DE69222840T2

DE69222840T2 - Verfahren zur herstellung von untereinheisimpfstoff gegen schweinparvovirus

Info

Publication number: DE69222840T2
Application number: DE69222840T
Authority: DE
Inventors: Alvarez Jose Casal; Valdes Elena Cortes; Kristian Dalsgaard; Casares Ana Ranz; Olmo Carmen Vela
Original assignee: Inmunologia y Genetica Aplicada SA
Current assignee: Inmunologia y Genetica Aplicada SA
Priority date: 1991-03-26
Filing date: 1992-03-26
Publication date: 1998-05-14
Anticipated expiration: 2012-03-27
Also published as: EP0551449A1; EP0551449B1; DE69222840D1; US5498413A; ES2026827A6; ATE159547T1; DK0551449T3; AU1537792A; WO1992017589A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Virusproteine und Tests und Impfstoffe, welche die nämlichen verwenden, und insbesondere ein mit dem Hauptantigen (VP2) des Parvovirus Porcino (PPV)-Kapsid verwandtes Protein. Ein derartiges Protein wurde in einem Expressionsvektor von Baculoviren, die in einer Zellkultur eines permissiven Wirts vermehrt wurden, erzeugt. Das bei der vorliegenden Erfindung erhaltene Protein ist singulär dadurch gekennzeichnet, daß es leere chimäre Kapside ausbildet, die bei der Impfstoff-Formulierung von Nutzen sind.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Parvovirus Porcino (PPV) verursacht Fortpflanzungsstörungen bei Schweinen, was zu Tod und Fetusmumifizierung, Totgeburten und anderen Fortpflanzungsstörungen bei trächtigen Sauen führt. (Joo & Johnson, 1976. Veterinary Bulletin 46, 653-660; Mengeling. 1978. J.Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294). PPV ist ein autonomes Parvovirus, das ein Einzelstrang-DNA (DNS)-Molekul von näherungsweise 5000 Nucleotiden enthält (Mollitor et al. 1984, Virology 137, 241-254). Die vollständige Sequenz dieses Genoms wurde vor kurzem von unserer Gruppe beschrieben (Ranz et al. 1989. J. Gen. Virol. 70, 2541-2553). Es wurden vier virusspezifische Proteine beschrieben: drei Kapsidproteine (VP1, VP2 und VP3 mit MG (Molekulargewicht)-Werten von 83000, 64000 bzw. 60000 Dalton) und ein nicht-strukturelles Protein NS1.
Das PPV ist verwandt mit der Kilham-Rattenvirus (KRV)-Gruppe autonomer Parvoviren, die gebildet wird von KRV, Mäuse-Minute Virus (MVM), LuIII, H-1, Katzen-Panleukopenia-Virus (FPV), Hunde-Parvovirus (CPV) und dem Nerz-Enteritus-Virus (MEV). Diese Viren teilen mehrere gemeinsame Merkinale mit anderen autonomen Parvoviren:
1. Es gibt zwei große offene Leserahmen (open reading frames, ORFs).
2. Die mRNAs (mRNs) beider ORFs sind polyadenyliert und 3'-coterminal.
3. Der linke ORF codiert Nicht-Kapsid-Proteine, die für die Virus-DNA-Replikation notwendig sind, und der rechte ORF codiert die Hauptkapsidproteine als einen zusammenhängenden Satz.
Bis jetzt gibt es mehrere vor Parvovirus Porcino-Krankheit schützende Impfstoffe, die auf konventionellen Inaktivierungsverfahren des Virus basieren. Jedoch alle früheren Versuche einer Herstellung neuer Impfstoffe unter Verwendung rekombinanter Proteine, die in prokaryotischen Mikroorganismen (z.B. E.coli) erzeugt werden, schlugen fehl. Bei dieser Erfindung wird ein neues Verfahren beschrieben zur Erhaltung einer neuen Art von Impfstoffen auf der Basis der immunogenen Eigenschaften des Hauptproteins VP2, das in einem Baculovirus-System, das in einer Zellkultur eines permissiven Wirts vermehrt wird, exprimiert wird. In den letzten Jahren hat unser Labor sehr genau die molekulare Biologie des PPV studiert. Die so erhaltenen Erkenntnisse sind in zwei weg bereitenden Veröffentlichungen zusammengefaßt:
- A. Ranz, J.J. Manclus, E. Dìaz Aroca, J.I. Casal. 1989. Porcine Parvovirus: DNA sequence and genome organization. J. Gen. virol. 70, 2541-25463.
- 3.1. Casal, E. Dìaz, A. Ranz, 3.3. Mandus. 1990. Construction of an infectious genomic done of PPV. Effect of the 5' end on DNA replication. Virology 177, 764-767.
Diese Veröffentlichungen befassen sich mit dem Wissen über die Virus- DNA-Sequenzen, welche die das Viruskapsid bildenden Proteine codieren. Diese Sequenzen erlaubten die Identifrzierung des Gens, welches das VP2 des PPV kodiert, und seine Manipulation und Insertion in die spezifischen Vektoren, um in dem Baculovirus-System exprimiert zu werden. Dieses System erlaubt eine Protein-Erzeugung im großen Maßstab auf der Basis der Replikation von rekombinantem Baculovirus, das von dem Kern des Polyhidrosisvirus Autographa Californica (Ac- MNPV) stammt, in Insektenzellkulturen. Der Stand der Technik für diese Vektoren wird in zwei wissenschaftlichen Veröffentlichungen wie folgt zusammengefaßt:
1. Luckow, V.A. & Summers, M.D. 1988. Trens in the development of baculovirus expression vectors. Bio/Technology 6, 47-55.
2. Vialard et al. 1990. Synthesis of the membrane fusion and hemagglutinin proteins of Measles virus using a novel baculovirus vector containing the β-galactosidase gen. J. Virol. 64, 37-50.
Die Vorteile der VP2-Proteinsynthese in einem Baculovirus-Vektor gegenüber der Virusproduktion in Zellkultur und nachfolgender Reinigung sind beträchtlich hinsichtlich der wirtschaftlichen Kosten des Verfahrens und des Ertrags an immunogenem Antigen. Andererseits vermeidet diese Erfindung das Opfern von Tieren zur Erstellung von Primärzellkulturen zur Virusreplikation, um Virusbestände zu erhalten, und die übliche Gefahr bei der Handhabung von Viren, etc.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren vor zur Herstellung eines rekombinanten Untereinheit-Impfstoffs zum Schützen von Schweinen vor PPV. Der neue, auf diese Weise hergestellte Impfstoff enthält leere chimäre PPV-VP2-Kapside, die bestehen aus selbst zusammengefügten (autoassembled) rekombinanten PPV-VP2-Proteinen, die in permissiven Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus mit der für das PPV-VP2-Protein codierenden DNA-Sequenz infiziert sind, exprimiert werden. Das rekombinante PPV-VP2-Protein wird hierin im folgenden manchmal als "VP2 hiervon" bezeichnet.
Das VP2-Protein hiervon ist singulär dadurch gekennzeichnet, daß es leere chimäre Kapside bildet, die gewünschtenfalls durch genetische Manipulation der rekombinanten Baculoviren oder chemische Manipulation der chimären Kapside andere Virusprotein-Epitope einbauen. Aufgabe der Erfindung ist daher ein neues Verfahren zum Erhalten eines neuen, verbesserten Untereinheit-Impfstoffes, der in der Lage ist, Schweine vor PPV-Infektionen zu schützen. Wie vorangehend ausgeführt, enthält der Impfstoff leere chimäre Kapside, die von dem VP2- Protein hiervon gebildet werden, ebenso wie die leeren Kapside eine gesteigerte Hämagglutinations-Aktivität besitzen und hochgradig immogen sind, wobei sie andere rekombinante Proteine dieser Viren, die hierzu in irgendeinem anderen Vektor erzeugt wurden, übertreffen. Die neuen Impfstoffe, die die Erfindung bereitstellt und die eine ihrer Aufgaben darstellen, enthalten die leeren Kapside mit einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel, mit oder ohne einem Adjuvans.
Da die besagten chimären Kapside chemisch oder genetisch manipuliert werden können, um in sie andere, nicht verwandte Virusproteine oder Viruspeptid-Epitope einzuführen, sind die Verwendung der besagten Kapside für PPV-Impfzwecke, und Modifizierung unter Auffnahme anderer Epitope, wodurch ein polyvalenter Impfstoff bereitgestellt wird, weitere zusätzliche Aufgaben dieser Erfindung.
Die von der Erfindung bereitgestellten chimären Kapside können nützlich sein bei der Diagnose zum Nachweis der Anwesenheit von PPV- spezifischen Antikörpern oder zum Induzieren polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, die zum PPV-Nachweis in der Lage sind. Die Verwendung der chimären Kapside für die obengenannten Zwecke ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Eine zusätzliche Aufgabe dieser Erfindung ist ein rekombinantes Baculovirus und das Verfahren zur Erhaltung desselben, das in der Lage ist, ein rekombinantes PPV-VP2-Protein zu erzeugen, das mit dem Virusprotein identisch ist, wie es in Antigenreaktivitätstests und anderen biologischen Funktionalitättests gezeigt wird. Das rekombinante Baculovirus wurde AcMNPV.pPPVEx8 genannt und am 2.3.1991 bei der European Collection of Animal Cell Cultures, (ECACC) in Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG (Großbritannien) eingereicht, Hinterlegungsnummer V91030213.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist der neue Baculovirus-Transfervektor (pPPVeX8), der die für das VP2 hiervon codierende Nucleinsäuresequenz enthält. Mit einem als homologe Rekombination bekannten Verfahren mit dem Genom des AcMNPV-Wildtyps führt dieser neue Vektor zu dem rekombinanten AcMNPV.pPPVEx8-Baculovirus.
Diese Erfindung offenbart auch die für das VP2-Protein der Erfindung codierende Nucleinsäuresequenz (Fig. 1).
Die leeren chimären PPV-Kapside, die gebildet wurden durch Selbstverkuüpfüng (autoassembly) der rekombinanten PPV-VP2-Proteine, die in permissiven Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus mit der für das PPV-VP2-Protein codierenden DNA-Sequenz infiziert wurden, exprimiert wurden, sind noch eine weitere Aufgabe der Erfindung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz, die für das VP2 hiervon codiert, und die Aminosäuresequenz davon. Die Nucleotidsequenz ist in 5'T3'-Richtung von links nach rechts gezeigt. Die Aminosäuren wurden unter Verwendung des allgemein akzeptierten Drei-Buchstaben-Codes bezeichnet.
Fig. 2 zeigt den Aufbau des pPPVEx8-Transfervektors unter Darlegung der geeigneten Manipulationen zur Insertion des PPV-VP2-Gens in das PJVP 10Z-Plasmid.
Fig. 3 zeigt die Anwesenheit leerer chimärer Kapside, die durch Aggregation des VP2-Proteins hiervon gebildet wurden, wie sie unter einem Elektronenmikroskop beobachtet wurden.
Fig. 4 zeigt die durchschnittlichen Antikörpertiter-Werte von Seren von Schweinen, die zweimal mit 3µg leeren chimären PPV-Kapsiden mit den Hilfsstoffen Alhydrogel + QuilA immunisiert wurden.
Der Antikörpertiter wurde gemessen durch:
A) ELISA anti-PPV-Viruspartikel ( - ).
B) PPV-Hämagglutinationshemmtest (HI) ( - ).
C) PPV-Neutralisierung ( - ).
Fig. 5 zeigt die Antikörpertiter-Werte gegen PPV, die durch ELISA bei trächtigen Sauen, die mit chimären PPV-Kapsiden geimpft ( , ) und nicht geimpft ( ) waren, wobei alle von ihnen mit einem virulenten PPV-Stamm erregt wurden, erhalten wurden.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung schafft ein neues Verfahren zur Erhaltung eines rekombinanten Untereinheit-Impfstoffs, der dazu dient, Schweine gegen Infektionen aufgrund von Parvovirus Porcino zu schützen. Der Impfstoff enthält leere chimäre PPV-VP2-Kapside, die bestehen aus selbstverkuüpften rekombinanten PPV-VP2-Proteinen, die in permissiven Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus mit der für das PPV-VP2-Protein codierenden DNA-Sequenz infiziert wurden, exprimiert wurden.
Die Erfindung schafft auch ein rekombinantes Baculovirus, das in der Lage ist, das PPV-VP2 zu exprimieren, wenn es in einen permissiven Wirt übertragen wird, und das Verfahren zum Erhalten des rekombinanten Baculovirus.
Das Erhalten des rekombinanten Baculovirus weist grundlegend die folgenden Schritte auf:
a) Herstellen des für das PPV-VP2 codierenden Gens;
b) Insertion des VP2-Gens in einen Baculovirus-Transfervektor;
c) Transfektion von permissiven Wirtszellen mit dem Baculovirus-Transfervektor, der das VP2-Gen enthält; und
d) Selektion des rekombinanten Baculovirus, das das PPV- VP2-Protein exprimiert.
Das so erhaltene rekombinante Baculovirus und die erzeugten Proteine und Kapside werden zusätzlich gekennzeichnet. Diese Schritte werden hierin im folgenden detailliert beschrieben werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das für das PPV-VP2- Protein codierende Gen erhalten aus dem früher in unserem Labor hergestellten Plasmid pPPV 15, das die für VP2 codierenden Sequenzen enthält, und eingesetzt in die einzigartige (unique) Klonierungsstelle Nhe1 des von AcMNPV abgeleiteten Plasmids pJVP10Z, um dadurch einen Baculovirus-Transfervektor zu erhalten. Bei unserer Erfindung erwies sich, daß der pPPVEx8-Vektor die PPV-DNA passend ausgerichtet enthält, um von dem AcMNPV-Virus-Polyederpromotor exprimiert zu werden.
Der pPPVEx8-Vektor wurde zur Co-Transfektion von permissiven Wirtzeilen mit der DNA des AcMNPV-Virus vom Wildtyp verwendet. Es konnte, unter anderem, Bezug genommen werden auf Zellen von Schmetterlingen oder ihrer Larven. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wurden Spodoptera frugiperda (S. frugiperda)- Zellen, im allgemeinen vom Sf9-Stamm, unter Verwendung von pPPVEx8 transfiziert, obwohl natürlich angenommen werden kann, daß bei der Transfektion anderer permissiver Zellen zur rekombinanten Baculovirus-Replikation ähnliche Ergebnisse erhalten wurden.
Nach der Transfektion wurden die rekombinanten Baculoviren nach dem Entfernen und Titrieren des in einer konfluierenden monomolekularen Schicht von S. frugiperda-Zellen erzeugten Überstands ausgewählt. Die blauen Platten ohne eine Spur des Viruspolyeders (viral polyhedrin) unter einem Lichtmikroskop wurden gesammelt und auf S. frugiperda- Zellen zurücktitriert, um die rekombinanten Baculoviren zu erhalten. Das rekombinante Baculovirus AcMNPV.pPPVEx8 ist in der Lage, das rekombinante PPV-VP2-Protein (VP2 hiervon) zu exprimieren und wurde bei der ECACC hinterlegt, Hinterlegungsnummer V91030213.
Ein Tupfen-Blot-Test wurde verwendet, um festzustellen, daß das VP2- Gen passend in das rekombinante Baculovirus-Genom eingebaut wurde.
Die Proteine, die von den mit dem rekombinanten Baculovirus infizierten S. frugiperda-Zellen exprimiert wurden, wurden analysiert durch Elektrophorese in 8 % bis 15 % SDS-Polyacrylamid-Gradientengelen und mit Coomassie-Blau gefärbt, um die Anwesenheit eines Proteins mit einem virtuellen Molekulargewicht von 64 kDa, das dem des Virus-VP2 in der Platte des rekombinanten Virus äquivalent ist, zu beobachten. Immunnachweis-Tests zeigten, daß die Anti-PPV polyklonalen Antiseren mit dem von dem rekombinanten Baculovirus exprimierten VP2 reagierten. Im Lichte dieser Ergebnisse kann gesagt werden, daß das VP2 hiervon, das von dem rekombinanten Baculovirus in S. frugiperda-Zellen exprimiert wurde, antigenisch von dem Virus-VP2 nicht unterscheidbar ist.
Das mit dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene VP2-Protein kann für Diagnosezwecke verwendet werden, um die Anwesenheit spezifischer PPV-Antikörper nachzuweisen, oder um polyklonale oder monoklonale Antikörper, die zum PPV-Nachweis in der Lage sind, zu induzieren. Sie können außerdem verwendet werden für die Immunisierung von Tieren gegen PPV. ELISA-Tests haben gezeigt, daß Seren immunisierter Tiere die Virus-Antigene erkannten, während Hämagglutinationshemmtests (HI) zeigten, daß Seren von Tieren, die mit dem mittels dieser Erfindung erhaltenen, gereinigten VP2-Protein immunisiert waren, HI-Titer von 1/320 boten, wenn 4HA-Einheiten an gereinigtem PPV als Antigen verwendet wurden. So kann man sagen, daß die Tiere, die mit dem mit unserem Verfahren erhaltenen VP2 immunisiert wurden, hochgradig geschützt sind.
Auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse kann das von dem rekombinanten Baculovirus-Vektor hiervon exprimierte VP2-Protein verwendet werden, um Impfstoffe zuzubereiten, um Schweine vor von PPV verursachten Infektionen zu schützen. Diese Impfstoffe können sowohl passiv als auch aktiv sein. Ein passiver Impfstoff könnte erhalten werden durch Immunisieren von Tieren mit dem rekombinanten und gereinigten VP2 hiervon, und dann Isolieren von polyklonalen Antikörpern von dem VP2, die dann gereinigt werden könnten, um bei therapeutischen oder prophylaktischen Anwendungen verwendet zu werden. Ein aktiver Impfstoff kann hergestellt werden durch erneutes Suspendieren des VP2 hiervon in einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel mit einem Adjuvans.
Vorstehend wurde dargelegt, daß das mit dem Verfahren dieser Erfindung erhaltene VP2-Protein insofern etwas besonderes ist, als es beim Arbeiten nach unseren Bedingungen aggregiert werden kann und, wie mittels Elektronenmikroskopie gezeigt wurde, leere chimäre Pseudovirus-Kapside von regelmäßiger und gleichmäßiger Struktur und mit einer Größe von etwa 22 nm ausbilden kann. Bisher hatte niemand die "in vitro"-Bildung von Pseudo-Viruskapsiden in Parvovirus Porcino unter Verwendung von nur dem VP2-Protein davon beschrieben. Dies erlaubt es, daß die erhaltenen rekombinanten VP2-Proteine leicht gereinigt werden können. Darüber hinaus haben die durch VP2-Zusammenfügung gebildeten leeren Kapside eine gesteigerte Hämagglutinationsaktivität und sind hochgradig immunogen, mehr als andere rekombinante PPV-Proteine, die bisher in anderen Vektoren erzeugt wurden. Die besagten Kapside können daher zubereitet werden zur Verwendung in Impfstoffen, die in der Lage sind, Tiere vor durch PPV verursachten Infektionen zu schützen. Allgemein gesagt, kann ein aktiver Impfstoff hergestellt werden durch Resuspendieren der Kapside in einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel, mit oder ohne ein Adjuvans. Ein wichtiges Merkmal dieser leeren chimären Kapside, das für einen Fachmann naheliegend sein könnte, ist, daß sie chemisch oder genetisch manipuliert werden können, um die Proteinepitope anderer Viren, vor denen geschützt werden soll, einzuführen, wodurch sie als ein polyvalenter Impfstoff wirken.
Phosphat-gepufferte Kochsalz (phosphate buffered sahne, PBS)-Lösungen oder andere kochsalzähnliche Lösungen könnten als ein immunologisch annehmbares Verdünnungsmittel verwendet werden. Das verwendete Adjuvans könnten Suspensionen von Aluminiumoxidgel oder andere Adjuvantien, die bei der Formulierung von Impfstoffen üblicherweise verwendet werden, sein.

GENAUE BESCHREIBUNG EINER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG (Beispiel)

1. Erhalten von rekombinanten Baculoviren die das PPV-VP2-Gen exprimieren

1.1 Herstellen des VP2-Gens des PPV

Das vollständige PPV-Genom wurde in unserem Labor erstmals in dem Bakterienplasmid pUC18 kloniert unter Erhaltung des Genom-Klons pPPV10. Der Aufbau dieses Genom-Klons wurde beschrieben in "Construction of an infectious genomic clone of Porcine Parvovirus: Effect of the 5'-end on DNA replication", Casal et al. 1990. Virology 177, 764- 767. Als Ausgangsmaterial verwendeten wir als ursprüngliches Virus den PPV-Stamm NADL-2, der erhältlich ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (USA), Hinterlegungsnummer ATCC-VR742.
Nach der Behandlung oder Manipulation wurde der Genom-Klon pPPV10 verwendet, um das Plasmid pPPVIS (Fig. 2) zu erhalten, das in einem DNA-Fragment von näherungsweise 1,9 kbp alle codierenden Sequenzen für PPV-VP2 enthält. Die Fremd-DNA wurde so eingefügt, daß dank einer BamHI-Restriktionsstelle ihre Extraktion in einem einzigen Schritt möglich war. Die eingefügte DNA von 1,9 kbp wurde mittels Elektrophorese in niedrig schmelzenden Agarosegelen isoliert und in einen PMTL-25-Vektor, der vorher dephosphoriliert und mit BamHI verdaut war, eingefügt.
Das so erhaltene Plasmid wurde pPPVI7 genannt. Es besaß die VP2 codierenden Sequenzen des PPV-Virus, die von zwei XbaI-Restriktionsstellen flankiert wurden.

1.2 Insertion des VP2-Gens in einen Baculovirus-Transfervektor

Der Plasmid-Vektor mit von AcMNPV abgeleiteter NheI-Stelle (Plasmid pJVP10Z), (Vialard, J. et al. J. Virol. 64, 37-50, 1990) war ein Geschenk von Dr. Chris Richardson (NRC, Quebec, Kanada) und wurde zum Klonieren des XbaI-Fragment verwendet, das aus dem Plasmid pPPV17 erhalten wurde, wie es in Fig. 2 beschrieben ist. Wie die besagte Figur zeigt, wurde das XbaI-Fragment von pPPVI7, das die VP2 codierende Sequenz von PPV enthielt, in die Nhei-Stelle von pJVP10Z eingefügt.
Die auf diese Weise erhaltenen Plasmide, die das VP2-Gen von PPV enthielten, wurden nach dem alkalischen Lyseverfahren (Birmboim & Doly. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523. 1979) gereinigt und mittels Restriktionsendonuklease-Kartierung charakterisiert.
Es zeigte sich, däß das rekombinante Plasmid pPPVEx8 das VP2-Gen von PPV in der richtigen Ausrichtung angeordnet hatte, um seine Expression durch den AcMNPV-Virus-Polyederpromotor zu erlauben.

1.3 Transfektion und Selektion von rekombinantem Virus

s. frugiperda-Zellen wurden nach dem von Burand et al. Virology 101. 286-290, 1980 beschriebenen Verfahren mit infektiösen DNA-Gemischen von gereinigter AcMNPV-DNA und pPPVEx8-Plasmid-DNA transfizierl. Gemäß Smith and Summers (Virology 123, 293-406, 1983) gereinigte AcMNPV-DNA (1 µg) wurde mit zwei unterschiedlichen Mengen an plasmidischer DNA (1 und 5 µg) gemischt und mit einer Hepesgepufferten Kochsalz-Lösung (25 mM Hepes, pH 7,1, 140 mM NaCl und 125 mM CaCl&sub2;) auf 750 µl gebracht. Die DNA-Lösung wurde durch Inokulation auf Monolayer-Kulturen von 2x10&sup6; S. frugiperda-Zellen übertragen und bei Raumtemperatur 4 Stunden lang inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und 5 ml eines Mediums, das 10% fetales Kälberserum enthielt, wurden hinzugefügt.
Nach 4 Tagen Inkubation wurde der Überstand gesammelt und auf konfluierende Monolayer von S. frugiperda-Zellen plattiert. Zur Verbesserung des Nachweises rekombinanter Platten wurde ein X-gal-blau- Indikator zu der Agarose hinzugefügt. Blaue Platten, die unter einem Lichtmikroskop keine Spuren von Okklusionskörpern (Viruspolyeder, viral polyhedrin) zeigten, wurden gesammelt und auf S. frugiperda- Zellen replattiert, um Stämme der rekombinanten Viren mit hohem Titer (10&sup7;&supmin;&sup8; pfu/ml (Plaque-bildende Einheiten/ml)) zu erhalten.
Der rekombinante Baculovirus wurde AcMNPV.pPPVEx8 genannt und bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Hinterlegungsnummer V91030213 hinterlegt.

2. Tuplen-Blot-Test

Ein Tupfen-Blot-Test wurde wie folgt durchgeflihrt, um zu bestimmen, ob das VP2-Gen in das rekombinante Baculovirus-Genom integriert worden war.
Um DNA von dem rekombinanten Baculovirus zu erhalten, wurden die S. frugiperda-Zellen mit dem besagten Virus mit einer Infektions-Multiplizität von 5 PFU/Zelle infiziert und bei 27ºC 48 Stunden lang inkubiert. Die infizierten Zellen wurden gesammelt, mit Schallwellen behandelt und bei 1000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde als Ausgangsmaterial für die Tests verwendet.
Ein Volumen von 100 µl wurde mit 10 µl 1M NaOH denaturiert, 5 Minuten gekocht und sofort auf Eis gebracht. Das Gemisch wurde mit 10 µl 1M PO&sub4;H&sub2;Na neutralisiert. Sofort wurde eine 20xSSC-Lösung hinzugefügt, um schließlich eine 6xSSC-Konzentration zu erhalten (SSC, Citrat-Kochsalz-Lösung).
Die Lösung wurde auf einen Nitrozellulose-Filter überführt, der vorher mit 6xSSC angefeuchtet worden war. Er wurde mit mehr 6xSSC gewaschen und bei 37ºC 30 Minuten lang getrocknet. Die DNA wurde unter einem UV-Licht 2 bis 3 Minuten lang an den Nitrozellulose-Filter fixiert. Die Membranen wurden dann mit einer spezifischen Probe der VP2-DNA-Region, die mit Phosphor 32 markiert war, bei 37ºC über Nacht hybridisiert. Danach wurde mit abnehmenden SSC-Lösungen gewaschen und eine Autoradiographie durchgeführt.
Ein starkes Hybridisierungs-Signal wurde nur in den Mulden, die Überstände der mit rekombinanten Viren infizierten Kulturen enthielten, beobachtet, was anzeigte, däß das VP2-Gen in das Virus-Genom integriert worden war.

3. Protein- und Immunnachweis-Analyse

S. frugiperda-Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovims infiziert mit einer Multiplizität von 5 PFU/Zelle und bei 27ºC 48h lang inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 1000 Upm, zwenmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalz (PBS)-Lösung von pH 7,4 gewaschen, und zu 1x10&sup6; Zellen/ml erneut suspendiert in Lyse-Puffer (5 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 % β- Mercaptoethanol und 17,4% Glycerol). Die Proben wurden zur Elektrophorese in 8 bis 15% SDS-Polyacrylamid-Gradientengele eingebracht und mit Coomassie-Blau gefärbt oder zum Immunnachweis auf Nitrozellulose-Membranen überführt. Das Coomassie-Blau zeigte in der Spur des rekombinanten Virus die hauptsächliche Anwesenheit eines Proteins mit einem Molekulargewicbt von 67 kDa, das dem des Virus-VP2 äquivalent ist.
Zum Immunnachweis wurden die Proteine in Übereinstimmung mit früher beschriebenen Verfahren (Burnette, Anal. Biochem. 112. 195- 203, 1981. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76.4350-4354. 1979) auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Die Protein-Übertragung wurde in einer PhastSystem (Pharmacy)-Vorrichtung durchgefährt. Im allgemeinen wurden 25 mA/Gel 10 bis 15 Minuten lang angewendet. Die Nitrozellulose-Streifen wurden mit 3 % pulverförmiger Magermilch in 20 mM Tris-HCl mit pH 7,5, 500 mM NaCl (TBS) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Streifen wurden dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem ersten Anti-PPV-Kaninchen-Antiserum inkubiert, mit TBS-0,05 % Tween-20 30 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen, und ih bei Raumtemperatur mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Serum, das mit Biotin (1:500) markiert war, inkubiert. Die Streifen wurden erneut gewaschen und mit Streptavidin, das mit Peroxidase markiert war (1:2000) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reagierenlassen. Nach sorgfältigem Waschen wurden die Filter mit einer TBS- Lösung, die 0,5 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol (Sigma), 17% (V/V) Methanol und 0,015% Wasserstoffperoxid in TBS enthielt, entwickelt bis sichtbare Banden erschienen. Die Reaktion wurde gestoppt durch Spülen der Streifen mit destilliertem Wasser.
Alle polyklonalen Kaninchen-Antiseren, die gegen vollständige PPV- Viruspartikel hergestellt worden waren, reagierten mit dem VP2-Protein, das von dem rekombinanten Baculovirus exprimiert wurde.

3.1 Reinigung von rekombinanten Proteinen und Kapsiden

S. frugiperda-Zellen wurden mit rekombinantem AcMNPV.pPPVEx8- Virus infiziert mit einer Infektions-Multiplizität von 5-10 PFU/Zelle und bei 27ºC 48-72h lang inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 1000 Upm, zweimal in einer Phosphatgepufferten Kochsalz-Lösung von pH 7,4 gewaschen, und zu 2x10&sup7; Zellen/ml erneut suspendiert in einem 25 mM Bicarbonat-Puffer von pH 9,5. Die erneut suspendierten Zellen wurden durch Behandlung mit Schallwellen zerstört und 10 Minuten lang bei 10000 Upm zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Das rekombinante VP2-Protein enthaltender Überstand kann gereinigt werden unter Ausnutzung seiner Autoaggregationsfähigkeit zur Ausbildung leerer Kapside. Zu diesem Zweck werden sie entweder durch Ausfällung mittels 20% Ammoniumsulfat gereinigt, oder die leeren Kapside werden 14h lang bei 45000 Upm auf CsCl-Gradienten zentrifugiert. Bei Bandenbildung in CsCl-Gradienten zeigen die Kapside eine Schwebedichte ( ) von 1,30 g/cm³. Die Herstellungsreinheit wurde bestimmt durch Elektrophorese in SDS-Polyacrylamid-Gelen wie das oben beschriebene Verfahren, und es zeigte sich, daß die Reinheit des VP2-Proteins mehr als 99% betrug.

4. Hämagglutinationsaktivität

Die Hämagglutinationsaktivität des Proteins VP2 wurde gemäß einem bereits bekannten Verfahren (Joo, H.S. et al. Aust. Vet. 3.52: 422-424. 1976) untersucht. Diese funktionelle Aktivität ist ausschließlich dem Teichencharakter des Produkts zuzuschreiben, wodurch sich selbiges klar von früheren Produkten unterscheidet.
Die Ergebnisse zeigen, daß das Präparat der VP2-Kapside einen Hämagglutinations-Titer von 5x10&sup5; Einheiten/ml besitzt.

5. Bestätigung der Anwesenheit von Kapsiden durch Elektronenmikroskopie

Ein gereinigtes VP2-Präparat wurde durch negativen Kontrast mit 2% Uranylacetat gefärbt und unter einem Elektronenmikroskop bei einem Vergrößerungsvermögen von 40000 x 2,5 betrachtet. Es wurde die Anwesenheit einer großen Anzahl von chimären Pseudoviruspartikeln regelmäßiger und gleichmäßiger Struktur und mit einer Größe von grob 22 nm beobachtet (Fig. 3).

6. Immunisieren von Kaninchen

Zwei Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von 2 kg wurden dreimal intramuskulär mit 100 µg einer gereinigten VP2-Zubereitung immunisiert. Das erste Mal in einem kompletten Freund-Adjuvans, das zweite und dritte Mal mit einem nicht-kompletten Adjuvans. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden die Kaninchen zur Ader gelassen und die erhaltenen Seren mit einem ELISA-Test und einem Hämagglutinationshemmtest getestet, wie es nachstehend beschrieben ist.

6.1 Quantitative Bestimmung der Anti-PPV-Antikörper durch ELISA und HI

Die Anwesenheit von PPV-spezifischen Antikörpern im Serum immunisierter Tiere wurde mittels eines indirekten ELISA-Tests bestimmt. Das verwendete Antigen war sowohl gereinigtes PPV-Virus als auch gereimgtes VP2-Protein. In Kürze, Polystyrol-Platten wurden mit 0,5 µg Virus oder 0,25 µg/Mulde VP2 in 100 µl Carbonat-Puffer (0,05 M, pH 9,6) bei 4ºC über Nacht beschichtet. Die Platten wurden mit PBS (0,15 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphat pH 7,4), das 0,05% Tween-20 enthielt, gewaschen und mit dem Anti-PPV Kaninchen-Antiserum 2h lang bei 37ºC inkubiert, erneut gewaschen und mit Anti-Kaninchen-IgG von Ziegen, das mit Biotin markiert war, inkubiert. Dann wurde mit Peroxidase markiertes Streptavidin zu dem mit Biotin markierten Antikörper 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zugegeben. Die Platten wurden erneut gewaschen und die Reaktion 10 Minuten im Dunklen mit o-Phenylendiamin als ein Substrat fur die Peroxidase entwickelt und bei 450 nm in einem Vielkanalspektralphotometer abgelesen.
Für die Kaninchen-Seren war der erzielte ELISA-Titer 1/1600 gegen das VP2-Protein und 1/3200 gegen das komplette PPV-Virus.
Der HI-Test wurde nach den vorstehend beschriebenen Standardverfahren durchgefuhrt (Joo. H.S. et al Aust. Vet. J. 52: 422-424.1976). Der erhaltene Titer war 1/320, wenn 4 HA-Einheiten an gereingtem PPV als Antigen verwendet wurden. Auf der Basis der guten Korrelation, die zwischen dem HI- und dem Schutz-Titer der Tiere gegen Virusinfektion beobachtet wurde, nehmen wir an, daß die Tiere, die in der Lage sind, diesen Titer auszubilden, ein hohes Schutzniveau besitzen.

7. Immunisierung von Schweinen

Zwei Schweine wurden immunisiert mit gereingten Zubereitungen von chimären PPV-VP2-Kapsiden, bestehend aus rekombinanten, selbstzusaammengefugten VP2-Proteinen. Eines der Schweine war vollständig seronegativ, wahrend das andere ein niedriges Antikörper-Niveau besaß aufgrund der Tatsache, daß seine Mutter früher geirupft worden war. Beide Schweine wurden während des Tests isoliert gehalten.
Der Impfstoff wurde zubereitet durch Mischen der Kapside ( 3µg) mit einem Standard-Adjuvans-System: 50% Alhydrogel (Superfos.Dänemark) + 500 µg QuilA (Superfos). Alle Komponenten wurden in Standardkonzentrationen gehalten, mit Ausnahme des inaktivierten Virus, der durch PPV-Kapside verändert worden war. Die Schweine erhielten zwei subkutane Impfungen: die Dosis beim ersten Mal war 2 ml, und drei Wochen später wurde ihnen eine zweite Dosis von 1 ml injiziert. Das Serum wurde wöchentlich, vor der Impfung, und bis zu 10 Tage nach der letzten Dosis getestet. Die Anwesenheit von Anti-PPV-Antikörpern in dem Schweineserum wurde nach drei unterschiedlichen Verfahren bestimmt: (1) ELISA Anti-PPV-Viruspartikel-Test, (2) Hämagglutinationshemmtest (Joo et al. 1976. Aust. Vet. J. 52: 422-424) und (3) PPV-Neutralisationstest (Holm-Jensen M. 1991. Acta Vet. Scand 22: 85-98).
Die mit dem rekombinanten Impfstoff aus Kapsiden erhaltenen Titer waren ähnlich (Fig. 4) denjenigen, die normalerweise mit dem inaktivierten kommerziellen Impfstoff erhalten werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die chimären PPV-Kapside hochgradig immunogen und in der Lage sind, die inaktivierten Viruspartikel (Virions) zu ersetzen. Obwohl eines der Schweine restliche mütterliche Antikörper behielt, war die Antwort auf den Impfstoff nicht gehemmt, wobei sie Niveaus erreichte, die denjenigen, die bei dem seronegativen Schwein erhalten wurden, ähnlich waren.
Die Antwort wurde erzielt mit einer niedrigen Dosis der rekombinanten Kapside ( 3 µg), was zeigt, daß das Produkt gute Aussichten für eine kommerzielle Anwendung als Impfstoff zeigt.

8. "In vivo"-Schutz gegen ein virulentes Virus

Es wurde ein Erregungs-Experiment durchgefuhrt, um die Geeignetheit der rekombinanten VP2-Kapside bei der Induktion von schützender Immnmität gegen PPV bei trächtigen Sauen zu studieren.
Vor der kunstuchen Besamung wurden zwei seronegative Sauen mit der gleichen Impfstoff-Zubereitung, die in dem vorangehenden Beispiel beschrieben ist, geimpft. Der Antigen-Gehalt, die Adjuvantien und die Formulierung des Impfstoffes waren die gleichen. Beide Sauen wurden zwenmal mit einem Abstand von 3 Wochen geimpft. Eine seronegative trächtige Sau wurde als nicht-geimpftes Kontrolltier verwendet. Nach etwa 40 Tagen Trächtigkeit wurden die drei trächtigen Sauen auf intravenösem Weg mit 10&sup7; TCDI&sub5;&sub0; eines virulenten PPV-Stammes "839" geimpft (S rensen and Askaa. 1981. Acta Vet. Scand 22, 171-179). Die drei Sauen wurden nach 66 Tagen Trächtigkeit geopfert.
Bei jedem Fötus wurden Scheitel-Steiß-Länge und schwere pathologische Läsionen (gross pathological lesions, GPL) aufgezeichnet. Blutproben aus der Nabelschnur und Seren der Föten wurden gesammt und auf die Anwesenheit von Anti-PPV-spezifischen Antikörpern mittels eines indirekten Immunofluoreszenz-Tests (IFAT) untersucht (S rensen et al. 1980, Acta Vet. Scand 21, 312-317). Anti-PPV-Antikörper wurden auch untersucht durch einen Gegenstrom-Immunoelektrophorese-Test. Darüber hinaus wurden diese Proben unter Verwendung von Raketen Elektrophorese (Dalsgaard et al. 1979. Acta Vet. Scand 20, 312-320) auch auf den IgM- und IgG-Gehalt hin untersucht. In denjenigen Fällen, in denen kein Blut aus der Nabelschnur erhalten werden konnte, wurden Abdominalflüssigkeiten oder Hirngewebe-Extrakte verwendet.
Fetale Nieren-, Leber- und Lungen-Gewebe wurden gesammelt und mittels des ELISA-Tests, der im staatlichen tiermedizinischen Institut fur Virusforschung, Lindholm (SVIV) routinemäßig zur PPV-Diagnose verwendet wird, auf die Anwesenheit von PPV-Antigen hin analysiert. Auch wurden Blutproben der Sauen nach der Impfung, bei der erneuten Impfung, 10 Tage später, in der Zeit der Virus-Beimpfung und beim Opfern genommen und mittels des vorher erwähnten ELISA-Tests auf die Anwesenheit von Anti-PPV-Antikörpern hin untersucht.
Die drei Sauen blieben während des gesamten Experiments gesund. Die während des Experiments erhaltenen Antikörper-Titer sind in Fig. 5 gezeigt. Die nicht geimpfte Sau blieb bis zur Virus-Erregung seronegativ. Nach der Infektion wurde bei der Nekropsie ein dramatisches Ansteigen der Anti-PPV-Antikörper-Titer beobachtet. Die zwei geimpften Sauen zeigen Antikörper-Titer, die nach Impfung und erneuter Impfung ansteigen. Diese Titer erleiden ein späteres leichtes Ansteigen wegen der Verabfolgung von virulentem Virus.

a) Feten des nicht-geimpften Kontrolltiers

Bei der Nekropsie zeigten Föten der Sau #1451 (nicht-geimpftes Kontrolltier) typische Schäden intrauteriner PPV-Infektion (Bachmann et al. 1975, Infect Immunity, 12, 455-460; Joo et al. 1976; Arch. Virol. 51, 123-391; Nielsen et al. 1991. Vet. Microbiol. 28, 1-11). Vier Föten waren am Leben. Einer von ihnen zeigte keine GPL, die anderen drei jedoch bildeten GPL unterschiedlichen Schweregrads aus, typischerweise Verflirbung, Morbidität, mit großen Volumina an Aszitesflüssigkeiten, Ödeme, Lungenstauung und Hautrötung, Thymus-Rückbildung und Vergrößerung der Leber. Fünf andere Föten waren tot und hatten eine schwere, durch GPL verursachte Wachstumsverzögerung, allgemeine äußere Odeme, Hyperämie und eine ausgeprägte Gewebezerstörung. Drei mumifizierte Föten hatten eine CR-Länge (Scheitel-Steiß-Länge) von 11,5 bis 12,5 cm, was ein Ende des Wachstums nach 57 Tagen Tragezeit anzeigt.
PPV-Antigen wurde unter Verwendung des vorher beschriebenen ELISA-Tests in allen Föten der nicht-geimpften Sau nachgewiesen. Eine Antikörper-Antwort (fetal) Anti-PPV gegen das Virus, das für die Erregung benutzt wurde, wurde in Pleuraraum-Flüssigkeiten von 3 Feten nachgewiesen, wie mittels IFAT und Gegenstrom-Immunoelektrophorese gemessen wurde. Die Anwesenheit von IgG und IgM in diesen Proben wurde bestätigt durch "Raketen"-Immunoelektrophorese. Die Schweinefeten sind in der Lage, bei 60 Tagen Tragezeit Anti-PPV-Antikörper zu induzieren (3. Nielsen et al. 1991, Vet. Microbiol. 28, 1-11).

b Feten der geimpften Sauen

Von den geimpften Sauen hatte eine 10 Feten und die andere 8 Feten. Alle waren am Leben und bei der Nekropsie normal. Alle schienen gesund. In keinem der Feten wurde PPV-Antigen nachgewiesen. Auch Anti-PPV-Antikörper wurden durch keine der verwendeten Techniken im Blut oder in Pleuraraum-Flüssigkeit nachgewiesen. Die Abwesenheit von IgG- oder IgM-Immunoglobolin wurde durch Raketen-Immunoelektrophorese bestätigt.
Auf der Basis dieser vorstehend beschriebenen Ergebnisse ist es möglich zu schließen, daß rekombinante VP2-Kapside von PPV, exprimiert in dem Baculovirus/Insektenzellen-System, in der Lage sind, bei trächtigen Sauen eine schützende Immunität gegen eine intravenöse Impfung mit virulentem PPV-Virus zu induzieren.
Auf (der Basis dieser Ergebnisse wird gezeigt, daß rekombinante VP2- Kapside die Basis für einen neuen Bereich kommerzieller Impfstoffe, die bei der Kontrolle der PPV-Infektion von Schweinen nützlich sind, darstellen können. Auf die gleiche Weise können diese Kapside, da die essentiellen immunodominanten Epitope von PPV auf den VP2-Kapsiden exprimiert werden, als ein Reagenz bei der Diagnose von PPV-Infektion bei Schweinen nützlich sein, beispielsweise in Ausrüstungen zum Antikörper-Nachweis.

9. Impfstoff-Formulierung gegen die durch PPV verursachte Infektion

Es ist möglich, einen passiven Impfstoff zu erhalten, der Tiere mit den rekombinanten VP2-Kapsiden, die, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, gereinigt wurden, immunisiert. Gegen dieses VP2 gerichtete polyklonale Antikörper können aus Serum, Milch oder anderen tierischen Körperflüssigkeiten isoliert werden. Diese Antikörper können dann gereinigt und fur therapeutische oder prophylaktische Anwendungen verwendet werden.
Ein aktiver Impfstoff kann hergestellt werden durch Resuspendieren der hierin beschriebenen rekombinanten VP2-Kapside in einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel wie PBS und einem Adjuvans wie Alhydrogel oder QuilA. Zur Verleihung von Immunität können Erstund Nach-Injektionen oder eine orale Verabreichung der Impfstoff-Lösung verwendet werden.
Ein aktiver Impfstoff kann auch hergestellt werden durch Resuspendieren der leeren Kapside in einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel mit oder ohne ein Adjuvans. Ein Fachmann wird deutlich sehen, daß diese nur von VP2 gebildeten chimären Kapside chemisch oder genetisch behandelt werden können, um andere Virusprotein-Epitope einzufuhren, und daher als ein polyvalenter Impfstoff wirken können.

10. Schlußfolgerungen

Das AcMNPV.pPPVEx8-Baculovirus ist in der Lage, ein rekombinantes VP2 zu erzeugen, das absolut identisch mit dem Virus-VP2-Protein ist, wie es durch die DNA-Sequenz, Bestimmung des Molekulargewichts und Antigen-Charakterisierung gezeigt wurde. Das hierin mit unserem Verfähren erhaltene VP2 ist auch bemerkenswerterweise in der Lage, leere Kapside auszubilden, wobei es selbige mit einer Hämagglutinations- und immunogenen Aktivität ausstattet, die deutlich größer ist als bei anderen, früher beschriebenen rekombinanten Proteinen, wie es durch die hierin beschriebenen Tier-Immunisierungs-Tests gezeigt wurde.
Diese gesteigerte immunogene Leistungsfähigkeit kann von Fachleuten genutzt werden, um andere Virus-Protein-Epitope vorzulegen, die durch chemische oder genetische Manipulation der rekombinanten Baculoviren darin eingefuhrt werden können.

Übertragung der Legenden zu den Figuren

Fig. 2
(a) Isolat von Agarosegel-Fragmenten
(b) Ligat
(c) Phosphatase
Fig. 4
(a) Logarithmus des Titers
(b) Tage nach Immunisierung
(c) zweite Immunisierung
Fig. 5
(a) Impfung trächtiger Sauen mit durch rekombinante VP2- Selbstzusammenfugung gebildeten, chimären PPV-Kapsiden.
(b) ELISA, Antikörper-Titer gegen PPV.
(c) Tage nach Impfung
(d) erste Impfung
(e) zweite Impfung
(f) Erregung
(g) künstliche Besamung
(h) Nekropsie.
Das rekombinante Baculovirus wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) am 4. März 1991 hinterlegt.
Nach Beschreibung der Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist nun in dem folgenden enthalten, was als das wesentliche der Erfindung betrachtet wird.

Claims

1. Leere chimärische Parvovirus Porcino (PPV)-VP2-Kapside, bestehend aus selbstverknüpften, rekombinanten VP2-Proteinen, exprimiert in permissiven Insektenzellen, infiziert mit einem rekombinanten Baculo- Virus, das diejenige DNS-Sequenz aufweist, die das Protein VP2 des PPV kodiert.

2. Kapside gemäß Anspruch 1, die die Fähigkeit der Hämagglutination besitzen und immunogen sind.

3. Kapside gemäß Anspruch 1, die die essentiellen immunodominanten Epitope des PPV besitzen.

4. Kapside gemäß Anspruch 1, in denen das genannte rekombinante Baculovirus dasjenige mit der Identifizierung AcMNPV.pPPVEx8 ist, hinterlegt in der ECACC mit der Depotnummer V91030213.

5. Ein rekombinanter Untereinheit-Impfstoff der dazu geeignet ist, Schweine vor Infektionen zu schützen, die durch PPV hervorgerufen werden, der einschließt:

a) eine immunisierende Menge der leeren chimärischen VP2- Kapside des PPV gemäß eines der Ansprüche 1 bis 4; und

b) ein Lösungsmittel und wahlweise einen Hilfsstoff, beide immunologisch akzeptabel.

6. Ein Mehrzweckimpfstoff, der dazu geeignet ist, Tiere vor den Infektionen zu schützen, die durch PPV und andere Viren hervorgerufen werden, der einschließt:

a) eine immunisierende Menge der leeren VP2-Kapside des PPV gemäß jedes beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, chemisch behandelt, um in sie Peptidepitope oder Virusproteine einzubringen, vor deren Infektion geschützt werden möchte; und

7. Ein Mehrzweckimpfstoff, der dazu geeignet ist, Tiere von den Infektionen zu schützen, die durch PPV und andere Viren hervorgerufen werden, der einschließt:

a) eine immunisierende Menge der leeren chimärischen VP2- Kapside des PPV gemäß jedes beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, genbehandelt, damit sie außerdem die Peptidepitope der Virusproteine beinhalten, vor deren Infektion geschützt werden möchte; und

8. Ein Impfstoff gemäß Anspruch 7, in dem die genannten leeren chimärischen VP2-Kapside des PPV, die außerdem die Peptidepitope oder Virusproteine beinhalten, gewonnen werden durch:

a) Genmanipulation eines rekombinanten Baculovirus, das diejenige DNS-Sequenz aufweist, die das Protein VP2 des PPV kodiert, indem in sein Genom diejenigen DNS-Sequenzen eingebracht und integriert wurden, die die genannten Epitope kodieren;

b) Infektion von permissiven Insektenzellen mit dem genannten genmanipulierten rekombinanten Bakulovirus; und

c) Züchtung der infizierten Zellen unter Bedingungen, die erlauben, daß sich die genmanipulierten VP2-Kapside, die die relevanten Virusepitope enthalten, bilden.

9. Verwendung der chimärischen VP2-Kapside des PPV gemäß jedes beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, um in vitro die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern gegen PPV aufzuspüren.