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Die Produkte eines Verfahrens zur Gestaltung und Synthese
von luteinisierendes Hormon freisetzenden
Hormonantagonisten und die Anwendung der besagten Produkte.
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Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Peptide und
deren Derivate, wobei diese Produkte eine präzise chemische
Struktur aufweisen. Die Erfindung betrifft auch die
Methoden ihrer Zubereitung und Anwendung. Hypothalamisches
luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH) wirkt
auf den Hypophysenvorderlappen so ein, daß die Sekretion
von luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem
Hormon (FSH) angeregt wird. Das antagonistische Analog von
LHRH wirkt schnell auf den Hypophysenvorderlappen ein,
bleibt lange wirksam und kann sicher und reversibel für
Empfängnisverhütung oder wahlweise unterdrückung der
Gonadotropinsekretion verwendet werden. Für Anwendungen
dieser Art sind die LHRH-Antagonisten besser geeignet als
die entsprechenden Agonisten. Bisher wurden mehr als
zweitausend LHRH-Analoge gestaltet und synthetisiert.
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K. Liu et al, Int. J. Peptide Protein Res., 35 (2), Seiten
157-160 (1990), offenbaren LHRH-Antagonisten, bei denen die
Aminosaure in Stellung 6 von LHRH durch
Phenylalaninderivate ersetzt ist.
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M.J. Karten et al, Endocrine Reviews, 7 (1), Seiten 44-66
(1986), beschreiben GNRH-Analoge mit Modifikationen in
Stellung 2, 3, 6 bzw. 10 und stellen fest, daß die bloße
Erhöhung der Anzahl von Aminosäuresubstitutionen nicht
unbedingt höhere Wirksamkeit bedingt.
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K. Folkers et al, Z. Naturforsch., 41C, Seiten 1087-1091
(1986) und ibid. 428, Seiten 101-106 (1987), offenbaren
gewisse Modifikationen von LHRH.
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R.W. Roeske et al, offenbaren in der von B.H. Vickery und
J.J. Nestor redigierten Veröffentlichung "LHRH Analogs:
Contraceptive and Therapeutic Application", MTP Press,
Boston 1987, Seiten 17-24, LHRH-Analoge, bei denen in
Stellung 5 bzw. 6 Mepal und/oder Arg substituiert ist.
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EP-A-0 277 829 beschreibt LHRH-Analoge, bei denen das
Arginin in Stellung 8 an der Seitenketten-Aminogruppe
alkyliert ist.
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Die vorstehenden Hinweise lassen erkennen, daß bereits
geringe Modifikationen der Proteinfolge von LHRH recht
drastische Änderungen der pharmakologischen Eigenschaften
bedingen.
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Bei dem "Nal-Arg"-Analog war die fruchtbarkeitsmindernde
Wirkung recht hoch. Bei dem "Nal-ARG"-Analog war aber auch
die histaminfreisetzende Wirkung (HRA) sehr intensiv. Sie
verursachte bei Ratten kurzfristiges Gesichts- und
Extremitätenödem, wenn es in einer Dosis verabreicht wurde,
die ganze 50-100mal höher war als die therapeutische Dosis.
Klinische Erprobung erwies histaminbezogene systemische
Effekte. Bei anderen DArg&sup6; oder DLys&sup6; enthaltenden LHRH-
Antagonisten traten ähnliche Nebenwirkungen auf, während
ihre ED&sub5;&sub0;-Werte für HRA geringer waren als 1 µg/ml. Die
vorliegende Erfindung schafft neue LHRH-Antagonisten mit
sehr hoher ovulationshemmender Wirksamkeit (AOA) und sehr
niedriger histaminfreisetzender Wirksamkeit (HRA) sowie
vernachläßigbar geringen Nebenwirkungen. Nachstehend ist
das Wesen dieser Erfindung erläutert, und es sind Beispiele
davon angeführt.
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Die Gestaltungsmethodologie dieser Erfindung beruht auf der
topologischen Ähnlichkeit zwischen dem Molekül der
Stammverbindung [Nac-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser&sup4;, Tyr&sup5;,
DArg&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;, DAla¹&sup0;]NH&sub2; (II) und einem
Neuropeptid, dem Stoff P, das infolge der Modifikation der
alkalischen und lipophilen Bereiche in dem Molekül der
Stammverbindung neue Antagonisten mit hoher AOA und
niedriger HRA ergibt. In diesem Zusammenhang ist unter dem
Begriff Ifmodifikationtf die Einstellung bzw. Substitution
der Aminosäuren im Bereiche von Tyr&sup5;-DArg&sup6;-Arg&sup8; der
Endgruppe C und der aromatischen Säuren in der Endgruppe N
von (II) zu verstehen. Insbesondere handelt es sich bei der
Gestaltung um die Einführung einer geeigneten Alkaligruppe
und Substitutionen unnatürlicher Aminosäuren in den
Stellungen 2, 3, 5, 6 und 8 von (II).
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Als Methoden und Beispiele dieser Erfindung sind auch die
nachstehenden Substitutionen zu erachten:
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1. Substitution von DArg&sup6; in (II) durch D3pal, eine
aromatische Aminosäure entsprechender Basizität, zwecks
Erzielung des Analogs (III): [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³
Ser&sup4;, Tyr&sup5;, D3Pal&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;, DAla¹&sup0;]NH&sub2;
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2. Substitution des Tyr&sup5; in (III) durch Arg&sup5; zwecks
Erzielung von (IV): [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser&sup4;
Arg&sup5;, D3pal&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;, DAla¹&sup0;]NH&sub2;
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3. Substitution des D3pal³ in (IV) durch Dphe³ oder dessen
(DXCH&sub2;PHE) -Derivate zwecks Erzielung von (V): [NAc-D2Nal¹,
DpClPhe², DPhe³, Ser&sup4; Arg&sup5;, D3Pal&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;
DAla¹&sup0;]NH&sub2; bzw. von dessen (DXCH&sub2;Phe³)-Analogen.
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4. Substitution von D3pal³ in (III) durch Dphe³ oder dessen
Derivate zwecks Erzielung von (V'): [NAc-D2Nal¹, DpClPhe²,
DPhe³, Ser&sup4;, Tyr&sup5;, D3Pal&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;, DAla¹&sup0;]NH&sub2; bzw.
von dessen (DXCH&sub2;Phe³)-Analogen.
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Es wurde eine Reihe von neuen LHRH-Antagonisten der Formel
[NAc-D2Nal¹, AA², AA³, Ser&sup4;, AA&sup5;, AA&sup6;, Leu&sup7;, AA&sup8;, Pro&sup9;,
DAla¹&sup0;]NH&sub2; synthetisiert, wobei AA natürliche oder
unnatürliche als D- bzw. L- Arala bezeichnete Aminosäuren
sind. Insbesondere handelt es sich dabei um die folgenden
LHRH-Antagonisten:
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AA² = D-pClPhe, D-ArAla, DPhe, Ar-Ala, DXCH&sub2;phe;
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AA³ = D3Pal, Ar-Ala, D-ArAla, DPhe, D-XCH&sub2;Phe;
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AA&sup5; = Arg, DMap, Pip, Tyr, Pal, Mop, Tep, Map,
Phe, Eap, Pap, Bap, DMop;
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AA&sup6; = D3pal, D-Ar-Ala, D-XCH²Phe;
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AA&sup8; = Pip, Mop, Tep, Map, Eap, Pap, Bap, Arg;
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wobei
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und
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wobei
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und R'&sub2;N-, RR'N-
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wobei
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R' = CH&sub3;-, CH&sub3;CH&sub2;-, C&sub3;H&sub7;-, C&sub4;H&sub9;-, H-;
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R = CH&sub3;-, CH&sub3;CH&sub2;-, C&sub3;H&sub7;-, C&sub4;H&sub9;-, H-;
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Die nach der vorstehend beschriebenen Methode als eine Art
Peptidmedikament erzeugten LHRH-Antagonisten können zu
Behandlung von störungen des endokrinen
Fortpflanzungssystems wie Endometriose, vorzeitiger
Pubertät bei Kindern und Prostata- sowie Brustkrebs
verwendet werden, kommen aber auch als
Empfängnisverhütungsmittel für Männer und Frauen oder zum
Einsatz im Zusammenhang mit der Diagnose und Behandlung von
Unfruchtbarkeit usw. in Frage. Solche Peptidmedikamente
können in der Form herkömmlicher für Injektion geeigneter
Kapseln oder in anderen anwendungsgerechten Formen
hergestellt werden.
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Weitere Merkmale dieser Erfindung sind wie folgt:
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Im natürlichen Verlauf der Histaminfreisetzung im Körper
spielt das Neuropeptid SP eine sehr wichtige Rolle, wobei
dessen ED&sub5;&sub0; für HRA 5-15 µM beträgt. Die chemische Struktur
von SP ist [Arg¹, Pro², Lys³, Pro&sup4;, Gln&sup5;, Gln&sup6;, Phe&sup7;, Phe&sup8;,
Gly&sup9;, Leu¹&sup0;, Met¹¹]NH&sub2;. Die Untersuchung der Beziehung
zwischen der Struktur von SP und der HRA erwies, daß die
HRA von SP nur dann möglich ist, wenn die Endgruppe N des
SP-Moleküls Arg¹-Pro²-Lys³ enthält, da Entfernung dieser
drei Aminosäuren aus dem Molekül vollkommene Ausschaltung
seiner HRA zur Folge hatte. Dagegen entsprach bei
Entfernung von ein, zwei oder drei Aminosäuren aus der
Endgruppe C die HRA nach wie vor einem Viertel ihres
ursprünglichen Wertes. Weitere Entfernung von Phe&sup8; und Phe&sup7;
hatte zur Folge, daß die HRA im Verhältnis zu deren Gehalt
in SP um 4 % bzw. 0,57 % reduziert wurde. Weitere
Entfernung des Gln5,6 hatte keine erhebliche Änderung der
HRA zur Folge. Aufgrund der vorstehenden Daten ist zu
schließen, daß der HRA-Wert durch den lipophilen Bereich um
Phe7,8 bestimmt wird, wobei dieser Bereich bei der Bindung
des Moleküls mit dem Mastzellenrezeptor eine Rolle spielt.
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Wie vorstehend erwähnt, war bei den (D2Nal¹, DArg&sup6;)-Analogen
des LHRH die HRA sehr hoch, wobei die Molekularstruktur
eine topologische Ähnlichkeit mit der des SP aufwies:
Darg&sup6;-Leu&sup7;-Arg&sup8; bei den LHRH-Analogen scheint Arg¹-Pro²-Lys³
bei SP zu entsprechen, und zwar bestehen beide Gruppen aus
einem Paar hochgradig basischer Aminosäurereste, zwischen
denen sich nur ein neutraler Aminosäurerest befindet, d.h.
sowohl das (D2Nal¹, DArg) -Analog von LHRH als auch SP
enthalten zwei hochgradig basische Aminosäurereste in
stellungsmäßiger Beziehung 1,3. Andererseits besteht die
Ansicht, daß vom Standpunkt der Bestimmung des HRA-Wertes
eine Gruppe von aromatischen Aminosäureresten in dem LHRH
Analog dem Phe7,8-Bereich in SP entspricht.
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Die erfindungsgemäße Gestaltung umfaßt zwei Aspekte: einer
davon besteht in der Modifikation des Tyr&sup5;-Darg&sup6;-Arg&sup8;-
Bereiches der Endgruppe C, während der andere in der
genauen Einstellung der aromatischen Säuren nach
Optimierung der Modifikation des alkalischen Bereiches der
Endgruppe C besteht. Als Stammverbindung wird [NAc-D2Nal¹,
DpClPhe², D3Pal³, Ser&sup4;, Tyr&sup5;, DArg&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;,
DAla¹&sup0;]NH&sub2; (II) benutzt, wobei der AOA-Wert bei 0,5 µg in
Maisöl 100 % und bei 0,25 µg 57 % betrug.
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In erster Linie konnte Darg&sup6; in (II) durch schwach basische
oder neutrale aromatische Säuren wie D3Pal, D6Qal,
Tetrahydrotryptophan und Methyltryptophan ersetzt werden.
[NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal3,6, DAla¹&sup0;] (LHRH(III)) wurde
bei Substitution des Darg&sup6; in (II) durch D3pal&sup6; erhalten.
Bei 3 µg bzw. 1 µg (in Maisöl) betrug die AOA von (III)
100 % bzw. 83 % und dessen ED&sub5;&sub0; für HRA betrug 9,8 µg/ml,
was viel besser war als die des "Nal-Arg"Analogs, bei dem
die ED&sub5;&sub0; für HRA geringer war als 1 µg/ml. Es scheint, daß
zur Erzielung einer hohen AOA die Basizität des gesamten
Moleküls der eines Argininpaars gleich oder sehr ähnlich
sein muß. Da die Stellung 5 ebenso wenig wie die Stellung 6
einen Einfluß auf die Rezeptorbindung ausübt, kann in
Stellung 5 eine Vielzahl von argininhaltigen Aminosäuren
eingeführt werden. Es wurde eine Reihe neuer Analoge
gestaltet. So ergab z.B. die Substituierung von Tyr&sup5; in
(III) durch Arg&sup5; [Nac-DNal¹, DpClPhe², D3Pal3,6, Arg&sup5;,
DAla¹&sup0;] LHRH (IV). Sowohl (IV) als auch (II) enthielten
Arginine, doch die Distanz zwischen den beiden Argininen in
(IV), deren geometrische Beziehung zu 1, 4 wurde - d.h
zwischen diesen beiden Argininen befanden sich zwei andere
Aminosäuren - war größer als in (II). Die HRA wäre daher
verringert, und andererseits sollte die AOA angesichts des
Vorhandenseins von zwei Argininen nicht geringer sein als
in (II). Die Durchführung von Biotests im Zusammenhang mit
(IV) ergab eine ED&sub5;&sub0; für HRA von 3,5 ijg/ml, während die AOA
bei 0,12 µg in Maisöl 60 %, bei 0,25 µg 85 % und bei
0,5 µg 100 % betrug. Damit wurde erstmalig bei Verwendung
von LHRH-Antagonisten eine ED&sub5;&sub0; für AOA erzielt, die -
0,125 µg entsprach oder geringer war.
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Die weitere Gestaltung ging daher von der Struktur von (IV)
aus.
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Das Molekül (IV) enthält vier alkalische Reste und zwar
D3Pal3,6 und Arg5,8, während (II) nur drei alkalische Reste
enthält. Es ist daher angebracht, ein D3Pal durch eine
neutrale Aminosäure zu ersetzen; andererseits wurde bei
(IV) sehr intensive Hydrophilizität nachgewiesen, und
Substitution von DPal in (IV) durch eine hydrophobe
Aminosäure, um die Hydrophilizität zu verringern, wäre für
die Retention des Mittels im Körper und im Anschluß daran
Verlängerung der Wirkungsdauer förderlich. Danach wurde
eine neue Reihe von Analogen durch die Substitution von
D3Pal³ gestaltet. In (V) betrug bei 1 µg (in
Kochsalzlösung) die AOA 100 %, was der AOA der
Stammverbindung (IV) entsprach, während die HRA um die
Hälfte verringert war. Die ED&sub5;&sub0; für HRA betrug 7,4 µg/ml.
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Weitere Substitution von DClPhe² durch DPhe² hatte
Verringerung der Lipophihe dieses Bereiches in dem Molekül
sowie verringerte HRA zur Folge.
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Arg&sup5;-D3PAl&sup6;-Leu&sup7;-Arg&sup8; in der Endgruppe C von (IV) scheint im
Zusammenhang mit der Auslösung der Histaminfreisetzung eine
bedeutende Rolle zu spielen. D3Pal verbindet Aromatizität,
Basizität und Hydrophilizität in einem Molekül und ist in
LHRH-Antagonisten für Rezeptorbindung auch sterisch
annehmbar. Des gleichen kann die Gestaltung neuer Reihen
von unnatürlichen Aminosäuren mit den gleichen Merkmalen
wie D3Pal bessere LHRH-Antagonisten ergeben als (IV) bzw.
(V).
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So ergibt z.B. die Modifikation natürlicher, lipophiler und
aromatischer Aminosäuren wie Phenylalanin nach dem in "Die
Synthese neuartiger unnatürlicher Aminosäuren¹¹ nachstehend
beschriebenen Verfahren eine Reihe neuartiger Aminosäuren,
die in einem Molekül Aromatizität, Hydrophilizität und
Basizität verbinden und durch die Formel
R&sub1;R&sub2;NCH&sub2;C&sub6;H&sub4;CH&sub2;CH(NH)CO&sub2;H (VI) ausgedrückt werden können, und
zwar können R&sub1; und R&sub2; identisch oder voneinander verschieden
und kettenartig oder ringförmig sein und auch ein
Heteroatom umfassen. Durch Änderung von R&sub1; und R&sub2; läßt sich
eine Reihe von Aminosäuren gestalten, die systemisch
geänderte Basizitäts-, Hydrophilizität- und Steromerkmale
aufweisen. Die Einführung dieser Aminosäuren in den
Stellungen 5, 6 und 8 von (IV) hat drei Reihen neuer LHRH-
Antagonisten ergeben. Die Ergebnisse der Biotests erwiesen,
daß jede Reihe mindestens einen neuen Antagonisten mit 100
%-iger AOA bei 1 µg ähnlich wie in (IV) aufwies, während
die HRA erheblich verringert war. Z.B. betrug bei (VII):
[NAc-D2Nal¹, DpClphe², D3Pal³, Ser&sup4;, Mop&sup5;, D3Pal&sup6;, Leu&sup7;,
Arg&sup8;, Pro&sup9;, DAla¹&sup0;]-NH&sub2; die AOA bei 1 µg 100 %, während die
ED&sub5;&sub0; für HRA 14,7 µg/ml betrug, was besser war als bei (V).
Wurde Arg&sup8; in (IV) durch (VI) substituiert, so stand das
Ausmaß der HRA-Abnahme in positivem Verhältnis zu der Länge
von R in (VI), und die ED&sub5;&sub0; für HRA könnte daher höher sein
als 200 µg/ml. Verbindungen dieser Art können leicht in
wässeriger Lösung aufgelöst werden, und es ist zu erwarten,
daß ihre klinische Verwertung keinerlei Ansetzprobleme
bedingen wird. Die Ergebnisse erwiesen, daß Arg&sup8; bzw. Lys&sup8;
zur Erzielung hochgradig wirksamer LHRH-Antagonisten nicht
unerläßlich ist. Eine geeignete alkalische Gruppe in
Stellung 8 kann hohe AOA gewährleisten, wohingegen die die
Mastzelle zur Freisetzung von Histamin anregende
Wirksamkeit erheblich reduziert war, wenn die besagte
basische Gruppe in erheblichem Maße sterische Hinderung
bedingte.
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Diese Erfindung, die Modifikationen sowohl in der Endgruppe
N als auch in der Endgruppe C vorsieht, ergibt bessere
LHRH-Antagonisten.
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Die Syntheseverfahren sind nachstehend veranschaulicht.
1. Die Synthese neuartiger unnatürlicher Aminosäuren
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Mehr als 60 serielle und nichtserielle D- bzw. L-
Aminosäuren werden im Einklang mit den vier in dem
nachstehenden Ablaufplan umrissenen Syntheseabläufen
gestaltet und synthetisiert. Die Strukturen dieser
unnatürlichen Aminosäuren sind gemeinsam mit den
allgemeinen Strukturformeln in dem gleichen Ablaufplan
angeführt. Einige dieser Aminosäuren weisen
Alkälinität, Hydrophilizität bzw. Aromatizität auf,
während die anderen alle dieser Merkmale in dem
Molekül vereinigen.
Ablauf
Chymotypsin
Dibutyl-Dicarbonat
Ablauf
Ablauf
sekundäres
Amin
sekundäres
Amin
Dicarbonat
Ablauf
Ablauf
subtilisin
Aminosäure
Ablauf
2. Peptidsynthese
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Die Synthese beginnt mit der Endgruppe C des Peptids
an Benzhydrylaminhydrochloridharz (BHA-Harz), wobei
von dem von Merrifield eingeführten Verfahren der
Festphasen-Peptidsynthese Gebrauch gemacht wird. Es
handelt sich dabei um ein dreistufiges Verankerung,
Kupplung und Abspaltung umfassendes Verfahren. Zum
Waschen zwischen den einzelnen Reaktionsstufen wird
hauptsächlich von Dichlormethan (DCM) Gebrauch
gemacht, doch werden, falls erforderlich, auch
Isopropanolalkohol (IPA) und N,N-Dimethylformamid
(DMF) verwendet. Die Kupplungsreaktion wird in durch
einen Überschuß von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
katalysiertem Zustand unter Zusatz einer ausreichenden
Menge von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) durchgeführt.
Das Ausmaß der Kupplungsreaktion wird nach Kaises
Ninhydrinmethode überwacht. Die Durchführung der
zweiten Kupplungsreaktion setzt voraus, daß in Kaises
Test ein positives Ergebnis erhalten wurde. Die
Peptidkette wird von dem Harz unter Einsatz von
anhydrischem Wasserstoffluorid (HF) nach dem Abschluß
aller Reaktionen, denen das Harz unterzogen werden
muß, in der Gegenwart von Anisol abgespalten, wobei
gleichzeitig bei allen der kurzfristig schützenden
Gruppen der Schutzeffekt aufgehoben wird. Nach dem
Waschen mit Äthylacetat bzw. Äther werden durch
wässerige Essigsäureextraktion und anschließende
Gefriertrocknung Rohprodukte von LHRH-Antagonisten
gewonnen. Die Ausbeute ist höher als 50%.
3. Peptidreinigung
(1) Das Peptid wird durch
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Gelpermeationschromatographie oder
Silicatrennchromatographie unter Verwendung einer
Säule, deren Höhe bis 60-100 cm betragen kann bei
gleichzeitiger UV/TLC-Überwachung gereinigt. Die
einmal gereinigten LHRH-Antagonisten werden nach
Gefriertrocknen der Hauptfraktionen gewonnen. Die
Ausbeute beträgt 50-90% und der Reinheitsgrad kann
höher sein als 90%.
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(2) Das Peptid wird dann zusätzlich in dem
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiegerät (HPLC
Gerät) nach Waters gereinigt, wobei von einer
C18-Umkehrphasensäule (7,8 x 300 mm) (µ- Bondapak 84176)
Gebrauch gemacht wird. Die Ausbeute dieser Stufe
betrifft 20-50%, und die Reinheit beträgt mindestens
99%.
4. Reinheitsanalyse des Peptids
(1) TLC-Analyse
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Diese wird auf einer Plastikfolie vorgenommen, die mit
Silicagel 60 F254 mit einer Höhe von 5-10 cm
beschichtet ist. Bei allen durchgeführten Tests tritt
bei Entwicklung in fünf verschiedenen
Lösungsmittelsystemen jeweils ein einziger Punkt in
Erscheinung.
(2) HPLC-Analyse
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Bei Eluierung unter Gebrauch von zwei verschiedenen
Lösungsmittelsystemen in dem HPLC-Gerät nach Waters,
wobei von einer Analysensäule (µ-Bondapak 27324) und
Überwachung durch UV 210 Gebrauch gemacht wurde, tritt
in allen Tests jeweils eine einzige Spitze in
Erscheinung. Die Probenmenge beträgt 10-200 µg.
5. Aminosäurenanalyse des Peptids
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Im Einklang mit dem von der Waters Company
entwickelten PICO-TAG-Verfahren werden auf einer
10&supmin;&sup5;
g Waage 50 µg der 2 Stunden lang unter Vakuum
getrockneten Probe genau ausgewogen. Nach Auflösung in
Wasser werden 10 µg aligtioter Teil in ein Reagenzglas
eingeführt, in das zusätzlich 1:1 Salzsäure (mit 1%
Phenol) eingeführt wurde, wie dies in dem Handbuch
erklärt ist.
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Die Reaktion geht bei 105ºC in einem abgedichteten
Behälter, der mit Stickstoff gefüllt und bis auf
Vakuum ausgepumpt wurde, um den in dem Reagenzglas
enthaltenen Sauerstoff zu entfernen, während einer
Zeitspanne von 22-24 Stunden vor sich. Es wird
Phenolisothiocyanat zugesetzt, um nach Verdampfung der
überschüssigen Salzsäure die Aminogruppe zu gewinnen.
Nach Durchführung der Reaktion wurde mit Hilfe des
HPLC-Geräts, das mit einer PICO-TAG-Analysensäule für
Aminosäure ausgestattet war, eine Analyse vorgenommen
und mittels UV254 überwacht. Es wurden die Gehalte der
einzelnen Aminosäuren und das relative Molverhältnis
berechnet, um die Aminosäurenanteile in der Probe
aufgrund des Vergleichs der integrierten Fläche jeder
Aminosäure mit der der H-Normalprobe nach Waters
entsprechenden Fläche zu bestimmen. Die klassische
Ionenaustausch-Ninhydrinderivationsmethode (IEN) wurde
als Kontrolle ebenfalls verwendet und ergab die
gleichen Resultate. Für die Erzielung eines
hinreichend zuverlässigen Resultats war jedoch eine
zehnmal so große Probenmenge erforderlich.
6. Auswertung biologischer Wirksamkeit
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Es wird von der Corbinschen Methode der
Ovulationshemmung bei Ratten Gebrauch gemacht. Für
diesen Versuch werden die gesunden ausgewachsenen
weiblichen SD-Ratten (Körpergewicht 200-250
verwendet. Alle Tiere werden bei 22-24ºC gehalten,
wobei sie sich abwechselnd 14 Stunden in Licht und 10
Stunden in Dunkelheit befinden. Sie werden mit
Standardfutter versorgt und erhalten Wasser ad
libitum. Die Ratten, bei denen Untersuchung des
Vaginalausstrichs mindestens zwei aufeinanderfolgende
viertägige östrogenzyklen erweist, kommen für diesen
Versuch in Frage. Den Ratten wurden um zwölf Uhr
mittags des Proöstrus Peptide (LHRH-Antagonisten)
verabreicht, wobei deren Konzentrationen in
Kochsalzlösung unterschiedlich waren. Am nächsten Tage
wurden die Ratten getötet und ihre beidseitigen
Ovidukte unter einem Präpariermikroskop untersucht, um
die Anzahl der Ova zu bestimmen. Die Ratten wurden je
nach der Dosierung in mehrere Gruppen unterteilt,
wobei jede Gruppe etwa zehn Ratten umfaßte, während
die Kontrollgruppe, in der die Ratten eine gleiche
Menge Kochsalzlösung erhielten, 9-10 Ratten umfaßte
Die ovulationshemmende Wirksamkeit (AOA) geht aus der
nachstehenden Gleichung hervor:
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AOA = Anzahl ovulationsgehemmter Ratten/Gesamtanzahl behandelter Ratten x 100%
7. Auswertung der histaminfreisetzenden Wirksamkeit:
(1) Histaminfreisetzungstest (HRT) in vitro.
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In diesem Versuch werden die gesunden ausgewachsenen
männlichen SD-Ratten (Körpergewicht 200-250 g), die
unter den gleichen Bedingungen untergebracht sind,
verwendet. Nach Betäubung mit Hilfe von CO&sub2; wird die
Peritonealhöhle mit 50 ml PIPES-AC-Medium gewaschen,
das 20 Einheiten Heparin enthält. Nach achtminütiger
Zentrifugierung bei 200xg und 4ºC werden die Zellen
wieder gewaschen und schließlich wieder in Suspension
gebracht, bis eine Konzentration der Leukozyten in
PIPES-AC auf insgesamt 8-24x10&sup5;/ml erreicht wird.
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Diese Suspension enthält etwa 5-10% Mastzellen.
Gewaschene Zellen werden unmittelbar nach der
Erfassung verwendet und 5 Minuten lang bei 37ºC
vorgewärmt, bevor mit der Pipette 0,3 ml aliquote
Teile in 0,3 ml verdünntes Peptid enthaltende
Polystyrolröhrchen eingeführt werden. Die Gemische
werden 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und die
Reaktion wird durch Zentrifugieren während 15 Minuten
bei 400xg und 4ºC abgebrochen. Die Überstände werden
nach der manuellen fluorometrischen Testmethode auf
Histamingehalt geprüft, nachdem sie nacheinander mit
n-Butanol und n-Heptan extrahiert wurden. Der
Histamingehalt läßt sich an Hand der Histaminnormkurve
bestimmen (siehe unten) . Die prozentuelle
Histaminfreisetzung läßt sich nach der folgenden
Gleichung berechnen:
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Histaminfreisetzung (%) = E-B/C-B x 100%
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wobei E der angezeigte fluorometrische Wert der
Versuchsprobe, B der angezeigte fluorometrische Wert
der nur Zellen und Puffer enthaltenden Proben und C
der angezeigte fluorometrische Wert der "Gesamtheit"
(d.h. der mit HCIO&sub4; behandelten Zellen) ist.
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Die Normkurve läßt sich durch Aufzeichnen der an einem
Fluorometer bei 350 nm/450 nm
(Aktivierung/fluoreszierend) abgelesenen OD-Werte im Verhältnis zu
den Konzentrationen seriell verdünnter Lösung von
genau ausgewogenem Histaminhydrochlorid erzielen. Der
Relativparameter r der Histaminnormkurve kann 0,9998
betragen, und die unterste nachweisbare
Histaminkonzentration beträgt 0,5 µg/ml.
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Der ED&sub5;&sub0;-Wert von Peptid läßt sich an Hand der
Dosisreaktionskurven bestimmen, die durch Aufzeichnen
der Histaminfreisetzung im Verhältnis zu der
Peptidkonzentration auf halblogarithmisches Papier
erzielt wurden.
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Alle Peptidproben sind mit Mastzellen von mindestens 3
verschiedenen Ratten zu prüfen.
(2). Kutaner Anaphylaxietest (CAT):
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In diesem Versuch werden die gesunden ausgewachsenen
weiblichen SD-Ratten (Körpergewicht 250 g) verwendet.
Die Ratten werden intravenös mit Evans Blau (1 ml
einer 0,05 %-igen Lösung) injiziert. Unmittelbar
danach werden 0,05 ml Peptidlösung (5, 0,5 bzw.
0,05 µg/ml) und Kochsalzlösung (Kontrolle) intrakutan
in einen rasierten Bereich am Rücken der Tiere
injiziert. 30 Minuten nach der Injektion werden die
Ratten getötet und die Rückenhaut wird umgeschlagen.
Die Durchmesser der Läsionen werden mit Hilfe einer
Nonius-Schublehre in zwei zueinander senkrechten
Richtungen in Millimetern gemessen. Der Durchmesser
der Kontrolle beträgt in der Regel weniger als 5,5 mm.
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Auch die Menge von Evans Blau, die aus dem Blutgefäß
in die Haut durchdringt kann spektralphotometrisch
gemessen werden. Die dem Läsionsbereich entsprechende
Haut wird ausgeschnitten und über Nacht in ein Gemisch
von Aceton/Kochsalzlösung (7:3, Vol/Vol) getaucht.
Nach Zentrifugierung am nächsten Tag wird der Gehalt
an Evans Blau in dem Uberstand mit einem
Spektralphotometer (UV-260) bei 610 nm im Verhältnis
zu einem Bezugsgemisch von Aceton/Kochsalzlösung (7:3)
gemessen. Jedes Peptid wurde bei mindestens drei
verschiedenen Ratten getestet.
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Es wurden nach der vorstehend beschriebenen Methode
verschiedene neue LHRH-Antagonisten gestaltet und
synthetisiert. Kurz gefaßt, wurde die neue Struktur
der LHRH-Antagonisten durch einfache bzw. mehrfache
Substitution der verschiedenen natürlichen und
unnatürlichen Aminosäuren, die in den vorstehenden
Absätzen angeführt sind, erhalten.
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Verschiedene Beispiele von neuen danach gewonnenen
LHRH-Antagonisten sind in Tabelle 1 angeführt.
Tabelle 1 : Ein Teil der erfindungsgmäßen Beispiele
Tabelle 1 : Ein Teil der erfindungsgmäßen Beispiele, Seite 2
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Die Anwendungen dieser Erfindung:
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1. Nach Abschluß der vorklinischen Pharmakologie- und
Toxikologiestudie können wir diese neuen LHRH
Antagonisten, die sich in klinischer Hinsicht durch
hohe therapeutische Wirksamkeit und geringe
Nebenwirkungen auszeichnen, dazu verwenden, neue
Medikamente für die Behandlung der Endometriose und
der dadurch bedingten Störungen des endokrinen
Fortpflanzungssystems, u.a. im Zusammenhang mit
vorzeitiger Pubertät bei Kindern sowie Prostata- und
Brustkrebs, zu entwickeln. Da sie die Sekretion von
Gonadotropin durch konkurrierende Rezeptoren mit
endogenem LHRH unterdrücken und schnell, reversibel
und sicher wirken, eignen sie sich zu weiterer
Entwicklung als neuartige Empfängnisverhütungsmittel
für Männer oder Frauen. Außerdem kommen sie auch für
die Behandlung der Unfruchtbarkeit und für wahlweise
und reversible Ausschaltung der Hypothysenfunktion bei
der Sekretion von Gonadotropin in Frage.
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Als eine Art Peptidmedikament werden die in dieser
Urkunde beschriebenen LHRH-Antagonisten normalerweise
nicht oral verabreicht. Sie können aber leicht zu
gefriergetrockneten Pulvern verarbeitet werden, die
zum Auflösen in Kochsalzlösungen für intravenöse,
subkutane bzw. intramuskuläre Einspritzung geeignet
sind.
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Außerdem werden langfristig wirkende Abgabesysteme wie
biologisch abbaufähige injizierbare Kapseln erforscht.
Die Kapseln können mit Hilfe einer besonderen Spritze
subkutan implantiert werden, werden nach Freisetzung
des gesamten Peptidgehalts durch das Gewebe adsorbiert
und brauchen nicht auf chirugischem Wege entfernt zu
werden. Das langfristig wirksame Abgabesystem eignet
sich besonders gut für die Langzeit-Verabreichung von
LHRH-Analogen in der klinischen Praxis.
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Nachstehend sind die die Beispiele betreffenden
Analyseresultate angeführt (wobei die drei Analoge IV,
V und VII als typische Beispiele dienen):
(1) Reinheit
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Dünnschichtchromatographie (TLC):
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Die in fünf verschiedenen Lösungsmittelsystemen
entwickelten Chromatogramme weisen jeweils nur
einen einzigen Punkt auf.
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Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC):
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Die mit zwei verschiedenen Lösungsmittelsystemen
eluierten Chromatogramme weisen jeweils nur eine
einzige Spitze auf.
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Die Rf-Werte und die Retentionszeit TR sind in
Tabelle 2 angeführt, und zwar ebenfalls unter
Bezugnahme auf die Bilder 1-4.
Tabelle 2: Die Resultate chromatographischer Analyse
von LHRH-Antagonisten
Lösung A + 80 % Acetonitril
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Lösungsmittelsystem 2:
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Lösung A ist eine wässerige Lösung von 0,01M KH&sub2;PO&sub4;
(pH3)
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Lösung B ist 20%-ige Lösung A + 80 % Acetonitril
TLC-Lösungsmittel system:
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1. nBuOH/EtOAC/HOAC/H&sub2;O (5:5:1:1)
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2. nBuOAC/nBuOH/HOAC/H&sub2;O (2:8:2:3)
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3. nBuOAC/HOAC/H&sub2;O (4:1:5), aufsteigende Phase
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4. nBuOH/HOAC/H&sub2;O (4:1:2)
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5. nBuOH/EtOAC/HOAC/H&sub2;O (1:1:1:1)
(2) Aminosäurenanalyse
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Die Analyse wird im Einklang mit der
herkömmlichen IEN-Methode und der neuen PICO-TAG-
Methode durchgeführt, und die Resultate sind in
der Tabelle 3 und den Bildern 5 und 6
ersichtlich.
Tabelle 3. Die Anteile der in LHRH-Antagonisten
enthaltenen Aminosäuren
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NB:
Nicht bestimmt
(3) Die Resultate der Biotests
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Die Resultate der Biotests, was u.a. deren
ovulationshemmende Wirksamkeit bei verschiedenen
Dosen und die ED&sub5;&sub0; für histaminfreisetzende
Wirksamkeit in vitro anbelangt, sind in Tabelle 4
angeführt, die 26 als Beispiele dienende
Antagonisten enthält.
Tabelle 4: Resultate der an neuen auf der Stammstruktur
basierenden LHRH-Antagonisten
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* Die Stammstruktur ist: [Nac-D2Nal¹, DpClphe², D3Pal³,
Ser&sup4;, Arg&sup5;, D3Pal&sup6;, Lue&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;, DAla¹&sup0;]NH&sub2;
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Wie vorstehend veranschaulicht und beschrieben, zeichnen
sich die erfindungsgemäß gestalteten und synthetisierten
LHRH-Antagonisten durch sehr gute Eigenschaften aus. TLC-
und HPLC-Analysen erweisen, daß sie vollkommen rein sind.
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Ihre Zusammensetzungen sind richtig, d.h. die sind absolut
vorschriftsgerecht. Ihre fruchtbarkeitshemmende Wirksamkeit
ist hoch: bei subkutaner Einspritzung in der Dosis von 0,1
bis 2,0 µg um zwölf Uhr mittag des Proöstrus können sie die
Ovulation bei Ratten hemmen. Ihre histaminbedingten
Nebenwirkungen sind gering: ihre ED&sub5;&sub0; für
Histaminfreisetzung in vitro (die effektive Dosis, bei der
die Rattenmastzelle 50% des Histamins freisetzt) erstreckt
sich von 5 bis 300 µg/ml; die dadurch in dem kutanen
Anaphylaxietest bei Ratten bewirkten Läsionen sind nicht
größer, als dies klinisch erforderlich ist. Die
Wasserlöslichkeit der Produkte ist sehr hoch, und alle
Biotests werden in Salzlösung vorgenommen, so daß sie sich
ohne weiteres für klinische Einspritzung ansetzen lassen.
Sie können auch als langfristig wirkende Abgabesysteme
zubereitet werden, wobei injizierbare Mikrokapseln für
langfristige Unterdrückung von Gonadotropin und
Gonadenhormon am praktischsten sind. Sie kommen daher als
hochgradig wirksame, reversible und sichere
Empfängnisverhütungsmittel für Männer und Frauen in Frage.
Außerdem können sie zur Behandlung verschiedener durch
Störungen des endokrinen Fortpflanzungssystems bedingter
Krankheiten wie von hormonbedingtem Prostata- und
Brustkrebs, Endometriose und vorzeitiger Pubertät bei
Kindern verwendet werden. Auch bei der Behandlung von
Unfruchtbarkeit leisten sie wertvolle Dienste. Von den
neuen hier beschriebenen LHRH-Antagonisten kann u.a. für
Grundlagenforschung im Zusammenhang mit
Fortpflanzungsphysiologie und -pharmakologie Gebrauch
gemacht werden, z.B. zwecks Erforschung der
Hypophysenfunktion, der Auswirkungen von Gonadenhormonen
bzw. Gonadotropinen oder LHRH auf geschlechtliches
Verhalten usw.
ABKÜRZUNGEN
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Nachstehend sind in dieser Patentanmeldung verwendete
Abkürzungen angeführt.
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Ala Alanin
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AOA ovulationshemmende Wirksamkeit
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Arg Arganin
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Bap Dibutylaminomethylphenylalanin
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Boc t-Butyloxylcarbonyl
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BuOAC Butylacetat
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CAT kutaner Anaphylaxietest
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DCC Dicyclohexylcarbodiimid
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DCM Dichlormethan
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D2nal D-β-(2-Naphthyl) Alanin
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D3pal D-β-(3-Pyridyl) Alanin
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Dpclphe p-Chloro-D-Phenylalanin
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Dpfphe p-Fluoro-D-Phenylalanin
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D6Qal D-β-(6-Quinolyl) Alanin
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DMF N, N-Dimethylformamid
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Eap Diäthylaminomethylphenylalanin
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ED&sub5;&sub0; Dosis für 50 %-ige Effektivität
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EtOAC Äthylacetat
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FSH Follikelstimulierendes Hormon
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Glu Glutaminsäure
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Gly Glycin
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His Histidin
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HOBT 1-Hydroxybenzoltriazol
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HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
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Ninhydrinderivat ion
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HRA Histaminfreisetzende Wirksamkeit
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HRT Histaminfreisetzungstest
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IEN Ionenaustauschchromatographie mit
nachgeschalteter Säule
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IPA
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LH luteinisierendes Hormon
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LHRH luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon
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Leu Leucin
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Lys Lysin
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Map Dimethylaminomethylphenylalanin
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Met Methionin
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5 Mop Morphol inomethylphenylalanin
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nBuOH n-Butylalkohol
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NS normale Kochsalzlösung
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Pap Dipropylaminomethylphenylalanin
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Phe Phenylalanin
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Pip Piperidinomethylphenylalanin
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Pipes Piperazin-N,N'-bis [2-Äthansulfonsäure]
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Pro Prolin
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Rf Durchsatzgeschwindigkeit
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SE Standardfehler
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Ser Serin
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TFA Trifluoressigsäure
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TLC Dünnschichtchromatographie
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TR Retentionszeit
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Trp Tryptophan
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Tyr Tyrosin
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Tep Tetrahydroperrolylmethylphenylalanm