DE69222749T2

DE69222749T2 - Streptolysin o derivate

Info

Publication number: DE69222749T2
Application number: DE69222749T
Authority: DE
Inventors: Craig Adams; Eva Wang
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-07-31
Publication date: 1998-02-26
Anticipated expiration: 2012-08-01
Also published as: JPH06503003A; EP0555439A1; JP3595840B2; CA2094245C; EP0555439B1; DE69222749D1; WO1993005156A1; AU2437292A; US5378620A; ATE159293T1; AU661028B2; ES2110009T3; CA2094245A1

Description

Ein Teil der Offenbarung der vorliegenden Patentschrift enthält Material, das dem Copyright-(Urheberrechts-)Schutz unterliegt. Der Copyright-Inhaber erhebt keine Einwendupg gegen die von beliebiger Seite erfolgende Wiedergabe des Patentdokuments oder der Patentoffenbarung, wie sie in den Akten und Unterlagen des Patent and Trademark Office (US-Patentamt) erscheint; im übrigen bleiben jedoch sämtliche Copyright-(Urheber-)Rechte vorbehalten.

Anmeldungen mit Bezug zur vorliegenden Anmeldung

Die vorliegende Anmeldung steht in Beziehung zu der US-Patentanmeldung Ser. No. (Beckman-Aktenzeichen 128D-122) mit dem Titel "Streptolysin-O-Varianten" von Craig W. Adams, und der US-Patentanmeldung Ser. No. (Beckman-Aktenzeichen 128D-123) mit dem Titel "Antikörper für Streptolysin-O-Derivate und -Varianten" von Craig W. Adams und Patty Pang. Beide Anmeldungen werden gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung eingereicht, und beide werden durch Referenz-Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung inkorporiert

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Streptolysin-O und näherhin durch Rekombinanten-DNA-Technik erzeugte Streptolysin-O-Derivate

Hintergrund der Erfindung

In der vorliegenden Anmeldung wird ein Derivat-Fusionsprodukt der Antigensubstanz Streptolysin-O beschrieben. Streptolysin-O ist im Menschen beispielsweise rheumatischem Fieber zugeordnet, derart, daß immundiagnostische Tests als Nachweis immunologischer Response gegen Streptolysin-O routinemäßig verwendet werden. Die hier offenbarte Derivatversion von Streptolysin-O wird durch Rekombinanten-DNA- Techniken erzeugt, ist nach der Expression löslich, vermag durch wenigstens einen zur Bindung mit Wildtyp-SLO fähigen Antikörper gebunden zu werden und ist hämolytisch aktiv. Vor der vorliegenden Erfindung konnte Streptolysin-O über das Bakterium Streptococcus pyogenes erhalten werden. Die toxischen und pathogenen Eigenschaften von Streptolysin-O werden typischerweise durch die Lyse von roten Blutzellen überwacht.

I. Der genetische Code

Der genetische Code für ein bestimmtes Protein, wie beispielsweise Streptolysin-O (im folgenden als "SLO" abgekürzt), hängt von der sequentiellen Gruppierung von drei als ein "Codon" bezeichneten Nucleotiden und von der Anordnung derartiger Codone in ihrer gegenseitigen Beziehung ab.
Ein "Nucleotid" besteht aus einem Nucleosid und einer oder mehreren Phosphatgruppen. Ein "Nucleosid" besteht aus einer stickstoffhaltigen Base, die mit einem Pentosenzucker verknüpft ist. Ein "Pentose-"Zucker umfaßt fünf Kohlenstoffatome. In einem Molekül der Desoxyribonucleinsäure, oder "DNA", ist der Pentosezucker "Desoxyribose", und die stickstoffhaltige Base kann Adenin ("A"), Guanin ("G"), Thymin ("T") oder Cytosin ("C") sein. In einem Molekül der Ribonucleinsäure, oder "RNA", ist der Pentosezucker "Ribose", und die stickstoffhaltigen Basen sind dieselben wie bei der DNA, mit der Ausnahme, daß Uracil ("U") an die Stelle von Thymin tritt. Drei Arten von RNA, nämlich Messenger-RNA, oder "mRNA", Transfer-RNA, oder "tRNA", und ribosomale, oder "rRNA", übersetzen die in der DNA codierte genetische Information in beispielsweise ein Polypeptid oder ein Protein. Somit wird genetische Information allgemein wie folgt übertragen: DNATRNATProtein.
Die Sequenz der stickstoffhaltigen Basen des DNA-Moleküls codiert die in diesem Molekül enthaltene genetische Information. Die Zucker- und Phosphatgruppen des DNA-Moleküls erfüllen eine strukturelle Rolle, indem sie das Rückgrat einer Reihe von DNA-Molekülen, die als ein DNA-"Makromolekül" bezeichnet werden, bilden. DNA besteht aus zwei komplementären Strängen von Nucleotidketten, und diese Stränge werden durch (relativ) schwache Wasserstoffbindungen zusammengehalten. Die Basen der einzelnen DNA-Moleküle binden jeweils miteinander: A bindet jeweils mit T und C jeweils mit G. Somit liegt die Sequenz 5'-ATCG-3' eines ersten Strangs unmittelbar einer komplementären Sequenz 5'-TAGC-3' auf dem anderen Strang gegenüber. Dieswird als "komplementäre Basenpaarung" bezeichnet. Der Prozeß der komplementären Basenpaarung wird als "Hybridisierung" bezeichnet und führt zur Bildung eines stabilen DNA-Makromoleküls.
Jedes Codon spezifiziert jeweils eine Aminosäure. "Aminosäuren" sind die Hauptkomponenten von Proteinen, und "Proteine" sind die wesentlichen Bestandteile aller lebenden Zellen. Es gibt 20 natürliche Aminosäuren. Da es vier Nucleotidbasen (A, C, G und T) und drei Nucleotide je Codon gibt, gibt es 64 mögliche Codone (4³) Da es nur 20 natürliche Aminosäuren gibt, werden somit die meisten Aminosäuren durch mehr als ein Codon spezifiziert. Dies wird als "Redundanz" oder "Degeneration" bezeichnet. Beispielsweise codieren die Codone GCG, GCA, GCT und GCC sämtlich für die Aminosäure Alanin.
Das Codon ATG (Met-Aminosäure-Codon) ist das normale "Start"-Codon. Die Codone TAA, TAG und TGA, die nicht für Aminosäuren codieren, sind die normalen "Stopp"-Codone. Die Bildung von mRNA beruht auf der Grundlage des Start- Codons eines Strangs des doppelsträngigen DNA-Makromoleküls, derart daß die resultierende einzelstrangige mRNA eine zu der Sequenz eines einzelnen Strangs der DNA komplementäre Nucleotidsequenz haben wird. Sobald die mRNA entlang des DNA-Moleküls auf ein Stopp-Codon trifft, wird die Translation angehalten.
Die Bereiche entlang des DNA-Makromoleküls, welche aus der mRNA übersetzt werden, werden als "Exone" für Eukaryonten und als "übersetzte Bereiche" für Prokaryonten bezeichnet. "Gene" enthalten Exone (Eukaryonten) und übersetzte Bereiche (Prokaryonten). Somit codieren Gene für Proteine und/oder Polypeptide. Beispielsweise sind Säugetiere Eukaryonten; Bakterien beispielsweise Prokaryonten.
Die natürliche Proteinsynthese findet über eine Reihe verschiedener Schritte statt. Der erste Schritt ist die Bildung eines zu dem DNA-Makromolekül komplementären mRNA-Makromoleküls, wie oben erwähnt. Danach wird tRNA hergestellt; die tRNA ergibt ein komplementäres Codon ("Anti-Codon") für
jedes Codon auf dem mRNA-Makromolekül. Danach katalysiert rRNA den Zusammenbau der aus dem mRNA:tRNA resultierenden Codon-spezifischen Aminosäuren zu Proteinen und/oder Polypeptiden

II. Rekombinanten-DNA-Technik

Die meisten Proteine werden von Natur aus in äußerst geringen Mengen erzeugt. Die Heraufkunft der Rekombinanten-DNA- Technik hat die Erzeugung großer Mengen von Proteinen ermöglicht, die früher nur in derartigen kleinen Mengen verfügbar waren.
Im folgenden wird eine "typische"Genmanipulation beschrieben, wie sie bei Escherichia coli Anwendung finden kann, einem typischen, zum Clonieren verwendeten bakteriellen Wirt.
Um ein Gen zu isolieren oder zu "donen", wird aus einer (als ein "Genom" bezeichneten) DNA-Sequenz unter Verwendung von Vektoren eine DNA-Bibliothek hergestellt. Ein "Vektor" ist ein kleines kreisformiges Molekül aus doppelsträngiger DNA, das natürlicherweise in Bakterien, Hefen und Säugetierzellen auftritt. Vektoren weisen im allgemeinen die folgenden Eigenschaften auf: (i) eine für einen selektierbaren "Marker" codierende DNA-Sequenz, was gewährleistet, daß der Vektor in einer geeigneten Wirtszelle (beispielsweise E. coli) aufrechterhalten bleibt; (ii) einen kontrollierbaren Transkriptions-Promotor, wobei "kontrollierbar" bedeutet, daß der Promotor durch Manipulation, beispielsweise der Umgebung des Vektors, "eingeschaltet" werden kann; ein "Promotor" ist ein DNA-Sequenzbereich, der bei Einschaltung große Mengen von in den Vektor eingesetzter MRNÄ aus dem interessierenden Gen erzeugt, wobei unterschiedliche Promotoren (beispielsweise lac, trp, tac usw.) unterschiedliche mRNA-Produktionsraten aufweisen; (iii) Translationskontroll-Sequenzen, beispielsweise ein geeignet positioniertes ATG-Start-Codon; sowie (iv) einen Polylinker; ein "Polylinker" vereinfacht die Insertion des interessierenden Gens in der richtigen Ausrichtung innerhalb des Vektors. Vektoren lassen sich so konstruieren, daß sie Restriktions- Endonudease-Stellen zu beiden Seiten eines auf dem Vektor befindlichen ATG-Start-Codons besitzen, derart daß das interessierende Gen nächst dem Start-Codon eingefügt werden kann; dies gestattet eine sofortige Transkription des Gens nach Aktivierung des Promotorgens.
Eine "Restriktions-Endonuclease" ist ein Enzym, das die doppelsträngige DNA an spezifizierten Sequenzen von vier bis acht Nucleotiden Länge spaltet, und viele Restriktions-Endonudeasen erzeugen versetzte Spaltschnitte, welche einen kurzen einzelsträngigen Schwanz an der Stelle des Schnitts zurücklassen. Dieses Ende wird als "kohäsives" oder "Kleb"-Ende bezeichnet, da es mit einem anderen kohäsiven oder Kleb-Ende komplementäre Basenpaare bilden kann. Das Genom wird durch eine der zum Spalten des Vektors verwendeten Restriktions-Endonuclease entsprechende spezifische Restriktions-Endonudease gespalten (aufgetrennt), und die einzelnen Stücke des aufgetrennten Genoms werden in den Vektor eingefügt. Zufallsartige Spaltung des gesamten Genoms einer Zelle mit einer spezifischen Restriktions-Endonuclease wird typischerweise als "Schrotschuß"-Verfahren der Genclonierung bezeichnet. Das Schrotschußverfahren kann eine außerordentlich große Zahl von DNA-Fragmenten erzeugen, die sämtlich in Vektoren eingefügt werden.
Die einzelnen Stücke des Genoms und die Vektoren mit entsprechenden kohäsiven oder Kleb-Enden werden miteinander verschmolzen" oder "verbunden, unter Bildung kreis- bzw. ringförmiger Hybrid-DNA-"Plasmide", welche einen Teil des Genoms und den Vektor enthalten.
Die Plasmide werden sodann in Wirtszellen eingeführt. Es gibt zwei Arten von Wirtszellen, "eukaryontische" und "prokaryontische". Ein Beispiel einer eukaryontischen Wirtszelle ist die Eizelle des chinesischen Hamsters ("chinese hamster ovary" ("CHO")); ein Beispiel einer prokaryontischen Wirtszelle ist E. coli bacteria. Für die Zwecke der folgenden Diskussion wird auf prokaryontische Wirtszellen abgestellt.
Nachdem die Plasmide in die Wirtszelle eingeführt sind. werden diese Zellen als mit den Plasmiden "transformiert" bezeichnet. Mit zunehmendem Zellwachstum und -teilung werden die Plasmide in gleicher Weise repliziert unter Erzeugung von Kopien der die DNA-Fragmente enthaltenden Plasmide. Die einzelnen transformierten Zellen werden jeweils als ein "genomischer DNA-Clon" bezeichnet, und die gesamte Kollektion transformierter Zellen, welche sämtliche verschiedenen DNA-Fragmente enthalten, wird als eine "genomische, DNA- Bibliothek" bezeichnet.
Um zu bestimmen, welche genomischen DNA-Clone die DNA-Sequenz enthalten, welche in eine entsprechende mRNA kopiert werden kann, ist es notwendig, die genomischen DNA-Clone zu isolieren oder einem "Screening" zu unterwerfen. Es gibt verschiedene Wege, dies zu erreichen, unter anderem die Verwendung radioaktiver DNA-Sonden oder Nachweis von Immunoreaktivität. Das Screening kann ein außerordentlich arbeitsintensiver Prozeß sein, da, wie erwähnt, die Schrotschuß- Methode definitionsgemäß zur Bildung einer großen Anzahl genomischer DNA-Clone führt, die durch Screening zum Auffinden potentiell interessierender Kandidaten überprüft werden müssen.

III. Streptolysin-O

Streptolysin-O ("SLO") hat ein ungefähres Molekulargewicht zwischen etwa 65 000 und 70 000 Dalton. SLO gebört zu einer Klasse sauerstoffempfindlicher ("Thiol-aktivierter"), zellzerstörender ("cytolytischer") Toxine ("Cytotoxin"), die durch gram-positive Bakterienarten erzeugt werden, welche zu vier verschiedenen Gattungen bzw. Stämmen gehören (Streptococcus, Bacillus, Clostridium und Listeria).
SLO zeigt Wechselwirkung mit Membrancholesterol und übt cytolytisch-cytotoxische Wirkungen auf einen breiten Bereich von Säugetierzellen aus. Des weiteren hat SLO sehr potente cardiotoxische Eigenschaften. Eine der mit SLO verbundenen toxischen und pathogenen Eigenschaften ist seine hämolytische Aktivität, d. h. SLO lysiert rote Blutzellen mit der Folge der Freisetzung von Hämoglobin. SLO kann für Labor- Lebewesen in verhältnismäßig kleinen Dosen lethal sein. Injektion von SLO in einem Tier führt typischerweise seinen sofortigen Tod herbei.
Da SLO durch spezifische Bakterienarten erzeugt wird, wird bei einer "Invasion" eines Wirts-Säugetiers durch diese Bakterienarten das von den Bakterien freigesetzte slo durch den Wirtsorganismus als ein fremdes Protein behandelt. SLO ist somit dann ein Antigen. "Antigene" sind hochmolekulare Verbindungen (Verbindungen mit hohem Molekulargewicht), die beim Eintritt in den Blutstrom eines Wirbeltiers die Umwandlung bzw. Transformation der kleinen Lymphozyten vom B-Typ zu Lymphgblasten stimulieren. Die Lymphoblasten sezernie ren für den Antigenstimulator spezifische Antikörper. Die Antikörper sind Proteine mit reaktiven Stellen, die spezifisch komplementär bezüglich einer reaktiven Eigenschaft oder Stelle an dem stimulierenden Antigen sind. Antikörper haben allgemein die Eigenschaft, das Antigen für den Wirtsorganismus harmlos zu machen, indem sie die immunologisch aktiven Stellen oder "Epitopen" an den Antigenteilchen oder Molekülen besetzen. Daher werden von dem Wirt Anti-SLO-Antikörper ("ASO") als Antwort auf die Sekretion von SLO in den Wirt erzeugt. Annähernd 80 bis 85 % der Individuen mit einer laufenden Streptococcen-Infektion oder deren Folgeerscheinungen (eine Nachwirkung einer Erkrankung oder Verletzung) werden erhöhte ASO-Pegel zeigen.
Die Bestimmung einer früheren und/oder gegenwärtigen Infektion mit den angegebenen spezifischen Bakterienarten, welche SLO absondern, ist mittels immunodiagnostischer Assay-Verfahren möglich, die beispielsweise auf den hämolytischen Eigenschaften von SLO und der Bindung von ASO an SLO beruhen. Was speziell hämolytische immunodiagnostische Assays für SLO betrifft, so wird eine Patientenprobe zu einer bekannten Menge von von einer anderen Quelle als dem Patienten abgeleitetem SLO zugegeben und dieses Gemisch zu einer bekannten Menge roter Blutzellen, wie beispielsweise roten Blutzellen von Kaninchen, zugesetzt. Da SLO hämolytische Eigenschaften besitzt, wird es diese roten Blutzellen lysieren. Wenn jedoch ASO an das SLO bindet, werden die hämolytischen Eigenschaften des SLO neutralisiert. Falls somit die Probe von einem Patienten mit gegenwärtiger Streptococcen- Infektion oder deren Folgen stammt, werden in der Probe erhöhte ASO-Pegel vorliegen. Falls daher das Gemisch hohe Pegel hämolytischer Aktivität ergibt, zeigt dies an, daß gar kein oder nur wenig ASO in der Serumprobe (und damit gar keine oder nur geringe Infektion durch die SLO-sezernierenden Bakterien) vorliegt, da die bekannte SLO-Menge in dem Gemisch die bekannte Menge an roten Blutzellen in dem Gemisch zu lysieren vermag. Falls das Gemisch nicht zu hämolytischer Aktivität führt, zeigt dies eine zur Inaktivierung der bekannten SLO-Menge in dem Gemisch ausreichende Menge von ASO in der Probe an. Das Untersuchungspersonal bezeichnet eine derartige A59-Menge als einen "Titer". Typischerweise ist ein ASO-Titer von mehr als etwa 300 Internationalen Einheiten pro Milliliter (International Units/ml) eine Anzeige für eine Infektion durch eine zur SLO-Sekretion fähige bakterielle Quelle. Andere immunodiagnostische Assays Zuübestimmung einer Infektion durch SLO-sezernierende Bakterien sind unter anderem nephelometrische und turbidimetrische Protokolle bzw. Verfahren.
Zur Anwendung der vorstehend dargelegten immunodiagnostischen Assay-Technik ist es notwendig, Zugang zu genügend SLO zu haben, das dem Gemisch zugesetzt werden muß. Eine Quelle für SLO sind Nährbouillons, welche das Bakterium Streptococcus pyogenes ("S pyogenes") enthalten. Jedoch ist die Beschaffung von SLO in dieser Weise ziemlich schwierig und kostspielig: Für jeden Liter der S. pyogenes-Nährbrühe können nur etwa 0,5 mg SLO erwartet werden; das typische Medium zum Ziehen von S. pyogenes ist teuer; S. pyogenes ist ein Klasse 2-Pathogen; und auf diese Weise erhaltenes SLO enthält viele andere Antigenstoffe. Außerdem neigt nach diesem Verfahren erhaltenes SLO zu Instabilität in flüssiger Form. Demzufolge werden derartige SLO-Zubereitungen typischerweise als lyophilisierte Pulver in Behältergefäßen geliefert. Vor der Verwendung muß das lyophilisierte Pulver in einem geeigneten Lösungsmittel rekonstituiert werden. Leider verliert derartiges rekonstituiertes SLO rasch seine hämolytische Aktivität und muß daher innerhalb einer kurzen Periode nach der Rekonstitution verwendet. oder als Abfall weggegossen werden. Dies hat eine beachtenswerte und negative Konsequenz: Es ist gewöhnlich unmöglich, individuelle Serumproben gleich, nachdem sie erhalten wurden, zu testen. Daher lagern Laboratorien, welche ASO-Assays auf der Grundlage hämolytischer Aktivität durchführen, typischerweise die individuellen Proben ein, bis eine ausreichende Anzahl angesammelt sind, um eine wirtschaftliche Verwendung des lyophilisierten SLO zu ermöglichen. Dies kann zu einer unangebrachten Verzögerung in der Gewinnung der Testergebnisse führen.
Für auf nephelometrischen oder turbidimetrischen Protokollen beruhende ASO-Assays werden beträchtliche Mengen an gereinigtem SLO benötigt. Wegen der mit der Gewinnung signifikanter Mengen an gereinigtem SLO von S. pyogenes verbundenen hohen Gestehungskosten war der vorstehend erläuterte Assay auf hämolytischer Grundlage der erste ASO-Assay, der kommerziell verfügbar wurde.
Rekombinanten-DNA-Verfahren zur Gewinnung von SLO-Fusionsprodukten bieten den Vorteil der Gewinnung relativ großer Mengen derartiger Produkte. Bei Verwendung einer derartigen Technik könnten die mühsamen und kosten-ineffizienten Aspekte der Gewinnung von SLO von S. pyogenes vermieden werden. In dem hier verwendeten Gebrauch bedeutet die Bezeichnung "SLO-Derivat" ein SLO-Fusionsprodukt, das löslich und hämolytisch aktiv ist und von wenigstens einem Antikörper bezüglich Wildform-SLO gebunden zu werden vermag. SLO-Derivate werden in der vorliegenden Beschreibung als "rSLO" bezeichnet. Diese SLO-Derivate werden in großen Mengen zur Verfügung gestellt, sind im wesentlichen rein und behalten ihre hämolytische Aktivität bei.
Derartige SLO-Derivate wären von Vorteil, beispielsweise bei immunodiagnostischen Assays, die beispielsweise auf den hämolytischen Eigenschaften von Wildform-SLO beruhen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert SLO-Varianten. Diese in der vorliegenden Beschreibung als "mSLO" bezeichneten Varianten weisen die folgenden Eigenschaften auf und werden hierdurch allgemein definiert: (i) Sie werden von Wildform- Anti-Streptolysin-O-Antikörpern (ASO), d. h. welche wenigstens ein für Wildform-Streptolysin-O charakteristisches Epitop enthalten, erkannt; und (ii) sie sind im wesentlichen nicht-hämolytisch aktiv. In der vorliegenden Verwendungsweise bedeutet der Ausdruck "erkannt" die Befähigung zur Bindung mit wenigstens einer epitopen Stelle an der mSLO; der Ausdruck "im wesentlichen nicht-hämolytische Aktivität" bedeutet eine prozentuale spezifische Wildform-SLO- Aktivität von weniger als etwa 75 % auf der Grundlage einer spezifischen Wildform-SLO-Aktivität von 4 x 10&sup5; hämolytischen Einheiten/mg Wildform-SLO; und "Wildform-SLO" wird die übliche mit einem derartigen Ausdruck verbundene Definition beigemessen, d. h. SLO, das auf natürliche Weise von einer hierzu befähigten bakteriellen Quelle sezerniert wird. "Wildform-SLO" schließt per definitionem nicht ein beispielsweise mittels Rekombinanten-DNA-Verfahren erhaltene SLO-Fusionsprodukte.
Ein besonders brauchbares rSLO gemäß der vorliegenden Erfindung wird in der vorliegenden Beschreibung als rSLO.3 bezeichnet, mit einer spezifischen hämolytischen Aktivität von etwa 3,6 x 10&sup4; hämolytischen Einheiten ("HU") pro mg.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein einzelner Strang der Nucleinsäure- Sequenz einer am meisten bevorzugten Ausführungsform eines als rSLO.3 bezeichneten SLO-Derivats; und
Fig. 2 ist die Aminosäure-Sequenz von rSLO.3.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele

In der Verwendungsweise der vorliegenden Beschreibung weisen Streptolysin-O-Derivate oder "rSLO" die folgenden Eigenschaften auf und werden dadurch allgemein definiert: (i) Vermögen zur Bindung von wenigstens einem Antikörper für Wildform-SLO; (ii) sie sind löslich nach der Expression; und (iii) sie sind hämolytisch aktiv. In der Verwendungsweise der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "Wildform- SLO" gemäß der diesem Ausdruck beigemessenen üblichen Definition verstanden, d. h. SLO, die auf natürlichem Weg von einer zur Sekretion eines derartigen Proteins befähigten bakteriellen Quelle sezerniert wird. Vorzugsweise beträgt die hämolytische Aktivität von rSLO etwa 75 % der hämolytischen Äktivität von Wildform-SLO, bezogen auf eine spezifische Aktivität von Wildform-SLO von 4 x 10&sup5; hämolytischen Einheiten/mg. Besonders bevorzugt beträgt die hämolytische Aktivität von rSLO zwischen etwa 5 % und 50 %, und am meisten bevorzugt etwa 9 % der hämolytischen Aktivität von Wildform- SLO, auf der Grundlage einer spezifischen Aktivität von Wildform-SLO von 4 x 10&sup5; hämolytischen Einheiten/mg Wildform-SLO. Diese Werte sind relativ; falls daher die prozentuale spezifische Wildform-SLO-Aktivität auf eine spezifischen Wildform-SLO-Aktivität von 1 x 10&sup6; hämolytischen Einheiten/mg bezogen ist, verringern sich die oben angegebenen Werte um einen Faktor von 2,5 (d. h. 75 % wird 30 %; 9 % wird 3,6 %; usw.).
Die vorgehende Klarstellung erfolgt, weil die "spezifische Aktivität" von Wildform-SLO mit Werten von bis zu etwa 1 x 10&sup6; hämolytischen Einheiten /mg berichtet wurde, obwohl auch eine spezifische Aktivität von etwa 4 x 10&sup5; hämolytischen Einheiten/mg beschrieben wurde. J. E. Abuf, "Streptococcal Toxins (Streptolysin O, Streptolysin S, Erythrogenic Toxin)", Pharmac. Ther. II: 661-717 (1980). Diese Veröffentlichung wird als Referenz in die vorliegende Offenbarung aufgenommen. Da somit die berichtete "spezifische Aktivität" von Wildform-SLO unzuverlässig ist, tragen die vorstehend angegebenen Prozentangaben dieser Tatsache Rechnung.
In der Gebrauchsweise der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Vektor" zweckmäßigerweise ein kreis- bzw. ringförmiges DNA-Makromolekül, welches wenigstens eine Restriktionsstelle und wenigstens ein Promotor-Gen aufweist. Der Ausdruck "Plasmid" bedeutet einen Vektor, der des weiteren einen Teil eines interessierenden Genoms, unter anderem ein Gen, umfaßt. Der Ausdruck "Wirt" bezeichnet eine Zelle, die zur "Transfektion" (transformierende Infektion) durch ein Plasmid befähigt ist.
Wie dem Fachmann bekannt, werden die meisten Vektoren im Hinblick auf ein gewünschtes Ergebnis ausgewählt. Beispielsweise wird in einem kommerziellen Rahmen typischeweise ein hoher Expressionspegel ("high-level expression") des interessierenden Gens vorgezogen, derart daß Vektoren mit einem geeigneten, zu derartiger Expression führenden Promotor gewählt werden; auf der anderen Seite kann es sein, daß im Rahmen von Forschungszwecken ein derartiger hoher Expressionspegel nicht kritisch ist, derart daß ein Vektor mit Translations- und Transkriptionssignalen, die unter Kontrolle von Regelelementen des Wirts stehen, geeignet sein kann. Somit ist es bei der Wahl eines für das gewünschte Ergebnis geeigneten Vektors häufig zweckmäßig, sich gleichzeitig auf das Promotor-Gen des interessierenden Vektors zu Promotor-Gene, die sehr hohe Werte von mRNA-Produktion erbringen, sind unter anderem beispielsweise PL, Ptac und PT7 Diese Liste soll keinevollständig-erschöpfende Liste sein und soll äuch nicht als solche ausgelegt werden. Vielmehr dienen diese Promotoren als Beispiele für die Zwecke der folgenden Erläuterung. Die Fachleute können unschwer einen geeigneten Vektor mit einem gewünschten Promotor auswählen, der gegenüber den in der Liste aufgeführten Promotoren gleichwertige Ergebnisse liefert.
Beispielsweise wird PT7 in Verbindung mit T7 RNA Pölymerase verwendet, welche RNA mit einer mehrfach höheren Geschwindigkeit als die von E. coli RNA Polymerase synthetisiert und welche die Transkription weniger häufig als E. coli RNA Polymerase terminiert. T7 RNA Polymerase ist hochselektiv für Initiation ihrer eigenen Promotorsequenz; daher initiiert sie keine Transkription von irgendeiner Sequenz an E. coly DNA. Des weiteren ist T7 RNA Pölymerase resistent gegenüber Antibiotika, wie beispielsweise Rifampicin, welche E. coli RNA Polymerase inhibieren. Daher bewirkt die Zugabe von beispielsweise Rifampicin zu Zellen, welche T7 RNA Polymerase promovieren, die ausschließliche Expression von Genen unter der Kontrolle eines T7 RNA Polymerase-Promotors, d. h. PT7.
Expression unter Verwendung des T7 RNA Polymerase/pT7- Systems beruht (typischerweise) auf einem Zwei-Plasmid System: Das erste Plasmid enthält das zu exprimierende Gen und PT7; das zweite Plasmid enthält das Gen für T7 RNA Polymerase. Das zweite Plasmid, beispielsweise pGP1-2 (welches das Gen für T7 RNA Polymerase enthält; vgl. Tabor und Richardson; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82: 1074-1078 (1985)), kann entweder permanent in E. coli anwesend sein oder in E. coli eingeführt werden mit einem spezialisierten Phagen, wie beispielsweise einem M13-Vektor (wie beispielsweise mGP1-2, vgl. Tabor und. Richardson) oder einem λ-Vektor (wie beispielsweise CE6, vgl. Studier und Moffett, J. Mol. Biol., 189: 113-130 (1986)), welche das T7 RNA Polymerase-Gen enthalten.
Typischerweise steht das zweite, das T7 RNA Polymerase-Gen enthaltende Plasmid unter der Kontrolle eines mittels Wärme induzierbaren E. coli Promotors, d. h. indem man die Temperatur von beispielsweise 30 ºC auf 42 ºC erhöht, wird der warme-induzierbare E. coli Promotor eingeschaltet, der seinerseits den pT7-Promotor des ersten Plasmids einschaltet und dadurch zur Expresslon, beispielsweise des interessierenden Gens führt. Somit weist bei Verwendung eines T7 RNA. Polymerase/pT7-Expressionssystems das E. coli-System einen wärme-induzierbaren Promotor, wie beispielsweise lambda PL mit einem CI&sub8;&sub5;&sub7;-Repressor, auf.
Beispiele von pT7 enthaltenden Vektoren sind unter anderem beispielsweise die pT7-Reihe (pT7-5, pT7-6 und pT7-7, welche Derivate von pT7-1 sind; vgl. Tabor und Richardson, supra.). und die PET-Reihe (vgl. Studier et al., Methods Enzymol. 185: 60-89 (1990)).
Ein anderes Vektorsystem weist ein PL-Promotor-Gen auf. Der PL-Promotor ist von dem λ Bacteriophagen abgeleitet und ist einer der leistungsstärksten regulierten E. coli- Promotoren. Die Transkription von PL kann voll unterdrückt werden, und daher können Plasmide, welche PL enthalten, durch den λ Repressor cl stabilisiert werden. Dieser Repressor wird typischerweise von einem E. coli-Wirt geliefert, der eine integrierte Kopie eines Teils des λ-Genoms aufweist. Ein derartiger E. coli-Wirt, der als ein "E. coli Lysogen" bezeichnet wird, ist wie folgt gekennzeichnet:
(i) Er liefert die λ-Regulierproteine cI und N (eine Anti- Terminations-Funktion); und (ii) er liefert keine lytischen Komponenten, die normalerweise zu Zell-Lysis führen würden. Somit können E. coli-Lysogene, die mit beispielsweise ein interessierendes Gen und PL enthaltenden Plasmiden transfiziert sind, anfänglich ohne Expression des Gens zu einer hohen Dichte herangezüchtet werden und sodann zur Synthese des Proteins unter Desaktivierung des Repressors induziert werden. Beispiele von Vektoren auf PL-Basis sind beschrieben beispielsweise in der US-Patentschrift 4 925 799 ("pAS1"), Shatzman und Rosenberg, "The PAS Vector System and Its Application to Heterologous Gene Expression in Eschericia coli", Heptalogy 7: 305-355 (1987) und Rosenberg et al., "The Use of pKC3O and its Derivatives for Controlled Expression of Genes", Methods Enzymol 101: 123-139 (1983).
Der Ptac-Promotor ist ein hybrider Promotor auf der Grundlage der tac- und lac-Promotoren. de Boer et al., "The tac promoter: A functional hybrid derived from the trp and lac promoters", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983); vgl. auch Amann et al., "Vectors bearing a hybrid trp-" promoter useful for regulated expression of cloned genes in Eschericia coli", Gene 25: 167-178 (1983). Da Ptac den lac-Operatorabschnitt enthält, kann es durch E. coli-Stämme, welche eine Überproduktion des lac-Repressors aufweisen, reprimiert und durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogaloctosid (IPTG) voll induziert werden.
Alle vorstehenden Referenzen werden durch Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung aufgenommen.
Die Wahl eines geeigneten Vektor/Wirt-Systems liegt im Bereich der jeweiligen speziellen Bedürfnisse des Fachmanns. Ein besonders bevorzugter Vektor basiert auf dem PL-Promotor. Tabelle I gibt eine repräsentative (nicht ausschließliche) Liste geeigneter Vektoren und Wirte, sowie die Quellen hierfür, wieder. Tabelle I
* = E. COLI CELL
(1) = BOEHRINGER MANNHEIM
(2) = STRATAGENE CLONING SYSTEMS
(3) = CLONETECH LABORATORIES, INC.
(4) = BETHESDA RESEARCH LABS
(5) = SMITHKLINE BECKMAN NOW SMITHKLINE BEECHAM
(6) = PHARMACIA LKB
Für die folgenden Beispiele wurden die Vektoren pΔ33 und pBTac2 DNA verwendet in Verbindung mit den Wirtsstämmen AR120 bzw. JM105, für die Subclonierung (anfänglich vom pUC19-Vektor) und die Expression von rSLO.3.

Beispiele

Die folgenden, auf bevorzugte Ausführungsformen gerichteten Beispiele sind nicht als Einschränkungen des Umfangs der weiter unten folgenden Ansprüche beabsichtigt, noch sollen sie als solche ausgelegt werdön.

Beispiel 1

Herstellung von partiell aufgeschlossener (digerierter) genomischer Streptolysin-O-DNA

Aus Streptococcus pyogenes (ATCC #10389) wurde genomische DNA nach der Verfahrensweise isoliert, die in M. Kehoe e& al., Infect. Immun., 55: 3228-3232 (1987) (nachfolgend: "Kehoe, 1987"), beschrieben ist; diese Veröffentlichung wird im Wege der Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingeführt. Nach diesem Verfahren wurde etwa 1mg S. pyogenes DNA erhalten (925 µg).
Zu 370 µl der S. pyogenes DNA (2,5 µg/µl) wurden 300 µl 10X High Salt Buffer (1,0 M NaCl; 100 mM Tris-hydroxyaminomethanchlorid ("TRIS-C1"), pH 7,5; 100 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithriothreotol ("DTT"), 2310 µl entionisiertes H&sub2;o und 20 µl Bgl II (BRL, Gaithersburg, MD, Cat. #52135A), zugegeben, auf ein Endvolumen von 3000 µl. Dieses Gemisch wurde bei 37 ºC gehalten und über Nacht inkubiert.
Zu diesem inkubierten Gemisch wurden 3000 µl Reagenz A (250 pl Phenol, 250 µl Chloroform, 10 µl Isoamylalkohol, 1 µl β-Mercaptoäthanol) zugegeben. Dieses Gemisch wurde umgerührt und sodann zentrifugiert, um die wäßrige und organische Schicht zü trennen. Der wäßrige Überstand wurde sodann mit 0,3 M NaOAc und 95 % Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde in 250 µl TE (10 mM TRIS-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA) wieder aufgelöst, und hierzu wurden 25 µl 10x Ballastfarbstoff (0,2 M EDTA; 50 % Glycerol; 0,25 % xylolcyanol; 0,25 % Bromphenol-Blau) zugegeben, mit nachfolgender Elektrophorese auf 1 % Agarose-Gel. Die Bgl II partiell aufgeschlossenen S. pyogenes genomischen DNA-Fragmente wurden sodanh gemäß ihrer Größe evaluiert.
Wie erwähnt, hat SLO ein ungefähres Molekulargewicht von 65 000 bis 70 000 Dalton. Jede Aminosäure hat jeweils ein ungefähres Molekulargewicht von 110 Dalton, so daß also (konservativ geschätzt) ein Protein von 70 000 Dalton durch ca. 636 Codone oder 1909 Basenpaare codiert würde. Somit wurden die partiell aufgeschlossenen bzw. digerierten Fragmente von zwischen etwa 2000 bis 2500 Basenpaaren (d. h. 2,0 bis 2,5 Kb), wie sie nach dem vorstehend erwähnten Gel- Elektrophoreseverfahren bestimmt wurden, gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden sodann in 150 µl TE resuspendiert. Der Einfachheit halber werden diese im folgenden als "SLO-Inserts" bezeichnet.

Beispiel 2

Herstellung von Streptolysin-O enthaltenden Plasmiden

Der verwendete Vektor war mit Bam Hi (BRL, Cat. # 52015A) geschnittenes pUCl9 (BRL, Cat. # 5364SA).
Zu 1 µl aufgeschnittenem pUC199-Vektor wurden 15 µl der SLO- Inserts, 3 µl 10x Ligationspuffer (660 mM TRIS-Cl, pH 7,5; 50 InM Magnesiumchlorid; 10 mM DTT; 10 mM ATP) zugegeben. Durch Zugabe von 8 µl entionisiertem H&sub2;O wurde ein Endvolumen von 30 µl erreicht. Zu diesem Gemisch wurden 2 µl T4-Ligase (USB, 5 µg/µl) zugesetzt; die Inkubation des Ansatzes bei Zimmertemperatur erfolgte über Nacht. Der Einfachheit halber wird das erhaltene Material als "SLO-Plasmidkandidaten" bezeichnet.

Beispiel 3

Screening der SLO-Plasmidkandidaten

Wirtszellen vom E. coli-Stamm JM105 wurden in der folgenden Weise mit den SLO-Plasmidkandidaten transformiert. Ein Behältergefäß, welches 300 µl gefrorenes JM105-Zellmaterial enthielt, wurde aufgetaut, und 16,0 µl der SLO-Plasmidkandidaten wurden hierzu zugesetzt. Dieses Gemisch wurde auf Eis 30 min lang inkubiert, mit nachfolgendem Wärmeschock in einem Wasserbad von 37 ºC über 2 min. Danach wurde die transfizierte JM105-Lösung zu 2 ml LB-Medium (10 g Bactotryptan; 5 g Bacto-Hefeextrakt; 10 g NaCl; 1 l entionisiertes Wasser; pH 7,5, mit Natriumhydroxid) zugegeben, sodann 30 min lang bei 37 ºC geschüttelt (200 U/min). Danach erfolgte eine Plattenzüchtung auf LB-Ampicillinplatten, mit nachfolgender Inkubation über Nacht bei 37 ºC; der Einfachheit halber werden die hierbei erhaltenen Materialien als "SLO-Transformanten" bezeichnet.
Das Screening wurde unter Anwendung eines neuartigen Verfahrens durchgeführt. Nach Wachstumszüchtung über Nacht wurden die Kolonien mit 3 ml 2,5 % gewaschenen roten Blutzellen von Kaninchen in 0,8 % Agarose in PBS/10 mM DTT überschichtet, die zur Bedeckung der Platten ausgebreitet wurden. Nach einer Inkubation von 40 min bei 37 ºC waren die SLO enthaltenden Kolonien von kleinen Hämolysezonen umgeben. Zum Nachweis, daß diese Kolonien SLO enthielten, wurde eine 25-mer-Oligonucleotidsonde als Sonde verwendet, welche von den Nucleotiden 670 bis einschließlich 694 der berichteten DNA-Sequenz von SLO (vgl. Kehoe, 1987) abgeleitet war. Diese Sonde wurde mit einem Biosearch 8600 DNA-Synthetisator hergestellt und mit ³²p markiert, nach dem in Maniatis et al., Molecular Cloning, CSPL (1982), S. 122-126(nachfolgend: "Molecular Cloning") beschriebenen T4-Polynucleotidkinaseverfahren.
Das Blutüberschichtungs-Screeningverfahren erwies sich als eine wirksame und genaue Methode für ein rasches Screening des von den SLO-Transformanten exprimierten SLO. Da eine Eigenschaft von SLO seine Fähigkeit zur Lyse roter Blutzellen ist, können rote Blutzellen aus einer beliebigen Quelle, d. h. vom Menschen, von Mäusen, Ziegen, Kaninchen, usw. verwendet werden. Rote Blutzellen von Kaninchen werden ihrer guten. Verfügbarkeit wegen vorgezogen.
Ein SLO-Clon, der zur Expression von Protein führte, das hämolytische Aktivität zeigte und mit der 25-mer-Sonde hybridisierte, wurde als "pUC19-SLO-B" bezeichnet. Der Einfachheit halber wird die Nicht-Vektor-DNA-Sequenz hiervon als "rSLO-Kandidaten" bezeichnet.

Beispiel 4

Optimierung der Expression und Bestimmung der Löslichkeit
Um die Expression von rSLO-Kandidaten zu optimieren, wurde ein zeitlich gesteuerter Aufschluß bzw. Digestion von rSLO- Kandidaten unter Verwendung von Bal-31 durchgeführt. Außerdem ist, wie bereits erwähnt, Löslichkeit des exprimierten Proteins ab initio, d. h. ohne weitere chemische Modifikation nach der Expression, von Wichtigkeit. Dies deshalb, weil nicht-lösliches SLO per definitionem inaktiv ist. Daher wurde auch eine Analyse durchgeführt zur Bestimmung, ob das exprimierte Protein löslich war, d. h. nach der Zentrifugation in einem Überstand statt in einer Pille vorlag.
Das pUC19-SLO-B wurde anfänglich mit Bste II (New England Bio Labs, Cat. # 162, 10 U/µl:) wie folgt zerschnitten. Zu 20µl pUC19-SLO-B (2,5 µg/µl) wurden 40 µl 10X High Salt Buffer, 335 µl entionisiertes H&sub2;O und 5 µl BstE II zugegeben. Dieses Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 60 ºC inkubiert, mit folgender Extraktion mit 400 µl Reagenz A und Präzipitation mit 44 µl 3 M NaOAc (pH 4,8) in 888 µl 95- %igem Äthanol. Das Präzipitat wurde sodann in 40 µl H&sub2;O wieder aufgelöst. Danach wurden 90 µl H&sub2;O, 20 µl 10X Bal- 31-Puffer (120 mM CaCl&sub2;; 120 mM MgCl&sub2;, 2,0 M NaCl; 0,2 M TRIS-Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA) und 50 µl 1 mg/ml Rinderserumalbumin mit dem wieder aufgelösten Präzipitat gemischt. Hierauf wurden 10 µl Bal-31 (New England Bio Labs, Cat. # 213, 100 U/ml) bis zu einer Gesamtmenge von 210 µl zugegeben, mit nachfolgender Inkubation bei Zimmertemperatur. Zur Kontrolle der Wirkungen von Bal-31 wurden 30 µl-Teilmengen der 210 µl Gesamtlösung in den Zeitpunkten 30, 45, 60, 80, 105, 130 und 160 min nach der Bal-31-Zugabe entnommen, und diese Teilmengen wurden jeweils mit 3,3 µl von 0,2 M EGTA gemischt und nachfolgend auf Eis gelagert. Nach der Präparierung und Speicherung der letzten Teilmenge wurden alle sieben Teilmengen gepoolt, mit 230 µl Reagenz A extrahiert und mit 23 µl 3 M NaOAc in 506 µl 95-%igem Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde sgdann in 75 µl H&sub2;O erneut gelöst.
Es folgte eine Ausfüllreaktion durch Zugabe von 5 pl 2,5 mM dXTP, 10 µl 10X Medium Salt Buffer (500 mM NaCl; 100 mM TRIS-Cl, pH 7,5; 100 mM MgCl&sub2;; 10 mM DTT) und 10 µl 100 mM DTT zu 75 µl des wieder gelösten Präzipitats, mit nachfolgender Zugabe Von 6 µl Klenow-Polymerase (5 U/µl) und Inkubation über 4 Stunden bei Zimmertemperatur. Dieses Gemisch wurde mit 100 µl Reagenz A extrahiert, es folgten Ausfällung mit 11 µl 3 M NaOAC in 22 µl 100-%igem Äthanol und Resuspensiön des Präzipitats in 40 µl H&sub2;O.
Nach der Ausfüllreaktion wurden 17 µl des resuspendierten Prazipitats mit 3 µl eines eine Bam HI-Sequenz (New England Bio Labs, Cat # 1021) enthaltenden Linkers und 5 µl von 5X- Linkerligation-Puffer (250 mM TRIS-Cl, pH 7,6; 50 mM MgCl&sub2;; 5 mM DTT; 5 mM ATP; 2,5 % (w/v) PEG 8000 (J. T. Baker, Cat. # U222-09)) gemischt. Hierauffolgte die Zugabe von 2 µl T4- Ligase (5 U/µl) und Inkubation über 6 Stunden bei Zimmertemperatur. Der Einfachheit halber wird das erhaltene Material als "ca/ew" bezeichnet.
Der E. coli-Stamm JM105 wurde mit ca/ew wie vorstehend beschrieben transformiert, mit anschließender Wachstumszüchtung über Nacht, wie oben in Beispiel 3 beschrieben. Zur Bestimmung, ob die Plasmide den Bam HI-Linker enthielten, wurden zu 40 µl ca/ew (0,5 µg/µl) 40 µl von 10X Medium Salt Buffer sowie 320 µl entionisiertes H&sub2;O zugegeben. Zu diesem Gemisch wurden 5 µl EcoRI (BRL, Cat # 5202 SA, 10 U/µl) zugegeben, mit nachfolgender Inkubation über 2 Stunden bei 37 ºC. Zur Vergewisserung, daß das Plasmid geschnitten war, wurde eine Gel-Elektrophorese (1 % Agarose-Gel) durchgeführt; dies ergab einen Aufstrich unterschiedlicher Abmessungen, als Anzeige für erfolgreiches Aufschneiden. Zu dem geschnittenen Plasmid wurden 8 µl 5 M NaCl zugegeben, danach 5 µl Bam HI (10 U/µl). Dieses Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Eine Bestimmung der Größe der der Bal-31-Digestion unterworfenen rSLO-Kandidatensequenz wurde mittels Gel-Elektrophorese (1 % Agarose-Gel) durchgeführt. Dies ergab ein interessierendes Band bei etwa 1,2 bis etwa 2,0 Kb, welches rSLO-Kandidaten aufwies. Somit waren die anfänglichen Fragmente von 2,0 bis 2,5 Kb, die hämolytische Aktivität zeigten, in ihrer Abmessung beträchtlich verringert.
Das rSLO-Kandidaten enthaltende Band wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in 15 µl TE gereinigt, derart daß rSLO-Kandidaten zur Ligation inzuvormit Bam HI und ECoRI geschnittenem pUC19-Vektor verfügbar waren. Zur Durchführung einer derartigen Verknüpfung bzw. Ligation wurden 10 µl des gelgereinigten rSLO-Kandidaten mit 4 µl des zuvor präparierten Vektors, 2 µl von 10X Ligationspuffer, 2 µl von 10 mM ATP und 2 µl entionisiertem H&sub2; gemischt. Zu diesem Gemisch wurden sodann 2 µl T4-Ligase zugegeben, mit nachfolgender Inkubation über 6 Stunden bei Zimmertemperatur. Ein E. coli- Wirtszellenstamm JM105 wurde mit diesen Plasmiden wie obeü transformiert, und aktive Kolonien wurden durch Screening nach dem oben beschriebenen Überschichtungsverfahren mit roten Blutzellen nachgewiesen. Es wurden sodann aktive Kolonien ausgewählt, in LB Medium/100µg/ml Ampicillin inokuliert und unter den oben beschriebenen Bedingungen über Nacht gezüchtet.
Nach der Wachstumszüchtung über Nacht wurden die Zellen 5 min lang bei 8;000 U/min bei 4 ºC zentrifugiert und die erhaltenen Pillen in 2 ml Reagenz B (150 mM NaCl; 20 mM TRIS, pH 7,0; 1 mM EDTA) resuspendiert. Danach wurden die resuspendierten Zellen einer Schallbehandlung während 2 x 30 sec auf Eis unterzogen; mit nachfolgender Zentrifugation bei 9500 U/min über 40"min bei 4 ºC, unter Verwendung einer Beckman JA20.1-Zentrifuge, um das exprimierte Protein zu erhalten.
In diesem Stadium. wäre das Prötein, falls der rSLO-Kandidat zur Expression eines löslichen Proteins führte, im Überstand vorhanden. Somit wurde eine Analyse auf das Vorliegen von rSLO-Kandidaten im Überstand durchgeführt, nach standardisierten Western-Blotting-Protokollen, zur Bestimmung eines antigenisch aktiven Proteins. Die Ergebnisse einer derartigen Western-Blotting-Analyse zeigen an, daß im Überstand ein SLO-Fusionsprodukt vorlag, das durch Pferde-Anti-SLO-Antikörper erkannt wurde. Ein derärtiges Fusionsprodukt wurde ausgewählt und als "rSLO.3" bezeichnet. Der Einfachheit halber wird die zur Expression von rSLO.3 führende DNA- Sequenz ebenfalls als rSLO.3 bezeichnet. Danach wurde eine rSLO.3-Expressipn hoher Intensität versucht.

Beispiel 5

Hocheffiziente (High Level) Expression von rSLO.3

Die Entfernung von rSLO.3 von dem pUC19-Vektor enthaltenden Plasmid wird wie folgt durchgeführt. Zu 15 µl des rSLO.3 (0,5 µg/µl) enthaltenden Plasmids wurden 40 µl 10X Sma I- Puffer (200 mM KCl; 100 mM TRIS-Cl, pH 8,0; 100 mM MgCl&sub2;; 10 mM DTT) und 345 µl entionisiertes H&sub2;O zugegeben. Zu diesem Gemisch wurden 5 µl Sma I (BRL, Cat # 5228 SA, 10 U/µl) zugegeben, mit nachfolgender Inkubation während 2 Stunden bei 37 ºC. Zur Vergewisserung, daß das Plasmid zerschnitten war, wurde eine Gel-Elektrophorese (1 % Agarose-Gel) durchgeführt; diese ergab ein einzelnes Band, als Anzeige eines erfolgreichen Schneidvorgangs. Zu dem geschnittenen Plasmid wurden 8 µl 5 M NaCl zugegeben, nachfolgend 5 µl Bam HI (10 U/µl). Dieses Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Zurvergewisserung, daß die rSLO.3-Sequenz erfolgreich von dem annähernd 2,7 Kb langen pUC19-Vektor herausgeschnitten war, wurde eine Gel-Elektrophorese (1 % Agarose-Gel) durchgeführt. Dies ergab zwei Bänder, eines bei etwa 2,7 Kb (dem Vektor) und das andere bei etwa 1,4 Kb (rSLO.3). Dieses Band wurde von dem Gel ausgeschnitten und in 15 µl entionisiertem H&sub2;O gereinigt, derart daß rSLO.3 für die Ligation bzw. Verknüpfung in dem zuvor mit Bam HI und Sma 1 geschnittenen pΔ33-Vektor verfügbar war.
Zu 2 µl der wie vorstehend erhaltenen rSLO.3-DNA wurden 2 µl des oben beschriebenen Vektors zugegeben, 1,5 µl von 10X-Ligationspuffer, 1,5 µl 10 mM ATP und 8 µl entionisiertes H&sub2;O. Zu diesem Gemisch wurden 2 µl T4-Ligase (10 U/µl) zugesetzt, mit nachfolgender Inkubation über 5 Stunden bei Zimmertemperatur. Eine derartige Inkubation ergab rSLO.3 und pΔ33-Vektor enthai[tende Plasmide.
Der E. coli-Stamm AR120 wurde mit den zuvor beschriebenen Plasmiden gemäß dem für den E. coli-Stamm JM105 beschriebenen Verfahren transformiert. Danach wurde. ein in Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Auschel et al., Eds. John Wiley & Sons (New York) (1987), Section 1.6, beschriebenes DNA-Mini-Prep bewirkt, mit nachfolgendem Ausschneiden der Plasmide mit Bam HI und Sal 1 (BRL, Cat. # 5217 SA), zur Bestimmung, ob die Plasmide rSLO.3 enthielten. Die mit rSLO.3 enthaltenden Plasmiden transformierten Wirtszellen wurden sodann einer Induktion gemäß dem Nalidixinsäure- Protokoll unterzogen. Vgl. J. E. Mott et al., "Maximizing gene expression from plasmid vectors containing the λPL promoter: Strategies for overproducing transcription termination factor p", PNAS USA, 82: 88-92 (1985); diese Literaturstelle wird im Wege der Inbezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung aufgenommen. Wie die Fachleute erkennen, induziert Nalidixinsäure, welche DNA schädigt, recA-Protein, ein Recovery- bzw. Erholungsprotein für E. coli. Ein damit in Zusammenhang stehender Vorteil bezüglich Über-Expression besteht darin, daß reca Protease-Aktivität besitzt, was u. a. zur Inaktivierung von λcI&spplus;-Repressor führt; diese Desaktivierung führt zu Über-Expression durch den pL-Promotor.
Im einzelnen wurden Kolonien, welche die transformierten ARI2O enthalten, von den Agarplatten aufgenommen und in Superbroth (Base - 12 g Tryptgn, 24 g Hefeextrakt, 5 ml Glycerol, 900 ml destilliertes H&sub2;O; Salz (pro Liter Base) - 1,7 g KH&sub2;PO&sub4;m 15,8 g K&sub2;HPO&sub4; (wasserfrei) 100 ml destilliertes H&sub2;O) sowie 100 µg/ml Ampicillin bei 37 ºC so lange inokuliert, bis die optische Dichte des Mediums bei A&sub6;&sub5;&sub0; 0,4 betrug. Danach wurde Nalidixinsäure zu dem inokulierten Gemisch bis zu einer Endkonzentration von 60 µg/ml zugegeben und 4 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Western- Blotting-Analyse. des Überstands zeigte das Vorliegen von rSLO.3.
Danach wurden die DNA- und Aminosäure-Sequenzen von rSLO.3 bestimmt (Lark Sequencing Technologies, Houston TX). Eine einzelsträngige Darstellung der festgestellten DNA-Sequenz von rSLO.3 ist in Fig. 1 wiedergegeben, die festgestellte Aminbsäure-Sequenz von rSLO.3 in Fig. 2.

Beispiel 6

Spezifische Aktivität von rSLO.3

Unmittelbar nach der Nalidixinsäure-Induktion wurden die Proteinkonzentration und die spezifische Aktivität von nicht-gereinigtem SLO.3 bestimmt.
Die Proteinkonzentration für rSLO. 3-Rohextrakte wurde nach dem BioRad Protein Assay-Verfahren (Coomassie Blue G-256) abgeleitet. Mit Nalidixinsäure induzierte Proteingemische wurden bei 8000 U/min 5 min lang bei 4 ºC zentrifugiert und die Pellets in 500 µl Sonication-Puffer (40 mM TRIS, pH 7,5; 1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 mM NaCl) resuspendiert. Die resuspendierten Pellets wurden sodann zweimal 30 sec auf Eis schallbehandelt, mit nachfolgender Zentrifugation über 40 min bei 4 ºC mit 12 000 U/min. Danach wurden 5 µl des resuspendierten rSLO.3-Gemischs auf Proteinkonzentration analysiert (Vermessung der optischen Dichte bei A&sub5;&sub9;&sub5;) und die Proteinkonzentration zu 4,6 µg/µl bestimmt.
Die spezifische Aktivitat wurde durch Verdünnungsreihen des oben erwähnten Rohextrakts unter Zugabe von gewaschenen roten Kaninchenblutzellen ("RRBC", "rabbit red blood cells") mit nachfolgender spektralphotometrischer Vermessung (optische Dichte bei A&sub5;&sub4;&sub1;) bestimmt. 5 ml frisches Kaninchenblut wurde zweimal mit 45 ml PBS einschließlich 10 mM DTT gewaschen und anschließend 5 min lang bei 4 ºC mit 2000 U/min zentrifugiert. Danach wurden 1,125 ml der gewaschenen roten Kaninchenblutzellen ("RRBC") vom Boden des Röhrchens abgezogen und 48,875 PBS/10 mM DTT hinzugegeben. Dies ergab eine Lösung, welche 2,25 % RRBC enthielt. Für die hämolytischen Assays wurden 500 µl der 2,25-%igen RRBC zu 500 µl von serienmäßig im Verhältnis 1:2 in PBS/10 mM DTT verdünntem rSLO.3 zugegeben, mit nachfolgender Inkubation während 30 min bei 37 ºC.
Diese Verdünnungsreihen wurden spektralphotometrisch analysiert (Messung der optischendichte bei A&sub5;&sub4;&sub1;). Diese Analyse ergab, daß 0,2 µl des verdünnten rSLO.3-Rohextrakts 50 % Hämolyse der RRBC bewirkte; 0,2 µl des verdünnten Extrakts sind äquivalent 2 µl des Extrakts selbst. Somit zeigte der rSLO.3-Rohextrakt eine hämolytische Einheit ("HU") pro zwei Mikroliter, oder 500 HU/ml.
Wie angegcben, wurde die Proteinkonzentration des Rohextrakts zu 4,6 mg/ml bestimmt. Dementsprechend betrug die spezifische Aktivität von rSLO.3, das von dem pΔ33-AR120- Expressionssystem abgeleitet war, 108,7 HU/mg. Es wird darauf hingewiesen, daß, da es sich hierbei um Werte fur einen rohen (d. h. nicht-gereinigten) Extrakt handelt, diese Werte für die Gesamtprdteinkonzentration des Extrakts gelten. Für einen gereinigten Extrakt nehmen die spezifischen Aktivitätswerte zu.

Beispiel 7

Gewinnung von rSLO.3

Das folgende Verfahren bezieht sich auf ca. 200 g transformierte Wirtszellen (d. h. etwa 6 g Gesamtprotein).
Transformierte Wirtszellen wurden in 200 ml Reagenz C (40 mM TRIS, pH 7,5; 1 mM EDTA; 0,1 % 2-Mercaptoäthanol) resuspendiert und danach 100 mM PMSF zugegeben. Danach wurden die Zellen durch Schallbehandlung aufgebrochen und anschließend 4 ml 100 mM PMSF zugegeben. Dieses Gemisch wurde 30 min lang bei 4 ºC mit 15 000 U/min zentrifugiert.
Der erhaltene Überstand wurde entnommen und aufbewahrt; zu dem Pellet wurden 200 ml Reagenz C zugegeben, mit anschließender Zugabe von 4 ml 100 mM PMSF. Das resuspendierte Pellet wurde sodann schallbehandelt und anschließend wie oben zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde sodann entnommen und mit dem früheren Überstand vereinigt und der pH-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt.
Zu dem Endvolumen des Überstands wurde langsam (mit Umrühren bei Zimmertemperatur) Polymin P (Aldrich Chemicals) bis zu einer Endkonzentration von 0,75 % zugegeben. Dieses Gemisch wurde sodann 30 min lang bei Zimmertemperatur mit 10 000 U/min zentrifugiert und danach der Überstand gewonnen. Unter Umrühren wurde festes Natriumsulfat langsam zugegeben, bis zu 80 % Sättigung des Überstands.
Danach wurde das Gemisch 2 Stunden lang bei: 4 ºC gerührt und anschließend 30 min lang bei 4 ºC mit 15 000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde sodann entnommen und in 400 ml gesättigtem Ammoniumsulfat, pH 7,0, resuspendiert. Das Gemisch wurde sodann 30 min lang bei 4 ºC mit 10 000 U/min zentrifugiert, das Pellet anschließend entnommen und in 200 ml Reagenz D (20 mM TRIS, pH 7; 1 mM EDTA; .0,1 % 2- Mercaptoäthanol) resuspendiert.
Das resuspendierte Pellet wurde sodann bei 4 ºC gegen 2 l Reagenz D dialysiert, mit 4 Wechseln. In der Dialysetasche wurde genügend Platz gelassen, insofern das Volumen der Probe. zunimmt. Nach der Dialyse wurde der pH-Wert der Probe kontrolliert und mit NaOH auf 7,0 eingestellt.
Die Probe wurde sodann in eine in Reagenz D äquilibrierte Pharmacia Fast Flow S-Sepharose-Säule beschickt. Ein Bettvolumen von 400 ml erwies sich als ausreichend zur Entfernung des MSLg.3/6 aus der Probe. Der E. coli-Proteine enthaltende Durchsatz wurde gesammelt und abgeschieden und die Säule mit ca. 1 l Reagenz D 4ewaschen.
Das rSLO.3 wurde mit 2 x 1 l 0,0 bis 0,4 M NaCl-Gradienten im Puffer B eluiert. Die Fraktionen wurden mit SDS-Acrylamid-Gel (9 %) analysiert und Fraktionen mit hohen rSLO.3- Mengen gepoolt. Es wurden ca. 250 ml gepooltes rSLO.3 gewonnen.
Bei Anwendung des vorstehenden Verfahrens waren ca, 60 % des ursprünglichen Gesantprot eins (d. h. ca. 0,36 g) rSLO.3, das bei 4 ºC bis zum Bedarfsfall gelagert werden kann.

Beispiel 8

Reinigung. von rSLO.3

Nach dem folgenden Protokoll erfolgte eine Reinigung des rSLO.3 bis zu einem Reinheitsgrad von wenigstens 80 %.
Ca. 600 g gefrorene Zellpaste, die gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahrensprotokoll erhalten wurde, wurde aufgetaut (37 ºC), in 3 1 kaltem Lysispuffer (40 mM TRIS-Cl, pH 7,0; 1 mm EDTA; 0,1 % 2-Mercaptoäthanol; 2 M NaCl; 4 ºC) resuspendiert und 60 min lang bei 4 bis 10 ºC mit einem Heat Systems Ultrasonics Continuous Flow Sonicator (Farmingdale, N. Y., No. W-385) ultraschallbehandelt. Danach wurde das Material auf einer Beckman JAB-Zentrifuge 40 min lang bei 20 bis 26 ºC mit 9500 U/min zentrifugiert. Es wurden ca. 3 l Überstand erhalten.
Zu dem Überstand wurde eine 12,5-%ige Vorratslösung von Polymin P-Fällungsmittel (Aldrich, Milwaukee, Wis.) bis zu einer Endkonzentration zwischen 0,2 bis 0,3 % zugegeben. Die Lösung wurde sodann 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt und das Präzipitat verworfen. Der pH-Wert des flüssigen Teils wurde sodann mit NaOH auf 7,0 eingestellt. Diese Flüssigkeit wurde sodann über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen.
Danach wurde die Lösung wie oben zentrifugiert, und man erhielt einen klaren Überstand. Der Überstand wurde sodann in eine 1 l-Phenyl-sepharose HIC-Säule (Pharmacia, Piscataway, N. J.) in einer Menge von 2 ml/min bei Zimmertemperatur beschickt. Danach wurde die Säule mit einem Eluierpuffer (20 mM TRIS-Cl, pH 7,0; 1 mM EDTA; 0,1 % BME) mit einer Geschwindigkeit von 7 ml/min gewaschen. Die Fraktionen wurden mittels SDS-Page-Elektrophorese unter Verwendung des Pharmacia Phast-Page -Systems überwacht. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Biorad Protein Assay-Set bestimmt. Proteinhaltige Fraktionen wurden sodann vereint.
Die vereinigten Fraktionen wurden sodann auf eine 1 l Blue Affinity-Säule (BioRad, Richmond, California) mit einer Aufgabegeschwindigkeit von 2 ml/mm bei Zimmertemperatur beschickt, mit nachfolgender Waschung unter Verwendung des oben beschriebenen Eluierpuffers bei einem Durchsatz von 2 ml/min bei Zimmertemperatur über zwei Säulenvolumina.
Die Eluierung von gebundenem Protein wurde unter verwendung eines NaCl-Dichtegradienten von 0,0 bis 0,8 M, pH 7,0, durchgeführt. Die Fraktionen wurden mit dem Phast-PAGE- System überwacht, und die Proteinkonzentration wurde mit dem BioRad Protein Assay-Set bestimmt. Auf dem NaCl-Dichtegradienten wurde eine einzige Spitze bei 0,3 bis 0,4 M erhalten.
Die Reinheit des eluierten rSLO.3 wurde unter Verwendung eines Beckman DU 7500-Spektralphotometers evaluiert, auf der Grundlage einer Analyse der Hauptbandenhomogenität mittels Gel-Elektrophorese (12 % SDS-Polyacrylamid) von sechs verschiedenen Mengen. des eluierten rSLO.3 (16, 8, 4, 2, 1, 0,5 µg rSLO.3). Die ermittelte Reinheit von rSLO.3 auf der Grundlage von Hauptbandenhomogenität ist in Tabelle 2 zusammengestellt: Tabelle 2
Zur Bestimmung der hämolytischen Aktivität wurde die Konzentration von gereinigtem rSLO.3 ermittelt. Ein 1:25600 Titer einer 0,7 mg/ml-Konzentration von gereinigtem rSLO.3 war erforderlich, um eine mehr als 50-%ige Lysis von 2,5 % RRBC zu erzielen. Somit beträgt die spezifische hämolytische Aktivi tät von gereinigtem rSLO.3 etwa 3,6 x 10&sup4; HU/mg (25 600 ÷ 0,7).
Wie angegeben, sind die spezifische Aktivität und die prozentuale hämolytische Aktivität spezieller Versionen von rSLO (gereinigtes rSLO.3), auf der Grundlage der "spezifischen Aktivität" von Wildform-SLO, Wie folgt: Tabelle 3

Beispiel 9

In vivo-Toxizitätswirküngen von rSLO.3

Zur Bestimmung der in vivo-Toxizitätseffekte von rSLO.3 wurden Balb/c-Mäusen unverdünnte und verdünnte intravenöse Injektionen von rSLO.3 verabreicht. Einer äquivalenten Anzahl von Mäusen wurden unverdünnter und verdünnter Kontroll- Suspensionspuffer verabreicht. Zur Verbesserung der intravenösen Injektionen wurden die Mäuse unter einer Heizlampe 20 bis 30 min vor der Injektion aufgewärmt. Es wurden ca. 20 Mäuse für jeden Zustand verwendet.
Für das unverdünnte rSLO.3 erhielt jede Maus jeweils eine ungefähre Dosis von 17 mg/kg, während für das verdünnte rSLO.3 jede Maus jeweils eine ungefähre Dosis von 1000 µg/kg erhielt. Der Kontroll-Lösungspuffer beeinflußte die Kontrollmäuse nicht.
Abgesehen von geringfügiger Erregung von einigen Minuten nach der Injektion zeigte keine der entweder verdünnte oder unverdünnte rSLO.3 erhaltenden Mäuse irgendwelche schlechten Wirkungen von den intravenösen Verabreichungen. Obwohl somit rSLO.3 hämolytisch aktiv ist, gingen Mäuse, welche in der beschriebenen Weise Injektionen von rSLO.3 erhielten, nicht zugrunde.

Beispiel 9

Subclonieren von rSLO.3

Nach Herstellung, Verifizierung und Sequenzierung von rSLO.3 wurde mit dessen Subclonieren und Expression unter Verwendung eines anderen Expression/Vektor-Systems begonnen. Der Vektor pBTac 2 DNA (Boehringer Mannheim, Cat. Nr. 1081381, 10 µg) wurde mit Hind III (BRL, Cat. Nr. 52075A, 10 U/ml) geschriitten, durch Vermischen von 30 µl pBTac2 DNA (1 µg/µl), 30 µl 10x Medium Salt Puffer, 240 µl entionisiertem Wasser, mit nachfolgender Zugabe von 5 µl Hind III (BRL, Cat. # 5207 SA, 10 U/µl). Dieses Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Danach wurde das Gemisch mittels Agarose-Elektrophorese (1 % Agarose-Gel) analysiert, um festzustellen, ob der Vektor erfolgreich geschnitten war; ein einzelnes Band zeigte an, daß die Schneidebehandlung erfolgreich war.
Zu den 305 µl Gemisch wurden 300 µl Reagenz A zugegeben. Dieses Gemisch wurde sodann 5 min lang bei 12 000 U/min auf einer Beckman-Mikrozentrifuge zentrifugiert, mit nachfolgender Gewinnung der oberen flüssigen Schicht. Zu dieser flüssigen Schicht wurden 33 µl 3 M Na9Ac (pH 4,8) und 660 µl Äthanol zugegeben, mit nachfolgender Präzipitationsbehandlung über Nacht bei -20 ºC. Hierauffolgte eine Zentrifugation über 10 min bei 12 000 U/min auf einer Beckman-Mikrozentrifuge. Das Pellet wäirde gewonnen und an Luft getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde sodann in 150 µl entionisiertem Wasser resuspendiert.
Um ein Ende des geschnittenen Hind III-Vektors glatt bzw. stumpf zu machen, wurde die das resuspendierte Pellet enthaltende 150 µl-Lösung mit 10 µl 20X DNTP (2,5 mM), 20 µl 10X MSB und 20 µl 100 mM DTT gemischt. Hieran schloß sich die Zugabe von 4 µl Klenow-Polymerase (New England Biolabs, Cat. Nr. 210, 5 U/ml) und Inkubation während 7 Stunden bei Zimmertemperatur an. Danach wurden 300 µl Reagenz A zu dem inkubierten Gemisch zugesetzt und anschließend 5 min lang bei 12 000 U/min zentrifugiert. Die obere flüssige Schicht wurde gewonnen und wie oben angegeben ausgefällt. Das getrocknete Pellet wurde sodann in 30 µl entionisiertem Wasser resuspendiert. Der Einfachheit halber wird der aufgefüllte geschnittene Hind III-Vektor als "vec.rb" bezeichnet.
Danach wurde vec.rb mit Bam HI (BRL, Cat No. 5201 SA, 10 U/µl) geschnitten. Zu 30 µl vec.rb wurden 30 µl 10X High Salt Puffer und 240 µl entionisiertes H&sub2;O zugegeben. Zu diesem Gemisch wurden 5 µl Bam HI zugesetzt, mit nachfolgender Inkubation während 2 Stunden bei 37 ºC. Zu dem inkubierten Gemisch wurden 300 µl Reagenz A zugegeben, danach wie oben angegeben zentrifugiert. Die obere flüssige Schicht wurde gewonnen und wie oben angegeben ausgefällt. Üas getrocknete Pellet wurde sodann in 20 µl entionisiertem H&sub2;O resuspendiert. Das resuspendierte Pellet enthielt geschnittenes, aufgefülltes Hind III, mit Bam HI geschnittene pBTac2 DNA.
Das rSLO.3 wurde aus dem oben beschriebenen Plasmid wie folgt entnommen. Zu 40 µl des Plasmid enthaltenden rSLO.3 (1 µg/1µl) wurden 10X Smai Puffer und 320 µl entionisiertes Wasser zugesetzt. Zu diesem Gemisch wurden 5 pl Sma I (10 U/µl) beigegeben und anschließend 2 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Zur Vergewisserung, daß das Plasmid geschnitten war, wurde eine Gel-Elektrophorese (1 % Agarose- Gel) durchgeführt; diese ergab ein einzelnes Band als Anzeichen für einen erfolgreichen Schnitt. Zu dem aufgeschnittenen Plasmid wurden 8 µl 5 M NaCl zugesetzt, danach 5 µl Bam HI (10 U/µl). Dieses Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert. Zur Vergewisserung, daß die rSLO.3-Sequenz erfolgreich aus dem ca. 6,3 Kb pΔ33-Vektor geschnitten wurde, wurde eine Gel-Elektrophorese (1 % Agarose-Gel) durchgeführt. Diese ergab zwei Banden, eine bei etwa 6,3 kB (dem Vektor) und die andere bei etwa 1,4 kB (rSLO.3). Die 1,4 kB-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in 20 µl entionisiertem H&sub2;O gereinigt, derart daß mSLO.3/6 zur Ligation in dem vorbereiteten pBTac2-Vektor zur Verfügung stand.
Zu 3 µl des Vektors wurden 2 µl von mSLO.3/6, 1,5 µl 10X Ligationspuffer (0,66 M TRIS-Cl (pH 7,5), 50 mM MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 10 mM ATP), 1,5 µl 10 mM ATP und 7 µl entionisiertes H&sub2;O zugesetzt. Danach wurden 1,5 µl T4-Ligase zugegeben, mit nachfolgender Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur. Zweckmäßigerweise wird dieses Gemisch als "Subclon" bezeichnet.
Der E. coli-Strang JM105 wurde in der f6lgenden Weise mit dem Subclon transfiziert. Ein 300 µl gefrorenes JM105 enthaltendes Behältergefäß wurde aufgetaut, und 8,0 µl Subclon wurden hierzu zugegeben. Das Gemisch wurde auf Eis 30 min lang inkubiert und anschließend 2 min lang einem Wärmeschock in einem Wasserbad von 37 ºC ausgesetzt. Danach wurden zu der transformierten JM105-Lösung 2 ml LB-Medium (10 g Bacto- Tryptan; 5 g Bacto-Hefeextrakt; 10 g NaCl; 1 l entionisiertes Wasser; pH 7,5 mit Natriumhydroxid) zugegeben, nachfolgend wurde 30 min lang bei 37 ºC geschüttelt (200 U/min). Danach erfolgte eine Plattierung auf LB Ampicillin-Platten, mit anschließendem Züchtungswachstum über Nacht bei 37 ºC. Es wurde eine Screeningbehandlung mittels des 6ben beschriebenen Blutüberschichtungsverfahrens durchgeführt, und Kolonien, welche Hämolyse zeigten, wurden ausgewählt.
Ausgewählte, durch Screening untersuchte Kolonien, welche rSLO.3 Subclone aufweisen, wurden in 12 ml Superbroth- Aittpicillin-Nährlösung inokuliert. Die Induktion erfolgt durch Zugabe vön Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid ("IPTG") bei einer Endkonzentration von 1 mM zu der Nährlösung, nachdem die Züchtungslösung eine optische Dichte&sub6;&sub0;&sub0; von 0,7 zeigte. 12 ml der erhaltenen Lösung wurden 10 min lang bei 4 ºC mit 80Q0 U/min zentrifugiert, und das erhaltene Pellet wurde in 1,2 ml PBS/10 mM DTT resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde 1,5 min lang mit Schall behandelt; die Proteinkonzentration des mit Ultraschall behandelten Extrakts wurde nach dem Weiter oben beschriebenen Biorad Protein Assay-Versuchsprotokoll bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde zu 9,3 mg/ml ermittelt. Diese Daten dienten zur Ermittlung der spezifischen hämolytischen Aktivität des schallbehandelten Extrakts mittels Titer auf der Grundlage. des oben beschriebenen Verfahrensprotokolls 50 % Lysen von 2,5-%igen gewaschenen roten Blutzellen von Kaninchen. Die hämolytische Titeraktivität der rSLO.3 enthaltenden Kultur wurde. zu 2,69 x 10³ bestimmt.
Die vorstehenden Beispiele sind auf die Erzeugung einer SLOgenomischen Bibliothek gerichtet. Dem Fachmann ist bekannt, daß ein anderer, wesentlich weniger komplexer Bibliothektyp als eine genomische DNA-Bibliothek eine "komplementäre DNA"- oder "cDNA"-Bibliothek ist. cDNA wird direkt von der mRNA abgeleitet; daher besteht die cDNA-Bibliothek definitionsgemäß aus Translationsbereichen. Verfahren zur Gewinnung von cDNA-Bibliotheken auf der Grundlage von mRNA komplementär zu mSLO DNA werden als im Bereich des Fachmanns liegend angesehen, derart daß auf cDNA beruhende Bibliotheken für mSLO ein Teil der vorliegenden Offenbarung sind.

Proteinfaltung

Wie die lineare Anordnung von Nucleotiden ein spezifisches Codon definiert, definiert die Anordnung oder Sequenz von Aminosäuren das Protein, einschließlich dessen spezieller Funktion. Während jedoch die spezielle Aminosäuren-Sequenz wichtig bezüglich der Identität des Proteins ist, ist die spezielle dreidimensionale Form oder Gestalt, welche das Protein zeigt, von ähnlicher Bedeutung. Eine derartige Spezifizität hinsichtlich der Gestalt codefiniert im wesentlichen die Eigenschaften des Proteins, da die Form bzw. Gestalt des Proteins das Protein zu einer spezifischen Wechselwirkung mit anderen Molekülen befähigt, welche nur diese spezielle Proteingestalt erkennen.
Die meisten Proteine falten sich spontan in ihre richtige Form bzw. Gestalt. Durch Behandlung des Proteins mit be.stimmten denaturierenden Lösungsmitteln kann sich das Protein zu einer flexiblen Kette "entfalten". Bei Entfernung des denaturierenden Mittels können Teile der flexiblen Kette sich in ihre ursprüngliche Konformation zurückfalten Dies kommt daher, daß einer der bedeutsamsten Faktoren, welche das Falten eines Proteins beherrschen bzw. kontrollieren, die Verteilüng von polaren (hydrophilen oder "wassersuchenden") und nicht-polaren (hydrophoben oder "wasserabstoßenden") Seitenketten der Aminosäuren dteses Proteins ist. Denaturierende Lösungsmittel stehen in Wechselwirkung mit der Polarität der Aminosäure-Seitenketten. Die folgenden Aminosäuren haben polare Seitenketten: Asn; Gln; Ser; Thr und Tyr. Die folgenden Aminosäuren haben nicht-polare Seitenketten: Gly; Ala; Val; Leu; Iso; Pro; Phe; Met; Trp und Cys. Aminosäuren mit basischen und sauren Seiteriketten sind sehr stark polar. Die folgenden Aminosäuren haben basische Seitenketten: Lys; Arg und His. Die folgenden Aminosäuren haben saure Seitenketten; Asp und Glu.
Die Umgebung, in welcher Proteine natürlicherweise existieren, ist per definitionern eine nicht-denaturierende Umgebung, die ganz typischerweise wäßrig ist. Somit neigen die hydrophoben Seitenketten eines Proteins dazu, im Inneren des Proteinmoleküls zusammengedrängt zu werden, was diese zur Vermeidung des Kontakts mit der wäßrigen Umgebung befähigt. Polare Seitenketten andererseits neigen dazu, sich nahe der Außenseite des Proteinmoleküls anzuordnen, wo sie mit Wasser und anderen polaren Molekülen in Wechselwirkung treten können.
Zwar isü der molekulare Mechanismus, nach welchem eine lineare DNA-Sequenz transkribiert und in eine genaue Aminosäure-Sequenz des entsprechenden Polypeptids übersetzt" wird, gut bekannt; hingegen ist nicht genau bekannt, wie die Poly peptidkette sich gleichzeitig und autonom in ihre dreidimensionale Struktur faltet. Jedoch wird das reale Potential synthetischer DNA, d. h. über Rekombinanten-Techniken synthetisierter DNA, auf dem Gebiet des Protein-Designs realisiert werden. Um dies zu realisieren, wird jedoch der Mechanismus der Proteinfaltung bündiger aufgeklärt werden müssen. Zwar ist das allgemeine Problem der Vorhersage der Proteinstruktur aus der Sequenz schwer faßbar (vor allem weil keine Regeln bzw. Gesetzmäßigkeiten bekannt geworden sind, welche die Struktur in Beziehung zur Sequenz zu setzen gestatten), jedoch ist es klar, daß bestimmte Teile der Sequenz für die Struktur bedeutsam und andere Teile Von.einem strukturellen Gesichtspunkt relativ unbedeutend sind, derart daß in diesen Bereichen Substitutionen und Modifizierungen vorgenommen werden können. Es wird daher angenommen, daß Teile der Sequenz eines Proteins signifikant zur Stabilität der gefalteten Proteinstruktur beitragen.
Wenngleich die Vorhersage einer Proteinstruktur aus der Proteinsequenz kaum faßbar ist, besitzen Proteine per definitionem eine eindeutige dreidimensionale Struktur, welche bestimmt werden kann. Beispielsweise können die folgenden methodischen Vorgangsweisen zur Bestimmung der Proteinstruktur Anwendung finden: Kristallographie; Optische Aktivität und Kernmagnetresonenz (Nudear Magnetic Resonance NMR)-Spektroskopie.

a) Kristallographie

Proteine vermögen Kristalle zu bilden. Proteine kristallisieren gewöhnlich in einem Sättigungs- oder Übersättigungszustand, der durch Änderung einer oder mehrerer aus einer Anzahl vpn Variablen bzw. Parametern, welche die Löslichkeit der Proteine beeinflussen, erreicht werden kann. So können durch Änderung der Ionenstärke der Lösung oder durch Verwendung organischer Polymere, wie beispielsweise Polyäthylenglycol, Proteine kristallisiert werden. Techniken zum Züchten von Proteinkristallen sind beschrieben in S. A. Narang, Protein Engineering: Approaches to the Manipulation of Protein Folding (Butteerworth, Publisher, Stoneham MA., 1990), Chpt. 6 (im folgenden "Narang"). Dieses vorstehende Textbuch wird im Wege der Inbezugnahme als Ganzes zum Gegenstand der vorliegenden Offenbarung gemacht. Nachdem das Protein kristallisiert hat, können Röntgen-, Neutronen- und Elektronenbeugungsverfahren zur Bestimmung der Struktur des Proteins Verwendung finden, wobei Röntgenbeugung bevorzugt wird. Man nimmt an, daß die Proteinstruktur in dem Kristall bei oder nahe dem Minimum der konfigurativen freien Energie des Moleküls für die Kristallform liegt.

b) Optische Aktivität

Die optische Aktivität von Polypeptiden/Proteinen infolge der asymmetrischen Zentren der Aminosäuren und ihrer asymmetrischen Konformationen kann zur Bestimmung der Struktur von Polypeptiden/Proteinen dienen. Diese Asymmetrie bewirkt, daß Proteine unterschiedliche Wechselwirkung mit rechts- und links-zirkular polarisiertem Licht zeigen; wenn daher als Folge hiervon die beiden Strahibündel das Protein mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durchsetzen, wird polarisiertes Licht rotiert. Optische Rotationsdispersion ("ORD") ist die Abhängigkeit dieser Rotation von der Wellenlänge. In einem Wellenlängenbereich, in welchem das Proteinmolekül keine Lichtabsorption zeigt, ändert sich die Rotation allmählich mit der Wellenlänge; in einem Absorptionsbereich jedoch nimmt die Rotation anfänglich zunächst scharf in. einer Richtung zu, fällt dann an der Stelle des Absorptionsmaximums auf Null ab und steigt sodann scharf in der entgegen gesetzten Richtung an. Es wird auch eine ungleiche Absorption von links- und rechts-zirkular polarisiertem Licht geben; dies wird als Zirkulardichroismus ("CD") bezeichnet. Sgwohl CD- als auch OES-Spektren eines Proteins sind sehr empfindlich bezüglich der strukturellen Konformation des Proteins. Gefaltete Proteine besitzen im allgemeinen nennenswerte optische Aktivität. im nahen UV-Bereich (250 bis 300 nm).

c.) Kernmagnetresonanz(NMR)-Spektroskopie

Die Kernmagnetresonanz (NMR)-Spektroskopie unter Verwendung von beispielsweise ¹H, ¹³C, ¹&sup5;N, ¹³p oder ²H hat sich von großem Nutzen bei der Untersuchung von Proteinstruktur in Lösung erwiesen. Unter Konzentration auf ¹H weist jeweils jedes Wasserstoffatom in einem Molekül einen Kernmagnetspin auf, d. h. daß die Kerne des Atoms wie winzige Magnete wirken. In Abwesenheit eines äußeren Magnetfelds sind die magnetischen Momente des Protons regelloszufällig orientiert. In einem Kernmagnetresonanz(NMR)-Experiment wird ein starkes äußeres Magnetfeld längs einer spezifizierten Richtung an die Probe gelegt, was eine resultierende Ausrichtung der magnetischen Momente und eine resultierende makroskopische Magnetisierung längs der spezifischen Ausrichtungsachse ergibt; sodann wird ein kurzer HF- Impuls geeigneter Stärke angelegt, welcher den Magnetisierungsvektor aus dieser Achse herausschlägt. Mit Wiederherstellung der Magnetisierung wird ein kurzzeitiges HF-Signal als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Eine Fourier-Transformierte dieses Signals ergibt dann ein Frequenzspekt rum. Jedes Proton in dem Molekül gibt Anlaß für das Auftreten einer Spitze in diesem Spektrum bei irgendeiner charakteristischen Resonanzfrequenz, die durch die örtliche elektronische Umgebung dieses Protons bestimmt ist. Die Resonanzfrequenz eines bestimmten speziellen Protons wird seine "chemische Verschiebung" genannt und wird als eine Versetzung gegenüber irgendeiner Bezugsfrequenz gemessen. Eine strukturierte Information aus der NMR wird aus dem kernphysikalischen Overhauser-Effekt ("NOE", der bestimmt, ob ein Protonenpaar einander räumlich benachbart ist) gewonnen sowie die Kopplungskonstanten von Protonen, die voneinander durch. drei oder weniger chemische Bindungsabstände getrennt sind. NOE- und Kopplungskonstanten ergeben eindimensionale Daten; zweidimensionale Daten liefert unter anderen die Overhauser-Verstärkungskernspektroskopie (NOESY, nudear Overhauser enhancement spectroscopy) und die zweidimensionale Korrelationsspektroskopie (COSY); und aus derartigen Daten können dreidimensionale Proteinstrukturen bestimmt werden.
Angesichts der vorstehenden Information bezüglich der Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Proteinmolekülen schließen die nachfolgenden, auf DNA-Makromoleküle und Aminosäuren gerichteten Ansprüche inhärent die den hierdurch exprimierten Proteinmolekülen entsprechenden dreidimensionalen Strukturen ein.
Die Beispiele der vorliegenden Beschreibung sollen nicht im Sinne einer Einschränkung auf spezifische Vektoren, Plasmide und Wirtszellen ausgelegt werden. Das vorliegend beschriebene rSLO darf nicht im Sinne. einer Beschränkung allein auf das bevorzugte, als rSLO.3 bezeichnete rSLO, oder auf die bevorzugten Vektoren, Plasmide und Wirtszellen ausgelegt werden. In gleicher Weise stellt das bevorzugte rSLO.3 in keiner Weise eine ausdrückliche oder implizierte Einräumung dar, daß dessen DNA- und Aminosäuresequenzen die einzigen DNA- und Aminosäuresequenzen wären, welche die Anmetder beanspruchen könnten. Sie haben Anspruch auf die volle Breite des Schutzanspruchs gemäß dem einschlägigen Patentrecht.
Für Zwecke der Beanspruchung von Stoffen durch Bezeichnung wurden mit Plasmiden einschließlich pΔ33 - rSLO.3 transformierte AR120und mit Plasmiden einschließlich pBTac2 DNA - rSLO.3 transformierte JM105 am 23. August 1991 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, hinterlegt, gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags über. die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren (Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure). Sie wurden von der ATCC am 27. August 1991 getestet und beide als brauchbar befunden. Die ATCC hat diesen Materialien die Hinterlegungsnummern ATCC 68675 bzw. ATCC 68677 zugeteilt.
Auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung können die Fachleute unschwer Fragmente d.er in Fig. 1 wiedergegebenen DNA-Sequenz erhalten, derart daß das Fragment wenigstens eine für Wildform-SLO charakteristische epitopische Stelle besitzt und weiterhin hämolytische Eigenschaften aufweist. Des weiteren können, wie angegeben, konservative Substitutionen von Nucleotiden ohne damit einhergehende Änderungen in der Aminosäuresequenz vorgenommen werden, wie dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können "computerisierte Rücktranslations"-Verfahren Anwendung finden, wobei die Aminosäuresequenz durch einen Computer analysiert wird und der Computer die optimalen Nucleotide zur Verwendung in den für die Codierung auf derartige Aminosäuren erforderlichen Codonen bestimmt. Des weiteren kann man, in dem Maße, wie die DNA-Synthesetechnik fortschreitet, derart daß Oligonucleotide mit der Länge der DNA-Sequenz aus Fig. 1 unschwer erhalten werden können, diese Sequenz in Übereinstimmung mit derartigen Fortschritten in der Synthesetechnik synthetisieren.
Da das Screening von SLO-Derivaten in einfacher Weise unter Verwendung der oben erwähnten Blutüberschichtungstechnik durchgeführt. werden kann, lassen sich zahlreiche SLO-Derivat-Kandidaten rasch evaluieren. Daher kann der Fachmann in einfacher Weise dieses Verfahren zur Ableitung analoger SLO- Derivat-Kandidaten verwenden, diese Kandidaten rasch einem Screening bezüglich Anzeichen hämolytischer Aktivität unterziehen und die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz von Analogen bestimmen.
Somit sind die vorliegenden Beispiele zwar auf eine spezifische SLO-Variante, rSLO.3, gerichtet; jedoch kann der Fachmann, nachdem ihm dieser Fortschritt zur Verfügung gestellt wurde, bekannte Techniken zur Anpassung dieses Fortschritts für seine eigenen Zwecke verwenden; es wird daher davon ausgegangen, daß die vorliegende Erfindung SLO-Derivate mit den angegebenen Eigenschaften umfaßt und nicht auf das in den Beispielen angegebene spezielle Derivat beschränkt ist.
Die vorliegende Erfindung wurde mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen mit beträchtlichen Einzelheiten beschrieben, jedoch sind andere Ausführungsformen im Rahmen der Offenbarung der vorliegenden Erfindung möglich. Zwar wurde daher die Erzeugung eines speziellen SLO-Derivats im Detail beschrieben, jedoch ist dies lediglich als ein exemplarisches Beispiel zu verstehen. Daher sind weder die Beschreibung noch die nachfolgenden Ansprüche absichtlich oder i.m Wege der Auslegung als durch die in der vorliegenden Beschreibung enthaltenen Beschreibungen bevorzugter Ausführungsbeispiele beschränkt anzusehen.

Claims

1. Gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, welche ein lösliches Fusionsprodukt von Streptolysin-O kodiert, das hämolytische Aktivität aufweist.

2. DNA-Sequenz aus Anspruch 1, wobei die genannte DNA-Sequenz die in SEQ ID Nr. 1 dargelegte Sequenz ist.

3. Mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 2 derart transformierte oder transfizierte prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, daß die Wirtszelle ein lösliches, hämolytisch aktives Fusionsprodukt von Streptolysin-O exprimieren kann.

4. DNA-Plasmid, welches einen DNA-Vektor und eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 2 umfaßt.

5. Aminosäure-Sequenz, welche für ein lösliches, hämolytisch aktives Fusionsprodukt von Streptolysin-O kodiert, wobei die genannte Aminosäure-Sequenz die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Sequenz ist.

6. DNA-Plasmid nach Anspruch 4, bei welchem der DNA-Vektor ein Promotor-Gen umfaßt.