DE69219325T2

DE69219325T2 - Xylanase, bazillusstämme die xylanase produzieren und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69219325T2
Application number: DE69219325T
Authority: DE
Inventors: Philippe Debeire; Michele Debeire-Gosselin; Eric Samain; Jean-Pierre Touzel
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1991-02-01
Filing date: 1992-01-28
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2012-01-29
Also published as: EP0573536B1; KR930703432A; FI933408L; FR2672300B1; ES2103934T3; CA2101063A1; AU666301B2; HUT64392A; BG97987A; NO932668L; EP0573536A1; HU214440B; IL100831A0; BR9205551A; ATE152168T1; NO306562B1; AU1376192A; NO932668D0; DK0573536T3; FI933408A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Xylanase sowie Bacillus- Stämme, die dieses Enzym erzeugen.
Sie betrifft außerdem die Verwendung dieses Enzyms und dieser Bakterien bei der Bleichung von Papierfaserbrei und bei der Herstellung von Xylose oder Xylooligosacchariden, insbesondere aus pflanzlichen Rohstoffen.
Im Bereich der Biotechnologie wurden verschiedene Verwendungen von Xylanasen vorgeschlagen, insbesondere im Lebensmittelbereich (Biely, Trends Biotechnol. 3 (11): 286-290, 1985), in der Papierindustrie (Mora et al., J. Wood Chem. Technol., 6: 147-165, 1986) oder bei der Herstellung chemischer Verbindungen aus Hemicellulo-. se (Reilly, P.J., 1981, "Xylanases: structure and function" in "Trends in the Biology of Fermentations for Fuels and Chemicals, A.J. Hollaender (Hrsg.), Plenum, New York).
Die technische Möglichkeit solcher Anwendungen wurde hauptsächlich mit Hilfe von Enzymen bewertet, die von mesophilen Pilzen erzeugt wurden. Dennoch könnten solche Anwendungen durch die Verwendung von Pilzen erleichtert werden, die eine bessere Temperaturstabilität aufweisen.
Für die Herstellung von Xylanasen sind verschiedene Bakterien und Enzyme bekannt (siehe insbesondere Wong et al., Microbiological Reviews, 52, Nr. 3, 305-317, 1988). Bis jetzt wurden die höchsten Enzymausbeuten erhalten, wenn von Pilzen ausgegangen wurde (Yu et al., Enzyme Microb. Technol. 9: 16-24, 1987). Jedoch wurden auch schon hyperproduktive Bacillus-Stämme beschrieben (Okazaki et al., Appl. Microbiol. Biotechnology, 19: 335-340, 1984; Okazaki et al., Agric. Biol. Chem. 49, 2033-2039, 1985). Solche thermophilen Bacillus-Spezies, die Xylan abbauen, sind aufgrund ihrer hohen Wachstumsraten und einer guten Kenntnis ihrer Genetik gute Kandidaten für die industrielle Herstellung von Xylanasen.
Die von Okazaki et al. isolierten Xylanasen sind von zwei Bacillus-Stämmen abgeleitet, die von den Autoren W1 und W2 genannt wurden. In jedem dieser Stämme hat man zwei Komponenter. mit Xylanase-Aktivität nachgewiesen, die I und II genannt werden. Die Komponenten I bauen Xylan zu Xylobiose und zu Oligomeren mit höherem Polymerisationsgrad ab, während die Komponenten II außerdem Vorläuferverbindungen von Xylose erzeugen.
Die Komponenten I (W1.I und W2.I genannt) haben Molekulargewichte von 21,5 kDa bzw. 22,5 kDa sowie isoelektrische Punkte von 8,5 bzw. 8,3. Die Komponenten 1 (W1.II und W2.II) haben wiederum Molekulargewichte von 49,5 kDa bzw. 50 kDa.
Die beiden Komponenten I und II werden durch Hg²&spplus;-Ionen sowie in geringerem Maße durch Cu²&spplus; gehemmt.
Zahlreiche weitere Xylanasen wurden unter anderem ausgehend von verschiedenen Bacillus-, Clostridium-, Aspergillus-, Streptomyces- oder Trichoderma-Spezies isoliert (Wong et al., 1988, loc. cit.).
So betrifft die Zusammenfassung des Japanischen Patentes JP 130 96 84 (Rikagaku Kenkyusho) eine Xylanase des Typs WII mit einem Molekulargewicht von 50 kDa oder 42 kDa. Für diese Xylanase wird kein isoelektrischer Punkt genannt.
Ein Artikel von Rajaram et al. (Applied Microbiology and Biotechnology, Vol 34, Nr. 1, Oktober 1990, Seite 141-144) bezieht sich auf einen aus der Natur isolierten Bacillus-Stamm, der eine Xylanase mit einer optimalen Aktivität zwischen 60ºC und 70ºC und bei einem pH zwischen 6 und 7 besitzt. Dieses Enzym wird weder durch sein Molekulargewicht noch durch seinen isoelektrischen Punkt charakterisiert. Dieser Stamm erzeugt außerdem noch andere Enzyme, wie Cellulasen.
Eine weitere Zusammenfassung eines Japanischen Patentes im Namen von Rikagaku Kenkyusho (JP-85 118 644) beschreibt eine Xylanase mit einer optimalen Aktivität bei einem Ph-Wert zwischen 6 und 7. Dieses Enzym hätte ein durch Ultrafiltration bestimmtes Molekulargewicht zwischen 50 und 100 kDa. In der Zusammenfassung wird kein isoelektrischer Punkt angegeben.
Ein Artikel von Grüninger et al. (Enzyme Microbiology and Technology, Vol 8, Mai 1986, Seite 309-314) betrifft einen weiteren Bacillus-Stamm, der aus Schlamm isoliert wurde und eine thermostabile Xylanase erzeugt. Das Enzym ist durch eine optimale Aktivität bei 78ºC und einem pH-Wert von 7,5 charakterisiert Dieses Enzym wird weder durch sein Molekulargewicht noch durch seinen isoelektrischen Punkt charakterisiert.
Ein Hindernis für die industrielle Herstellung von Xylanasen ist die gleichzeitige Anwesenheit kontaminierender Aktivitäten, wie die von Cellulasen, was zu vermehrten Kosten für die Reinigung führt. Andererseits kann die Verwendung genetisch veränderter Keime Probleme aufwerfen, wie die Instabilität der Plasmide, die für Xylanasen codierende Gene tragen.
Nach Kenntnis der Anmelderin fand man die beste Produktivität an Endoxylanase, die von einem Mikroorganismus erhalten wurde, der keine Cellulase erzeugt, bei einer Mutante von Streptomyces lividans, der keine Cellulaseaktivität aufwies, nach Einführung eines Plasmids, das für Xylanase A und B codierende Gene trägt. Im Kulturmedium wurden Produktivitäten in der Größenordnung von 6000 bis 10 000 IE beobachtet. Dennoch ist anzumerken, daß in diesem Fall Probleme in Verbindung mit der Nicht-Hydrolyse von unlöslichem Xylan durch Xylanase A und mit der thermischen Stabilität der Xylanase B auftraten (Kluepfel et al., Biochem. J. 267, 47-50, 1990).
Nach Kenntnis der Anmelderin wies also keines der im Stand der Technik beschriebenen Enzyme Merkmale auf, die eine industrielle Anwendung erlauben, d.h. eine gute thermische Stabilität, eine gute Fähigkeit zum Abbau der Substrate und eine Gewinnung aus überproduktiven Stämmen.
Die Anmelderin hat also überraschend gezeigt, daß bestimmte Bacillus-Stämme thermostabile Xylanasen erzeugen, die eine hohe Abbauaktivität zeigen.
Noch überraschender hat die Anmelderin gezeigt, daß diese Bacillus-Stämme eine große Menge dieser Enzyme ausscheiden, ohne nennenswerte Mengen an Cellulasen zu erzeugen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung sind also Bacillus-Stämme mit Xylanase-Hyperproduktivität und insbesondere die Stämme, die bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de l'Institut Pasteur unter Nr. I-1017 und I-1018 hinterlegt sind.
Diese Stämme wurden aus Mist isoliert.
Die Bakterien treten als kurze und gerade sporenbildende Stäbchen mit einer mittleren Größe von 0,5 bis 2,5 µm auf. Sie liegen im allgemeinen einzeln oder in Paaren auf, sind Gram-positiv, und die Sporen sind oval und zentral.
Diese Stämme sind streng aerob, da in Abwesenheit von Sauerstoff keinerlei Wachstum beobachtet wird und Nitrat nicht als Elektronenakzeptor genutzt wird.
Der optimale pH-Wert für Wachstum und Xylanase-Erzeugung beträgt 7,8, während die pH-Grenzwerte für das Wachstum zwischen 6,5 und 8,5 liegen und die maximale Temperatur 63ºC beträgt.
Außer Xylan verwerten diese Stämme Xylose, Glucose, Saccharose, Maltose sowie Stärke. Fructose, Arabinose, Cellulose, Pektin sowie Chitin werden nicht verwertet. Außerdem wird das Wachstum durch eine Natriumchloridkonzentration von 5% gehemmt.
Der durch thermische Denaturierung bestimmte Gehalt der DNA dieser Stämme an G+C beträgt 57,5 Mol-%.
Diese Stamme sind von den anderen Xylanase-erzeugenden Stämmen, wie in Tabelle I angegeben, durch die verschiedenen Kulturzeiten und Xylanase-Produktivitäten wohlunterschieden.
Der Stamm I-1018 wurde durch Mutagenese aus dem Stamm I-1017 erhalten. Der Stamm I-1018 besitzt dieselben allgemeinen Merkmale wie der Stamm I-1017, weist jedoch eine Xylanase-Hyperproduktion auf.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist außerdem eine thermophile (bei ungefähr 60ºC stabile) Xylanase, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Molmasse von ungefähr 22 kDa besitzt, daß sie einen iso-. elektrischen Punkt von ungefähr 7,7 hat und daß sie die folgende N-terminale Aminosäuresequenz aufweist: Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-- Trp-Thr-Asp-Gly- Ile-Gly-Tyr-Val -Asn-Ala-Thr-Asn-Gly-Gln.
Dieses Enzym weist außerdem vorteilhafterweise bei 60ºC eine große Stabilität während wenigstens 24 Stunden und einen pH-Wert der optimalen Aktivität im Bereich von 4,8 bis 7 und vorzugsweise von ungefähr 6 auf.
Es sei angemerkt, daß der pHi (isoelektrische Punkt) dieses Enzyms recht hoch liegt, aber kleiner ist als der pHi der Xylanasen mit ähnlicher Molmasse, die von Bacillus, insbesondere den von Okazaki et al. beschriebenen (1985, loc. cit.), erzeugt werden.
Der pH-Wert 6 entspricht einem optimalen pH, aber im Bereich zwischen 4,8 und 7 bleibt die Aktivität oberhalb von 80%.
Vorteilhafterweise umfaßt sie in ihrer Sequenz 15 Alaninreste, 6 Argininreste, 29 Aspartat- und Asparaginreste, 19 Glutamat- und Glutaminreste, 31 Glycinreste, 3 Histidinreste, 6 Isoleucinreste, 7 Leucinreste, 3 Lysinreste, 1 Methioninrest, 4 Phenylalaninreste, 8 Prolinreste, 19 Serinreste, 13 Threoninreste, 22 Tyrosinreste und 14 Valinreste.
Dieses Enzym wird außerdem durch Hg²&spplus; gehemmt, aber weder durch Ag²&spplus; (1 mM) noch durch 0,1% SDS.
Die Michaelis-Konstante (Km) in bezug auf Xylan aus der Birke beträgt 0,9 g/l.
Die von diesem Enzym aus Birken-Xylan erzeugten neutralen Oligo-. saccharide (5 g/l Birken-Xylan; 500 E/l, 60ºC) bestehen:
- bei sehr kurzen enzymatischen Inkubationszeiten (15 Minuten) aus Xylotriose und Xylooligosacchariden mit höherem Polymerisationsgrad;
- bei langen Inkubationszeiten (24 bis 72 Stunden) aus Xylobiose, Xylotriose und Xylotetraose, letztere in sehr geringer Menge.
Diese Endoxylanase wird insbesondere durch Bacillus und insbesondere durch die oben beschriebenen Stämme I-1017 und I-1018 ausgeschieden.
Sie wird in das Kulturmedium ausgeschieden.
Das Kulturmedium dieser Stämme ist insbesondere durch das Fehlen einer Endo-β-1,4-Glucanase-Aktivität (Cellulase-Aktivität) und. durch die Anwesenheit einer sehr schwachen kontaminierenden β-Xylosidase-Aktivität (ungefähr 0,06 IE/ml Kulturüberstand für die beiden Stämme) gekennzeichnet. Es sei angemerkt, daß der Kulturüberstand ohne nennenswerten Verlust an Xylanase-Aktivität lyophilisiert werden kann und im gefrorenen Zustand wenigstens ein Jahr lang ohne Aktivitätsverlust haltbar ist.
Die Endo-β-1,4-Glucanase-Aktivitäten wurden durch Messung der aus 1% Carboxymethylcellulose (CMC) oder Avicel (1%) in einem 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 6, freigesetzten reduzierenden Zucker bestimmt. Die β-Xylosidase-Aktivität wurde durch Messung des aus p-Nitrophenyl-β-D-xylosid (0,1%) in einem 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 6, freigesetzten p-Nitrophenols bestimmt.
Eine Einheit der Xylanase-Aktivität (IE) ist als ein Mikromol eines Äquivalents reduzierender Xylose definiert, das bei 60ºC pro Minute freigesetzt wird.
Die Konzentration an reduzierendem Zucker wird nach dem Verfahren von Kidby und Davidson bestimmt (Anal. Biochem., 55: 321-325, 1973).
Das gereinigte Enzym ist seinerseits in gefrorener Form in 20%igem Ethylenglycol ein Jahr lang ohne nennenswerten Aktivitätsverlust haltbar.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung der oben beschriebenen Xylanase, das die folgenden Schritte umfaßt:
- Konzentrieren des Überstandes einer Kultur von Bacillus Nr. I-1017 oder I-1018 durch Ultrafiltration;
- Durchlaufenlassen durch eine lonenaustauschersäule, wie eine Säule des Typs O-Sepharose Fast Flow (Pharmacia);
- Durchlaufenlassen durch eine hydrophobe Säule, wie eine Phenylsepharosesäule (Pharmacia).
Das Konzentrieren des Überstands kann insbesondere durch Ultrafutration auf einer Polysulfonmembran mit einer Ausschlußschwelle von über 10 kDa erfolgen.
Dieses Verfahren erlaubt es, ein im wesentlichen reines Xylanase- Präparat zu erhalten.
Die vorliegende Anmeldung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Gewinnung der oben beschriebenen Xylanase, das die Schritte umfaßt:
- Züchten der Bakterien Nr. I-1017 oder I-1018 in einem Medium, das ein Wachstumssubstrat, wie Glucose, enthält; und
- Produktion von Xylanase, die durch kontinuierliche Zufuhr geeigneter Mengen von Xylooligosacchariden zu der Kultur induziert wird.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist außerdem die Verwendung der oben beschriebenen Xylanase bei der Bleichung von Papierfaserbrei.
Ein Vorteil dieser Xylanase besteht darin, daß der Hydratationsgrad des Papierfaserbreis nur von geringer Bedeutung ist. Es ist nicht unbedingt notwendig, den Faserbrei sehr zu verdünnen, um einen guten enzymatischen Angriff zu erhalten. Die Verwendung dieser Xylanase als Hilfsmittel bei der Bleichung von Papierfaserbrei ist um so interessanter, als die Präparate frei von Cellulase-Verunreinigungen sind.
Diese Xylanase kann auch für die Herstellung von Xylose oder Xylooligosacchariden aus pflanzlichen Rohstoffen verwendet werden, bei denen es sich um kostengünstige und erneuerbare Rohstoffe handelt (zum Beispiel Maisspindeln).
Weitere Verwendungen von Xylanasen sind in der Literatur erwähnt. Der Übersichtsartikel von Zeikus et al. ("Thermostable saccharidases: New Sources, Uses and Biodesigns" in "Enzymes in biomass conversion", Leatham und Himmel, ACS Washington DC, 1991) führt die hauptsächlichen Verwendungen von Xylanasen auf. Sie werden hauptsächlich bei der Herstellung von Lebensmitteln, wo ihre Eigenschaften es erlauben, die Brotbereitung, die Klärung von Fruchtsäften und Weinen und die Nährwerteigenschaften von Getreidefasern zu verbessern, sowie bei der Herstellung von Verdickungsmitteln für die Ernährung verwendet.
Der zweite Anwendungsbereich betrifft die Industrie des Papierfaserbreis und der Fasern, wo bei der Bleichung des Faserbreis, der Herstellung von Holzfaserbrei und der Reinigung von Fasern für die Herstellung von Kunstseide verwendet werden.
Erwähnt seien auch Verwendungen in der Nahrung von Geflügel, in der die Xylanasen verwendet werden, um die Viskosität des Futters zu verringern (Van Paridon et al., Xylans and Xylanases, International Symposium, Wageningen, 8.-11. Dezember 1991; Bedford und Classen, H.L., Xylans and Xylanases, International Symposium, Wageningen, 8.-11. Dezember 1991).
Die Verwendung von Xylanasen bei der Aufwertung von Abfallprodukten der Industrie des Papierfaserbreis wird genauer im Artikel von Biely erwähnt (Trends in Biotechnology, Vol 3, Nr. 11, 1985).
Erwähnen lassen sich auch die beiden Europäischen Patente EP 228 732 und EP 227 159, die die Verwendung von Xylanasen zur Verbesserung der Filtrierbarkeit von Glucosesirup bzw. von Bier betreffen.
Erwähnt sei auch die Möglichkeit, Xylanasen für die Herstellung chemischer Produkte aus Hemicellulose zu verwenden (Reilly, loc. cit.).
Diese verschiedenen Veröffentlichungen zeigen, daß die Xylanasen, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden, in zahlreichen Anwendungen verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Anwendungsbeispiele erläutert, ohne in irgendeiner Weise auf diese beschränkt zu sein.
Figur 1 zeigt die Entwicklung diskontinuierlicher Kulturen des Stammes I-1017.
Figur 2 zeigt die Entwicklung einer kontinuierlichen Kultur des Stammes I-1017 bei kontinuierlicher Zufuhr von Lösungen von Xylooligosacchariden verschiedener Konzentrationen.
Figur 3 zeigt die Erzeugung von Xylanasen im Vergleich zwischen den Stämmen I-1017 und I-1018 in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Xylooligosacchariden.
Figur 4 zeigt die Freisetzung von Xylooligosacchariden aus ungebleichtem Kraftfaserbrei durch verschiedene Konzentrationen an xylanase.
Figur 4 zeigt die Freisetzung von Xylooligosacchariden aus gemahlenen Maisspindeln.

Beispiel 1: Auswahl des Stammes I-1017

Verschiedene Boden-, Kompost- und Mistproben wurden als Impfmaterial verwendet, um xylanolytische Stämme anzureichern. Nach 24 Stunden Inkubation werden die Xylanase-Aktivitäten in den Kulturüberständen getestet, und die drei Anreicherungen, die die höchsten Aktivitäten zeigen, werden verdünnt und auf xylanhaltigem Agarmedium ausgestrichen.
Ein Grundkulturmedium, das Mineralien und Vitamine (Zeikus une. Wolfe, J. Bacteriol. 109: 707-713, 1972) sowie Hefeextrakt (0,2%) enthielt, wurde mit Agar (2%) und Haferxylan (0,5%) versetzt. Nach der Sterilisation wird KHCO&sub3; (25 mM) aus einer sterilen Stammlösung (1 M) zu dem gemischten Medium zur Isolierung der Stämme hinzugefügt. Die beimpften Petri-Schalen werden in geschlossenen Gefäßen bei 55ºC inkubiert.
Die Kolonien, die klare Zonen bilden, werden gereinigt. Die produktivsten Isolate (Stamm I-1017) werden ausgewählt und charakterisiert.
Die Anreicherung sowie das Wachstum der Kulturen werden aerob in einem gerührten Wasserbad in geschlossenen 125-ml-Flaschen durch- geführt, die 10 ml Medium enthielten. Die Inkubationstemperatur beträgt 55ºC, und das Medium ist durch Zugabe von 50 mM KHCO&sub3; auf pH 7 gepuffert.

Beispiel 2: Wachstum des Stammes I-1017

Die Kinetik der Erzeugung von Xylanasen wird bei 55ºC in 2-Liter- Fermentatoren in einem Anfangsvolumen des Mediums von 1,5 Liter aufgenommen. Nach der Sterilisation werden 50 ml einer 1 M KHCO&sub3;Lösung hinzugefügt, und der pH-Wert wird auf 7,8 eingestellt und auf diesem Wert gehalten. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wird reguliert und auf einem Sättigungsgrad von 70% gehalten.
Figur 1 zeigt das Wachstum des Stammes I-1017 in diskontinuierlicher Kultur auf 0,5% Haferxylan. Der Stamm I-1017 erzeugt bis zu 110 Einheiten Xylanase/ml. Während der ersten Stunden der Kultur wird eine vorübergehende Anhäufung reduzierender Zucker beobachtet. Diese Anhäufung ist auf die Gegenwart kleiner Mengen Xylanase im Impfmaterial zurückzuführen, die eine schnelle Hydrolyse der löslichen Xylanfraktion zu Xylooligosacchariden katalysieren.
Das Bakterienwachstum erlaubt also einen Verbrauch der Xylooligosaccharide und die Synthese von Xylanase, die einsetzt, unmittelbar nachdem die Konzentration der Xylooligosaccharide für das Wachstum der Bakterien limitierend geworden ist.
Die Erzeugung von Xylanase ist während 4 Stunden weitgehend konstant (30 IE/ml/h).
Man beobachtet eine große Variabilität der Xylanase-Erzeugung als Funktion der im voraus vorhandenen Xylanase-Aktivität des Impfmaterials, des Ausmaßes der stationären Phase und der physikalischen Merkmale des Xylans.
b) Einfluß der Menge an Xylooligosacchariden auf das Wachstum des Stammes I-1017.
Um reproduzierbare Kulturbedingungen zu erhalten, wurde die Xylanase-Erzeugung in Kulturen getestet, denen eine Lösung in Gegenwart von Xylooligosacchariden zugeführt wurde. Figur 2 zeigt den Einfluß der Konzentration an Xylooligosacchariden.
Die Anfangszuckerkonzentration beträgt 2 g/l. Das Substrat wird während der Phase des exponentiellen Wachstums verbraucht, während der keine Erzeugung von Xylanase nachgewiesen wird.
Wenn die Konzentration des Substrats für das Wachstum limitierend zu werden beginnt, beobachtet man eine sofortige Synthese vor.. Xylanase.
Das Ausmaß und auch die Dauer der Erzeugung des Enzyms hängen von der Substratzufuhr ab, die bei einem Substratfluß von 24 ml/h und einem Anfangsvolumen des Kulturmediums von 1,5 l von 0,26 g/h bis 0,67 g/h variiert.
Der Pfeil in Figur 2 entspricht der Zugabe der Xylooligosaccharide.
Die stärkste Erzeugung von Enzymen (230 IE/ml) erhält man, wenn das Substrat in einer Menge von 0,36 g/h zugeführt wird. Höhere Substratmengen führen zu einer Verkürzung der Zeit der Xylanase- Erzeugung.
Wenn Glucose anstelle von Xylooligosacchariden verwendet wird, wird die Erzeugung von Xylanase beträchtlich reduziert (14 IE/ml) und dauert weniger als 2 Stunden.
Andererseits wird bei Verwendung von Glucose als Anfangswachstumssubstrat die Ausbeute an Xylanase gegenüber der Ausbeute bei Verwendung von Xylooligosacchariden nicht modifiziert.
Um die Xylooligosaccharide als Substrate in kontinuierlicher Kultur herzustellen, inkubiert man eine 5%ige Suspension von Haferxylan 8 Stunden lang bei 60ºC und pH 6 in Gegenwart von 5 xylanase-Einheiten pro ml. Diese Suspension wird anschließend zentrifugiert, und der Überstand wird entnommen und dann im Autoklaven behandelt.

Beispiel 3 : Reinigung von Xvlanase aus einer Kultur des Stammes I-1017

Das Verfahren zur Reinigung der Xylanase umfaßt die folgenden Schritte:
- Konzentrieren des Kulturüberstands von Bacillus durch Ultrafil- tration auf einer Polysulfonmembran mit einer Ausschlußschwelle von 10 kDa,
- Durchlaufenlassen durch eine Ionenaustauschersäule des Typs Sepharose Fast Flow (Pharmacia);
- Durchlaufenlassen durch eine hydrophobe Säule des Typs Phenylsepharose (Pharmacia).
Die Ergebnisse dieser Reinigung sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Diese Reinigung zeigt, daß die Endoxylanase das Hauptprotein der in das Kulturmedium ausgeschiedenen Proteine ist (ungefähr 50% der insgesamt ausgeschiedenen Proteine).

Beispiel 4: Charakterisierung der Xylanase

40 µg der gemäß Beispiel 3 gereinigten Xylanase wurden mit Hilfe eines Gasphasensequencers des Typs Applied Biosystems 470 A sequenziert. Die Phenylthiohydantoin-(PTH)-Derivate jeder Aminosäure wurden durch HPLC mit Hilfe eines PTH-Analysators identifiziert, der mit einer Apparatur des Typs Applied Biosystems 120 A gekoppelt war.
Die erhaltene N-terminale Sequenz der 20 ersten Aminosäuren lautet wie folgt:
Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr-Val-Asn-Ala- Thr-Asn-Gly-Gln.
Die globale Aminosäurezusammensetzung wurde nach der Hydrolyse mit 5,6 N Salzsäure bei 100ºC während 24 Stunden ebenfalls bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben, in der die Mol- prozente jeder Aminosäure, die geschätzte Anzahl der Reste jedes Typs im Protein und durch Vergleich die Anzahl der Reste jedes Typs im N-terminalen Ende von 20 Aminosäuren angegeben sind.
Man wird feststellen, daß die Reste Asparagin und Glutamin mit den Resten Aspartat bzw. Glutamat zusammen gezählt worden sind und daß die Reste Tryptophan und Cystein nicht gemessen wurden.

Beispiel 5: Mutagenese des Stammes I-1017

Kulturen des Stammes I-1017 wurden auf einem Medium angelegt, das Xylan und Ethylmethansulfonat (EMS) enthielt.
Die behandelten Zellen werden zweimal gewaschen, über Nacht inkubiert und auf einem Agar-Xylan-Medium ausgestrichen.
Die Klone werden in Mikroglasröhrchen (8 x 35 mm) kultiviert, die mit 100 µl eines Kulturmediums gefüllt sind, dem Haferxylan (0,5%) zugesetzt wurde. Die Mikroröhrchen werden mit Silikonstopfen verschlossen, um eine Verdampfung zu vermeiden, und 24 Stunden lang bei 55ºC auf einem Rührer inkubiert.
Für die Auswahl von Mutanten werden 96 Proben parallel getestet; 20 µl jeder Mikroröhrchenkultur werden mit einer Mehrkanalpipette auf Polypropylenmikroröhrchen übertragen, wo die Hydrolyse des xylans bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 300 µl Substratsuspension in jedes Röhrchen eingeleitet und durch 400 µl 3,5-Dinitrosalicylsäure abgebrochen. Nach 15 Minuten Kochen werden 50 µl aus jedem Röhrchen auf eine Mikrotiterplatte übertragen, um die optische Dichte abzulesen.
Die Klone, die die höchsten Xylanase-Aktivitäten zeigen, werden durch fünfmaliges sukzessives Überimpfen erneut getestet und mit dem Parentalstamm verglichen.
Mutanten, die eine signifikante Zunahme der Xylanase-Aktivität zeigten, wurden unter 500 Klonen ausgewählt, die nach der Mutagenese mit EMS isoliert worden waren.
Diese Mutanten zeigen in diskontinuierlicher Kultur auf xylanhaltigem Medium eine Erhöhung der Xylanase-Aktivität.
Die Xylanaseproduktivität der Mutanten wird auch in Kulturen mit kontinuierlicher Substratzufuhr bestimmt. Bei einem Fluß der xylooligosaccharide von 0,36 g/h wird die Ausbeute an Xylanase bei der Mutante I-1018 gegenüber der beim Wildstamm I-1017 nicht signifikant erhöht (um weniger als 10%), wie Figur 3 zeigt, die das unterschiedliche Wachstum der Stämme I-1017 und I-1018 bei zwei Konzentrationen der Xylooligosaccharide zeigt.
Wenn der Fluß der Xylooligosaccharide auf 0,67 g/l erhöht wird, zeigt der Stamm I-1018 zum Beispiel eine zweimal größere Erhöhung der Xylanaseproduktion als der Stamm I-1017 (Parentalstamm).
Die Gewinnung der Mutante und die Optimierung der Bedingungen der Kultur mit kontinuierlicher Substratzufuhr erlauben eine Erhöhung der Xylanase-Erzeugung um den Faktor 3 im Vergleich zu den diskontinuierlichen Kulturen des Wildstamms auf Xylan. Diese hohen Enzymmengen (bis zu 392 IE/ml) werden in 7 Stunden Kultur erhalten, und die Xylanase-Produktivität von I-1018 ist also erheblich größer als die der besten Pilz- und Bakterienstämme (Bertrand et al., Biotechnol. Bioeng., 33: 791-794, 1989) (Yu et al., 1987, loc. cit.), die Xylanase erzeugen und die mehrere Tage benötigen, bevor man solche Enzymmengen erhält.

Beispiel 6: Behandlung von Papierfaserbreien (ungebleichtes Kraft) mit Xylanase

8,5 g feuchter Faserbrei (entsprechend 1 g Trockengewicht), der von der Strandkiefer stammte und 60 mg Xylan enthielt, wurde 24 Stunden lang bei 60ºC mit 25 ml Puffer behandelt (der verschiedene Xylanasekonzentrationen enthielt).
Die jeweilige Kinetik der Freisetzung von Xylooligosacchariden ist in Figur 4 dargestellt. Es wurde eine gleichzeitige Freisetzung von Ligninderivaten gezeigt (durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm).

Beispiel 7: Gewinnung von Xylooligosacchariden aus gemahlenen Maisspindeln

1 g (Trockengewicht) Maisspindelpulver (Korngröße > 100 mesh) wurde in 100 ml 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 6, der 1000 IE xylanase enthielt, suspendiert und 18 Stunden lang bei 60ºC inkubiert.
Figur 5 zeigt, daß es unter diesen Bedingungen möglich ist, bis zu 38% Xylan in Oligosaccharide (Xylooligosaccharide und Arabinoxylooligosaccharide) umzuwandeln. Diese Verbindungen können so, wie sie sind, verwendet werden oder als Vorstufen von Xylose und Arabinose dienen. Tabelle I Vergleich der Erzeugung von Xylanasen durch die Stämme gemäß der Erfindung und durch die Stämme des Standes der Technik * Solka-Floc: gereinigte Cellulose, die 5 bis 7% Hemicellulose enthält. Tabelle I (Fortsetzung) Vergleich der Erzeugung von Xylanasen durch die Stämme gemäß der Erfindung und durch die Stämme des Standes der Technik * Solka-Floc: gereinigte Cellulose, die 5 bis 7% Hemicellulose enthält. Tabelle II Tabelle III Globale Aminosäurezusammensetzung der Xylanase
(a) als Asparaginsäure gezählt
(b) Glutaminsäure gezählt
(c) nicht gemessen

Claims

1. Thermophile Xylanase, dadurch gekennzeichnet, daß sie bei ungefähr 60ºC stabil ist, daß sie eine Molmasse von ungefähr 22 kDa besitzt, daß sie einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 7,7 hat und daß sie die folgende N-terminale Aminosäuresequenz aufweist:

Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr- Val-Asn-Ala-Thr-Asn-Gly-Gln.

2. Xylanase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihr pH-Wert der optimalen Aktivität im Bereich von 4,8 bis 7 liegt und vorzugsweise ungefähr 6 beträgt.

3. Xylanase gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrer Sequenz 15 Alaninreste, 6 Argininreste, 29 Aspartat- und Asparaginreste, 19 Glutamat- und Glutaminreste, 31 Glycinreste, 3 Histidinreste, 6 Isoleucinreste, 7 Leucinreste, 3 Lysinreste, 1 Methioninrest, 4 Phenylalaninreste, 8 Prolinreste, 19 Serinreste, 13 Threoninreste, 22 Tyrosinreste und 14 Valinreste umfaßt.

4. Xylanase erzeugender Bacillus-Stamm, der bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de l'Institut Pasteur unter der Nr. I-1017 hinterlegt ist.

5. Xylanase erzeugender Bacillus-Stamm, der bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de l'Institut Pasteur unter der Nr. I-1018 hinterlegt ist.

6. Xylanase, dadurch gekennzeichnet, daß sie von einem der Bacillus-Stämme gemäß einem der Ansprüche 4 und 5 sezer- niert wird.

7. Verfahren zur Gewinnung von Xylanase gemäß Anspruch 6, das die folgenden Schritte umfaßt:

- Konzentrieren des Überstandes einer Bacillus-Kultur gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5;

- Durchlaufenlassen durch eine Ionenaustauschersäule;

- Durchlaufenlassen durch eine hydrophobe Säule.

8. Verfahren zur Gewinnung von Xylanase gemäß Anspruch 6, das die Schritte umfaßt:

- Züchten eines Bacillus gemäß einem der Ansprüche 4: oder 5 in einem Medium, das ein Wachstumssubstrat, wie Glucose, enthält; und

Produktion von Xylanase, die durch kontinuierliche Zufuhr geeigneter Mengen von Xylooligosacchariden zu der Kultur induziert wird.

9. Verwendung der Xylanase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 bei der Bleichung von Papierfaserbrei.

10. Verwendung der Xylanase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 bei der Herstellung von Xylooligosacchariden auf pflanzlichen Rohstoffen.