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Die vorliegende Erfindung betrifft eine gefriergetrocknete Präparation mit einem
monoklonalen Antikörper (oder Antikörpern) als Hauptbestandteil(e).
Stand der Technik
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Ein monoklonaler Antikörper ist ein homogenes Globulin-Protein, welches nur gegenüber
einem spezifischen Epitop eine Reaktivität aufweist. Neueste Fortschritte in Techniken wie
Zellfiision, Zellkultivierung, Proteinreinigung usw. machten es möglich, große Mengen an
monoklonalen Antikörpern zu produzieren. Infolge davon können monoklonale Antikörper
auf verschiedene Weise eingesetzt werden, wie z.B. in zahlreichen Analysen, Diagnosen,
Behandlungen und bei Krankheitsverhütungen. Insbesondere nehmen die in monoklonale
Antikörper als Arzneien für Behandlungen und bei Krankheitsverhütungen gesetzten
Erwartungen zu. Vor allem wird erwartet, daß sie künftig mehr und mehr am menschlichen
Körper zum Einsatz kommen und die Entwicklung von Antikörpern, die vom Menschen
stammen und günstige antigene Wirkung zeigen, wird vorangetrieben.
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Bisher wurden auf diesem technischen Gebiet monoklonale Antikörper und Immunglobulin-
Präparationen zum gleichen Zweck in der medizinischen Diagnose und Behandlung
eingesetzt. Während ein monoklonaler Antikörper homogen ist und nur eine gegen ein
spezifisches Epitop gerichtete Reaktivität aufweist, stellt ein polyklonaler Antikörper
entsprechend seinem Namen eine Mischung aus vielen Antikörpern dar. Daher wirken in
polyklonalen Antikörpern viele Moleküle mit jeweils unterschiedlichen Eigenschaften
zusammen und stabilisieren sich gegenseitig, so daß solche polyklonalen Antikörper als
ganzes in einem relativ stabilen Zustand verharren. Bei gereinigten monoklonalen
Antikörpern konnte jedoch eine Stabilisierung durch die Wechselwirkung zwischen
unterschiedlichen Molekülen nicht erwartet werden, so daß, unabhängig davon, zu welcher
Immunoglobulin-Klasse sie gehören, monoklonale Antikörper gegenüber verschiedenen
physikalischen und chemischen Einwirkungen instabil sind.
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Globulin-Proteine wie monoklonale und polyklonale Antikörper werden oft erhitzt, um die
darin enthaltenen Viren zu inaktivieren, insbesondere, wenn sie medizinisch in einer Diagnose
und bei einer Behandlung eingesetzt werden. Solche Globulin-Proteine sind zur
Aufbewahrung in Lösung über einen längeren Zeitraum nicht geeignet. Daher wurden zur
stabilen Aufbewahrung solcher Globulinproteinmoleküle gewöhnlich gefriergetrocknete
Formulierungen verwendet. Die Globulin-Proteine werden oft zusätzlich, falls erwünscht, mit
sauren oder alkalischen Agentien behandelt.
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Gegenüber einer solchen Hitzebehandlung, Gefriertrocknung und sauren oder alkalischen
Behandlung sind polyklonale Antikörper im allgemeinen stabil, aber monoklonale Antikörper
denaturieren oft und verlieren leicht durch eine solche Behandlung ihre Aktivität.
Insbesondere ist IgM weniger stabil als jeder andere monoklonale Antikörper und jedes
andere Immunglobulin (z.B. IgG, IgA und IgE).
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Zur Hitzebehandlung von Antikörpern offenbart beispielsweise die JP-A 61-76423 ("JP-A"
bedeutet eine "ungeprüfte, veröffentlichte japanische Patentanmeldung"), daß monoklonale
Antikörper gegenüber einer Hitzebehandlung instabil sind und daß zum Zwecke der
Überwindung der thermischen Instabilität ein Ovalbumin-Hydrolysat zu einer Präparation
monoklonaler Antikörper zugesetzt wird.
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Andererseits ist eine Behandlung von monoklonalen Antikörper durch Gefriertrocknung mit
einem spezifischen Problem verbunden. Falls nämlich eine Lösung von monoklonalen
Antikörpern ohne Zusatz eines Stabilisators gefriergetrocknet wird, stellt sich das Problem,
daß die Antigen-Bindungsaktivität der monoklonalen Antikörper infolge Denaturierung
während des Gefriertrocknens abnimmt. Es ist daher notwendig, dies zu verhindern. Das
Problem taucht beim Gefriertrocknen monoklonaler Antikörper auf, ist jedoch beim
Gefriertrocknen polyklonaler Antikörper nicht so signifikant, da polyklonale Antikörper aus
den oben genannten Gründen stabil sind.
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Es ist bekannt, daß bei der Präparation eines gefriergetrockneten Produkts aus monoklonalen
Antikörpern vor dem Gefriertrocknen das heterologe Protein Albumin (z.B. aus JP-A 60-
146833, 61-78730 und 61-78731 sowie aus WO 90/11091) oder das Saccharid Maltose (z.B.
aus WO 89/11297) zur Lösung von monoklonalen Antikörpern zugesetzt werden.
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Immunglobulin-Präparationen polyklonaler Antikörper werden gewöhnlich in relativ hohen
Konzentrationen eingesetzt, wobei sich während der Aulbewahrung oder während der
anschließenden Gefriertrocknungsbehandlung in den Lösungen oft Aggregate bilden. Man
nimmt an, daß die Aggregate eine ernsthafte anaphylaktische Nebenwirkung zeigen, wenn das
sie enthaltende Globulin intravenös in den menschlichen Körper injiziert wird. Es ist bekannt,
daß man deshalb ein heterologes Protein zu den Ausgangslösungen zusetzt, um die Bildung
solcher Aggregate zu verhindern. Beispielsweise ist bekannt, daß die alleinige Zugabe des
heterologen Proteins Gelatine zu einer Immunglobulinlösung (z.B. aus JP-A 58-167518, Vox.
Sang. (1983) 51, 81-86) oder sowohl der Zusatz des Saccharids Glucose als auch der Zusatz
von Gelatine die Aggregatbildung in der Ausgangslösung wirksam verhindert und auch
antibakterielle und antivirale Aktivitäten aufrechterhält (SU 700132). Alle oben
beschriebenen Techniken dienen dazu, die Aggregatbildung in einer hochkonzentrierten
Immunglobulinlösung polyklonaler Antikörper zu verhindern. In keiner der Schriften wird
jedoch erwähnt oder diskutiert, daß die Antigen-Bindungsaktivität der polyklonalen
Antikörper infolge der Gefriertrockhungsbehandlung abnimmt. Andererseits pflegt man
monoklonale Antikörper mit relativ niedriger Konzentration aufzubewahren oder
gefrierzutrocknen. Doch selbst bei solch niedriger Konzentration bleibt immer noch das
Problem, daß sowohl der monoklonale Antikörper während der Gefriertrocknung denaturiert
als auch, daß seine Antigen-Bindungsaktivität abnimmt. Bisher wurde noch nicht festgestellt,
ob der zur Verhinderung der Aggregatbildung von Immunglobulinen eingesetzte
Gelatinezusatz zur Lösung dieses Problems beiträgt oder nicht.
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Auf der anderen Seite ist weithin bekannt, daß man Carboxylsäuren und ihre Salze als
Pufferkomponente zur Aufrechterhaltung des pH-Werts verschiedener Proteinlösungen
einsetzt. Beispielsweise wird in der WO 89/11298 der Zusatz von Maltose, Natriumchlorid
oder Natriumphosphat als Stabilisator zu einer Ausgangslösung von monoklonalen
Antikörpern offenbart, um die Bildung von Aggregaten in der Lösung zu verhindern, die dann
ausfallen. Dort wird auch die Verwendung von Natriumcitrat anstelle von Natriumohosphat
als Pufferkomponente erwähnt. Es wird jedoch lediglich die Technik angezeigt, die
Aggregatbildung in der Ausgangslösung von monoklonalen Antikörpern während der
Lagerung zu verhindern, keineswegs wird jedoch ein Arbeitsverfahren zur Gefriertrocknung
monoklonaler Antikörper, ein Arbeitsverfahren zur Verhinderung der Denaturierung
monoklonaler Antikörper während der Gefriertrocknung und ein Arbeitsverfahren zur
Verhinderung der Abnahme der Antigen-Bindungsaktivität offenbart. In der WO 89/11297
wird als Stabilisator der Zusatz von Maltose zu einer Lösung von monoklonalen IgG-
Antikörpern, die gefriergetrocknet werden sollen, gelehrt und ferner der Zusatz von 5 - 10
mM Natriumacetat als Pufferkomponente, damit der pH-Wert der Lösung in den sauren
Bereich von 3 bis 6 zu liegen kommt. Es ist offensichtlich, daß Natriumacetat als Komponente
einer Pufferlösung eingesezt wird. Die WO 89/11297 sagt nichts darüber aus, daß
Carboxylsäure und deren Salze zusätzlich als Stabilisator wirken könnten, um die
Denaturierung von Antikörpern während des Gefriertrocknungsprozesses in dem pH-Bereich
zu verhindern, wo die Carboxylsäure oder ihre Salze keine Pufferwirkung ausüben. Bezüglich
des pH-Bereichs einer Antikörperlösung bleibt anzumerken: falls eine Antikörperlösung mit
niedrigem pH-Wert intravenös in einen Körper injiziert wird, verursacht sie an der
Injektionsstelle oft Schmerzen. Wird eine Antikörperlösung injiziert, ist es wünschenswert,
daß der pH-Wert ungefähr in den Neutralbereich zu liegen kommt. Eine solche Verwendung
einer Antikörperlösung im Neutralbereich wird jedoch in der WO 89/11297 nicht
vorgeschlagen.
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Zur Inaktivierung von Viren, welche die Immunglobuline bei ihrer Gewinnung aus Serum
oder Plasma kontaminieren können, werden Immunglobuline oft in Lösung erhitzt. Zu diesem
Zweck wird in den JP-A 62-292731, 61-194035, 61-191622 und 57-140724 der Zusatz von
Carboxylsäzren zur Globulinlösung offenbart. In JP-A 61-78730 und 61-78731 wird der
Zusatz von Natriumacetat zu Immunglobulinpräparationen sowie deren Erhitzen in trockenem
Zustand offenbart. Alle diese Schriften jedoch erwähhen lediglich den Zusatz von
Carboxylsäuren, um Immunglobulin-Präparationen während der Hitzebehandlung zu
stabilisieren. Bisher war nicht bekannt, ob Carboxylsäure und deren Salze einen Beitrag zur
Verhinderung der Denaturierung von Antikörpern während deren Gefriertrocknung zu leisten
vermögen und auch nicht, ob sie die Abnahme der Antigen-Bindungsaktivität infolge
Denaturierung verhindern können.
DER ERFINDUNG ZUGRUNDELIEGENDE AUFGABE
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Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, stabile gefriergetrocknete
Präparationen von monoklonalen Antikörpern zur Verfügung zu stellen, ohne daß die
monoklonalen Antikörper während ihrer Gefriertrocknung denaturiert sind und ohne daß die
Antigen-Bindungsaktivität infolge Denaturierung abgenommen hat.
LÖSUNG DER AUFGABE
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Eingehende Untersuchungen führten die Erfinder zu dem Ergebnis, daß Gelatine sowie
Carboxylsäuren oder deren Salze die Stabilisierung monoklonaler Antikörper während deren
Gefriertrocknung bewirken. Insbesondere wurde geflinden, daß durch Zusatz von Gelatine zu
einer Lösung mit zur Gefriertrocknung vorgesehenen Antikörpern sowohl eine Denaturierung
der monoklonalen Antikörper während ihrer Gefriertrocknung als auch eine Abnahme ihrer
Antigen-Bindungsaktivität verhindert werden kann, und daß durch Zusatz von
Carboxylsäuren oder deren Salzen zu einer Lösung mit zur Gefriertrocknung vorgesehenen
Antikörpern sowohl eine Denaturierung der monoklonalen Antikörper während ihrer
Gefriertrocknung als auch eine Abnahme ihrer Antigen-Bindungs-Aktivität infolge dieser
Denaturierung in einem weiten pH-Bereich, selbst bei einem pH-Wert außerhalb des
Pufferbereichs, verhindert werden kann. Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurde
geflinden, daß eine stabile und äußerst sichere Präparation von monoklonalen Antikörpern
möglich ist, was dann zu der Erfindung führte.
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Die Erfindung liefert speziell eine gefriergetrocknete Präparation, die monoklonale Antikörper
und Gelatine enthält. Die Herstellung erfolgt so, daß eine Lösung mit monoklonalen
Antikörpern, Gelatine und zusätzlich einer Carboxylsäure oder deren Salz gefriergetrocknet
wird, beispielsweise bei einem pH-Wert zwischen 6,1 und 8,1.
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Die vorliegende Erfindung wird nun im folgenden näher beschrieben.
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Für die vorliegende Erfindung brauchbare Antikörper können beliebige Antikörper sein, wie
sie ganz allgemein aus Menschen, Mäusen, Ratten u.a. erhalten werden, wobei weder deren
Ursprung noch die Mittel zur Gewinnung speziell angegeben sind. Beispielsweise können die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper aus einem Überstand einer Kultur
erhalten werden, wie er bei der Kultur von Antikörper produzierenden Zellen anfällt, die nach
bekannten Verfahren, wie z.B. der Zellfusions- oder Transformationsmethode gewonnen
wurden, oder indem Zellen kultiviert werden, in welche ein geklontes Antikörpergen
eingebracht worden ist, oder aus dem Ascites usw. der Maus, in welchen solche Antikörper
produzierenden Zellen transplantiert worden sind. Um die aus einem solchen
Zellkulturüberstand oder einem Ascites der Maus oder ähnlichem erhaltenen monoklonalen
Antikörper zu reinigen, sind verschiedene Reinigungsverfahren einsetzbar, wie z.B. das
Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration,
Ultrazentrifugation, Adsorptionschromatographie und hydrophobe Chromatographie. Die
Immunglobulin-Klassen der erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörper sind
überwiegend IgG, IgM, IgA und IgE, sie werden jedoch nicht speziell angegeben.
Monoklonale Antikörper einer jeden Immunglobulin-Klasse können erfindungsgemäß
eingesetzt werden. Insbesondere ist IgM weniger stabil als die Vertreter der anderen
Immunglobulin-Klassen. Daher läßt sich das bei monoklonalen Antikörpern der IGM-Klasse
wirksame Stabilisierungsverfahren leicht bei monoklonalen Antikörpern anderer
Immunglobulin-Klassen einsetzen. In der vorliegenden Erfindung können Antikörper sowohl
eines einzelenen Klons als auch problemlos einer Mischung aus vielen verschiedenen Klonen
eingesetzt werden.
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Gelatine kann in zwei Typen (Neutraltyp und saurer Typ) unterteilt werden, je nach den
Herstellungsverfahren, deren isoelektrischer Punkt voneinander verschieden sind. Beide
können in der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen. Darüber hinaus können auch
modifizierte Gelatine, wie z.B. Oxypolygelatine oder modifizierte flüssige Gelatine verwendet
werden.
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Als Carboxylsäure sind beispielsweise Citronensäure, Essigsäure, Oxalsäure, Bemsteinsäure
und Fumarsäure einsetzbar. Citronensäure ist bevorzugt. Als Salz der Carboxylsäure können
beispielsweise Natriumcitrat, Kaliumcitrat, Natriumacetat, Kaliumacetat, Natriumoxalat,
Kahumoxalat, Natriumsuccinat, Kaliumsuccinat, Natriumfiimarat und Kahumfümarat
verwendet werden. Natriumcitrat ist bevorzugt.
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Zur Stabilisierung der monoklonalen Antikörper oder zur pH-Wert-Einstellung wird die zu
lyophilisierende monoklonale Antikörper enthaltende Lösung isotonisch gemacht und
gepuffert, wobei zusätzlich zu Gelatine oder Carboxylsäure oder deren Salzen ein
anorganisches Salz, Monosaccharid, Disaccharid, Zuckeralkohol oder eine Aminosäure
zugegeben werden können.
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Als anorganisches Salz können beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid und
Magnesiumchlorid verwendet werden. Natriumchlorid ist bevorzugt.
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Als Monosaccharid können beispielsweise Glucose, Mannose, Galactose und Fructose
verwendet werden. Glucose oder Mannose sind vevorzugt.
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- Als Disaccharid können beispielsweise Maltose, Sucrose und Lactose verwendet werde.
Maltose oder Sucrose sind bevorzugt.
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Als Zuckeralkohol können beispielweise Sorbit und Mannit eingesetzt werden. Mannit ist
bevorzugt.
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Als Arninosäure können beispielsweise Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin,
Phenylalanin, Serin, Threonin, Glutamin, Glutaminsäure, Asparagin, Asparaginsaure,
Arginin, Lysin, Histidin, Prolin, Tryptophan, Methionin und Cystein eingesetzt werden.
Glycin und Arginin sind bevorzugt.
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Zur Herstellung einer gefriergetrockneten Präparation der vorliegenden Erfindung kann eine
Gelatine und Carboxylsäure oder deren Salz enthaltende Lösung von monoklonalen
Antikörpern gefriergetrocknet werden. Vorzugsweise wird eine Lösung von monoklonalen
Antikörpern zu einem Gelatine und Carboxylsäure oder deren Salz enthaltenden Puffer mit
eingestelltem pH zugegeben; oder Gelatine und Carboxylsäure oder deren Salz wird einer
monoklonale Antikörper enthaltenden Lösung zugesetzt. Die Konzentration der monoklonalen
Antikörper in der erfindungsgemäß zu verwendenden Lösung beträgt 0,01 mg/ml bis 50
mg/ml, vorzugsweise 0,1 mg/ml bis 10 mg/ml. Die Menge an zugesetzter Gelatine beträgt
1/100 bis 100 Gew.-Teile zu einem Gew.-Teil an monoklonalen Antikörpern. Vorzugsweise
beträgt sie 1/10 bis 10 Gew.-Teilen zu einem Gew.-Teil derselben. Die Konzentration an
zuzusetzender Carboxylsäure oder deren Salz beträgt 2 mM bis 500 nim, vorzugsweise 10
mM bis 200 mM.
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Wenn Gelatine zugesetzt wurde, liegt der pH-Wert der Lösung von gefrierzutrocknenden
monoklonalen Antikörpern im Bereich von 4,0 bis 8,1. Wird auch Carboxylsäure zugesetzt,
liegt er im Bereich von 6,1 bis 8,1, vorzugsweise von 6,5 bis 7,8.
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Die Einstellung des pH-Werts der Lösung kann über organische Säuren, anorganische Säuren,
anorganische Salze oder andere Verbindungen erfolgen, die im allgemeinen zur pH-
Werteinstellung verwendet werden, einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren
derselben. Als einsetzbare Verbindung für eine derartige pH-Werteinstellung seien
beispielhaft Citronensäue, Natriumcitrat, Kaliumcitrat, Phosphorsäure, Natriumphosphat,
Kaliumphosphat, Salzsäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Essigsäure, Natriumacetat,
Kaliurnacetat, Natriumhydroxid, Borsäure, Natriumborat und Kahumborat genannt. Die
Konzentration der Puffer zum Auflösen der monoklonalen Antikörper liegt zwischen 5 mM
und 500 mM, vorzugsweise zwischen 10 und 500 mM. Wie oben bereits ausgeführt, können
Cyrboxylsäuren und ihre Salze auch zur Einstellung des pH-Werts einer monoklonale
Antikörper enthaltenden Lösung eingesetzt werden und der oben angegebene Gehalt der Säure
oder ihres Salzes bestimmt den Gesamtengehalt in der Lösung, einschließlich des Gehalts zur
Einstellung des pH-Werts.
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Die so hergestellte Lösung aus monoklonalen Antikörpern kann recht stabil sein, wenn sie
direkt, so wie sie vorliegt, gefriergetrocknet wird. Es ist auch möglich ein Tensid wie Tween
20 oder Tween 80, Human- oder Rinderalbumin, oder einen Chelatbildner wie EDTA
zuzusetzen, um die Lösung isotonisch zu machen oder das Anhaften der monoklonalen
Antikörper an dem die Lösung enthaltenden Behälter zu verhindern.
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Das Gefriertrocknen der Lösung aus monoklonalen Antikörpern kann nach jedem gewöhnlich
bekannten Verfahren erfolgen, wobei die Trocknungstemperatur und das verfahrensmäßig
angelegte Vakuum sorgfältig auszuwählen sind.
BEISPIELE
Als nächstes wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele erläutert, die sie
jedoch nicht einschränken. IGM dient in der vorliegenden Erfindung beispielhaft als
monoklonaler Antikörper. Dies geschieht deshalb, weil, wie oben bereits angeführt, IgM eine
geringere Stabilität als ein Antikörper anderer Immunglobulin-Klassen aufweist (z.B. IgG,
IgA, und IgE) und daher der für IgM nachzuweisende stabilisierende Effekt leicht auf
Antikörper anderer Immunglobulin-Klassen anwendbar ist.
Beispiel 1:
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Zellen der mit dem Epstein-Barr-Virus (EB-Virus) transformierten Zelllinie MP-5038 (FERM
BP- 1596), die einen gegenüber dem Serogruppe E von Pseudomonas aeruginosa reaktiven
IgM-Antikörper produzieren, wurden kultiviert und aus dem Kulturüberstand durch Aussalzen
mit Ammoniurnsulfat, Gelfiltration mit Sephacryl S-300 (Pharmacia Co.) und
Säulenchromatographie mit einer Hydroxyapatit-HPLC-Säule (Mitsui Toatsu Chemicals, Inc.)
und Sepharose-Blau (Pharmacia Co.) menschliche monoklonale Antikörper gereinigt. Die mit
diesen Verfahren erhaltene Präparation von monoklonalen Antikörpern wies eine Reinheit
von 99% und darüber auf, wie mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und HPLC mit
einer Gelfiltrationssäule nachgewiesen werden konnte. Die monoklonalen Antikörper wurden
in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem eingestellten pH von
7,4 (im folgenden als PBS bezeichnet) gelöst und lagen schließlich in einer Konzentration von
0,1 g/ml vor. Andererseits wurde Gelatine (High-grade-Gelatine; Nippi Co., Typ A
(Neutralgelatine) und Typ B (saure Gelatine)) bis zu einer Endkonzentration von 0,001 bis 1%
zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde sodann in Gefrierröhrchen aus Polypropylen (Corning
Co.) von einem Volumen von 2 ml jeweils in Mengen von 0,5 ml unter sterilen Bedingungen
eingetragen und darin bei -80ºC eingefroren. Diese wurden sodann im Vakuum
gefriergetrocknet. Nach dem Trocknen wurde dieselbe Menge an für Injektion geeignetem
Wasser wie vor der Lyophilisation zu dem gefriergetrockneten Produkt gegeben, so daß sich
das Produkt auflöste. Die Antigen-Bindungsaktivität der monoklonalen Antikörper in der
erhaltenen Lösung wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt.
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(Verfahren zum Messen der Antigen-Bindungs-Aktivität)
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Die Bestimmung der Antigen-Bindungsaktivität der Anti-Pseudomonas aeruginosa-
Antikörper wurde folgendermaßen durchgeführt. Ein Lipopolysaccharid, wie es nach dem
Verfahren von Tanabe und Mitarbeitern (Menekijikkensousahou C, (1978)1793 - 1801) aus
mit Formalin abgetöteten Zellen des Gruppe E-Serotyps von Pseudomonas aeruginosa ATCC
27581 gewonnen wurde, wurde in PBS bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und
mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) auf das 500-fache verdünnt. Die so verdünnte Lösung
wurde sodann in Vertiefungen einer aus 96 Vertiefungen bestehenden EIA-Platte
(Immulon-600; Greiner Co.) in Mengen von jeweils 50ul/Vertiefung gegeben. Die Platte wurde über
Nacht bei 4ºC zum Überschichten stehen gelassen und sodann mit 0,05% Tween 20
enthaltender PBS (im Folgenden als "Waschlösung" bezeichnet) gewaschen. Eine 0,5%
Rinderserumalbumin enthaltende PBS (im Folgenden als "Blockierungslösung" bezeichnet)
wurde in jede Vertiefung jeweils in einer Menge von 200 ul gegeben und die Platte sodann
bei Raumtemperatur eine Stunde lang geschüttelt, so daß die unspezifischen Bindungsstellen
für Protein abgesättigt wurden. Nach Entfernung der Blockierungslösung wurden die
Lösungen einer zu untersuchenden Probe jeweils mit einer im Vergleich mit einer bestimmten
Konzentration mehrfach verdünnten Konzentration jeweils in Mengen von 100ul in die
Vertiefungen gegeben und die Platte wurde sodann 2 Stunden bei Raumtemperatur
geschüttelt. Nach viermaligem Waschen mit der Waschlösung wurde ein mit Peroxidase
markierter Anti-Human-IgM-Antikörper von Ziegen (Tage Co.) 1000-fach mit der
Blöckierungslösung verdünnt und in jede Vertiefung jeweils 100ul eingetragen und die Platte
sodann bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Nach viermaligem Waschen mit
Waschlösung und sodann einmal mit 0,1 M Citratpuffer (pH 4,0) wurde eine 1 mg/ml 2,2'-
Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) und 0,003% Wasserstoffperoxid im selben
Puffer enthaltende Substratlösung in jede Vertiefung jeweils in einer Menge von 50 ul
gegeben und die Platte sodann bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 30 Minuten wurde 2%
Bemsteinsäure zu jeder Vertiefung jeweils in einer Menge von 50 ul zugesetzt, so daß darin
die enzymatische Reaktion angehalten wurde. Die Absorption bei 414 nm wurde mit einem
Lesegerät für 96 Vertiefungen (Nippon Intermed Co.) bestimmt. Mit dem reziproken Wert
aus Verdünnung plus Absorption zu Verdünnung wurde eine doppeltlogarithmische
Auftragung vorgenommen, wobei für die Absorption 0,1 als Wert für die Antigen-
Bindungsaktivität der untersuchten Probe erhalten wurde.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben, und zwar die relative Aktivität, bezogen auf
den Wert 10 als Maß für die Antigen-Bindungsaktivität der Probe vor dem Einfrieren. Dort,
wo ein monoklonaler Antikörper ohne Zusatz von Gelatine lyophilisiert wurde, nahm die
Antigen-Bindungsaktivität deutlich ab. Im Gegensatz dazu blieb dort, wo Gelatine zugesetzt
worden war, die Antigen-Bindungsaktivität selbst beim gefriergetrockneten Produkt erhalten,
wobei die Wirkung von der zugesetzen Gelatinekonzentration abhing.
Tabelle 1
Beispiel 2:
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Der gleiche monoklonale Antikörper wie in Beispiel 1 wurde in verschiedenen Puffern mit
jeweils unterschiedlichem pH gelöst, so daß jeweils eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml
erhalten wurde. Andererseits wurde jeweils neutrale Gelatine bis zu einer Konzentration von
0,01% zugesetzt. Jeweils 0,5 ml einer jeden Charge wurden unter sterilen Bedingungen in ein
Gefrierröhrchen aus Polypropylen gegeben und bei -80ºC eingefroren. Diese Chargen wurden
sodann im Vakuum gefriergetrocknet. Dieselbe Menge an für Injektion geeignetem Wasser
wie vor der Lyophilisation wurde zu dem gefriergetrockneten Produkt gegeben, so daß sich
das Produkt auflöste und die Antigen-Bindungsaktivität des monoklonalen Antikörpers in der
erhaltenen Lösung wurde bestimmt.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben, und zwar die relative Aktivität, bezogen auf
den Wert 10 als Maß für die Aktivität der Probe vor dem Einfrieren. Bei jedem pH-Wert blieb
die Antigen-Bindungsaktivität gut erhalten.
Tabelle 2
Beispiel 3:
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0,1 mg/ml als Endkonzentration des gleichen monoklonalen Antikörpers wie in Beispiel 1
wurden in PBS gelöst. Zusätzlich wurde neutrale Gelatine bis zu einer Endkonzentration von
0,003% zugesetzt und weiterhin wurde Glucose, Sucrose, Mannit, Glycin oder Arginin bis zu
einer Endkonzentration von 0,001 bis 0,1% zugegeben. Jeweils 0,5 ml der erhaltenen Lösung
mit monoklonalen Antikörpern wurde sodann in Polypropylen-Gefrierröhrchen unter sterilen
Bedingungen gegeben und darin bei -80ºC eingefroren. Im Vakuum wurde gefriergetrocknet.
Dieselbe Menge an für Injektion geeignetem Wasser wie vor der Lyophilisation wurde zu dem
gefriergetrockneten Produkt gegeben, so daß sich das Produkt auflöste und die Antigen-
Bindungsaktivität des monoklonalen Antikörpers in der erhaltenen Lösung wurde bestimmt.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben, und zwar die relative Aktivität, bezogen auf
den Wert 10 als Maß für die Aktivität der Probe vor dem Einfrieren. Die Antikörperaktivität
blieb, je nach Konzentration, bei allen niederrnolekularen Substanzen erhalten.
Tabelle 3
Beispiel 4:
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0,1 mg/ml als Endkonzentration des gleichen monoklonalen Antikörpers wie in Beispiel 1
wurden in PBS gelöst. Zusätzlich wurde neutrale Gelatine bis zu einer Endkonzentration von
0,003% zugesetzt und weiterhin wurden bis zu einer Endkonzentrati6n von 0,5 oder 1%
Mannit zugegeben. Jeweils 0,5 ml der erhaltenen Lösung mit monoklonalen Antikörpern
wurden sodann in Polypropylen-Gefrierröhrchen unter sterilen Bedingungen gegeben und
darin bei -80ºC eingefroren. Im Vakuum wurde gefriergetrocknet. Dieselbe Menge an für
Injektion geeignetem Wasser wie vor der Lyophilisation wurde zu dem gefriergetrockneten
Produkt gegeben, so daß sich das Produkt auflöste und die Antigen-Bindungsaktivität des
monoklonalen Antikörpers in der erhaltenen Lösung wurde bestimmt.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben, und zwar die relative Aktivität, bezogen auf
den Wert 10 als Maß für die Aktivität der Probe vor dem Einfrieren. Die Antigen-
Bindungsaktivität blieb bei allen gefriergetrockneten Produkten erhalten, wobei jedes eine
andere Konzentration an Mannit aufwies.
Tabelle 4
Beispiel 5:
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0,1 mg/ml als Endkonzentration des gleichen monoklonalen Antikörpers wie in Beispiel 1
wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, welcher neutrale Gelatine (0,01%),
Natriumcitrat (0,02 M), Mannit (0,5%) und Natriumchlorid (0,05 M) enthielt. Die erhaltene
Lösung von monoklonalen Antikörpern wurde sodann unter sterilen Bedingungen jeweils in
einer Menge von 1 ml in Glasfläschchen von 10 ml (Iwaki Glass Co.) gegeben und darin bei
-80ºC eingefroren. Im Vakuum wurde gefriergetrocknet. Dieselbe Menge an für Injektion
geeignetem Wasser wie vor der Lyophilisation wurde zu dem gefriergetrockneten Produkt
gegeben, so daß sich das Produkt auflöste und die Antigen-Bindungsaktivität des
monoklonalen Antikörpers in der erhaltenen Lösung wurde bestimmt. Als Ergebnis wurde
gefunden, daß die gefriergetrockneten Produkte aus monoklonalen Antikörpern die gleiche
Antigen-Bindungsaktivität aufwiesen wie die Proben vor dem Einfrieren.
VORTEIL DER ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß läßt sich durch Zusatz von Gelatine und wahlweise einer Carboxylsäure
oder deren Salz zu einer gefrierzutrocknenden, monoklonale Antikörper enthaltenden Lösung
die Denaturierung der monoklonalen Antikörper während der Gefriertrocknung ziemlich
verhindern, so daß eine Präparation von gefriergetrockneten monoklonalen Antikörpern mit
stabiler Antigen-Bindungsaktivität verfügbar ist. Die vorliegende Erfindung ist auf
monoklonale Antikörper jeder Immunglobulin-Klasse anwendbar, unter Einschluß von IgG,
IgM, IgA und IgE. Insbesondere ist sie zur Verwendung von instabilen IGM geeignet. Die
vorliegende Erfindung ist gut durchfürbar mit monoklonalen Antikörpern von Mensch, Maus
und Ratte. Die Zahl für die in der erfindungsgemäß gefriergetrockneten Präparation enthalten
Arten von monoklonalen Antikörpern kann eins oder größer sein.
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Die monoklonale Antikörper enthaltende, gefriergetrocknete Präparation der vorliegenden
Erfindung kann, wie andere Immunglobulinpräparationen, als Verabreichungsmittel bei der
passiven Immunisierung zur Vorbeugung und Behandlung bakterieller und viraler
Infektionskrankheiten verwendet werden.