KR102185850B1

KR102185850B1 - 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법

Info

Publication number: KR102185850B1
Application number: KR1020200021383A
Authority: KR
Inventors: 이지현; 박소정; 권희수; 김대영; 이지혜
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2020-12-02
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: US12275972B2; JP2023109990A; JP7372329B2; US20220380821A1; EP3916096A1; JP2022524680A; CN113853429B; CN113853429A; WO2021167414A1; EP3916096A4

Abstract

본 출원은 퓨린 뉴클레오티드을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법{Microorganisms that produce purine nucleotides and methods of producing purine nucleotides using the same}

퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어, 5'-이노신산 (5'-inosine monophosphate; 이하 IMP), 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate; 이하 XMP) 및 5'-구아닌산 (5'-guanosine monophosphate; 이하 GMP)은 핵산 생합성 대사계의 중간 물질로서, 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행하고, 식품, 의약품 등에 널리 이용되고 있다. 구체적으로, IMP는 자체로 소고기 맛을 내며, XMP에서 유래되는 GMP는 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으며, 두 물질 모두 모노소디움 글루탐산 (MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 정미성 핵산계 조미료로 각광 받고 있다.

인산은 퓨린 뉴클레오티드의 구성물질로, 미생물 생장에 필요한 에너지를 제공하고, 세포막의 인지질과 핵산 및 단백질 생합성에 필수적이다. 또한 세포 신호 전달 과정에도 주요한 역할을 한다.

인산은 주로 무기인산 (inorganic orthophosphate; 이하 Pi로 표기) 형태로 세포 내로 흡수된다. 미생물의 Pi 유입은 세포막에 존재하는 임포터 (importer)의 기능에 의존한다. 기존에 알려진 Pi 임포터에는 세포 외부의 Pi 농도를 인지하여 발현이 조절되는 고친화성 (high-affinity) Pi 유입 시스템인 Pst 시스템과 Pi 농도에 관계없이 발현하여 금속이온과의 혼합형태로 Pi를 유입하는 Pit 시스템, 유기인산 형태인 글라이세롤-3-인산 및 글루코즈-6-인산을 유입하는 안티포터 (antiporter) 수송 시스템 등이 공지되어 있다.

상기 인산 유입 시스템 중 Pst 시스템을 조절하여 아미노산 생산에 이용하는 몇 종류의 방법이 보고되어 있으나 (PCT 특허 WO2015-050276 및 WO2003-008607), Pst 시스템의 영향력은 이용하는 미생물 또는 목적하는 산물에 따라 상이하다.

이와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 퓨린 뉴클레오티드를 미생물 발효로 생산하면서 중요 구성물질인 인산의 유입량이 중요하다는 것을 확인하였다. 이에, 인산 임포터의 발현량을 미생물내에서 조절함으로써 퓨린 뉴클레오티드 생산이 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 인산 임포터 (importer)의 활성이 강화된, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 하나의 목적은 인산 임포터의 활성이 강화된, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 인산 임포터 (importer)의 활성이 강화된, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어, “인산 임포터 (importer)"는 세포내로 인산을 흡수하는 기능을 갖는 단백질을 의미한다. 인산은 주로 무기인산 (inorganic orthophosphate; 이하 Pi로 표기) 형태로 세포 내로 흡수되며, 세포막에 존재하는 임포터의 기능에 의존하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 기존에 알려진 Pi 임포터에는 Pst 시스템과 Pit 시스템, 및 유기인산 형태인 글라이세롤-3-인산 및 글루코즈-6-인산을 유입하는 안티포터 (antiporter) 수송 시스템 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 목적상, 상기 인산 임포터는 Pst 시스템일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "Pst 시스템"은 인산 임포터, 즉, Pi 임포터 중 하나인 인산 아데노신 3인산 결합상자 수송 시스템으로, Pi에 높은 친화력을 가지고 있으며, 인산결합 단백질 (Phosphate binding protein; 이하 PstS), 인산 아데노신 3인산 결합상자 수송체의 내막 서브유니트 (Phosphate ATP-binding cassette transporter, inner membrane subunit; 이하 PstC), 인산 아데노신 3인산 결합상자 수송체의 퍼미에이즈 (Phosphate ABC transporter, permease protein; 이하 PstA), 인산 아데노신 3인산 결합상자 수송체의 아데노신 3인산 결합 단백질 (Phosphate ABC transporter, ATP-binding protein; 이하 PstB)로 이루어진 pst 오페론에 의해 발현되는 것으로 알려져 있다 (Aguena et al., 2002). 구체적으로, PstS는 세포 외부 Pi 농도를 인식하여 Pi를 세포 내부로 운반하는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있고 (Surin et al., 2002), PstC와 PstB는 막횡단 단백질로서 Pi가 세포 내부로 이동하는 통로로 이용되는 것으로 알려져 있으며, PstB는 아데노신 3인산과 결합하여 이로부터 Pi 유입을 위한 에너지를 얻는 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (Webb et al., 1992; Chan and Torriani, 1996). 일반적으로, pst 오페론은 세포 외부의 Pi 농도가 풍부할 때에는 억제된 상태로 유지되다가 세포 외부의 Pi 농도가 마이크로몰 (uM) 이하로 낮아지면 발현이 강화되는 것으로 보고되어 있다 (Surin et al., 1985; Magota K et al., 1982).

본 출원에 있어서, 상기 PstS는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 PstC는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 PstA는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 PstB는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7은 pstS, pstC, pstA 또는 pstB 유전자에 의해 코딩되는 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 활성을 갖는 단백질 서열일 수 있다. 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 코리네박테리움 스테셔니스 (Corynebacterium stationis) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 본 출원에서의 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 활성을 갖는 단백질은 비록 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명할 수 있다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명할 수 있다.

즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명할 수 있다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드'는, 이와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드'에 속할 수 있음은 자명할 수 있다.

또한, 본 출원에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열은, 예를 들어, 각각 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드 단위체 (monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체 (polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 폴리뉴클레오타이드는, 본 출원에 따른 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 각각 pstS, pstC, pstA 또는 pstB 유전자이며, 상기 유전자는 코리네박테리움 스테셔니스 유래일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 PstS, PstC, PstA 또는 PstB의 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로 90% 이상인 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건 (stringent condition)"이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 97% 이상, 특히 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화 (southern hybridization)의 세척 조건인 60 ℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건 (stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오타이드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 또한 고려될 수 있다.

임의의 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치 (Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스 (동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

또한, 임의의 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 출원에 있어서, 상기 인산 유입 시스템의 활성 강화는, pstS, pstC, pstA, 및 pstB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성이 강화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 pstS 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 pstC 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 pstA 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 pstB 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, 단백질 활성의 "강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.

상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 활성의 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.

본 출원에 있어서, 상기 활성 강화의 대상이 되는 단백질, 즉, 목적 단백질은 인산 임포터일 수 있고, 구체적으로는 Pst 시스템일 수 있으며, 보다 구체적으로는 PstS, PstC, PstA 및 PstB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 활성 강화의 대상이 되는 인산 임포터는, 상기 i) PstS, ii) PstC 또는 iii) PstS 및 PstC의 조합으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 이에 PstA 또는 PstB를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원에 있어서, 상기 해당 단백질로부터 생산되는 산물은 퓨린 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않을 수 있다. 상기 방법은 이로 제한되는 것은 아니나, 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있다.

상기 유전자 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,

1) 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,

2) 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법,

3) 상기 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,

4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티스 서열을 변형시키는 방법,

5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는

6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.

본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.

또한, 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다.

상기 2) 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj7 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호), cj1 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, Trp프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 3) 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티스 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

상기 5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호

화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

이와 같은 단백질 활성의 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 인산 임포터의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 기준 미생물은 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 것으로 알려진 야생형 미생물일 수 있으며, 예를 들면, 코리네박테리움 스테셔니스 ATCC6872 일 수 있다. 또는, 상기 기준 미생물은 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 것으로 알려진 미생물일 수 있으며, 예를 들면, CJX1664 (KCCM12285P, 대한민국 등록특허 제10-1950141호), CJX1665 (CJX1664::purA(G85S), KCCM12286P, 대한민국 등록특허 제10-1950141호) 및 CJI2335 (KCCM12278P, 대한민국 등록특허 제10-1956510호)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물"은 자연적으로 약한 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지고 있는 미생물 혹은 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 없는 모균주에 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 상기 미생물은 배지에서 배양되는 경우, 미생물내에서 퓨린 뉴클레오티드를 생산하여 축적하거나, 또는 이를 배지내에 분비하거나 축적하는 능력을 갖는 것일 수 있다. 당해 퓨린 뉴클레오티드 생산 능력은 코리네박테리움 속 미생물의 야생주의 성질로서 갖는 것일 수 있고, 유전자 개량에 의해 부여되거나 증진된 것일 수 있다. 본 출원에서 상기 "퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물"은 "퓨린 뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물", "퓨린 뉴클레오티드 생산 균주"와 혼용되어 사용될 수 있다.

본 출원의 목적상, 상기 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 본 출원의 인산 임포터 활성을 나타내는 폴리펩타이드 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하고, 전술한 단백질 활성의 강화 방법에 의해 상기 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비해 강화됨에 따라, 퓨린 뉴클레오티드의 생산량이 야생형 또는 변형전 미생물에 비해 증가한 것일 수 있다. 이는 야생형 미생물이 퓨린 뉴클레오티드를 생산하지 못하거나, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하더라도 극미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 본 출원의 인산 임포터 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 도입하고 이의 활성을 강화함으로써 미생물에서 퓨린 뉴클레오티드 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있을 수 있다.

구체적으로, 상기 인산 임포터는 PstS, PstC, PstA 및 PstB으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로 PstS, PstC, PstS 및 PstC 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 퓨린 뉴클레오티드를 생산할 수 있다면 특별히 제한되지 않으나, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물에는, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스 (Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티 (Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내 (Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스 (Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레 (Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스 (Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼 (Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리 (Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스 (Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스 (Corynebacterium testudinoris) 코리네박테리움 플라베스센스 (Corynebacterium flavescens), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) 및 이들을 모균주로 하여 제작된 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 스테셔니스 KCCM12285P 및 KCCM12286P (대한민국 등록특허 제10-1950141호), 코리네박테리움 스테셔니스 KCCM12278P (대한민국 등록특허 제10-1956510호), 코리네박테리움 스테셔니스 KCCM12280P (대한민국 등록특허 제10-1950141호)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 코리네박테리움 스테셔니스 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주일 수 있다. 상기 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 자연적 또는 인위적인 유전적 변형을 포함함으로 인하여, 야생형 미생물, 예를 들면 ATCC 6872 보다 퓨린 뉴클레오티드를 더 많이 생산하는 미생물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "퓨린 뉴클레오티드"는 구체적으로 5'-이노신산 (5'-inosine monophosphate; 이하 IMP), 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate; 이하 XMP) 및 5'-구아닌산 (5'-guanosine monophosphate; 이하 GMP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 IMP는 아데닌이 탈아미노된 화합물로 히포잔틴·리보스·인산 각 1분자로 구성된 뉴클레오타이드를 의미한다. 5'-포스포라이보실-1-파이로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate; PRPP)로부터 생합성될 수 있으며, 구체적으로 PRPP의 1번 탄소에 결합되어 있던 피로인산기가 질소 원자로 치환되고, 9단계에 걸쳐 이미다졸 고리와 피리미딘 고리를 구성하여 형성될 수 있다. 상기 XMP는 IMP에서 탈수소화된 뉴클레오타이드를 의미한다. 5'-이노신산 탈수소효소 (inosine-5'-monophosphate dehydrogenase)에 의해 IMP로부터 합성될 수 있다. 상기 GMP는 구아노신 분자 내의 리보오스 부분에 인산기가 에스테르 결합을 이루고 있는 구조를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 GMP는 5'-구아닌산 생합성효소 (GMP synthase)에 의해 XMP에 암모니아 분자가 추가되어 합성될 수 있다. XMP로부터 GMP를 제조하는 방법 및/또는 상기 방법에 사용되는 수단은 공지되어 있는 기술 중에서 선택될 수 있다.

본 출원의 또 하나의 양태는 인산 임포터의 활성이 강화된, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법을 제공한다.

상기 인산 임포터, 미생물 및 퓨린 뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀 (즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

배지의 온도는 20 ℃내지 50 ℃, 구체적으로는 30 ℃ 내지 37 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 배양에 의하여 생산된 퓨린 뉴클레오티드는 배지 중으로 배출되거나 미처 배출되지 못하고 세포 내에 잔류할 수 있다.

상기 방법은, 배지 내 효소를 추가하는 단계 또는 상기 효소를 발현하는 미생물을 추가하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은, XMP를 생산하는 미생물을 배양하는 단계 이후에, XMP를 GMP로 전환하는 효소 또는 상기 효소를 발현하는 미생물을 추가하는 단계 및/또는 상기 미생물을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물로부터 퓨린 뉴클레오티드를 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨린 뉴클레오티드를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 퓨린 뉴클레오티드를 수집 (collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 퓨린 뉴클레오티드를 회수할 수 있다. 상기 배양액은 발효액으로도 명명될 수 있다.

또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 퓨린 뉴클레오티드는 정제된 형태, 혹은 퓨린 뉴클레오티드를 함유한 미생물 발효액일 수 있다 (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).

본 출원에 따라 인산 임포터의 활성을 강화시킴으로써 퓨린 뉴클레오티드 생산에 중요한 성분인 인산의 미생물내 유입을 원활하게 할 수 있다. 이로써, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 퓨린 뉴클레오티드를 효율적으로 생산할 수 있으며, 퓨린 뉴클레오티드를 산업적 규모로 생산할 경우 원가 절감에 크게 기여할 수 있다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1: pstS 개시코돈 변환 균주 제작 및 XMP 생산능 평가

1-1. pstS 개시코돈 변환 재조합 벡터 및 XMP 생산 균주 제작

XMP 생산 균주인 CJX1664 (코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis) ATCC6872 유래의 XMP 생산주, KCCM12285P, 대한민국 등록특허 제10-1950141호) 및 이의 purA(G85S) 변이주인 CJX1664::purA(G85S) (KCCM12286P, 대한민국 등록특허 제10-1950141호)에 내재적 pstS 유전자 활성을 강화시킨 균주를 제작하기 위하여 pstS의 내재적 개시코돈인 GTG를 단백질 발현율이 더 높은 개시코돈인 ATG로 치환하는 실험을 진행하였다.

코리네박테리움 스테셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체 유전자를 G-스핀 총 DNA 추출 미니 키트 (G-spin Total DNA extraction mini kit, Cat. No 17045, Intron)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 분리하고 서열번호 9와 서열번호 10의 프라이머 쌍 및 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 한쌍의 유전자 단편 (pstS(ATG)-A, pstS(ATG)-B)을 각각 얻었다. PCR은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 769bp, 766bp의 폴리뉴클레오티드를 획득하였다.

두 단편을 주형으로 2차 PCR을 실시하여 1.5kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. 이후, T4 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 접합하였다. 제조된 벡터를 pDZ-pstS(ATG)로 명명하였다.

상기 pDZ-pstS(ATG) 벡터를 상기 XMP 생산능을 가진 CJX1664 및 CJX1664::purA(G85S)에 일렉트로포레이션 (Electroporation)법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 변이 유전자와 벡터가 함께 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 기존 염색체상의 유전자와 벡터를 통해 삽입된 유전자의 상동성을 이용한 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 pstS의 개시코돈이 ATG로 변경되고, 카나마이신 내성유전자를 포함한 벡터는 제거된 최종 균주를 얻었다. 개시코돈이 변경된 유전자는 서열번호 13와 서열번호 12 및 서열번호 14와 서열번호 12 프라이머를 이용한 미스매치 (mismatch) PCR을 통하여 1차 확인 후 유전자 서열분석을 통해 최종 확인하였다. 위와 같은 방법으로 획득된 pstS 개시코돈 변환 균주를 각각 CJX1664_pstS(g1a), CJX1664::purA(G85S)_pstS(g1a)라 명명하였다.

상기에서 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.

서열번호	명칭	서열
9	pstS(ATG)-A-F	GGGTCTAGACCACAAACAGAATTAATGGTA
10	pstS(ATG)-A-R	GCTTAAAGTTGCGAATCATGGGGAAAC
11	pstS(ATG)-B-F	CCGGAAAGGTTTCCCCATGATTCGCAA
12	pstS(ATG)-B-R	GGGTCTAGAGACGTAGGTGATGCCACCGTT
13	pstS(ATG)-mismatch-wt-F	GAAAGGTTTCCCCG
14	pstS(ATG)-mismatch-mut-F	GAAAGGTTTCCCCA

1-2. pstS 개시코돈 변환 균주의 XMP 생산능 평가

제작된 균주의 XMP 생산능을 측정하기 위하여 플라스트 평가를 실시하였다. 하기 종배지 2.5 ml을 함유하는 14 ml 튜브에 CJX1664, CJX1664_pstS(g1a), CJX1664::purA(G85S), CJX1664::purA(G85S)_pstS(g1a)를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 32 ml (본배지 24 ml + 별도 살균 배지 8 ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 0.7 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 75시간 동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다.

상기 종배지, 본배지 및 별도 살균 배지의 조성은 다음과 같다.

XMP 플라스크 종배지

포도당 30g/L, 펩톤 15 g/L, 효모엑기스 15 g/L, 염화나트륨 2.5 g/L, 우레아 3 g/L, 아데닌 150 mg/L, 구아닌 150 mg/L, pH 7.0 (배지 1L 기준)

XMP 플라스크 생산배지 (본배지)

포도당 50 g/L, 황산마그네슘 10 g/L, 염화칼슘 100 mg/L, 황산철 20 mg/L, 황산망간 10 mg/L, 황산아연 10 mg/L, 황산구리 0.8 mg/L, 히스티딘 20 mg/L, 시스틴 15 mg/L, 베타-알라닌 15 mg/L, 비오틴 100 ug/L, 티아민 5 mg/L, 아데닌 50 mg/L, 구나닌 25 mg/L, 니아신 15 mg/L, pH 7.0 (배지 1L 기준)

XMP 플라스크 생산배지 (별도 살균 배지)

인산 제1칼륨 18 g/L, 인산 제2칼륨 42 g/L, 우레아 7 g/L, 황산암모늄 5 g/L (배지 1L 기준)

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 XMP의 생산량을 측정한 결과는 하기 표 2와 같다.

	균주	XMP (g/L)
	균주	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJX1664	2.1	2.2	2.1	2.1
실험군1	CJX1664_pstS(g1a)	2.5	2.5	2.6	2.5
대조군2	CJX1664::purA(G85S)	2.2	2.2	2.3	2.2
실험군2	CJX1664::purA(G85S)_pstS(g1a)	2.5	2.6	2.6	2.6

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, pstS의 개시코돈이 치환된 CJX1664_pstS(g1a), CJX1664::purA(G85S)_pstS(g1a)에서는 XMP 농도가 모균주 CJX1664, CJX1664::purA(G85S)에 비하여 각각 19%, 15% 증가하였다.

상기의 결과는 코리네박테리움 속 XMP 생산 균주에서 pstS의 개시코돈 변환이 XMP 생산에 효과적임을 나타낸다.

실시예 2: pstC 개시코돈 변환 균주 제작 및 IMP 생산능 평가

2-1. pstC 개시코돈 변환 재조합 벡터 및 IMP 생산 균주 제작

IMP 생산 균주인 CJI2335 (코리네박테리움 스테셔니스 ATCC6872 유래의 IMP 생산주, KCCM12278P, 대한민국 등록특허 제10-1956510호)의 염색체 유전자를 분리하고 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머 쌍 및 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편 (pstC(ATG)-A, pstC(ATG)-B)을 각각 얻었다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 771bp, 766bp의 폴리뉴클레오티드를 획득하였다.

두 단편을 주형으로 2차 PCR을 실시하여 1.5kbp의 폴리뉴클레오티드 주형을 얻었다. 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI으로 절단하였다. 이후, T4 리가아제를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDZ 벡터에 접합하였다. 제조된 벡터를 pDZ-pstC(ATG)으로 명명하였다.

상기 pDZ-pstC(ATG) 벡터를 IMP 생산능을 가진 균주인 CJI2335 및 CJI2332::purA(G85S) (코리네박테리움 스테셔니스 ATCC6872 유래의 IMP 생산주의 purA(G85S) 변이주, KCCM12280P, 대한민국 등록특허 제10-1950141호)에 일렉트로포레이션법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 변이 유전자가 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 실시예 1과 동일한 방법으로 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 pstC의 개시코돈이 ATG로 변경된 균주를 얻었다. 개시코돈이 변경된 유전자는 서열번호 19와 서열번호 18의 프라이머 쌍 및 서열번호 20과 서열번호 18의 프라이머 쌍을 이용한 미스매치 PCR을 통하여 1차 확인 후 유전자 서열분석을 통해 최종 확인하였다. 위와 같은 방법으로 획득된 pstC 개시코돈 변환 균주를 CJI2335_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstC(gla)로 명명하였다.

상기에서 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.

서열번호	명칭	서열
15	pstC(ATG)-A-F	GGGTCTAGACATCAACCTGAGCACCGAAAC
16	pstC(ATG)-A-R	TCAGGAGTGTCGTAAACATACCATACA
17	pstC(ATG)-B-F	CGCTGGCTTGTATGGTATGTTTACGAC
18	pstC(ATG)-B-R	GGGTCTAGAACCGGTAAACAGGTTACGGCC
19	pstC(ATG)-mismatch-wt-F	TGGCTTGTATGGTG
20	pstC(ATG)-mismatch-mut-F	TGGCTTGTATGGTA

2-2. pstC 유전자의 개시코돈 변환 균주의 IMP 생산능 평가

실시예 2-1에서 제작한 pstC 개시코돈 변환 균주인 CJI2335_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstC(gla)에 대해 IMP 생산능 향상을 확인하기 위하여 다음의 실험을 진행하였다.

가압 살균한 지름 18mm 시험관 종배지 5ml에 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 29ml를 250ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 121℃ 온도에서 15분간 가압 살균한 후, 종 배양액 2ml을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양 조건은 회전 수 170rpm, 온도 30℃, pH 7.8로 조절하였다.

상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.

IMP 종배지

포도당 1%, 펩톤1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100㎎/L, 구아닌 100㎎/L, pH 7.2 (배지 1L 기준)

IMP 플라스크 발효배지

글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘 1.2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20㎎/L, 황산망간 20㎎/L, 황산아연 20㎎/L, 황산구리 5㎎/L, L-시스테인 23㎎/L, 알라닌 24㎎/L, 니코틴산 8㎎/L, 비오틴 45㎍/L, 티아민염산 5㎎/L, 아데닌 30㎎/L, 인산(85%) 1.9%, 포도당 4.2%, 원당 2.4% (배지 1L 기준)

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 IMP 생산량을 측정하였다. CJI2335_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)에 대한 배양 결과는 하기 표 4와 같다.

	균주	IMP (g/L)
	균주	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJI2335	0.7	0.6	0.6	0.6
실험군1	CJI2335_pstC(g1a)	0.8	0.8	0.7	0.8
대조군2	CJI2332::purA(G85S)	0.6	0.6	0.6	0.6
실험군2	CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)	0.8	0.7	0.7	0.7

상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 모균주인 CJI2335, CJI2332::purA(G85S)과 배지 내 IMP 축적량을 비교한 결과, 동일한 조건하에서 CJI2335_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)가 모균주 대비 수율이 각각 21%, 22% 증가함을 확인하였다.

실시예 3: pstC 개시코돈 변환 균주 제작 및 XMP 생산능 평가

3-1. pstC 개시코돈 변환 재조합 벡터 및 XMP 생산 균주 제작

실시예 2-1에서 제작한 pDZ-pstC(ATG) 벡터를 XMP 생산능을 가진 균주인 CJX1664, CJX1664::purA(G85S)에 일렉트로포레이션법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 변이 유전자가 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 pstC의 개시코돈이 ATG로 변경된 균주를 얻었다. 개시코돈이 변경된 유전자는 상기 실시예 2-1에서와 동일한 방법으로 확인하였으며, 이를 통해 획득된 pstC 개시코돈 변환 균주를 CJX1664_pstC(g1a), CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)로 명명하였다.

3-2. pstC 개시코돈 변환 균주의 XMP 생산능 평가

상기 CJX1664_pstC(g1a), CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a) 균주의 XMP 생산능을 측정하기 위하여 상기 실시예 1-2의 방법으로 플라스크 평가를 실시하였으며, 배양 결과는 하기 표 5와 같다.

	균주	XMP (g/L)
	균주	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJX1664	2.1	2.2	2.1	2.1
실험군1	CJX1664_pstC(g1a)	2.3	2.3	2.3	2.3
대조군2	CJX1664::purA(G85S)	2.2	2.2	2.3	2.2
실험군2	CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)	2.5	2.5	2.4	2.5

상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, CJX1664_pstC(g1a), CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)는 모균주에 비하여 XMP 수율이 각각 8%, 10% 향상되었음을 확인하였다.

실시예 4: pstS 및 pstC 개시코돈 동시 변환 균주 제작 및 IMP 생산능 평가

4-1. pstS 및 pstC 개시코돈 동시 변환 IMP 생산 균주 제작

높은 활성을 나타내는 개시 코돈(ATG)을 pstS와 pstC 두 유전자 모두에 도입한 균주를 제작하기 위하여 실시예 2-1에서 제작한 균주인 CJI2335_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)에 실시예 1-1의 방법으로 제작 벡터 pDZ-pstS(ATG)을 삽입하였다. 벡터가 삽입된 균주 선별 방법은 실시예 1-1과 동일하였다. 이 과정을 통해, pstS와 pstC의 개시코돈이 변환 재조합 벡터로 형질전환된 균주가 선별되었고 2차 선별과정을 통해 균주제작을 완료하였다. 그 제작 균주를 CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)로 명명하였다.

4-2. pstS 및 pstC 개시코돈 동시 변환 균주의 IMP 생산능 평가

상기 CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a) 균주의 IMP 생산능을 측정하기 위하여 상기 실시예 2-2의 방법으로 플라스크 평가를 실시하였다.

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 IMP 생산량을 측정하였다. CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)에 대한 배양 결과는 하기 표 6과 같다.

	균주	IMP (g/L)
	균주	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJI2335_pstC(g1a)	0.8	0.8	0.7	0.8
실험군1	CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a)	0.9	0.9	0.8	0.9
대조군2	CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)	0.8	0.7	0.7	0.7
실험군2	CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)	0.9	0.8	0.9	0.9

상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a), CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)는 모균주에 비하여 IMP 생산량이 각각 13%, 18% 증가되었음을 확인하였다.

실시예 5: pstSC 강화를 위한 pstSCAB 오페론 강화 IMP 생산 균주 제작 제작 및 평가

5-1. 코리네박테리움 스테셔니스 유래 pstSC 강화를 위한 pstSCAB 유전자 오페론의 카피 수가 증가된 벡터 제작 및 IMP 생산 균주 제작

pstSC의 활성강화를 위해 카피 수를 증가시킨 미생물을 제작하여 IMP의 생산능을 평가하였다.

코리네박테리움 스테셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체를 실시예 1과 동일한 키트를 이용하여 분리하고, 이를 주형으로 하여 PCR을 진행하였다. 중합효소는 Maxime PCR PreMix (i-pfu) 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Intron)를 사용하였으며, PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 54℃ 30초 어닐링, 72℃ 9분 30초 중합을 24회 반복하여 수행하였다. 그 결과 프로모터 부위를 포함한 pstSCAB 유전자 두 쌍 (pstSCAB-A, pstSCAB-B)을 얻었다. pstSCAB-A는 4960 bp의 크기로 서열번호 21과 서열번호 22를 프라이머로 사용하여 증폭한 것이며, pstSCAB-B는 4960 bp의 크기로 서열번호 21과 서열번호 23을 프라이머로 하여 증폭한 것이다. 상기 pstSCAB-A와 pstSCAB-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (pstSCAB-A : XbaI, pstSCAB-B : XbaI 과 SpeI)를 처리하여 XbaI 및 SpeI으로 직선화시킨 pDZ 벡터에 3조각 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 pstSCAB 유전자 2개가 연속적으로 클로닝된 pDZ-2pstSCAB 재조합 벡터를 제작하였다.

상기 pDZ-2pstSCAB 벡터를 IMP 생산 균주인 CJI2335, CJI2332::purA(G85S)에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환 하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 pstSCAB 유전자의 바로 옆에 1개의 pstSCAB 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 pstSCAB 유전자는 2개의 pstSCAB 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 24와 서열번호 25의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다. 이 과정을 통해, pstSCAB 유전자 오페론 copy 수 증가 벡터로 형질전환된 균주가 선별되었고 그 제작 균주를 CJI2335_2pstSCAB, CJI2332::purA(G85S)_2pstSCAB로 명명하였다.

상기에서 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.

서열번호	명칭	서열
21	pstSCAB-Xba-F	TGCTCTAGAGAAGTGGCACGATGAAGTATCGCC
22	pstSCAB XbaI-R	TGCTCTAGAGCAGTCGATATTGCGCTGCTATCAC
23	pstSCAB SpeI-R	ACGACTAGTGCAGTCGATATTGCGCTGCTATCAC
24	pstSCAB-2copy-check-F	CACCATCGTGATCGTTACCCACAA
25	pstSCAB-2copy-check-R	GAATCATCTGCGGAATCAGAGCAAG

5-2. 코리네박테리움 스테셔니스 유래 pstSCAB 유전자 오페론의 카피 수가 증가된 균주의 IMP 생산능 평가

코리네박테리움 스테셔니스 유래 pstSC가 카피 수 증가로 활성이 강화된 CJI2335_2pstSCAB, CJI2332::purA(G85S)_2pstSCAB 균주와 모균주인 CJI2335, CJI2332::purA(G85S)를 이용하여 실시예 2-2의 플라스크 평가 방법으로 IMP 생산능을 평가하였으며 그 결과는 하기 표 8과 같다.

	균주	IMP (g/L)
	균주	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJI2335	0.7	0.6	0.6	0.6
실험군1	CJI2335_2pstSCAB	0.8	0.8	0.8	0.8
대조군2	CJI2332::purA(G85S)	0.6	0.6	0.6	0.6
실험군2	CJI2332::purA(G85S)_2pstSCAB	0.8	0.7	0.8	0.8

상기 표 8에서 나타낸 바와 같이, 위 결과와 같이 플라스크 발효 평가에서 CJI2335_2pstSCAB, CJI2332::purA(G85S)_2pstSCAB는 모균주에 비해 IMP 생산능이 각각 26%. 27% 향상됨을 확인하였다.

실시예 6: pstSC 강화를 위한 pstSCAB 오페론 강화 XMP 생산 균주 제작 및 평가

6-1. 코리네박테리움 스테셔니스 유래 pstSCAB 유전자 오페론의 카피 수가 증가된 XMP 생산 균주 제작

상기 실시예 5-1에서 제작된 pDZ-2pstSCAB 벡터가 도입된 XMP 생산 균주인 CJX1664, CJX1664::purA(G85S)에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 pstSCAB 유전자의 바로 옆에 1개의 pstSCAB 유전자를 추가로 삽입하여 총 개수를 2개로 증가시킨 균주를 얻었다. 연속적으로 삽입된 pstSCAB 유전자는 2개의 pstSCAB 연결부위를 증폭할 수 있는 서열번호 24와 25의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다. 위와 같은 방법으로 획득된 pstSCAB 카피 수가 증가된 균주는 CJX1664_2pstSCAB, CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB로 명명하였다.

6-2. 코리네박테리움 스테셔니스 유래 pstSCAB 유전자 오페론의 카피 수가 증가된 균주의 XMP 생산능 평가

상기 CJX1664_2pstSCAB, CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB 균주의 XMP 생산능을 측정하기 위하여 실시예 1-2와 같이 플라스크 평가를 실시하였다.

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 XMP 생산량을 측정하였다. CJX1664, CJX1664::purA(G85S), CJX1664_2pstSCAB, CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB에 대한 배양 결과는 아래 표 9와 같다.

	균주	XMP (g/L)
	균주	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJX1664	2.1	2.2	2.1	2.1
실험군1	CJX1664_2pstSCAB	2.3	2.3	2.4	2.3
대조군2	CJX1664::purA(G85S)	2.2	2.2	2.3	2.2
실험군2	CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB	2.4	2.4	2.4	2.4

상기 표 9에서 나타낸 바와 같이, CJX1664_2pstSCAB, CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB은 모균주에 비하여 XMP 생산능이 각각 9%, 7% 향상되었다.

실시예 7: pstSC 강화를 위한 pstSCAB 유전자 프로모터 치환 IMP 생산 균주 제작 및 평가

7-1. pstSCAB 유전자 프로모터 치환 재조합 벡터 제작 및 IMP 생산 균주 제작

인산 유입인자 Pst 시스템의 구성요소 단백질을 코딩하는 pstSC의 발현량을 증가시키기 위해, 염색체 내 pstS 자체 프로모터를 활성이 강하다고 공지된 cj7 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호)로 교체하였다.

우선, cj7 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 양끝 말단 부위는 염색체상의 원래의 서열을 갖는 상동 재조합 벡터를 제작하였다.

구체적으로, pstS 유전자에 cj7 프로모터 삽입용 벡터제작을 위해 코리네박테리움 스테셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체를 실시예 1의 방법에 의해 분리하였다. 이를 주형으로 하여 막심 (Maxime) PCR 프리믹스 (i-pfu) 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Intron)를 이용하여 PCR을 진행하였으며, PCR은 95℃에서 5분 변성 후, 95℃ 30초 변성, 54℃ 30초 어닐링 및 72℃, 1분 30초 중합을 24회 반복하여 수행하였다. 그 결과, 두 종류의 서로 다른 PCR 생성물 (PstSpro-A, PstSpro-B)을 얻었다. PstSpro-A는 981 bp의 크기이며, 서열번호 26, 서열번호 27을 프라이머로 사용하여 증폭한 것이다. 그리고 PstSpro-B는 2026 bp 크기이며, 서열번호 28, 서열번호 29를 프라이머로 사용하여 증폭한 것이다. 상기 두 종류의 증폭 산물을 주형으로 하여 소잉 (sewing) PCR 기법으로 2차 PCR을 수행하였다. PCR은 상기와 동일 조건에서 수행하였고, BamHI과 NdeI 제한효소 사이트를 가운데에 포함하는 2988 bp의 pstS 유전자의 PCR 생성물을 얻었다. 이후에 상기 증폭 산물을 양 말단에 위치한 제한효소 위치 (PstSpro-A와 PstSpro-B : XbaI)를 이용하여 자른 후, T4 리가아제의 활성을 이용해 pDZ 벡터에 클로닝하였으며 이를 통해 pDZ-PstSpro 벡터를 얻었다.

상기 획득한 벡터를 이용하여 CJI2335, CJI2332::purA(G85S) 염색체상의 pstS 유전자의 프로모터가 cj7 프로모터로 치환될 수 있는 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 스테셔니스 야생형인 ATCC6872 유전체를 주형으로 하여 다음과 같이 PCR을 진행하였다. 중합효소는 Maxime PCR PreMix (i-pfu) 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Intron)를 사용하였으며, PCR은 95℃에서 5분 변성 후, 95℃ 30초 변성, 54℃ 30초 어닐링 및 72℃, 2분 30초 중합을 24회 반복하여 수행하였다. 그 결과 cj7 프로모터 유전자의 양 말단에 BamHI과 NdeI 제한효소 사이트를 가지는 유전자를 획득하였다. 이 유전자는 서열번호 30, 서열번호 31을 프라이머로 이용하여 증폭하였으며, 크기는 491 bp이다. 이 유전자와 상기 pDZ-PstSpro 벡터를 BamHI 및 NdeI 제한효소로 처리한 후 T4 유전자 리가아제를 이용한 방법으로 클로닝하여 pDZ-pCJ7/PstSCAB 벡터를 획득하였다.

상기에서 제작된 pDZ-pCJ7/PstSCAB 벡터를 IMP 생산 균주인 코리네박테리움 스테셔니스 CN01-1811 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환 하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 pstSCAB의 프로모터가 cj7 프로모터로 치환된 균주를 제작하였다. 치환된 cj7 프로모터는 cj7 프로모터와 pstS 유전자의 일부를 연결하여 증폭할 수 있는 서열번호 32, 서열번호 33을 프라이머 쌍으로 한 PCR을 통하여 최종 확인하였다. 이와 같은 방법으로 획득된 균주를 CJI2335_Pcj7/pstS, CJI2332::purA(G85S)_Pcj7/pstS 로 명명하였다.

상기에서 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.

서열 번호	명칭	서열
26	PstSpro-A-F	TGCTCTAGAGAAGCAGTTGCCGCAAGCG
27	PstS-pro-A-R	CATATGGAATTCCGGATCCGGGGAAACCTTTCCGGTTAATTTCAG
28	PstSpro-B-F	GGATCCGGAATTCCATATGATTCGCAACTTTAAGCGCTCC
29	PstSpro-B-R	TGCTCTAGACAGACAGGCCCTCATCCTGG
30	CJ7pro-F	CGCGGATCCTTCCTTCAGGCTAATCTTTTCCGGG
31	CJ7pro-R	GGAATTCCATATGCATATGTGTTTCCTTTCGTTGGGTACG
32	CJ7pro-check-F	CTACGACCTCAGCGTGATTGGTTTG
33	PstS-check-R	CAGGAAGTCCTTGACCAAGTTTGCC

7-2. pstSCAB 유전자 프로모터 치환 균주의 IMP 생산능 평가

코리네박테리움 스테셔니스 유래 pstSC의 cj7 프로모터 적용으로 활성이 강화된 CJI2335_Pcj7/pstS, CJI2332::purA(G85S)_Pcj7/pstS 균주와 모균주인 CJI2335, CJI2332::purA(G85S)를 이용하여 실시예 2-2의 플라스크 평가 방법으로 IMP 생산능을 평가하였으며 그 결과는 하기 표 11과 같다.

	균주	IMP (g/L)
	균주	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJI2335	0.7	0.6	0.6	0.6
실험군1	CJI2335_Pcj7/pstS	0.8	0.8	0.7	0.8
대조군2	CJI2332::purA(G85S)	0.6	0.6	0.6	0.6
실험군2	CJI2332::purA(G85S)_Pcj7/pstS	0.8	0.8	0.8	0.8

상기 표 11에서 나타낸 바와 같이, pstSCAB 유전자의 프로모터를 강화시킨 균주 CJI2335_Pcj7/pstS, CJI2332::purA(G85S)_Pcj7/pstS의 경우 플라스크 발효에서 모균주 대비 각각 21%, 28% 향상된 IMP 생산능을 나타내었다.

실시예 8: pstSC 강화를 위한 pstSCAB 유전자 프로모터 치환 XMP 생산 균주 제작 및 평가

8-1. pstSCAB 유전자 프로모터 치환 XMP 균주 제작

실시예 7-1에서 제작된 pDZ-pCJ7/PstSCAB 벡터를 XMP 생산 균주인 CJX1664, CJX1664::purA(G85S) 균주에 일렉트로포레이션법을 통하여 형질전환 하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 내재적 pstSCAB의 프로모터가 cj7 프로모터로 치환된 균주를 제작하였다. 치환된 cj7 프로모터는 cj7 프로모터와 pstS 유전자의 일부를 연결하여 증폭할 수 있는 서열번호 32, 서열번호 33를 프라이머 쌍으로 한 PCR을 통하여 최종 확인하였다. 이와 같은 방법으로 획득된 균주를 CJX1664_Pcj7/pstS, CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS로 명명하였다.

8-2. pstSCAB 유전자 프로모터 치환 균주의 XMP 생산능 평가

코리네박테리움 스테셔니스 유래 pstSC의 cj7 프로모터 적용으로 활성이 강화된 CJX1664_Pcj7/pstS, CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS 균주와 모균주인 CJX1664, CJX1664::purA(G85S)를 이용하여 실시예 1-2의 플라스크 평가 방법으로 XMP 생산능을 평가하였으며 그 결과는 하기 표 12와 같다.

	균주번호	XMP (g/L)
	균주번호	Flask1	Flask2	Flask3	평균
대조군1	CJX1664	2.1	2.2	2.1	2.1
실험군1	CJX1664_Pcj7/pstS	2.5	2.3	2.5	2.4
대조군2	CJX1664::purA(G85S)	2.2	2.2	2.3	2.2
실험군2	CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS	2.5	2.5	2.5	2.5

상기 표 12에서 나타낸 바와 같이, pstSCAB 유전자의 프로모터를 강화시킨 균주 CJX1664_Pcj7/pstS, CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS의 경우 플라스크 발효에서 모균주 대비 각각 14%, 12% 향상된 XMP 생산능을 나타내었다.

상기 CJX1664_Pcj7/pstS는 CJX1911, CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS는 CJX1912라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 12월 20일자로 기탁하여 각각 수탁번호 KCCM12647P, KCCM12648P를 부여받았다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12647P

20191220

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12648P

20191220

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganisms that produce purine nucleotides and methods of producing purine nucleotides using the same <130> KPA191450-KR <160> 33 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1119 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> pstS <400> 1 gtgattcgca actttaagcg ctccgctgcc atcatcggtg ccgtcgcagc ttcctctgtc 60 gcactggtag cttgctctga ttccgcagat gattctgcaa acggcggcga agcagcagca 120 gagctgcctg gcggttacgc gctctctggc gcaaccggcg gcctagttgc tgaaggtgcg 180 tcctctcagc aaaacgccat ggactacttc ggtgcgatgt accaggaagc cactggtggc 240 gacgcttact tggagtacaa cccaactggt tccggttccg gccgtaccaa cttcgtcgct 300 ggccaggtag tctttgcagg ttctgactcc cctctggagg aggaccaggt agaggcagct 360 gcagagcgct gtggcggcaa cgatgcatgg cacctgccat tcgttattgg cccagttgca 420 atcgcctaca accttgaggg cgttgaagag tccatcaacc tgagcaccga aaccctgggc 480 aagattttcg ctggcgacat caccaagtgg aacgatgacg caatcgcttc tgagaacgaa 540 ggcgttgaac tgccagatac tgacatctcc gtggtttacc gttccgacga gtccggtacc 600 tcggacaact tccagaagtt cctgagcgct tccaccggtg actgggaagg cgaaggcacc 660 aacttcccaa ccgcagttgg tgaaggcgca aacggttctt ccggtgttgc tacccaggtt 720 cagcagatca acggtggcat cacctacgtc gagcactctc acgcagcaga ctccggtctg 780 gacattgcga acatcgactt cggcaacggc ccaaccgagc tgaacgaaga gtccgtgggt 840 gcggcacttg aggctatgga gttcaccacc gagggcaacg acatggttgt cgactccgat 900 gcactcttcg cttccgatgc aggttaccca ctcatcctga ccacttacga gattgtttgc 960 tccggtggat acagcgaaga tgaggcaaac ttggtcaagg acttcctgat gaccgcactg 1020 gcttaccagg atgagggcct gtctgaggct ggccacattc cagtaaccgg tggccactat 1080 gaccgcctcg ttgaggctgt tgaagcaatc aacagctaa 1119 <210> 2 <211> 372 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PstS <400> 2 Met Ile Arg Asn Phe Lys Arg Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ala Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ser Val Ala Leu Val Ala Cys Ser Asp Ser Ala Asp Asp Ser 20 25 30 Ala Asn Gly Gly Glu Ala Ala Ala Glu Leu Pro Gly Gly Tyr Ala Leu 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Gly Gly Leu Val Ala Glu Gly Ala Ser Ser Gln Gln 50 55 60 Asn Ala Met Asp Tyr Phe Gly Ala Met Tyr Gln Glu Ala Thr Gly Gly 65 70 75 80 Asp Ala Tyr Leu Glu Tyr Asn Pro Thr Gly Ser Gly Ser Gly Arg Thr 85 90 95 Asn Phe Val Ala Gly Gln Val Val Phe Ala Gly Ser Asp Ser Pro Leu 100 105 110 Glu Glu Asp Gln Val Glu Ala Ala Ala Glu Arg Cys Gly Gly Asn Asp 115 120 125 Ala Trp His Leu Pro Phe Val Ile Gly Pro Val Ala Ile Ala Tyr Asn 130 135 140 Leu Glu Gly Val Glu Glu Ser Ile Asn Leu Ser Thr Glu Thr Leu Gly 145 150 155 160 Lys Ile Phe Ala Gly Asp Ile Thr Lys Trp Asn Asp Asp Ala Ile Ala 165 170 175 Ser Glu Asn Glu Gly Val Glu Leu Pro Asp Thr Asp Ile Ser Val Val 180 185 190 Tyr Arg Ser Asp Glu Ser Gly Thr Ser Asp Asn Phe Gln Lys Phe Leu 195 200 205 Ser Ala Ser Thr Gly Asp Trp Glu Gly Glu Gly Thr Asn Phe Pro Thr 210 215 220 Ala Val Gly Glu Gly Ala Asn Gly Ser Ser Gly Val Ala Thr Gln Val 225 230 235 240 Gln Gln Ile Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Val Glu His Ser His Ala Ala 245 250 255 Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ala Asn Ile Asp Phe Gly Asn Gly Pro Thr 260 265 270 Glu Leu Asn Glu Glu Ser Val Gly Ala Ala Leu Glu Ala Met Glu Phe 275 280 285 Thr Thr Glu Gly Asn Asp Met Val Val Asp Ser Asp Ala Leu Phe Ala 290 295 300 Ser Asp Ala Gly Tyr Pro Leu Ile Leu Thr Thr Tyr Glu Ile Val Cys 305 310 315 320 Ser Gly Gly Tyr Ser Glu Asp Glu Ala Asn Leu Val Lys Asp Phe Leu 325 330 335 Met Thr Ala Leu Ala Tyr Gln Asp Glu Gly Leu Ser Glu Ala Gly His 340 345 350 Ile Pro Val Thr Gly Gly His Tyr Asp Arg Leu Val Glu Ala Val Glu 355 360 365 Ala Ile Asn Ser 370 <210> 3 <211> 1071 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> pstC <400> 3 gtggctgact acaactcgac ctcgggcgac cacgtcaaac tggaagataa ccgaaccgtt 60 gatacccatc cggtgaccgt aaactccagc ggtgccgcgg cacctgcagg tgtagataac 120 ggtgccactc cgaaagccgt tcgtcgcatc ggcgaccgcg ttttcgaaac gctatccact 180 gcatccgcaa cactgattac ggtattcatt gccgccatcg gtatcttcct tgtcctccgt 240 gcaattcctg cacttaaccg aaacgccaac ggattcctag gattctttac gtacaccgat 300 acgtggaata cctccgatgt tgagaacatg tacttcggca ttccgaacct gttcgcagca 360 accgtcatga tgtcagtctt ggcgttgatc atcgctatgc caattgcttt gggcgttgcg 420 atcttcttgt ccaactacgc accaaagtcc atcgttaagc caatgggcta cttggtcgac 480 atgctagctg cagttccttc catcgtttac ggcctgtggg gctggctggt gcttggccca 540 ttcctatctg gcttctacaa gtggattgaa agctggggga gcggcttctt cctgtttgcg 600 acctacagca acagcccatc gtttgaaacc ggccgtaacc tgtttaccgg tggcattgtt 660 ctagcaatca tgattttgcc aatcattgcc gcaaccacac gcgaaatctt cgtgcagacg 720 cctaaaggcc aggtcgaatc cgcattggct ctcggcgcta cccgctggga agttgtacgc 780 atgaccgtgc tgcctttcgg tatgtccggc tacatctccg gttcgatgct cggcttgggc 840 cgcgcccttg gtgaaaccat ggcgctatac atggtggttt ccccatcgac cgcattccgc 900 ggttcgttat ttgacggtgg tacaacattt gcaaccgcaa ttgcgaacgc ggcaccggaa 960 tttaataacg acatcaaggc aggcgcttat attgctgccg gcctagtcct gttcctcttg 1020 accttcgtgg tcaacgcgat tgctcgctcg attgttgcgg gcaagaaata g 1071 <210> 4 <211> 356 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PstC <400> 4 Met Ala Asp Tyr Asn Ser Thr Ser Gly Asp His Val Lys Leu Glu Asp 1 5 10 15 Asn Arg Thr Val Asp Thr His Pro Val Thr Val Asn Ser Ser Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Gly Val Asp Asn Gly Ala Thr Pro Lys Ala Val Arg 35 40 45 Arg Ile Gly Asp Arg Val Phe Glu Thr Leu Ser Thr Ala Ser Ala Thr 50 55 60 Leu Ile Thr Val Phe Ile Ala Ala Ile Gly Ile Phe Leu Val Leu Arg 65 70 75 80 Ala Ile Pro Ala Leu Asn Arg Asn Ala Asn Gly Phe Leu Gly Phe Phe 85 90 95 Thr Tyr Thr Asp Thr Trp Asn Thr Ser Asp Val Glu Asn Met Tyr Phe 100 105 110 Gly Ile Pro Asn Leu Phe Ala Ala Thr Val Met Met Ser Val Leu Ala 115 120 125 Leu Ile Ile Ala Met Pro Ile Ala Leu Gly Val Ala Ile Phe Leu Ser 130 135 140 Asn Tyr Ala Pro Lys Ser Ile Val Lys Pro Met Gly Tyr Leu Val Asp 145 150 155 160 Met Leu Ala Ala Val Pro Ser Ile Val Tyr Gly Leu Trp Gly Trp Leu 165 170 175 Val Leu Gly Pro Phe Leu Ser Gly Phe Tyr Lys Trp Ile Glu Ser Trp 180 185 190 Gly Ser Gly Phe Phe Leu Phe Ala Thr Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Phe 195 200 205 Glu Thr Gly Arg Asn Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Leu Ala Ile Met 210 215 220 Ile Leu Pro Ile Ile Ala Ala Thr Thr Arg Glu Ile Phe Val Gln Thr 225 230 235 240 Pro Lys Gly Gln Val Glu Ser Ala Leu Ala Leu Gly Ala Thr Arg Trp 245 250 255 Glu Val Val Arg Met Thr Val Leu Pro Phe Gly Met Ser Gly Tyr Ile 260 265 270 Ser Gly Ser Met Leu Gly Leu Gly Arg Ala Leu Gly Glu Thr Met Ala 275 280 285 Leu Tyr Met Val Val Ser Pro Ser Thr Ala Phe Arg Gly Ser Leu Phe 290 295 300 Asp Gly Gly Thr Thr Phe Ala Thr Ala Ile Ala Asn Ala Ala Pro Glu 305 310 315 320 Phe Asn Asn Asp Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Ile Ala Ala Gly Leu Val 325 330 335 Leu Phe Leu Leu Thr Phe Val Val Asn Ala Ile Ala Arg Ser Ile Val 340 345 350 Ala Gly Lys Lys 355 <210> 5 <211> 918 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> pstA <400> 5 atgactaaca ttacagctcc tgcacaaacc ggagtcggta aaacctccgc gttcttgcaa 60 atctcggctc gccgcaaggc caccgataat atcgctaagt atctcatcta cttctgcatg 120 ggcttagcag taattccttt gattctcgtt ctgtgggaac tgatttctaa gggccttcca 180 ccagtgctca acgctgaatg gtggaccgat gacatgctgg gtacccgcta cgcccaagaa 240 ggaggcggcg cgatccatgc gattatcggt accttggtgc agtcggttct agcatctatc 300 atcgctatcc ctatcggtat cttcaccgca atctacttgg ttgagtactc ccgtggcggc 360 tggctcggac gcaccacaac cttcatggtg gatatcttgt ccggtgtgcc ttcgatcgtt 420 gcagcactgt tcgtctacgc ggcctggatt acggtcctag gtttcgaccg ctccggcttg 480 gccgtggctt ggtccctgtt gctgttgatg attccaattg tggttcgcaa caccgaagaa 540 atgctgcgcg ttgttccaat ggacttgcgc gaggctgcct acgctcttgg cgttccaaag 600 tggaagacta tcgcgcgcat tgttcttcca actgcattgt ccggtattgc aaccggcatc 660 atgctggcga ttgcccgcat catgggtgag tctgcaccag ttctgattct ggttggtacc 720 accccggcgc tgaagtggga ccccaccggt ggcccaatgt cttccttgcc gttgatgatg 780 ctcgatatgt tcaaggccgg tttgaacccg aatgttcttg acaagatgtg gggcgcagca 840 ttcacgctgg ttctgatcat cgcaatttta aatattggtg ctcgcgtaat ttccgcgaaa 900 ttctccatca aacagtag 918 <210> 6 <211> 305 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PstA <400> 6 Met Thr Asn Ile Thr Ala Pro Ala Gln Thr Gly Val Gly Lys Thr Ser 1 5 10 15 Ala Phe Leu Gln Ile Ser Ala Arg Arg Lys Ala Thr Asp Asn Ile Ala 20 25 30 Lys Tyr Leu Ile Tyr Phe Cys Met Gly Leu Ala Val Ile Pro Leu Ile 35 40 45 Leu Val Leu Trp Glu Leu Ile Ser Lys Gly Leu Pro Pro Val Leu Asn 50 55 60 Ala Glu Trp Trp Thr Asp Asp Met Leu Gly Thr Arg Tyr Ala Gln Glu 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ala Ile His Ala Ile Ile Gly Thr Leu Val Gln Ser Val 85 90 95 Leu Ala Ser Ile Ile Ala Ile Pro Ile Gly Ile Phe Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Leu Val Glu Tyr Ser Arg Gly Gly Trp Leu Gly Arg Thr Thr Thr Phe 115 120 125 Met Val Asp Ile Leu Ser Gly Val Pro Ser Ile Val Ala Ala Leu Phe 130 135 140 Val Tyr Ala Ala Trp Ile Thr Val Leu Gly Phe Asp Arg Ser Gly Leu 145 150 155 160 Ala Val Ala Trp Ser Leu Leu Leu Leu Met Ile Pro Ile Val Val Arg 165 170 175 Asn Thr Glu Glu Met Leu Arg Val Val Pro Met Asp Leu Arg Glu Ala 180 185 190 Ala Tyr Ala Leu Gly Val Pro Lys Trp Lys Thr Ile Ala Arg Ile Val 195 200 205 Leu Pro Thr Ala Leu Ser Gly Ile Ala Thr Gly Ile Met Leu Ala Ile 210 215 220 Ala Arg Ile Met Gly Glu Ser Ala Pro Val Leu Ile Leu Val Gly Thr 225 230 235 240 Thr Pro Ala Leu Lys Trp Asp Pro Thr Gly Gly Pro Met Ser Ser Leu 245 250 255 Pro Leu Met Met Leu Asp Met Phe Lys Ala Gly Leu Asn Pro Asn Val 260 265 270 Leu Asp Lys Met Trp Gly Ala Ala Phe Thr Leu Val Leu Ile Ile Ala 275 280 285 Ile Leu Asn Ile Gly Ala Arg Val Ile Ser Ala Lys Phe Ser Ile Lys 290 295 300 Gln 305 <210> 7 <211> 774 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> pstB <400> 7 atgtcaaagc tcgaactcaa tgacgtggac atcttctacg gtgatttcca cgctgtgcaa 60 aatgtcaata tgcacatccc ggctcaggca gtgaccgcgt tcattggccc atccggctgt 120 ggtaagtcca cagttctgcg cagtatcaac cgcatgcacg aagttatccc tggcgcatat 180 gtcaagggtg aaatcctgct cgacggtgaa aacatctacg gctcaaagat tgacccagtc 240 tccgtacgca acaccatcgg catggtcttc cagaaagcta atccatttcc aaccatgtcc 300 atcgaggaca acgtggtggc gggcctgaag ctgtccggcg tcaaggacaa gaagaagctc 360 aaggaagtag ctgagaagtc tcttcgcggc gcaaacctgt gggatgaggt caaggaccgt 420 ctggataagc caggcggcgg cctctccggt ggtcagcagc agcgtctgtg catcgctcgc 480 gcgatcgctg tggagccaga agttctgctc atggatgagc catgctcggc actggaccca 540 atttcgaccc ttgctgtgga agatttgatc cacgagctga aggaaaactt caccatcgtg 600 atcgttaccc acaacatgca gcaggctgca cgtgtatccg ataagactgg tttcttctcc 660 ttggaagcaa ctggccgccc tggacacctt gtggaattca acgagaccaa gaagatcttc 720 gaaaacccag ataagaagga aaccgaagac tacatctccg gccgcttcgg ctaa 774 <210> 8 <211> 257 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PstB <400> 8 Met Ser Lys Leu Glu Leu Asn Asp Val Asp Ile Phe Tyr Gly Asp Phe 1 5 10 15 His Ala Val Gln Asn Val Asn Met His Ile Pro Ala Gln Ala Val Thr 20 25 30 Ala Phe Ile Gly Pro Ser Gly Cys Gly Lys Ser Thr Val Leu Arg Ser 35 40 45 Ile Asn Arg Met His Glu Val Ile Pro Gly Ala Tyr Val Lys Gly Glu 50 55 60 Ile Leu Leu Asp Gly Glu Asn Ile Tyr Gly Ser Lys Ile Asp Pro Val 65 70 75 80 Ser Val Arg Asn Thr Ile Gly Met Val Phe Gln Lys Ala Asn Pro Phe 85 90 95 Pro Thr Met Ser Ile Glu Asp Asn Val Val Ala Gly Leu Lys Leu Ser 100 105 110 Gly Val Lys Asp Lys Lys Lys Leu Lys Glu Val Ala Glu Lys Ser Leu 115 120 125 Arg Gly Ala Asn Leu Trp Asp Glu Val Lys Asp Arg Leu Asp Lys Pro 130 135 140 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Leu Cys Ile Ala Arg 145 150 155 160 Ala Ile Ala Val Glu Pro Glu Val Leu Leu Met Asp Glu Pro Cys Ser 165 170 175 Ala Leu Asp Pro Ile Ser Thr Leu Ala Val Glu Asp Leu Ile His Glu 180 185 190 Leu Lys Glu Asn Phe Thr Ile Val Ile Val Thr His Asn Met Gln Gln 195 200 205 Ala Ala Arg Val Ser Asp Lys Thr Gly Phe Phe Ser Leu Glu Ala Thr 210 215 220 Gly Arg Pro Gly His Leu Val Glu Phe Asn Glu Thr Lys Lys Ile Phe 225 230 235 240 Glu Asn Pro Asp Lys Lys Glu Thr Glu Asp Tyr Ile Ser Gly Arg Phe 245 250 255 Gly <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS(ATG)-A-F <400> 9 gggtctagac cacaaacaga attaatggta 30 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS(ATG)-A-R <400> 10 gcttaaagtt gcgaatcatg gggaaac 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS(ATG)-B-F <400> 11 ccggaaaggt ttccccatga ttcgcaa 27 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS(ATG)-B-R <400> 12 gggtctagag acgtaggtga tgccaccgtt 30 <210> 13 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS(ATG)-mismatch-wt-F <400> 13 gaaaggtttc cccg 14 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstS(ATG)-mismatch-mut-F <400> 14 gaaaggtttc ccca 14 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstC(ATG)-A-F <400> 15 gggtctagac atcaacctga gcaccgaaac 30 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstC(ATG)-A-R <400> 16 tcaggagtgt cgtaaacata ccataca 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstC(ATG)-B-F <400> 17 cgctggcttg tatggtatgt ttacgac 27 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstC(ATG)-B-R <400> 18 gggtctagaa ccggtaaaca ggttacggcc 30 <210> 19 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstC(ATG)-mismatch-wt-F <400> 19 tggcttgtat ggtg 14 <210> 20 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstC(ATG)-mismatch-mut-F <400> 20 tggcttgtat ggta 14 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstSCAB-Xba-F <400> 21 tgctctagag aagtggcacg atgaagtatc gcc 33 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstSCAB XbaI-R <400> 22 tgctctagag cagtcgatat tgcgctgcta tcac 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstSCAB SpeI-R <400> 23 acgactagtg cagtcgatat tgcgctgcta tcac 34 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstSCAB-2copy-check-F <400> 24 caccatcgtg atcgttaccc acaa 24 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pstSCAB-2copy-check-R <400> 25 gaatcatctg cggaatcaga gcaag 25 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PstSpro-A-F <400> 26 tgctctagag aagcagttgc cgcaagcg 28 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PstS-pro-A-R <400> 27 catatggaat tccggatccg gggaaacctt tccggttaat ttcag 45 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PstSpro-B-F <400> 28 ggatccggaa ttccatatga ttcgcaactt taagcgctcc 40 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PstSpro-B-R <400> 29 tgctctagac agacaggccc tcatcctgg 29 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7pro-F <400> 30 cgcggatcct tccttcaggc taatcttttc cggg 34 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7pro-R <400> 31 ggaattccat atgcatatgt gtttcctttc gttgggtacg 40 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7pro-check-F <400> 32 ctacgacctc agcgtgattg gtttg 25 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PstS-check-R <400> 33 caggaagtcc ttgaccaagt ttgcc 25

Claims

pstSCAB 오페론에 의하여 코딩되는 인산 유입 시스템의 활성이 강화된, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis).
제1항에 있어서, 상기 인산 유입 시스템의 활성 강화는, pstS, pstC, pstA, 및 pstB로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성이 강화되는 것인, 코리네박테리움 스테셔니스.
제2항에 있어서, 상기 pstS 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 코리네박테리움 스테셔니스.
제2항에 있어서, 상기 pstC 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 코리네박테리움 스테셔니스.
삭제
제1항에 있어서, 상기 퓨린 뉴클레오티드는 5'-이노신산 (5'-inosine monophosphate, IMP), 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate, XMP) 및 5'-구아닌산 (5'-guanosine monophosphate, GMP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 코리네박테리움 스테셔니스.
pstSABC 오페론에 의하여 코딩되는 인산 유입 시스템의 활성이 강화된, 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법으로서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 스테셔니스 (Corynebacterium stationis)인, 생산 방법.
제7항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 퓨린 뉴클레오티드를 회수하는 단계를 포함하는 것인, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법.
제8항에 있어서, 상기 퓨린 뉴클레오티드는 5'-이노신산, 5'-크산틸산 및 5'-구아닌산로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법.