticuerpo es un fragmento Fab. Preferiblemente, el fragmento Fab presenta una cadena pesada que comprende o que consiste en la secuencia indicada como SEQ ID NO:14, y una cadena ligera que comprende o que consiste en la secuencia indicada como SEQ ID NO:12. Las secuencias de aminoácidos que aparecen en SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:12 son preferiblemente codificadas por las secuencias de nucleótidos que aparecen en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:11, respectivamente.

Como alternativa, se prefiere que el fragmento de anticuerpo sea un fragmento Fab modificado, en el que la modificación es la adición en el extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora o indicadora. Preferiblemente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más restos cisteína a los cuales puede unirse la molécula efectora o indicadora, tal como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 98/25971).

La célula según la presente invención comprende una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo. Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo.

En una realización preferida, la secuencia de ADN codifica una cadena ligera y comprende la secuencia mostrada en la presente.

La secuencia de ADN puede comprender ADN sintético, por ejemplo, producido por medio de procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquiera de sus combinaciones.

Los dominios de región constante del anticuerpo, si están presentes, pueden seleccionarse tomando en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo y, en particular, las funciones efectoras que puedan ser necesarias. 5 Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanas. En particular, pueden emplearse los dominios de región constante de IgG humana, en especial de los isotipos IgG1 e IgG3 cuando esté previsto que la molécula anticuerpo se dirija a usos terapéuticos y sean necesarias las funciones efectoras del anticuerpo. Como alternativa, pueden emplearse los isotipos IgG2 e IgG4 cuando esté previsto que la molécula anticuerpo se dirija a objetivos terapéuticos y no sean necesarias las funciones efectoras del anticuerpo, 10 por ejemplo, simplemente para bloquear la actividad CD154.

El anticuerpo puede ser útil en el tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunológicos, trastornos fibróticos y cánceres.

Las expresiones "enfermedad inflamatoria" o "trastorno autoinmunológico" y "enfermedad o trastorno inmunológico" incluyen la artritis reumatoide, artritis psoriática, espondilitis anquilosante, artritis juvenil, enfermedad de Still, tiroiditis 15 de Hashimoto, enfermedad de Graves, síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, vasculitis, que incluye vasculitis asociada a ANCA y granulomatosis de Wegener, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmunológica, polimialgia reumática, síndrome de Guillain-Barre, síndrome antifosfolípidos, trombocitopenia idiopática, anemia hemolítica autoinmunológica, anemia perniciosa, pénfigo vulgar, dermatomiositis, penfigoide bulloso, púrpura de Henoch-Schonlein, enfermedad de Muckle Wells, psoriasis, 20 enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, LES (lupus eritematoso sistémico), enfermedad celíaca, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, esclerosis múltiple, vasculitis, diabetes mellitus de tipo I, transplantes y enfermedad del injerto frente al receptor.

La expresión "trastorno fibrótico", tal como se emplea en la presente, se refiere a un trastorno que se caracteriza por la formación o el desarrollo de un exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o un tejido, con frecuencia como 25 un proceso reparador o reactivo. Un trastorno fibrótico puede afectar a órganos individuales, tales como los pulmones (por ejemplo, sin limitación, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar intersticial), el hígado, el intestino, el riñón, el corazón o la piel, o afectar a múltiples órganos, por ejemplo y sin limitación, en la esclerosis sistémica. La expresión trastornos fibrótico también se relaciona con la formación de cicatrices en la piel. Las cicatrices de la piel incluyen, pero no se limitan a cicatrices queloides, cicatrices de contractura que aparecen, por 30 ejemplo y sin limitación, después de quemaduras de la piel, cicatrices hipertróficas y cicatrices del acné.

La célula hospedante de la invención también puede comprender otro polinucleótido que codifica una o más proteínas de interés adicionales.

La célula bacteriana gram-negativa recombinante según la presente invención puede producirse mediante cualquier medio adecuado.

35 Los expertos en la técnica conocen técnicas adecuadas que pueden emplearse para insertar el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo. El polinucleótido recombinante que codifica DsbC y/o el polinucleótido que codifica el anticuerpo pueden integrarse en el genoma de la célula empleando un vector adecuado, tal como pKO3 descrito en Link et al. (Link, Phillips, y Church, 6228-6237).

Como alternativa o además, el polinucleótido recombinante que codifica DsbC y/o el polinucleótido que codifica el 40 anticuerpo pueden no estar integrados en un módulo de expresión recombinante. En una realización, se emplea un módulo de expresión en la presente invención para portar el polinucleótido que codifica DsbC y/o el polinucleótido que codifica el anticuerpo que generalmente comprende una secuencia codificadora de proteína que codifica DsbC, una o más secuencias codificadoras de proteínas que codifican el anticuerpo y una o más secuencias reguladoras de la expresión reguladoras. Dichas una o más secuencias reguladoras de la expresión pueden incluir un promotor. 45 Dichas una o más secuencias reguladoras de la expresión pueden incluir además una región 3' no traducida, tal como una secuencia de terminación. Los promotores adecuados se analizan con más detalle a continuación.

En una realización, el gen que codifica DsbC y/o el anticuerpo, o uno de sus fragmentos, se integran en el genoma de la célula hospedante para crear una línea celular estable.

En una realización, la célula según la presente invención comprende uno o más vectores de expresión, tales como 50 un plásmido. El vector comprende preferiblemente uno o más de los módulos de expresión definidos anteriormente. La célula hospedante preferiblemente comprende un vector de expresión que comprende un ADN que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, tal como se describió anteriormente. Preferiblemente, el vector de expresión comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera y una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena pesada del anticuerpo, o uno 55 de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154.

En una realización preferida, el vector de expresión es un vector de expresión de E. coli.

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En una realización, la secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo y el polinucleótido que codifica DsbC se insertan en vectores de expresión distintos.

Para la producción de productos que comprenden cadenas pesadas y ligeras, la línea celular puede transformarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Como alternativa, puede emplearse un solo vector, y el vector incluye secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

Como alternativa, la secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo y el polinucleótido que codifica DsbC se insertan en un solo vector. Preferiblemente, el vector comprende las secuencias que codifican los polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada del anticuerpo.

La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC y un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154. El vector de expresión es un vector multicistrónico que comprende la secuencia polinucleotídica que codifica DsbC y la secuencia polinucleotídica que codifica el anticuerpo.

El vector multicistrónico puede ser producido por medio de un método de clonación ventajoso que permita la clonación secuencial repetida de secuencias polinucleotídicas en un vector. El método emplea extremos cohesivos compatibles de un par de sitios de restricción, tales como los extremos "AT" de los sitios de restricción Ase I y Nde I. Un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora y que tiene extremos cohesivos compatibles, tal como un fragmento Asel-Ndel, puede clonarse en un sitio de restricción en el vector, tal como Nde I. La inserción de la secuencia polinucleotídica destruye el sitio de restricción 5', pero crea un nuevo sitio de restricción 3', tal como Ndel, que entonces puede emplearse para insertar otra secuencia polinucleotídica que comprende extremos cohesivos compatibles. El proceso entonces puede repetirse para insertar más secuencias. Cada secuencia polinucleotídica insertada en el vector comprende la secuencia no codificadora 3' con respecto al codón de fin, que puede comprender un sitio Ssp I para la selección, una secuencia de unión a ribosomas de Shine Dalgarno, un espaciador rico en A y un sitio Ndel que codifica un codón de inicio.

En la figura 1 se muestra una representación en forma de diagrama de la creación de un vector que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera de un anticuerpo (LC), una cadena pesada de un anticuerpo (HC), una secuencia polinucleotídica de DsbC y otra secuencia polinucleotídica.

La célula según la presente invención comprende preferiblemente un vector de expresión tal como se definió anteriormente.

En la presente también se describe una célula, en la que la célula también expresa una o más proteínas adicionales como sigue:

• una o más proteínas capaces de facilitar la formación de enlaces disulfuro, tales como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG;

y dichas una o más proteínas adicionales pueden expresarse a partir de dichos uno o más polinucleótidos insertados en el mismo vector que el polinucleótido que codifica DsbC y/o dichos uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154. Como alternativa, dichos uno o más polinucleótidos pueden insertarse en vectores distintos.

El vector de expresión puede producirse insertando uno o más módulos de expresión, tal como se definió anteriormente, en un vector adecuado. Como alternativa, las secuencias de expresión reguladoras para dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica pueden estar contenidas en el vector de expresión y, por tanto, solo puede ser necesaria la región codificadora del polinucleótido para completar el vector de expresión.

El polinucleótido que codifica DsbC y/o el polinucleótido que codifica el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, se inserta de modo adecuado en un vector replicable, generalmente un vector de expresión de replicación autónoma, para la expresión en la célula bajo el control de un promotor adecuado para la célula. En la técnica se conocen muchos vectores para este fin, y la selección del vector apropiado puede depender del tamaño del ácido nucleico y del tipo de célula concreta.

Los ejemplos de vectores de expresión que pueden emplearse para transformar la célula hospedante con un polinucleótido según la invención incluyen:

• un plásmido, tal como pBR322 o pACYC184 y/o

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• un vector vírico, tal como un fago bacteriano,

• un elemento genético transponible, tal como un transposón.

Estos vectores de expresión habitualmente comprenden un origen de la replicación del ADN del plásmido, un marcador seleccionable con antibiótico, un promotor y un terminador transcripcional separados por un sitio de multiclonación (módulo de expresión) y una secuencia de ADN que codifica un sitio de unión a ribosomas.

Los promotores empleados en la presente invención pueden unirse al polinucleótido pertinente directamente o, como alternativa, pueden localizarse en una posición apropiada, por ejemplo, en un vector, de modo que cuando el polipéptido pertinente se inserte, el promotor pertinente pueda actuar sobre él. En una realización, el promotor se localiza antes de la porción codificadora del polinucleótido sobre el cual actúa, por ejemplo, un promotor pertinente antes de cada porción codificadora del polinucleótido. "Antes", tal como se emplea en la presente, pretende insinuar que el promotor se localiza en el extremo 5' con relación a la porción codificadora del polinucleótido.

Los promotores pueden ser endógenos o exógenos a las células hospedantes. Los promotores adecuados incluyen lac, tac, trp, phoA, Ipp, Arab, tet y T7.

Uno o más de los promotores empleados pueden ser promotores inducibles. En la realización en la que el polinucleótido que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo se insertan en un vector, las secuencias de nucleótidos que codifican DsbC y el anticuerpo pueden estar bajo el control de un único promotor o de promotores distintos. En la realización en la que las secuencias de nucleótidos que codifican DsbC y el anticuerpo están bajo el control de promotores distintos, los promotores pueden ser independientemente promotores inducibles.

Los promotores para su uso en sistemas bacterianos en general también contienen una secuencia de Shine- Dalgamo (S.D.) unida operablemente al ADN que codifica el polipéptido de interés. El promotor puede retirarse del ADN fuente bacteriano mediante una digestión con enzimas de restricción e insertarse en el vector que contiene el ADN deseado.

El vector de expresión preferiblemente comprende además un mensaje dicistrónico para producir el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, tal como se describe en los documentos WO 03/048208 o WO 2007/039714. Preferiblemente, el cistrón cadena arriba contienen el ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón cadena abajo que contiene el ADN que codifica la correspondiente cadena pesada, y la secuencia intergénica dicistrónica ("intergenic sequence", IGS) preferiblemente comprende una secuencia seleccionada de IGS1 (SEQ ID NO:33), IGS2 (SEQ ID NO:34), IGS3 (SEQ ID NO:35) e IGS4 (SEQ ID NO:36).

Un vector de expresión preferible comprende un mensaje tricistrónico para producir la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo, o de uno de sus fragmentos de unión al antígeno, tal como se describió anteriormente, y un mensaje para producir la DsbC recombinante, que preferiblemente comprende un marcador de his.

Los terminadores pueden ser endógenos o exógenos a las células hospedantes. Un terminador adecuado es rrnB.

Pueden encontrarse otros reguladores transcripcionales adecuados, que incluyen promotores y terminadores, y métodos de transporte dirigido de proteínas en Makrides et al., que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad (Makrides, 512-538).

El polinucleótido de DsbC insertado en el vector de expresión preferiblemente comprende el ácido nucleico que codifica la secuencia señal de DsbC y la secuencia codificadora de DsbC. La proteína DsbC también puede dirigirse al periplasma por fusión genética con otros péptidos señal, por ejemplo, los de las proteínas: OmpA, MalB, PelB, PhoA, PhoS, LppA, DsbA. El vector preferiblemente contiene una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedantes seleccionados, preferiblemente que se replique independientemente del cromosoma del hospedante. Estas secuencias son muy conocidas para una diversidad de bacterias.

En una realización, la DsbC y/o la proteína de interés comprende un marcador de histidina en el N-terminal y/o C- terminal.

La molécula de anticuerpo puede segregarse de la célula o dirigirse al periplasma por medio de secuencias señal adecuadas. Como alternativa, las moléculas de anticuerpos pueden acumularse dentro del citoplasma de la célula. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo se dirige al periplasma.

El polinucleótido que codifica el anticuerpo puede expresarse como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que presente un sitio de corte específico en el N-terminal del polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una secuencia que sea reconocida y procesada por la célula hospedante. Para células hospedantes procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal del polipéptido nativo o eucariota, la secuencia señal es sustituida por una secuencia señal procariota. Las secuencias señal adecuadas incluyen OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA y DsbC. En una realización en la que la célula

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comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada del anticuerpo y un polinucleótido que codifica una cadena ligera del anticuerpo, cada polinucleótido puede comprender una secuencia señal, tal como OmpA.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente emplea técnicas de acoplamiento convencionales. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se cortan, se ajustan y se vuelven a acoplar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Los expertos en la técnica conocen los métodos generales por los cuales los vectores pueden construirse, así como los métodos de transfección y los métodos de cultivo.

Pueden usarse técnicas convencionales de la biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican el anticuerpo. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completamente o en parte empleando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Pueden emplearse las técnicas de mutagénesis específica dirigida a sitio y de reacción de cadena con polimerasa (PCR) según sea apropiado.

Las realizaciones de la invención descritas en la presente con referencia al polinucleótido se aplican igualmente a realizaciones alternativas de la invención, por ejemplo, vectores, módulos de expresión y/o células hospedantes que comprenden los componentes empleados en la presente, hasta el punto en que el aspecto pertinente pueda aplicarse a estos.

La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, que comprende:

cultivar una célula bacteriana gram-negativa recombinante, según se definió anteriormente, en un medio de cultivo bajo condiciones eficaces para expresar el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y el polinucleótido recombinante que codifica DsbC; y

recuperar el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, del periplasma de la célula bacteriana gram-negativa recombinante y/o del medio de cultivo.

La célula bacteriana gram-negativa y el anticuerpo preferiblemente empleados en el método de la presente invención se describieron con detalle anteriormente.

El polinucleótido recombinante que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, pueden incorporarse en la célula hospedante empleando cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Tal como se analizó anteriormente, en general, el polinucleótido que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo se incorporan como parte del mismo vector de expresión o de vectores de expresión diferentes, que son transformados en la célula.

El polinucleótido que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, pueden transformarse en una célula empleando técnicas convencionales, por ejemplo, empleando cloruro de rubidio, PEG o electroporación.

El método según la presente invención también puede emplear un sistema de selección para facilitar la selección de células estables que han sido transformados con éxito con el polinucleótido que codifica la proteína de interés. El sistema de selección generalmente emplea la cotransformación de un polinucleótido que codifica un marcador de selección. En una realización, cada polinucleótido transformado en la célula comprende además un polinucleótido que codifica uno o más marcadores de selección. Por consiguiente, la transformación de los polinucleótidos que codifican DsbC y el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y dichos uno o más polinucleótidos que codifican el marcador se produce conjuntamente, y el sistema de selección puede emplearse para seleccionar las células que producen las proteínas deseadas.

Las células capaces de expresar uno o más marcadores son capaces de sobrevivir/crecer/multiplicarse bajo ciertas condiciones impuestas de modo artificial, por ejemplo, la adición de una toxina o un antibiótico, debido a las propiedades otorgadas por el polipéptido/gen o componente polipeptídico del sistema de selección incorporado en ellas (por ejemplo, resistencia a antibióticos). Las células que no pueden expresar dichos uno o más marcadores no son capaces de sobrevivir/crecer/multiplicarse en las condiciones impuestas de modo artificial. Las condiciones impuestas de modo artificial pueden seleccionarse para que sean más o menos vigorosas, según sea necesario.

En la presente invención puede emplearse cualquier sistema de selección adecuado. Generalmente, el sistema de selección puede basarse en la inclusión en el vector de uno o más genes que proporcionan resistencia a un antibiótico conocido, por ejemplo, un gen de resistencia a tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina o ampicilina. Las células que crecen en presencia de un antibiótico pertinente pueden seleccionarse, puesto que expresan tanto el gen que confiere resistencia al antibiótico como la proteína deseada.

En la presente invención puede emplearse un sistema de expresión inducible o un promotor constitutivo para expresar el anticuerpo y/o la DsbC. Los sistemas de expresión inducible y los promotores constitutivos adecuados son muy conocidos en la técnica.

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En una realización en la que el polinucleótido que codifica DsbC y el polinucleótido que codifica el anticuerpo están bajo el control del mismo promotor inducible o de distintos promotores inducibles, la expresión del polinucleótido o polinucleótidos que codifican el anticuerpo y el polinucleótido recombinante que codifica DsbC es inducida por la adición de un inductor al medio de cultivo.

Puede emplearse cualquier medio adecuado para cultivar la célula transformada. El medio puede adaptarse para un sistema de selección específico, por ejemplo, el medio puede comprender un antibiótico, para permitir crecer en el medio solo a las células que han sido transformadas con éxito.

Las células obtenidas del medio pueden someterse a una posterior selección y/o purificación según sea necesario. El método puede comprender además una o más etapas para extraer y purificar la proteína de interés, según sea necesario.

El anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, puede recuperarse y purificarse de la cepa, incluyendo desde el citoplasma, el periplasma o el sobrenadante. Los métodos adecuados incluyen el fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; la precipitación con etanol; una HPLC en fase inversa; una cromatografía de interacción hidrófoba; una cromatografía en sílice; una cromatografía en una resina de intercambio iónico, tal como S-SEPHAROSE y DEAE; un cromatoenfoque; una precipitación con sulfato de amonio; y una filtración en gel.

En la presente se describe también un método que comprende además separar el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, de DsbC.

Los anticuerpos, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, pueden separarse de modo adecuado del medio de cultivo y/o de un extracto de citoplasma y/o de un extracto de periplasma mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de proteína G, cromatografía de proteína L, resinas de modo mixto tiofílicas, marcadores de His, marcadores FLAG, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad, fraccionamiento/precipitación en sulfato de amonio, etanol o PEG, membranas de intercambio iónico, cromatografía de adsorción de lecho expandido (EBA) o cromatografía de lecho móvil simulado.

El método también puede incluir otra etapa de medir la cantidad de expresión de la proteína de interés y seleccionar las células que presentan unos niveles de expresión altos de la proteína de interés.

Una o más de las etapas del método descrito en la presente pueden realizarse en combinación en un recipiente adecuado, tal como un biorreactor.

Después de la expresión, el anticuerpo puede procesarse aún más, por ejemplo, mediante conjugación con otra entidad, tal como una molécula efectora. Por consiguiente, el método según la presente invención puede comprender una etapa adicional de unir una molécula efectora al anticuerpo.

La expresión molécula efectora, tal como se emplea en la presente, incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano o vegetal y sus fragmentos, por ejemplo, ricina y sus fragmentos), proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros naturales o sintéticos, ácidos nucleicos y sus fragmentos, por ejemplo, ADN, ARN y sus fragmentos, radionúclidos, en particular radio-yodo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden ser detectados mediante espectroscopía de RMN o ESR. La molécula efectora puede unirse al anticuerpo, o a uno de sus fragmentos, mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede modificarse para unir al menos una molécula efectora, tal como se describe en los documentos WO 2005/003171 o WO 2005/003170. Los documentos WO 2005/003171 o WO 2005/003170 también describen moléculas efectoras adecuadas.

El anticuerpo puede tener un macrociclo para quelar un átomo de metal pesado o una toxina, tal como ricina, unidos a él mediante una estructura de puente covalente. Como alternativa, pueden emplearse procedimientos de la tecnología del ADN recombinante para producir una molécula de anticuerpo en la que el fragmento Fc (CH2, CH3 y dominios bisagra), los dominios CH2 y CH3 o el dominio CH3 de una molécula de inmunoglobulina completa han sido reemplazados por una proteína de inmunoglobulina no funcional, o esta ha sido unida a través de un enlace peptídico, tal como una enzima o una molécula de toxina. En la realización en la que el anticuerpo es un fragmento Fab modificado que presenta, en el extremo C-terminal de su cadena pesada, uno o más aminoácidos que permiten la unión de una molécula efectora o indicadora, los aminoácidos adicionales preferiblemente forman una región bisagra modificada que contiene uno o dos restos cisteína a los cuales puede unirse la molécula efectora o indicadora.

Un grupo efector preferido es una molécula de polímero que puede unirse al fragmento Fab modificado para aumentar su semivida in vivo.

En general, la molécula de polímero puede ser un polímero sintético o natural, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un

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polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo, un homo- o heteropolisacárido.

Los sustituyentes opcionales concretos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi. Los ejemplos concretos de polímeros sintéticos incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol, poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos, o sus derivados, en especial polietilenglicol opcionalmente sustituido, tal como metoxipolietilenglicol, o sus derivados. Los polímeros naturales concretos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o sus derivados. Los "derivados", tal como se emplea en la presente, incluyen los derivados reactivos, por ejemplo, grupos reactivos con tiol selectivos, tales como maleimidas. El grupo reactivo puede estar unido directamente o a través de un segmento conector al polímero. Se apreciará que el resto de dicho grupo, en algunos casos, formará parte del producto como el grupo conector entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero puede variar según se desee, pero en general estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50000 Da, preferiblemente de 5000 Da a 40000 Da, y más preferiblemente de 25000 Da a 40000 Da. El tamaño del polímero puede seleccionarse, en particular, basándose en el uso previsto del producto. Así, por ejemplo, cuando el producto está previsto para que abandone la circulación y penetre en un tejido, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de una inflamación, puede resultar ventajoso emplear un polímero de peso molecular bajo, por ejemplo, con un peso molecular de aproximadamente 5000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanece en la circulación, puede resultar ventajoso emplear un polímero con un peso molecular más alto, por ejemplo, que tenga un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.

Los polímeros particularmente preferidos incluyen un polímero de polialquileno, tal como polietilenglicol, o, en especial, un metoxipolietilenglicol, o uno de sus derivados, y en especial con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 25000 Da a aproximadamente 40000 Da.

Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede estar unida covalentemente al átomo de azufre de un resto cisteína localizado en el fragmento. El enlace covalente será, en general, un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono.

Cuando se desee, el fragmento de anticuerpo puede tener unida una o más moléculas efectoras o indicadoras. Las moléculas efectoras o indicadoras pueden estar unidas al fragmento de anticuerpo a través de cualquier grupo funcional de aminoácido terminal o cadena lateral de un aminoácido disponible localizado en el fragmento, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Una o más moléculas efectoras o indicadoras pueden unirse a un aminoácido en el extremo C-terminal o hacia el extremo C-terminal de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo.

Puede emplearse un polímero activado como material de partida para la preparación de fragmentos de anticuerpos modificados con polímeros, tal como se describió anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo al tiol, tal como un éster o ácido a-halocarboxílico, por ejemplo, yodoacetamida, una imida, por ejemplo, maleimida, una vinil sulfona o un disulfuro. Estos materiales de partida pueden obtenerse en el mercado (por ejemplo, en Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE. UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles en el mercado empleando procedimientos químicos convencionales.

Cuando se desee obtener un fragmento de anticuerpo unido a una molécula efectora o indicadora, este puede prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante o químicos convencionales, en los que el fragmento de anticuerpo se une directamente o a través de un agente de acoplamiento a la molécula efectora o indicadora antes o después de la reacción con el polímero activado, según sea adecuado. Los procedimientos químicos concretos incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento WO 93/62331 y WO 92/22583. Como alternativa, cuando la molécula efectora o indicadora es una proteína o un polipéptido, el enlace puede lograrse empleando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, tal como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP-A- 0392745.

Preferiblemente, el fragmento Fab modificado proporcionado por el método de la presente invención está PEGilado (es decir, tiene un PEG (polietilenglicol) unido covalentemente) según el método descrito en el documento EP-A- 0948544. Preferiblemente, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado PEGilado, tal como se muestra en la figura

2. Tal como se muestra en la figura 2, el fragmento Fab modificado lleva unido a uno de los restos cisteína del extremo C-terminal de la región bisagra modificada de la cadena pesada un grupo derivado de lisilo-maleimida, en el que cada uno de los dos grupos amino del resto lisilo lleva unido covalentemente un resto metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20000 Da, de modo que el peso molecular promedio total de los restos metoxipolietilenglicol es de aproximadamente 40000 Da, y más preferiblemente el grupo derivado de lisilo- maleimida es [1-[[[2-[[3-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)-1-oxopropil]amino]etil]amino]carbonil]-1,5-

pentanediil]bis(iminocarbonilo). Un resto lisina está unido covalentemente al grupo maleimida. A cada uno de los grupos amina en el resto lisina está unido un polímero de metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20000 Da. Por tanto, el peso molecular total de la molécula efectora completa es de aproximadamente 40000 Da.

Por consiguiente, el método según la presente invención comprende preferiblemente unir a uno de los restos

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cisteína en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en el que cada grupo amino del resto lisilo lleva unido covalentemente un resto metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20000 Da.

En una realización, una propiedad física de una proteína hospedante contaminante se altera mediante la adición de un marcador de aminoácido al extremo C-terminal o N-terminal. En una realización preferida, la propiedad física que se altera es el punto isoeléctrico, y el marcador de aminoácido es un marcador de poli(ácido aspártico) unido al C- terminal. En una realización, las proteínas de E. coli alteradas por la adición de dicho marcador son la proteína de unión a dipéptido (DppA), la proteína de unión a maltosa (MBP), la proteína de unión a tiorredoxina y fosfato (PhoS/PstS). En una realización específica, el pI de la proteína de unión a fosfato (PhoS/PstS) de E. coli se reduce de 7,2 a 5,1 mediante la adición de un marcador de poli(ácido aspártico) (poliD), que contiene 6 restos ácido aspártico en el C-terminal.

También se prefiere la modificación de restos específicos de la proteína de E. coli contaminante para alterar sus propiedades físicas, sola o en combinación con la adición de marcadores N- o C-terminales. Estos cambios pueden incluir inserciones o deleciones para alterar el tamaño de la proteína, o sustituciones de aminoácidos para alterar el pI o la hidrofobicidad. En una realización, estos restos se localizan sobre la superficie de la proteína. En una realización preferida, se alteran restos de la superficie de la proteína PhoS para reducir el pI de la proteína. Preferiblemente, se evitan los restos que se consideran importantes para la unión de fosfato (documento US 5.304.472) para mantener una proteína PhoS funcional.

Ejemplos

Líneas celulares

Para todos los experimentos se empleó la línea celular W3110 de E. coli como línea de células de tipo salvaje parental.

Se crearon líneas celulares que portan las siguientes mutaciones:

a. un gen Tsp mutado;

b. un gen Tsp mutado y que porta DsbC recombinante;

c. un gen Tsp mutado y un gen spr mutado;

d. un gen Tsp mutado y un gen spr mutado y que porta DsbC recombinante.

Ejemplo 1: Generación de una línea celular que porta el gen Tsp mutado MXE001 (ATsp)

Se generó la línea MXE001 como sigue:

El módulo de Tsp se movió como fragmentos de restricción Sal I, Not I a plásmidos pKO3 restringidos de modo similar. El plásmido pKO3 emplea el mutante sensible a la temperatura del origen de la replicación de pSC101 (RepA), junto con un marcador de cloranfenicol para forzar y seleccionar los acontecimientos de integración cromosómica. El gen sacB, que codifica la levansacarasa, es letal para E. coli cultivado sobre sacarosa y por tanto se emplea (junto con el marcador de cloranfenicol y el origen de pSC101) para forzar y seleccionar los acontecimientos de desintegración y de curación del plásmido. Esta metodología ha sido descrita previamente (Hamilton et al., 4617-4622; Blomfield et al., 1447-1457). El sistema de pKO3 elimina todos los marcadores selectivos del genoma del hospedante, excepto por el gen insertado.

Se construyeron los siguientes plásmidos:

pMXE191 comprende el gen Tsp mutado inactivado, tal como se muestra en SEQ ID NO:28, y comprende los marcadores de restricción EcoR I y Ase I.

El plásmido después se transformó en células W3110 de E. coli electrocompetentes preparadas empleando el método de Miller y Nickoloff, que se incorpora como referencia en la presente en su totalidad (Miller y Nickoloff, 105113).

Día 1: Se mezclan 40 pl de células de E. coli con (10 pg) 1 pl de ADN de pKO3 en una cubeta de electroporación enfriada BioRad de 0,2 cm antes de una electroporación a 2500 V, 25 pF y 200 O. Se añadieron inmediatamente 1000 pl de 2xPY, y las células se recuperaron mediante agitación a 250 rpm en un incubador a 30 °C durante 1 hora. Las células se diluyeron en serie 1/10 en 2xPY antes de que partes alícuotas de 100 pl fueran cultivadas en placas de agar 2xPY que contenían cloranfenicol a 20 pg/ml precalentadas a 30 °C y 43 °C. Las placas se incubaron durante la noche a 30 °C y 43 °C.

Día 2: El número de colonias cultivadas a 30 °C produjo un cálculo de la eficacia de la electroporación, mientas que las colonias que sobrevivieron cultivadas a 43 °C representan los acontecimientos de integración potenciales. Se

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eligieron colonias individuales de la placa de 43 °C y se resuspendieron en 10 ml de 2xPY. De esto, se extrajeron 100 |jl y se cultivaron en placas de agar 2xPY que contenían sacarosa al 5% (en p/v) precalentadas a 30 °C para generar colonias individuales. Las placas se incubaron durante la noche a 30 °C.

Día 3: En este punto, las colonias representan los acontecimientos de desintegración y de curación del plásmido simultáneos potenciales. Si los acontecimientos de desintegración y de curación se producen en un momento temprano del crecimiento, entonces la mayor parte de la masa de la colonia será clonal. Se escogieron colonias individuales y se cultivaron en placas por duplicado en agar 2xPY que contenía cloranfenicol a 20 jg/ml o sacarosa al 5% (en p/v). Las placas se incubaron durante la noche a 30 °C.

Día 4: Las colonias que crecen en sacarosa y mueren en cloranfenicol representan los acontecimientos de sustitución cromosómica y de curación del plásmido potenciales. Estas se eligieron y se seleccionaron mediante PCR con un oligonucleótido específico de mutación. Las colonias que generaron una banda de PCR positiva con el tamaño correcto se eligieron para producir colonias individuales en agar 2xPY que contenía sacarosa al 5% (en p/v) y las placas se incubaron durante la noche a 30 °C.

Día 5: Se emplearon colonias individuales positivas en PCR, sensibles a cloranfenicol y resistentes a sacarosa de E. coli para preparar disoluciones madre en glicerol, células químicamente competentes y para actuar como moldes de PCR para una reacción de PCR con cebadores oligonucleotídicos flanqueantes 5' y 3' para generar un producto de la PCR para dirigir la secuenciación directa del ADN empleando Taq polimerasa.

Se ensayó la cepa de células MXE001 para confirmar la modificación correcta del ADN genómico que porta el gen Tsp mutado mediante amplificación con PCR de la región del gen Tsp que comprende un sitio de restricción Ase I no natural (SEQ ID NO:28), empleando cebadores oligonucleotídicos. Las regiones amplificadas del ADN después se analizaron mediante una electroforesis en gel antes y después de una incubación con la enzima de restricción Ase I para confirmar la presencia del sitio de restricción Ase I no natural en los genes mutados. Este método se realizó como sigue:

Se emplearon los siguientes oligos para amplificar el ADN genómico, utilizando PCR, a partir de lisados de células de E. coli de MXE001 y W3110:

6284 Tsp 3' 5'-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3' (SEQ ID NO:47)

6283 Tsp 5' 5'-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3' (SEQ ID NO:48)

Los lisados se prepararon calentando una única colonia de células durante 10 minutos a 95 °C en 20 jl de tampón 1 x PCR. Se dejó que la mezcla se enfriase hasta la temperatura ambiente y después se centrifugó a 13.200 rpm durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y se etiquetó como "lisado celular".

Cada cepa se amplificó empleando la pareja de oligonucleótidos de Tsp.

El ADN se amplificó empleando un procedimiento de PCR convencional.

5 jl: Tampón x10 (Roche)

1 jl: Mezcla de dNTP (Roche, mezcla 10 mM)

1,5 jl: Oligo 5' (5 pmol)

1,5 jl: Oligo 3' (5 pmol)

2 jl: Lisado celular

0,5 jl: Taq ADN polimerasa (Roche 5 U/jl)

38,5 jl: H2O

Ciclo de PCR.

co 0 O: 1 minuto

CO 0 O: 1 minuto

en en 0 O: 1 minuto (repetir para 30 ciclos)

0 0 CM: 1 minuto

0 0 CM: 10 minutos

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Tras haber completado la reacción se retiraron 25 |jl a un nuevo tubo de microcentrífuga para la digestión con Ase I. A los 25 jl de la reacción de PCR se le añadieron 19 jl de H2O, 5 jl del tampón 3 (New England Biolabs®), 1 jl de Ase I (New England Biolabs®), se mezcló y se incubó a 37 °C durante 2 horas.

Al resto de la reacción de PCR se le añadieron 5 jl de tampón de carga (x6) y se cargaron 20 jl en un gel de agarosa TAE al 0,8% 200 ml (Invitrogen®) más bromuro de etidio (5 jl de una disolución madre 10 mg/ml) y se ejecutó a 100 V durante 1 hora. Se cargaron 10 jl del marcador de tamaño (marcador de ADN Perfect, 0,1-12 Kb, Novagen®) en el carril final.

Tras haber completado las digestiones con Ase I se añadieron 10 jl de tampón de carga (x6) y se cargaron 20 jl sobre un gel de agarosa TAE al 0,8% (Invitrogen® más bromuro de etidio (5 jl de una disolución madre 10 mg/ml) y se ejecutó a 100 V durante 1 hora. Se cargaron 10 jl del marcador de tamaño (marcador de ADN Perfect, 0,1-12 Kb, Novagen®) en el carril final. Ambos geles se visualizaron empleando un transluminador de UV.

El fragmento genómico amplificado mostró una banda del tamaño correcto de 2,8 Kb para Tsp. Tras la digestión con Ase I se confirmó la presencia de los sitios Ase I introducidos en la cepa deficiente en Tsp MXE001, pero no en el control de W3110.

MXE001: El ADN genómico se amplificó empleando el conjunto de cebadores de Tsp, y el ADN resultante se digirió con Ase I para producir bandas de 2,2 y 0,6 Kpb.

El ADN amplificado con PCR de W3110 no fue digerido por la enzima de restricción Ase I.

Ejemplo 2: Generación de líneas celulares que portan un gen spr mutado y de líneas celulares que portan un gen Tsp mutado y un gen spr mutado

Se generaron las mutaciones de spr y se seleccionaron para su utilización en un ensayo de complementación.

El gen spr (SEQ ID NO:23) fue mutado empleando un kit de PCR de diversidad de mutagénesis aleatoria de Clontech® que introduce de 1 a 2 mutaciones por 1000 pb. El ADN de PCR con spr mutado se clona en un vector de expresión inducible [pTTO CDP870] que expresa CDP870 Fab' (tal como se describe en el documento WO 01/94585) junto con el spr mutante. Este acoplamiento después se electrotransformó en una cepa de E. coli que comprende un variante de deleción de Tsp (ATsp) (denominada MXE001) preparada empleando el método de Miller et al. (Miller y Nickoloff, 105-113). Se empleó el siguiente protocolo: se añadieron 40 jl de MXE001 electrocompetente, 2,5 jl del acoplamiento (100 pg de ADN) a una cubeta de electroporación de 0,2 cm, se realizó la electrotransformación empleando BioRad® Genepulser Xcell® con las siguientes condiciones: 2500 V, 25 jF y 200 O. Después de la electrotransformación se añadió 1 ml de medio S.OC. (Invitrogen®, n.° de catálogo: 18045088) (precalentado hasta 37 °C) y se dejó que las células se recuperaron a 37 °C durante 1 hora con agitación suave.

Las células se cultivaron en placas de agar hipotónico [extracto de levadura 5 g/l, triptona 2,5 g/l, agar 15 g/l (todos de Difco®)] y se incubaron a 40 °C. Las células que formaron colonias se volvieron a cultivar en placa en HLB a 43 °C para confirmar el restablecimiento de la capacidad para crecer bajo condiciones osmóticas bajas a alta temperatura para la cepa MXE001. Se preparó el ADN plasmídico a partir de los clones seleccionados y se secuenció para identificar las mutaciones de spr.

Empleando este método se aislaron ocho mutaciones individuales, una mutación doble y dos mutaciones múltiples en la proteína spr que complementan al fenotipo ATsp como sigue:

1. V98E

2. D133A

3. V135D

4. V135G

5. G147C

6. S95FyY115F

7. I70T

8. N31T, Q73R, R100G, G140C

9. R62C, Q99P, R144C

10. L108S

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11. L136P

Se emplearon las mutaciones individuales 1 a 5 identificadas anteriormente y tres mutaciones en la tríada catalítica de spr (C94A, H145A, H157A) y W174R para generar nuevas cepas utilizando la cepa W3110 de E. coli de tipo salvaje (genotipo: F- LAM- IN (rrnD-rrnE)l rphl (ATCC, n.° de catálogo 27325) para crear cepas de spr mutado o la cepa MXE001 de ejemplo 1 para preparar cepas combinadas de ATsp/spr mutante.

Se generaron las siguientes cepas de células mutantes de E. coli empleando un sistema de vector de sustitución de genes usando el plásmido de sustitución/recombinación homóloga pKO3 (Link et al., supra), tal como se describe en el ejemplo 1, para la generación de MXE001.

Tabla 1

Cepa de E. coli mutante: Genotipo Vectores de spr

MXE001: ATsp -

MXE008: ATsp, spr D133A pMXE339, pK03 spr D133A (-SalI)

MXE009: ATsp, spr H157A pMXE345, pK03 spr H157A (-SalI)

MXE010: sprG147C pMXE338, pK03 spr G147C (-SalI)

MXE011: spr C94A pMXE343, pK03 spr C94A (-SalI)

MXE012: sprH145A pMXE344, pK03 spr H145A (-SalI)

MXE013: spr W174R pMXE346, pK03 spr W174R (-SalI)

MXE014: ATsp, spr V135D pMXE340, pK03 spr V135D (-SalI)

MXE015: ATsp, spr V98E pMXE342, pK03 spr V98E (-SalI)

MXE016: ATsp, spr C94A pMXE343, pK03 spr C94A (-SalI)

MXE017: ATsp, spr H145A pMXE344, pK03 spr H145A (-SalI)

MXE018: ATsp, spr V135G pMXE341, pK03 spr V135G (-SalI)

Los módulos de integración de spr mutante se movieron como fragmentos de restricción Sal I, Not I a plásmidos pKO3 restringidos de modo similar.

Para todos los experimentos se empleó la línea celular de E. coli W3110 como la línea celular de tipo salvaje y la línea celular de E. coli W3110 ATsp, spr C94A (MX016).

Ejemplo 3: Generación del plásmido para la expresión de Fab' anti-CD154 y DsbC

Se construyó un plásmido que contenía las secuencias de cadena pesada y ligera de un anti-CD154 Fab (SEQ ID NO:13 y 11, respectivamente) y la secuencia que codifica DsbC (SeQ ID NO:27).

Se construyó el plásmido pMXE351 (pTTOD_DsbC), un vector de expresión para el anti-CD154 Fab y DsbC (un polipéptido periplásmico), empleando metodologías de clonación de restricción convencionales. El plásmido pMXE351 contiene las siguientes características: un promotor de tac fuerte y una secuencia de operador lac. Tal como se muestra en la figura 1, el plásmido contiene un sitio de restricción EcoRI exclusivo después de la región codificadora de la cadena pesada de Fab', seguido de una secuencia no codificadora y después un sitio de restricción NdeI exclusivo. El gen DsbC se clonó mediante PCR empleando el ADN cromosómico bruto de W3110 como molde. Se retiró un sitio EcoRI de la secuencia de DsbC de tipo salvaje mediante extensión de solapamiento con PCR, de modo que el producto de la PCR codificaba un sitio 5' EcoRI, seguido de un sitio de unión a ribosomas fuerte, seguido del codón de inicio nativo, la secuencia señal y una secuencia madura de DsbC, terminando con un marcador de His C-terminal y, por último, un sitio NdeI no codificador. El fragmento de la PCR EcoRI-NdeI se restringió y se acopló en el vector de expresión, de modo que los tres polipéptidos (la cadena ligera de Fab', la cadena pesada de Fab' y DsbC) son codificados sobre un único ARNm policistrónico.

Los genes de la cadena ligera y la cadena pesada de Fab y el gen DsbC se transcribieron como un único mensaje policistrónico. El ADN que codifica el péptido señal de la proteína OmpA de E. coli se condensó en el extremo 5' de ambas secuencias del gen de cadena pesada y ligera, que dirige la translocación de los polipéptidos al periplasma de E. coli. La transcripción se terminó empleando un terminador de la transcripción dual rrnB t1t2. El gen laclq

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codifica la proteína represora de Lac I constitutivamente expresada. Esta transcripción reprimida del promotor de tac hasta la eliminación de la represión fue inducida por la presencia de alolactosa u IPTG. El origen de la replicación usado fue p15A, que mantiene un bajo número de copias. El plásmido contiene un gen de resistencia a tetraciclina para la selección con antibióticos.

Ejemplo 4: Expresión de Fab' anti-CD154 y DsbC en E. coli W3110 y MXE016 (E. coli W3110 ATsp, spr C94A)

Expresión de Fab’ anti-CD154 y DsbC en E. coli W3110 ATsp, spr C94A

La cepa de células de E. coli W3110 ATsp, spr C94A (MXE016) se transformó con el plásmido pMXE351 generado en el ejemplo 3. La transformación de las cepas se realizó empleando el método de Chung C.T et al. (Chung, Niemela, y Miller, 2172-2175).

Expresión de Fab’ anti-CD154 en E. coli W3110

Se transformó la cepa de células de E. coli W3110 con el plásmido pTTOD, un vector de expresión para el Fab' anti- CD154, que se construyó empleando metodologías de clonación de restricción convencionales. El plásmido pTTOD contiene las siguientes características: un promotor de tac fuerte y una secuencia de operador lac. Los genes de la cadena ligera y la cadena pesada de Fab se transcribieron como un único mensaje dicistrónico. El ADN que codifica el péptido señal de la proteína OmpA de E. coli se condensó en el extremo 5' de ambas secuencias del gen de cadena pesada y ligera, que dirige la translocación de los polipéptidos al periplasma de E. coli. La transcripción se terminó empleando un terminador de la transcripción dual rrnB t1t2. El gen laclq codifica la proteína represora de Lac I constitutivamente expresada. Esta transcripción reprimida del promotor de tac hasta la eliminación de la represión fue inducida por la presencia de alolactosa u IPTG. El origen de la replicación usado fue p15A, que mantiene un bajo número de copias. El plásmido contiene un gen de resistencia a tetraciclina para la selección con antibióticos. La transformación de las cepas se realizó empleando el método de Chung C.T et al. (Chung, Niemela, y Miller, 2172-2175).

Ejemplo 5: Crecimiento de cepas de E. coli mutadas y expresión de Fab' anti-CD154 en cepas de E. coli mutadas empleando fermentaciones de alta densidad

Las cepas producidas en el ejemplo 4 se ensayaron en experimentos de fermentación que comparan el crecimiento y la expresión de un Fab' anti-CD154:

Medio de crecimiento, inóculo y etapas de fermentación. El proceso de la fermentación se inicia preparando un inóculo a partir de un vial del banco de células y amplificando a través de varias etapas de precultivo (matraz y reactores) antes de sembrar en el fermentador de producción. En la fermentación de producción, las células se cultivan en medio definido hasta una alta densidad en el modo discontinuo y de alimentación discontinua. Cuando se alcanza la densidad celular deseada se induce la expresión de Fab' mediante la adición de IPTG. La expresión de Fab' se dirige al espacio periplásmico de E. coli, en donde Fab' se acumula a lo largo de la fase de inducción. Se aplica una alimentación de una fuente de carbono durante la fase de inducción para controlar la expresión y el crecimiento celular. Se controla la temperatura, el oxígeno disuelto (pO2) y el pH para mantener el cultivo dentro de las condiciones óptimas de cultivo.

Medición de la concentración de biomasa y tasa de crecimiento. La concentración de biomasa se determina midiendo la densidad óptica de los cultivos a 600 nm.

Extracción periplásmica. Las células se recolectaron de las muestras de cultivo mediante centrifugación. La fracción del sobrenadante se guarda (a -20 °C) para un posterior análisis. La fracción del sedimento celular se resuspende hasta el volumen original del cultivo en tampón de extracción (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4). Tras una incubación a 60 °C durante aproximadamente 10 a 16 horas, el extracto se aclaró mediante centrifugación, y la fracción del sobrenadante se empleó fresca o se guardó (a -20 °C) para su análisis.

Cuantificación de Fab'. Se determinaron las concentraciones de Fab' en los extractos periplásmicos y los sobrenadantes de cultivo empleando HPLC de proteína G. Una columna HiTrap® Protein-G HP 1 ml (GE- Healthcare® o equivalente) se cargó con el analito (pH aproximadamente neutro, 30 °C, filtrado a 0,2 pm) a 2 ml/min, la columna se lavó con fosfato 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,4, y después el Fab' se eluyó empleando una inyección de glicina 50 mM/HCl, pH 2,7. El Fab' eluido se midió con A280 en un sistema de HPLC Agilent® 1100 o 1200 y se cuantificó mediante la referencia a una curva patrón de una proteína Fab' purificada de concentración conocida.

Ejemplo 6: Nivel de los fragmentos de cadena ligera en extracciones de fermentación de cepas de E. coli mutadas

Las fermentaciones presentadas en el ejemplo 2 se ensayaron para el nivel de fragmentos de cadena ligera de Fab' anti-CD154 en extracciones periplásmicas.

Cuantificación de los fragmentos de cadena ligera. Se logró el cálculo cuantitativo del nivel de Fab' y fragmentos

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proteolíticos de Fab' mediante una HPLC en fase inversa a alta temperatura. La separación se realiza en una columna en fase inversa Poroshell® 300SB-C8 (Agilent Technologies®, n.° de producto 660750-906) a una temperatura de 80 °C. El disolvente de equilibrio es agua de HPLC, TFA al 0,1% (en v/v), y el disolvente de elución es 1-propanol:acetonitrilo 80:20 (en v/v), TFA al 0,03% (en v/v). La separación se realiza con un caudal de 2,0 ml/min, por medio de un gradiente lineal de disolvente B al 16-38% en 4,4 min. La detección fue mediante la absorbancia de UV a 214 nm. Los datos se procesaron mediante integración manual, y la cantidad de fragmentos proteolíticos de Fab se expresa como porcentaje del área de pico con relación al pico de Fab intacto.

La presente invención también proporciona una composición terapéutica o de diagnóstico que comprende el anticuerpo producido mediante el método de la presente invención, en combinación con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición terapéutica o de diagnóstico que comprende mezclar el anticuerpo producido mediante el método de la presente invención, junto con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Lista de referencias bibliográficas

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Listado de secuencias

<110> UCB Pharma, S.A.

<120> CEPA HOSPEDANTE BACTERIANA QUE EXPRESA FRAGMENTO DE ANTICUERPO RECOMBINANTE

<130> G0157 WO

<150> EP11173880.3 <151>

<160> 52

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 CDR-H1 <400> 1

Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr His val His 1 5 10

<210> 2 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 CDR-H2 <400> 2

Val lie Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn ser val Leu Lys Ser 15 10 15

<210> 3 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 CDR-H3 <400> 3

Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala 1 5 10

<210> 4 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 CDR-L1 <400> 4

Arg Ala ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala 1 5 10

<210>5 <211>7 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 CDR-L2 <400> 5

Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp 1 5

<210>6 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 CDR-L3 <400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 7 <211> 384 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 cadena ligera variable (gL4) <220>

<221> peptido_señal <222> (1)..(63)

<220>

<221> CDS <222> (64)..(384)

<400> 7

atgaaaaaga <: cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60

gct: gat ate cag atg acc cag agt cea age agt etc tcc gee age gta 108

: Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Al a ser val

: 1 5 10 15

ggc: gat cgt gtg act att acc tgt cgt gee agt gag gac etc tat tac 156

Gly: Asp Arg val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr

5

10

15

20

25

20 25 30

aac ctg gcc tgg tat cag cgt aaa ccg gac aaa gcc ccg aag ctg etc

Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

ate tat gat acg tac cgc ctg gct gac ggt gtq cea age cgt ttc agt

lie Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val pro Ser Arg Phe Ser

50 55 50

ggc agt ggc age ggt act gac tat ace etc aca att teg tet etc cag

Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser ser Leu Gln

65 70 75

ccg gaa gat ttc gcc tet tac tat tgt cag caa tat tac aag ttc cct

Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro

80 85 90 95

ttc acc ttc ggt cag ggc act aaa gta gaa ate aaa

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys

100 105

252

300

348

384

<210>8 <211> 107 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Construcción sintética <400>8

Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ser ser Leu Ser Ala ser val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys val Glu lie Lys 100 10 5

<210>9 <211> 351 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 Cadena variable pesada (gH1)

<220>

<221> CDS <222> (1)..(351)

<400> 9

gag: gtg cag ctg gtc gag tet gga ggc ggg ctt gtc cag cct ggt ggg

Glu: val Gln Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gln Pro Gly Gly

1: 5 10 15

age: ctg cgt etc tet tgt gca gtg age ggc ttc age tet acc aat tac

Ser: Leu Arg Leu Ser Cys Ala val ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr


: 20 25 30

cat: gtg cae tgg gtg cgt cag gca cct ggg aag ggc ctg gag tgg atg

Hi s: Val Hi s Trp val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met


: 35 40 45

ggt: gtt att tgg ggc gac ggc gat aca tcc tac aac tcc gtc ctg aag

Gly: Val 50 lie Trp Gly Asp Gly 55 Asp Thr Ser Tyr Asn 60 Ser Val Leu Lys

age: cgt ttc acc att tcc cgt gac acc tea aag aat acc gtt tac etc

Ser: Arg phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65: 70 75 80

cag: atg aac tet etc cgc gca gag gac aca gca gtc tat tac tgt gca

Gln: Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Al a




: 85 90 95

cgt: caa ctg acc cae tat tac gtt ttg gca gee tgg ggt caa ggg act

Arg: Gln Leu Thr His Tyr Tyr val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr


: 100 105 110

ctg: gtc aca gtc teg

Leu: val Thr val Ser

115

96

144

192

240

288

336

351

<210> 10 <211> 117 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10

<220>

<223> Construcción sintética <400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr 20 25 30

Hl S

Gly

Ser

65

Gln

Arg

Leu

15

val: Hi S 35 Trp val Arg Gln

Val: He Trp Gly O. < Gly

50: 55

Arg: Phe Thr lie Ser
Arg




: 70

Met: Asn ser Leu Arg Al a



: 85

Gln: Leu Thr His Tyr Tyr


: 100

Val: Thr Val Ser

: 115

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 40 45

Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys 60

Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 75 80

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 90 95

val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr 105 110

<210> 11 <211> 705 <212>ADN

20 <213> Secuencia Artificial

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 gL4 (V+C)

<220>

<221> CDS 5 <222> (64)..(705)

<400> 11

atgaaaaaga >: cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60

gct: gat Asp 1 ate lie cag Gln atg Met acc Thr 5 cag Gln agt Ser cea Pro age Ser agt Ser 10 etc Leu tcc Ser gee Ala age Ser gta val 15 108

ggc Gly: gat Asp cgt Arg gtg val act Thr 20 att lie acc Thr tgt cys cgt Arg gee Ala 25 agt Ser gag Glu gac Asp etc Leu tat Tyr 30 tac Tyr 156

aac Asn: ctg Leu gee Ala tgg Trp 35 tat Tyr cag Gln cgt Arg aaa Lys ccg Pro 40 ggc Gly aaa Lys gee Al a ccg Pro aag Lys 45 ctg Leu etc Leu 204

ate He: tat Tyr gat Asp 50 acg Thr tac Tyr cgc Arg ctg Leu gct Ala 55 gac Asp ggt Gly gta Val cea Pro age Ser 60 cgt Arg ttc Phe agt Ser 252

egc Gly: agt Ser 65 ggc Gly age Ser ggt Gly act Thr gac ASp 70 tat Tyr acc Thr etc Leu aca Thr att He 75 teg Ser tet Ser etc Leu cag Gln 300

ccg Pro 80: gaa Glu gat Asp ttc Phe gee Al a tet Ser 85 tac Tyr tat Tyr tgt Cys cag Gln caa Gln 90 tat Tyr tac Tyr aag Lys ttc Phe cct Pro 95 348

ttc Phe: ace Thr ttc Phe ggt Gly cag Gln 100 ggc Gly act Thr aaa Lys gta Val gaa Glu 10 5 ate lie aaa Lys cgt Arg acg gta Thr val 110 gcg Ala 396

gee Al a: cea pro tet Ser gtc val 115 ttc Phe ate lie ttc Phe ccg Pro cea Pro 120 tet Ser gat ASp gag Glu cag Gl n ttg Leu 125 aaa Lys tet ser 444

gga Gly: act Thr gee Ala 130 tet Ser gtt val «Si tgc cys ctg Leu 135 ctg Leu aat Asn aac Asn ttc Phe tat Tyr 140 ccc Pro aga Arg gag Glu 492

gee Ala: aaa Lys 145 gta val cag Gln tgg Trp aag Lys «;? 150 gat Asp aac Asn gee Al a etc Leu caa Gln 155 teg ser ggt Gly aac Asn tcc Ser 540

cag Gln 160: gag Glu agt Ser gtc val aca Thr gag Glu 165 cag Gln gac Asp age Ser aag Lys gac Asp 170 age Ser acc Thr tac Tyr age Ser etc Leu 175 588

age Ser: age ser ace Thr ctg Leu acg Thr 180 ctg Leu age Ser aaa Lys gca Ala gac Asp 185 tac Tyr gag Glu aaa Lys cae His aaa Lys 190 gtc val 636

tac Ty r: gee Ala tgc Cys gaa Glu 195 gtc val acc Thr cat His cag Gln ggc Gly 200 ctg Leu age Ser tea ser cea Pro gta val 205 aca Thr aaa Lys 684

agt Ser: ttt phe aat Asn aga Arg ggg Gly gag Glu tgt Cys 705

10 210

<210> 12 <211> 214 <212> PRT

15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 20 <400> 12

imagen1

<210> 13 5 <211> 726

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 gH1 Fab (no bisagra) HC con región constante

<220>

<221> CDS <222> (64)..(726)

<400> 13

atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa

gct gag gtt cag ctg gtc gag tct gqa gqc gqg ctt gtc cag cct ggt

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 S 10 15

gag age ctg cgt etc tct tgt gca gtq age gqc ttc age tct ace aat

Gly ser Leu Arg Leu Ser cys Ala val ser Gly Phe ser ser Thr Asa

20 25 30

60

108

tac Tyr: cat His 9tg val cae H1 s 35 tgg Trp 8? cgt Arg cag Gln gca Ala 40 cct Pro 999 Gly aag Lys ggc Gly ctg Leu 45 gag Glu tgg Trp

atg Met: ggt Gly gtt val 50 att lie tgg Trp ggc Gly gac Asp ggc Gly 55 gat Asp aca Thr tcc Ser tac Tyr aac A$n 60 tcc Ser gtc Val ctg Leu

aag Lys: age ser 65 cgt Arg ttc Phe acc Thr att He tcc Ser 70 cgt Arg gac Asp acc Thr tea Ser aag Lys 75 aat Asn acc Thr gtt val tac Tyr

etc Leu 80: cag Gl n atg Met aac Asn tet Ser etc Leu 85 cgc Arg gca Al a gag Glu gac Asp aca Thr 90 gca Ala gtc val tat Tyr tac Tyr tgt Cys 95

gca Ala: cgt Arg caa Gln ctg Leu acc Thr 100 cae Hi s tat Tyr tac Tyr gtt val ttg Leu 105 gca Ala gee tgg Ala Trp ggt Gly caa Gln 110 ggg Gly

act Thr: ctg Leu gtc Val aca Thr 115 gtc Val teg Ser age Ser gct Al a tet Ser 120 aca Thr aag Lys ggc Gly cea Pro teg ser 12 5 gtc val ttc Phe

ccc pro: ctg Leu gca Al a 130 ccc Pro tcc Ser tcc Ser aag Lys age Ser 13 5 acc Thr tet Ser 999 Gly ggc Gly aca Thr 140 gcg Ala gee Ala ctg Leu

ggc Gly: tgc Cys 145 ctg Leu gtc val aag Lys gac Asp tac Tyr 150 ttc Phe ccc Pro gaa Glu ccg Pro gtg val 155 acg Thr teg Ser tgg Trp

aac Asn 160: tea ser ggc Gly gee Ala ctg Leu acc Thr 16 5 age Ser ggc Gly gtg Val cae Hi s acc Thr 170 ttc Phe ccg pro gct Ala gtc Val cta Leu 175

cag Gln: tcc Ser tea Ser gqa Gly etc Leu 180 tac Tyr tcc Ser etc Leu age Ser age Ser 185 gtg val gtg val acc Thr gtg Val ccc Pro 190 tcc Ser

age Ser
age Ser: ttg Leu ggc Gly 195 acc Thr cag Gln acc Thr tac Tyr ate lie 200 tgc Cys aac Asn gtg val aat Asn cae Hi s 205 aag Lys ccc pro

age Ser: aac Asn acc Thr 210 aag Lys gtc Val gac Asp aag Lys aaa Lys 215 gtí val gag Glu ccc Pro aaa Lys tet Ser 220 tgt Cys

252

300

348

396

444

492

540

588

636

684

726

<210> 14 <211> 221 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Construcción sintética

10

<400> 14

Glu val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

ser: Leu Arg Leu Ser Cys Ala val Ser Gly Phe ser Ser Thr Asn Tyr


: 20 25 30

H1 s: val Hi s Trp val Arg Gl n Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met


: 35 40 45

Gly: val lie Trp Gly Asp Gl y Asp Thr Ser Tyr Asn Ser val Leu Lys

: 50 55 60

ser: Arg Phe Thr lie Ser Arg A5P Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65: 70 75 80

Gln: Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala GlU Asp Thr 90 Ala val Tyr Tyr Cys 95 Ala

Arg: Gln Leu Thr Hi S Tyr Tyr val Leu Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr


: 100 105 110

Leu: val Thr val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu: Ala Pro Ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr Al a Ala Leu Gly

: 130 13 5 140

Cys: Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr val ser Trp Asn

145: 150 155 160

Ser: Gly Al a Leu Thr Ser Gly val Hi s Thr Phe Pro Al a Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205

Asn Thr Lys val Asp Lys Lys val Glu pro Lys ser cys 210 215 220

<210> 15 <211> 750 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: 342 gH1 Fab' HC con región constante

10

<220>

<221> CDS <222> (64)..(750)

15 <400> 15

atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa

60

gct: gag Gl u 1 gtt val cag Gl n ctg Leu gtc Val 5 gag Gl u tet Ser gga Gly ggc Gly ggg Gly 10 ctt Leu gtc val cag Gln cct Pro ggt Gly 15

999 Gly: age Ser ctg Leu cgt Arg etc Leu 20 tet Ser tgt Cys gca Al a age Ser 25 ggc Gly ttc Phe age ser tet Ser acc Thr 30 aat Asn

tac Tyr: cat His gtg val cae His 35 tgg Trp gtg val cgt Arg cag Gln gca Ala 40 cct Pro ggg Gly aag Lys ggc Gly ctg Leu 45 gag Glu tgg Trp

atg Met: ggt Gly gtt val 50 att lie tgg Trp ggc Gly gac ASp ggc Gly 55 gat Asp aca Thr tcc Ser tac Tyr aac Asn 60 tcc Ser gtc val ctg Leu

aag Lys: age ser 65 cgt Arg ttc Phe acc Thr att lie tcc ser 70 cgt Arg gac Asp acc Thr tea ser aag Lys 75 aat Asn acc Thr gtt Val tac Tyr

etc Leu 80: cag Gln atg Met aac Asn tet Ser etc Leu 85 cgc Arg gca Al a gag Glu gac Asp aca Thr 90 gca Ala gtc val tat Tyr tac Tyr tgt cys 95

ge a Al a: cgt Arg caa Gln ctg Leu acc Thr 100 cae Hi s tat Tyr tac Tyr gtt Val ttg Leu 105 gca Ala gee Al a tgg Trp caa Gl n 110 ggg Gly

act Thr: ctg Leu gtc Val aca Thr 115 gtc val teg Ser age Ser gct Ala tet Ser 120 aca Thr aag Lys ggc Gly cea Pro teg Ser 125 gtc Val ttc Phe

ccc Pro: ctg Leu gca Ala 130 ccc Pro tcc Ser tcc Ser aag Lys age Ser 135 acc Thr tet Ser ggg Gly ggc Gly aca Thr 140 gcg Al a gee Al a ctg Leu

ggc Gly: tgc Cys 145 ctg Leu gtc val aag Lys gac Asp tac Tyr 150 ttc Phe ccc Pro gaa Glu ccg Pro SS 155 acg Thr teg Ser tgg Trp

aac Asn 160: tea Ser ggc Gly gee Al a ctg Leu acc Thr 165 age Ser ggc Gly &¥ cae Hi S acc Thr 170 ttc Phe ccg Pro gct Al a gtc Val cta Leu 175

cag Gln: tcc Ser tea Ser gga Gly etc Leu 180 tac Tyr tcc Ser etc Leu age Ser age Ser 185 gtg val gtg val acc Thr 8! ccc Pro 190 tcc ser

age Ser: aac Asn acc Thr 210 aag Lys gtc val gac Asp aag Lys aaa Lys 215 gtt val gag Glu ccc Pro aaa Lys tet Ser 220 tgt cys gac Asp aaa Lys

act: cae aca tgc gee gcg

Thr: His 225 Thr Cys Ala Ala

108

156

204

252

300

348

396

444

492

540

588

636

684

732

750

<210> 16 5 <211> 229

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Construcción sintética

Glu: val Gl n Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gln Pro Gly Gly

1: 5 10 15

Ser: Leu Arg Leu Ser Cys Ala val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr


: 20 25 30

His: val Hi s T rP val Arg Gln Ala Pro Gl y Lys Gly Leu Glu Trp Met


: 35 40 45

Gly: Val lie Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser val Leu Lys

: 50 55 60

ser: Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Thr ser Lys Asn Thr val Tyr Leu

65: 70 75 80

Gln: Met Asn ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Thr 90 Al a val Tyr Tyr Cys 95 Ala

Arg: Gln Leu Thr His Tyr Tyr val Leu Al a Ala Trp Gly Gln Gly Thr


: 100 105 110

Leu: val Thr Val ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro


: 115 120 125

Leu: Ala pro ser ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

: 130 135 140

cys: Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr Val Ser Trp Asn

145: 150 155 160

Ser: Gly Al a Leu Thr Ser Gly Val Hi s Thr Phe Pro Ala val Leu Gln




: 165 170 175

Ser
Ser: Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser val Val Thr val Pro
Ser
Ser



: 180 185 190

Ser: Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie cys Asn val Asn Hi S Lys Pro
Ser

195 200 205

Asm Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220

His Thr Cys Ala Ala 225

5 <210> 17

<211> 711 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial 10 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: hu342 kappa LC

<220>

<221> CDS 15 <222> (1)..(711)

<400> 17

atg: gac atg agg gtc ccc gct cag etc ctg ggg etc ctg cta etc tgg

Met: Asp Met Arg val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1: 5 10 15

etc: cga gqt gee aga tgt gat ate cag atg acc cag agt cea age agt

Leu: Arg Gly Ala Arg cys ASp lie Gln Met Thr Gln ser Pro ser Ser


: 20 25 30

etc: tcc gee age gta ggc gat cgt gtg act att acc tgt cgt gee agt

Leu: Ser Ala Ser val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr cys Arg Ala ser


: 35 40 45

gag: gac etc tat tac aae ctg gee tgg tat cag cgt aaa ccg ggc aaa

Glu: ASP Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys

: 50 55 60

gee: ccg aag ctg etc ate tat gat acg tac cgc ctg gct gac ggt gtg

Al a: Pro Lys Leu Leu lie Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Al a Asp Gly val

65: 70 75 80

cea: age cgt ttc agt ggc agt ggc age gqt act gac tat acc etc aca

Pro: Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr



: 85 90 95

att: teg tet etc cag ccg gaa gat ttc gee tet tac tat tgt cag caa

He: Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln



: 100 105 110

tat: tac aag ttc cct ttc ace ttc gqt cag ggc act aaa gta gaa ate

Tyr
Tyr: Lys Phe pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie

115: 120 125

aaa: cgt acg gtg gct gca cea tet gtc ttc ate ttc ccg cea tet gat

Lys: Arg Thr val Ala Ala Pro Ser val phe lie Phe Pro Pro Ser ASp

130: 135 140

gag: cag ttg aaa tet gqa act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aae

Glu: Gln Leu Lys Ser Gly Thr Al a Ser val val Cys Leu Leu Asn Asn

96

144

192

240

288

336

384

432

480

145: 150 155 160

ttc: tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat aae gee etc

Phe: Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val ASp Asn Ala Leu


: 165 170 175

caa: teg ggt aae tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac

Gln: Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp



: 180 185 190

age: acc tac age etc age age acc ctg acg ctg age aaa gca gac tac

Ser: Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr


: 195 200 205

gag: aaa cae aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age

Glu: Lys His Lys val Tyr Ala cys Glu val Thr His Gln Gly Leu Ser

: 210 215 220

teg: ccc gtc aca aag age ttc aae agg gqa gag tgt tag

Ser: Pro val Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225: 230 235

528

576

624

672

711

5 <210> 18

<211> 236 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Construcción sintética

5

10

Met Asp Met Arg val pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg cys Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro ser ser 20 25 30

Leu Ser Ala ser val Gly Asp Arg val Thr lie Thr Cys Arg Ala ser

35 40 45

Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys 50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Asp Thr Tyr Arg Leu Ala Asp Gly Val 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr 85 90 95

lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110

Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys val Glu lie 115 120 125

Lys Arg Thr val Ala Ala Pro Ser val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala cys Glu val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 19 <211> 1392 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: hu342 aglyP-huIgG4 HC

<220>

<221> CDS <222> (1)..(1392)

<400> 19

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1. - Una célula bacteriana gram-negativa recombinante que comprende:

a) un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC; y

b) uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154;

c) un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene 50% o menos de la actividad proteasa de una proteína Tsp no mutada de tipo salvaje según se muestra en SEQ ID NO:26; y

d) un gen spr mutado que codifica una proteína spr cuya secuencia de tipo salvaje se muestra en SEQ ID NO:24 que comprende una mutación que afecta al aminoácido C94; y

en la que dicha célula bacteriana gram-negativa se selecciona de las cepas K12 y W3110 de E. coli, y en la que la célula bacteriana es isogénica con dichas cepas excepto por el polinucleótido recombinante que codifica DsbC, dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y el gen Tsp mutado y el gen spr mutado.
2. - La célula bacteriana gram-negativa según la reivindicación 1, en la que DsbC comprende un marcador de histidina en el N-terminal o el C-terminal.
3. - La célula bacteriana gram-negativa según la reivindicación 1 o 2, en la que el vector de expresión comprende un polinucleótido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:51.
4. - La célula bacteriana gram-negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende tres CDR que tienen la secuencia indicada en SEQ ID NO:1 para CDRH1, SEQ ID NO:2 para CDRH2 y SEQ ID NO:3 para CDRH3, y un dominio variable de cadena ligera que comprende tres CDR que tienen la secuencia indicada en SEQ ID NO:4 para CDRL1, SEQ ID NO:5 para CDRL2 y SEQ ID NO:6 para CDRL3.
5. - La célula bacteriana gram-negativa según la reivindicación 4, en la que dichos uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo comprenden la secuencia de la región variable de cadena ligera indicada en SEQ ID NO:8 y la región variable de cadena pesada indicada en SEQ ID NO:10.
6. - La célula bacteriana gram-negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el anticuerpo es un fragmento Fab o Fab'.
7. - La célula bacteriana gram-negativa según la reivindicación 6, en la que el fragmento Fab o Fab' comprende una cadena ligera que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:12 y una cadena pesada que tiene la secuencia indicada en SeQ ID NO:14 o 16.
8. - La célula bacteriana gram-negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la célula bacteriana gram-negativa comprende un primer vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC, y un segundo vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154.
9. - La célula bacteriana gram-negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC comprende además uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154.
10. - La célula bacteriana gram-negativa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la mutación en el gen spr que codifica una proteína spr da como resultado un cambio del aminoácido cisteína a alanina en la posición 94 (C94A).
11. - La célula bacteriana gram-negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC y un mensaje dicistrónico para producir un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, en la que el cistrón cadena arriba contiene ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón cadena abajo contiene ADN que codifica la correspondiente cadena pesada, que se caracteriza porque el mensaje dicistrónico comprende una secuencia seleccionada de IGS1 (SeQ ID NO:33), IGS2 (SEQ ID NO:34), IGS3 (SEQ ID NO:35) e IGS4 (SEQ ID NO:36).
12. - Un método para producir un anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, que comprende:

a) cultivar una célula bacteriana gram-negativa recombinante, según se define en cualquiera de las reivindicaciones

1 a 11, en un medio de cultivo bajo condiciones eficaces para expresar el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, y el polinucleótido recombinante que codifica DsbC; y

b) recuperar el anticuerpo, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, que se une específicamente a CD154, del periplasma de la célula bacteriana gram-negativa recombinante y/o del medio de cultivo.

5 13.- Un método según la reivindicación 12, en el que el método comprende además una etapa de unir una molécula

efectora a un aminoácido en el extremo C-terminal o hacia el extremo C-terminal de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo.
14.- Un método según la reivindicación 13, en el que la molécula efectora comprende polietilenglicol o metoxipolietilenglicol.

10 15.- Un método según la reivindicación 14, en el que el método comprende unir a uno de los restos cisteína en el

extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida, en el que cada grupo amino del resto lisilo lleva unido covalentemente un resto metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.

imagen1

imagen2

Densidad óptica (Au, 600 nm)

imagen3

Tiempo de fermentación (h)

-♦-W3110 pTTOD -«-MXE016 pTTOD_DsbC

Concentración de Fab’ (g/l)

imagen4

-♦-W3110 pTTOD_anti-CD154 Fab' -O-W3110 pTTOD_ant¡-CD154 Fab1 -«-MXE016 pTTOD_ant¡-CD154 Fab'_DsbC -O-MXE016 pTTOD_anti-CD154 Fab'_DsbC

Fab’ periplásmico Fab’ extracelular Fab’ periplásmico Fab’ extracelular

imagen5

Fab’ recolectado (g/l)

imagen6

"O

ro

TD

X2

ro

>

o

T3

80

60

40

20

----------í----------

89%

74%

W3110/SM6

n=4

MXE016_DsbC

n=8

Fab' (g/l)

2,5

1,5

0,5

0,12

95,0% 2,55 95,5%

1,95

Fab’

extracelular

□ Fab’

periplásmico

MXE016 (n=3)

MXE016/DsbC (n=8)

ptr de tipo salvaje (proteasa III) 5’.

* M PRS TWFKA LLLLV

TGA ATG CCC CGC AGC ACC TGG TTC AAA GCA TTA TTG TTG TTA GTT

A L W A P L S

GCC CTT TGG GCA CCC TTA AGT

A ptr mutado (proteasa III) 5’.

Ecofí I

* I PRSTWFKA LLLLV TGA ATT CCC CGC AGC ACC TGG TTC AAA GCA TTA TTG TTG TTA GTT

Ase I

A L W A H * C GCC CTT TGG GCA CAT TAA 7GT

Tsp de tipo salvaje 5’.

MNMFFRLT ALA G L LA ATG AAC ATG TTT TTT AGG CTT ACC GCG TTA GCT GGC CTG CTT GCA

I A G Q T F A ATA GCA GGC CAG ACC TTC GCT

A Tsp mutado 5’.

EcoRI

MNSFLGLPR * L ACL Q ATG AAT TCG TTT TTA GGC TTA CCG CGT TAG CTG GCC TGC TTG CAA

Ase I

* Q A R H * L TAG CAG GCC AGA CAT TAA 7TG

DegP de tipo salvaje

202 DAAINRG NSGG 949 GAT GCA GCG ATC AAC CGT GGT AAC TCC GGT GGT

DegP S210A mutado

Ase I

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