DE69309810T2

DE69309810T2 - Mittel zur förderung des haarwuchses und dessen wiederherstellung

Info

Publication number: DE69309810T2
Application number: DE69309810T
Authority: DE
Inventors: Mitsuo 1-26 Daikan 2-Chome Tochigi 320 Murayama
Original assignee: Sanwa Shoyaku Co Ltd
Current assignee: Sanwa Shoyaku Co Ltd
Priority date: 1992-03-12
Filing date: 1993-02-09
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2013-02-10
Also published as: EP0584365A4; DE69309810D1; DE584365T1; EP0584365B1; CN1047516C; EP0584365A1; US5401503A; WO1993017657A1; CN1079893A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für Mittel zur Förderung des Haarwuchses und/oder der Durchblutung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Extraktfraktion von Aconitum-Wurzeln als aktiver Bestandteil verwendet wird, der nicht-aconitinartige alkaloidale Komponenten enthält.
Alopecia wird bekanntermaßen verursacht durch beispielsweise die Verminderung der physiologischen Funktion der Kopfhaut, bedingt durch eine Unausgeglichenheit der Versorgung oder eine Überproduktion von Schuppen, durch Verminderung des Metabolismus in der Haarpapille, bedingt durch deren ungenügende Blutversorgung, die aus der Verminderung des peripheren Blutflusses resultiert, durch androgen-assoziierte Verminderung der Haarfollikelfunktion in der Talgdrüse, dem Haarfollikel oder der Haarwurzel, oder durch psychischen Streß und eine Vielzahl von Medikamenten werden für die Behandlung von Alopecia oder ähnlichem verwendet. Beispiele für solche Medikamente beinhalten Ethinylestradiol, das eine anti-androgene Aktivität zeigt, Vitamin E, Swertiae-Kräuterextrakt, Ginsengextrakt, Cepharanthin oder ähnliches, die eine stimulierende Wirkung auf den peripheren Blutfluß haben, und Capsicumtinktur, Pfefferminzöl, 1-Menthol oder ähnliches, die eine lokale stimulierende Wirkung zeigen. Es gibt jedoch bis heute keine zufriedenstellenden Medikamente.
Der gegenwärtige Erfinder hat früher ein "Mittel zur Förderung des Haarwuchses" zur Verfügung gestellt, "das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen wäßrigen oder alkoholischen Extrakt von Aconitum-Wurzeln, -Stämmen oder -Blättern enthält". (Japanische, veröffentlichte, nicht geprüfte Patentanmeldung Nr. 3-271213 (JP-A-3-27 1213)). Als Ergebnis weiterer Untersuchungen an wäßrigen oder alkoholischen Extrakten von Aconitum-Wurzeln hat sich herausgestellt, daß die Extraktfraktion von Aconitum-Wurzeln mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten eine außerordentlich bemerkenswerte stimulierende Wirkung auf den Haarwuchs und das Haarwachstum hat, im Vergleich zu dem einfachen wäßrigen oder alkoholischen Extrakt von Aconitum-Wurzeln. Außerdem ist diese Fraktion merklich überlegen bei der Verwendung in Menschen in bezug auf ihre Sicherheit. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf diesen Erkenntnissen erreicht.
Es war nicht bekannt, daß nicht-aconitin-artige alkaloidale Komponenten eine stimulierende Wirkung auf den Haarwuchs und das Haarwachstum haben. Erfindungsgemäß wird somit ein neues Mittel zur Förderung des Haarwuchses zur Verfügung gestellt, gekennzeichnet durch die Verwendung der Extraktfraktion aus Aconitum-Wurzeln mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten als aktivem Bestandteil.
Erfindungsgemäß hat sich auch herausgestellt, daß die vorstehend genannte Fraktion von Aconitum-Wurzeln mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten eine bemerkenswerte Wirkung zur Erhöhung des peripheren Blutflusses hat.
Es war bis heute nicht bekannt, daß nicht-aconitin-artige alkaloidale Komponenten eine Blutfluß-erhöhende Wirkung haben. Dementsprechend wird außerdem erfindungsgemäß ein neues Pharmazeutikum zur Stimulierung der Durchblutung zur Verfügung gestellt, gekennzeichnet durch die Verwendung der Extraktfraktion von Aconitum-Wurzeln mit nicht- aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.
Erfindungsgemäß wird ein Mittel zur Förderung des Haarwuchses zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Extraktfraktion von Aconitum-Wurzeln als aktiver Bestandteil verwendet wird, der durch Extrahieren der Wurzeln mit Wasser oder Alkohol und Abtrennen des resultierenden wäßrigen oder alkoholischen Extrakts durch Massenverteilung zwischen Fest-Flüssigphasen oder Flüssig-Flüssigphasen zur Entfernung der aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten erhalten wird.
Erfindungsgemäß wird auch ein Pharmazeutikum zur Stimulierung der Durchblutung zur Verfügung gestellt, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktfraktion als aktiver Bestandteil verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun detailliert beschrieben.
Die erfindungsgemäß verwendeten Rohmaterialien, Aconitum-Wurzeln, sind Wurzeln von Pflanzen der Gattung Aconitum, die zur Familie der Ranunclaceae gehören. Als Hauptart kann Aconitum Japonicum THUNB., Aconitum subcuneatum N'AKAI, Aconitum Japonicum THUNB. var. montanum, Aconitum carmichaeli DEBX. und Aconitum vesoense NAKAI erwähnt werden. Zusätzlich zu diesen sind eine Vielzahl anderer Arten als Pflanzen der Gattung Aconitum bekannt. Das erfindungsgemäß verwendete Rohmaterial wird geeigneterweise aus diesen Arten, die zur Gattung Aconitum gehören, ausgewählt.
In dem Verfahren zur Herstellung der Extraktfraktion, die als aktiver Bestandteil der vorliegenden Erfindung in dem Mittel zur Förderung des Haarwuchses oder der Durchblutung verwendet wird, werden Aconitum-Wurzeln, vorzugsweise nach feiner Zerteilung, mit Wasser oder Alkohol, wie Methanol oder Ethanol, vermischt, um die Extraktion bei Raumtemperatur oder unter Erhitzen durchzuführen und der resultierende wäßrige oder alkoholische Extrakt wird durch Massenverteilung zwischen Fest-Flüssigphasen oder Flüssig-Flüssigphasen getrennt, zur Entfernung der aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten, wobei die Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten erhalten wird.
Da Aconitum-Wurzeln in der Regel extrem giftige Alkabide enthalten, erfordern wäßrige oder alkoholische Extrakte davon spezielle Aufmerksamkeit in ihrer Behandlung. Aus dieser Sicht ist es bevorzugt, Aconitum-Wurzeln zu verwenden, die einer Abschwächungsbehandlung unterworfen worden sind, wie durch Erhitzen. Als Beispiele für solche Behandlungen können (1) Erhitzen der Aconitum-Wurzeln unter Druck in einem Autoclaven, (2) Bedampfen in einem Dampfkäfig und (3) Kochen in einem Topf erwähnt werden.
Zum Durchführen der Extraktion aus Aconitum-Wurzeln können Wasser und Alkohol als Extraktionsmittel verwendet werden, entweder allein oder in Kombination. Als Alkohol zu diesem Zweck ist es bevorzugt, Methanol oder Ethanol zu verwenden. Wenn Alkohol verwendet wird, um die Extraktion unter Erhitzen durchzuführen, wird sie bevorzugt durch Refluxieren durchgeführt. Die Extraktion kann unter Rühren mit einem Rührer durchgeführt werden, wobei vorzugsweise Ultraschallwellen angewendet werden.
Als Mittel zum Trennen durch Massenverteilung oder differenzierte Massenadsorption zwischen zwei Phasen, wie Fest-Flüssigphasen oder Flüssig-Flüssigphasen, können z.B. verschiedene Chromatographien wie Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Verteilungschromatographie erwähnt werden. Weiterhin kann Gelfiltration oder ein ähnliches Verfahren, das ein Mittel zum Fraktionieren von Material auf der Basis von Unterschieden in der molekularen Größe ist, zum Zweck der Trennung verwendet werden. Der vorstehend genannte Wasser- oder Alkoholextrakt kann unter Verwendung dieser Arten und Mittel behandelt werden, um die aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu entfernen und damit die Extraktfraktion zu liefern, die nicht-aconitin-artige alkaloidale Komponenten enthält.
Bei der Durchführung der vorstehend genannten Adsorptionschromatographie können Adsorbens verwendet werden, die herkömmlich bei Säulenchromatographie verwendet werden, wie Polyamid, Aktivkohle, aktiviertes Silicagel, aktiviertes Aluminiumoxid oder ein ähnlicher Träger.
Falls Polyamid als Träger verwendet wird, kann die erwünschte Extraktfraktion mit nicht- aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten mit dem folgenden Verfahren erhalten werden: Der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol, als solcher im Fall des wäßrigen Extrakts oder, im Fall des alkoholischen Extrakts in Form einer Suspension seines zur Trockene konzentrierten Produkts in Wasser, wird auf eine Säule geladen, die mit Polyamid gepackt ist, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert werden. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, um die aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu entfernen und daraufhin mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert, wie Ethanol, das mit Ammoniak alkalisch gemacht wurde, um die gewünschte Extraktfraktion zu ergeben.
Falls Aktivkohle als Träger verwendet wird, wird der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol, als solcher im Fall des wäßrigen Extrakts oder, im Fall des alkoholischen Extrakts in Form einer Suspension seines zur Trockene konzentrierten Produkts in Wasser, auf eine Säule geladen, die mit Aktivkohle zur Adsorption gepackt ist. Die Säule wird mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, wie 20% Methanol, und sodann mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert, wie Methanol, das mit Ammoniak alkalisch gemacht wurde, um die erwünschte Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu erhalten.
Falls Silicagel als Träger verwendet wird, wird der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol zur Trockene konzentriert und der resultierende wäßrige oder alkoholische Extrakt wird in einem kleinen Volumen Methanol suspendiert. Die Suspension wird auf eine Säule geladen, die mit Silicagel zur Adsorption gepackt ist. Die Säule wird mit einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gewaschen, wie Chloroform/Methanol/Ammoniakwasser (50:10:1), um die aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu entfernen und sodann mit einem geeigneten Lösungsmittelgemisch, wie Chloroform/Methanol/Wasser (6:4:1), um die erwünschte Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu erhalten.
Falls Aluminiumoxid als Träger verwendet wird, wird der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol zur Trockene konzentriert und der resultierende wäßrige oder alkoholische Extrakt wird in einem kleinen Volumen Methanol suspendiert. Die Suspension wird auf eine Säule geladen, die mit Aluminiumoxid zur Adsorption gepackt ist. Die Säule wird mit einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gewaschen, wie Chloroform/Methanol (4:1), um die aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu entfernen, und sodann mit einem geeigneten Lösungsmittelgemisch eluiert, wie Chloroform/Methanol/Wasser (12:10:3), um die erwünschte Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu erhalten.
Die vorstehend erwähnte Ionenaustauschchromatographie kann unter Verwendung verschiedener Ionenaustauscher durchgeführt werden, wie Ionenaustauschharz, Ionenaustauschcellulose oder Ionenaustauschdextran. Falls z.B. CM-Sephadex C-25, ein Ionenaustauschdextran, verwendet wird, kann die erwünschte Extraktfraktion mit nicht- aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten durch das folgende Verfahren erhalten werden: Der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol, als solches im Fall des wäßrigen Extrakts oder, im Fall des alkoholischen Extrakts in Form einer Suspension, seines zur Trockene konzentrierten Produkts in Wasser, wird auf eine Säule geladen, die mit CM-Sephadex C-25 gepackt ist, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert werden. Die Säule wird dann mit Wasser eluiert, um die erwünschte Extraktfraktion zu ergeben.
Falls Säulenchromatographie verwendet wird, um die vorstehend erwähnte Verteilungschromatographie durchzuführen, können verschiedene feste Phasen-tragende Materialien verwendet werden, wie Silicagel oder Sephadex. Falls beispielsweise CM- Sephadex C-25 als das feste Phasen-tragende Material verwendet wird, wird der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol, als solches im Fall des wäßrigen Extrakts oder, im Fall des alkoholischen Extrakts in Form seines zur Trockene konzentrierten Produkts in Wasser auf eine Säule geladen, die mit CM-Sephadex C-25 gepackt ist, und sodann wird die Säule mit Wasser eluiert, um die erwünschte Extraktfraktion mit nicht- aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu erhalten. Wenn die Trennung unter Verwendung eines wäßrig-organischen Lösungsmittelsystems durchgeführt wird, können z.B. eine saure oder eine alkalische wäßrige Lösung als wäßriges Lösungsmittelsystem und Ether oder n-Butanol als das organische Lösungsmittelsystem verwendet werden. Somit wird bei spielsweise der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol zur Trockene konzentriert und der resultierende wäßrige oder alkoholische Extrakt wird in 1N Ammoniakwasser gelöst. Die Lösung wird mit Ether gewaschen und die wäßrige Phase wird mit Salzsäure gewaschen, um die erwünschte Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu erhalten.
Bei der vorstehend erwähnten Gelflitration können geeignete Gelpartikel mit Netzwerkstruktur als Träger verwendet werden. Somit wird beispielsweise der Extrakt aus Aconitum-Wurzeln mit Wasser zur Trockene konzentriert, wenn technisch erhältlisches Toyopearl HW 40F verwendet wird, und der resultierende wäßrige oder alkoholische Extrakt wird in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert, wie 50% Methanol. Die Suspension wird auf eine Säule geladen, die mit Toyopearl HW 40F gepackt ist und die Säule wird mit einer geeigneten Menge an 50% Methanol gewaschen und dann mit 50% Methanol eluiert, um die erwünschte Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten zu erhalten.
Die erhaltene Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln wird erfindungsgemäß verdünnt, entweder als solche, d.h. in Form einer Flüssigkeit oder nach dem Konzentrieren zur Trockene in einen geeigneten Basisbestandteil vor ihrer Anwendung. Als Basisbestandteile können Träger und Additive verwendet werden, wie Emulgiermittel, Suspendiermittel und Duftmittel, die herkömmlich als geeignete oder notwendige Hilfsmittel in Kosmetika, Pharmazeutika, etc., verwendet werden. Die erfindungsgemäße Extraktfraktion kann mit herkömmlichen Methoden in Präparate zur Anwendung verarbeitet werden. Beispiele für Materialien für solche Basisbestandteile beinhalten Ölsäure, Triethanolamin, weißes Bienenwachs, Cetylalkohol, Natriumlaurylsulfat, Glycerin, Natriumalginat, Gummiarabicum, Natriumcarboxylmethylcellulose, Methylcellulose, Bentonit, Vasilin, flüssiges Paraffin, Alkohole und Ester davon wie Ethanol, Propylenglykol, Ketostearylalkohol und Sorbitanmonostearat. Diese Präparate können in verschiedenen Applikationsformen dargereicht werden, wie Haartonikum, Haarcreme, Haarlotion und Haarshampoo.
Präparate für örtliche Anwendung werden beispielsweise in Form von Zusammensetzungen für Salben, Pflaster oder Umschläge oder in Form einer Tönungslotion oder Creme dargereicht. Sie können bekannte Träger enthalten, wie Vasilin, Paraffin, wäßriges Lanolin, Plastibase, Kaolin, Bentonit, Talk, Aluminiumsilikat, Propylenglykol, Sorbitol, hydrophiles Petrolat, Makrogol, Wachs, Harz, gereinigtes Lanolin, Gummi, Glycerin, Gelatine, Polyacrylsäure, Polyacrylsäuresalz, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenoxid, Bienenwachs, Kakaobutter, Carnaubawachs, Stearylalkohol, Olivenöl, Castoröl, Ethanol, Ölsäure, Cetylalkohol, Gummiarabicum, Natriumalginat, Carboxymethylcellulose und Methylcellulose. Der Gehalt als Trockenkonzentrat der Extraktfraktion mit nicht-aconitin- artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln in den vorstehend genannten Präparaten liegt bei etwa 0,05 bis 10%, vorzugsweise 0,1 bis 5%.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Förderung der Durchblutung kann in Formen für orale Verabreichung gebracht werden, wie Tabletten, Pulver, Granulate und Kapseln oder in die Form für rektale Verabreichung. Im Fall dieser Formen ist die klinische Dosis für Erwachsene der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln als Trockenkonzentrat davon 10 bis 1000 mg/Tag, vorzugsweise 100 bis 600 mg/Tag.
Orale Präparate, wie Tabletten, Pulver, Granulate und Kapseln können herkömmliche Trägersubstanzen enthalten, wie Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Calciumphosphat, Maisstärke, Kartoffelstärke, Zucker, Lactose, Talk, Magnesiumstearat und Gummiarabicum. Tabletten können mit herkömmlichen Verfahren überzogen werden. Orale flüssige Präparate können wäßrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Sirups, Elixiere, etc., sein.
Präparate für die rektale Verabreichung können in Form von Zusammensetzungen für Zäpfchen dargereicht werden und können bekannte Träger enthalten, wie Polyethylenglykol, Lanolin und Kokosnußöl.
Präparate zur Injektion können verschiedene Hilfsmittel enthalten, wie suspendierende, stabilisierende und dispergierende Mittel. So können sie beispielsweise sterilisiertes destilliertes Wasser, gereinigte Öle, wie Erdnußöl oder Maisöl, nicht-wäßrige Lösungsmittel, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, etc., enthalten.
Nachstehend werden nun einige Beispiele für Präparate der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben, sowie Reinheitstests (auf die Anwesenheit von aconitin-artigen Alkabiden), pharmakologische Tests, Sicherheitstests und Beispiele für Formulierungen.

Beispiel 1

(1) Aconitum-Wurzeln wurden bei 110ºC für 40 Minuten autoclaviert, getrocknet und sodann gemahlen.
(2) 4 l Methanol wurden zu 1 kg des erhaltenen groben Pulvers gegeben und die Extraktion wurde durch Refluxieren für 30 Minuten unter Erhitzen auf einem Wasserbad bewirkt. Nach der Extraktion wurde das Gemisch stehengelassen und der Überstand wurde filtriert.
Zu dem Rest wurden 4 l Methanol gegeben und die Extraktion durch Refluxieren unter Erhitzen wurde wie vorstehend beschrieben wiederholt. Das erhaltene Filtrat wurde mit dem vorher erhaltenen Filtrat zusammengegeben. Das Filtrat wurde zu Trockene konzentriert und man erhält 100 g methanolischen Extrakt.
(3) 16 g des methanolischen Extrakts wurden in 10 ml Wasser suspendiert und die Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 75 g Polyamid gepackt ist, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Diese Säule wurde mit 1 l Wasser gewaschen und sodann mit 1 l Ethanol eluiert, das mit 3 % Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde zur Trockene unter vermindertem Druck konzentriert. Man erhält 1,8 g des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

10 mg der nach dem vorstehend genannten Verfahren erhaltenen Extraktfraktion mit nicht- aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten wurde in 1 ml Methanol gelöst. Sodann wurden 0,5 g Polyamid zu dieser Lösung gegeben und das Gemisch gründlich gerührt. Sodann wurde das Methanol abdestilliert. Der Rest wurde auf eine Säule geladen, die mit 2 g Polyamid gepackt war und diese Säule wurde mit 40 ml Wasser eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Der erhaltene Rest wurde in 1 ml Methanol gelöst, um eine Probelösung zu ergeben. 3 µl der Probelösung wurden auf eine Dünnschichtplatte getropft, die mit Silicagel für Dünnschichtchromatographie hergestellt ist. Diese Platte wurde sodann mit Ammoniak-gesättigtem Chloroform/Ethanol (15:1) als Entwicklungslösungsmittel entwickelt und sodann luftgetrocknet. Auf diese Platte wurde sodann einheitlich Dragendorff-Reagenz (Anmerkung 1) gesprüht. Es wurden keine orangefarbenen Punkte gefünden.
(Anmerkung 1) Es wurde hergestellt durch Zusetzen von 2 ml einer Lösung, die hergestellt wurde durch Auflösen von 8 g Kaliumiodid in 20 ml Wasser und 20 ml 20% Essigsäurelösung zu 2 ml einer Lösung, die hergestellt wurde durch Auflösen von 0,85 g Bismutsubnitrat in 10 ml Eisessig.

Experimente zur Wiedergewinnung von zugesetzter Standardsubstanz in dem vorstehend genannten Reinheitstest

Experiment 1

Beladener Test: Etwa 3 mg Aconitin wurde so gewogen, daß es ein präzises Gewicht (a) ergab und wurde in 1 ml Methanol gelöst. Sodann wurden 0,5 g Polyamid zu dieser Lösung zugegeben und das Gemisch wurde gründlich gerührt. Das Methanol wurde abdestilliert. Der Rest wurde auf eine Säule geladen, die mit 2 g Polyamid gepackt war. Die Säule wurde sodann mit 40 ml Wasser eluiert. Nachdem das Eluat zur Trockne konzentriert wurde, wurde das Gewicht des Restes (b) gemessen.
Leertest: Das Gewicht des Restes (c) wurde in derselben Weise, wie in dem vorstehend beschriebenen beladenen Test gemessen, mit der Ausnahme, daß 1 ml Methanol statt 1 ml der methanolischen Lösung von Aconitin in dem vorstehend beschriebenen beladenen Test verwendet wurde.
An Mesaconitin, Hypaconitin und Jesaconitin wurde der gleiche Test wie an Aconitin durchgeführt. Jeder Test wurde dreimal mit jeder Standardsubstanz wiederholt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. In Tabelle 1 wurden "Gewicht der wiedergewonnenen Standardsubstanz" und "Wiedergewinnungsprozent" mit den nachstehenden Gleichungen berechnet.
(Gewicht der wiedergewonnenen Standardsubstanz) = b-c
(Wiedergewinnungsprozent) = (b-c) x 100/a Tabelle 1

Experiment 2

Beladener Test: 20 mg der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten, wie in Beispiel 1 erhalten wurden in 2 ml Methanol gelöst. 1 ml dieser Lösung wurde A genannt und der verbleibende 1 ml wurde Lösung B genannt. Etwa 3 mg Aconitin wurden so gewogen, um ein genaues Gewicht (a) zu ergeben und wurden in Lösung A gelöst. Sodann wurden 0,5 g Polyamid zu dieser Lösung zugegeben, und das Gemisch wurde gründlich gerührt. Das Methanol wurde abdestilliert und der Rest wurde auf eine Säule geladen, die mit 2 g Polyamid gepackt war. Die Säule wurde sodann mit 40 ml Wasser eluiert. Nachdem das Eluat zur Trockne konzentriert wurde, wurde das Gewicht des Restes (b) gemessen.
Leertest: Das Gewicht des Restes (c) wurde in derselben Weise wie in dem vorstehend beschriebenen beladenen Test gemessen, außer daß Lösung B anstelle der Lösung A mit darin gelöstem Aconitin verwendet wurde.
An Mesaconitin, Hypaconitin und Jesaconitin wurden die gleichen Tests wie an Aconitin durchgeführt. Jeder Test wurde dreimal mit jeder Standardsubstanz wiederholt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. In Tabelle 2 wurden "Gewicht der wiedergewonnenen Standardsubstanz" und "Wiedergewinnungsprozent" mit den nachstehenden Gleichungen berechnet.
(Gewicht der wiedergewonnenen Standardsubstanz) = b-c
(Wiedergewinnungsprozent) = (b-c) x 100/a Tabelle 2
Mit den Ergebnissen aus Experiment 1 und Experiment 2 wurde bestätigt, daß hohe Wiedergewinnungsprozent von aconitin-artigen Alkaloiden in diesem Reinheitstest erhalten wurden und auch, daß dieser Reinheitstest hoch reproduzierbar war, wie durch die Werte der relativen Standardabweichung gezeigt. In den nachstehenden Beispielen wurde der Reinheitstest wie vorstehend beschrieben durchgeführt.

Beispiel 2

Ein methanolischer Extrakt wurde durch Durchführen des gleichen Verfahrens, wie in (1) und (2) in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Sodann wurden 4 g des methanolischen Extrakts in 10 ml Wasser suspendiert und an einer Säule adsorbiert, die mit 20 g Aktivkohle gepackt war. Die Säule wurde sodann mit 600 ml 20% Methanol gewaschen und anschließend mit 600 ml Methanol eluiert, das mit 3 % Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 766 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkoidalen Komponenten.

Reinheitstest

Das gleiche Verfahren, wie in dem in Beispiel 1 beschriebenen Reinheitstest wurde durchgeführt. Es wurden keine orangefarbenen Punkte gefunden.

Beispiel 3

Ein methanolischer Extrakt wurde durch Durchführen des gleichen Verfahrens, wie in (1) und (2) in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Sodann wurden 4 g des methanolischen Extrakts in 100 ml 1 N Ammoniakwasser suspendiert, und die Lösung wurde 5mal mit 100 ml Ether gewaschen. Zu der wäßrigen Lösung wurden 17 ml 10 N Salzsäure zugegeben und das Gemisch wurde 2mal mit 100 ml n-Butanol extrahiert. Nachdem der Extrakt 5mal mit 20 ml 1 N Salzsäure gewaschen wurde, wurde er unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 424 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 4

Ein methanolischer Extrakt wurde durch Durchführen des gleichen Verfahrens, wie in (1) und (2) in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Sodann wurden 0,9 g des Methanolextrakts in 5 ml Wasser suspendiert und die Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 45 g CM- Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemicals) gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 450 ml Wasser eluiert und die erhaltene Extraktfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 630 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkabidalen Komponenten.

Reinheitstest

Das gleiche Verfahren, wie in dem in Beispiel 1 beschriebenen Reinheitstest wurde durchgeführt. Es wurden keine orangefarbenen Punkte gefünden.

Beispiel 5

Ein methanolischer Extrakt wurde durch Durchführen des gleichen Verfahrens, wie in (1) und (2) in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. 1 g des methanolischen Extrakts wurde in 1 ml Methanol suspendiert und die Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 100 g Aluminiumoxid gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde sodann mit 400 ml Chloroform/Methanol (4:1) gewaschen und dann wurde mit 300 ml Chloroform/Methanol/Wasser (12:10:3) eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 60 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 6

Ein methanolischer Extrakt wurde durch Durchführen des gleichen Verfahrens, wie in (1) und (2) in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Sodann wurden 0,2 g des methanolischen Extrakts in 0,5 ml Methanol suspendiert und die Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 20 g Silicagel gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde sodann mit 300 ml Chloroform/Methanol/Ammoniak (50:10:1) gewaschen und anschließend mit 150 ml Chloroform/Methanol/Wasser (6:4:1) eluiert. Die erhaltene Extraktfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 42 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 7

Ein methanolischer Extrakt wurde durch Durchführen des gleichen Verfahrens, wie in (1) und (2) in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Sodann wurden 0,38 g des methanolischen Extrakts in 0,5 ml 50% Methanol suspendiert und die Suspension auf eine Säule geladen, die mit 70 ml Toyopearl HW 40 F gepackt war. Die Säule wurde sodann mit 45 ml 50% Methanol gewaschen und anschließend mit 120 ml 50% Methanol eluiert. Die erhaltene Extraktfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 228 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 8

(1) 4 l Methanol wurden zu 1 kg fein zerteilten Aconitum-Wurzeln gegeben und das Gemisch wurde 30 Minuten durch Refluxieren unter Erhitzen extrahiert. Nach der Extraktion wurde es stehengelassen und der Überstand wurde abfiltriert. Zu dem Rest wurden 4 l Methanol gegeben und die Extraktion wurde wie vorstehend beschrieben wiederholt. Das erhaltene Filtrat wurde mit dem früher erhaltenen kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 150 g methanolischen Extrakt.
(2) Sodann wurden 16 g des erhaltenen methanolischen Extrakts in 10 ml Wasser suspendiert und diese Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 75 g Polyamid gepackt war, so daß die Extraktkomponenten daran adsorbiert wurden. Diese Säule wurde mit 1 l Wasser gewaschen und sodann mit 1 l Ethanol eluiert, das mit 3 % Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 1,8 g des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 9

Der methanolische Extrakt wurde durch Durchführen der gleichen Extraktion wie in Beispiel 8 (1) erhalten. Sodann wurden 4 g des methanolischen Extrakts in 10 ml Wasser suspendiert und das Gemisch auf eine Säule geladen, die mit 20 g Aktivkohle gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde sodann mit 600 ml 20% Methanol gewaschen und anschließend mit 600 ml 20% Methanol eluiert, das mit 3 % Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 770 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 10

Der methanolische Extrakt wurde durch Durchführen der gleichen Extraktion wie in Beispiel 8 (1) erhalten. Sodann wurden 4 g des methanolischen Extrakts in 100 ml 1 N Ammoniakwasser suspendiert und die Suspension wurde 5mal mit 100 ml Ether gewaschen. Zu der wäßrigen Schicht wurden 17 ml 10 N Salzsäure zugegeben und das Gemisch wurde 2mal mit 100 ml n-Buatnol extrahiert. Nachdem der Extrakt 5mal mit 20 ml 1 N Salzsäure gewaschen worden ist, wurde er unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 421 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin- artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 11

Der methanolische Extrakt wurde durch Durchführen der gleichen Extraktion wie in Beispiel 8 (1) erhalten. Sodann wurden 0,9 g des methanolischen Extrakts in 5 ml Wasser suspendiert und dann auf eine Säule geladen, die mit 45 g CM-Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemicals) gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde sodann mit 450 ml Wasser eluiert und die erhaltene Fraktion unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 625 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 12

Der methanolische Extrakt wurde durch Durchführen der gleichen Extraktion wie in Beispiel 8 (1) erhalten. 1 g des methanolischen Extrakts wurden in 1 ml Methanol suspendiert und auf eine Säule geladen, die mit 100 g Aluminiumoxid gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde sodann mit 400 ml Chloroform/Methanol (4:1) gewaschen und anschließend mit 300 ml Chloroform/Methanol/Wasser (12:10:3) eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 62 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 13

Der methanolische Extrakt wurde durch Durchführen der gleichen Extraktion wie in Beispiel 8 (1) erhalten. Sodann wurden 0,2 g des methanolischen Extrakts in 0,5 ml Methanol suspendiert und auf eine Säule geladen, die mit 20 g Silicagel gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde sodann mit 300 ml Chloroform/Methanol/Ammoniakwasser (50:10:1) gewaschen und anschließend mit 150 ml Chloroform/Methanol/Wasser (6:4:1) eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 44 mg Trockenkonzentrat der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 14

Der methanolische Extrakt wurde durch Durchführen der gleichen Extraktion wie in Beispiel 8 (1) erhalten. Sodann wurden 0,38 g des methanolischen Extrakts in 0,5 ml 50% Methanol suspendiert und auf eine Säule geladen, die mit 70 ml Toyopearl HW 40 F gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde dann mit 45 ml 50% Methanol gewaschen und anschließend mit 120 ml 50% Methanol eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 230 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 15

Aconitum-Wurzeln wurden bei 110ºC 40 Minuten autoclaviert, getrocknet und sodann gemahlen. Zu 100 g des erhaltenen groben Pulvers wurde 1 l Wasser zugegeben, um die Extraktion unter Erhitzen auf etwa 100ºC für etwa 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt ist, wurde er zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die mit 150 g Polyamid gepackt ist, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde dann mit 2 l Wasser gewaschen und anschließend mit 2 l Ethanol eluiert, das mit 3% Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 1,5 g des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 16

Aconitum-Wurzeln wurden bei 110ºC 40 Minuten autoclaviert, getrocknet und sodann gemahlen. Zu 100 g des erhaltenen groben Pulvers wurde 1 l Wasser zugegeben, um die Extraktion unter Erhitzen auf etwa 100ºC für 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt ist, wurde er zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die mit 150 g Aktivkohle gepackt ist, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde sodann mit 5 l 20% Methanol gewaschen und anschließend mit 4,5 l Methanol eluiert, das mit 3 % Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 2,8 g des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 17

(1) Aconitum-Wurzeln wurden bei 110ºC 40 Minuten autoclaviert, getrocknet und dann gemahlen. Zu 100 g des erhaltenen groben Pulvers wurde 1 l Wasser zugesetzt, um die Extraktion unter Erhitzen auf etwa 100ºC für 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde er zentrifugiert. Der Überstand wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält einen wäßrigen Extrakt.
(2) Nachdem 4 g des wäßrigen Extrakts in 100 ml 1 N Ammoniakwasser suspendiert wurden, wurde er 5mal mit 100 ml Ether gewaschen. Zu der wäßrigen Schicht wurden 17 ml 10 N Salzsäure zugegeben und das Gemisch 2mal mit 100 ml n-Butanol extrahiert. Nachdem der Extrakt 5mal mit 20 ml 1 N Salzsäure gewaschen wurde, wurde er unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 200 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 18

Aconitum-Wurzeln wurden bei 110ºC 40 Minuten autoclaviert, getrocknet und dann gemahlen. Zu 100 g des erhaltenen groben Pulvers wurde 1 l Wasser zugesetzt, um die Extraktion unter Erhitzen auf 100ºC für 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde er zentrifugiert. Das Volumen des Überstands wurde mit Wasser auf 1 l aufgefüllt und 100 ml dieser Lösung wurden auf eine Säule geladen, die mit 80 g CM-Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemicals) gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 800 ml Wasser eluiert und die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 800 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 19

Ein wäßriger Extrakt wurde erhalten, indem das gleiche Verfahren wie in Beispiel 17 (1) durchgeführt wurde. 1 g des wäßrigen Extrakts wurde in 1 ml Methanol suspendiert und auf eine Säule geladen, die mit 100 g Aluminiumoxid gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 400 ml Chloroform/Methanol (4:1) gewaschen und sodann mit 300 ml Chloroform/Methanol/Wasser (12:10:3) eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 25 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkabidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 20

Ein wäßriger Extrakt wurde erhalten, indem das gleiche Verfahren wie in Beispiel 17 (1) durchgeführt wurde. Sodann wurden 0,2 g des wäßrigen Extrakts in 0,5 ml Methanol suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 20 g Silicagel gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 300 ml Chloroform/Methanol/Ammoniakwasser (50:10:1) gewaschen und sodann mit 150 ml Chloroform/Methanol/Wasser (6:4:1) eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 19 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 21

Ein wäßriger Extrakt wurde erhalten, indem das gleiche Verfahren wie in Beispiel 17 (1) durchgeführt wurde. Sodann wurden 0,4 g des wäßrigen Extrakts in 0,5 ml 50% Methanol suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 70 ml Toyopearl HW 40 F gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 45 ml 50% Methanol gewaschen und sodann mit 120 ml 50% Methanol eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 100 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 22

Zu 100 g fein zerteilten Aconitum-Wurzeln wurde 1 l Wasser zugegeben, um die Extraktion unter Erhitzen auf etwa 100ºC für 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde er zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die mit 150 g Polyamid gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Sodann wurde diese Säule mit 2 l Wasser gewaschen und daraufhin mit 2 l Ethanol eluiert, das mit 3% Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 1,6 g des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 23

Zu 100 g fein zerteilten Aconitum-Wurzeln wurde 1 l Wasser zugegeben, um die Extraktion unter Erhitzen auf etwa 100ºC für 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde er zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die mit 150 g Aktivkohle gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 5 l 20% Methanol gewaschen und sodann mit 4,5 l Methanol eluiert, das mit 3% Ammoniak alkalisch gemacht wurde. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 2,9 g des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 24

(1) Zu 100 g fein zerteilten Aconitum-Wurzeln wurde 1 l Wasser zugegeben, um die Extraktion unter Erhitzen auf etwa 100ºC für 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde er zentrifugiert. Der Überstand wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält einen wäßrigen Extrakt.
(2) Nachdem 4 g des wäßrigen Extrakts in 100 ml 1 N Ammoniakwasser suspendiert wurden, wurde er 5mal mit 100 ml Ether gewaschen. Zu der wäßrigen Schicht wurden 17 ml 10 N Salzsäure zugegeben und das Gemisch wurde 2mal mit 100 ml n-Butanol extrahiert. Nachdem der Extrakt 5mal mit 20 ml 1 N Salzsäure gewaschen wurde, wurde er unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 197 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 25

Zu 100 g fein zerteilten Aconitum-Wurzeln wurde 1 l Wasser zugegeben, um die Extraktion unter Erhitzen auf etwa 100ºC für 1,5 Stunden zu bewirken. Nachdem der Extrakt auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde er zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die mit 80 g CM-Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemicals) gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 800 ml Wasser eluiert und die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 795 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 26

Ein wäßriger Extrakt wurde erhalten, indem das gleiche Verfahren wie in Beispiel 24 (1) durchgeführt wurde. 1 g des wäßrigen Extrakts wurde in 1 ml Methanol suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Säule geladen, die mit 100 g Aluminiumoxid gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 400 ml Chloroform/Methanol (4:1) gewaschen und sodann mit 300 ml Chloroform/Methanol/Wasser (12:10:3) eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 25 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 27

Ein wäßriger Extrakt wurde erhalten, indem das gleiche Verfahren wie in Beispiel 24 (1) durchgeführt wurde. Nachdem 0,2 g des wäßrigen Extrakts in 0,5 ml Methanol suspendiert wurden, wurde er auf eine Säule geladen, die mit 20 g Silicagel gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 300 ml Chloroform/Methanol/Ammoniak (50:10:1) gewaschen und sodann mit 150 ml Chloroform/Methanol/Wasser (6:4:1) eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 20 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Beispiel 28

Ein wäßriger Extrakt wurde erhalten, indem das gleiche Verfahren wie in Beispiel 24 (1) durchgeführt wurde. Nachdem 0,4 g des wäßrigen Extrakts in 0,5 ml 50% Methanol suspendiert wurden, wurde er auf eine Säule geladen, die mit 70 ml Toyopearl HW 40 F gepackt war, so daß die extrahierten Komponenten daran adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 45 ml 50% Methanol gewaschen und sodann mit 120 ml 50% Methanol eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 105 mg des Trockenkonzentrats der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten.

Reinheitstest

Das gleiche Verfahren, wie in dem in Beispiel 1 beschriebenen Reinheitstest wurde durchgeführt. Es wurden keine orangefarbenen Punkte gefunden.
Nachstehend wird der stimulierende Effekt der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten, die in dem erfindungsgemäßen Mittel zur Förderung des Haarwuchses verwendet wurden, gezeigt. Der in den Experimenten nachstehend erwähnte verwendete wäßrige oder ethanolische Extrakt wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt.

Herstellung des ethanolischen Extrakts aus Aconitum-Wurzeln

1 kg gemahlene Aconitum-Wurzeln wurden mit 10 l Ethanol unter Refluxieren 1,5 Stunden unter Erhitzen extrahiert. Der Extrakt wurde gefiltert und das Filtrat wurde sodann unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert. Man erhält 140 g des ethanolischen Extrakts.

Herstellung des wäßrigen Extrakts von Aconitum-Wurzeln

1 kg der gemahlenen Aconitum-Wurzeln wurde mit 10 l Wasser unter Erhitzen auf etwa 100ºC für 1,5 Stunden extrahiert. Der Extrakt wurde mit einem Filter aus Edelstahl (ein Netz von 0,246 mm Maschen) mittels Zentrifugation (1350 Umdrehungen/Minute) filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne konzentriert. Man erhält 350 g des wäßrigen Extrakts.

Experiment 1

In diesem Experiment wurden männliche Mäuse des Std:ddY-Stamms (Körpergewicht 30- 35 g) in Gruppen von jeweils 7 verwendet. Die Tiere wurden bei 24-25 ºC Raumtemperatur in einem 12 Stunden Licht - 12 Stunden Dunkelheit-Zyklus gehalten und bekamen Futter und Wasser ad libitum. Am Tag vor Beginn des Experiments wurde der Rücken jeder Maus mit einem cremigen Haarentferner rasiert. 0,1 g jeder Probe wurde in 20 ml 60% Ethanol gelöst und diese Lösung wurde als Probelösung betrachtet. Etwa 0,1 ml der Probelösung wurde auf den von Haar befreiten Rücken 2mal am Tag aufgetragen, d.h. am Morgen und am Abend. Als negative Kontrolle wurde 60% Ethanol allein als eine Probe aufgetragen. Die Beurteilung wurde durch makroskopische Beobachtung durchgeführt und der Standard der Beurteilung war wie nachstehend:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Aus Tabelle 3 geht hervor, daß die Extraktfraktion der Aconitum-Wurzeln, die nicht-aconitin-artige alkaloidale Komponenten enthält und in dem erfindungsgemäßen Mittel zur Förderung des Haarwuchses verwendet wurde, einen weit besser stimulierenden Effekt auf den Haarwuchs und das Haarwachstum hatte, als der einfache wäßrige oder alkoholische Extrakt. Außerdem wurden im Laufe des Experiments und nach dem Ende des Experiments keine Hautirritationen oder allergische Reaktionen in allen Gruppen beobachtet, auf die die Probelösung der Extraktionfraktion mit den vorstehend genannten nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten angewendet wurde. Tabelle 3

Experiment 2

In diesem Experiment wurden männliche Mäuse des Std:ddY-Stammes (Körpergewicht 30- 35 g) in Gruppen von jeweils 7 verwendet. Die Tiere wurden bei 24-25 ºC Raumtemperatur auf einem 12 Stunden Licht-12 Stunden Dunkelheit -Zyklus gehalten und bekamen Futter und Wasser ad libitum. Am Tag vor Beginn des Experiments wurde der Rücken jeder Maus mit einem cremigen Haarentfemer rasiert. Dieselben Probelösungen wie in Experiment 1 wurden verwendet. Etwa 0,1 ml der Probelösung wurde auf den von Haar befreiten Rücken 2mal am Tag aufgetragen, d.h. am Morgen und am Abend. Am 21sten und am 28sten Tag nach dem Probenauftrag wurde neu entwickeltes Haar von der Stelle der Haarentfernung entnommen (abgehoben) und die Länge davon mit einem Stereomikroskop gemessen. 5 längere aus zufällig gewählten 20 Probehaaren wurden identifiziert und der mittere Wert der Länge dieser 5 Haare wurde als die Länge des Körperhaars der Maus betrachtet. Um die Bedeutung der Unterschiede der Arzneimittel-behandelten Gruppen, basierend auf dem Vergleich innerhalb der Gruppen, zu beurteilen, wurde der Studenten-t-Test (Student's t- test) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Wie in Tabelle 4 ersichtlich, zeigte die Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln einen merklich (P< 0,01) stimulierenden Effekt auf den Haarwuchs und das Haarwachstum im Vergleich zu der negativen Kontrolle oder dem einfachen wäßrigen oder ethanolischen Extrakt. Tabelle 4
*P< 0,05, ** P< 0,01: Vergleich mit negativer Kontrollgruppe
P< 0,01: Vergleich mit wäßrigem oder ethanolischem Extrakt aus Aconitum-Wurzeln.
Nachstehend werden experimentelle Beispiele und pharmakologische Wirkung der Fraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln gezeigt, die in einem Mittel zur Förderung der Durchblutung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.

Experiment 3 (Blutfluß-erhöhender Effekt)

In diesem Experiment wurden männliche Mäuse des Std:ddY-Stamms (20-25 g) in Gruppen von jeweils 5 verwendet. Die Tiere wurden bei 24-25 ºC Raumtemperatur in einem 12 Stunden Licht-12 Stunden Dunkelheit-Zyklus gehalten und bekamen Futter und Wasser ad libitum. Eine angemessene Menge jeder Probe wurde in Dimethylsulfoxid gelöst. Am Tag vor dem Beginn des Experiments wurde der Rücken der Maus mit einem cremigen Haarentferner rasiert. Nach dem Betäuben mit Urethan wurde die Sonde eines Laser Doppler Flow Meter (ALF 21, Produkt von Advance) auf den von Haaren befreiten Rücken der Maus befestigt. Vor dem Aufbringen der Probelösung wurde der Blutfluß gemessen. 0,05 ml der Probelösung wurden dann in die Schwanzvene des Tieres injiziert. Nach 10 Minuten wurde der Blutfluß (in ml/Minute/100 g) für 25 Minuten gemessen. Die Ergebnisse wurden in dem akkumulierten Blutflußanstieg innerhalb einer Periode von 25 Minuten von 10 Minuten, nachdem die Probe aufgetragen wurde, im Vergleich mit dem Blutfluß vor dem Auftragen der Probe angezeigt. In der negativen Kontrollgruppe wurde nur Dimethylsulfoxid gegeben. Um die Bedeutung der Unterschiede für die Gruppen, die das Arzneimittel verabreicht bekommen haben, basierend auf dem Vergleich zwischen den Gruppen, einzuschätzen, wurde der Studenten-t-Test durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Wie in der Tabelle 5 ersichtlich, zeigt die vorstehend erwähnte Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln einen signifikanten (P< 0,01) stimulierenden Effekt auf den Blutfluß im Vergleich zu der negativen Kontrollgruppe. Tabelle 5
*P< 0,01

Experiment 4 (Blutfluß-erhöhender Effekt)

Eine Salbe auf der Basis der Formulierung 1 unter Verwendung der Fraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln, erhalten in Beispiel 1, wurde hergestellt. Männliche erwachsene Menschen wurden als Testpersonen ausgewählt und der Blutfluß wurde gemessen. Die Testbedingungen waren wie nachstehend beschrieben: Die Testperson wurde in eine auf dem Rücken liegende Position gebracht und die Sonde eines Laser Doppler Flow Meters (ALF21, Produkt von Advance) wurde auf dem Rücken ihrer Hand befestigt. Der Blutfluß wurde für etwa 30 Minuten vor dem Auftragen der Salbe gemessen. Sodann wurde die vorstehend genannte Salbe um die befestigte Sonde aufgetragen und der Blutfluß wurde für etwa 1 Stunde gemessen. Die Ergebnisse wurden in minimalem und maximalem Blutfluß, der während der 30 Minuten davor erreicht wurde und während 15 Minuten bis 1 Stunde nach dem Auftragen der Salbe angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Wie in Tabelle 6 ersichtlich, wurde durch das Auftragen der Salbe mit der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten von Aconitum-Wurzeln ein bemerkenswerter Anstieg im Blutfluß beobachtet. Tabelle 6
Nachstehend werden nun Ergebnisse der akuten Toxizität und Sicherheit der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten von Aconitum-Wurzeln gezeigt.

Experiment 5 (Akute Toxizität)

In diesem Experiment wurden männliche Mäuse des Std:ddY-Stamms (20-25 g) verwendet. Eine geeignete Menge jeder Probe wurde in Wasser suspendiert und die Suspension wurde p.o. mit einer Dosis, wie in Tabelle 7 gezeigt, verabreicht. Die Sterblichkeit während 72 Stunden nach dem Verabreichen wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, konnte kein Tod der Mäuse sogar bei einer p.o. Verabreichung von 3g/kg der erfindungsgemäßen Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten aus Aconitum-Wurzeln festgestellt werden, die somit eine weit niedrigere Toxizität hat, als einfache Extrakte von Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Ethanol. Tabelle 7

Experiment 6 (Sicherheit)

Als Testverfahren wurde ein 24-Stunden Pflastertest auf dem menschlichen Unterarm verwendet. Die Testpersonen waren 3 männliche und 1 weiblicher Erwachsener. Die Beurteilung basiert auf dem nachstehend gezeigten Standard. Die verwendeten Proben wurden mit Formulierung 1 unter Verwendung der Extraktfraktion mit nicht-aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten von Aconitum-Wurzeln hergestellt.
++: Schweres Erythema ±: Leichtes Erythema
+: Erythema -: Negativ
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Wie in Tabelle 8 ersichtlich, wurden keine Hautirritationen und allergische Reaktionen auf diese Probe festgestellt. Dies zeigt, daß die Sicherheit dieser Probe sehr hoch war. Zusätzlich wurden während des Tests keine Nebenwirkungen bei den Personen beobachtet. Tabelle 8
Nachstehend werden nun einige Beispiele für Formulierungen für Mittel zur Förderung des Haarwuchses gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben. Formulierung 1: Haartonikum
Das Gesamtvolumen wurde auf 100 ml aufgefüllt durch Zugabe von gereinigtem Wasser. Formulierung 2: Haarlotion
Das Gesamtvolumen wurde auf 100 ml ergänzt durch die Zugabe von gereinigtem Wasser. Formulierung 3: Haarcreme (A) Die Ölphasenkomponenten wurden gemäß der nachstehenden Formulierung hergestellt: (B) Die Wasserphasenkomponenten wurden gemäß der nachstehenden Formulierung hergestellt:
Die Ölphasenkomponenten (A) und die Wasserphasenkomponenten (B) wurden jeweils auf 75ºC und 77ºC unter Rühren erhitzt. Während des Rührens wurde langsam (B) zu (A) gegeben zur Bildung einer Emulsion. Formulierung 4: Haarshampoo Komponenten (B)
Nachdem die Komponenten (A) und (B) getrennt erhitzt und gerührt wurden, wurden die Komponenten (B) langsam zu den Komponenten (A) unter Rühren zugegeben, zur Bildung einer Lösung zur Verwendung als ein Shampoo.
Nachstehend werden Beispiele für Formulierungen für das Mittel zur Förderung der Durchblutung gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben. Formulierung 1: Salbe Formulierung 2: Tablette (in 10 Tabletten) Formulierung 3: Creme Formulierung 4: Zäpfchen

Claims

1. Eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Mittel zur Förderung des Haarwuchses und/oder zur Förderung der Durchblutung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Extraktfraktion aus Aconitum-Wurzeln als aktiven Bestandteil enthält, wobei die Extraktfraktion nicht-aconitin-artige alkaloidale Komponenten enthält und durch Extrahieren von Aconitum-Wurzeln mit Wasser oder Alkohol und Abtrennen des resultierenden wäßrigen oder alkoholischen Extrakts mittels Massenverteilung zwischen Fest-Flüssigphasen oder Flüssig-Flüssigphasen zum Entfernen der aconitin-artigen alkaloidalen Komponenten erhalten wird.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der bei der Extraktion verwendete Alkohol ausgewählt ist aus Methanol und Ethanol.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aconitum-Wurzeln zur Abschwächung einer Hitzebehandlung unterworfen werden, bevor sie mit Wasser oder Alkohol extrahiert werden.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Mittel zur Trennung mittels Massenverteilung zwischen Fest-Flüssigphasen oder Flüssig-Flüssigphasen Chromatographie oder Gelfiltration ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Chromatographie Adsorptionschromatographie ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Chromatographie Ionenaustauschchromatographie ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Chromatographie Verteilungschromatographie ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei Polyamid, Aktivkohle, aktiviertes Silicagel oder aktiviertes Aluminiumoxid als Adsorbent für die Adsorptionschromatographie verwendet wird.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zusammensetzung die Extraktfraktion als aktiven Bestandteil enthält und unter Verwendung von Carriern und/oder Additiven hergestellt wird, die gewöhnlich in Kosmetika oder Pharmazeutika verwendet werden.