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Die Erfindung betrifft virusfreie Produkte mit einem Gehalt an wirksamen Milchbestandteilen, die durch Erhitzen
von beispielsweise menschlicher Muttermilch (im folgenden kurz als "Muttermilch" bezeichnet) oder anderer
Sorten von Milch unter derartigen Bedingungen hergestellt werden, daß die Aktivitäten der darin vorhandenen
nützlichen, wirksamen Proteinbestandteile, wie z.B. Immunoglobulinen, Lactoferrin und Lysozym beibehalten
werden, ohne deren Verschlechterung zu verursachen, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
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Obschon Fortschritte bei der Behandlung von Frühgeborenen es möglich gemacht haben, die Überlebensraten
von unentwickelt geborenen Kindern und Frühgeborenen in bemerkenswerter Weise zu verbessern, sind
Probleme bisher im Hinblick darauf ungelöst, wie Frühgeborene ernährt werden sollen. Frühgeborene werden
derzeit hauptsächlich durch Muttermilch ernährt, neigen jedoch angesichts deren zunehmend unzulänglicher
Ernährung und raschen Wachstums dazu, an ernsthaftem Ernährungsmangel in erster Linie im Hinblick auf
Eiweiß und Mineralstoffe zu leiden, was zu ernsthaften Bedenken bezüglich eventueller nachteiliger
Auswirkungen auf das spätere Wachstum und die spätere Entwicklung führt. Als Mittel zur Ergänzung der
Nahrungsbestandteile wurden hauptsächlich in Europa Versuche unternommen, angereicherte Muttermilch zu
verwenden, worin die in der Muttermilch fehlenden Nahrungsbestandteile ergänzt sind [R.M. Goldblum et al.,
Pediatric Research, 25, 184 (1989), S. Hagelberg et al., Acta Pediatr. Scand., 79, 1163 (1990)].
Anreicherungssubstanzen für die Muttermilch schließen Vitamine, Mineralstoffe und Zucker, wie auch
Eiweißbestandteile ein, wie sie in der Kuh- oder Muttermilch enthalten sind.
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Die Anreicherung der Muttermilch wird vom Standpunkt einer vollständigen Ernährung unter Verleihung der
Immunität für bedeutsam angesehen, wobei berichtet wurde, daß angereicherte Muttermilch im Labormaßstab
für Versuchszwecke hergestellt wurde; nach der Gabe an unentwickelt frühgeborene Kinder oder
Frühgeborene erhöhte sich das Körpergewicht, wurde Diarrhoe unterdrückt oder die Häufigkeit von nekrotischer
Colitis erniedrigt [P.W. Howie et al., Br. Med. J., 300, 11 (1990); G.E. Moro et al., J. Pediatr. Gastroenterol.
Nutr., 13, 150 (1991); A. Lucas et al., The Lancet, 336, 1519 (1990)]. Im Falle von Muttermilch, insbesondere
von gepoolter Muttermilch, verursacht die antivirale Behandlung gegen eine Verseuchung durch das AIDS-
Virus und andere pathogene Virusarten beträchtliche Bedenken. Die Sterilisationsbehandlung derartiger
Milchbestandteile wird gegenwärtig nur durch eine Hitzebehandlung für kurze Zeit oder eine antivirale
Behandlung derartiger Bestandteile lediglich durch eine Inaktivierungsbehandlung bei 56ºC 30 Minuten lang
durchgeführt. Es wurde berichtet, daß das AIDS-Virus unter den obenstehend beschriebenen Bedingungen
inaktiviert wird [R.P. Eglin et al., The Lancet, May 9, 1093 (1987)], wobei jedoch davon ausgegangen wird, daß
bei Kontaminierung das AIDS-Virus alles andere als vollständig inaktiviert ist [L. Raskin et al., JAMA, 255,
1857 (1986)].
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Als zuverlässiges Verfahren zum Auslöschen pathogener Viren, das im Hinblick auf das gegenwärtige
Lernniveau ins Leben gerufen wurde, ist die Hitzebehandlung in flüssigem Zustand 10 Stunden lang bei 60ºC
(im folgenden als "Erhitzen in flüssigem Zustand") auf der Grundlage des Berichtes von Murray übernommen
worden [The New York Academy of Medicine, 31, 341 (1955)], was seitdem in weit verbreitetem Gebrauch ist.
Das Verfahren wird jedoch nur für Substanzen angewendet, die dem Erhitzen in flüssigem Zustand, wie z.B.
Albumine, standhalten können; das Verfahren verursacht bei den wirksamen Eiweißbestandteilen in der
Muttermilch, wie z.B. sekretorischen Immunoglobulinen, Lactoferrin und Lysozym, eine thermische
Denaturierung bei 62,5ºC während eines Zeitraums von 30 Minuten, wobei entweder eine jeweils verringerte
Wirksamkeit oder eine vollständige Desaktivierung eintritt [T.J. Evans et al, Archives of Disease in Childhood,
58, 239 (1978)]. Die Erfinder haben nunmehr aufgezeigt, daß das sekretorische Immunoglobulin A aus der
Muttermilch in gereinigter Form stabil bleibt, sogar nachdem es in flüssigem Zustand bei 60ºC für eine Dauer
von 10 Stunden erhitzt worden war [JP-A-145031/1992 (entsprechend der EP-A-0479597)], wobei jedoch
bisherige Versuche, das Lactoferrin, Lysozym und andere nützliche wirksame Eiweißbestandteile in der Hitze
zu sterilisieren, sämtlich fehlschlugen.
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Die Erfinder haben nunmehr gefunden, daß die in Milch enthaltenen wirksamen Eiweißbestandteile in erhöhter
Sicherheit und Effektivität gewonnen werden können durch das Erhitzen von entfetteter Milch in flüssigem
Zustand unter neutralen pH-Bedingungen, worauf das Aussalzen unter schwachsauren Bedingungen erfolgt.
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Die Erfindung betrifft Produkte mit einem Gehalt an wirksamen Milcheiweißbestandteilen, die durch ein
Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte aufweist: Zugabe eines Zuckeralkohols oder
Disaccharids zum Milchplasma oder Milchserum, gegebenenfalls zusammen mit einer Aminosäure,
Durchführen der Hitzebehandlung des so erhaltenen Gemisches bei einem pH-Wert von 6 bis 8, vorzugsweise
bei etwa 60ºC für eine Zeitdauer von etwa 10 Stunden und Ausfällen der wirksamen Milcheiweißstoffe durch
Zusatz von Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 30 bis 60 Gew./Vol.-% zu dem hitzebehandelten
Gemisch, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Produkte.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines virusfreien Produktes mit einem Gehalt an
wirksamen Milcheiweißbestandteilen durch Erhitzen einer Milchfraktion zusammen mit einem Stabilisator bei
einer Temperatur und während einer Zeitdauer zur Verfügung gestellt, die ausreichen, pathogene Viren zu
inaktivieren, wonach das Ausfällen der wirksamen Milcheiweißbestandteile erfolgt, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Stabilisator, der aus Zuckeralkoholen oder Disacchariden in einer Konzentration von 30 bis 70
Gew./Vol.-% und Gemischen aus einem Zuckeralkohol oder Disaccharid in dieser Konzentration zusammen
mit einer Aminosäure in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew./Vol.-% ausgewählt wird, zu einer Milchfraktion
hinzugefügt wird, welche Milchplasma oder Milchserum darstellt und die so erhältliche Lösung bei einem pH-
Wert von 6 bis 8 erhitzt wird und weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß Ammoniumsulfat in einer
Konzentration von 30 bis 60 Gew./Vol.-% anschließend zu der so erhaltenen hitzebehandelten Lösung bei einem pH-
Wert von 4 bis 7 zum Ausfällen der wirksamen Milcheiweißbestandteile hinzugegeben wird.
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Erfindungsgemäß wird von Milchplasma oder Milchserum aus tierischer Milch, wie menschlicher und Kuhmilch,
Gebrauch gemacht. Die Milchflüssigkeit wird in bekannter Weise zum Erhalt von Milchplasma entfettet, das
anschließend von Kasein zur Herstellung von Milchserum befreit wird.
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Erfindungsgemäß wird das Milchplasma oder Milchserum vorzugsweise bei etwa 60ºC für eine Dauer von etwa
10 Stunden in Anwesenheit von hinzugefügtem Stabilisator zur Inaktivierung von Viren erhitzt.
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Die Zugabe des Stabilisators ist von außerordentlicher Bedeutung, nicht nur im Hinblick darauf, in der
Milchflüssigkeit eine Trübung (Konsistenzveränderung) während des Erhitzens zu vermeiden, sondern auch
die Denaturierung oder Desaktivierung der in der Milchflüssigkeit enthaltenen wirksamen Eiweißbestandteile,
wie z.B. sekretorisches Immunoglobulin, Lactoferrin und Lysozym, zu vermeiden.
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Der Ausdruck "wirksame Eiweißbestandteile" bezeichnet im Sinne der Erfindung jegliches Eiweiß, das bereits
in winzigen Anteilen physiologische und pharmakologische Aktivitäten zeigt.
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Als Stabilisator werden Zuckeralkohole, wie z.B. Sorbit und Mannit, sowie Disaccharide, wie z.B. Rohrzucker
und Malzzucker, für sich allein oder im Gemisch mit Aminosäuren, wie z.B. Glycin und Alanin, verwendet.
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Es werden ein oder mehrere dieser Stabilisatoren verwendet, wobei in den Fällen, wo sie allein zum Einsatz
gebracht werden, die Verwendung von solchen Zuckeralkoholen bevorzugt wird, die keine
Braunfärbungsreaktion (Maillard-Reaktion) verursachen, wie z.B. Sorbit.
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Obschon die Stabilisatoren wünschenswerterweise in höheren Konzentrationen verwendet werden, wird für den
Zweck einer erhöhten Effizienz beim Aussalzen nach der Hitzebehandlung empfohlen, die Aminosäuren in
einer Menge von 10 bis 20 Gew./Vol.-% zu verwenden, die Zuckeralkohole oder Disaccharide werden dagegen
in einer Menge von 30 bis 70 Gew./Vol.-%, vorzugsweise 40 bis 70 Gew./Vol.-% eingesetzt.
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Gemäß der JP-A-145031/1992 (entsprechend der EP-A-0479597) wurde das sekretorische Immunoglobulin
A dem Erhitzen in flüssigem Zustand bei etwa 60ºC für eine Dauer von etwa 10 Stunden in Anwesenheit des
gleichen Stabilisators unterzogen, wobei keine Notwendigkeit bestand, den pH-Wert der Lösung einzustellen.
Dagegen ist der pH-Wert der Lösung mit einem Gehalt an Stabilisator beim Erhitzen der verschiedenen
wirksamen Eiweißbestandteile in der Milchflüssigkeit in ihrer gesamten und umfassenden Anzahl in flüssigem
Zustand von außerordentlicher Bedeutung. Im sauren Bereich des pH-Werts sind das Lactoferrin und Lysozym
stabil, wogegen das sekretorische Immunoglobulin A trübe (Konsistenzveränderung) wird und eine
Polymerisation eingeht, so daß es gegenüber der Denaturierung empfänglich wird. Andererseits werden das Lactoferrin
und Lysozym im alkalischen Bereich des pH-Wertes instabil. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß das
Erhitzen bei einem pH-Wert in Nähe des Neutralwertes (pH 6 bis 8) es ermöglicht, diese nützlichen wirksamen
Eiweißbestandteile in der Rohmilch in umfassender und stabiler Weise zurückzugewinnen.
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Es wurde anhand des Poliovirus Typ I als Modellvirus aufgezeigt, daß die Viren mittels der Durchführung des
Erhitzens der Milchflüssigkeit in flüssigem Zustand bei einem pH-Wert von 7,0 und bei 60ºC für eine Dauer
von 10 Stunden in Anwesenheit von 65% Sorbit inaktiviert werden, wobei diese Bedingungen in den
erfindungsgemäßen Hitzebehandlungsbedingungen eingeschlossen sind (Tabelle 1). Die Ergebnisse lassen
den Schluß zu, daß das Erhitzen in flüssigem Zustand in Anwesenheit des erfindungsgemäßen Stabilisators
zu einer Inaktivierung des AIDS- und Cytomegalovirus führt, die eine jeweils individuelle Hitzebeständigkeit
zeigen, die geringer oder gleich jener des Poliovirus ist.
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Die wirksamen Eiweißbestandteile in der hitzebehandelten Milchlösung werden durch Aussalzen mit
Ammoniumsulfat gewonnen. Um dieses Ziel zu erreichen, wird empfohlen, bei der Hitzebehandlung
Milchserum einzusetzen, da es im voraus von Kasein befreit wurde. Angesichts der Konzentration an
Stabilisator in der hitzebehandelten Milchlösung werden die wirksamen Eiweißbestandteile gewünschtenfalls
durch Ausfällen mittels Verdünnen der hitzebehandelten Milchlösung mit dem gleichen oder doppelten
Volumen an Wasser gewonnen, um deren Viskosität zu vermindern. Auf diese Weise wird durch das
Gewinnungsverfahren im Falle eines sauren pH-Bereiches (pH 4 bis 7) die beste Ausbeuterate der wirksamen
Eiweißbestandteile erzielt.
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Die Ausfällung mit Polyethylenglykol, wie sie von den gegenwärtigen Erfindern in der JP-A-145031/1992
(entsprechend der EP-A-0479597) zur Gewinnung von Immunoglobulinen angewendet wird, kann die
Gewinnung des sekretorischen Immunoglobulins A mit hohem Molekulargewicht sowie Lactoferrin aus der
Muttermilch ermöglichen, versagt jedoch bei der Gewinnung von Lysozym und anderen Bestandteilen mit
niedrigerem Molekulargewicht (siehe Tabelle 2).
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Das erfindungsgemäße hitzebehandelte Milchserum läßt sich als solches oder im Gemisch mit Wasser oder
anderen Nahrungsmitteln als virusfreie Ernährung verfüttern, wenn es einen geeigneten Typ an Stabilisator in
geeigneter Konzentration enthält. Die wirksamen Eiweißkomponenten, wie sie aus dem hitzebehandelten
Milchserum fraktioniert werden, lassen sich mittels Dialyse oder Ultrafiltration entsalzen, sterilisieren und in
flüssiger Form verfüttern, gegebenenfalls nach dem Vermischen mit gefriergetrockneter Muttermilch oder
Milchzubereitungen für Frühgeborene oder läßt sich in normalem Milchpulver zum Einsatz bringen.
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Milch oder andere Nahrungsmittel, die mit erfindungsgemäßen Muttermilchbestandteilen vermischt werden, die
nur die wirksamen Eiweißbestandteile einschließlich der Immunoglobuline enthalten, lassen sich als Ergänzung
zur Muttermilch und als Unterstützung bei der Ernährung von Frühgeborenen wie auch zur Verhütung von
Virusinfektionen und bei der Behandlung von schwer behandelbarer Diarrhoe verwenden, wobei die Erwartung
besteht, daß sie nicht nur als Nahrungsmittel, sondern auch als Arzneimittel appliziert werden können.
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Untenstehend sind Beispiele und Versuchsbeispiele zur Erläuterung der Erfindung ausführlicher beschrieben.
Analytische Testverfahren
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Sekretorisches Immunoglobulin A (slgA) wurde anhand des ELISA-Verfahrens analytisch bestimmt, bei dem
die antisekretorische Antikörperkomponente (von K.K. Igaku Seibutugaku Kenkyuusho hergestellt) als
Festphase verwendet wurde sowie ein Anti-α-Kettenantikörper, markiert mit Peroxidase und aus einem Anti-α-
Kettenantikörper [hergestellt von Seikagaku Kogyo K.K. nach der Hasbida-Methode (J. Appl. Biochem., 6 56
(1984))] hergestellt, als markierter Antikörper benutzt wurde. Es wurde ein Standard von slgA benutzt, der von
den gegenwärtigen Erfindern hergestellt worden war. Die jeweiligen Werte der Virusinfektion und der
Virusneutralisation durch den Antikörper wurden auf der Grundlage der viralen Zellendegenerationseffekte
berechnet, die auf den Mikrotiterplatten unter Verwendung von proliferierten Viruszellen und der
funktionierenden Zellenlinie MA 104 renalen Ursprungs aus Rhesusaffen [Uirus Jikken-gaku Soron (Studies on Virus
Experiments, Elements, Maruzen Ltd. aus Tokio, Japan (1973)] gefunden wurden.
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Das Lactoferrin wurde anhand der ELISA-Methode analytisch bestimmt, bei der der Anti-Lactoferrin-Antikörper
(von Jackson Immunoresearch Lab. hergestellt) als Festphase verwendet und ein peroxidasemarkierter
Antikörper (hergestellte von Jackson Immunoresearch Lab.) als markierter Antikörper eingesetzt wurde. Das
Lactoferrin, hergestellt von Sigma Co. wurde als Standard verwendet.
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Die Fähigkeit des Lactoferrins, mit Eisen zusammenzutreten, wurde anhand des Verfahrens nach Mazurier et
al. [Biochemica et Biophysica Acta, 629, 399 (1980)] bestimmt.
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Die Lysozymaktivität wurde analytisch durch die Trübungsreduktionsmethode für Micrococcus ruteus Zeilen
(mit einem jeweiligen Standard für die Ingredientien für Arzneimittel außerhalb der Grenzen des japanischen
Arzneibuchs) bestimmt. Als Standard wurde das Lysozym aus Eiweiß (hergestellt von Sigma Co.) eingesetzt.
Beispiel 1:
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Es wurde eine Menge von 5 l Muttermilch durch Zentrifugieren entfettet und der daraus erhaltene flüssige
Überstand auf einen pH-Wert von 4,6 eingestellt, wonach sich die Entfernung von Kasein durch Zentrifugieren
zur Gewinnung eines flüssigen Überstands (Milchserum) anschloß. Das Milchserum wurde auf einen pH-Wert
von 7,0 eingestellt, mit Sorbit in einer Menge von 65 Gew./Vol.-% vermischt und die so erhaltene Lösung auf
Hartglasflaschen verteilt, wonach diese luftdicht verschlossen wurden. Die Glasflaschen wurden in 60ºC
warmes Wasser eingetaucht, um den jeweiligen Inhalt 10 Stunden lang zu erwärmen; anschließend wurden
diese durch den Zusatz eines zweifachen Volumens an kaltem Wasser abgekühlt, auf einen pH-Wert von 5,0
eingestellt und mit Ammoniumsulfat bis auf eine Konzentration von 50 Gew./Vol.-% zum Durchführen des
Aussalzens vermischt. Die ausgefällte Fraktion wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in isotonischer
Salzlösung aufgelöst, wonach die Lösung einer adäquaten Dialyse unter Verwendung einer Dialysemembran
zur Abtrennung von Stoffen mit einem Molekulargewicht von 3.000 (Trenngrenze) unterzogen und
anschließend die Sterilisation mittels der Membranfiltration folgte. Die Eiweißrückgewinnungsrate (Überwachung
mittels Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm) betrug 75% auf der Basis von Milchserum (Charge Nr.
HW-1). Dasselbe Verfahren wurde gleichzeitig, jedoch ohne Hitzebehandlung, zur Herstellung einer
Vergleichsprobe (Charge Nr. NW-1) durchgeführt.
Beispiel 2:
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Eine Menge von 5 l menschlicher Muttermilch wurde durch Zentrifugieren entfettet, die erhaltene Lösung
(Milchserum) auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und mit Sorbit sowie Glycin in einer jeweiligen
Konzentration von 50 Gew./Vol.-% und 15 Vol./Vol.-% vermischt, wonach diese auf Hartglasflaschen verteilt und jene
luftdicht verschlossen wurden. Die Glasflaschen wurden in warmes Wasser bei 60ºC zum Erwärmen des
jeweiligen Inhalts 10 Stunden lang eingetaucht, danach durch den Zusatz etwa des zweifachen Volumens an
Wasser abgekühlt, auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und mit Ammoniumsulfat in einer Konzentration von
50 Gew./Vol.-% vermischt, um das Aussalzen zu bewirken. Die ausgefällte Fraktion wurde durch Zentrifugieren
gewonnen und in isotonischer Salzlösung aufgelöst, danach die so erhaltene Lösung einer adäquaten Dialyse
mittels einer Dialysemembran zum Abtrennen von Stoffen mit einem Molekulargewicht von 1.000
(Trenngrenze) unterzogen; anschließend folgte das Sterilisieren mittels der Membranfiltration. Die
Eiweißwiedergewinnungsrate (Überwachung durch die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm) betrug 72% auf
der Basis von Milchserum (Charge Nr. HW-2). Dasselbe Verfahren wurde gleichzeitig, jedoch ohne
Hitzebehandlung, zur Herstellung einer Vergleichsprobe (Charge Nr. NW-2) durchgeführt.
Versuchsbeispiel 1:
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Die Eiweißkomponenten von Muttermilch, wie sie gemäß Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden mittels
Säulenchromatographie über DEAE-Toyopearl , einem Ionenaustauscherharz, zur Herstellung sekretorischen
Immunoglobulins A (slgA) gereinigt. Das aus der Charge Nr. HW-1 dargestellte slgA wurde "Charge Nr. H-
slgA" genannt, wogegen das aus Charge Nr. NW-1 als "Charge-Nr. N-slgA" genannt wurde. Diese
Vergleichsproben wie auch die Eiweißbestandteile von Muttermilch gemäß Herstellung in den Beispielen 1 und
2 wurden einer Messung von Neutralisierungsantikörperwerten anhand von Coxsackie-Viren, Gruppe B Typ
3, Gruppe A Typ 4 und Gruppe A Typ 16 unterzogen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 dargestellt.
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Es wurde aufgezeigt, daß die erfindungsgemäßen Eiweißbestandteile von Muttermilch (Charge Nr. HW-1 und
HW-2) und das aus Charge Nr. HW-1 (Charge Nr. H-slgA) isolierte slgA die gleichen Werte einer
Virusantikörperneutralisation im Hinblick auf alle Coxsackie-Viren aufweisen wie die Eiweißbestandteile aus der
Muttermilch, die nicht hitzebehandelt worden war (Charge Nr. NW-1 und NW-2) sowie das slgA, das aus der
Charge Nr. NW-1 (Charge Nr. N-slgA) isoliert wurde. Derartige Ergebnisse weisen darauf hin, daß das jeweils
gereinigte slgA das viruserkennende Paratop ohne Denaturierung selbst nach der Hitzebehandlung beibehält.
Versuchsbeispiel 2:
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Die Eiweißbestandteile von Muttermilch gemäß Herstellung in Beispiel 1 wurden mittels der
Affinitätssäulenchromatographie auf sulfuriertem Cellulofine zum Darstellen von Lactoferrin gereinigt. Das gereinigte
Lactoferrin aus der Charge Nr. HW-1 wurde als Referenz "Charge Nr. H-Lf" bezeichnet, während jenes aus der
Charge Nr. NW-1 als "Charge Nr. N-Lf" bezeichnet wurde. Diese Versuchsproben wie auch die
Eiweißbestandteile von Muttermilch gemäß Herstellung in den Beispielen 1 und 2 wurden im Hinblick auf die Fähigkeit zur
Bindung von Eisen bestimmt, wobei das Ergebnis in der Tabelle 4 dargestellt ist.
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Die erfindungsgemäßen Muttermilcheiweißbestandteile (Chargen Nrn. HW-1 und HW-2) wie auch das aus der
Charge Nr. HW-1 isolierte Lactoferrin (Charge Nr. H-Lf) erwiesen als sich befähigt, etwa 1,5 Eisenmoleküle pro
Molekül zu binden, was auch bei den Muttermilcheiweißbestandteilen, die nicht hitzebehandelt worden waren
(Chargen Nrn. NW-1 und NW-2) und dem aus der Charge Nr. NW-1 isolierten Lactoferrin (Charge Nr. N-Lf)
jeweils der Fall war. Aufgrund der bekannten Tatsache, daß das Lactoferrin zwei Eisenbindungsstellen im
Molekül aufweist, offenbaren die Ergebnisse, daß das aus den Eiweißbestandteilen von Muttermilch isolierte
Lactoferrin sogar nach der Hitzebehandlung beide Eisenbindungsstellen unverändert beibehält.
Versuchsbeispiel 3:
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Die Eiweißbestandteile von Muttermilch gemäß Herstellung in den Beispielen 1 und 2 wurden im Hinblick auf
die enzymatische Aktivität von Lysozym gemessen, wobei die Ergebnisse in der Tabelle 5 dargestellt sind.
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Die erfindungsgemäßen Eiweißbestandteile von Muttermilch (Chargen Nrn. HW-1 und HW-2) erwiesen sich
im Hinblick auf Lysozym als enzymatisch aktiv, und zwar gleich den Eiweißbestandteilen von Muttermilch, die
nicht hitzebehandelt worden waren (Chargen Nrn. NW-1 und NW-2). Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß
das in den Eiweißbestandteilen enthaltene Lysozym seine jeweiligen Substratbindungsstellen und
Aktivitätszentren selbst nach der Hitzebehandlung unangetastet beibehält.
Tabelle 1:
Inaktivierung des Poliovirus mittels Erhitzen vom Poliovirustyp I
im Flüssigzustand nach Verdünnen mit Phosphatpuffer PBS (pH 7,2).
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Anmerkung*: 2% humanes Serumalbumin, das als Modellprotein im Hinblick auf die Möglichkeit hinzugefügt
wurde, daß das Protein selbst als Virusstabilisator fungiert.
Tabelle 2:
Wiedergewinnungsrate von Eiweißbestandteilen aus der Muttermilch
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Anmerkung*: Das Milchserum derselben Herstellungscharge wurde dem erfindungsgemäßen Erhitzen im
Flüssigzustand unterworfen, mit Wasser verdünnt und auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt,
wonach die Aufteilung in zwei Anteile gleichen Volumens folgte, wobei der eine mit 50%igem
Ammoniumsulfat ausgesalzt wurde und der andere der Wiedergewinnung durch Ausfällen mit
25%igem Polyethylenglykol zugeführt wurde.
Tabelle 3:
Die Werte aus der Neutralisierung des Virus mit Antikörper der Eiweißbestandteile der Muttermilch und dem
slgA wurde in maximalen Verdünnungswerten von 5 mg/cm³ von slgA ausgedrückt, die erforderlich waren, 100
TCID&sub5;&sub0; pro jeweiligem Virus (die Konzentration an slgA wurde auf der Basis des ELISA-Verfahrens berechnet)
zu neutralisieren.
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Anmerkungen*: Die Muttermilchbestandteile NW-1 und HW-1 wie auch NW-2 und HW-2 wurden aus
derselben Muttermilch hergestellt, wobei die Hitzebehandlung bei HW-1 und HW-2
erfolgte, jedoch keine Hitzebehandlung bei NW-1 und NW-2 erfolgte.
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**: Das jeweils gereinigte slgA, N-slgA und H-slgA stammten aus der Isolierung von den
Muttermilchbestandteilen NW-1 und HW-1.
Tabelle 4:
Die Fähigkeit zur Eisenbindung der Muttermilchbestandteile und des Lactoferrins wurden als Anzahl der
Moleküle mit gebundenem Eisen (als Kombination) ausgedrückt.
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Anmerkung*: Die Muttermilchbestandteile NW-1 und HW-1 wie auch NW-2 und HW-2 wurden aus
derselben Muttermilch hergestellt, wobei bezüglich HW-1 und HW-2 eine Hitzebehandlung
erfolgte, jedoch keine Hitzebehandlung bei NW-1 und NW-2 erfolgte.
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**: Das jeweils gereinigte Lactoferrin, N-Lf und H-Lf stammten aus der Isolierung aus den
Muttermilchbestandteilen NW-1 und HW-1.
Tabelle 5:
Die Lysozymaktivität der Muttermilchbestandteile nach der Berechnung, wie sie bezüglich des Mengentiters
von Lysozym aus Eiweiß angesetzt und als Mengentiterwerte ausgedrückt sind, und zwar in ug mittels
Absorptionsmessung mit einer 10 mm langen Zelle bei einer Wellenlänge von 280 nm.
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Anmerkung*: Die Muttermilchbestandteile NW-1 und HW-1 wie auch NW-2 und HW-2 wurden aus
derselben Muttermilch hergestellt, wobei bezüglich HW-1 und HW-2 die Hitzebehandlung
erfolgte, jedoch bei NW-1 und NW-2 keine Hitzebehandlung erfolgte.