DE69316293T2

DE69316293T2 - Methode zur Bestimmung von Fibrinogen, trockenes Reagens hierfür und Verfahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE69316293T2
Application number: DE1993616293
Authority: DE
Inventors: Masayoshi Kikuchi; Kenji Kunai; Takafumi Yamada
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1992-09-09
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 1998-08-27
Anticipated expiration: 2013-09-08
Also published as: EP0587398B1; DE69316293D1; ES2113492T3; EP0587398A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Probe, ein Trockenreagens dafür und ein Verfahren zur Herstellung des Trockenreagens. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Probe durch einfache Mittel auf rasche Weise und mit guter Reproduzierbarkeit, und die damit verbundenen Verfahrensstufen.

Stand der Technik

Die Bestimmung von Fibrinogen und die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (nachfolgend als "APTT" abgekürzt), und der Prothrozbinzeit (nachfolgend als "PT" abgekürzt), werden durchgeführt, um Blut auf abnormale oder normale Koagulation zu testen, und um die Dringlichkeit bei Patienten zu bestimmen, die an einem übermäßigen Blutverlust leiden.
Konventionelle Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen werden grob eingeteilt in ein Verfahren unter Verwendung eines Thrombin-enthaltenden Reagens in flüssiger Form (nachfolgend als "flüssiges Reagens" bezeichnet) und ein Verfahren unter Verwendung eines Trockenreagens, das Thrombin enthält.
Das Verfahren unter Verwendung des flüssigen Reagens umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung der Thrombinzeit, ein Gewichtsbestimmungsverfahren, ein Aussalzverfahren, ein Verfahren unter Verwendung eines Aritifibrinogen-Antikörpers und ein Aggregationsverfahren unter Verwendung von Latexteilchen.
Im Aussalzverfahren und dem Verfahren unter Verwendung eines Antifibrinogen-Antikörpers wird Fibrinogen als Antigen in einer Probe bestimmt, und Moleküle, die von intaktem Fibrinogen verschieden sind, wie z.B. durch Abbau von Fibrinogen gebildete Produkte, werden ebenfalls zusammen damit gemessen. Deshalb werden diese Verfahren nicht für einen allgemeinen Blutkoagulationstest zur Bestimmung einer normalen oder abnormalen Blutkoagulationsfähigkeit verwendet.
Im Gewichtsbestimmungsverfahren wird Thrombin zum Plasma zugegeben, damit das Thrombin mit Fibrinogen reagiert, und von der gebildeten Fibrinmasse wird direkt das Gewicht bestimmt. Dieses Verfahren wird selten verwendet, weil seine Durchführung kompliziert ist, und der Meßwert manchmal irregulär ist.
Die Bestimmung nach dem Aggregationsverfahren unter Verwendung von Latexteilchen wird z.B. beschrieben in der Japanischen offengelegten Patentpublikation Nr. 4551/1982. Dieses Bestimmungsverfahren verwendet die hohe Affinität eines Fibrinmonomers gegenüber Latexteilchen. D.h., es werden zuerst seriell verdünnte Plasmaläsungen hergestellt, eine Suspension von Latexteilchen dazugegeben und mit jeder verdünnten Plasmalösung gemischt, und die Mischungen kultiviert. Dann wird die Aggregation der Latexteilchen überwacht und der Titer aufgezeichnet. Außerdem wird eine Thrombin-enthaltende Suspension von Latexteilchen zu den gleichen verdünnten Plasmalösungen zugegeben und die Mischungen kultiviert. Die Aggregation der Latexteilchen wird überwacht, und der Titer aufgezeichnet. Der erstere Titer entspricht der Konzentration von Fibrinmonomer im Plasma, und der letztere Titer entspricht der Gesamtsumme der Konzentration an Fibrinogen im Plasma und der Konzentration an Fibrinmonomer im Plasma. Die Fibrinogenkonzentration wird deshalb bestimmt, indem man den ersteren Titer von dem letzteren Titer abzieht. Dieses Bestimmungsverfahren ist brauchbar zur gleichzeitigen Bestimmung von Fibrinmonomer und Fibrinogen in Plasma, während es den Nachteil besitzt, daß es nicht als rascher Test verwendet werden kann, weil es eine beträchtliche Zeitspanne von der Inituerung der Messung bis zur Berechnung der Fibrinogenkonzentration erfordert und weil die Herstellung des Reagens Zeit benötigt.
Im Fibrinogenbestimmungsverfahren unter Verwendung eines flüssigen Reagens wird im allgemeinen ein Thrombinzeit- Verfahren verwendet, das von dauss entdeckt wurde (A. Clauss, Gerinungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens, Acta Heamat 17 (1957) 237). Dieses Fibrinogenbestimmungsverfahren macht Gebrauch von der Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Überführung von Fibrinogen in Fibrin in Gegenwart einer überschüssigen Menge an Thrombin in Bezug auf die Fibrinogenkonzentration.
In dem obigen Bestimmungsverfahren wird die Messung durchgeführt, indem man eine Probe mit einer Pufferlösung verdünnt, die resultierende verdünnte Lösung vorerhitzt, ein flüssiges Reagens, das Thrombin enthält, zugibt, und die Koagulationszeit mißt. In dieser Messung wird eine optische Messung zur Bestimmung der Dämpfung des durchgelassenen Lichtes oder eine physikalische Messung zur Bestimmung einer Viskositätserhöhung bis zu einem bestimmten Endpunkt durchgeführt. Die Koagulationszeit in diesem Verfahren bezieht sich auf die Zeit, die erforderlich ist von der Zugabe des flüssigen Thrombinreagens bis zum vorstehend genannten Endpunkt. In diesem Bestimmungsverfahren wird die Fibrinogenkonzentration auf der Basis der vorstehend genannten Koagulationszeit bestimmt.
Das in dem Thrombinzeit-Verfahren verwendete Thrombinreagens und das vorstehende Bestimmungsverfahren werden weitverbreitet zur Bestimmung von Fibrinogen verwendet. Die Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen unter Verwendung des Thrombinreagens haben jedoch die folgenden Nachteile. Das Thrombinreagens wird zuerst aus einer gefriergetrockneten Substanz mit destilliertem Wasser hergestellt (ein so wiederhergestelltes Reagens besitzt eine schlechte Lagerbeständigkeit, wenn es während längerer Zeit gelagert wird) . Es ist erforderlich, die verdünnte flüssige Probe vorzuerhitzen. Dafür ist vor der Messung Zeit erforderlich. Außerdem ist der Konzentrationsbereich, bei dem eine Probe bestimmt werden kann, eng. Wenn die Probe eine Fibrinogenkonzentration besitzt, die geringer ist als der vorstehend genannte Konzentrationsbereich, ist es deshalb notwendig, für eine weitere Messung den Verdünnungsgrad zu verringern. Wenn die Probe eine Fibrinogenkonzentration besitzt, die höher ist als der vorstehend genannte Konzentrationsbereich, dann ist es notwendig, den Verdünnungsgrad für die weitere Messung zu erhöhen.
Andererseits wurde ein Verfahren unter Verwendung eines Trockenreagens, das Thrombin enthält, vor kurzem vorgeschlagen, und wird in US-Patent 5110727 (offengelegte PCT-Publikation Nr. WO 89/10788) beschrieben.
Die vorstehende Veröffentlichung beschreibt ein Trockenreagens, das magnetische Teilchen enthält, die bei der Koagulationsbestimmung zur Messung verschiedener Koagulations- und Blutgerinnsellyse-Faktoren verwendet werden, und seine Verwendung.
Das in der vorstehend genannten Veröffentlichung beschriebene Thrombin-enthaltende Trockenreagens wird hergestellt durch Mischen einer Thrombinreagenslösung und einer Plasminogenreagenslösung, nachfolgende Zugabe von magnetischen Teilchen, Aufgießen einer bestimmten Menge der resultierenden Lösungsmischung auf einen Reagensträger und nachfolgendes Gefriertrocknen der Lösungsmischung. Wenn das vorstehend genannte Trockenreagens zur Messung der Fibrinogenkonzentration verwendet wird, wird die Messung durchgeführt, indem man das Thrombin-enthaltende trockene Reagens auf einen Reaktionsträger aufbringt, eine bestimmte Menge an Plasma zum Thrombin-enthaltenden Trockenreagens zugibt, eine Kombination eines schwingenden magnetischen Feldes mit einem statischen permanenten Magnetfeld sofort nach der vorstehenden Zugabe anlegt, wodurch die Magnetteilchen in Bewegung gesetzt werden und das Bewegungssignal der Magnetteilchen optisch überwacht wird. Die vorstehende Veröffentlichung schlägt vor, daß das Plasma gleichzeitig auf die Fibrinogenkonzentration und die Plasminogenaktivatorkonzentration gemessen werden kann, indem man die Zuordnung des Abfalles und Anstiegs dieses Bewegungssignals zum Viskositätsanstieg und -abfall im Trockenreagens verwendet. D.h., gemäß der vorstehenden Veröffentlichung wird vorgeschlagen, daß eine negative Neigung des Bewegungssignals, das die Magnetteilchen sofort nach Zugabe des Plasmas zeigen, in Verhältnis zur Fibrinogenkonzentration im Plasma steht, und daß die Lyse- Initiationszeit, bei der das Bewegungssignal der Magnetteilchen wieder zu steigen beginnt, nachdem sie auf einem Plateau angelangt sind, umgekehrt proportional ist zur Plasminogenaktivatorkonzentration im Plasma. Die vorstehende Veröffentlichung nimmt jedoch nicht spezifisch Bezug auf irgendwelche technische Maßnahmen zur Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des Trockenreagens und ihrer Wirkungen und beschreibt auch nichts über die Beziehung zur Bestimmungsmethode unter Verwendung eines flüssigen Reagens.
Wenn Fibrinogen mit einem Trockenreagens, das Thrombin enthält, bestimmt werden kann, so kann, wie dies vorstehend beschrieben wurde, das bestehende Problem, daß vor der Messung Zeit verstreicht, überwunden werden. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben gemäß dem US-Patent 5110727 ein Trockenreagens hergestellt und von einem Plasma die Fibrinogenkonzentration unter Verwendung des Trockenreagens gemessen. Als Ergebnis wurde jedoch gefunden, daß die erhaltene Größe der negativen Neigung des Bewegungssignals der Magnetteilchen keine ausreichende zufriedenstellende Reproduzierbarkeit zeigt. Außerdem wurde gefunden, daß, wenn Plasma mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen mehrere Male gemäß der vorstehenden Methode gemessen wird, die erhaltene Größe der negativen Neigung des Bewegungssignals der Magnetteilchen in einigen Fällen nicht der Fibrinogenkonzentration entspricht.
Es wurde deshalb gefunden, daß es schwierig ist, die Fibrinogenbestimmung gemäß dem im US-Patent 5110727 beschriebenen Verfahren in der Praxis zu verwenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine erste Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es, ein Trockenreagens bereitzustellen, mit dem Fibrinogen in einer Probe genau und während eines kurzen Zeitraums bestimmt werden kann, und ein Bestimmungsverfahren dafür.
Eine zweite erfindungsgemäße Aufgabenstellung ist es, ein Trockenreagens bereitzustellen, das eine leichte Bestimmung von Fibrinogen in einer Probe mit guter Reproduzierbarkeit ermöglicht, und das entsprechende Bestimmungsverfahren dafür.
Eine dritte erfindungsgemäße Aufgabenstellung ist es, ein Trockenreagens zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Probe bereitzustellen, das die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit auch dann behält, wenn es während eines längeren Zeitraums gelagert wird, und einen Reagensträger, der dieses Trockenreagens enthält.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabenstellung ist es, einen einfachen Weg bereitzustellen, mit dem Fibrinogen in einer Probe genau bestimmt werden kann, und ein dafür verwendetes Reagens.
Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabenstellung ist es, ein Reagens zur Fibrinogenbestimmung bereitzustellen, das für einen dringenden Bluttest in einer Blutprobe auf normale oder abnormale Koagulation bei einem übermäßigen Blutverlust vorteilhafterweise verwendet werden kann, und ein entsprechendes Bestimmungsverfahren dafür.
Weitere Aufgabenstellungen und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um die vorstehend genannten erfindungsgemäßen Aufgabenstellungen zu lösen, und haben gefunden, daß die Löslichkeit eines Trockenreagens, das ein Protein mit Thrombinaktivität in einer flüssigen Probe enthält, die Leistungsfähigkeit der Bestimmung von Fibrinogen stark beeinflußt. D.h., es wurde festgestellt, daß die Gleichmäßigkeit der Auflösung des Trockenreagens in der flüssigen Probe die Reproduzierbarkeit der Fibrinogenbestimmung beeinflußt und außerdem eine Verbesserung der Löslichkeit des Trockenreagens den Bereich der Fibrinogenbestimmung verbreitert. Und außerdem wurde gefunden, daß die Gleichmäßigkeit und Verbesserung der Löslichkeit des Trockenreagens erreicht werden kann, indem man ein spezifisches Additiv verwendet, und daß die Inhibierung der Koagulationsreaktion des Fibrinogens in Gegenwart dieses spezifischen Additivs nicht verursacht wird.
Erfindungsgemäß werden einige der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Aufgabenstellungen durch ein Trockenreagens (I) zur Fibrinogenbestimmung gelöst, das im wesentlichen besteht aus:
(a) einem Protein mit Thrombinaktivität (Komponente a), (b) mindestens einem Additiv, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Salz davon und einem Saccharid (Komponente b), und (c) Magnetischen Teilchen (Komponente c). Erfindungsgemäß können einige der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Aufgabenstellungen gelöst werden durch ein Trockenreagens (II) zur Fibrinogenbestimmung, das im wesentlichen besteht aus:
(a) einem Protein mit Thrombinaktivität (Komponente a) und
(b) mindestens einem Additiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Salz davon und einem Saccharid (Komponente b).
Gemäß der vorliegenden Erfindung können einige der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Aufgabenstellungen gelöst werden durch ein Verfahren zur Fibrinogenbestimmung in einer Probe, das umfaßt:
(1) In-Kontakt-Bringen des vorstehend genannten Trockenreagens (I) mit einer Probe,
(2) Überwachen der Viskosität des Trockenreagens bis zu einem Endpunkt, der willkürlich bei einem Punkt gewählt wird, wo die Viskosität des Trockenreagens auf das 20/19 bis 3-fache des Minimalwertes seiner Viskosität ansteigt,
(3) Messen der Koagulationszeit, die vom In-Kontakt-Bringen des Trockenreagens mit der Probe bis zum Endpunkt verstrichen ist, und
(4) Bestimmen des Gehalts an aktivem Fibrinogen in der Probe auf der Basis der Koagulationszeit.
Das erfindungsgemäße Fibrinogenbestimmungsverfahren basiert auf der Thrombinzeitmethode, und das durch das erfindungsgemäße Fibrinogenbestimmungsverfahren gemessene Fibrinogen ist Fibrinogen, das dazu fähig ist, in Gegenwart von Thrombin selbst in Fibrin überführt zu werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen Trockenreagentien (I) und (II), die Verfahren zu ihrer Herstellung, und das Verfahren zur Fibrinogenbestimmung einer Probe werden nun detaillierter und spezifischer beschrieben.
Trockenreagentien (I) und (II) zur Fibrinogenbestimmung
Die erfindungsgemäßen Trockenreagentien (I) und (II) enthalten als Komponente (a) ein Protein mit Thrombinaktivität, und dieses Protein bezieht sich auf ein Protein, das die Überführung von Fibrinogen in Fibrin katalysiert. Der Ursprung dieses Proteins ist nicht spezifisch beschränkt, sofern es die obige Überführung in Fibrin katalysieren kann. Dieses Protein wird im allgemeinen vorteilhafterweise ausgewählt aus Rinderthrombin, menschlichem Thrombin und Schlangengiftprotein. Das Protein mit Thronbinaktivität ist im allgemeinen als gefriergetrocknetes Protein im Handel erhältlich, und diese können zweckmäßigerweise als solche verwendet werden.
Die Menge des Proteins als Komponente (a) in einem Trockenreagens (I), die in einer Messung zur Fibrinogenbestimmung pro 25 ul einer verdünnten Probe verwendet wird (pro Reagensträger, der später beschrieben wird) beträgt im allgemeinen zweckmäßigerweise mindestens 0,05 NIHU, und vorzugsweise 0,5 bis 1,5 NIHU. "NIHU" ist eine Einheit für die Menge der Thrombinaktivität und ist allgemein bekannt. Sie wird z.B. in "Minimum Requirement for Dried Thrombin", 2. Revision, Division of Biologic Standards, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1946, beschrieben.
In den Erläuterungen des Trockenreagens (1) zur Fibrinogenbestimmung und des Verfahrens zu seiner Herstellung, wie sie erfindungsgemäß bereitgestellt werden, beziehen sich die Anteile der Komponenten (a), (b) und (c) auf ihre Mengen, die pro 25 ul einer verdünnten Probe in einer Messung verwendet werden (z.B. pro einem Reagensträger) . Die Anteile dieser Komponenten können deshalb, abhängig von der normalen Menge einer Probe, bestimmt werden, und können relativ zur Menge der verdünnten Probe variiert werden.
Was auf der anderen Seite das Trockenreagens (II) zur Fibrinogenbestimmung betrifft, wie es durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, wird im allgemeinen eine verdünnte Probe in einer Menge von ca. 300 ul für eine Messung verwendet, und die Menge des Proteins (Komponente (a)) pro 300 ul einer verdünnten Probe beträgt zweckmäßigerweise im allgemeinen mindestens 0,5 NIHU, und vorzugsweise 5 bis 15 NIHU. In den Erläuterungen zum Trockenreagens (II) zur Fibrinogenbestimmung und dem Verfahren zu seiner Herstellung, wie sie erfindungsgemäß bereitgestellt werden, beziehen sich die Anteile der Komponente (a), (b) und (c) auf ihre Mengen, die pro 300 ul einer verdünnten Probe, die in einer Messung verwendet wird, verwendetwerden. Die Anteile dieser Komponenten können deshalb relativ zur Menge der Probe variieren.
Die erfindungsgemäßen Trockenreagentien (I) und (II) enthalten als Komponente (b) mindestens ein Additiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Salz davon und einem Saccharid. Als Aminosäure oder Salz davon ist eine α-Aminosäure oder ein Salz davon bevorzugt. Die Aminosäure oder das Salz davon kann ausgewählt sein aus einer neutralen Aminosäure oder einem Salz davon, einer sauren Aminosäure oder einem Salz davon, und einer basischen Aminosäure oder einem Salz davon. Von diesen sind aus den folgenden Gründen eine saure Aminosäure oder ein Salz davon bevorzugt. Wenn eine saure Aminosäure oder ein Salz davon verwendet wird, ist die Löslichkeit einer Probe in den Trockenreagentien (I) und (II) hervorragend, und das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen zeigt eine hervorragende Reproduzierbarkeit. Typische Beispiele für eine saure Aminosäure oder ihr Salz umfassen Glutaminsäure, Natriumglutamat, Asparaginsäure und Natriumaspartat. Beispiele für die neutrale Aminosäure oder ihr Salz umfassen Glycin, Glycinhydrochlorid und L-Alanin. Beispiele für die basische Aminosäure oder ihr Salz umfassen L-Lysin, L- Lysinhydrochlorid und L-Arginin.
Wenn eine Aminosäure als Komponente (b) verwendet wird, wird die saure Aminosäure im allgemeinen auf einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 mit einer geeigneten Base, wie z.B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, vor der Verwendung neutralisiert, und die basische Aminosäure wird auf einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 mit einer geeigneten Säure, wie z.B. Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure, vor der Verwendung neutralisiert.
Das Saccharid wird ausgewählt aus Monosacchariden und Polysacchariden, wobei Monosaccharide bevorzugt sind, weil das Bewegungssignal der Magnetteilchen dann in seiner Reproduzierbarkeit hervorragend ist. Typische Beispiele des Monosaccharids umfassen Glucose und Fructose. Beispiele für Polysaccharide umfassen Sucrose, Lactose, Trehalose und Dextrin. Von diesen Sacchariden sind Glucose, Fructose und Sucrose bevorzugt.
In dem Trockenreagens (I) und dem Verfahren zu seiner Herstellung, wie sie erfindungsgemäß bereitgestellt werden, beträgt die Menge der Komponente (b) vorzugsweise 0,02 bis 1 mg, und insbesondere 0,2 bis 0,8 mg.
In dem Trockenreagens (II) und dem Verfahren zu seiner Herstellung, wie sie erfindungsgemäß bereitgestellt werden, beträgt die Menge der Komponente (b) vorzugsweise 0,2 bis 10 mg, und insbesondere 2,0 bis 8,0 mg.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte Trockenreagens zur Fibrinogenbestimmung enthält magnetische Teilchen als Komponente (c) . Diese Komponente (c) ist zur optischen Überwachung der Änderung der Viskosität des Reagens als Bewegungssignal in dem Verfahren zur Überführung von Fibrinogen zu Fibrin nützlich. Als Komponente (c) können ohne irgendeine Einschränkung bekannte magnetische Teilchen verwendet werden. Die Komponente (c) wird z.B. ausgewählt aus Eisen(III,II)-oxid-Teilchen, Eisen(III) -oxid-Teilchen, Eisenteilchen, Kobaltteilchen, Nickelteilchen und Chromoxidteilchen. Bevorzugt sind im Hinblick auf die Intensität des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen Eisen (III,II) -oxid-Teilchen. Der durchschnittliche Teilchendurchmesser der magnetischen Teilchen ist nicht speziell beschränkt, und beträgt im allgemeinen 0,01 bis 10 um, und vorzugsweise 0,1 bis 3 um. Der Gehalt an magnetischen Teilchen im Trockenreagens (1) ist nicht spezifisch beschränkt, und beträgt im allgemeinen 2 x 10&supmin;&sup6; g bis 2 x 10&supmin;&sup4; g, und vorzugsweise 2 x 10&supmin;&sup5; g bis 1,2 x 10&supmin;&sup4; g.
Wenn die Komponente (b), d.h. die vorstehend genannte Aminosäure, ihr Salz davon oder das Saccharid nicht enthalten sind, dann zeigt das Reagens eine schlechte Löslichkeit. Als Ergebnis wird kein Bewegungssignal der magnetischen Teilchen erhalten, und deshalb kann die Bestimmung nicht wirksam durchgeführt werden. Auch wenn ein von diesen verschiedenes Additiv verwendet wird, zeigt das Reagens eine schlechte Löslichkeit, und in einigen Fällen wird kein Bewegungssignal der magnetischen Teilchen erhalten. Auch wenn ein Bewegungssignal erhalten wird, variiert die Löslichkeit des Reagens, und als Ergebnis wird keine Reproduzierbarkeit in der Veränderung des Bewegungssignals mit der Zeit beobachtet. Als Folge davon kann keine genaue Bestimmung mit guter Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Außerdem wird keine Inhibierung der Koagulationsreaktion des Fibrnogens verursacht und als Ergebnis kann keine leichte und genaue Bestimmung des Fibrinogens durchgeführt werden. Als Komponente (b) ist im allgemeinen die Aminosäure oder ihr Salz im Hinblick auf die Löslichkeit des Reagens, die Reproduzierbarkeit und die Leichtigkeit der Reaktion besser als das Saccharid.
Herstellung des Trockenreagens für die Fibrinogenbestimmung und die Materialien für das Trockenreagens.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Trockenreagens (I) zur Fibrinogenbestimmung bereitgestellt, das die Gefriertrocknung einer Flüssigkeitsmischung umfaßt, die im wesentlichen besteht aus:
(a) einem Protein mit Thrombinaktivität (Komponente (a)),
(b) mindenstens einem Additiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Salz davon und einem Saccharid (Komponente b),
(c) magnetischen Teilchen (Komponente c), und
(d) einem Medium auf Wasserbasis (Komponente d).
Erfindungsgemäß wird außerdem ein Verfahren zur Herstellung des obigen Trockenreagens (II) zur Fibrinogenbestimmung bereitgestellt, das die Gefriertrocknung einer Flüssigkeitsmischung umfaßt, die im wesentlichen besteht aus:
(a) einem Protein mit Thrombinaktivität (Komponente a);
(b) mindestens einem Additiv, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Salz davon und einem Saccharid (Komponente b), und
(d) einem Medium auf Wasserbasis (Komponente d).
Das erfindungsgemäße Trockenreagens (I) kann z.B. hergestellt werden, indem man das Protein mit Thrombinaktivität (Komponente a) in dem Medium auf Wasserbasis (Komponente d), insbesondere in einer Pufferlösung, löst, die bestimmten Mengen der magnetischen Teilchen (Komponente c) und des Additivs (Komponente b), wie z.B. einer Aminosäure, eines Salzes davon oder eines Saccharids, zugibt, um die Endlösung auszubilden, dann eine bestimmte Menge der Endlösung auf einen Reagensträger aufbringt, die aufgebrachte Endlösung einfriert und die eingefrorene Lösung gefriertrocknet.
Der vorstehend beschriebene in dem vorstehenden Herstellungsverfahren verwendete Reagensträger ist nicht speziell beschränkt, sofern er die optische Überwachung eines Ansteigens der Viskosität des Trockenreagens als Abschwächung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen bei der Fibrinogenbestimmung erlaubt. Es kann z.B. ein in den Figuren 1 und 2 dargestellter Reaktionsträger verwendet werden. Die Figur 1 zeigt eine Draufsicht auf eine Ausführungsform des Reagensträgers, bei der ein durch eine gestrichelte Linie umgrenzter Teil den wesentlichen Teil darstellt, der einen Einlaß für die Endlösung, die zur Herstellung des Trockenreagens zur Fibrinogenbestimmung verwendet werden soll, und einen Einlaß für eine Probe umfaßt. Die Figur 2 zeigt detailliert die Struktur des wesentlichen Teils. Der wesentliche Teil wird z.B. aufgebaut, indem man eine transparente Polyesterplatte B auf einer weißen Polyesterplatte c auflaminiert, und dann eine transparente Polyesterplatte A auf die transparente Polyesterplatte B auflaminiert. Die Endlösung für das Trockenreagens zur Fibrinogenbestimmung wird durch einen in Figur 1 gezeigten Einlaß eingebracht und in den Teil, der mit D bezeichnet wird, eingefüllt. Wenn der Reaktionsträger dieses Typs verwendet wird, wird die Endlösung im allgemeinen in einer Menge von ca. 20 bis 30 ul aufgebracht.
Die Struktur des Reaktionsträgers dieses Typs wird im Detail auch in den Figuren 11 bis 16 des US-Patentes Nr. 5110727 beschrieben.
Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Mengen und Aktivitäten der Komponenten des Trockenreagens zur Fibrinogenbestimmung, wie sie in der vorliegenden Beschreibung spezifiziert werden, auf Mengen und Aktivitäten pro Reaktionsträger, wenn 25 ul der Endlösung auf einen solchen Reaktionsträger, wie er in den Figuren 1 und 2 dargestellt wird, aufgebracht und gefriergetrocknet werden.
Das Medium auf Wasserbasis, vorzugsweise eine Pufferlösung, in dem das Protein mit Thrombinaktivität, die magnetischen Teilchen und die Aminosäure oder das Salz davon oder das Saccharid erhalten sind, ist nicht spezifisch beschränkt, sofern es eine Pufferkapazität von pH = 6,0 bis 8,0 zeigt. Das Medium auf Wasserbasis umfaßt vorzugsweise 20 mM HEPES- Pufferlösung (pH = 7,35) oder eine 20 mM Phosphatpufferlösung (pH = 7,4).
Das Verfahren zur Trocknung der Pufferlösung, die die vorstehenden essentiellen Komponenten enthält, ist, obwohl es darauf nicht speziell beschränkt ist, vorzugsweise ein Gefriertrocknungsverfahren. Wenn ein Lufttrocknungsverfahren verwendet wird, verschlechtert sich die Löslichkeit des Reagens in einem gewissen Ausmaß, und die Intensität des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen tendiert dazu, schlechter zu werden.
Das vorstehend genannte Gefriertrocknungsverfahren ist nicht spezifische beschränkt. Das Gefriertrocknungsverfahren umfaßt z.B. ein allgemeines Verfahren, bei dem die Endlösung des Trockenreagens zur Fibrinogenbestimmung auf den in Figur 1 dargestellten Reaktionsträger durch den Einlaß eingebracht wird, und der Reaktionsträger sofort mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff gekühlt wird. Das Verfahren zur Trocknung der gekühlten Endlösung ist ebenfalls nicht speziell beschränkt, obgleich es bevorzugt ist, die Temperatur des eingefrorenen Reaktionsträgers im Vakuum von -30 ºC auf Raumtemperatur innerhalb einer Zeit von 7 bis 13 Stunden linear zu erhöhen.
Das erfindungsgemäße Trockenreagens (I) liegt vorzugsweise in einem im Reagensträger ausgebildeten Film vor.
Das erfindungsgemäße Trockenreagens (II) kann hergestellt werden, indem man das Protein mit Thrombinaktivität (Komponente a) in einem Medium auf Wasserbasis, vorzugsweise einer Pufferlösung, löst, ein Additiv, wie z.B. eine Aminosäure, ein Salz davon oder ein Saccharid, zugibt, um die Endlösung herzustellen, eine bestimmte Menge der Endlösung in einen Reaktionsbehälter gibt, die Endlösung einfriert und die eingefrorene Endlösung trocknet.
Das Verfahren zur Trocknen der eingefrorenen Endlösung ist nicht speziell beschränkt. Das Verfahren und die Bedingungen zur Trocknung der eingefrorenen Endlösung sind die gleichen, wie sie im Hinblick auf das vorstehend beschriebene Trockenreagens (I) beschrieben wurden. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich in diesem Fall die Komponenten des Reagens (II) zur Fibrinogenbestimmung, wie sie in der vorliegenden Beschreibung spezifiziert werden, jedoch auf die Mengen pro Reaktionsgefäß und die Aktivitäten, wenn 300 ul der Endlösung in das Reaktionsgefäß gegeben und gefriergetrocknet werden.
Die das Fibrinogen enthaltende Probe, zu dem die erfindungsgemäßen Trockenreagentien (I) und (II) zugegeben werden können, ist nicht spezifisch beschränkt, und umfaßt menschliches Gesamtblut, tierisches Gesamtblut, menschliches Plasma und tierisches Plasma. Insbesondere werden die erfindungsgemäßen Trockenreagentien (I) und (II) vorzugsweise für von Menschen abgeleitetes Gesamtblut und Plasma verwendet.

Verfahren zur Bestimmung von aktivem Fibrinogen

Wenn das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Trockenreagens (I) oder (II) verwendet wird, kann das Fibrinogen in einer Probe in einem breiten Konzentrationsbereich genau, mit guter Reproduzierbarkeit und schnell gemessen werden. Erfindungsgemäß wurde insbesondere festgestellt, daß die Fibrinogenbestimmung genau durchgeführt werden kann, indem man das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen des vorstehend beschriebenen Trockenreagens (I) überwacht und die Beziehung zwischen der Veränderung der Viskosität und der Koagulation bestimmt.
Die Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) wird nachfolgend erläutert.
Die Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) kann durchgeführt werden, indem man das Trockenreagens (I) auf die die Reaktionsteilnehmer aufnehmende Einrichtung aufgibt, die bestimmte Menge an Probe zum Trockenreagens (I) zugibt, sofort nach der Zugabe eine Kombination eines schwingenden Magnetfelds mit einem statischen permanenten Magnetfeld appliziert, wobei die in dem Trockenreagens (I) enthaltenden Magnetteilchen in Bewegung gesetzt werden, und das Bewegungssignal der Magnetteilchen mit einer Vorrichtung zur optischen Überwachung optisch überwacht.
Für die Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) sind Vorrichtungen zur optischen Überwachung mit den Handelsnamen CG01 (A & T Corp.) und COAG1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) erhältlich.
Die Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) kann auf der Basis einer Änderung des Bewegungssignal der magnetischen Teilchen während der Zeit durchgeführt werden, wobei diese Veränderung erhalten wird, nachdem eine Probe zum Reagens (I) zugefügt wurde.
Das Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenkonzentration einer Probe auf der Basis einer Veränderung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen während der Zeit ist nicht speziell beschränkt, und es sind eine Vielzahl von Methoden verfügbar. Es kann z.B. eine bekannte Methode, die die Größe der negativen Neigung des Bewegungssignals, das die magnetischen Teilchen sofort nach Zugabe einer Probe zeigen, verwendet werden. Neben dieser Methode kann eine Methode verwendet werden, die die Koagulationszeit verwendet, bei der ein ausgewählter Punkt in der Bewegungssignalintensität als Endpunkt angesetzt wird, und die Zeit von der Zugabe der Probe bis zum Endpunkt wird als Koagulationszeit genommen.
Das Verfahren, bei dem ein aus gewählter Punkt der Bewegungssignalintensität als Endpunkt festgesetzt wird, und die Zeit von der Addition einer Probe bis zum Endpunkt gemessen wird, ist das folgende. Ein Punkt, bei dem das Bewegungssignal sich gegenüber dem Peakwert des beobachteten Bewegungssignals der magnetischen Teilchen in einem bestimmten Verhältnis abgeschwächt hat, wird als Endpunkt angesetzt, und die Zeit von der Zugabe der Probe bis zum Endpunkt wird als Koagulationszeit genommen. Die nach diesem Verfahren erhaltene Koagulationszeit korreliert gut mit der Fibrinogenkonzentration in der Probe.
Das Fibrinogenbestimmungsverfahren in Plasma unter Verwendung der Koagulationszeit ist ebenfalls nicht speziell beschränkt, und es wird typischerweise wie folgt durchgeführt. Zuerst werden drei Plasmaproben mit bekannten aber unterschiedlichen Fibrinogenkonzentrationen mit Pufferlösungen der gleichen Art verdünnt, und die resultierenden verdünnten Plasmalösungen werden auf ihre Koagulationszeiten gemessen, die den individuellen Plasmaproben der vorstehend beschriebenen Methode entsprechen. Auf der Basis der so erhaltenen Ergebnisse wird eine Eichkurve hergestellt. Dann wird ein Plasma in der gleichen Pufferlösung, wie sie vorstehend verwendet wurde, mit dem gleichen Verdünnungsverhältnis verdünnt, und die resultierende verdünnte Plasmalösung wird auf die Koagulationszeit auf die gleiche Weise wie oben beschrieben gemessen, und die Fibrinogenkonzentration wird auf der Basis der so erhaltenen Koagulationszeit unter Bezugnahme auf die vorstehend hergestellte Eichkurve bestimmt. In diesem Fall ist es bevorzugt, eine Eichkurve in Form eines log-log-Diagrammes zu verwenden, in dem die X- Achse die Fibrinogenkonzentrationen und die Y-Achse die Koagulationszeiten darstellt.
Die obige Pufferlösung zur Verdünnung einer Probe (z.B. Plasma) kann unter irgendeiner Pufferlösung ausgewählt werden, obgleich OWREN's Puffer bevorzugt wird.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Fibrinogenbestimmung in einer Probe bereitgestellt, das umfaßt:
(1) In-Kontakt-Bringen des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) mit der Probe,
(2) Überwachen der Viskosität des Trockenreagens bis zu einem Endpunkt, der willkürlich bei einem Punkt gewählt ist, wo der Viskositätswert des Trockenreagens 20/19- bis 3-fach so groß ist wie der minimale Wert seiner Viskosität,
(3) Messung der Koagulationszeit&sub1; die vom Kontakt mit dem Trockenreagens und der Probe bis zum Endpunkt verstrichen ist, und
(4) Bestimmen des Gehaltes an aktivem Fibrinogen in der Probe auf der Basis der Koagulationszeit.
Die Probe, für die das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren angewendet wird, ist vorzugsweise menschliches Gesamtblut oder Plasma, und insbesondere menschliches Plasma.
Der Endpunkt, auf den in der vorstehenden Bestimmungsmethode bezuggenommen wurde, ist irgendein angenommener Punkt, bei dem die Viskosität des Trockenreagens ansteigt, um das 20/19bis 3-fache des Minimalwertes der Viskosität zu betragen, nachdem eine Probe zum Trockenreagens zugefügt wurde. Im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit ist es insbesondere bevorzugt, den Endpunkt, bei dem der Viskositätswert ansteigt, so festzusetzen, daß er das 10/7- bis 2-fache des minimalen Viskositätswertes beträgt. Wenn der Endpunkt so angesetzt wird, daß die Viskosität kleiner als das 20/19- (ca. 1,05)-fache des minimalen Viskositätswerts ist, ist die Empfindlichkeit gering. Wenn er so angesetzt wird, daß die Viskosität größer als das 3-fache des minimalen Viskositätswertes ist, neigt der Bestimmungsbereich dazu, eng zu werden.
Die Viskositätsänderung im erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) kann überwacht werden, indem man die darin enthaltenden magnetischen Teilchen verwendet. Die Methode zur Überwachung der Viskositätsänderung ist nicht speziell begrenzt. Die Überwachung wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt. Das Trockenreagens (I) wird auf eine die Reaktionsteilnehmer aufnehmende Einrichtung gegeben, dann eine bestimmte Menge der Probe zum Trockenreagens (I) zugegeben, eine Kombination eines schwingenden Magnetfelds und eines statischen permanenten Magnetfelds appliziert, um die in dem Trockenreagens (I) enthaltenden magnetischen Teilchen in Bewegung zu setzen, und das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen wird optisch überwacht. Für die obige Überwachung kann irgendeine im Handel erhältliche Vorrichtung, einschließlich der vorstehend genannten Vorrichtung, verwendet werden.
Wenn eine im Handel erhältliche Überwachungsvorrichtung verwendet wird, wird die Veränderung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen, die der Viskositätsänderung des Trockenreagens umgekehrt proportional ist, als Veränderung während der Zeit erhalten. Um die vorliegende Erfindung für diesen Fall zu erklären, ist der Minimalwert der Viskosität ein Punkt, bei dem alle Komponenten des Trockenreagens gelöst sind, d.h., bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen sofort nach Zugabe einer Probe einen Peakwert zeigt. Dies wird ferner unter Bezugnahme auf die Figur 4-A erläutert. Die Figur 4-A zeigt ein typisches Verhältnis zwischen der Zeit, die nach der Zugabe der Probe (Abszisse) und der Intensität des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen (Ordinate) verstrichen ist. Die Intensität des durch die Ordinate angezeigten Bewegungssignals steht in umgekehrtem Verhältnis zur Viskosität des Reagens. D.h. Figur 4-A zeigt, daß, wenn die Intensität des Bewegungssignals entlang der Ordinate wächst, die Viskosität abnimmt.
Wenn eine Probe zum Trockenreagens zugegeben wird, wird das Reagens in der Probe gelöst, und die Viskosität fällt dann scharf ab, um einen Minimalwert zu erreichen. Der Punkt, bei dem die Viskosität den Minimalwert besitzt, ist der Punkt, bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen einen Peakwert besitzt, der in Figur 4-A als X dargestellt wird. Die Viskosität des Reagens zeigt dann den Minimalwert und steigt dann allmählich an, um einen bestimmten Viskositätswert bei einer bestimmten Zeit zu erreichen. Wenn der Signalwert zu dieser Zeit als Y angenommen wird, ist der Viskositätsanstieg zu dieser Zeit X/Y-mal so groß wie die Viskosität am Punkt X. D.h. die Zeit, bei der die Abschwächung der Signalintensität relativ zum Peakwert des Bewegungssignales (X-Y)x100/X (%) erreicht, entspricht der Zeit, bei der der Viskositätsanstieg das X/Y-fache der Viskosität am Punkt X erreicht. In Figur 4-A wird ein Punkt, bei dem die Signalintensität des Peakwertes (X) um 30 % abgeschwächt ist, als Y, bezeichnet. In diesem Fall zeigt der Punkt Y daß die Viskosität ansteigt, um 10/7-fach so groß wie die Viskosität beim Punkt X zu sein.
Im erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren kann irgendein Punkt im Bereich, in dem die Viskosität des Trockenreagens ansteigt, um 20/19- bis 3-fach so groß wie die Viskosität des Minimalwertes (X), und vorzugsweise 10/7- bis 2-fach so groß ist, als Endpunkt angenommen werden. Die Zeitspanne von der Kontaktzeit des Trockenreagens mit der Probe bis zur Zeit des Endpunkts wird als Koagulationszeit gemessen.
Die Länge der vorstehenden Koagulationszeit korreliert gut mit der Fibrinogenkonzentration in der Probe.
Das Fibrinogenbestimmungsverfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (II) wird nachfolgend erläutert.
Das Trockenreagens (II) enthält im Gegensatz zu den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) keine magnetischen Teilchen. Das Trockenreagens (II) kann deshalb ähnlich wie das Trockenreagens (I) verwendet werden, wenn es vorher, um magnetische Teilchen zu enthalten, gelöst und getrocknet wird. Das erfindungsgemäße Trockenreagens (II) kann jedoch in Kombination mit einer Stahlkugel verwendet werden, da es keine magnetischen Teilchen enthält, wodurch das Fibrinogen in einer Probe genau bestimmt werden kann.
Das Bestimmungsverfahren unter Verwendung des Trockenreagens (II) wird nachfolgend erläutert. Das Trockenreagens (II), das in wesentlichen aus den Komponenten (a) und (b) besteht, wird in einen Reaktionsgefäß KC-10A (bezogen von Amelung GmbH, Lemgo) hergestellt. Dann wird eine Stahlkugel (bezogen von Amelung GmbH, Lemgo) auf das Trockenreagens (II) aufgegeben, und eine Probe zugegeben. Die Zeit von der Zugabe der Probe bis zu der Zeit, bei der die Stahlkugel sich zu bewegen beginnt, wird als Koagulationszeit gemessen. Die nach diesem Verfahren erhaltene Koagulationszeit stimmt gut mit der Fibrinogenkonzentration in der Probe überein. Das Verfahren zur Fibrinogenbestimmung im Plasma durch die Koagulationszeit ist nicht speziell beschränkt. Die Bestimmung gemäß diesem Verfahren wird z.B. wie folgt durchgeführt. Zuerst werden drei Plasmaproben mit bekannten, aber verschiedenen Fibrinogenkonzentrationen in Pufferlösungen verdünnt, und die verdünnten Probenlösungen dann auf ihre Koagulationszeiten, die den vorstehenden drei Plasmaproben gemäß der vorstehend beschriebenen Bestimmungsmethoden entsprechen, gemessen. Auf der Basis der so erhaltenen Ergebnisse wird eine Eichkurve aufgestellt. Ein Plasma wird im gleichen vorstehend verwendeten Verdünnungsverhältnis verdünnt. Die verdünnte Plasmalösung wird auf die Koagulationszeit auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben gemessen, und die Fibrinogenkonzentration wird auf der Basis der so erhaltenen Koagulationszeit unter Bezugnahme auf die vorstehend hergestellte Eichkurve bestimmt. In diesem Fall ist es bevorzugt, eine Eichkurve, die ein log-log-Diagramm ist, zu verwenden, in dem die X-Achse die Fibrinogenkonzentrationen und die Y-Achse die Koagulationszeiten darstellt.
Die obige Pufferlösung zur Verdünnung einer Probe kann ausgewählt sein unter irgendeiner Pufferlösung, so wie dies im Hinblick auf das Trockenreagens (I) festgestellt wurde, wobei OWREN's Puffer bevorzugt ist.
Im Verfahren zur Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) ist die praktisch zweckmäßigste Methode die, bei der das Trockenreagens (I) und eine Probe in Kontakt miteinander gebracht werden, die Zeit während der die Viskosität von der Zugabe der Probe bis zu einem bestimmten Viskositätswert (Endpunkt) ansteigt, als Koagulationszeit gemessen wird, und der Fibrinogengehalt, wie vorstehend beschrieben, auf der Basis der Koagulationszeit bestimmt wird, da die Probe leicht, genau und rasch durchgeführt werden kann.
Zusätzlich haben Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Anmeldung ergeben, daß der Fibrinogengehalt in einer Probe durch andere modifizierte Bestimmungsverfahren unter Verwendung des Trockenreagens (I) bestimmt werden kann, da das Trockenreagens (I) als solches eine hervorragende Reaktivität, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit zeigt.
D.h. erfindungsgemäß werden auch modifizierte Verfahren (a-1) bis (a3) der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) bereitgestellt.
(a-1) Ein Verfahren zur Fibrinogenbestimmung auf der Basis der Veränderung der Viskosität mit der Zeit mittels der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I).
(a-1) Ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen auf der Basis einer Veränderung der Viskosität mit der Zeit unter Verwendung des Trockenreagens (I), wobei das Verfahren umfaßt:
(i) vorherige Zugabe von Proben mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen zu den Trockenreagentien (I), danach Bestimmen der anfänglichen Viskositätsanstiegsraten beginnend mit der Zeit, bei der jede Reaktionsmischung einen minimalen Viskositätswert zeigt, bis zu einer vorbestimmten Zeit und Bestimmungsbereichen, die den anfänglichen Viskositätsanstiegsraten zur Bestimmung der Konzentration einer Probe entsprechen, und
(ii) Zugabe einer Probe mit einer unbekannten Konzentration zum Trockenreagens (I), Messen der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate der resultierenden Reaktionsmischung, Bestimmen des Bestimmungsbereiches auf der Basis der anfänglichen Viskositätsanstiegsrate, Messen der Viskositätsanstiegsrate der Reaktionsmischung im Bestimmungsbereich und Bestimmen des Fibrinogengehaltes in der Probe auf der Basis der Viskositätsanstiegsrate.
(a-2) Ein Verfahren zur Fibrinogenbestimmung auf der Basis der Veränderung der Viskosität mit der Zeit unter Verwendung des Trockenreagens (I), wobei das Verfahren umfaßt:
(i) vorhergehende Zugabe von Proben mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen zu Trockenreagentien (I), danach Bestimmung der Viskositätsminimalzeiten von der Zugabe der Proben bis zu einer Zeit, bei der jede Reaktionsmischung minimale Werte der Viskosität und der Bestimmungsbereiche zeigt, die den Viskositätsminimalzeiten zur Bestimmung der Konzentration einer Probe entsprechen, und
(ii) Zugabe einer Probe mit unbekannter Konzentration zum Trockenreagens (I), Messen des Viskositätsminimums der resultierenden Reaktionsmischung, Bestimmen der Bestimmungsbereiche auf der Basis der Viskositätsminimalzeit, Messen der Viskositätsanstiegsrate für die Reaktionsmischung im Bestimmungsbereich und Bestimmen des Fibrinogengehaltes in der Probe auf der Basis der Viskositätsanstiegsrate.
(a-3) Verfahren zur Fibrinogenbestimmung auf der Basis der Veränderung der Viskosität mit der Zeit unter Verwendung des Trockenreagens (I), wobei das Verfahren umfaßt:
(i) vorhergehende Bestimmung des Bestimmungsbereiches in einem Bereich, bei dem die Viskosität des Reaktionssystems 20/19- bis 2-fach so groß wie der Wert der minimalen Viskosität ist, und
(ii) Zugabe einer Probe mit einer unbekannten Konzentration zum Trockenreagens (I), Messen der Viskositätsanstiegsrate der Reaktionsmischung im Bestimmungsbereich und Bestimmen des Fibrinogengehaltes in der Probe auf der Basis der Viskositätsanstiegsrate.
Wenn irgendeines der obigen Verfahren (a-1) bis (a-3) mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung, wie z.B. "CG01" oder "COAG1" durchgeführt wird, wird die in Figur 4-A dargestellte Signalwellenform in eine logarithmische Signalwellenform umgewandelt, die in Figur 4-B dargestellt ist, und die Fibrinogenbestimmung wird charakteristischerweise auf der Basis eines linearen Teils der logarithmischen Signalwellenform vorgenommen. Diese Verfahren werden nachfolgend erklärt. Wenn die Viskositätsänderung im System mittels einer Meßvorrichtung, wie z.B. CG01 oder COAG1, bestimmt wird, wird eine Signalwellenform, wie sie in Figur 4-A dargestellt wird, erhalten. Dann wird der Logarithmus dieser Signalintensität berechnet. Die so erhaltene Wellenforn wird als logarithmische Signalwellenform bezeichnet. Z.B. wird eine logarithmische Signalwellenform, wie sie in Figur 4-B dargestellt wird, erhalten. In Figur 4-B zeigt die Abszisse die Zeit nach der Zugabe einer Probe an, und die Ordinate zeigt den Logarithmus der Signalintensität an. Aus der logarithmischen Signalwellenform ist es ersichtlich, daß, je kleiner der Wert des Logarithmus der Signalintensität ist, desto höher ist dann die Viskosität. D.h., in Figur 4-B ist, wenn das Reaktionssystem den minimalen Viskositätswert zeigt, der Logarithmus der Signalintensität am größten.
In Figur 4-B besitzt A, B, C, D, E und F die folgenden Bedeutungen:
A: Maximalwert des Logarithmus der Signalintensität
B: Logarithmischer Wert der Signalintensität, wenn C Sekunden von der Zeit, bei der das Reaktionssystem die
Minimalviskosität (Pt) gezeigt hat, verstrichen sind.
C: Eine ausgewählte Zeit
D: Bestimmungsbereich
E: Logarithmischer Wert der Signalintensität beim Startpunkt des Bestimmungsbereiches
F: Logarithmischer Wert der Signalintensität beim Endpunkt des Bestimmungsbereiches
Die anfängliche Viskositätssteigerungsrate wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Figur 4-B erläutert. In diesem Fall wird die anfängliche Viskositätssteigerungsrate durch die folgenden zwei Gleichungen ausgedrückt, die A und B in der in Figur 4-B dargestellten logarithmischen Signalwellenform verwenden.
Anfänglicher Viskositätserhöhungsumwandlungskoeffizient (%) = (B/A) x 100
Anfängliche Viskositätssteigerungsrate = 100 - anfänglicher Viskositätssteigerungsumwandlungskoeffizient (%)
Der anfängliche Viskositätssteigerungsumwandlungskoeffizient bedeutet, daß, je kleiner dieser Koeffizient ist, desto größer ist die anfängliche Viskositätssteigerungsrate. A in Figur 4-B zeigt den Maximalwert der logarithmischen Werte der Signalintensität, und dieses A entspricht dem logarithmischen Wert der Signalintensität, wenn das Reaktionssystem die Minimalviskosität zeigt. B ist der logarithmische Wert der Signalintensität zu einer Zeit, bei der eine gewählte Zeit C von der Zeit, bei der das Reaktionssystem die Minimalviskosität zeigte, verstrichen ist. Die in Figur 4-B dargestellte Zeitspanne C ist nicht speziell beschränkt und kann frei gewählt werden, obgleich C im Hinblick auf eine Verbesserung der Bestimmungsgenauigkeit vorzugsweise bei einem Wert von ca. 12 Sekunden gewählt wird.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren (a-1) bis (a-3) kann das Fibrinogen durch Messen der Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich bestimmt werden. Auf ähnliche Weise wird in Figur 4-B die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich ausgedrückt als Änderungswert der logarithmischen Werte der Signalintensität pro Zeiteinheit im Bestimmungsbereich. Die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich entspricht der Fibrinogenkonzentration. D.h., je höher die Fibrinogenkonzentration im Blut oder Plasma ist, umso größer ist die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich. In Figur 4-B wird die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich durch die folgende Gleichung ausgedrückt.
Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich = (E-F)/D
Der vorstehende Bestimmungsbereich wird zunächst kontinuierlich oder stufenweise bestimmt, damit er der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate unter Verwendung von Proben bekannter Konzentrationen entspricht. Die kontinuierliche Bestimmung des Bestimmungsbereiches wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figur 4-B erläutert.
In der kontinuierlichen Bestimmung wird zunächst unter Verwendung von Proben mit bekannten Konzentrationen die Signalwellenform erhalten. Die erhaltene Signalwellenform wird in eine logarithmische Signalwellenform konvertiert. Dann wird auf der Basis dieser Kurve (logarithmisches Signalwellenform) ein linearer Bereich der Kurve ausgewählt von einer Zeit, bei der das Reagens gelöst wird, d.h. wenn das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis zu einer Zeit, bei der das Reaktionssystem eine konstante Viskosität nach Vervollständigung der Koagulation zeigt, und die obige anfängliche Viskositätssteigerungsrate wird bestimmt. Dieser lineare Teil gibt die Fibrinogenkonzentration am genauesten wieder. Der Startpunkt (Startzeit) und Endpunkt (Endzeit) des so bestimmten linearen Teils wird auf eine solche Weise aufgetragen, daß diese Punkte der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate entsprechen, und dann wird der Bestimmungsbereich innerhalb des linearen Bereichs, d.h. eines Bereichs zwischen dem Startpunkt des linearen Bereichs und seines Endpunkts, für jede anfängliche Viskositätssteigerungsrate bestimmt, wodurch der Startpunkt des Bestimmungsbereiches später kommt, wenn die anfängliche Viskositätssteigerungsrate abfällt, oder der Startpunkt des Bestimmungsbereiches früher kommt, wenn die anfängliche Viskositätssteigerungsrate steigt, und die für den Bestimmungsbereich verwendete Zeit länger ist, wenn die anfängliche Viskositätssteigerungsrate abfällt. Auf diese Weise wird die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich kaum durch eine Störung beeinträchtigt und kann genau bestimmt werden. Die durch Kombinieren der Werte des Startpunktes (E) des so bestimmten Bestimmungsbereiches und der Werte des Endpunktes (F) des so bestimmten Bestimmungsbereiches ausgebildeten kontinuierlichen Linien sind bevorzugte Kurven, und der Bereich zwischen diesen zwei kontinuierlichen Linien wird als Bestimmungsbereich genommen.
Spezifischer ausgedrückt umfaßt, wenn der anfängliche Viskositätssteigerungsumwandlungskoeffizient (%) 95 % beträgt, der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 5,0 Sekunden, nämlich von 2,5 Sekunden nach dem das Reaktionssystem die minimale Viskosität besitzt, bis zu 7,5 Sekunden danach. Wenn er 96 % beträgt, umfaßt der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 7,0 Sekunden, beginnend 7,5 Sekunden nachdem das Reaktionssystem die minimale Viskosität besitzt, bis zu 14,0 Sekunden danach. Wenn er 97 % beträgt, umfaßt der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 7,5 Sekunden von 7,5 Sekunden nachdem das Reaktionssystem den Minimalwert der Viskosität besitzt, bis zu 15,0 Sekunden danach. Wenn er 98 % beträgt, umfaßt der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 10,0 Sekunden, beginnend von 8,0 Sekunden nachdem das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis zu 18,0 Sekunden danach. Wenn er 99 % beträgt, umfaßt der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 19,0 Sekunden, beginnend 16,0 Sekunden nachdem das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis zu 35,0 Sekunden danach. Wenn er mindestens 99,1 % beträgt, umfaßt der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 21,0 Sekunden, beginnend 17,5 Sekunden nachdem das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis 38,5 Sekunden danach.
Bei der stufenweisen Bestimmung wird zunächst die Signalwellenform unter Verwendung von Proben bekannter Konzentrationen erhalten. Die erhaltene Signalwellenform wird in die logarithmische Signalwellenform konvertiert. Dann wird auf der Basis dieser Kurve (logarithmische Signalwellenform) ein linearer Bereich von einer Zeit, bei der das Reagens gelöst wird, d.h. wenn das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis zu einer Zeit, bei der die Reaktion endet, wodurch das Reaktionssystem eine konstante Viskosität zeigt, ausgewählt und die anfängliche Viskositätssteigerungsrate wird auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben bestimmt. Der Bestimmungsbereich wird stufenweise auf der Basis überlappender Bereiche im Linearbereich auf eine Weise bestimmt, daß der Bestimmungsbereich der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate entspricht. Der Standard, bei dem die anfängliche Viskositätssteigerungsrate stufenweise getrennt wird, wird abhängig von dem entsprechenden linearen Bereich geeignet bestimmt, und ist nicht konstant.
Wenn der vorstehend definierte anfängliche Viskositätssteigerungsumwandlungskoeffizient (%) z.B. geringer als 95 % ist, umfaßt der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 5 Sekunden, beginnend 2,5 Sekunden nachdem das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis zu 7,5 Sekunden danach. Wenn der anfängliche Viskositätssteigerungsumwandlungskoeffizient (%) mindestens 95 % und weniger als 99,1 % beträgt, wird der Bestimmungsbereich so angesetzt, daß er den Zeitraum von 7,5 Sekunden von 7,5 Sekunden nachdem das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt bis 15 Sekunden danach umfaßt. Wenn der vorstehende anfängliche Viskositätssteigerungsumwandlungskoeffizient (%) mindestens 99,1 % beträgt, umfaßt der Bestimmungsbereich den Zeitraum von 17,5 Sekunden von 17,5 Sekunden nachdem das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt bis zu 35 Sekunden danach.
Der Bestimmungsbereich, der der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate stufenweise oder kontinuierlich entspricht, wird durch die Vorrichtung und das Reagens, die verwendet werden, beeinflußt. Es ist deshalb erforderlich, den Bestimmungsbereich vorher unter Verwendung eines Modellplasmas mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen zu bestimmen.
Zur Bestimmung des Fibrinogengehaltes auf der Basis der Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich werden im allgemeinen die Viskositätssteigerungsraten in den Bestimmungsbereichen bestimmt, indem man eine Vielzahl von Proben mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen in Betracht zieht, und es werden vorher Eichkurven der Viskositätssteigerungsraten in den Bestimmungsbereichen und der Fibrinogenkonzentrationen hergestellt. Auf der Basis dieser Eichkurven wird der Fibrinogengehalt bestimmt. D.h., wenn von einer Probe mit einer unbekannten Fibrinogenkonzentration eine Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich gemessen wird, kann die Fibrinogenkonzentration auf der Basis der Eichkurve bestimmt werden.
Es wird um ein spezifisches Anwendungsbeispiel erläutert, wobei die obere Grenze und die untere Grenze des Bestimmungsbereiches als Funktion der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate verwendet werden. D.h., der entsprechende Bestimmungsbereich wird auf der Basis der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate bestimmt. Wenn eine Probe gemessen wird, wird zuerst die anfängliche Viskositätssteigerungsrate berechnet, und der Bestimmungsbereich auf der Basis des erhaltenen Wertes der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate bestimmt. Auf der Basis der vorausgehend hergestellten Eichkurve kann dann die Fibrinogenkonzentration bestimmt werden durch Berechnung der Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich.
In der Methode (a-2) der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des Trockenreagens (I) auf der Basis der Veränderung seiner Viskosität während der Zeit kann die Fibrinogenbestimmung durchgeführt werden, indem man zunächst Proben mit bekannten Konzentrationen den Trockenreagentien (I) zugibt, dann die Viskositätsminimalzeiten von der Zugabe der Proben bis zu einer Zeit, bei der jede Reaktionsmischung einen minimalen Viskositätswert zeigt, und die Bestimmungsbereiche, die den Viskositätsminimalzeiten zur Bestimmung der Konzentration einer Probe bestimmt, dann eine Probe mit einer unbekannten Konzentration dem Trockenreagens (I) zugibt, die Viskositätsminimalzeit der resultierenden Reaktionsmischung mißt, und schließlich die Viskositätssteigerungsrate der Reaktionsmischung im Bestimmungsbereich, der der erhaltenen Viskositätsminimalzeit entspricht, mißt.
Die Zeit, bei der das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, und die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich, entsprechen der vorstehenden Definition.
In dieser Methode (a-2) wird der Bestimmungsbereich charakteristischerweise auf der Basis der Viskositätsminimalzeit bestimmt, die von der Zugabe der Probe bis zu der Zeit, bei der das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, verstreicht.
D.h., der Bestimmungsbereich wird kontinuierlich oder stufenweise auf eine Art bestimmt, daß er der Viskositätsminimalzeit entspricht. Die kontinuierliche Bestimmung des Bestimmungsbereiches auf der Basis der Viskositätsminimalzeit wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figur 4-B erläutert.
In der vorstehenden Bestimmung wird zunächst die Signalwellenform unter Verwendung von Proben mit bekannten Konzentrationen erhalten. Die erhaltene Signalwellenform wird in eine logarithmische Signalwellenform konvertiert. Dann wird auf der Basis dieser Kurve (logarithmische Signalwellenform) ein linearer Bereich der Kurve von einer Zeit, bei der das Reagens gelöst wird, d.h. wenn das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis zu einer Zeit bei der das Reaktionssystem eine konstante Viskosität nach Vervollständigung der Koagulation zeigt, ausgewählt und die obige Viskositätsminimalzeit bestimmt. Dieser lineare Teil gibt die Fibrinogenkonzentration sehr genau an. Der Startpunkt (Startzeit) und Endpunkt (Endzeit) des so bestimmten linearen Teils werden auf solche Weise aufgetragen, daß diese Punkte der Viskositätsminimalzeit entsprechen, und dann wird der Bestimmungsbereich innerhalb des linearen Bereichs, d.h. eines Bereichs zwischen dem Startpunkt und dem Endpunkt, für jede Viskositätsminimalzeit so bestimmt, daß der Startpunkt des Bestimmungsbereiches später kommt, wenn die Viskositätsminimalzeit verlängert ist, oder der Startpunkt des Bestimmungsbereiches früher kommt, wenn die Viskositätsminimalzeit kürzer ist, und die vom Bestimmungsbereich umfaßte Zeit länger ist, wenn die Viskositätsminimalzeit verlängert ist. Auf diese Weise wird die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich kaum durch eine Störung beeinträchtigt und kann genau bestimmt werden. Die durch Kombinieren der Werte des Startpunktes (E) der so bestimmten Bestimmungsbereiche und der Werte des Endpunkts (F) der so bestimmten Bestimmungsbereich gebildeten kontinuierlichen Linien sind bevorzugten Kurven, und der Bereich zwischen diesen zwei kontinuierlichen Linien wird als Bestimmungsbereich genommen.
In der stufenweisen Bestimmung wird zunächst die Signalwellenform unter Verwendung von Proben mit bekannten Konzentrationen erhalten. Die erhaltene Signalwellenform wird in eine logarithmische Signalwellenform konvertiert. Dann wird auf der Basis dieser Kurve (logarithmische Signalwellenform) ein linearer Bereich von einer Zeit, bei der das Reagens gelöst wird, d.h. wenn das Reaktionssystem die minimale Viskosität zeigt, bis zu einer Zeit, wo die Reaktion endet, wodurch das Reaktionssystem eine konstante Viskosität zeigt ausgewählt, und die Viskositätsminimalzeit wird auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben bestimmt. Der Bestimmungsbereich wird stufenweise auf der Basis von überlappenden Bereichen in der linearen Region auf eine Art bestimmt, daß der Bestimmungsbereich der Viskositätsminimalzeit entspricht. Der Standard, auf dem die Viskositätsminimalzeit stufenweise getrennt wird, wird abhängig vom entsprechenden linearen Bereich passend bestimmt, und ist nicht konstant.
Wenn die Viskositätsminimalzeit geringer als 5 Sekunden nach Beginn der Messung ist, wird z.B., wie im später beschriebenen Beispiel 12 gezeigt, der Bestimmungsbereich so angesetzt, daß er den Zeitraum von 2,5 Sekunden nach der Viskositätsminimalzeit bis 7,5 Sekunden umfaßt. Wenn die Viskositätsminimalzeit nach Beginn der Messung mindestens 5 Sekunden und weniger als 15 Sekunden beträgt, wird der Bestimmungsbereich so angesetzt, daß er den Zeitraum von 7,5 Sekunden von 7,5 Sekunden nach der Viskositätsminimalzeit bis 15 Sekunden umfaßt. Wenn die Viskositätsminimalzeit nach Beginn der Messung mindestens 15 Sekunden beträgt, wird der Bestimmungsbereich so angesetzt, daß er den Zeitraum von 17,5 Sekunden von 17,5 Sekunden nach der Viskositätsminimalzeit bis 35 Sekunden umfaßt.
Zur Bestimmung des Fibrinogengehaltes auf der Basis der Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich werden die Viskositätssteigerungsraten in den Bestimmungsbereichen im allgemeinen unter Berücksichtigung einer Vielzahl von Proben mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen bestimmt, wobei die Eichkurven der Viskositätssteigerungsraten in den Bestimmungsbereichen und den Fibrinogenkonzentrationen vorausgehend erstellt werden. Auf der Basis dieser Eichkurven wird der Fibrinogengehalt bestimmt. D.h., wenn eine Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich für eine Probe unbekannter Fibrinogenkonzentration gemessen wird, kann die Viskositätssteigerungsrate auf der Basis der Eichkurve in die Fibrinkonzentration konvertiert werden.
In dem Verfahren (a-3) zur Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des Trockenreagens (I) zur Fibrinogenbestimmung auf der Basis einer Veränderung seiner Viskosität während der Zeit wird die Fibrinogenbestimmung durch vorhergehende Bestimmung eines Bestimmungsbereiches aus einem Bereich bestimmt, in dem die Viskosität des Reaktionssystems auf das 20/19- bis 2-fache des Minimalwertes der Viskosität steigt, dann wird eine Probe mit einer unbekannten Konzentration zum Trockenreagens (I) zugegeben, und die Viskositätssteigerungsrate des Reaktionssystem im Bestimmungsbereich gemessen.
Es wird nun eine Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens unter Verwendung der vorstehenden Meßvorrichtung für das vorstehende Blutkoagulationstrockenreagens erläutert; es wird eine Veränderung des Bewegungssignal der magnetischen Teilchen während der Zeit erhalten, wobei diese Veränderung umgekehrt proportional ist zur Viskosität im Reagensträger. Es wird die in Figur 4-A dargestellte Veränderung des Bewegungssignals erhalten. Wenn die Signalintensität des Bewegungssignals, bei der die Viskosität das Minimum ist, als X angenommen wird, und wenn die Signalintensität, bei der die Viskosität des Reaktionssystems bis zu einem bestimmten Viskositätwert steigt, als Y angenommen wird, steigt die Viskosität zu dieser Zeit auf das X/Y-fache des Minimalwertes der Viskosität. D.h. der Bruch, der eine Signalintensität von Y/X x 100 (%) der Signalintensität des Bewegungssignals zeigt, wenn die Viskosität das Minimum aufweist, entspricht einem Punkt, bei dem die Viskosität auf das X/Y-fache des Minimalwertes der Viskosität angestiegen ist. Der Punkt, bei dem die Viskosität des Reaktionssystems auf das 20/19-fache der minimalen Viskosität angestiegen ist, entspricht z.B. einem Punkt, bei dem die Signalintensität 95 % der Signalintensität des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen beträgt, wenn die Viskosität den Minimalwert besitzt.
In dem obigen Verfahren (a-3) werden im Bereich von einem Punkt, bei dem die Viskosität des Reaktionssystem das 20/19- fache des minimalen Wertes davon beträgt, bis zu einem Punkt, bei dem die Viskosität auf das 2-fache des Minimalwertes steigt, zwei Punkte angenommen, und der Bereich (Zeit) zwischen diesen beiden Punkten als Bestimmungsbereich bestimmt. Bevorzugt ist es, den Bestimmungsbereich zwischen dem 10/9-fachen und 10/7-fachen festzusetzen, da dann die Reproduzierbarkeit verbessert wird. Die Zeit zwischen den obigen beiden Punkten ist nicht speziell begrenzt, wenn sie im obigen Bereich liegt, obgleich sie vorzugsweise auf mindestens 2 Sekunden festgelegt wird, weil dies die Bestimmungsgenauigkeit verbessert.
Wenn der Bestimmungsbereich dort festgesetzt wird, wo die Viskosität des Reaktionssystems geringer als das 20/19-fache ihres Minimalwertes ist, korrelieren die Fibrinogenkonzentration und die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich schlecht miteinander. Wenn die erhaltenen Daten in einem Millimeterpapier zur Ausbildung eines Diagrammes eingetragen werden, bei dem die X-Achse die Fibrinogenkonzentration bedeutet und die Y-Achse die Viskositätssteigerungsrate, ist die Linearität unzureichend. Insbesondere kann Fibrinogen in hoher Konzentration überhaupt nicht bestimmt werden. Wenn der Bestimmungsbereich dort angesetzt wird, wo die Viskosität des Reaktionssystems größer als das 2-fache des Minimalwertes ist, kann Fibrinogen in einem geringen Konzentrationsbereich nicht bestimmt werden, und die Messung in einem hohen Konzentrationsbereich zeigt große Fehler. Deshalb ist es erforderlich, daß der Bestimmungsbereich in dem Bereich festgesetzt wird, worin die Viskosität des Reaktionssystems das 20/19- bis 2-fache ihres Minimalwertes beträgt.
Zur Bestimmung des Fibrinogengehaltes auf der Basis der Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich werden die Viskositätssteigerungraten in den Bestimmungsbereichen im allgemeinen unter Berücksichtigung einer Vielzahl von Proben mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen bestimmt, wobei zunächst Eichkurven der Viskositätssteigerungsraten in den Bes timmungsberei chen und den Fibrinogenkonzentrationen hergestellt werden. Auf der Basis dieser Eichkurven wird der Fibrinogengehalt bestimmt. D.h., wenn die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich für eine Probe mit unbekannter Fibrinogenkonzentration gemessen wird, kann die Viskositätssteigerungsrate auf der Basis der Eichkurve in die Fibrinogenkonzentration konvertiert werden.
Die Trockenreagentien (I) und (II) für die Fibrinogenbestimmung, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellüwerden, sind hervorragend, weil sie eine Wiederherstellung des Thrombinreagens und die Zeit zur Erwärmung der Probe vermeiden, und, im Gegensatz zu der Fibrinbestimmungsmethode unter Verwendung eines flüssigen Reagens gemäß der Thrombinzeitmethode, eine rasche Fibrinogenbestimmung mit guter Reproduzierbarkeit durch einfache Verdünnung einer Probe, ermöglichen. Das Trockenreagens (I) und (II) erlaubt breite Bestimmungsbereiche, und im Gegensatz zu einem flüssigen Reagens vermeiden die Trockenreagentien (I) und (II) im wesentlichen die Verfahren der Nachmessung einer Probe durch Veränderung des Verdünnungsverhältnisses, wenn die Probe eine Fibrinogenkonzentration außerhalb des Bestimmungsbereiches besitzt. Spezifischer ausgedrückt erlauben konventionelle Reagentien nur die Bestimmung in einem Konzentrationsbereich von 150 bis 300 mg/dl, wenn eine Probe auf das 20-fache verdünnt wird, während das erfindungsgemäße Trockenreagens (I) die Bestimmung eines breiten Konzentrationsbereiches von 50 bis 800 mg/dl erlaubt, wenn die Probe auf das 20-fache verdünnt wird. Das erfindungsgemäße Trockenreagens (I) besitzt deshalb das charakteristische Merkmal, daß es eine hohe Empfindlichkeit und Meßgenauigkeit auch in einem geringen Konzentrationsbereich aufweist.
Das Ergebnis der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) korreliert auch besser mit dem Ergebnis der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung eines flüssigen Reagens, als mit dem Ergebnis bekannter Trockenreagentien, die Thrombin enthalten (US-Patent 5110727), und die Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) kann mit einer verbesserten Reproduzierbarkeit und mit einer höheren Verläßlichkeit durchgeführt werden.
Als Ergebnis der Entwicklung des Trockenreagens (I) für die Fibrinogenbestimmung, wie es durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann die Meßvorrichtung verkleinert werden, und außerdem kann sie leichter bedient werden. Mit dem Trockenreagens (I) kann deshalb ein dringender Test direkt am Krankenbett durchgeführt werden, ohne daß dafür ein Fachmann erforderlich ist.
Wenn das Trockenreagens (II) für die Fibrinogenbestimmung, daß durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, verwendet wird, z.B. mit einer Vorrichtung zur Fibrinogenbestimmung (Handelsname KC-10A, bezogen von Amelung GmbH, Lemgo), wobei im allgemeinen ein flüssiges Reagens benutzt wird, korrelieren die Koagulationszeit und die Fibrinogenkonzentration im Plasma miteinander sehr gut. Unter Verwendung des Trockenreagens (II) kann deshalb die Fibrinogenbestimmung mit einer Vorrichtung zur Fibrinogenbestimmung unter Verwendung eines flüssigen Reagens ohne mühsame Reagenszubereitungen, wie z.B. einem Vorerhitzen, durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenkonzentration in einer Probe erlaubt einen breiteren Konzentrationsbereich zur Fibrinogenbestimmung und ergibt, im Vergleich zu einer Fibrinogenbestimmung unter Verwendung einer negativen Neigung des Bewegungssignal der magnetischen Teilchen, eine hervorragende Reproduzierbarkeit. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren vermeidet deshalb Verfahren zur Nachmessung einer Probe unter Veränderung des Verdünnungsverhältnisses, wenn die Probe eine Fibrinogenkonzentration außerhalb des Bestimmungsbereiches aufweist, wie beim Fibrinogenbestimmungsverfahren unter Verwendung der negativen Neigung des Bewegungssignal der magnetischen Teilchen.
Außerdem korrelieren die Ergebnisse der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Trockenreagentien sehr gut mit den Ergebnissen der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung eines flüssigen Reagens, und die Bestimmung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Trockenreagentien kann mit einer verbesserten Reproduzierbarkeit, höherer Verläßlichkeit und höheren Genauigkeit durchgeführt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figur 1 zeigt einen typischen Reagensträger für die Verwendung bei der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I), worin D den Teil für das aufzubringende Reagens darstellt.
Die Figur 2 zeigt eine Aufgliederung des in Figur 1 dargestellten Reagensträgers, worin A eine transparente Harzplatte bedeutet, B eine transparente Harzplatte bedeutet und C eine weiße Harzplatte bedeutet.
Die Figur 3 zeigt die Veränderung der Bewegungssignalintensität von Magnetteilchen abhängig von der Zeit nach Zugabe einer Probe zum Trockenreagens (I)
Figur 4-A zeigt eine Endpunkt-Analysenmethode unter Verwendung des Trockenreagens (I) zum Erhalt der dem Fibrinogengehalt entsprechenden Koagulationszeit.
Figur 4-B ist ein Diagramm, daß eine logarithmische Signalwellenform darstellt, in der die Abszisse die Zeit nach Zugabe der Probe und die Ordinate den logarithmischen Wert der Signalintensität angeben.
Die Figur 5 zeigt die Differenz in der Veränderung der Bewegungssignalintensität von Magnetteilchen zwischen dem durch Gefriertrocknen erhaltenen Trockenreagens (I) und einem luftgetrockneten Reagens.
Die Figur 6 zeigt die Beziehung zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma, erhalten durch die in Figur 4-A dargestellte Endpunktanalysenmethode.
Die Figur 7 zeigt die Beziehung zwischen den durch ein konventionelles Verfahren unter Verwendung eines flüssigen Reagens erhaltenen Fibrinogenwerten und den durch das Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) erhaltenen Fibrinogenwerten.
Die Figur 8 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (II) erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Die Figur 9 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), das Schlangengiftprotein als Protein mit Thrombinaktivität enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 10 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), das menschliches Thrombin als Protein mit Thrombinaktivität enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 11 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), das Sucrose als Additiv enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 12 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), das Glucose als Additiv enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 13 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), das Fructose als Additiv enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 14 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), daß L-Lysinchlorat als Additiv enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 15 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), das Glycin als Additiv enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 16 zeigt das Verhältnis zwischen der unter Verwendung des Trockenreagens (I), das Natriumaspartat als Additiv enthält, erhaltenen Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Die Figur 17 zeigt die Korrelation zwischen der Koagulationszeit, die erhalten wird, wenn die Endpunkte durch Veränderung des Abschwächungsverhältnisses zum Peakwert des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen festgesetzt werden, und der Fibrinogenkonzentration.
Die Figur 18 zeigt die Methode zur Berechnung der negativen Neigung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen.
Die Figur 19 zeigt die Korrelation zwischen der nach der in Figur 18 gezeigten Methode erhaltenen negativen Neigung und der Fibrinogenkonzentration im Plasma.
Figur 20 zeigt die Korrelation zwischen der erhaltenen Koagulationszeit, wenn die Endpunkte so angesetzt sind, daß das Abschwächungsverhältnis zum Peakwert des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen von dem der vorliegenden Erfindung verschieden ist, und der Fibrinogenkonzentration.
Figur 21 zeigt die Fibrinogenbestimmungskurve (Eichkurve), erhalten durch Bestimmung des Bestimmungsbereiches, der der Zeit entspricht, in der das Reaktionssystem den minimalen Viskositätswert zeigt, wobei die Abszisse die Fibrinogenkonzentration und die Ordinate die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich zeigt.
Figur 22 zeigt die Korrelation zwischen den im Beispiel 13 erhaltenen Fibrinogenwerten gemäß der in Figur 21 dargestellten Eichkurve und den Fibrinogenwerten, die mittels eines konventionellen Verfahrens erhalten wurden, wobei die Abszisse die Fibrinogenkonzentration gemäß dem konventionellen Verfahren und die Ordinate die Fibrinogenkonzentration gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren angibt.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf Beispiele näher erläutert. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auf diese Beispiele nicht beschränkt.
Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1: Vergleich der Anderungen der Bewegungssignale von magnetischen Teilchen während der Zeit, abhängig von Additiven.
Die folgenden sechs Trockenreagentien wurden im Hinblick auf Veränderungen der Bewegungssignale der magnetischen Teilchen während der Zeit mittels einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung (CG01, bezogen von A&T Corp.) verglichen. Die verglichenen Trockenreagentien waren ein Thrombinreagens, das Glucose enthielt (nachfolgend als "Glucosereagens" abgekürzt), ein Thrombinreagens, das Natrium-L-Glutamatmonohydrat enthielt (nachfolgend als "Natriumglutamatreagens" abgekürzt), ein Thrombin enthaltendes Rinderserumalbumin (nachfolgend als "Albuminreagens" bezeichnet), ein Thrombinreagens, das Tween 80 enthielt (nachfolgend als "Tween 80 Reagens" abgekürzt), ein Thrombinreagens, das PEG6000 enthielt (nachfolgend als "PEG6000 Reagens" abgekürzt) und ein Thrombin enthaltendes Glycerin (nachfolgend als "Glycerinreagens" abgekürzt). Die vorstehenden Reagentien wurden wie folgt hergestellt.
In den folgenden Reagentienpräparationen bezieht sich der Ausdruck "HEPES" auf N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure (C&sub8;H&sub1;&sub8;N&sub2;O&sub4;S).

Herstellung des Glucosereagens

Zu Rinderthrombinreagens (bezogen von International Reagents Corp.) wurde reines Wasser zugegeben, um 100 U/ml einer wässerigen Thrombinlösung herzustellen. Diese wässerige Thrombinlösung und 30 mM HEPES (bezogen von Dojindo Laboratories)-Pufferlösung (pH = 7,35), die 1,5 % Glucose enthielt (bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden in einem Volumenverhältnis von 1:2 gemischt. Ferner wurden Eisen(III,II)-oxid-Teilchen (magnetische Teilchen, bezogen von Rare Metallic Co., Ltd.) mit der obigen Mischung in einer solchen Menge gemischt, daß die Endkonzentration des Eisen(III,II)-oxids (magnetische Teilchen) 5 mg/ml betrug, um eine Endlösung des Glucosereagens herzustellen. Die Endlösung (25 ul) wurde auf den gleichen Reagensträger, wie er in Figur 1 dargestellt wird, aufgebracht. Der Reagensträger wurde sofort eingefroren und dann gefriergetrocknet, um ein Glucosereagens zu erhalten. Die Gefriertrocknung wurde durchgeführt, indem man die Temperatur im Vakuum linear von - 30 ºC bis 20 ºC innerhalb von 8 Stunden erhöhte.

Herstellung des Natriumglutamatreagens

Ein Natriumglutamatreagens wurde auf die gleiche Weise wie in der vorstehenden Herstellung des Glucosereagens hergestellt, mit der Ausnahme, daß 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 1,5 % (Gew/Vol) Glucose enthielt, durch 30 InM HEPES-Pufferlösung, die 3,0 % (Gew/Vol) Natrium L-Glutamatmonohydrat enthielt, ersetzt wurde.

Herstellung des Albuminreagens

Das Albuminreagens wurde auf die gleiche Weise wie in der vorhergehenden Herstellung des Glucosereagens hergestellt, mit der Ausnahme, daß die 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 1,5 % (Gew/Vol) Glucose enthielt, durch 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 4,5 mg/ml Rinderserumalbumin (bezogen von Sigma Chemical Company) enthielt, ersetzt wurde.

Herstellung des Tween 80-Reagens

Das Tween 80 Reagens wurde auf die gleiche Weise wie in der vorhergehenden Herstellung des Glucosereagens hergestellt, mit der Ausnahme, daß die 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 1,5 % (Gew/Vol) Glucose enthielt, durch 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 0,075 % (Gew/Vol) Tween 80 (nichtionisches oberflächenaktives Mittel, bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ersetzt wurde.

Herstellung von PEG6000-Reagens

Das PEG6000 Reagens wurde auf die gleiche Weise wie in der vorstehenden Herstellung des Glucosereagens hergestellt, mit der Ausnahme, daß die 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 1,5 % (Gew/Vol) Glucose enthielt, durch 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 1,5 % (Gew/Vol) PEG6000 (Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 6000, bezogen von Koch-Light, Ltd.) ersetzt wurde.

Herstellung des Glycerinreagens

Das Glycerinreagens wurde auf die gleiche Weise wie in der obigen Herstellung des Glucosereagens hergestellt, mit der Ausnahme, daß die 30 mM HEPES Pufferlösung, die 1,5 % (Gew/Vol) Glucose enthielt, durch 30 mM HEPES-Pufferlösung, die 0,75 % (Gew/Vol) Glycerin (bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) enthielt, ersetzt wurde.

Vergleich der Veränderungen des Bewegungssignals während der Zeit

Plasma, das 200 mg/dl Fibrinogen enthielt, wurde mit OWREN's Pufferlösung (bezogen von Sigma Chemical Company) auf das 20- fache verdünnt. Dann wurde jedes der obigen 6 Trockenreagentien unabhängig in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 gegeben, und 25 ul der obigen verdünnten Lösung zugegeben. Dann wurde das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen jedes Reagens optisch überwacht.
Die Figur 3 zeigt die Veränderungen der Bewegungssignale der magnetischen Teilchen während der Zeit nach Zugabe der verdünnten Lösung. In Figur 3 bedeutet A das aus dem Glucosereagens erhaltene Diagramm, B bedeutet das aus dem Natriumglutamatreagens erhaltene Diagramm, C bedeutet das aus dem Albuminreagens erhaltene Diagramm, D bedeutet das aus den Tween 80-Reagens erhaltene Diagramm, E bedeutet das aus PEG6000-Reagens erhaltene Diagramm und F bedeutet das aus dem Glycerinreagens erhaltene Diagramm.
Aus der Figur 3 ist es leicht verständlich, daß, wenn das Glucosereagens, das Natriumglutamatreagens und das Glycerinreagens verwendet wurden, die Veränderung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen während der Zeit einem Anstieg der Viskosität der Reagentien entsprach. Die verbleibenden Reagentien waren in ihrer Löslichkeit schlecht und zeigten keine Korrespondenz des Bewegungssignal der magnetischen Teilchen gegenüber einem Ansteigen der Viskosität der Reagentien.

Vergleichsbeispiel 2: Kein Additiv enthaltendes Trockenreagens

Die folgenden Reagentien, die kein Additiv enthielten (nachfolgend als "Additiv-freies Reagens" abgekürzt) wurden mit einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung (CG01, bezogen von A£T Corp.) auf Änderungen der Bewegungssignale der magnetiscchen Teilchen während der Zeit getestet. Die Additiv-freien Reagentien wurden wie folgt hergestellt.

Herstellung des Additiv-freien Reagens

Reines Wasser wurde zu Rinderthrombinreagens (bezogen von International Reagents Corp.) zugegeben, um 100 U/ml einer wässerigen Thrombinlösung herzustellen. Diese wässerige Thrombinlösung und 30 mM HEPES (bezogen von Dojindo Laboratories)-Pufferlösung (pH = 7,35) wurden in einem Volumenverhältnis von 1:2 gemischt. Außerdem wurde Eisen(III,II)-oxid (magnetische Teilchen, bezogen von Rare Metallic Co., Ltd.) mit der obigen Mischung in einer solchen Menge gemischt, daß die Endkonzentration des Eisen(III,II)- oxids (magnetische Teilchen) 5 mg/ml betrug, um eine Endlösung für das Additiv-freie Reagens herzustellen. Das Additiv-freie Reagens wurde aus der obigen Endlösung auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 hergestellt.

Messung der Veränderung des Bewegungssignals während der Zeit

Plasma, das 200 mg/dl Fibrinogen enthält, wurde mit OWREN's Pufferlösung (bezogen von Sigma Chemical Company) auf das 20- fache verdünnt. Dann wurde das obige Additiv-freie Reagens in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 eingegeben, und 25 ul der obigen verdünnten Lösung zugegeben. Dann wurde das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen des Additiv-freien Reagens optisch überwacht.
Wenn das Additiv-freie Reagens verwendet wurde, war das resultierende Diagramm ähnlich dem Diagramm des PEG6000- Reagens im Vergleichsbeispiel 1, d.h. es wurde kein Bewegungssignal der magnetischen Teilchen beobachtet, und es war keine Bestimmung möglich.

Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 3: Reproduzierbarkeit der Koagulationszeit

Das gleiche Glucosereagens, Natriumglutamatreagens und Glycerinreagens, wie sie vorstehend im Beispiel 1 und im Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurden, und ein konventionelles Trockenreagens, beschrieben in US-Patent Nr. 5110727, wurden in einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG-01 (bezogen von A&T Corp.) auf die Reproduzierbarkeit der Koagulationszeit geprüft.
Plasma, das 200 mg/dl Fibrinogen enthielt, wurde mit OWREN's Pufferlösung (bezogen von Sigma Chemical Company) auf das 20- fache verdünnt. Dann wurde eines der obigen Reagentien in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 gegeben, und 25 ul der obigen verdünnten Lösung zugegeben. Dann wurde das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen des Reagens optisch überwacht. Diese Verfahren wurden mit jedem Reagens fünfmal wiederholt. Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die Tabelle 1 zeigt auch die durchschnittlichen Werte davon und die Koeffizienten der Variationswerte (CV-Werte)
Der Endpunkt und die Koagulationszeit wurden wie in Figur 4-A dargestellt festgesetzt. D.h., in dem Diagramm, das die Veränderung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen während der Zeit zeigt, wurde der Endpunkt bei einem Punkt angesetzt, wo das Bewegungssignal um 30 % des Peakwertes des Bewegungssignals abgeschwächt war, und die Koagulationszeit wurde festgesetzt, um einen Zeitraum von der Zugabe der Probe bis zum Endpunkt zu umfassen. In Figur 4-A zeigt nämlich A den Endpunkt an und B zeigt die Koagulationszeit an.
Wie die Tabelle 1 zeigt, waren das Glucosereagens und das Natriumglutamatreagens, die unter der vorliegenden Erfindung fallen, im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit der Koagulationszeit hervorragend. Die anderen Reagentien, d.h. das Glycerinreagens und das in der offengelegten PCT- Patentpublikation 504076/1991 beschriebene Reagens zeigten jedoch keine Reproduzierbarkeit der Veränderung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen während der Zeit, da diese Reagentien sich nicht gleichmäßig lösen. Es wurde deshalb festgestellt, daß diese anderen Reagentien keine Reproduzierbarkeit der Koagulationszeit zeigen. Tabelle 1

Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 4

Vergleich der Veränderungen des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen während der Zeit abhängig von den Trocknungsmethoden

Die folgenden zwei Fibrinogenbestimmungs-Trockenreagentien, die Natrium L-Glutamatmonohydrat als Additiv enthielten, wurden durch verschiedene Trocknungsverfahren hergestellt und im Hinblick auf die Veränderungen der Bewegungssignale der magnetischen Teilchen während. der Zeit mittels einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung (CG01, bezogen von A&T Corp.) verglichen. Die zwei durch verschiedene Verfahren hergestellen Trockenreagentien waren ein Trockenreagens, das durch Gefriertrocknen nach Einfrieren erhalten wurden (nachfolgend als "gefriergetrocknetes Reagens" abgekürzt) und ein Trockenreagens, das durch Lufttrocknung erhalten wurde (nachfolgend als "luftgetrocknetes Reagens" abgekürzt).

Herstellung des gefriergetrockneten Reagens

Das gefriergetrocknete Reagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der Herstellung des Natriumglutamatreagens im Beispiel 1 hergestellt.

Herstellung des luftgetrockneten Reagens

Die gleiche Endlösung, wie sie bei der Herstellung des Natriumglutamatreagens im Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde hergestellt, und auf dem gleichen Reagensträger, wie er in Figur 1 dargestellt ist, aufgebracht. Der resultierende Reagensträger wurde im Vakuum bei 30 ºC 12 Stunden lang luftgetrocknet, und ein luftgetrocknetes Reagens erhalten.

Vergleich der Veränderungen des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen während der Zeit

Plasma, das 200 mg/dl Fibrinogen enthielt, wurde mit OWREN's Pufferlösung (bezogen von Sigma Chemical Company) auf das 20- fache verdünnt. Dann wurden die obigen Trockenreagentien (I) in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 gegeben, und 25 ul der obigen verdünnten Lösung zugegeben. Dann wurde das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen für jedes Reagens optisch überwacht.
Die Figur 5 zeigt die Veränderungen der Bewegungssignale der magnetischen Teilchen während der Zeit nach Zugabe der verdünnten Lösung.
In Figur 5 bedeutet A das Diagramm aus dem gefriergetrockneten Reagens, und B bedeutet das Diagramm aus dem luftgetrockneten Reagens. Wenn das luftgetrocknete Reagens verwendet wurde, war das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen gering. Wenn das gefriergetrocknete Reagens verwendet wurde, war das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen ausreichend hoch, und zeigte eine gute Reproduzierbarkeit.

Beispiel 4: Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit

Das gleiche im Beispiel 3 hergestellte gefriergetrocknete Reagens (I) wurde in einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 (bezogen von A&T Corp.) auf die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration getestet.
Die Endpunktbestimmung und die Bestimmung der Koagulationszeit wurden auf die gleiche Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt. Die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration wurde wie folgt bestimmt. Zuerst wurde eine Serie von Verdünnungen menschlicher Plasmaproben mit Fibrinogenkonzentrationen von 50 bis 800 mg/dl aus menschlichem Plasma, das 800 mg/dl Fibrinogen enthielt, und aus menschlichem Plasma mit Fibrinogenmangel(bezogen von George King Bio-Medical Inc.) hergestellt. Dann wurde eine Serie dieser verdünnten Lösungen mit OWREN's Pufferlösung auf das 20-fache verdünnt. Das obige gefriergetrocknete Reagens wurde in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 gegeben, und 25 ul einer der obigen verdünnten Lösungen zugegeben, um die Koagulationszeit der verdünnten Lösung auf die gleiche Weise wie im Beispiel 2 zu bestimmen. Auf diese Weise wurden die Koagulationszeiten aller verdünnten Lösungen bestimmt. Die so erhaltenen Daten wurden in einem logarithmischen Diagramm mit X-Y-Achsen aufgetragen, in der die X-Achse die Fibrinogenkonzentration und die Y-Achse die Koagulationszeit anzeigt. Die Korrelation wurde auf der Basis der Linearität des aufgezeichneten Diagrammes bestimmt.
Die Figur 6 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit. Aus der Figur 6 ist klar ersichtlich, daß die Fibrinogenkonzentration und die Koagulationszeit ein lineares Verhältnis und Korrelation zeigen. Das Ergebnis in Figur 6 zeigt außerdem, daß Fibrinogen im gesamten Konzentrationsbereich von 50 bis 800 mg/dl bei einer 20-fachen Verdünnung bestimmt werden kann.
Wenn die obigen Plasmaproben auf das 10-fache verdünnt wurden und ihre Koagulationszeit gemessen wurde, und wenn die obigen Plasmaproben auf das 40-fache verdünnt wurden, und ihre Koagulationszeit gemessen wurde, so zeigen in beiden Fällen die resultierende Koagulationszeit und die Fibrinogenkonzentrationen im Plasma ein lineares Verhältnis, obwohl der Bestimmungsbereich verschieden ist.

Beispiel 5: Korrelation zwischen dem Flüssigreagens-Verfahren und dem Trockenreagens-Verfahren

Es wurden die Ergebnisse von Fibrinogenbestimmungen von 41 menschlichen Plasmaproben mittels einer konventionellen Methode unter Verwendung eines flüssigen Reagens und die Ergebnisse der Fibrinogenbestimmung von 41 menschlichen Plasmaproben unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (1) verglichen.
In der Fibrinogenbestimmung nach der konventionellen Methode unter Verwendung eines flüssigen Reagens wurde Data-Fi- Fibrinogen (bezogen von International Reagents Corp.) mit einer Meßvorrichtung KC-10A (bezogen von Amelung GmbH, Lemgo) gemäß den dem Data-Fi-Fibrinogen beigefügten Instruktionen getestet.
In der Fibrinogenbestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Trockenreagens (I) wurde das gleiche im Beispiel 3 hergestellte gefriergetrocknete Reagens mit einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 (bezogen von A&T Corp.) getestet. Die Endpunktbestimmung und die Koagulationszeitbestimmung wurden auf die gleiche Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt. Menschliches Plasma wurde mit einer OWREN's Pufferlösung (bezogen von Sigma Chemical Company) auf das 20-fache verdünnt. Dann wurde das obige gefriergetrocknete Reagens in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 gegeben, und 25 ul der obigen verdünnten Lösung zugegeben, um die Koagulationszeit zu bestimmen. Die Fibrinogenkonzentration im Plasma wurde bestimmt auf der Basis der erhaltenen Koagulationszeit, wobei als Eichkurve das in Figur 6 dargestellte Diagramm, auf das im Beispiel 4 bezuggenommen wurde, verwendet wurde.
Die Figur 7 zeigt die Korrelation zwischen den mittels der konventionellen Methode erhaltenen Fibrinogenwerten unter Verwendung des flüssigen Reagens und den mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Fibrinogenwerten.
Aus der Figur 7 ist klar ersichtlich, daß die mittels des konventionellen Verfahrens unter Verwendung des flüssigen Reagens erhaltenen Fibrinogenwerte und die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Fibrinogenwerte stark übereinstimmen.

Beispiel 6: Korrelation zwischen der Koagulationszeit mittels Trockenreagens (II) und der Fibrinogenkonzentration

Das mit einer KC-10A-Vorrichtung (bezogen von Amelung GmbH, Lemgo) verwendete Trockenreagens (II) wurde wie folgt hergestellt.
Zu Rinderthrombinreagens (bezogen von International Reagents Corp.) wurde reines Wasser zugegeben, um 100 U/ml einer wässerigen Thrombinlösung herzustellen. Diese wässerige Thrombinlösung und 30 mM HEPES-Pufferlösung (bezogen von Dojindo Laboratories, pH = 7,35), die 3,0 % Natrium L- Glutamatmonohydrat enthielt (bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden in einem Volumenverhältnis von 1:2 gemischt, um eine Endlösung für das Trockenreagens (II) herzustellen. Die Endlösung (300 ul) wurde in ein Reaktionsgefäß (bezogen von Amelung GmbH, Lemgo) gegeben. Das Reaktionsgefäß wurde sofort mit flüssigem Stickstoff eingefroren und dann gefriergetrocknet, um das Trockenreagens (II) für die Fibrinogenbestimmung zu erhalten. Die obige Gefriertrocknung wurde durchgeführt, indem man im Vakuum die Temperatur linear von -30 ºC auf 20 ºC während 8 Stunden erhöhte.
Das obige Trockenreagens (II) wurde in eine KC-10A- Vorrichtung gegeben, und dann eine Stahlkugel (bezogen von Amelung GmbH, Lemgo) darin angebracht. Dann wurden 300 ul einer Probe zugegeben, und die Zeit von der Zugabe der Probe bis zur Zeit, bei der die Stahlkugel sich zu bewegen begann, wurde als Koagulationszeit gemessen.
Die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration wurde wie folgt bestimmt. Die gleichen 6 menschlichen Plasmaproben mit Fibrinogenkonzentrationen von 200, 300, 400, 500, 600 und 700 mg/dl, wie sie im Beispiel 4 hergestellt wurden, wurden mit OWREN's Pufferlösung (bezogen von Sigma Chemical Company) auf das 20-fache verdünnt. Diese verdünnten Lösungen wurden als Proben verwendet, und die Koagulationszeit jeder verdünnten Lösung mittels der obigen Methode bestimmt. Die so erhaltenen Daten wurden in einem logarithmischen X-Y- Achsendiagramm aufgetragen, wobei die X-Achse die Fibrinogenkonzentration und die Y-Achse die Koagulationszeit anzeigt. Die Korrelation wurde auf der Basis des gezeichneten Diagrammes bestimmt.
Die Figur 8 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit. Die Figur 8 zeigt deutlich, daß die Fibrinogenkonzentration und die Koagulationszeit ein lineares Verhältnis zeigen, und deshalb übereinstimmen. Wenn deshalb das erfindungsgemäße Trockenreagens (II) verwendet wird, kann das Fibrinogen mit einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung, wie sie mit einem flüssigen Reagens verwendet wird, ohne komplizierte Vorbehandlungen, wie z.B. einem Vorerhitzen, bestimmt werden.

Beispiel 7: Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentratoin im Plasma und der Koagulationszeit, wenn Schlangengiftprotein und menschliches Thrombin als Protein mit Thrombinaktivität verwendet werden.

Zwei Trockenreagentien (I) für die Fibrinogenbestimmung wurden wie folgt hergestellt.

Herstellung des Schlangengiftproteinreagens

Das Schlangengiftproteinreagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der Herstellung des Natriumglutamatreagens im Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Rinderthrombinreagens durch ein gefriergetrocknetes Protein eines Schlangengiftproteins mit Thrombin-ähnlicher Wirkung (Crotalase, bezogen von Sigma Chemical Company) ersetzt wurde, und daß das Gefriertrocknen durchgeführt wurde, indem die Temperatur im Vakuum linear von -30 bis 30 ºC während 13 Stunden erhöht wurde.

Herstellung des menschlichen Thrombinreagens

Das menschliche Thrombinreagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der vorstehenden Herstellung des Schlangengiftreagens hergestellt, mit der Ausnahme, daß das gefriergetrocknete Produkt des Schlangengiftproteins durch ein gefriergetrocknetes Produkt von menschlichem Thrombin (bezogen von Sigma Chemical Company) ersetzt wurde.

Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration

Als Fibrinogenbestimmungsvorrichtung wurde CG01 (bezogen von A&T Corp.) verwendet.
Die obigen zwei Trockenreagentien (I) wurden mit einer Blutkoagulationmeßvorrichtung CG01 auf die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration getestet.
Die Endpunktbestimmung und die Bestimmung der Koagulationszeit wurden wie folgt durchgeführt. Bei Verwendung des Schlangengiftproteins wurde ein Punkt, bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen gegenüber dem Peakwert um 10 % abgeschwächt war, in Figur 4-A als Endpunkt festgesetzt, und die Zeit von der Zugabe einer Probe bis zum Endpunkt wurde als Koagulationszeit genommen. D.h., C in Figur 4-A zeigt den Endpunkt an, und D in Figur 4-A zeigt die Koagulationszeit an. Der obige Endpunkt enspricht einem Punkt, bei dem die Viskosität auf das 100/90 (ca. 1.11)-fache des Minimalwertes der Viskosität ansteigt.
Unter Verwendung des menschlichen Thrombinreagens wurde ein Punkt, wo das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen gegenüber dem Peakwert um 30 % abgeschwächt war, in Figur 4-A als Endpunkt festgesetzt, und die Zeit von der Zugabe der Probe bis zum Endpunkt wurde als Koagulationszeit genommen. D.h., A in Figur 4-A zeigt den Endpunkt an und B in Figur 4-A zeigt die Koagulationszeit an. Der obige Endpunkt entspricht einem Punkt, bei dem die Viskosität auf das 100/70 (ca. 1,43)-fache des Minimalwertes der Viskosität ansteigt.
Die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration wurde wie folgt bestimmt. Eine Serie von fünf Verdünnungslösungen menschlicher Plasmaproben mit Fibrinogenkonzentrationen von 123, 184,5, 246, 369 und 492 mg/dl wurden aus menschlichem Plasma, das 900 mg/dl Fibrinogen enthielt, und von menschlichem Plasma mit einem Fibrinogenmangel (bezogen von George King Bio-Medical, Inc.) hergestellt. Dann wurde eine Serie dieser Verdünnungslösungen mit OWREN's Pufferlösung auf das 15-fache verdünnt. Das obige gefriergetrocknete Reagens wurde in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 gegeben, und 25 ul einer der obigen verdünnten Lösungen zugegeben, um die Koagulationszeit der verdünnten Lösung mittels der obigen Methode zu bestimmen. Auf diese Weise wurde die Koagulationszeit aller verdünnten Lösungen bestimmt. Die so erhaltenen Daten wurden aufgezeichnet, um ein logarithmisches X-Y-Achsen-Diagramm zu ergeben, in dem die X-Achse die Fibrinogenkonzentration anzeigt und die Y-Achse die Koagulationszeit. Die Korrelation wurde auf der Basis der Linearität des aufgezeichneten Diagrammes bestimmt, auf dessen Basis die Möglichkeit der Fibrinogenbestimmung bestimmt wurde. Jede der aufgezeichneten Koagulationszeitwerte war ein aus 5 Messungen erhaltener Mittelwert.
Figur 9 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit unter Verwendung des Schlangengiftproteinreagens. Die Figur 10 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit, wenn menschliches Thrombinreagens verwendet wurde. Die Figuren 9 und 10 zeigen deutlich, daß die Fibrinogenkonzentration und die Koagulationszeit ein lineares Verhältnis zeigen, und eine sehr gute Übereinstimmung besitzen.
D.h., es wurde gefunden, daß die obigen beiden Reagentien zur Bestimmung von Fibrinogen brauchbar sind.

Beispiel 8: Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration im Plasma und der Koagulationszeit unter Verwendung von Saccharid als Additiv

Saccharide, wie z.B. Glucose, Fructose und Sucrose, wurden ausgewählt, und drei Trockenreagentien (I), die diese Saccharide enthielten, wurden wie folgt hergestellt.

Herstellung des Sucrosereagens

Ein Glucosereagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der Herstellung des Glucosereagens im Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß der Glucosegehalt in der Pufferlösung von 1,5 % (Gew/Vol) auf 3,0 % (Gew/Vol) geändert wurde, und die Gefriertrocknung durch lineare Erhöhung der Temperatur von - 30 ºC bis 30 ºC im Vakuum während 13 Stunden durchgeführt wurde.

Herstellung des Fructosereagens

Das Fructosereagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der obigen Herstellung des Glucosereagens durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Glucose durch Fructose (bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ersetzt wurde.

Herstellung des Sucrosereagens

Das Sucrosereagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der obigen Herstellung des Glucosereagens hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Glucose durch Sucrose (bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ersetzt wurde.

Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration

Die obigen Reagentien wurden auf die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration auf die gleiche Weise wie im Beispiel 7 untersucht.
Der Endpunkt der Koagulationszeit jedes Reagens wurde wie folgt bestimmt. Unter Verwendung des Sucrosereagens wurde ein Punkt, bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen vom Peakwert um 10 % abgeschwächt war, in Figur 4-A (die Viskosität erhöhte sich auf 100/90-fache des Minimalwertes der Viskosität) als Endpunkt festgesetzt. Unter Verwendung des Glucosereagens und das Fructosereagens wurde ein Punkt, bei dem das Bewegungssignal der Magnetteilchen vom Peakwert um 30 % abgeschwächt war, in Figur 4-A (die Viskosität erhöhte sich auf das 100/70-fache des Minimalwertes der Viskosität) als Endpunkt festgesetzt.
Die Figur 11 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit unter Verwendung des Sucrosereagens. Die Figur 12 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit unter Verwendung des Fructosereagens. Die Figur 13 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit unter Verwendung des Fructosereagens. Wie die Figuren 11 bis 13 zeigen, zeigt die Fibrinogenkonzentration und die Koagulationszeit ein lineares Verhältnis, und besitzen eine sehr gute Übereinstimmung, obwohl die Empfindlichkeit im Vergleich zu einem Aminosäurereagens (Glycinreagens, Lysinreagens, Natriumaspartatreagens, Natriumglutamatreagens, Beispiel 1 und Beispiel 9) gering ist.
D.h., es wurde gefunden, daß die obigen zwei Reagentien für eine Fibrinogenbestimmung brauchbar sind.

Beispiel 9: Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration im Plasma und der Koagulationszeit unter Verwendung von Aminosäure als Additiv

L-Glycin als neutrale Aminosäure, L-Lysinhydrochlorid als basische Aminosäure und Natrium L-Aspartat als Salz einer sauren Aminosäure wurden ausgewählt. Drei Trockenreagentien (I), die diese Aminosäuren enthielten, wurden wie folgt hergestellt.

Herstellung des Glycinreagens

Das Glycinreagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der Herstellung des Natriumglutamatreagens im Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Natriumglutamat durch Glycin (bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ersetzt wurde und die Gefriertrocknung durch lineare Erhöhung der Temperatur von -30ºC bis 30 ºC im Vakuum während 13 Stunden durchgeführt wurde.

Herstellung des Lysinreagens

Das Lysinreagens wurde auf die gleiche Weise wie die vorstehende Herstellung des Glycinreagens durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Glycin durch L-Lysinhydrochlorid (bezogen von Wako Pure Chemical Ltd.) ersetzt wurde.

Herstellung des Natriumaspartatreagens

Das Natriumaspartatreagens wurde auf die gleiche Weise wie bei der obigen Herstellung des Glycinreagens durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Glycin durch Natrium L-Aspartat (bezogen von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ersetzt wurde.
Die obigen Reagentien wurden auf ihre Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration auf die gleiche Weise wie im Beispiel 7 untersucht.
Der Endpunkt der Koagulationszeit jedes Reagens wurde wie folgt bestimmt. Unter Verwendung des Lysinreagens wurde ein Punkt, bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen vom Peakwert um 10 % abgeschwächt war, in Figur 4-A (die Viskosität erhöhte sich auf das 100/90-fache des Minimalwertes der Viskosität) als Endpunkt festgesetzt. Unter Verwendung des Glycinreagens und des Natriumaspartatreagens wurde ein Punkt, bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen vom Peakwert um 30 % abgeschwächt war, in Figur 4-A (die Viskosität erhöhte sich auf das 100/70-fache des Minimalwertes der Viskosität) als Endpunkt festgesetzt.
Die Figur 14 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit unter Verwendung des Lysinreagens. Die Figur 15 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit unter Verwendung des Glycinreagens. Die Figur 16 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit unter Verwendung des Natriumaspartatreagens. Wie die Figuren 14 bis 16 zeigen, zeigt die Fibrinogenkonzentration und die
Koagulationszeit ein lineares Verhältnis, und sie besitzen eine sehr gute Übereinstimmung.
D.h., es wurde gefunden, daß die obigen drei Reagentien zur Fibrinogenbestimmung geeignet sind.
Beispiel 10: Vergleich von Reagentien, die Aminosäuren als Additiv enthalten, im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit.
Plasma, das 246 mg/dl Fibrinogen enthielt, wurde mit OWREN's Pufferlösung auf das 15-fache verdünnt, und die resultierende verdünnte Lösung wurde zu einer Vielzahl von Aminosäurenreagentien zugegeben, um die Koagulationszeit jedes Reagens zu bestimmen. Die Verfahren wurden für jedes Reagens fünfmal wiederholt, und die Werte der Variationskoeffizienten (CV-Werte) wurden berechnet.
Die obigen Aminosäurereagentien waren die gleichen wie die in den nachfolgend angegebenen Beispielen hergestellten.
Natriumglutamatreagens: Beispiel 1
Natriumaspartatreagens: Beispiel 9
Glycinreagens: Beispiel 9
Lysinreagens: Beispiel 9
Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Aus Tabelle 2 ist klar ersichtlich, daß die Reproduzierbarkeit der gemessenen Werte unter Verwendung von saurer Aminosäure denen unter Verwendung anderer Aminosäuren deutlich überlegen ist. Tabelle 2

Beispiel 11: Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit, wenn der Endpunkt verändert wird.

Das gleiche Natriumglutamatreagens, das im Beispiel 1 verwendet wurde, wurde als Trockenreagens (I) verwendet und mit einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 (bezogen von A&T Corp.) auf die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration in einer Probe und der Koagulationszeit getestet, bei Festsetzung der Endpunkte unter Veränderung des Abschwächungsverhältnisses des
Bewegungssignals der magnetischen Teilchen gegenüber dem Peakwert.
Die Endpunkte wurden festgesetzt, wenn das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen vom Peakwert um 10 %, 20 %, 30 % und 40 % abgeschwächt war, und die Zeit von der Zugabe der Probe bis zum Endpunkt wurde als Koagulationszeit genommen. Diese Endpunkte entsprechen den Punkten, bei denen die Viskosität auf das 100/90 (ca. 1,1)-fache, 100/80 (1,25)- fache, 100/70 (ca. 1,43)-fache und 100/60 (ca. 1,67)-fache des Minimalwertes der Viskosität ansteigt.
Die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit wurde wie folgt bestimmt. Eine Serie von Verdünnungslösungen menschlicher Plasmaproben mit Fibrinogenkonzentrationen von 100 bis 600 mg/dl wurden aus menschlichem Plasma, das 600 mg/dl Fibrinogen enthielt, und aus menschlichem Plasma mit einem Fibrinogenmangel (bezogen von George King Bio-Medical, Inc.) hergestellt. Dann wurde eine Serie dieser Verdünnungslösungen mit OWREN-Pufferlösung auf das 20-fache verdünnt. Das obige gefriergetrocknete Reagens wurde in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 gegeben, und 25 ml einer der obigen verdünnten Lösungen wurde zugegeben, um die Koagulationszeit der verdünnten Lösung mittels der obigen Methode zu bestimmen. Auf diese Weise wurden die Koagulationszeiten aller verdünnten Lösungen bestimmt. Die so erhaltenen Daten wurden aufgezeichnet und ein logarithmisches X-Y-Achsen-Diagramm gezeichnet, indem die X-Achse die Fibrinogenkonzentration anzeigt und die Y-Achse die Koagulationszeit. Die Korrelation wurde auf der Basis der Linearität des gezeichneten Diagrammes bestimmt.
Die Figur 17 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit. In Figur 17 zeigt A ein Diagramm, das die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration angibt, wenn das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen gegenüber seinem Peakwert um 10 % abgeschwächt war, B zeigt das gleiche Diagramm, bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen gegenüber dem Peakwert um 20 % abgeschwächt war, C zeigt ein Diagramm der gleichen Art, bei der das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen gegenüber seinem Peakwert um 30 % abgeschwächt ist, und D zeigt ein Diagramm der gleichen Art, bei dem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von seinem Peakwert um 40 % abgeschwächt ist.
Wie die Figur 17 zeigt, stimmen die Koagulationszeit und die Fibrinogenkonzentration in einer Probe gut miteinander überein, wenn der Endpunkt festgesetzt wird, indem man das Abschwächungsverhältnis gegenüber dem Peakwert des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen innerhalb des in der vorliegenden Erfindung definierten Viskositätsänderungsbereiches ändert.

Vergleichsbeispiel 5: Korrelation zwischen einer konventionellen Methode der negativen Neigung und der Fibrinogenkonzentration.

Das gleiche Natriumglutamatreagens, das im Beispiel 1 verwendet wurde, wurde als Trockenreagens (I) verwendet und in einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 (bezogen von A&T Corp.) auf die Korrelation zwischen der negativen Neigung und der Fibrinogenkonzentratoin getestet.
Die negative Neigung wurde wie folgt gemessen. Zuerst wurde der Peakwert des Bewegungssignals aufgezeichnet (A in Figur 18). Dann wurde der Wert der Signalintensität zur Zeit, bei der 5 Sekunden verstrichen waren, seit das Bewegungssignal den Peakwert erreicht hatte, aufgezeichnet (F in Figur 18), und die Größ der Änderung des Bewegungssignals pro Sekunde wurde als negative Neigung auf der Basis der beiden obigen Bewegungssignalwerte berechnet. D.h., der Bereich zur Messung der negativen Neigung in diesem Vergleichsbeispiel umfaßte den Zeitraum von 5 Sekunden nachdem das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen den Peak erreichte. Unter Verwendung der Symbole in Figur 18 wird die negative Neigung ausgedrückt als (A-B)/5[Zählungen/Sek].
Die Korrelation zwischen der negativen Neigung und der Fibrinogenkonzentration wurde wie folgt untersucht. Eine Serie von Verdünnungslösungen menschlicher Plasmaproben mit Fibrinogenkonzentrationen von 50 bis 800 mg/dl wurden aus menschlichem Plasma, das 800 mg/dl Fibrinogen enthielt, und aus menschlichem Plasma mit einem Fibrinogenmangel (bezogen von George King Bio-Medical, Inc.) hergestellt. Dann wurde eine Serie dieser Verdünnungslösungen mit einer OWREN- Pufferlösung auf das 20-fache verdünnt. Das obige gefriergetrocknete Reagens wurde in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 eingebracht, und 25 ul einer der obigen verdünnten Lösungen wurde zugegeben, um die Koagulationszeit der verdünnten Lösung nach der obigen Methode zu bestimmen. Auf diese Weise wurden die Koagulationszeiten aller verdünnen Lösungen bestimmt. Die so erhaltenen Daten wurden aufgetragen und ein Diagramm gezeichnet, in dem die X-Achse die Fibrinogenkonzentration und die Y-Achse die Größe der negativen Neigung anzeigt. Die
Korrelation wurde auf der Basis der Linearität des gezeichneten Diagrammes bestimmt.
Figur 19 zeigt die Korrelation zwischen dem Fibrinogen in der Probe und der negativen Neigung. Wie die Figur 19 zeigt, wird, wenn die Fibrinogenkonzentration in der Probe ansteigt, die negative Neigung größer, während eine solche Linearität, wie sie in den Beispielen 4 und 12 gezeigt wurde, nicht erhalten wurde. Es wurde deshalb festgestellt, daß es wirklich schwierig ist, die Fibrinogenkonzentration in einer Probe unter Verwendung der negativen Neigung des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen zu bestimmen.

Vergleichsbeispiel 6: Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulation bei Veränderung des Endpunktes.

Das gleiche Natriumglutamatreagens, das im Beispiel 1 verwendet wurde, wurde als Trockenreagens (I) verwendet und mit einer Fibrinogenbestimmungsvorrichtung CG01 (bezogen von A&T Corp.) auf die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration in einer Probe und der Koagulationszeit getestet, wobei der Endpunkt festgesetzt wurde, wenn das Abschwächungsverhältnis gegenüber dem Peakwert des Bewegungssignals der magnetischen Teilchen außerhalb des in der vorliegenden Erfindung bestimmten Viskositätsveränderungsbereiches lag.
Die Endpunkte wurden an Punkten festgesetzt, bei denen das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von ihrem Peakwert um 3 %, 30 % und 60 % abgeschwächt war, und die Zeit von der Zugabe der Probe zu jedem Endpunkt wurde als Koagulationszeit genommen. Diese Punkte entsprechen Punkten, bei denen die Viskosität auf das 100/97 (ca. 1,03)-fache, 100/70 (ca. 1,43)-fache und 100/40 (ca. 2,5)-fache des Minimalwertes der Viskosität anstieg.
Die Korrelation zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration wurde wie folgt bestimmt. Eine Serie von sieben Verdünnungslösungen von menschlichen Plasmaproben mit Fibrinogenkonzentrationen von 50, 90, 100, 200, 400, 600 und 800 mg/dl wurde aus menschlichem Plasma, das 800 mg/dl Fibrinogen enthielt, und aus menschlichem Plasma mit einem Fibrinogenmangel (bezogen von George King Bio-Medical Inc.) hergestellt. Dann wurde eine Serie dieser Verdünnungslösungen mit OWREN's-Pufferlösung auf das 20-fache verdünnt. Das obige gefriergetrocknete Reagens wurde in eine Fibrinogenbestimmungsvorrichtung eingebracht, und 25 ul einer der obigen verdünnten Lösungen zugegeben, um die Koagulationszeit der verdünnten Lösung mittels der obigen Methode zu bestimmen. Auf diese Weise wurden die Koagulationszeiten aller verdünnten Lösungen bestimmt. Die so erhaltenen Daten wurden aufgetragen und ein Diagramm in einem logarithmischen X-Y-Maßstab gezeichnet, wobei die X-Achse die Fibrinogenkonzentration anzeigt und die Y-Achse die Werte der Koagulationszeit (Durchschnitt aus drei Meßdaten). Die Korrelation wurde auf der Basis der Linearität des gezeichneten Diagrammes bestimmt. Die Figur 20 zeigt die Korrelation zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Koagulationszeit. In Figur 20 zeigt A ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Koagulationszeit und der Fibrinogenkonzentration darstellt, wenn das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von seinem Peakwert um 3 % abgeschwächt war, B zeigt ein Diagramm mit der gleichen Bedeutung, bei der das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von seinem Peakwert um 30 % abgeschwächt war, und C zeigt ein Diagramm der gleichen Bedeutung, bei der das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von seinem Peakwert um das 60-fache abgeschwächt war. In jedem Diagramm bedeutet jeder "." einen Durchschnittswert, der durch dreimaliges Messen der Koagulationszeit erhalten wurde, und die Länge jeder vertikalen Linie ("I") zeigt die Abweichungsbreite von drei Meßwerten.
Die Figur 20 zeigt, daß, wenn der Endpunkt festgesetzt wird, wenn das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von seinem Peakwert um 3 % abgeschwächt ist, ein Mangel besteht, weil die Fibrinogenbestimmung aufgrund der geringen Empfindlichkeit und schlechten Reproduzierbarkeit nicht genau durchgeführt werden kann. Gleichermaßen zeigt die Figur 20, daß, wenn der Endpunkt festgesetzt wird, wenn das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von seinem Peakwert um 60 % abgeschwächt ist, die Empfindlichkeit hoch ist, aber insofern ein Mangel vorhanden ist, als der Bestimmungsbereich eng ist, weil kein Endpunkt für Plasma mit einer Fibrinogenkonzentration von weniger als 200 mg/dl bestimmt werden kann, und deshalb die Koagulationszeit nicht bestimmt werden kann.
Die Figur 20 zeigt deutlich, daß, wenn der Endpunkt festgesetzt wird, wenn das Bewegungssignal der magnetischen Teilchen von seinem Peakwert um 30 % abgeschwächt ist, die Empfindlichkeit hoch ist, der Bestimmungsbereich breit ist, und die Reproduzierbarkeit hervorragend ist.

Beispiel 12

Jeder der folgenden verdünnten Plasmaproben (25 ul) mit einer Fibrinogenkonzentration von 50 bis 800 mg/dl wurde zum gleichen Natriumglutamatreagens, wie es im Beispiel 1 hergestellt wurde, zugefügt, und von der Mischung wurden mit einer Meßvorrichtung CG01 (bezogen von A&T Corp.) die Signale gemessen.
Die verdünnten Plasmaproben wurden wie folgt hergestellt. Eine hochkonzentrierte Fibrinogenlösung (FIBI, bezogen von Enzyme Research Laboratories, Inc.) und normales Plasma (bezogen von George King Bio-Medical Inc.) wurden gemischt, um ein Plasma herzustellen, das eine Fibrinogenkonzentration von 1100 mg/dl besitzt. Das so erhaltene Plasma und ein Plasma mit einem Fibrinogenmangel wurden gemischt, um 8 Arten von Plasmaproben mit Fibrinogenkonzentrationen von 800, 600, 400, 300, 200, 150, 100 und 50 mg/dl herzustellen. Jedes Plasma wurde mit OWREN's-Pufferlösung (bezogen von Sigma Chemical Company) auf das 20-fache verdünnt, um unverdünnte Plasmalösungen zu erhalten.
Die mittels der obigen Messung erhaltenen Signalwellenformen wurden in logarithmische Signalwellenformen konvertiert, und die Zeiträume (manchmal nachfolgend als "pt" abgekürzt) von der Zugabe der Probe bis zu einer Zeit, bei der das Reaktionssystem eine minimale Viskosität zeigte, wurden bestimmt. Die logarithmischen Wellenformen wurden auf lineare Bereiche hin untersucht, von denen angenommen wurde, daß sie die Fibrinogenkonzentrationen wiedergeben, und die pt's wurden so klassifiziert, daß die Bestimmungsbereiche in den obigen Bereichen enthalten waren. Die Bestimmungsbereiche wurden wie in Tabelle 3 angegeben bestimmt. Die Viskositätssteigerungsrate jedes Bestimmungsbereichs wurde berechnet. Tabelle 3
Die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich bezieht sich auf einen Wert, der erhalten wurde durch Teilen der veränderten Größe der logarithmischen Werte der Signalintensität vom Startpunkt des Bestimmungsbereiches bis zu seinem Endpunkt während eines Zeitraums (Sekunden) vom Startpunkt bis zum Endpunkt, und ist das Veränderungsverhältnis pro Zeiteinheit im Bestimmungsbereich.
Dann wurde die Beziehung zwischen der Viskositätssteigerungsrate und der Fibrinogenkonzentration im Bestimmungsbereich untersucht. Figur 21 zeigt die Ergebnisse, wobei die Abszisse die Fibrinogenkonzentration und die Ordinate die Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich zeigt. In der Figur 21 bedeutet jeder Punkt den Durchschnitt von fünf Messungen. Die Figur 21 zeigt, daß acht Arten der verdünnten Plasmaproben ein lineares Verhältnis zwischen der Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich und der Fibrinogenkonzentration zeigten. Der Korrelationskoeffizient dieser Linearität war 0,99978, und es wurde eine hervorragende Linearität erhalten. Wie vorstehend beschrieben, wurde in einem Konzentrationsbereich von 50 bis 800 mg/dl eine Eichkurve erhalten, die das Verhältnis zwischen der Viskositätssteigerungsrate im Bestimmungsbereich und dem Fibrinogengehalt zeigt.

Beispiel 13

20 menschliche Plasmaproben wurden auf die gleiche Weise wie im Beispiel 12 verdünnt und zu den gleichen Natriumglutamatreagentien, wie sie im Beispiel 1 hergestellt wurden, zugegeben. Die resultierenden Reaktionssysteme wurden auf ihre Pt's gemessen. Dann wurden die resultierenden Reaktionssysteme auf ihre Viskositätssteigerungsraten in den Bestimmungsbereichen, entsprechend den Pt's, auf die gleiche Weise wie im Beispiel 12 gemessen. Die so erhaltenen Viskositätssteigerungsraten der obigen Proben wurden auf der Basis der im Beispiel 12 hergestellten Eichkurve in die Fibrinogenkonzentrationen konvertiert.
Die gleichen Proben wie sie vorstehend verwendet wurden, wurden mittels einer konventionellen Bestimmungsmethode unter Verwendung eines flüssigen Reagens auf ihre Fibrinogenwerte gemessen, um die Korrelation zu den vorstehend erhaltenen Fibrinogenwerten zu untersuchen. Die Fibrinogenbestimmung unter Verwendung eines flüssigen Reagens wurde wie folgt durchgeführt. Das Reagens war Data-Fi.Fibrinogen (bezogen von International Reagents Corp.), und Mischungen der Proben mit diesem Reagens wurden mit einer Meßvorrichtung KC-10A (bezogen von Amelung GmbH, Lemgo) gemäß den dem Data- Fi.Fibrinogen beigegeben Instruktionen gemessen.
Die Figur 22 zeigt die Ergebnisse, wobei die Abszisse die mittels der konventionellen Methode erhaltenen Fibrinogenkonzentrationen angibt, und die Ordinate die erfindungsgemäß erhaltenen Fibrinogenkonzentrationen anzeigt. Auf der Basis der Ergebnisse war der Korrelationskoeffizient 0,98966, und die erfindungsgemäß erhaltenen Ergebnisse stimmten gut mit denen durch die konventionelle Methode erhaltenen überein.

Claims

1. Trockenreagens (II) zur Fibrinogenbestimmung umfassend:

(a) ein Protein mit Thrombinaktivität; und

(b) mindestens einen Bestandteil bestehend aus einer Aminosäure, einem Salz davon oder einem Saccharid.

2. Reagens (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem umfaßt:

(c) magnetische Teilchen.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (a) Rinderthrombin, menschliches Thrombin oder ein Schlangengiftprotein mit Thrombinaktivität ist.

4. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (b) eine Aminosäure oder ein Salz davon ist.

5. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (b) eine α-Aminosäure oder ein Salz davon ist.

6. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (b) eine saure Aminosäure oder ein Salz davon ist.

7. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (b) Glutaminsäure, Natriumglutamat, Asparaginsäure oder Natriumaspartat ist.

8. Reagens nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Saccharid Glucose, Fructose oder Succrose ist.

9. Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (c) Eisen(III,II)- oxid-Teilchen darstellt.

10. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens für 300 ul einer verdünnten Probe für eine Messung umfaßt:

(a) 5 bis 15 NIHU, als Thrombinmenge, der Komponente (a) und

(b) 0,2 bis 10 mg der Komponente (b).

11. Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens für 25 ul einer verdünnten Probe für eine Messung umfaßt:

(a) 0,5 bis 1,5 NIHU, als Thrombinmenge, der Komponente (a),

(b) 0,02 bis 1 mg der Komponente (b), und

(c) 2 x 10&supmin;&sup6; bis 2 x 10&supmin;&sup4; g der Komponente (c).

12. Reagensträger zur Fibrinogenbestimmung, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Form eines Filmes umfaßt.

13. Verfahren zur Herstellung eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt das Gefriertrocknen einer flüssigen Mischung, die im wesentlichen besteht aus:

(a) einem Protein mit Thrombinaktivität;

(b) mindestens einem Bestandteil ausgewählt aus einer Aminosäure, einem Salz davon oder einem Saccharid; und

(d) einem Medium auf Wasserbasis.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Mischung außerdem (c) Magnetteilchen umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente (d) eine Pufferlösung ist.

16. Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen umfaßt:

(1) In-Kontakt-Bringen eines Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und einer zu bestimmenden Probe,

(2) Überwachen der Viskosität des Trockenreagens bis zu einem Endpunkt, der willkürlich bei einem Punkt angenommen wird, bei dem die Viskosität des Trockenreagens auf das 20/19- bis 3-fache des Minimalwertes der Viskosität ansteigt,

(3) Messen der Koagulationszeit, die vom In-Kontakt-Bringen des Trockenreagens und der zu bestimmenden Probe bis zum Endpunkt verstrichen ist, und

(4) Bestimmen des aktiven Fibrinogengehaltes in der Probe auf der Basis der Koagulationszeit.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Endpunkt an einem Punkt festgelegt wird, bei dem die Viskosität des Trockenreagens auf das 10/17- bis 2-fache des Minimalwertes seiner Viskosität ansteigt.

18. Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen auf der Basis einer Viskositätsänderung während der Zeit, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

(i) vorhergehendes Zugeben von Proben mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen zu einem Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, nachfolgendes Bestimmen der anfänglichen Viskositätssteigerungsraten, beginnend mit der Zeit, bei der jede Reaktionsmischung einen minimalen Viskositätswert besitzt, bis zu einer vorgegebenen Zeit, und Feststellen der Bestimmungsbereiche, die den anfänglichen Viskositätssteigerungsraten entsprechen, wobei diese Bereiche einen Bereich umfassen, bei dem die Konzentration einer Probe bestimmt werden kann, und

(ii) Zugabe einer zu bestimmenden Probe mit einer unbekannten Konzentration zu dem Trockenreagens, Messen der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate der resultierenden Reaktionsmischung, Auswählen eines Bestimmungsbereiches auf der Basis der anfänglichen Viskositätssteigerungsrate, Messen der Viskositätssteigerungsrate der Reaktionsmischung im Bestimmungsbereich und Bestimmen des Fibrinogengehaltes in der Probe auf der Basis der Viskositätssteigerungsrate.

19. Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen auf der Basis einer Viskositätsänderung während der Zeit, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

(i) vorheriges Zugeben von Proben mit bekannten Fibrinogenkonzentrationen zu einem Trockenreagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, danach Bestimmen der minimalen Zeiten minimaler Viskosität von der Zugabe der Proben bis zu einer Zeit, bei der die Reaktionsmischung eine minimale Viskosität zeigt, und Bestimmen der Bestimmungsbereiche, die den Zeiten der minimalen Viskosität entsprechen, wobei die Bereiche einen Bereich umfassen, bei dem die Konzentration einer Probe bestimmt werden kann, und

(ii) Zugabe einer Probe mit einer unbekannten Konzentration zum Trockenreagens, Messen der Zeit der minimalen Viskosität der resultierenden Reaktionsmischung, Auswählen eines Bestimmungsbereiches auf der Basis der minimalen Viskositätszeit, Messen der Viskositätssteigerungsrate der Reaktionsmischung in dem Bestimmungsbereich und Bestimmen des Fibrinogengehaltes in der Probe auf der Basis der Viskositätssteigerungsrate.

20. Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen auf der Basis einer Veränderung der Viskosität während der Zeit, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

(i) vorheriges Bestimmen eines Bestimmungsbereiches in einem Bereich, in dem die Viskosität des Reaktionssystems das 20/19- bis 2-fache des Wertes der minimalen Viskosität beträgt, und

(ii) Zugabe einer Probe mit einer unbekannten Konzentration zu einem Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, Messen der Viskositätssteigerungsrate der Reaktionsmischung in dem Bestimmungsbereich und Bestimmen des Fibrinogengehaltes in der Probe auf der Basis der Viskositätssteigerungsrate.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Gesamtblut oder Plasma ist.