DE69332024T2 - Die trennung lebender säugetierzellen durch hoch geschwindigkeits-durchflusscytometrie - Google Patents

Description

• Die hierin beschriebene Arbeit wurde durch einen Vertrag zwischen der University of California und dem United States Department of Energy zum Betreiben des Lawrence Livermore National Laboratory mit der Vertragsnummer W-7405-ENG-48 unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten kann bestimmte Rechte an dieser Erfindung haben.
Einführung Technisches Gebiet
• Das Gebiet der Erfindung ist die Abtrennung von Säugerzelluntergruppen.
Hintergrund
• Es gibt eine unvergleichliche Vielfalt an Zellen in Säugern. Zellen, die verschiedene Organe und Gewebe aufbauen, können eine große Vielzahl an unterschiedlichen Zelltypen mit unterschiedlichen Funktionen umfassen und unter Bildung von unterschiedlichen Strukturen wechselwirken. In vielen Situationen führt die Isolierung des Gewebes oder des Organs zu einem komplexen Zellgemisch, worin eine Gruppe oder eine Untergruppe an Zellen erwünscht ist. Dies wird graphisch durch hämatopoetische Zellen beispielhaft dargestellt, wie sie insbesondere im Knochenmark und dem peripheren Blut, wie auch in vielen lymphoiden Organen gefunden werden.
• Einer der vielseitigsten Wege zur Abtrennung von Zellen ist durch Duchlflußcytometrie, worin die Partikel, das heißt Zellen, durch Fluoreszenz oder Lichtstreuung detektiert werden können. Jedoch ist aufgrund der geringen Prozessierungsrate, die herkömmlichen Zellsortiennaschinen eigen ist, eine Reinigung einer kleinen Zellpopulation aus einer großen Anzahl an Zellen nicht möglich.
• Beispielhaft für die Situation mit Zellen ist der Versuch, eine große Anzahl an Chromosomen zur Herstellung von rekombinanten DNA Banken oder Genkartierung zu reinigen. Berechnungen zeigen, daß ein im Handel erhältlicher Zellsortierer, der im Mittel mit 2000 Ereignissen pro Sekunde arbeitet, über 120 Stunden benötigen würde, um 1 ug DNA zu erhalten (Cremer et al., Human Genet. 60, 262-266 [1982]).
• Kürzlich wurde ein Hochgeschwindigkeitszellsortierer am Lawrence Livermore National Laboratory entwickelt, der zur routinemäßigen Reinigung von großen Mengen an humanen Chromosomen in wenigen Stunden fähig ist, wo im Handel erhältliche Zellsortierer mehrere Tage benötigen würden. Dieser Sortierer ist beschrieben in Gray et al., Science 238, 323-329 (1987), Peters (1989), Chromosome purification by high speed sorting, Herausgeber J. Gray, in "Flow Cytogenetics", London, Academic press, Seiten 211-224, Peters et al., Cytometry (1985) 6, 290-301, von den Engh und Stockdijk, Cytometry (1989) 10, 282-293). Gray et al., Science (1987) 238 beschreiben die Trennung von Chromosomen bei einem Arbeitsdruck von 1,4 · 10&sup4; gcm&supmin;² (200 psi), siehe Tabelle 1, Seite 324 in einem Hochgeschwindigkeitssortierer.
• Peters et al., Cytometry (1985) beschreiben einen zweistrahligen Hochgeschwindigkeitssortierer (HiSS) mit einer Tröpfchenbildungsrate von 200000 s&supmin;¹, der zur Arbeitsweise bei hohen Drücken über 1,4 · 10&sup4; gcm&supmin;² (200 psi) fähig ist.
• Van der Engh und Stockdijk beschreiben ein parallel verarbeitendes Datenakquisitionssystem für eine Multilaserdurchflußcytometrie und Zellsortierung.
• Sasaki et al., 1987 beschreiben ein Verfahren zur simultanen Zweifarbenanalyse oder -sortierung von lebensfähigen Leukozyten, das nur einen einzigen Laser erfordert. Das Verfahren verwendet Popidiumiodid, das tote Zellen färbt und diese Zellen hierdurch von der Analyse ausschließt.
• Obwohl der Sortierer mit Chromosomen erfolgreich ist, dürfte die Art, auf die er die hohe Geschwindigkeit erreicht, einen außerordentlichen Streß auf die lebensfähigen Zellen ausüben. Der technologische Unterschied zwischen den im Handel erhältlichen Systemen und einem Hochgeschwindigkeitssortierer liegt in der signifikanten Erhöhung der Erzeugung stabiler Tröpfchen. Eine erhöhte Tröpfchenbildung kombiniert mit der Belegung von Partikeln gemäß der Poission Statistik stellt sicher, daß eine erhöhte Menge an "Raum" zwischen den Ereignissen existiert, um die Zurückweisungseffekte aufgrund von Coinzidenz zu vermindern. Dieser Faktor alleine minimiert die Wahrscheinlichkeit, daß man mehr als ein Ereignis pro Tropfen hat. Konstruktionsbetrachtungen, die in einen Hochgeschwindigkeitssortierer eingearbeitet sind, um höhere Tropfenfrequenzen zu erhalten, umfassen einen höheren Arbeitsdrnck (50-100 psi) im Vergleich zu herkömmlichen Sortierern, die etwa 5-15 psi, gewöhnlicher 12 psi verwenden, um die Flüssigkeit mit einer höheren Geschwindigkeit durch die Düse zu treiben, einen akustischen Schallkopf mit Ultraschallfrequenzmöglichkeiten (bis zu 200 kHz im Vergleich zu 20-30 kHz bei einem im Handel erhältlichen Sortierer), Tropfenbeladung, elektronische Ablenkungsuntersysteme und mit Hochgeschwindigkeit digital verarbeitende Elektronik. Für die Beschreibung jeder dieser Komponenten siehe experimenteller Teil.
• Es ist daher von substanziellem Interesse zu bestimmen, ob Parameter definiert werden können, bei denen lebensfähige Zellen effizient bei hohen Geschwindigkeiten sortiert werden können, um hohe Ausbeuten an Zelluntergruppenpopulationen zu erhalten, wobei im wesentlichen die Lebensfähigkeit beibehalten wird, der Phänotyp beibehalten wird und eine hohe Effizienz des isolierten Zellanteils, der erhalten wird, wie auch die Reinheit der erhaltenen Population erhalten werden.
Zusammenfassung der Erfindung
• Es werden Säugerzellen aus einem Zellgemisch isoliert, bei denen die gewünschte Population eine kleine Fraktion der gesamten Zellpopulation ist. Die Untergruppe von Interesse wird durch eine differenzielle Fluoreszenzmarkierung zwischen der Untergruppe von Interesse und den anderen vorkommenden Zellen und der Sortierung durch einen Hochgeschwindigkeitszellsortierer isoliert. Die Untergruppe kann als lebensfähige Zellen in hoher Reinheit mit einer Effizienz erhalten werden, die mit der Anzahl an Zellen vergleichbar ist, die ursprünglich in der Population vorhanden sind.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
• Es werden lebensfähige Zellen in zwei oder mehr unterschiedliche Populationen mit hoher Geschwindigkeit und hoher Effizienz unter Bildung von Untergruppen an lebensfähigen Zellen mit hoher Reinheit getrennt. Die Zelltypen können breit variieren, einschließlich hämatopoetische Zellen, neuronale Zellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Fibroblasten, Myoblasten, Mesenchymzellen, NK Zellen, reife/fötale Erythrocyten. Die Zellen von besonderem Interesse sind hämatopoetische Zellen, die Vorläufer und reife Zellen der lymphoiden, myelomonocytischen und erythroiden Linien umfassen, wie auch Stammzellen (die ursprünglichen Vorläufer) und Untergruppen dieser Zellen, wie T-Zellen und Untergruppen an T-Zellen, wie CD4&spplus; und CD8&spplus;, Zellen mit spezifischen Oberflächenmembranproteinen, wie T-Zellen mit einer spezifischen variablen Region, einem spezifischen Bindungsrezeptor, Wachstumsfaktor, Hormon und CSF Rezeptoren und Neurotransmitterrezeptoren.
• Die Zellen können von jedem Säuger stammen, einschließlich Primaten, insbesondere Mensch, Maus, vor allem Maus, Pferd, Rind, Huhn. Schwein, Kaninchen, Hund und Katze.
• Die Quelle der Zellen kann jede Quelle sein, die bequem ist. Die verschiedenen Gewebe, Organe und Flüssigkeiten können die Quelle der Zellgemische sein. Von besonderem Interesse sind Knochenmark und peripheres Blut, obwohl andere lymphoide Gewebe auch von Interesse sind, wie Milz, Thymus und Lymphknoten. Zur Verwendung in der Durchflußcytometrie werden Zellen aus festem Gewebe normalerweise in einem geeigneten Medium dispergiert.
• Die zellulären Zusammensetzungen, die in das Hochgeschwindigkeitsdurchflußcytometer eingeführt werden, können einer vorausgehenden Behandlung unterzogen worden sein oder auch nicht. Vorausgehende Behandlungen können die Entfernung von Zellen durch verschiedene Techniken umfassen, einschließlich Zentrifugation mittels Ficoll-Hypaque, Schwenkdekantieren, Affinitätstrennung mittels Antikörper, die für ein oder mehrere Marker spezifisch sind, die als Oberflächenmembranproteine auf den Oberflächen der Zellen vorkommen oder einer anderen Technik, die die Anreicherung der Gruppe oder Untergruppe der Zellen von Interesse bereitstellen. Gewöhnlich enthält die Zellzusammensetzung der hämatopoetischen Zellen, die durch die Hochgeschwindigkeitszytometrie abgetrennt werden, nicht mehr als etwa 5%, gewöhnlich nicht mehr als etwa 2% und gewöhnlicher nicht mehr als 1% der Zellanzahl von Interesse, und enthält gewöhnlich zumindest etwa 0,01%, vorzugsweise etwa 0,02 % und vorzugsweise mindestens etwa 0,05% der Zellen von Interesse.
• Die Zellen von Interesse unterscheiden sich im wesentlichen durch Oberflächenmembranproteine, die für die Zellen charakteristisch sind. Beispielswiese ist CD34 ein Marker für unreife hämatopoetische Zellen. Marker für bestimmte Zellen umfassen CD 10, CD 19, CD20 und sIg für B Zellen, CD 15, CD 16 und CD33 für myeloische Zellen, CD15 für Monocyten/Granulocyten, CD41 für Megakaryozyten, CD38 für abstammungsspezifische Zellen, CD3, CD4, CD7, CD8 und TCR für T-Zellen, Thy-1 für Vorläuferzellen und Glycophonin für erythroide Vorläufer. Bei der Isolierung von frühen Vorläufern kann man eine auf CD34&spplus; angereicherte Fraktion in Lin&supmin; (CD10&supmin;, CD19&supmin;, CD33&supmin;), Thy-1&spplus; oder in CD38&supmin; einteilen, um eine Zusammensetzung bereitzustellen, die im wesentlichen auf frühe Vorläuferzellen angereichert ist. Andere Marker von Interesse umfassen Vα und Vβ Ketten der T-Zellrezeptoren. Das Medium, worin die Zellen sortiert werden, umfaßt gewöhnlich Nährstoffe und kann ein angereichertes Medium sein oder auch nicht. Es sind verschiedene Medien im Handel erhältlich und können gemäß der Art der Zellen verwendet werden.
• Die Basis für die Trennung im Hochgeschwindigkeitsdurchflußcytomyter hängt von den durch Licht detektierbaren Charakteristiken der Zellen ab. Daher können verschiedene Lichtcharakteristiken im Zellsortierer verwendet werden, wobei die Charakteristiken Lichtbrechung und Fluoreszenz umfassen, wobei das Durchflußcytometer den Effekt einer Zelle auf einen Laserstrahl detektieren kann. In Abhängigkeit der Art der Zellzusammensetzung können verschiedene Charakteristiken verwendet werden.
• Als Marker kann eine große Vielzahl an fluoreszierenden Molekülen verwendet werden, die als Markierungen an Antikörper konjugiert werden können, welche für Zellmarker spezifisch sind, die bestimmte Gruppen und Untergruppen an Zellen identifizieren. Es können Liganden an Rezeptoren konjugiert werden, wobei die Liganden natürlich vorkommend oder synthetisch sein können, wie Proteine, Saccharide, synthetische organische Moleküle oder Moleküle, die andere Moleküle binden, wie MHC-TCR Kombinationen. Fluoreszenzmarker, die erhältlich sind, umfassen Fluorescein, Texas Rot, Phycobiliproteine, Allophycocyanin, Cyanindetwate, Rhodamin und Tandemkonjugate für Oberflächenmarker und eine Quelle für Fluoreszenzsonden, die zum Anzeigen von physiologischer Entwicklung und Kernparametern verwendet werden.
• Die Durchführungsbedingungen des Hochgeschwindigkeitsdurchflußcytometers umfassen im allgemeinen einen Systemdruck für die Flüssigkeiten von zumindest 3,5 · 10³ gcm&supmin;² (50 psi) und nicht mehr als etwa 7,0 · 10³ gcm&supmin;² (100 psi), gewöhnlich nicht mehr als etwa 5,2 · 10³ gcm&supmin;² (75 psi). Vorzugsweise liegt der Systemdruck im Bereich von etwa 3,9-4,6 · 10³ gcm&supmin;² (55-65 psi) und bevorzugter etwa 4,2 · 10³ gcm&supmin;² (60 psi). Der Düsendurchmesser beträgt zumindest etwa 25 um, gewöhnlicher zumindest etwa 30 um und nicht mehr als etwa 100 um, vorzugsweise etwa 40-75 um, bevorzugter etwa 50 um. Eine berechnete Geschwindigkeit für den Strom beträgt im allgemeinen mindestens etwa 15 m/s, gewöhnlicher mindestens etwa 20 m/s und nicht mehr als etwa 30 m/s, wobei sie im allgemeinen zwischen etwa 20-25 m/s liegt. Die Tröpfchenfrequenz beträgt zumindest etwa 75 kHz, gewöhnlicher zumindest etwa 90 kHz und nicht mehr als etwa 150 kHz, gewöhnlicher nicht mehr als etwa 125 kHz und vorzugsweise etwa 100 kHz. Die Verzögerungseinstellung beträgt mindestens etwa 90 und nicht mehr als etwa 125, gewöhnlicher etwa 100-110. Der Abstimmungswert ist für den Erfolg der Sortierung wichtig, da er der Elektronik anzeigt, wann die Tröpfchen aufgeladen werden sollen, die die Zelle von Interesse enthalten.
• Die Tröpfchenbelegung beträgt gewöhnlich etwa 1%, gewöhnlicher mindestens 5% und nicht mehr als 25 %, häufiger nicht mehr als etwa 20%, im allgemeinen im Bereich von etwa 15-20%. Daher weist die Probenflußrate im allgemeinen mindestens etwa 10 000 Ereignisse pro Sekunde, gewöhnlicher mindestens etwa 12 000 Ereignisse pro Sekunde und im allgemeinen nicht mehr als etwa 30 000 Ereignisse pro Sekunde, gewöhnlicher nicht mehr als etwa 25 000 Ereignisse pro Sekunde, vorzugsweise im Bereich von etwa 15 000-20 000 Ereignisse pro Sekunde auf.
• Die Zellen können in jedem geeigneten Medium mittels eines Serumkissens oder eines anderen Sammelmediums gesammelt werden. Die Zellen können dann verwendet werden, wie dies geeignet ist. In manchen Fällen kann es erwünscht sein, die Antikörpermarker zu entfernen, wobei die Zellen mit Molekülen überflutet werden, die mit den Oberflächenmembranproteinen um die monoklonalen Antikörper konkurrieren, um im wesentlichen die Antikörper von der Oberfläche zu entfernen. Die Zellen können dann vom Kompetitor freigewaschen werden und die Antikörper, die unspezifisch gebunden sind, können dann verwendet werden.
• Die Zellen finden eine große Vielzahl an Anwendungen. Wenn hämatopoetische Zellen beteiligt sind, können diese verwendet werden für eine Knochenmarkstransplantation, zur Identifizierung von Wachstumsfaktoren und zur Herstellung von verschiedenen hämatopoetischen Zellvorläuferuntergruppen durch die Verwendung geeigneter Wachstumsfaktoren. Für spezifische T-Zellen können diese Zellen eine Anwendung bei der Krebsbehandlung finden, wie im Fall von Tumorinfiltrierenden Lymphocyten, zur Identifizierung von T-Zellen, die mit den spezifischen Erkrankungen assoziiert sind, beispielsweise Autoimmunerkrankungen, für B-Zellen mit bestimmten sIg, die an ein spezifisches Epitop von Interesse binden.
• Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angeboten.
Experimenteller Teil
• Knochenmark von der Maus wird aus BA1.1 Mäusen erhalten und zur Entfernung der roten Zellen und Granulozyten durch Dichtegradienten verarbeitet (Nycodenz). Die Zellen werden dann in kalter Hank's Basic Salt Solution ("HBSS") resuspendiert, die Propidiumiodid enthält, um die lebenden Zellen zu unterscheiden (Sasaki et al., Cytometry (1987), 8, 413).
• Es wird ein Hochgeschwindigkeitsdurchflußcytometer verwendet (Gray et al., Science (1987) 238, 323- 329, Peters (1989) Chromosome purification by high speed sorting, J. Gray (Herausgeber), in "Flow Cytogenetics" London, Academic Press, Seiten 211-224, Peters et al., Cytometry (1985) 6, 290-301, von den Engh und Stokdijk, Cytometry (1989) 10, 282, 293). Es wird eine sichtbare Laseranregung (488 nm) verwendet. Man läßt Latexkalibrierungspartikel laufen, um die Position der Lichtbrechungs- und Fluoreszenzdetektoren zu überprüfen. Der Systemdruck für die Flüssigkeiten wird auf 4,2 · 10³ gcm&supmin;² (60 psi) mit einem Strahl eingestellt, der aus einer Düse mit einem Durchmesser von 50 um mit einer berechneten Geschwindigkeit von 23 m/s herauskommt. Die Tröpfchenfrequenz wird auf 100 kHz eingestellt. Diese Partikel werden auch zur Bestimmung der optimalen Tröpfchenverzögerungseinstellung verwendet.
• Wenn das System gemäß den Kalibrierungsfaktoren arbeitet wird die Knochenmarksprobe aus der Maus in das Gerät gegeben. Die Detektoren werden dann so eingestellt, um das Lichtstreuungsprofil der lymphoiden von den myeloiden zu Zellen trennen. Die Probenflußrate wird dann auf 17 000 Ereignisse pro Sekunde eingestellt. Die Auflösung des Lichtstreuungsprofils verändert sich im Vergleich zu den bisherigen Visualisierungen am FACStar aufgrund der Elastizität der Zellen im Hochdruck-/Hochgeschwindigkeitssystem. Neutrophile bleiben beim Durchgang durch das System intakt und sind klar abtrennbar.
• Es werden fünf getrennte Läufe mit derselben Probe ausgeführt. Es wird ein Lauf mit einem Durchsatz bei 13 000 Ereignissen pro Sekunde gefolgt von drei bei 17 000 pro Sekunde und einem bei 18 000 pro Sekunde ausgeführt. Vier der Läufe basieren auf der Ablenkung aller Leukozyten von den RBC und dem Debris im Lichtsstreuungsprofil und einer lenkt die lymphoiden Zellen ab. Die Tropfenverzögerungszeiten werden ebenfalls variiert. 106 abgelenkte Zellen werden in jedem der Läufe in weniger als 5 Minuten gesammelt. Die sortierten Zellen werden in Plastikröhrchen gesammelt, die frisches Medium enthalten und sofort zur Lagerung auf Eis gestellt. Tabelle I: Sortierungsvariablen
• Es werden Portionen (5 · 10&sup5; Zellen) der sortierten Proben auf einem Becton-Dickinson FACScan Durchflußzytometer analysiert. Die Reinheit für alle Proben basierend auf den Lichtstreuungsprofilen ist besser als 85% auf der Basis der entsprechenden Ablenkkriterien. Zellzählungen und eine Lebensfähigkeit mittels Trypanblau zeigen eine Lebensfähigkeit von mehr als 90%.
• 5 · 10&sup5; Zellen jeder der sortierten Proben werden für die Injektion in C57 Mäuse verwendet. 1 · 10&sup5; Zellen werden in 4 Mäusen für die Sortierung 1-3 durch die Injektion der Zellsuspension in den suborbitalen Sinus der Tiere verwendet. Drei Mäusen wird eine Injektion unter Verwendung von Sortierfraktion 4 verabreicht. Nur 3 · 10&sup4; Zellen werden in 3 Mäuse aus der Fraktion der Sortierung 5 injiziert, die auf lymphoide Zellen eingestellt war. Das Vorkommen von Milzkolonien von den mit Injektionen versehenen Mäusen wird nach diesen Tieren nach 13 Tagen bestätigt. (Spangrude et al., Science (1988) 241, 58-62). Kontrollmäuse bilden keine Milzkolonien. Tabelle 2: Milzkolonieergebnisse
• Es wird aus den obigen Ergebnissen deutlich, daß das vorliegende Verfahren die effiziente Abtrennung von kleinen Zellzahlen aus einer stark gemischten Zellpopulation erlaubt. Es kann eine hohe Reinheit und Effizienz der Abtrennung erreicht werden, wobei die Zellen die Lebensfähigkeit und ihre Fähigkeit zur Proliferation behalten, wie dies durch die Bildung von Milzkolonien gezeigt wird. Daher liefert das vorliegende Verfahren die Fähigkeit zur Abtrennung eines kleinen Teils an Zellen aus einer großen Anzahl an Zellen zur Verwendung in einer großen Vielzahl an Anwendungen.
• Obwohl die vorhergehende Erfindung zur Erläuterung im Detail beschrieben wurde, um sie klar zu verstehen, ist es für den Fachmann in Anbetracht der Beschreibungen der Erfindung offensichtlich, daß bestimmte Veränderungen und Modifikationen hierbei ausgeführt werden können.

Claims (9)

1. Verfahren zur Abtrennung einer Untergruppe einer Säugerzellpopulation aus einem Zellgemisch mittels Durchflußzytometrie, wobei diese Untergruppe ein lichtdetektierbares Merkmal aufweist, wobei dieses Verfahren eine hochreine lebende Zellpopulationsuntergruppe liefert durch Passage eines Zellstroms durch eine Düse mit einem Durchmesser von 25 bis 100 um mit einer Fließgeschwindigkeit im Bereich von 15 bis 30 m/s, worin die Tröpfchenfrequenz 75 bis 150 kHz beträgt, die entstehende Probenflußrate im Bereich von 10000 bis 30000 Ereignissen pro Sekunde liegt und diese Untergruppe an Zellen durch die Detektion des lichtdetektierbaren Merkmals abgetrennt wird, und durch Isolierung einer lebenden Untergruppe einer Zellpopulation mit einer Reinheit von mehr als 80% dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in Gegenwart von etwa 3, 5 · 10³ gcm&supmin;² (50 psi) und nicht mehr als 7,0 · 10³ gcm&supmin;² (100 psi) ausgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zellen hämatopoetische Zellen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das lichtdetektierbare Merkmal ein fluoreszenzmarkiertes Molekül ist, das für ein Oberflächenmembranprotein dieser Untergruppe spezifisch ist und das Verfahren ferner die Umsetzung dieses Zellgemisches mit einem fluoreszenzmarkierten Molekül vor der Passage des Zellstroms umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, worin die Zellen entweder Knochenmarkszellen oder periphere Blutzellen sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 und 4, worin die Untergruppe Stammzellen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 3, worin das fluoreszenzmarkierte Molekül ein monoklonaler Antikörper ist, der für humanes Thy-1 spezifisch ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Zellgemisch bezüglich CD34&spplus; Zellen angereichert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Zellgemisch bezüglich CD38&spplus; Zellen abgereichert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Zellen hämatopoetische Zellen sind und worin die Untergruppe weniger als 1% der Zellen des Gemisches umfaßt.