DE69205566T3

DE69205566T3 - Herpes-simplex-impfstoff, der hsv-glycoprotein-gd und 3-deacyl monophosphoryl-lipid-a enthaelt.

Info

Publication number: DE69205566T3
Application number: DE69205566T
Authority: DE
Inventors: Myriam Francotte; Nathalie Garcon-Johnson; Jean-Paul Prieels; Moncef Slaoui
Original assignee: SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1991-03-21
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2012-03-18
Also published as: FI934134L; NO307499B1; CN1101226C; CA2106492A1; FI107881B; NO933343D0; ES2081102T3; EP0576478B2; AP298A; PT100262A; CY1936A; ES2081102T5; WO1992016231A1; IL101290A0; AU650521B2; YU28392A; GR3017884T3; DK0576478T4; CN1065997A; IL101290A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Impfstoff-Formulierungen, Verfahren zur deren Herstellung und ihre Anwendung in der Therapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Formulierungen zur Behandlung von Herpes simplex-Virusinfektionen, insbesondere von Herpes simplex-Virus 2 (HSV-2)-Infektionen.
HSV-2 ist der Hauptkrankheitserreger von Herpes genitalis und zusammen mit HSV-1 (dem Erreger von Herpes labialis) dadurch gekennzeichnet, daß beide Viren die Fähigkeit besitzen, hauptsächlich in neuronalen Ganglienzellen sowohl akute Krankheiten zu induzieren als auch eine latente Infektion zu entwickeln.
Man schätzt, das Herpes genitalis bei etwa 5 Millionen Menschen in den USA auftritt, wobei jedes Jahr allein 500.000 klinische Fälle registriert werden (primäre und wiederauftretende Infektionen). Eine Erstinfektion tritt typischerweise nach der Pubertät auf und ist durch das örtlich begrenzte Auftreten von schmerzhaften Hautläsionen gekennzeichnet, die für einen Zeitraum von 2 bis 3 Wochen fortbestehen. Innerhalb der folgenden sechs Monate nach der Erstinfektion tritt die Krankheit bei 50% der Patienten wieder auf. Bei etwa 25% der Patienten kann die Krankheit jedes Jahr in 10-15 Schüben wiederauftreten. Bei Patienten mit einer Immunschwäche ist die Verbreitung eines Wiederauftretens mit hoher Häufigkeit statistisch größer als in der normalen Patientenpopulation.
Sowohl das HSV-1-Virus als auch das HSV-2-Virus besitzt eine Anzahl von Glykoproteinkomponenten, die sich auf der Oberfläche des Virus befinden. Diese sind als gA, gB, gC, gD, gE etc. bekannt.
Das Glykoprotein D ist auf der Virusmembran lokalisiert und es kommt auch im Cytoplasma infizierter Zellen vor (Eisenberg R. J. et al., J. of Virol. 35 (1980), 428-435). Es umfaßt 393 Aminosäuren, einschließlich eines Signalpeptids, und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 60 kD. Von allen HSV-Hüllglykoproteinen ist dieses wahrscheinlich das am besten charakterisierte Protein (Cohen et al., J. Virology 60, 157-166). Es ist bekannt, daß es in vivo eine zentrale Rolle bei der Virusanheftung an Zellmembranen spielt. Außerdem wurde gezeigt, daß das Glykoprotein D in vivo die Bildung von neutralisierenden Antikörpern auslösen kann (Eing et al., J. Med. Virology 127, 59-65). Jedoch kann das latente HSV-2-Virus trotz des Vorhandenseins eines hohen Titers von neutralisierenden Antikörpern in den Patientenseren noch reaktiviert werden und ein Wiederauftreten der Krankheit induzieren.
Allein die Fähigkeit, neutralisierende Antikörper zu induzieren, ist unzureichend, um die Krankheit hinreichend zu kontrollieren. Um einem Wiederauftreten der Krankheit vorzubeugen, muß ein Impfstoff nicht nur neutralisierende Antikörper stimulieren, sondern auch eine durch T-Zellen vermittelte zelluläre Immunität. Die vorliegende Erfindung erreicht diese Ziele.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Impfstoff bereit, umfassend ein HSV- Glykoprotein D oder ein immunologisches Fragment davon in Verbindung mit 3-O-desacyliertem Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL), einem desacylierten Derivat von Monophosphoryl-Lipid A, und Alaun. Typischerweise stammt das Glykoprotein D von HSV-2. Das 3D-MPL ist im Bereich von 10 ug bis 100 ug, vorzugsweise 25 ug bis 50 ug, pro Dosis vorhanden, wobei das Antigen typischerweise in einem Bereich von 2 ug bis 50 gg pro Dosis vorhanden ist.
3D-MPL kann gemäß den im Britischen Patent Nr. 2220211 (RIBI) beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein verkürztes HSV-2-Glykoprotein D von 308 Aminosäuren, das die Aminosäuren 1 bis 306 des natürlich vorkommenden Glykoproteins unter Addition von Asparagin und Glutamin am C-terminalen Ende des verkürzten Proteins, dem der Membran-Ankerbereich fehlt, umfaßt. Diese Form des Proteins schließt das Signalpeptid ein, das abgespalten wird, um ein reifes Protein von 283 Aminosäuren zu erhalten. Die Herstellung eines solchen Proteins in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters wurde in Genentech's Europäischem Patent EP-B-139 417 beschrieben.
Das reife verkürzte Protein wird vorzugsweise in den erfindungsgemäßen Impfstoff-Formulierungen verwendet und als rgD&sub2;t bezeichnet.
Das HSV-Antigen kann chemisch oder auf andere Weise an einen aus Teilchen bestehenden Träger konjugiert werden. Ein besonders bevorzugter Ansatz ist die chemische Konjugation an ein bestimmtes Hepatitis B-Oberflächenantigen über freie Sulfhydrylgruppen, die auf der Oberfläche des Hepatitis B-Oberflächenantigens lokalisiert sind. Vgl. die gleichzeitig anhängige GB-Patentanmeldung Nr. 9027623.9.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind bei der Induktion einer schutzgewährenden Immunität, sogar bei sehr geringen Antigendosen (z. B. nur 5 ug rgD&sub2;t), sehr wirksam.
Sie stellen einen ausgezeichneten Schutz gegen eine Erstinfektion bereit und stimulieren vorteilhafterweise sowohl spezifische humorale (neutralisierende Antikörper) als auch durch Effektorzellen vermittelte (DTH) Immunantworten.
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß einem weiteren Gesichtspunkt eine Impfstoff-Formulierung, wie hier beschrieben, zur Verwendung bei der medizinischen Therapie, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von oder für die Vorbeugung gegen Herpes simplex-Virusinfektionen, bereit.
Der erfindungsgemäße Impfstoff enthält eine immunprotektive Menge von HSVgD oder einem immunologischen Fragment davon, und dieses kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
Die Impfstoffherstellung wird in New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978, allgemein beschrieben. Die Einkapselung innerhalb von Liposomen wird zum Beispiel von Fullerton, US-Patent 4,235,877, beschrieben. Die Konjugation von Proteinen an Makromoleküle ist zum Beispiel bei Likhite, US-Patent 4,372,945, und bei Armor et al., US-Patent 4,474,757, offenbart.
Die Proteinmenge in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge gewählt, die eine immunprotektive Antwort ohne wesentliche unerwünschte Nebenwirkungen in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten spezifischen Immunogen. Im allgemeinen wird erwartet, daß jede Dosis 1 ug bis 1000 ug Protein, vorzugsweise 2 ug bis 100 ug, besonders bevorzugt 4 ug bis 40 ug, umfaßt. Eine optimale Menge für einen bestimmten Impfstoff kann durch Standardstudien ermittelt werden, die die Beobachtung von Antikörpertitern und anderen Antworten in Individuen einschließen. Nach einer Erstimpfung können die Individuen nach etwa 4 Wochen eine Auffrischung erhalten.
Zusätzlich zur Impfung von Personen, die für HSV-Infektionen anfällig sind, können die erfindungsgemäßen Arzneimittel zur immuntherapeutischen Behandlung von Patienten, die an HSV-Infektionen leiden, verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Herstellungsverfahren bereitgestellt, wie hier beschrieben, wobei das Verfahren das Mischen von HSV-2-Glykoprotein D oder einem immunologischen Fragment davon mit Alaun und 3D-MPL umfaßt.

Vergleich der Adjuvanswirksamkeit eines rekombinanten Herpes simplex-Virus- Glykoprotein D-Untereinheit-Impfstoffs

In dieser Studie wurde die Fähigkeit mehrerer Adjuvanzien, die schutzgewährende Immunität eines rekombinanten Glykoproteins D vom Herpes simplex-Virus (HSV)-Typ 2 (rgD&sub2;t) zu verbessern, in einem Meerschweinchenmodell bewertet. Die getesteten Adjuvanzien waren Aluminiumhydroxid, Aluminiumhydroxid in Verbindung mit 3-Desacyl-Monophosphoryl-Lipid A und in einer Öl-in-Wasser-Emulsion verteiltes 3-Desacyl-Monophosphoryl-Lipid A.

1. Beschreibung des Antigens

HSV-rgD&sub2;t ist ein gentechnisch verändertes, rekombinantes, verkürztes Glykoprotein, das in transfizierten Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) hergestellt wurde (Europäisches Patent Nr. 0 139 417).

2. Antigen-Adjuvans-Präparationen und Immunisierungsprogramme

Zwei verschiedene Experimente wurden durchgeführt, um die schutzgewährende Immunität mehrerer rgD&sub2;t-Formulierungen in dem Meerschweinchenmodell zu bewerten. Im ersten Experiment wurden Gruppen von Meerschweinchen dreimal mit einer geringen Antigendosis (5 ug rgD&sub2;t) in 4 Adjuvansformulierungen, die hergestellt wurden, wie nachstehend beschrieben, immunisiert. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden sie intravaginal HSV Typ 2 ausgesetzt und täglich auf die Entwicklung einer primären und einer wiederauftretenden HSV-2-Erkrankung überprüft. Beim zweiten Experiment wurden diese Formulierungen ferner in größeren Tiergruppen beurteilt. Faktoren, die die Wirksamkeit dieser Formulierungen beeinflussen, wie Antigendosis und Adjuvanszusammensetzung, wurden ebenfalls untersucht.

2. 1. Antigen-Adjuvans-Präparationen

Im ersten Experiment wurden Meerschweinchen mit den folgenden Adjuvanspräparationen immunisiert. Jede Dosis (5 ug) wurde in einem Volumen von 0,25 ml verabreicht.

2.1.1. rgD&sub2;t/Alaun (Aluminiumhydroxid)

Das Alaun wurde von Superfos (Alhydrogel (Boehimte), Superfos, Dänemark) bezogen. 5 ug gereinigtes rgD&sub2;t wurden über Nacht bei 4ºC an Aluminiumhydroxid (Alaun) adsorbiert, was 0,25 mg Äquivalenten Al³&spplus; in 0,25 ml 150 mM NaCl in 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, entspricht.

2.1.2. rgD&sub2;t/Aluminiumhydroxid plus 3D-MPL

3D-MPL wurde von Ribi Immunochem Research, Inc., bezogen. Nach Adsorption von 5 ug rgD&sub2;t an Alaun über Nacht, wie unter 2.1.1. beschrieben, wurde die Adjuvanspräparation zentrifugiert und der Überstand entfernt. Ein gleiches Volumen des Adsorptionspuffers, der 100 ug 3D-MPL enthielt, wurde dann zu dem Alaun-gebundenen rgD&sub2;t zugegeben.
Für beide rgD&sub2;t/Alaun-Präparationen wurde festgestellt, daß mehr als 98% des rgD&sub2;t in dem Aluminiumhydroxid-Adjuvans eingearbeitet waren.

2.1.3. rgD&sub2;t/3D-MPL in einer Öl-in Wasser-Emulsion (R)

Die Öl-in-Wasser-Emulsion wurde unter Verwendung von 12% (Gew./Vol.) Lecithin hergestellt, das zu Squalenöl und 0,08% Tween® 80 zugegeben wurde. 3D-MPL wurde in einer Konzentration zugegeben, die 100fach höher als die gewünschte Endkonzentration war. 1% dieser Präparation wurde dann in einem Volumen von 0,25 ml mit 5 ug rgD&sub2;t in einer wäßrigen Phase gemischt, wobei eine 1%ige Öl-in-Wasser-Emulsion, enthaltend 100 ug 3D-MPL, erhalten wurde.
Ähnliche Adjuvansformulierungen, die wie vorstehend hergestellt wurden, die aber unterschiedliche Mengen von rgD&sub2;t und/oder einen Immunstimulator enthielten, wurden im zweiten Experiment verwendet. Sie wurden in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml verabreicht. Diese Formulierungen werden nachstehend beschrieben.
rgD&sub2;t/Alaun: 5 oder 20 ug rgD&sub2;t; 0,5 mg Äquivalente Al³&spplus; pro 0,5 ml-Dosis.
rgD&sub2;t/Alaun plus 3D-MPL: 5 oder 20 ug rgD&sub2;t; 0,5 mg Äquivalente Al³&spplus;; 50 ug 3D-MPL pro 0,5 ml-Dosis.
rgD&sub2;t/3D-MPL in einer O/W-Emulsion (R): 5 oder 20 ug rgD&sub2;t wurden in einer 1%igen O/W-Emulsion formuliert, wie vorstehend beschrieben (2.1.3.). Eine 0,5 ml-Dosis enthielt 5 ug oder 20 ug rgD&sub2;t und 50 ug 3D-MPL in einer 1%igen O/W-Emulsion.
rgD&sub2;t/3D-MPL in einer O/W-Emulsion (S): Der Träger wurde wie folgt hergestellt: zu einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), enthaltend 0,4% (Vol./Vol.) Tween®80, wurden 5% (Vol./Vol.) Pluronic®L121 und 10% Squalan zugegeben, und das so erhaltene Gemisch wurde zehnmal durch einen Mikroverflüssiger (Modell M/110, Microfluidics Corp.) mikroverflüssigt, so daß die erhaltene Emulsion nur submikronische Partikel umfaßte. 50 ug 3D-MPL wurden dann zu der Emulsion zugegeben. Ein Volumenteil dieser 3D-MPL-enthaltenden Emulsion wurde dann mit einem gleichen Volumenteil des zweifach konzentrierten Antigens gemischt und mit Hilfe eines Vortexgeräts kurz gemischt, um sicherzustellen, daß die Bestandteile vollständig gemischt waren. Die fertige Präparation bestand aus 0,2% Tween®80, 2,5% Pluronic®L121, 5% Squalan, 50 ug 3D-MPL und 5 ug oder 20 ug rgD&sub2;t in einer 0,5 ml-Dosis.

2.2. Immunisierungsprogramm

Gruppen weiblicher Hartley-Meerschweinchen (200-250 g) wurden dreimal an den Tagen 0,28 und 95 mit 5 ug rgD&sub2;t immunisiert, das in vier unterschiedlichen Adjuvansformulierungen formuliert wurde.
Die Immunisierungen erfolgten subkutan mit einem Injektionsvolumen von 0,25 ml. Den Kontrolltieren wurde nach dem gleichen Protokoll nur das Adjuvans allein injiziert oder sie wurden nicht behandelt.
Die verschiedenen Gruppen wurden wie folgt immunisiert:
Gruppe 1 (n = 4): 5 ug rgD&sub2;t/3D-MPL (100 ug) in einer O/W-Emulsion (R);
Gruppe 2 (n = 4): 5 ug rgD&sub2;t/Alaun plus 3D-MPL (100 ug);
Gruppe 3 (n = 4): 5 ug rgD&sub2;t/Alaun;
Gruppe 4 (n = 5): Alaun allein;
Gruppe 5 (n = 5): 3D-MPL (100 ug) allein;
Gruppe 6 (n = 8): nicht behandelt.
Die Tiere wurden alle 2 Wochen für Antikörperbestimmungen mit ELISA- und Neutralisationstests, wie nachstehend beschrieben, zur Ader gelassen.
Die unterschiedlichen Formulierungen wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, eine durch T-Zellen vermittelte Immunität zu induzieren, was durch die Induktion von Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ gemessen wurde. Die abgelesenen Meßdaten, die zur Bewertung der humoralen und zellulären Immunantworten, die durch die unterschiedlichen rgD&sub2;t-Formulierungen induziert wurden, verwendet wurden, werden nachstehend beschrieben.
Um die durch die rgD&sub2;t-Formulierungen induzierte schutzgewährende Immunität zu vergleichen, wurden alle Meerschweinchen 2 Wochen nach der letzten Immunisierung intravaginal 105 Plaque-bildenden Einheiten ("plaque-forming units", PFU) HSV-2, Stamm MS, ausgesetzt. Sie wurden täglich auf klinische Symptome einer akuten Infektion sowie auf Hinweise für wiederauftretende Herpeserkrankungen überprüft. Scheidenabstriche wurden am Tag 5 nach der Virusexposition gesammelt, und die Konzentration des infektiösen Virus wurde durch Titration bestimmt.
Eine ausführliche Beschreibung des intravaginalen Meerschweinchenmodells ist nachstehend angegeben.
Im zweiten Experiment wurde die Immunogenität der folgenden rgD&sub2;t-Formulierungen in größeren Tiergruppen bewertet. Es wurden zwei Antigendosen verglichen (5 und 20 ug) und unterschiedliche Adjuvanszusammensetzungen getestet. Eine Dosis von 50 ug 3D-MPL wurde verwendet und ihre Wirkungen wurden mit der vorher verwendeten Dosis von 100 ug verglichen.
Gruppen von weiblichen Hartley-Meerschweinchen wurden dreimal an den Tagen 1,28 und 84 wie folgt immunisiert:
Gruppe I (n = 8): 20 ug rgD&sub2;t/3D-MPL (50 ug) O/W-Emulsion (R);
Gruppe II (n = 8): 5 ug rgD&sub2;t/3D-MPL (50 ug) O/W-Emulsion (R);
Gruppe III (n = 10): 20 ug rgD&sub2;t/3D-MPL (50 ug) O/W-Emulsion (S);
Gruppe IV (n = 10): 5 ug rgD&sub2;t/3D-MPL (50 ug) O/W-Emulsion (S);
Gruppe V (n = 10): 20 ug rgD&sub2;t/Alaun + 3D-MPL (50 ug);
Gruppe VI (n = 10): 5 ug rgD&sub2;t/Alaun + 3D-MPL (50 ug);
Gruppe VII (n = 4): Alaun + 3D-MPL (50 ug) allein;
Gruppe VIII (n = 4): 3D-MPL (50 ug) O/W-Emulsion (R) allein;
Gruppe IX (n = 8): nicht behandelt.
Die Immunisierungen erfolgten mit einer Dosis von 0,5 ml. Die Kontrollgruppen wurden nach dem gleichen Protokoll mit dem Adjuvans allein immunisiert (Gruppen VII und VIII) oder nicht behandelt (Gruppe IX).
Eine letzte Gruppe (Gruppe X) wurde mit einer rgD&sub2;t-Alaun + 3D-MPL-Formulierung, enthaltend 100 ug 3D-MPL in einer 0,25 ml-Dosis, gemäß dem im ersten Prophylaxe- Experiment beschriebenen Protokoll immunisiert:
Gruppe X (n = 10): 5 ug rgD&sub2;t/Alaun plus 3D-MPL (100 ug).
Die Tiere wurden alle zwei Wochen für einzelne Antikörperbestimmungen mit ELISA- und Neutralisationstests, wie nachstehend beschrieben, zur Ader gelassen. Scheidenwaschlösungen wurden nach der zweiten Immunisierung gesammelt und auf das Vorhandensein von systemischen Antikörpern, die für gD&sub2;t spezifisch sind (anti-gD&sub2;t-Antikörper der IgG-Klasse), getestet. Die Meerschweinchen wurden zwei Wochen nach der letzten Immunisierung intravaginal 10&sup5; PFU HSV-2 (Stamm MS) ausgesetzt. Nach der Exposition wurden sie täglich auf klinische Symptome einer akuten Infektion (Tage 4 bis 12 nach der Exposition) sowie auf Hinweise einer wiederauftretenden Herpeserkrankung (Tage 13 bis 39 nach der Exposition) überprüft.

3. Abgelesene Meßdaten

Es wurden mehrere Meßdaten abgelesen, um die durch die Impfung mit rgD&sub2;t-Formulierungen induzierten spezifischen Antikörper- und zellvermittelten Antworten zu bewerten. Der Schutzwert dieser Formulierungen wurde im intravaginalen Meerschweinchenmodell nachgewiesen.

3.1. ELISA

Ein ELISA wurde entwickelt, um gD-spezifische Antikörper in Meerschweinchenseren und -scheidenwaschlösungen mit rgD&sub2;t als Beschichtungsantigen nachzuweisen und zu quantifizieren.

3.1.1. Nachweis von für rgD&sub2;t spezifischen IgG-Antikörpern in Seren

Pro Vertiefung wurden 50 ul der Antigen- und Antikörperlösungen verwendet. Das Antigen wurde auf eine Endkonzentration von 1 ug/ml in PBS verdünnt und über Nacht bei 4ºC an die Oberfläche der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Maxisorp-Immuno-Platte, Nung, Dänemark) adsorbiert. Die Vertiefungen wurden dann fünfmal mit PBS-0,1% Tween® (Waschpuffer) gewaschen und eine Stunde bei 37ºC mit PBS, enthaltend 1% Rinderserumalbumin, 4% fötales Kälberserum und 0,1% Tween® (Sättigungspuffer), inkubiert. Dreifache Verdünnungen der Seren (beginnend bei einer 1/100- Verdünnung) in dem Sättigungspuffer wurden zu den rgD&sub2;t-beschichteten Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wie vorstehend gewaschen, und Biotin-konjugiertes Schaf-anti-Meerschweinchen- IgG (IgG1- und IgG2-spezifisch, Serotec, Sopar Biochem., Belgien), 1/3000 in Sättigungspuffer verdünnt, wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden 1,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde ein Streptavidin-biotinylierter Peroxidase-Komplex (Amersham, GB), 1/1000 in Sättigungspuffer verdünnt, zugegeben, und die Platten wurden 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden wie vorstehend gewaschen und mit einer Lösung von 0,04% o-Phenylendiamin (Sigma) und 0,03% H&sub2;O&sub2; in 0,1 M Citratpuffer bei pH 4,5 inkubiert. Die Farbreaktion wurde nach 15 Minuten durch die Zugabe von 2 M H&sub2;SO&sub4; gestoppt, und die Absorption wurde bei 492 nm abgelesen.
Der ELISA-Titer wurde definiert als der reziproke Wert der Serumverdünnung, die eine Absorption (bei 492 nm gemessene optische Dichte) hervorruft, welche 50% des maximalen Absorptionswerts (mittlerer Titer) entspricht.
Die ELISA-Titer wurden mit einem Computerprogramm durch eine lineare 4 Parameter-Regressionsanalyse berechnet.

3.1.2. Nachweis von für rgD&sub2;t spezifischen IgG-Antikörpem in Scheidenwaschlösungen

Die Scheidenwaschlösungen wurden wie folgt zuerst mit einem ELISA auf ihren IgG-Gesamtgehalt geeicht. Maxisorp-Immuno-Platten wurden über Nacht bei 4ºC mit 1 ug/ml (50 ul pro Vertiefung) gereinigtem Ziegen-anti-Meerschweinchen-IgG (Sigma, Belgien), verdünnt in PBS, beschichtet. Die Platten wurden gewaschen und wie vorstehend mit Sättigungspuffer inkubiert. Die Scheidenwaschlösungen wurden in einer doppelten Verdünnungsreihe (beginnend bei einer 1/100-Verdünnung) in dem Sättigungspuffer verdünnt und zu den Platten zugegeben. Eine Standardkurve von gereinigtem Meerschweinchen-IgG (Sigma, Belgien) (Zweifachverdünnung beginnend bei einer Konzentration von 100 ng/ml) war bei jeder Platte eingeschlossen.
Nach einer 2-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten wie vorstehend gewaschen, und Biotin-konjugierte Schaf-Antikörper, die für Meerschweinchen- IgG1 und -IgG2 spezifisch sind (Serotec, Sopar Biochem., Belgien), 1/1000 in Sättigungspuffer verdünnt, wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, und die Platten wurden 1,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die nächsten Schritte (Zugabe des Streptavidin-biotinylierten Peroxidase- Komplexes und Farbreaktion) waren wie vorstehend beschrieben (3.1.1.).
Die Konzentration des in den Scheidenwaschlösungen vorhandenen gesamten IgG wurde aus der IgG-Standardkurve mit einem Computerprogramm durch eine nicht lineare 4 Parameter-Regressionsanalyse bestimmt.
Nach Eichung auf ihren IgG-Gesamtghalt wurden die Scheidenwaschlösungen auf das Vorhandensein von IgG-Antikörpern, die für rgD&sub2;t spezifisch sind, unter Verwendung des gleichen ELISA getestet, wie er für die anti-gD-Antikörper-Serenquantifizierung beschrieben wurde. Die Ergebnisse wurden als optische Dichten, gemessen bei 492 nm, pro 0,5 ug/ml Gesamt-IgG angegeben.

3.2. Neutralisationstest

Ein Neutralisationstest mit einer Anordnung von 96 Vertiefungen wurde wie folgt ausgeführt:
Doppelte Verdünnungsreihen der zu testenden Proben wurden direkt in den Platten mit 96 Vertiefungen hergestellt (25 ul/Vertiefung jeder der Serumverdünnungen, in doppelter Ausfertigung). Fünfzig Mikroliter eines Gemisches, das 4000 PFU des Virus HG52 und Komplement (1/100 Endverdünnung in der Vertiefung) enthielt, wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Dann wurden zu jeder Vertiefung 100 ul einer BHK-21-Zellsuspension mit 4 · 10&sup5; Zellen/ml zugegeben (4 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung). Die Platten wurden 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert und fünf Tage bei 37ºC in Gegenwart von 7% CO&sub2; inkubiert.
Nach diesem Zeitraum wurde das Kulturmedium vorsichtig entfernt, und 100 ul einer Kristallviolett-Lösung (10% Methanol, 90% H&sub2;O, 0,3% Kristallviolett) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden 20 Minuten beim Raumtemperatur inkubiert und dann gründlich mit Leitungswasser gewaschen. Das Vorhandensein von Plaques kann mittels einer mikroskopische Untersuchung leicht überprüft werden.
Der Neutralisierungstiter wurde definiert als reziproker Wert der höchsten Serumverdünnung, bei der kein Virusplaque beobachtet wurde (100%iger Schutz vor einer cytopathogenen Wirkung). Es ist wichtig anzumerken, daß zu diesem Zeitpunkt eine vollständige cytopathogene Wirkung (100% Lyse der einzelligen Zelischicht) in den Kontrollvertiefungen beobachtet wurde.

3.3. Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ ("Delayed-Type Hypersensitivity", DTH)

Die unterschiedlichen rgD&sub2;t-Formulierungen wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, eine T-Zell-spezifische Immunantwort zu induzieren, wie durch die Induktion von Überempindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ gemessen wurde.
In dieser Studie wurden die für das erste Experiment hergestellten Adjuvansformulierungen verwendet. Diese Präparationen enthielten 5 ug rgD&sub2;t pro 0,25 ml-Dosis. Der Immunisierungsplan war wie folgt: Erstimmunisierung: 0,25 ml Impfstoff-Formulierung intramuskulär verabreicht; Nachimmunisierung: 0,25 ml Impfstoff-Formulierung 21 Tage später intramuskulär verabreicht; Hauttest: 5 ug rgD&sub2;t (in physiologischer Salzlösung) 8 Tage später intradermal verabreicht. Bei allen Meerschweinchen wurde die Haut mit physiologischer Salzlösung als Kontrolle getestet.
Zusätzlich wurde die Haut bei Kontroll-Meerschweinchen (nicht immunisierte Tiere) mit rgD&sub2;t getestet. Die Hautrötung und Verhärtung an der Stelle der intradermalen Injektion wurde 24 und 48 Stunden später überprüft.

3.4. Intravaginales Meerschweinchenmodell

Das Meerschweinchenmodell für die genitale HSV-Infektion wurde von Stanberry L. R. et al. beschrieben (J. of Infectious Diseases 146 (1982), 397-403; Intervirology 24 (1985), 226-231).
Kurz zusammengefaßt wurden die Meerschweinchen 2 Wochen nach der letzten Immunisierung 10&sup5; PFU HSV-2, Stamm MS, durch intravaginale Einträufelung ausgesetzt. Der klinische Verlauf der Erstinfektion wurde durch tägliche Beobachtung der Häufigkeit und Schwere der Hautläsionen an den äußeren Genitalien während des Zeitraums von 12 Tagen nach der Exposition überprüft.
Am Tag 5 nach der Virusexposition wurden Scheidenabstriche gesammelt, und die Konzentration des infektiösen HSV-2-Virus wurde durch Titration mit einen Plaquetest bestimmt, wie nachstehend beschrieben. Die Tiere wurden dann ab dem Tag 13 bis 60 täglich auf Hinweise für wiederauftretende Herpesläsionen untersucht. Die Herpesläsionen der Haut der äußeren Genitalien wurden unter Verwendung einer Läsionsbeurteilungsskala, die von 0 bis 4 reichte (0 = keine Läsion oder Rötung; 0,5 = Rötung; 1 = Bläschen; 1,5 = ≥4 kleine Bläschen; 2 = größere Bläschen; 2,5 = mehrere große Bläschen, die von der Fusion von Bläschen wie in Beurteilung 2 resultieren; 3 = Größe und Anzahl der Bläschen zunehmend; 3,5 = Läsionen bedecken die gesamte Oberfläche der Genitalhaut; 4 = eitrige Läsionen mit Mazeration), quantifiziert.
Der Grad des durch die unterschiedlichen rgD&sub2;t-Impfstoffe bereitgestellten Schutzes wurde gemäß den nachstehend definierten Kriterien bewertet.

Schutz vor einer Ersterkrankung (Tage 0-12)

Die Tiere wurden als nicht geschützt angesehen, wenn die folgenden Läsionen beobachtet wurden:
- mehr als ein roter Bereich zu einem beliebigen Zeitpunkt;
- ein roter Bereich, der im gleichen Bereich für mindestens 3 aufeinanderfolgende Tage fortbesteht (Läsionsbeurteilung 0,5);
- ein oder mehrere Bläschen (Läsionsbeurteilung ≥ 1).

Schutz gegen eine wiederauftretende Erkrankung (Tage 13-60)

Die Tiere wurden positiv für eine wiederauftretende Erkrankung beurteilt, entweder wenn eine Läsionsbeurteilung von 0,5 für mindestens zwei aufeinanderfolgende Tage registriert wurde oder wenn eine Läsionsbeurteilung von ≥ 1 an einem beliebigen Tag beobachtet wurde. Ein Schub der wiederauftretenden Erkrankung war vorausgegangen und ihm folgte ein Tag ohne Läsionen oder eine Rötung.
Die Schwere der Läsion für ein Tier wird als Summe der Beurteilungen berechnet, die während der Erstinfektion (Tage 1-12) gemessen wurden. Die Läsionshäufigkeit entspricht einer Anzahl von Tieren, die während des Beobachtungszeitraums (Tage 1-12 [Ersterkrankung] oder Tage 13-60 [wiederauftretende Erkrankungen]) eine Läsion von ≥ 1 aufwiesen.

3.5. Virustitration in Scheidenabstrichen

Fünf Tage nach der Virusexposition wurden Scheidenabstriche gesammelt. Das Scheidengewölbe wurde mit einem Tupfer mit einer Calciumalginat-Spitze abgewischt, der vorher in Eagle-Basisnährmedium, supplementiert mit 2% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 100 ug/ml Gentamycin und 1 ug/ml Amphotericin B (Abstrichmedium), befeuchtet worden war.
Jeder Abstrich wurde aufgebrochen und in ein steriles 12 · 75mm großes 5 ml- Polyallomer-Röhrchen, enthaltend 1 ml Abstrichmedium, überführt. Die Röhrchen wurden dann mit Hilfe eines Vortexgeräts gemischt, um das Virus herauszulösen, und bis zur Verwendung tiefgefroren. Für die Titration selbst wurden Kulturplatten mit 6 Vertiefungen, enthaltend 5 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung, über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden aufgetaut, und Verdünnungsreihen der Proben in Abstrichmedium wurden hergestellt. Nach Entfernung des Kulturmediums in den 6 Vertiefungen wurden 200 ul jeder Probenverdünnung in doppelter Ausfertigung auf die einzelligen Zellschichten übertragen, und die Platten wurden eine Stunde bei 37ºC gehalten. 4 ml eines Kulturmediums, enthaltend 1,5% Carboxymethylcellulose, wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden dann 2 Tage bei 37ºC inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum wurde das Medium vorsichtig entfernt, und 1 ml einer Kristallviolett-Lösung (10% Methanol, 90% H&sub2;O, 0,3% Kristallviolett) wurde zu jeder Vertiefung für 15 Minuten zugegeben. Die Platten wurden dann gründlich gespült, und die Plaques wurden gezählt. Der HSV-2-Titer wurde in PFU/ml angegeben.

4. Ergebnisse

In einer ersten Reihe von Experimenten wurden Gruppen von Meerschweinchen mit einer geringen Antigendosis (5 ug rgD&sub2;t), in 4 unterschiedlichen Formulierungen formuliert, immunisiert. Diese suboptimale Antigendosis wurde gewählt, um die wirksamere rgD&sub2;t- Adjuvanskombination auszuwählen, die einen Schutz gegen eine primäre und eine wiederauftretende HSV-Erkrankung bereitstellen könnte, wenn sie Meerschweinchen vor der intravaginalen HSV-2-Impfung verabreicht wird (Prophylaxeversuche).

4.1. Induktion der humoralen Immunität

Wie in Tabelle 1 aufgeführt, zeigten Gruppen, die mit 3D-MPL-enthaltenden rgD&sub2;t-Formulierungen als Immunstimulans geimpft wurden, höhere ELISA-Titer und Neutralisierungstiter in ihren Seren als die Gruppe, die mit dem rgD&sub2;t/Alaun-Impfstoff immunisiert wurde. Gute mittlere Neutralisierungstiter wurden nach 3 Immunisierungen mit rgD&sub2;t- 3D-MPL-O/W (R) oder rgD&sub2;t-Alaun-3D-MPL induziert.

4.2. Induktion der Effektor-T-Zell-Antwort (DTH)

Hauttestergebnisse (Tabelle 2) zeigten, daß rgD&sub2;t formuliert in einer 3D-MPL- O/W-Emulsion die stärkste DTH-Antwort induziert. Eine spezifische DTH-Antwort wurde auch durch rgD&sub2;t-Alaun-3D-MPL induziert. Ähnliche in Mäusen durchgeführte Experimente zeigten auch, daß rgD&sub2;t kombiniert mit Alaun plus 3D-MPL im Gegensatz zur rgD&sub2;t-Alaun- Formulierung bei der Induktion einer in vivo-Effektor-T-Zell-Antwort sehr wirksam war.

4.3. Wirkung der Impfung auf die HSV-Ersterkrankung

Zwei Wochen nach der dritten Immunisierung wurden Meerschweinchen intravaginal HSV-2 ausgesetzt. Die Wirkung der Impfung auf den klinischen und virologischen Verlauf der HSV-2-Erstinfektion ist in Fig. 1 veranschaulicht und in Tabelle 3 zusammengefaßt. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Gruppen 4 bis 6), die infiziert wurden und eine akute Ersterkrankung durchmachten, zeigten 100% der Tiere, die mit der rgD&sub2;t-3D-MPL- 01 W-Formulierung geimpft wurden, keinen Hinweis auf eine Herpeserkrankung, wie durch die Hautläsionshäufigkeit und -schwere überwacht wurde. Außerdem zeigten diese Tiere keine Virusreplikation im Vaginaltrakt, wie durch eine vaginale Virustitration am Tag 5 nach der Exposition bestimmt wurde. Sehr ähnliche Ergebnisse erhielt man in der Gruppe, die mit rgD&sub2;t/Alaun-3D-MPL geimpft wurde. Diese Gruppe entwickelte während des Beobachtungszeitraums nie Herpesbläschen (Läsionsbeurteilung < 1). Außerdem konnte in den gesammelten Scheidenabstrichen eine sehr geringe Virusreplikation nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu waren Tiere, die rgD&sub2;t adsorbiert an Alaun erhielten, schlecht geschützt (75% Hautläsionshäufigkeit).

4.4. Wirkung der Impfung auf eine wiederauftretende HSV-Erkrankung

Die Ergebnisse sind in Fig. 1 veranschaulicht und in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Die Impfung mit 3D-MPL-enthaltenden rgD&sub2;t-Formulierungen (Gruppen 1 und 2) verändert die Entwicklung von wiederauftretenden Herpeserkrankungen erheblich. Zwei Gruppen wiesen bedeutend weniger wiederauftretende Schübe und eine geringere Anzahl von Tagen, an denen die Krankheit wiederauftrat, auf als die Kontroll- oder rgD&sub2;t-Alaun- behandelten Gruppen.
Um die Faktoren, die die Wirksamkeit der vorbeugenden, 3D-MPL-enthaltenden rgD&sub2;t-Impfstoffe beeinflussen, weiter zu bestimmen, wurde eine zweite Reihe von Experimenten mit einer größeren Zahl von Meerschweinchen initiiert.
Zwei Antigendosen wurden verglichen (5 und 20 ug) und unterschiedliche Adjuvanszusammensetzungen wurden getestet. Drei Immunisierungen wurden an den Tagen 0,28 und 84 verabreicht. Die Tiere wurden alle zwei Wochen für die individuelle Antikörperbestimmung mit ELISA- und Neutralisationstests zur Ader gelassen. Nach der zweiten Immunisierung wurden Scheidenwaschlösungen gesammelt und auf das Vorhandensein von systemischen Antikörpern, die für rgD&sub2;t spezifisch sind, untersucht.

Induktion der humoralen Immunität

Die Ergebnisse (Tabelle 5) zeigten, daß alle 3D-MPL-enthaltenden rgD&sub2;t- Formulierungen hohe ELISA-Titer und Neutralisierungstiter in den Meerschweinchenseren stimulieren können.
Die mittleren ELISA-Titer und Neutralisierungstiter, die nach drei Immunisierungen induziert wurden, waren in den Seren der Gruppen, die mit einer rgD&sub2;t-Formulierung geimpft wurden, die entweder 5 ug oder 20 ug rgD&sub2;t enthielt, sehr ähnlich. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der humoralen Antwort, die in den Gruppen gemessen wurde, die mit einem rgD&sub2;t-Alaun-Impfstoff immunisiert wurden, der entweder 50 ug 3D-MPL (Gruppe VI) oder 100 ug 3D-MPL (Gruppe X) enthielt.
Es ist interessant, daß systemische anti-rgD&sub2;t-Antikörper (IgG-Klasse) in den Scheidenwaschlösungen aller geimpften Gruppen nachgewiesen werden konnten. Diese in der Schleimhaut lokalisierte anti-rgD&sub2;t-Antikörperantwort könnte durch die Verringerung der Menge des infektiösen Virus im Genitaltrakt während der Erstinfektion eine wichtige Schutzfunktion übernehmen.

Wirkung der Impfung auf die HSV-Ersterkrankung

Zwei Wochen nach der dritten Immunisierung wurden die Meerschweinchen intravaginal HSV-2 ausgesetzt. Die Wirkung der Impfung auf den klinischen und virologischen Verlauf der HSV-2-Erstinfektion ist in Tabelle 6 zusammengefaßt. Im Vergleich zu den Kontrollen zeigten Tiere, die mit einer 5 ug rgD&sub2;t-Alaun-3D-MPL- Formulierung geimpft wurden, die entweder 50 ug oder 100 ug 3D-MPL enthielt (Gruppen VI und X), eine signifikante (p < 0,05) Reduktion der Hautläsionschwere sowie eine Reduktion der Hautläsionshäufigkeit.
Sehr ähnliche Ergebnisse wurden in der Gruppe beobachtet, die mit 5 ug rgD&sub2;t in einer 3D-MPL-O/W-Emulsion (Gruppe III) geimpft wurde. In den drei geimpften Gruppen konnte in den Scheidenabstrichen, die 5 Tage nach der Exposition gesammelt wurden, eine sehr geringe Virusreplikation nachgewiesen werden.

Wirkung der Impfung auf eine wiederauftretende HSV-Erkrankung

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen war die Häufigkeit der Hautläsionen und die Anzahl der Tage, an denen die Krankheit wiederauftrat, in den drei geimpften Gruppen signifikant (p > 0,05) verringert. Diese Gruppen wiesen auch weniger wiederauftretende Schübe als die Kontrollgruppen auf.

5. Zusammenfassung

Die in Meerschweinchen erhaltenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß die Impfung mit einer rgD&sub2;t-Formulierung, die 3D-MPL, verteilt in einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder kombiniert mit Aluminiumhydroxid, enthält, bei der Bereitstellung eines Schutzes gegen die primäre und wiederauftretende HSV-2-Erkrankung sehr wirksam ist, wenn sie den Meerschweinchen vor der HSV-2-Inoculation verabreicht wird. Solche rgD&sub2;t-3D-MPL-Formulierungen können die spezifischen, humoralen (neutralisierende Antikörper) und die durch Effektorzellen vermittelten (DTH) Immunantworten verstärken. Diese Ergebnisse wurden mit einer geringen rgD&sub2;t-Dosis (5 ug) erhalten.

6. Immunogenität von rgD&sub2;t-Formulierungen bei Primaten

6.1. Relative Immunogenität der rgD&sub2;t/Alaun- und rgD&sub2;t/Alaun-3D-MPL-Formulierungen

Die Immunogenität der rgD&sub2;t/Alaun- und rgD&sub2;t/Alaun-3D-MPL-Impfstoffe wurde in Cercopithecus aethiops (African Green Monkeys (AGM), afrikanische grüne Meerkatze) bestimmt. Drei Immunisierungen wurden nach den Monaten 0, 1 und 3 verabreicht. Die spezifischen, humoralen (ELISA-Titer und Neutralisierungstiter) und die durch Effektorzellen vermittelten (DTH) Immunantworten wurden gemessen.

6.1.1. Experimentelles Verfahren

Jede Formulierung enthielt 20 mg rgD&sub2;t und 0,5 mg Äquivalente Al³&spplus;/Dosis. Es wurde eine Dosis von 50 ug 3D-MPL verwendet. Gruppen von Cercopithecus aethiops (AGM) wurden dreimal an den Tagen 0, 28 und 84 immunisiert. Die Immunisierungen wurden in einer Dosis von 0,5 ml (20 ug rgD&sub2;t) intramuskulär verabreicht. Den Tieren wurden zur Antikörperbestimmung mit ELISA- oder Neutralisationstests alle ±2 Wochen Blut abgenommen. Die zwei Formulierungen wurden auch auf ihre Fähigkeit untersucht, eine T-Zellvermittelte Immunität zu induzieren, was durch die Induktion von Überempfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ (DTH) gemessen wurde. Dreizehn Tage nach der zweiten Immunisierung wurden den Affen unterschiedliche rgD&sub2;t-Dosen (20, 5 und 1 ug) in physiologischer Salzlösung intradermal in den Bauch verabreicht. Ihre Haut wurde auch mit physiologischer Salzlösung allein als Kontrolle getestet. Die Hautrötung und Verhärtung an der Stelle der intradermalen Injektion wurde 24 Stunden und 48 Stunden später überprüft.

6.1.2. Ergebnisse

a) Induktion der humoralen Immunität

Vor der Impfung zeigte kein Affenserum eine anti-HSV-2-Antikörperaktivität (Daten nicht aufgeführt). Wie in Tabelle 7 aufgeführt, induzieren beide Impfstoffe nach der zweiten Immunisierung gute ELISA-Titer und Neutralisierungstiter. Diese Antikörperantwort wurde bei den mit rgD&sub2;t/Alaun geimpften Affen nicht mit einer dritten Immunisierung verstärkt. Im Gegensatz dazu produzierten Affen, die eine dritte Immunisierung mit rgD&sub2;t/Alaun-3D-MPL erhalten hatten, höhere ELISA- und Neutralisierungs-Antikörperantworten (mittlerer ELISA-Titer: 10056; mittlerer Neutralisierungstiter: 950).

b) Induktion der Effektor-T-Zell-Antwort (DTH)

Die Hauttestergebnisse (Tabelle 8) zeigten, daß rgD&sub2;t kombiniert mit Alaun plus 3D-MPL im Gegensatz zur rgD&sub2;t-Alaun-Formulierung bei der Induktion einer in vivo-Effektor-T-Zell-Antwort sehr wirksam war. Eine starke DTH-Antwort wurde bei allen rgD&sub2;t- Alaun-3D-MPL-geimpften Tieren beobachtet, deren Haut mit 20 mg rgD&sub2;t getestet wurde. Bei der Mehrzahl der Affen (3/4 für die 5 ug-Dosis und 2/4 für die 1 ug-Dosis) wurden bei den geringen rgD&sub2;t-Konzentrationen (5 und 1 ug) ebenfalls spezifische DTH-Antworten gemessen. Diese rgD&sub2;t-Dosen induzierten schwächere Hauttestantworten als die rgD&sub2;t- Konzentration von 20 mg.

6.2. Immunogenität von rgD&sub2;t/Alaun-3D-MPL-Formulierungen in Rhesusaffen

Die Immunogenität von rgD&sub2;t/Alaun-3D-MPL-Impfstoffen, die unterschiedliche rgD&sub2;t-Dosen (100 ug, 10 ug oder 5 ug) enthielten, wurde in Rhesusaffen verglichen.

6.2.1. Experimentelles Verfahren

Jede Formulierung enthielt pro Dosis 0,5 ug Äquivalente Al³&spplus; und 50 ug 3D-MPL. Drei Gruppen von Rhesusaffen (4 Affen/Gruppe) wurden dreimal an den Tagen 0, 28 und 77 wie folgt immunisiert:
Gruppe 1: 100 ug rgD&sub2;t-Alaun plus 3D-MPL (50 ug);
Gruppe 2: 20 ug rgD&sub2;t-Alaun plus 3D-MPL (50 ug);
Gruppe 3: 5 ug rgD&sub2;t-Alaun plus 3D-MPL (50 ug).
Die Immunisierungen wurden intramuskulär in einer Dosis von 1 ml verabreicht. Den Tieren wurden zur Antikörperbestimmung mit ELISA- und Neutralisierungstests alle ± 2 Wochen Blut abgenommen.

6.2.2. Induktion der humoralen Immunität

Vor der Impfung zeigte kein Affenserum eine anti-HSV-2-Antikörperaktivität. In den drei geimpften Gruppen, die entweder 100, 20 oder 5 mg rgD&sub2;t in Alaun + 3D-MPL erhielten, wurden gute ELISA-Titer und Neutralisierungstiter beobachtet (Daten nicht aufgeführt).

6.3. Zusammenfassung

Die in Cercopithecus aethiops erhaltenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß ein rgD&sub2;t-Impfstoff, der eine Kombination von Alaun mit 3D-MPL enthält, die humoralen (neutralisierende Antikörper) und die durch Effektorzellen vermittelten (DTH), spezifischen Immunantworten erheblich verbessert. Im Vergleich zu diesem Impfstoff ist eine rgD&sub2;t- Alaun-Formulierung bei der Induktion von neutralisierenden Antikörpern weniger wirksam und kann keine in vivo-DTH-Antwort induzieren.
Die in Rhesusaffen erhaltenen Ergebnisse zeigen auch, daß eine rgD&sub2;t-Alaun + 3D-MPL-Formulierung bei der Induktion einer spezifischen humoralen Antwort, auch bei geringen Antigendosen (5 gg oder 20 gg rgD&sub2;t), sehr wirksam ist.

7. Allgemeine Zusammenfassung

Die in Meerschweinchen erhaltenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß Adjuvansformulierungen, die entweder 3D-MPL verteilt in einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder kombiniert mit Aluminiumhydroxid enthalten, bei der Induktion einer Immunschutzantwort mit einem rekombinanten HSV-Glykoprotein-Impfstoff im intravaginalen Meerschweinchen-Expositionstiermodell, auch bei sehr geringen Antigendosen (5 ug rgD&sub2;t), sehr wirksam sind. Die Schutzdaten zeigen auch, daß diese rgD&sub2;t-3D-MPL-Formulierungen bei der Bereitstellung eines Schutzes wirksamer sind. Solche 3D-MPL-Formulierungen können die spezifischen humoralen (neutralisierende Antikörper) und die durch Effektorzellen vermittelten (DTH) Immunantworten verbessern.
Ferner wurde gezeigt, daß die rgD&sub2;t-Alaun-3D-MPL-Formulierung auch die Immunogenität auf dem Antikörperniveau verbessert und eine Effektor-T-Zell-Antwort in Primaten induziert. Dies legt nahe, daß diese Adjuvanswirkung nicht auf kleine Tierarten beschränkt ist. Tabelle 1: Anti-HSV-Antikörperantwort in Seren von Meerschweinchen, die mit rgD&sub2;t-Formulierungen immunisiert wurden, vor und nach der Virusexposition.
(1) rgD&sub2;t-Dosis = 5 ug. Die Tiere wurden dreimal an den Tagen 0, 28 und 95 immunisiert. Sie wurden zwei Wochen später 10&sup5; PFU HSV-2 ausgesetzt.
(2) Die Seren wurden am Tag vor der Exposition gewonnen (= 14 Tage nach der dritten Immunisierung).
(3) Die Seren wurden 2 Wochen nach der Exposition gewonnen.
Die Werte sind als arithmetische mittlere Titer ± Standardabweichung (SD) angegeben. Tabelle 2: Hauttestergebnisse (DTH) in Meerschweinchen, die mit rgD&sub2;t-Formulierungen geimpft wurden.
Die Meerschweinchen wurden an den Tagen 0 und 21 mit 5 ug rgD&sub2;t-Formulierung immunisiert (intramuskulär verabreicht). Am Tag 29 wurden ihnen 5 ug rgD&sub2;t in physiologischer Kochsalzlösung intradermal verabreicht. Der Hauttest wurde nach 24 und 48 Stunden abgelesen.
E = Hautrötung an der Stelle der intradermalen Injektion in Millimeter.
I = Verhärtung an der Stelle der intradermalen Injektion in Millimeter.
N = Nekrose an der Hautteststelle.
Tabelle 3: Wirkung der Immunisierung mit rgD&sub2;t-Formulierungen auf den klinischen und virologischen Verlauf der HSV-2- Erstinfektion in Meerschweinchen.
(1) rgD&sub2;t-Dosis = 5 ug. Die Tiere wurden dreimal an den Tagen 0, 28 und 95 immunisiert. Sie wurden 2 Wochen später 10&sup5; PFU HSV-2 ausgesetzt.
(2) Anzahl der Tiere, die während des 12tägigen Beobachtungszeitraums eine Läsionsbeurteilung von ≥1 aufwiesen.
(3) Summe der Läsionsbeurteilungen (Tage 1-12), arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung.
(4) Maximaler HSV-Titer (PFU/ml) in Scheidenabstrichen, die 5 Tage nach der Exposition gewonnen wurden. Tabelle 4: Wirkung der Immunisierung mit rgD&sub2;t-Formulierungen auf die wiederauftretende genitale HSV-Erkrankung in Meerschweinchen.
(1) rgD&sub2;t-Dosis = 5 ug. Die Tiere wurden dreimal an den Tagen 0, 28 und 95 immunisiert. Sie wurden 2 Wochen später 10&sup5; PFU HSV-2-ausgesetz.
(2) Anzahl der Tiere, die während des Beobachtungszeitraums (Tage 13-60) eine Läsionsbeurteilung von ≥ 1 zeigten.
(3) Einem wiederauftretenden Schub geht voraus und folgt ein Tag ohne Läsion, und er ist dadurch gekennzeichnet, daß an mindestens zwei Tagen eine Hautrötung (Läsionsbeurteilung = 0,5) oder ein Tag mit einem oder mehr Bläschen (Läsionsbeurteilung ≥ 1) auftritt. Die Ergebnisse wurden als arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt (Beobachtungszeitraum: Tage 13-60).
(4) Gesamtzahl der Tage, an denen die Tiere einen wiederauftretenden Herpesschub erlitten, arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung (Beobachtungszeitraum: Tage 13-39). Tabelle 5: Vergleich der Wirkung von unterschiedlichen Adjuvansformulierungen auf die Immunogenität von rgD&sub2;t in Meerschweinchen.
(1) Die Tiere wurden dreimal an den Tagen 0, 28 und 84 immunisiert. Sie wurden 2 Wochen später 10&sup5; PFU HSV-2 ausgesetzt.
(2) Die Seren und Scheidenwaschlösungen wurden 14 Tage nach der zweiten Immunisierung gewonnen.
(3) Die Seren wurden am Tag vor der Exposition gewonnen (= 14 Tage nach der dritten Immunisierung).
(4) Die Werte sind als arithmetische mittlere Titer ± Standardabweichung angegeben.
(5) Entspricht der optischen Dichte (bei 492 nm) pro 0,5 ug/ml Gesamt-IgG, gemessen im Standard-anti-gD&sub2;t-ELISA-Test, arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung. Tabelle 6: Wirkung der Immunisierung mit rgD&sub2;t-Formulierungen auf den klinischen und virologischen Verlauf der HSV-2- Infektion in Meerschweinchen
Experimentelles Programm: 3 Immunisierungen an den Tagen 0, 28 und 84.
Exposition mit 10&sup5; PFU HSV-2 2 Wochen nach der letzten Immunisierung
HSV-2-Erstinfektion: (Beobachtungszeitraum Tage 4 bis 12 nach der Exposition)
Häufigkeit von Hautläsionen (%): Anzahl der Tiere mit einem oder mehreren Bläschen (Läsionsbeurteilung ≥ 1).
Schwere der Hautläsion: Summe der Läsionsbeurteilungen (für die Tage 4 bis 12), arithmetischer Mittelwert ± Standard
Scheidenvirustiter: Virustiter (PFU/ml) in Scheidenabstrichen, die 5 Tage nach der Exposition gesammelt wurden.
Wiederauftretende HSV-2-Infektion: (Beobachtungszeitraum Tage 13 bis 39 nach der Exposition)
Häufigkeit von Hautläsionen (%): Anzahl (%) der Tiere mit einem oder mehreren Bläschen (Läsionsbeurteilung ≥ 1).
Anzahl der Tage, an denen die Krankheit wiederauftritt: Gesamtzahl der Tage, an denen die Tiere eine wiederauftretende Herpeserkrankung erlitten, arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung. Die Tiere wurden positiv für eine wiederauftretende Erkrankung beurteilt, entweder wenn eine Läsionsbeurteilung von 0,5 (Hautrötung) für mindestens 2 aufeinanderfolgende Tage beobachtet wurde oder wenn eine Läsionsbeurteilung von ≥1 (ein oder mehren Bläschen) an einem beliebigen Tag beobachtet wurde.
Anzahl der wiederauftretenden Schübe: Arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung Tabelle 7: DTH-Ergebnisse in Afrikanischen Grünen Meerkatzen, die mit gD&sub2;t-Alaun oder gD&sub2;t-Alaun-3D-MPL geimpft wurden.
Die Affen wurden an den Tagen 0 und 28 mit 20 ug gD&sub2;t-Formulierung immunisiert (intramuskulär verabreicht). Ihnen wurden 13 Tage später gD&sub2;t-Dosen in physiologischer Kochsalzlösung intradermal in den Bauch verabreicht. Der Hauttest wurde nach 24 und 48 Stunden abgelesen.
E = Hautrötung an der Stelle der intradermalen Injektion.
I = Verhärtung an der Stelle der intradermalen Injektion.
ND = Nicht durchgeführt. Tabelle 8: Relative Immunogenität von gD&sub2;t-Alaun und gDZt-Alaun-3D-MPL in Afrikanischen Grünen Meerkatzen: Serologische Antworten.
*Jede Impfostoffdosis enthält 20 ug gD&sub2;t.
ELISA-Titer = Mittlerer Titer.
NEUT.-Titer = Reziproker Wert der höchsten Serumverdünnung, die einen 100%igen Schutz gegen die cytopathogene Wirkung bereitstellt.

Claims

1. Impfstoff-Formulierung, umfassend ein HSV-Glycoprotein D oder ein immunologisches Fragment davon in Verbindung mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryl- Lipid A und Alaun.

2. Impfstoff-Formulierung nach Anspruch 1, wobei das Glycoprotein D ein Glycoprotein D von HSV-2 oder ein immunologisches Fragment davon ist.

3. Impfstoff-Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Glycoprotein verkürzt ist.

4. Impfstoff-Formulierung nach Anspruch 3, wobei das verkürzte Protein HSVgD&sub2; ist und der C-terminale Ankerbereich fehlt.

5. Impfstoff-Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Glycoprotein D oder ein immunologisches Fragment davon an einen aus Teilchen bestehenden Träger konjugiert ist.

6. Impfstoff-Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das 3-des-O- acylierte Monophosphoryl-Lipid A im Bereich von 10 ug bis 100 ug pro Dosis vorhanden ist.

7. Impfstoff-Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Medikament.

8. Verwendung von HSV-Glycoprotein D oder einem immunologischen Fragment davon in Verbindung mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryl-Lipid A und Alaun für die Herstellung eines Medikaments für die Vorbeugung gegen oder die Behandlung von HSV-Infektionen.

9. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren das Mischen von HSV-Glycoprotein D oder einem immunologischen Fragment davon mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryl-Lipid A und Alaun umfaßt.