DE69132369T2

DE69132369T2 - Inhibitoren und substrate für thrombin

Info

Publication number: DE69132369T2
Application number: DE69132369T
Authority: DE
Inventors: Leifeng Cheng; Naoyashi Chino; Goran Karl Claeson; John Joseph Deadman; Said Mohamed Anwar Elgendy; Vijay Vir Kakkar; Michael Finbarr Scully
Original assignee: Trigen Ltd
Current assignee: Trigen Ltd
Priority date: 1990-11-06
Filing date: 1991-11-06
Publication date: 2001-02-22
Anticipated expiration: 2011-11-07
Also published as: DK0509080T3; NZ264128A; GB9024129D0; WO1992007869A1; JP3173786B2; EP0509080A1; ZA918805B; JP3453357B2; EP0955309A1; IE913871A1; ES2149158T3; DE69132369D1; JP2001226397A; IE20000539A1; EP0509080B1; NZ240477A; GR3034839T3; JPH05504775A; AU8900791A; DE69132369T4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Thrombin-Inhibitoren und -Substrate.
Thrombin, das letzte Enzym im Koagulationssystem, spaltet lösliches Fibrinogen in Fibrin, welches daraufhin vernetzt wird und ein unlösliches Gel ausbildet, das die Matrix für einen Thrombus bildet. Wenn ein Gefäß beschädigt wird, ist dieser Prozess notwendig, um die Blutung zu stoppen. Unter normalen Umständen ist in Plasma keine messbare Menge an Thrombin vorhanden. Ein Anstieg der Thrombin-Konzentration kann zur Bildung von Gerinnseln führen, was eine Thromboembolie auslösen kann, eines der häufigsten ernsten medizinischen Probleme unserer Zeit.
Thrombin trägt mittels einiger biologischer Reaktionen zur hämostatischen Steuerung bei. Zusätzlich zu seiner primären Funktion, der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin, aktiviert Thrombin den Faktor XIII, der verantwortlich für die Vernetzung von Fibrin ist. Thrombin wirkt auch mittels eines positiven Rückkopplungsmechanismus, der die Aktivierung der Faktoren V und VIII beinhaltet, welche beide notwendig für die Bildung von Prothrombin sind. Thrombin hat eine weitere wichtige Funktion: seine Bindung an Blutplättchen initiiert die Freisetzung und Aggregation von Blutplättchen, welche für primäre Hämostase verantwortlich ist.
Fibrinolyse ist der Prozess, der eine enzymatische Auflösung von Fibrinogen und Fibringerinnseln bewirkt. Plasma enthält ein Protein, Plasminogen, welches unter dem Einfluss verschiedener Aktivatoren in Plasmin umgewandet wird, einem proteolytischen Enzym, dessen Aktivität der von Fibrin gleicht. Plasmin baut Fibrin in Fibrin-Abbauprodukte ab.
Unter normalen Bedingungen ist das Fibrinolysesystem im Gleichgewicht mit dem Koagulationssystem. Kleine Thrombi, die sich im Blutkreislauf gebildet haben, können enzymatisch aufgelöst werden und die Blutzirkulation durch die Gefäße kann durch das fibrinolytische System im Körper wieder hergestellt werden. Wenn die fibrinolytische Aktivität zu hoch ist, kann dies Blutungen bewirken oder verlängern, und wenn sie, verglichen mit der Aktivität des Koagulationssystems zu niedrig ist, besteht ein Thromboserisiko.
Die Reaktionen von Thrombin werden weiter durch natürliche Inhibitoren im Plasma gesteuert. Die wichtigsten dieser Inhibitoren sind Antithrombin III und Heparin. Diese Verbindungen wurden isoliert und werden therapeutisch und prophylaktisch bei Zuständen verwendet, wo ein Ungleichgewicht im hämostatischen Mechanismus mit einem Risiko der Prothrombinaktivierung vorliegt.
Zur Prävention von Thrombose werden hauptsächlich zwei Arten von therapeutischen Mitteln eingesetzt. Die Heparine wirken durch eine Beschleunigung der Thrombinhemmung durch Antithrombin III. Cumarin-Derivate, die oralen Antikoagulanzien, z. B. Warfarin, beugen der Bildung von Thrombin vor, dadurch, dass sie die post-translationale, Vitamin K-abhängige γ-Carboxylierung in der Synthese von Prothrombin blockieren. Weder Heparin noch Warfarin ist ideal geeignet. Heparin muss parenteral verabreicht werden, da es als ein Co- Faktor für Antithrombin III wirkt. Ohne diesen Inhibitor zeigt es keine Wirkung. Die Wirkung von Warfarin entwickelt sich sehr langsam und durch häufige Tests müssen individuelle Dosierungen angepasst werden. Keines dieser Antikoagulanzien ist Thrombin-spezifisch: sie hemmen auch andere Serin-Proteasen und beide können Blutungen verursachen, wenn die Dosierungen nicht korrekt eingestellt sind.
Daher wären direkt wirkende, spezifische Thrombin-Inhibitoren mit oraler Aktivität nützliche Alternativen zu den vorstehend genannten Antikoagulanzien. Intensive Forschung in diesem Bereich resultierte in der Synthese von unterschiedlichen Arten von Thrombin-Inhibitoren.
Durch die Imitation von Aminosäuresequenzen von Fibrinogen, dem wichtigen natürlichen Substrat von Thrombin, wurden einige gut geeignete kurze Peptidsubstrate für Thrombin synthetisiert. Die erste entwickelte Sequenz mit einer Affinität für das aktive Zentrum von Thrombin war Phe-Val-Arg [1], die die der Bindungsspaltung durch Thrombin vorausgehende Fibrinogensequenz nachahmt. Diese Sequenz wurde später verbessert und lautet D- Phe-Pro-Arg und D-Phe-Pip-Arg, welche in chromogenen Substraten, z. B. D-Phe-Pro-Arg- pNA und D-Phe-Pip-Arg-pNA [1] und in Thrombin-Inhibitoren, z. B. dem Peptidaldehyd D- Phe-Pro-Arg-H [2], dem irreversiblen Inhibitor D-Phe-Pro-Arg-CH&sub2;Cl [3], Inhibitoren mit einer Ketomethylenbindung, z. B. D-Phe-Pro-Arg-k-Gly-Piperidid [4] und in den kürzlich synthetisierten Peptid-Boronsäure-Inhibitoren, z. B. Z-D-Phe-Pro-boroArg [5] und dem Nitril Boc-D- Phe-Pro-ArgCN [6] verwendet wurden.
Daher wurde etwa 15 Jahre lang die Sequenz D-Phe-Pro-Arg als die beste Sequenz angesehen, und sie zeigte eine sehr gute Affinität für das aktive Zentrum von Thrombin, in Substraten (Km etwa 10&supmin;&sup6;M) sowie in Inhibitoren (Ki 10&supmin;&sup7;M bis 10&supmin;&sup9;M).
Eine Erniedrigung des Blutdrucks ist eine Nebenwirkung, die bei vielen bekannten Thrombin- Inhibitoren mit Arg oder Arg-Analoga wie Gpa und Apa [7] beobachtet wurde. Es wird angenommen, dass diese Nebenwirkung, die bei einigen Verbindungen sehr stark störend ist, von den positiv geladenen Guanidino- oder Amidinogruppen der Seitenkette von Arg oder seiner Analoga abhängt.
Wir haben überraschenderweise gefunden, dass durch eine Veränderung der Seitenkette in eine nicht-basische Alkyl oder Alkylarylgruppe einer bestimmten Größe die Affinität für Thrombin immer noch sehr gut ist, während die Affinität für andere Serin-Proteasen stark reduziert ist, d. h., diese Inhibitoren/Substrate sind spezifischer für Thrombin als entsprechende Verbindungen mit Arg. Mit dieser nicht-basischen Seitenkette wird die blutdrucksenkende Nebenwirkung stark vermindert.
Die vorliegende Erfindung stellt Thrombin-Inhibitoren und -Substrate bereit, die von D-Phe- Pro-Arg oder seinen Analoga, bei denen Arg ersetzt ist, abgeleitet sind.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Thrombose oder Thrombose-inhibierenden Peptiden der Formel
bereit, in der der Rest X ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine N-Schutzgruppe, der Rest Y ein Alkylrest mit 3 bis 9 Kohlenstoffatomen oder ein Alkylrest mit 3 bis 9 Kohlenstoffatomen, substituiert durch einen Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
der Rest Z die Gruppe
ist, in der die Reste R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen eine Diolgruppe darstellen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Peptide der allgemeinen Formel
bereit, in der die Reste X, Y und Z wie vorstehend definiert sind, jedoch der Rest Y nicht die Gruppe -CH(CH&sub3;)&sub2; ist.
Vorzugsweise stellen die Reste R&sub2; und R&sub3; zusammengenommen eine Pinacol- oder Pinandiolgruppe dar.
In bevorzugten Peptiden ist der Rest Y ein Methoxypropylrest.
Eine bevorzugte Klasse von Peptiden besteht aus Verbindungen, bei denen der Rest X gleich Benzyloxycarbonyl ist.
Ebenfalls sind solche erfindungsgemäßen Peptide bevorzugt, die der Formel
Z-D-Phe-Pro-Boro-methoxypropylglycin-pinandiol
entsprechen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Thrombin-inhibierende erfindungsgemäße Peptide zur Verwendung als Arzneimittel bereit, gegebenenfalls zur Verwendung als Arzneimittel zur oralen Verabreichung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Inhibierung von Thrombin in einem Säuger bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes Thrombin-inhibierendes Peptid und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung vorgesehen.
In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäß zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Thrombose verwendeten Peptids bereit, um die Koagulation von Blut in Blutsammel- oder -verteilungsbehältern zu verhindern.
In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des hier in Schema 2 oder 3 skizzierten Syntheseverfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids bereit.
Wie vorstehend beschrieben, haben die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen anti- thrombogene Eigenschaften und können für Indikationen verwendet werden, wenn ein anti- thrombogenes Mittel angezeigt ist. Im allgemeinen können diese Verbindungen oral oder parenteral einem Wirt verabreicht werden, um eine anti-thrombogene Wirkung zu erhalten. Im Falle größerer Säugetiere wie z. B. Menschen können die Verbindungen alleine oder in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel in einer Dosis von 0,02 bis 15 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise von 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden, um die anti-thrombogene Wirkung zu erhalten, und sie können als Einzeldosis oder in aufgeteilten Dosen oder als Formulierung mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden. Wenn bei einem Patienten eine Blutschleife außerhalb des Körpers durchgeführt werden soll, können 0,1 bis 1 mg/kg intravenös verabreicht werden. Zur Verwendung mit Vollblut können 1 bis 10 mg/l zur Verhinderung von Koagulation bereitgestellt werden. Pharmazeutische Verdünnungsmittel sind bekannt und schließen Zucker, Stärken und Wasser ein, die verwendet werden können, um Tabletten, Kapseln, injizierbare Lösungen und ähnliches herzustellen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dem Blut zugesetzt werden, um eine Koagulation des Bluts in Blutsammel- oder -verteilungsbehältern, einem Schlauch oder einer implantierbaren Vorrichtung, die mit Blut in Kontakt kommen, zu verhindern.
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Verbindungen schließen eine orale Aktivität, ein rasches Einsetzen der Aktivität und eine geringe Toxizität ein. Zusätzlich können diese Verbindungen eine spezielle Verwendung bei der Behandlung von Individuen, die auf Verbindungen wie z. B. Heparin allergisch reagieren, haben.
In den nachstehenden Beispielen haben die Abkürzungen die folgenden Bedeutungen:
Aa = Aminosäure
Ac = Acetyl
Boc = t-Butyloxycarbonyl
Bu = Butyl
Bzl = Benzyl
Mpg = Methoxypropylglycyl
Oct = Octylglycyl
EtOAc = Ethylacetat
EtOH = Ethylalkohol
HOSu = N-Hydroxysuccinimid
MeOH = Methylalkohol
NMR = kernmagnetische Resonanz
PinOH = Pinandiol
pip = Piperidid
TLC = Dünnschichtchromatographie
THF = Tetrahydrofuran
Z = Cbz = Benzyloxycarbonyl
Apa = Amidinophenylalanin
Dpa = 3,3-Diphenylalanin
Gpa = Guanidinophenylalanin
Irg = Isothioharnstoff-Analogon von Arg
Mbg = 2-(2-Methylbutyl)-glycin
Pgl = Pentylglycin
boroAa = Boronsäure-Analogon von Aa
Die nachstehenden Beispiele 1 bis 5 zeigen unter Verweis auf die Schemata 1 bis 3 geeignete Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Beispiele 3, 6 und 7 veranschaulichen erfindungsgemäße Verbindungen, während die inhibierenden Eigenschaften einiger erfindungsgemäßer Verbindungen in den Tabellen 1, 2 und 3 aufgezeigt sind.

HPLC

Die nachstehenden Bedingungen wurden für die Analyse der meisten der synthetischen Verbindungen mittels Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) übernommen: Säule: SuperPac Pep-S (4 · 250 mm); Elutionsmittel: A = Wasser mit 0,1% TFA, B = Acetonitril mit 0,1% TFA; Gradient: 50% bis 90% B in A während 25 Minuten; Flussrate: 1,0 ml/min; Detektion: UV- Absorption bei 210 nm.

TLC

Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde unter Verwendung von vorbeschichteten Silica- Platten (Merck, F254) in den nachstehenden Systemen mit den nachstehenden Verbindungen durchgeführt: A: Chloroform-Ethylacetat (2 : 1); B: Chloroform-Methanol-Essigsäure (20 : 4 : 1); C: n-Butanol-Essigsäure-Ethylacetat-Wasser (1 : 1 : 1 : 1); D: Chloroform-Methanol (9 : 1); E: Pyridin-Ethylacetat-Essigsäure-Wasser (5 : 5 : 1 : 3); F: Chloroform-Methanol-Ammoniak (1 M) (60 : 35 : 5). Die Substanzflecke wurden durch Ninhydrin und Chlor-Dicarboxidin- Reagenzien zum Aufsprühen (cm Swahn und J Gyllander, J. Chromatogr. (1979) 170, 292) sichtbar gemacht.

NMR-Spektren

Kernmagnetische Resonanzspektren wurden bei 250 MHz unter Verwendung eines Bruker- Geräts aufgenommen.

BEISPIELE

1. Synthese von Dpa und Z-Dpa-Pro < vgl. Schema 1)

(a) DL-Dpa·HCl

Ethylacetamidocyanoacetat (10 g, 0,059 mol) wurde bei Raumtemperatur und unter Argon einer Lösung aus Kalium-t-butoxid (6,75 g, 0,06 mol) in t-Butanol (350 ml) zugesetzt. Sobald die Lösung klar geworden war, wurde Bromdiphenylmethan (14,55 g, 0,059 mol) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 20ºC 24 Stunden lang gerührt und anschließend unter vermindertem Druck eingeengt. Der feste Rückstand wurde mit Ethylacetat (500 ml) und Wasser (175 ml) behandelt. Die organische Phase wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und konzentriert, wobei sich gelbe Kristalle bildeten. Die Kristalle wurden wiederholt mit Ether gewaschen und getrocknet, wobei Ethyl-2-diphenylmethylacetamidocyanoacetat erhalten wurde (11,61 g, 58%, F. p. 181-185ºC). Der Ester (11,61 g, 34,4 mol) wurde mit Salzsäure (20%) gemischt und 30 Stunden lang refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde abkühlen gelassen und die Kristalle wurden isoliert, gewaschen (Ether) und getrocknet, wobei HCl·D,L-Dpa (7,82 g, 81,8%) erhalten wurde.

(b) Z-DL-Dpa

Einer auf 0ºC abgekühlten und stark gerührten Lösung aus D,L-Dpa·HCl (0,56 g, 0,0021 mol) in NaOH (2 N, 5 ml) wurde tropfenweise Benzylchlorformiat (0,39 g, 0,33 ml, 0,0023 mol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei pH 10 und 5 bis 10ºC gehalten. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 1 Stunde lang stark gerührt. Die Lösung wurde mit Ether (4x) gewaschen und mit HCl (5 N) auf pH 3 angesäuert. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan extrahiert und die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt, wobei Z-DL-Dpa (0,73 g, 97%, F. p. 214-217ºC) erhalten wurde.

(c) Z-D,L-Dpa-ONSu

Einer gerührten Lösung von Z-D,L-Dpa (1,88 g, 0,005 mol) und N-Hydroxysuccinimid (0,575 g, 0,005 mol) in trockenem 1,2-Dimethoxyethan (30 ml) wurde bei 0ºC Dicyclohexylcarbodiimid (1,03 g, 0,005 mol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei 0ºC gehalten. Die Suspension wurde filtriert und das Filtrat wurde bis zur Trockne eingeengt, wobei ein Öl erhalten wurde, welches mit Ether verrieben und filtriert wurde, wobei Z-D,L-Dpa-ONSu (2,15 g, 91%, F. p. 139-142ºC) erhalten wurde.

(d) Z-D-Dpa-Pro und Z-L-Dpa-Pro

Einer Lösung von Prolin (0,78 g, 0,0068 mol) und NaHCO&sub3; (0,57 g, 0,0068 mol) in Wasser (8 ml) wurde eine Lösung von Z-D,L-Dpa-ONSu (2,15 g, 0,0045 mol) in 1,2-Dimethoxyethan (15 ml) zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und Wasser (5 ml) wurde zugesetzt. Die Lösung wurde auf pH 2 angesäuert (konzentrierte HCl), wobei sich weiße Kristalle bildeten (1,98 g, F. p. 113-117ºC). Fraktionierende Umkristallisierung aus EtOAc ergab als erste Charge ein Diastereomeres als ein Feststoff (0,7 g, F. p. 180-183ºC, FAB MS : M&spplus;473; ¹H NMR: 7,26 (15H, m, 3xPh), 5,66 (1H, d, CH), 5,23 (1H, m, CH), 4,40 (1H, d, CH), 2,03 (2H, s, CH&sub2;), 2,20 (4H, m, 2xCH&sub2;); ¹³C NMR: 172,19 (CO), 156,1 (CO), 139,17 (CO), 127-128 (Ph), 66,88 (CH&sub2;), 59,48 (CH), 55,58 (CH), 24,15 (CH&sub2;). Weitere Kristallisation aus der Mutterlösung ergab als zweite Charge ein Gemisch der Diastereomere (0,43 g, F. p. 126-130ºC). Der Zusatz von Petrolether (K. p. 60- 80ºC) ergab das andere Isomer (0,54 g, F. p. 128-131ºC), FAB MS : M&spplus;473; ¹H NMR: 7,29 (15H, m, 3xph), 5,55 (1H, d, CH), 5,23 (1H, m, CH), 4,47 (1H, d, CH), 2,04 (2H, s, CH&sub2;), 1,20-2,20 (4H, m, 2 CH&sub2;); ¹³C NMR: 172,77 (CO), 156,13 (CO), 139,48 (CO), 126,99-128,72 (Ph), 66,90 (CH&sub2;), 59,62 (CH), 55,48 (CH), 53,54 (CH), 47,44 (CH&sub2;), 27,94 (CH&sub2;), 24,58 (CH&sub2;).

2. Synthese von Peptid-Aminoboronsäure-Inhibitoren

(a) (+)-Pinandiol-4-brom-R-1-aminobutanboronat-hydrochlorid

Die Titelverbindung wurde gemäß D. S. Matteson et al. (1984), Organometallics 3, 1284- 1288 und EP-A-293881 hergestellt.

(b) Z-D-Dpa-Pro-Irg-OPin·HCl

Einer Lösung von Z-D-Dpa-Pro-OH (236 mg, 0,5 mmol) in THF (5 ml) in Gegenwart von Triethylamin (70 ul, 0,5 mmol) wurde bei -15ºC Isobutylchlorformiat (65 ul, 0,5 mmol) zugesetzt, und die Lösung wurde 13 Minuten lang bei -13ºC gerührt. Nach dem Zusatz von (+)- Pinandiol-4-brom-R-1-aminobutanboronat-hydrochlorid (183 mg, 0,5 mmol) in CHCl&sub3; (3 ml) und anschließendem Zusatz von Triethylamin (70 ul, 0,5 mmol) wurde das Reaktionsgemisch bei derselben Temperatur 2 Stunden lang gerührt und dann 2 Stunden lang bei unter 10ºC. THF wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ethylacetat (50 ml) gelöst, mit 1%iger NaHCO&sub3;, Wasser, 0,2 N HCl und Wasser gewaschen und anschließend über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde quantitativ ein öliges Produkt erhalten. Eine HPLC-Analyse zeigte einen Hauptpeak bei einer Retentionszeit von 22,8 Minuten neben einigen Komponenten in geringerer Menge.
Zu einer Lösung der vorstehenden Verbindung (2/5 der gesamten hergestellten Menge, 0,2 mmol) in Ethanol (1 ml) wurde unter einer Argonatmosphäre bei Raumtemperatur Thioharnstoff (61 mg, 0,8 mmol) zugesetzt. Nach 4-tägigem Rühren wurde Ethylacetat (70 ml) zum Reaktionsgemisch zugesetzt, dieses wurde mit 1% NaHCO&sub3;, Wasser, 0,2 N HCl und anschließend Wasser gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Der nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde mit n-Hexan behandelt, um das Produkt als Pulver zu erhalten. Umkristallisation aus Ethylacetat mit einem 2 : 1-Gemisch aus Ethylether und n-Hexan ergab ein Produkt (98,9 mg, 60,6%, zwei Stufen insgesamt). Die Retentionszeit bei der RP-HPLC-Analyse betrug unter den zum allgemeinen Verfahren beschriebenen Bedingungen 13,5 Minuten. Eine ¹H NMR-Analyse in deuteriertem Chloroform ergab auf grund des Vorhandenseins des Prolinrests im Molekül ein komplexes Peak-Muster. Allerdings konnten die typischen Signale des Pinandiols im richtigen Verhältnis beobachtet werden.

3. Z-D-Phe-Pro-boroMbg-OPin (vgl. Schema 2)

Ein mit einem Septum ausgestatter 100 ml-Kolben wurde mit einer Lösung von Pinandiol- (dichlormethyl)-boronat (1 ml, 1,2 g, 4,6 mmol) in THF (7 ml) beschickt und 1,1-Dimethylpropanmagnesiumchlorid (4,6 ml, 4,6 mmol) wurde tropfenweise aus einer trockenen Spritze bei 0ºC zugesetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur rühren gelassen. Nach 7 Stunden zeigte ein Dünnschicht-Chromatogramm hauptsächlich einen Substanzfleck [Rf = 0,82, Chloroform : Petrolether (1 : 1)]. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand in Ether (50 ml) gelöst, mit Wasser (2 · 10 ml) gewaschen, getrocknet (Magnesiumsulfat) und filtriert.
Der Ether wurde entfernt und das Rohprodukt wurde auf einer Silicagelsäule gereinigt, mit Hexan und 10% Chloroform eluiert, wobei der α-Chlorboronsäureester als blassgelbes Öl erhalten wurde (0,55 g, 40% Ausbeute).
Die vorstehende Verbindung (0,55 g, 1,8 mmol) in THF (5 ml) wurde über eine Kanüle bei -78ºC einer Lösung von Lithiumbis-(trimethylsilyl)-amid (1,8 ml, 1,8 mmol) in THF (5 ml) unter Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 20ºC gehalten und anschließend wurde das Lösungsmittel entfernt. Das Rohprodukt wurde in Petrolether (40-60ºC, 25 ml) gelöst, wobei das anorganische Salz (LiCI) ausfiel. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, auf -78ºC abgekühlt und trockene ätherische HCl, 1 M (3 Äquivalente, 5,4 ml, 5,4 mmol) wurde zugesetzt. Der Kolben wurde über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt. Am nächsten Morgen wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Hydrochlorid (0,41 g, 1,29 mmol, 72% Ausbeute) wurde als weißer Feststoff isoliert.
Z-D-Phe-Pro-OH (0,45 g, 1,1 mmol) wurde in THF (7 ml) gelöst und 1 Äquivalent N-Methylmorpholin (0,11 g, 1,1 mmol) wurde zugesetzt. Die Lösung wurde auf -20ºC abgekühlt und 1 Äquivalent Isobutylchlorformiat (0,149 g, 1,1 mmol) wurde tropfenweise zugesetzt. Nach 10 Minuten wurde eine Lösung des vorstehenden Aminohydrochlorids (0,348 g, 1,1 mmol) in THF (7 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre in das Reaktionsgemisch übertragen und Triethylamin (0,11 g, 1,1 mmol) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei -20ºC 1 Stunde lang gerührt und anschließend 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. Unlösliches Material wurde durch Filtration entfernt, anschließend wurde das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt und der Rückstand in Ethylacetat (30 ml) gelöst. Die organische Phase wurde mit 0,2 N HCl (10 ml), 5% wässrigem Natriumhydrogencarbonat, einer gesättigten Lösung von Natriumchlorid und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde dann über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde entfernt, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde, der auf einer Silicagelsäule gereinigt und mit Petrolether eluiert wurde, wobei das gewünschte Produkt (0,59 g, 81%) erhalten wurde. Die Struktur wurde durch ¹H NMR und MS bestätigt.

4. Herstellung der α-Bromboronsäureester (vgl. Schema 3)

Bei allen Reaktionen mit Borverbindungen wurden gereinigte wasserfreie Reagenzien verwendet.
Die Reaktionen wurden unter Argon oder Stickstoffatmosphäre durchgeführt, wobei das Argon oder der Stickstoff direkt aus der Gasflasche durch eine Glasleitung bereitgestellt wurde. Ein 250 ml-Kolben, der mit einem Rückflusskühler ausgestattet war, wurde mit 1- Brom-1-propen (3,63 g, 30 mmol) beschickt. Dem Kolben wurde anschließend ein Dibromboran-Methylsulfid-Komplex in Dichlormethan (60 ml, 60 mmol) tropfenweise zugesetzt und das Gemisch wurde unter Stickstoffatmosphäre 5 Stunden lang unter Rückfluss gehalten. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;).
Ein trockener Rundkolben (100 ml) wurde mit der Bromboronsäure (0,5 g, 3 mmol) und Pinandiol (0,52 g, 3 mmol), einem Magnetrührstäbchen und trockenem Ether (20 ml) beschickt, mit einem Septum verschlossen und mit Stickstoff gespült. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang gerührt, bis sich der Feststoff aufgelöst hatte, dann wurde die organische Phase mit Wasser (10 ml) gewaschen, abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert. Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagel (ca. 37-70 um (230-400 mesh))-Säule gereinigt und mit Chloroform eluiert (das Produkt wurde vor dem blassroten Ring eluiert). Die erste Fraktion (100 ml) wurde aufgefangen und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei α- Bromboronsäureester (0,8 g, 88,6%) als farblose Flüssigkeit erhalten wurde.

5. Synthese von Z-Pgl-H

(a) Pgl

Pentylglycin wurde gemäß der Strecker*-Synthese unter Verwendung von Hexanal in einer Ausbeute von 31,6% erhalten (*Vogel, Textbook of Practical Organic Chemistry).

(b) Z-Pgl

Einer Lösung von Pentylglycin (0,5 g, 3,5 mmol) in einem Gemisch aus Wasser (4 ml) und THF (4 ml) (0,5 M Lösung) in Gegenwart von Triethylamin (0,64 ml, 1,22 Äquivalente) wurde bei Raumtemperatur Z-OSu (0,963 g, 3,86 mmol) zugesetzt, wobei die Lösung nach 15 Minuten klar wurde. Ein Dünnschichtchromatogramm nach 2 Stunden zeigte noch Ausgangsmaterial an und daher wurde eine weitere Menge Triethylamin (0,2 ml) und Z-OSu (200 mg) zugesetzt. Nach weiteren 2 Stunden zeigte das Dünnschichtchromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr an und daher wurde die Lösung auf Wasser (50 ml) gegossen und mit Chloroform (50 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit HCl (1 M, 20 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO&sub4;) und eingeengt, wobei Z-Pgl (1,18 g) als gummiartiger Feststoff erhalten wurde, der zu einem weißen kristallinen Feststoff (0,8 g) umkristallisiert wurde (DCM/Petrolether K. p. 60-80ºC). Die Struktur wurde durch ¹H NMR bestätigt.

Beispiel 6

Die nachstehende Verbindung wurde im wesentlichen gemäß Beispiel 3 hergestellt:
22 Z-D-Phe-Pro-BoroMbg-OPin 89% NMR

Beispiel 7

Die nachstehenden Verbindungen wurden im wesentlichen gemäß Beispiel 2a hergestellt:
11 Z-D-Phe-Pro-BoroPgl-OPinac 41,5% NMR
43 Z-D-Phe-Pro-BoroOct-OPinac 77% NMR Schema 1 Synthese der Aminosäure Dpa und ihrer Di- und Tripeptide mit Pro und Pro-Arg Schema 2 Schema 3

Plasmathrombinzeit (TT)

150 ul zitronensaures gewöhnliches menschliches Plasma und 20 ul Puffer oder Probe wurden 1 Minute lang bei 37ºC erwärmt. Die Koagulation wurde durch den Zusatz von 150 ul frisch zubereitetem Rinderthrombin (5 NIH-Einheiten/ml physiologische Kochsalzlösung) gestartet und die Koagulationszeit wurde mit einem Koagulometer aufgezeichnet.
Ein Phosphatpuffer, pH 7,8, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin und 0,02% Natriumazid wurde verwendet. Die Proben wurden in DMSO gelöst und mit dem Puffer verdünnt. Wenn kein Inhibitor verwendet wurde, wurde DMSO dem Puffer in derselben Konzentration zugesetzt wie in den Proben. Die Inhibitorkonzentrationen wurden gegen die Thrombinzeiten in einem halblogarithmischen Graphen aufgetragen, aus dem die Inhibitorkonzentration, die eine Verdopplung (40 Sekunden) der Thrombinzeit bewirkte, bestimmt wurde.

Bestimmung von Ki

Die Inhibierung von menschlichem α-Thrombin wurde durch die Inhibierung der Enzym- katalysierten Hydrolyse dreier verschiedener Konzentrationen des chromogenen Substrats S-2238 bestimmt.
200 ul der Probe oder des Puffers und 50 ul von S-2238 wurden 1 Minute lang bei 37ºC inkubiert und 50 ul von menschlichem α-Thrombin (0,25 NIH-Einheiten/ml) wurden zugesetzt. Die anfängliche Rate der inhibierten und nicht-inhibierten Reaktionen wurde bei 405 nm aufgezeichnet. Der Anstieg der optischen Dichte wurde gemäß dem Verfahren von Lineweaver und Burke aufgetragen. Km und scheinbares Km (Km app) wurden bestimmt und Ki wurde unter Verwendung der Gleichung
bestimmt.

Wirkungen auf Herz-Kreislauf

2-3 kg schwere Katzen wurden mit Mebumal betäubt, das als intraperitoneale Injektion verabreicht wurde. Der zentrale Blutdruck und die Herzfrequenz wurden auf einem Grass-Polygraphen mittels eines in die femurale Arterie eingesetzten Katheders aufgezeichnet.

Bestimmung von km

Die km-Werte der Substrate mit menschlichem α-Thrombin wurden durch Messung der Absorption bei einer Substrat-Verdünnungsreihe bestimmt (Seite 753, Longman Scientific & Technical, 5. Auflage, 1989).

Bestimmung der aktivierten artiellen Thromboplastinzeit (APTT) für In vitro-Proben

150 ul zitronensaures (3,2%) gewöhnliches menschliches Plasma wurde 1 Minute lang bei 37ºC mit der Probe (20 ul) oder dem Puffer (20 ul, Kontrolle) inkubiert. Zur Lösung wurde wiederhergestelltes "Automatisiertes APTT" (erhältlich von Organon Teknika, 0,1 ml) zugesetzt. Jede Lösung wurde 5 Minuten lang bei 37ºC aktiviert.
Nach der Aktivierung wurde Calciumchlorid (0,1 ml, 0,025 M, vorgewärmt bei 37ºC) zugesetzt und der Blutgerinnselnachweis wurde unter Verwendung eines "halbautomatisierten Koagulometers" (Nach, Schnicter und Gross) gemessen.

In vivo-Toxizitätsdaten

Die Ablagerung von ¹¹¹Indium-markierten Blutplättchen wurde nach intravenösen Dosen von 1 mg/kg über eine Kanüle in die marginale Ohrenvene von weißen Neuseeland-Kaninchen beobachtet, wie es in G. R. May, C. M. Hero, K. D. Butler, C. P. Page, Journal of Pharmacological Methods 24, Seiten 1-35, 1990, beschrieben ist. Der periphere Blutdruck wurde mittels eines Drucksensors in der Halsschlagader beobachtet.

Ex vivo-APTT, TT

Die Daten wurden wie in den In vitro-Tests erhalten, jedoch wurden Plasmaproben verwendet, die bei 0, 1, 10, 30 und 60 Minuten nach der Dosierung von 1 mg/kg i.v. als Bolusinjek tion in eine marginale Ohrenvene in weißen Neuseeland-Kaninchen erhalten wurden, welche durch eine Kanüle in der Halsschlagader betäubt worden waren. TABELLE 1 BLUTPLÄTTCHENAKKUMULATION EX VIVO-DATEN
Inhibierungsdaten für einige der neuen Verbindungen sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 - In vitro-Test TABELLE 3

Literaturverzeichnis

1. Claeson, G. und Aurell, L., Annals of New York Academy of Sciences 370, 79-811 (1981).
2. Bajusz, S., Barabas, E., Tolnay, P., et al., Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217-221 (1978).
3. Kettner, C. und Shaw, E., Thrombosis Research 14, 969-973 (1979).
4. Szelke, M. und Jones, D. M., US-PS 4,638,047-A.
5. Kettner, C. und Shenvi, A. B., EP-A-293881 (1988).
6. Stüber, W., Kosina, H. und Heimburger, N., Int. J. Peptide Protein Res. 31, 63-70 (1988).
7. Kaiser, B., Hauptmann, J. und Markwardt, F., Die Pharmacie 42, 119-121 (1987).

Claims

für die Vertragsstaaten ES, GR

1. Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel

in der

der Rest X ein Wasserstoffatom, die Gruppe CH&sub3; oder eine N-Schutzgruppe ist,

der Rest Y eine C&sub3;-C&sub9;-Alkylgruppe oder eine C&sub3;-C&sub9;-Alkylgruppe, substituiert durch eine C&sub1;- C&sub4;-Alkoxygruppe ist,

der Rest Z die Gruppe

ist, in der

die Reste R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen eine Diolgruppe darstellen, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von Thrombose.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Reste R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen die Pinakol- oder Pinandiolgruppe darstellen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Rest Y die Methoxypropylgruppe ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Rest X die Benzyloxycarbonylgruppe ist.

5. Verwendung des Peptids Z-D-Phe-Pro-Boro-methoxypropylglycin-pinandiol zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von Thrombosen.

6. Verwendung eines Thrombin-inhibierenden Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur oralen Verabreichung.

7. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als gerinnungshemmendes Mittel durch Inhibieren von Thrombin.

8. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention von Thrombosen, umfassend Kombinieren eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.

9. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verhinderung der Blutkoagulation in Blutsammel- oder -verteilungsbehältern.

10. Peptid der allgemeinen Formel

in der

der Rest Y eine C&sub3;-C&sub9;-Alkylgruppe ist, die von der Gruppe -CH(CH&sub3;)&sub2; verschieden ist, oder

eine C&sub3;-C&sub9;-Alkylgruppe, substituiert durch eine C&sub1;-C&sub4; Alkoxygruppe ist,

der Rest Z die Gruppe

ist, in der

die Reste R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen eine Diolgruppe darstellen.

11. Peptid nach Anspruch 10, wobei die Reste R&sub1; und R&sub2; zusammengenommen die Pinakol- oder Pinandiolgruppe darstellen.

12. Peptid nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Rest Y die Methoxypropylgruppe ist.

13. Peptid nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der Rest X die Benzyloxycarbonylgruppe ist.

14. Ein Peptid der Formel Z-D-Phe-Pro-Boro-methoxypropylglycin-pinandiol.

15. Thrombin-inhibierendes Peptid nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zur Verwendung als Arzneimittel, gegebenenfalls zur Verwendung als Arzneimittel zur oralen Verabreichung.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung von Thrombin in einem Säuger, umfassend ein Thrombin-inhibierendes Peptid, definiert nach einem der Ansprüche 10 bis 14, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16 zur oralen Verabreichung.

18. Verwendung des hier in Schema 2 oder 3 skizzierten Syntheseverfahrens zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 10 bis 14.