DE69810283T2 - GnRH ANTAGONISTEN - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Peptide, die Antagonisten des humanen Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) sind und vorteilhafte physikalische chemische und biologische Eigenschaften aufweisen. Insbesondere betrifft die Erfindung Decapeptide, die die gonadale Wirkung und die Freisetzung der steroidalen Hormone Progesteron und Testosteron hemmen und die weniger teuer herzustellen sind als vergleichbare GnRH-Peptid- Antagonisten und Verfahren zur Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die solche Decapeptide enthalten, für einen solchen Zweck und insbesondere um Zustände zu leiten, die von der übermäßigen Absonderung gonadaler Steroide resultieren.
- Das Follikel-stimulierende Hormon (FSH) und das luteinisierende Hormon (LH), manchmal als Gonadotropine oder gonadotropische Hormone bezeichnet, werden von der Hypophyse abgesondert, die durch einen Stiel an den Hypothalamus gebunden ist.
- Die Hormonabsonderung durch das Logos-Anterior der Hypophyse erfordert gewöhnlich die vorherige Absonderung der erzeugten Hormone durch den Hypothalamus, wie das Decapeptid GnRH.
- Die Verabreichung von GnRH-Analoga, die antagonistisch für die normale Wirkung von GnRH sind, sind verwendet worden, um die Sekretion von Gonadotropinen in Säugern allgemein zu unterdrücken und die Ovulation zu unterdrücken oder zu verzögern.
- Die Suche nach besseren GnRH-Antagonisten führte zu der Herstellung von Antid, d. h. [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, Lys(Nic)&sup5;, D-Lys(Nic)&sup6;, ILys&sup8;, D-Ala¹&sup0;]-GnRH; und Cetrorelix, d. h. [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, D-Cit&sup6;, D-Ala¹&sup0;]-GnRH. Das US-Patent Nr. 5 516 887 beschreibt GnRH- Antagonisten, von denen gesagt wird, daß sie wirksamer Plasma-Testosteron unterdrücken als Antid, z. B. [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, D-N&sup6;- Carbamoyl-Lys&sup6;, ILys&sup8;, D-Ala¹&sup0;]-GnRH, das als Antarelix bezeichnet wird.
- Das US-Patent Nr. 5 296 468, herausgegeben am 22. März 1994, offenbart den Entwurf und die Synthese einer Anzahl von GnRH-Antagonisten, wobei die Seitenketten ausgewählter Reste reagiert werden, um Cyanoguanidino-Komponenten zu erzeugen, einige von ihnen wandeln sich danach spontan zu einem gewünschten Heterocyclus um, z. B. zu einem 3-Amino- 1,2,4-triazol(atz). Solche Cyanoguanidino-Komponenten werden von der omega- Aminogruppe in einer Aminosäure-Seitenkette, wie Lysin, Ornithin, 4-Aminophenylalanin (4Aph) oder einer verlängerten Kettenversion davon, wie 4-Aminohomophenylalanin (4Ahp) gebildet. GnRH-Antagonisten mit solchen bedeutenden modifizierten oder unnatürlichen Aminosäuren in der 5. und 6- Position entfalten gute biologische Potenz und solche die auf 4Aph basieren, werden im allgemeinen als bevorzugt angesehen. Eines das insbesondere bevorzugt ist, ist Azalin B, d. h. [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, 4Aph(atz)&sup5;, D-4Aph(atz)&sup6;, ILys&sup8;, D-Ala¹&sup0;]-GnRH. Das US-Patent-Nr. 5 506 207 offenbart biopotente GnRH-Antagonisten, wobei Amino-substituierte Phenylalanin-Seitenketten des Restes in der 5- und 6-Position acyliert sind; ein besonders potentes Decapeptid ist Acylin, d. h. [Ac-D-2Nal¹, D- 4ClPhe², D-3Pal³, 4Aph(Ac)&sup5;, D-4Aph(Ac)&sup6;, ILys&sup8;, D-Ala¹&sup0;]-GnRH.
- Abgesehen von den attraktiven Eigenschaften dieser GnRH-Antagonisten wurde die Suche nach noch besseren GnRH-Antagonisten fortgesetzt, insbesondere nach solchen, die über einen langen Zeitraum biologische Wirkung entfalten und die weniger teuer formuliert werden können. Es kann häufig bedeutend sein, daß ein Peptid-Analog für sowohl kurzfristige als auch langfristige Behandlungsindikationen hinsichtlich der LH-Sekretion einen langen Aktivitätszeitraum entfalten sollten, eine Eigenschaft, die durch die Resistenz des Peptids gegen proteolytischen Enzymabbau im Körper gesteigert werden kann und verhältnismäßig wenig Histamin-Freisetzung provoziert. Zur Erleichterung der Verabreichung dieser Verbindungen an Säuger, insbesondere an Menschen, wird es zusätzlich als äußerst vorteilhaft für solche GnRH-antagonistischen Decapeptide angesehen, eine hohe Löslichkeit in Wasser bei einem normalen physiologischen pH, d. h. ungefähr pH 5 bis ungefähr pH 7,4 aufzuweisen, ohne besonders zu gelieren. Da diese Verbindungen für klinische Untersuchungen herangezogen werden, die Kosten der Herstellung darüber hinaus ein Faktor sind, und es ist zu bemerken, daß alle der obigen Peptide D-3Pal in der 3-Positign verwenden -- das eine geschützte Aminosäure erfordert, die besonders teuer zu erwerben oder zu synthetisieren ist. Ähnlich biopotente Analoga, die weniger teuer synthetisiert werden können, würden attraktiv sein, und die 3-Position ist ein Ziel zur Kostenverringerung.
- Es wurde festgestellt, daß durch die Substitution von weniger teuren Resten in der 3-Position dieser Subklasse von linearen GnRH-Antagonisten, die Cetrorelix, Antarelix, Acylin, Azalin B, Antid und andere umfassen, die Kosten verringert werden können, ohne die Biopotenz zu verringern. Diese Analoga sind nicht nur weniger teuer zu synthetisieren als Peptide, die das bisher bevorzugt D-3Pal³ enthalten, sondern außerdem wird häufig unerwarteterweise die besonders vorteilhafte Eigenschaft der Bioaktivität über einen langen Zeitraum erhalten. Im allgemeinen sind lineare GnRH- Antagonisten Decapeptide mit der folgenden Formel, eng damit verwandte Analoga und pharmazeutisch annehmbare Salze davon, weniger teuer zu synthetisieren als vergleichbare Verbindungen des Standes der Technik und weisen häufig verbesserte pharmakologische Eigenschaften auf, insbesondere Bioaktivität über einen langen Zeitraum:
- X-D-2Nal-(A)D-Phe-Xaa&sub3;-Ser-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Leu-Xaa&sub8;-Pro-Xaa&sub1;&sub0;
- wobei:
- X eine Acyl-Gruppe mit 7 Kohlenstoffatomen oder weniger als Q ist,
- wobei Q
- ist,
- wobei R H oder ein Niedrigalkyl ist,
- A 4Cl, 4F, 4Br, 4NO&sub2;, 4CH&sub3;, 4OCH&sub3;, 3,4Cl&sub2; oder CαMe4Cl ist,
- Xaa&sub3; D-Gin, Gln, D-Asn, Asn oder D-Dpr(Q) ist,
- Xaa&sub5; Tyr, Aph(Q&sub1;), Amf(Q&sub1;) oder Lys(Nic) ist, wobei Q&sub1; Q, For, Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, β-Ala(3-Amino-1,2,4-triazol), Gab(3-Amino-1,2,4- triazol), D-, L- oder D/L-Hor oder D-, L- oder D/L-Im² ist,
- Xaa&sub6; D-Aph(Q&sub2;), D-Amf(Q&sub2;), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci oder D-Pal ist, wobei Q&sub2; A, For, Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, β-Ala(3-amino-1,2,4-triazol) oder Gab(3-amino-1,2,4-triazol), D-, L- oder D/L-Hor oder D-, L- oder D/L-Imz ist,
- Xaa&sub8; Lys(ipr), Arg, Har, Har(Et&sub2;) oder Arg(Et&sub2;) ist; und
- Xaa&sub1;&sub0; D-Ala-NH&sub2;, NHCH&sub2;CH&sub3;, Gly-NH&sub2;, AzaGly-NH&sub2;, Ala-NH&sub2;, Agl-NH&sub2;, D-Agl-NH&sub2;, Agl(Me)-NH&sub2; oder D-Agl(Me)-NH&sub2; ist, vorausgesetzt, daß die α-Amino-Gruppe von Xaa&sub5; methyliert sein kann.
- Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur in vivo- oder in vitro-Diagnose eines Zustandes bereit, bei dem GnRH eine überschüssige Hormonsekretion oder Tumorwachstum verursacht, wobei das Verfahren die Verabreichung eines GnRH-Antagonistenpeptids des oben beschriebenen Typs und das Verfolgen der Hormonsekretion oder der Tumorzellproliferation umfaßt.
- Diese Antagonisten sind besonders nützlich, um die Sekretion von Gonadotropinen zu unterdrücken und als Fertilitätsregulatoren bei Menschen, da sie Aktivität über einen langen Zeitraum entfalten, als Folge des Restes der in der dritten Position des Decapeptids vorhanden ist, d. h. setzen substantiell die Unterdrückung der LH-Sekretion für mindestens ungefähr 4 Tage fort. Sie weisen ausgezeichnete Löslichkeit in wäßrigen Puffern bei physiologischen pHs auf und akzeptierbare Nebenwirkungen in bezug auf die Stimulierung der Histaminfreisetzung, d. h. besser als die GnRH-Superagonisten, die derzeit klinisch verwendet werden; sie entfalten außerdem minimale Gelbildung nach subkutaner (sk) Injektion. Diese GnRH-Antagonisten funktionieren außerdem gut in einem Anaphylaxie-ähnlichen Versuch, wobei sie ein verhältnismäßig kleinen wheal verursachen. Als Folge werden diese Peptide insbesondere bei der Verabreichung an Säuger, insbesondere Menschen, als Fertilitätsregulatoren und zur Behandlung pathologischer Zustände, wie vorzeitiger Pubertät, Hormon-abhängiger Neoplasia, Dysmenorrhöa, Endometriose, Steroid-abhängiger Tumore und anderer kurzzeitiger und langzeitiger Indikationen, die hier genannt werden, verwendet. Sie sind außerdem diagnostisch nützlich.
- Da diese GnRH-Antagonisten leicht im physiologischen pH-Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 7,4 löslich sind, können sie formuliert und in konzentrierter Form verabreicht werden, insbesondere bei einem pH zwischen ungefähr 5 und ungefähr 7. Aufgrund ihres polaren Charakters eignen sie sich besonders zur Verwendung bei Präparationen auf Basis von bekannten Copolymeren zur langsamen Freisetzung. Aufgrund der Substitutionen an der 3-Position sind diese Analoga weniger teuer herzustellen als vergleichbare Analoga, die D-Pal³ enthalten. Da viele dieser GnRH-Antagonisten wirksam LH und FSH über einen langen Zeitraum unterdrücken, sind sie besonders wirksam bei der empfängnisverhütenden Behandlung männlicher Säuger (mit der Verabreichung von Testosteron) und zur Behandlung Steroid-abhängiger Tumore.
- Über die letzten 10-12 Jahre wurden die besonderen Eigenschaften jedes der 10 Reste in der GnRH-Sequenz vom Standpunkt des Erzeugens wirksamer Antagonisten intensiv untersucht und als Folge dieser Untersuchungen wurde festgestellt, daß es verschiedene äquivalente Reste gibt, die ausgewählt werden können, und daß Substitutionen einer dieser Äquivalente für ein anderes die biologische Potenz der GnRH-Decapeptid- Antagonisten nicht bedeutendes beeinträchtigt. Solche äquivalente Substitutionen können in den erfindungsgemäßen GnRH-Antagonisten erzeugt werden.
- Z. B. gilt es im allgemeinen als akzeptiert, daß der Einschluß eines para-substituierten D-Phe oder 2,4-Dichlor-substituierten D-Phe oder D-CαMethyl-4ClPhe-Restes in der 2-Position bedeutend die GnRH-Antagonistenaktivität zunehmen läßt, die spezifische Identität des Ringsubstituenten ist von verhältnismäßig geringer Bedeutung, wenn ausgewählt aus den folgenden: Chlor, Fluor, Brom, Nitro, Methyl und Alkoxy. Solche Reste in der 2-Position werden daher als Äquivalent zu D-4ClPhe, das hier im allgemeinen verwendet wird, angesehen. Der N-Terminus ist bevorzugt N-acyliert, bevorzugt durch Acetyl (Ac), aber auch durch andere Acyl- Gruppen mit nicht mehr als 7 Kohlenstoffatomen, z. B. Formyl (For), Acrylyl (Acr), Propionyl (Pn), Butyryl (By), Valeryl (Vl), Vinylacetyl (Vac) und Benzoyl (Bz), alternativ kann eine substituierte oder unsubstituierte Carbamoyl-Gruppe vorhanden sein. Die α-Amino-Gruppe am Rest der 5-Position kann wahlweise methyliert sein, wie in dem US-Patent Nr. 5 110 904 offenbart, um die Löslichkeit in Wasser zu verbessern, aber eine solche Modifikation kann zu einer Verkürzung der Dauer der LH-Unterdrückung führen und zu einer größeren Histamin-Freisetzung. Der C-Terminus ist bevorzugt D- Ala-NH&sub2;; es können jedoch auch Gly-NH&sub2;, NHCH&sub2;CH&sub3;, AzaGly-NH&sub2;, Agl-NH&sub2;, D- Agl-NH&sub2;, Agl(Me)-NH&sub2; und D-Agl(Me)-NH&sub2; verwendet werden, da sie als bekannte Äquivalente angesehen werden.
- Wie zuvor offenbart, stellt die vorliegende Erfindung einen Stamm von GnRH-Antagonisten bereit, die im allgemeinen Verbesserungen gegenüber bekannten GnRH-Antagonisten aufweisen, und die eine Substitution in der 3-Position aufweisen, und durch die folgende Formel dargestellt sind:
- X-D-Nal-(A)D-Phe-Xaa&sub3;-Ser-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Leu-Xaa&sub8;-Pro-Xaa&sub1;&sub0;
- wobei:
- X eine Acyl-Gruppe mit 7 Kohlenstoffatomen oder weniger als Q ist,
- wobei Q
- ist,
- wobei R H oder ein Niedrigalkyl ist,
- A 4Cl, 4F, 4Br, 4NO&sub2;, 4CH&sub3;, 4OCH&sub3;, 3,4Cl&sub2; oder CαMe4Cl ist,
- Xaa&sub3; D-Gln, Gln, D-Asn, Asn oder D-Dpr(Q) ist,
- Xaa&sub5; Tyr, Aph(Q&sub1;), Amf(Q&sub1;) oder Lys(Nic) ist, wobei Q&sub1; Q, For, Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, β-Ala(3-Amino-1,2,4-triazol) oder Gab(3-Amino-1,2,4- triazol) ist,
- Xaa&sub6; D-Aph(Q&sub2;), D-Amf(Q&sub2;), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci oder D-Pal ist, wobei Q&sub2; Q, For, Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, β-Ala(3-Amino-1,2,4-triazol) oder Gab(3-Amino-1,2,4-triazol) ist,
- Xaa&sub8; Lys(ipr), Arg, Har, Har(Et&sub2;) oder Arg(Et&sub2;) ist; und
- Xaa&sub1;&sub0; D-Ala-NH&sub2;, NHCH&sub2;CH&sub3;, Gly-NH&sub2;, AzaGly-NH&sub2;, Ala-NH&sub2;, Agl-NH&sub2;, D-Agl-NH&sub2;, Agl(Me)-NH&sub2; oder D-Agl(Me)-NH&sub2; ist, vorausgesetzt, daß die α-Amino-Gruppe von Xaa&sub5; methyliert sein kann.
- Mit D-Nal ist das D-Isomer von Alanin gemeint, das durch Naphthyl am β-Kohlenstoffatom substituiert ist, d. h. auch als β-D-Nal oder 3-D-Nal bezeichnet. Bevorzugt wird D-2Nal eingesetzt, wobei die Bindung von Naphthalin an der zweiten Position der Ringstruktur ist, jedoch kann auch D-1Nal verwendet werden. D-Cpa stellt Chlor-D-Phe und D-4ClPhe dar, d. h. D-4Cpa ist bevorzugt. D-Pal stellt das D-Isomer von Alanin dar, das durch Pyridyl am β-Kohlenstoffatom substituiert ist, die Bindung ist bevorzugt an der 3-Position des Pyridin-Ringes, d. h. β-3-Pyridyl-D-Ala. D-2Pal wird als Äquivalent angesehen. Mit 4Aph ist 4NH&sub2;Phe gemeint, wobei der Amino- Substituent am Phenyl-Ring sich an der Position 4 befindet; 3NH&sub2;- Phenylalanin (3Aph) wird als dessen Äquivalent betrachtet. Mit Amf ist Phenylalanin gemeint, wobei eine Amino-Gruppe an den Phenyl-Ring durch eine Methylen-Bindung gebunden ist. Das Verbinden ist bevorzugt an der Position 4, jedoch wird 3Amf als Äquivalent betrachtet. Mit Gab ist gamma- Aminobuttersäure gemeint. Mit atz ist 3-Amino-1,2,4-triazol gemeint. 4Aph(atz) ist außerdem unter dem präziseren chemischen Namen 4-(3'-Amino- 1H-1',2',4'-triazolyl-5'-yl)aminophenylalanin bekannt. Mit Lys(Nic) ist Nε-Nicotinoyllysin gemeint, d. h. ε-Amino-Gruppe von Lys ist mit 3-Carboxypyridin acyliert. Mit Har ist Homoarginin gemeint. Mit D-Cit ist das D-Isomer von Citrullin gemeint und mit D-Hci ist das D-Isomer von Homocitrullin gemeint, das außerdem D-Nε-Carbamoyllysin genannt wird. Mit ILys oder Lys(ipr) ist Nε-Isopropyllysin gemeint, d. h. die ε-Amino-Gruppe von Lys ist alkyliert. Mit AzaGly-NH&sub2; ist NHNHCONH&sub2; gemeint. Mit Dbu ist alpha/gamma-Diaminbuttersäure gemeint und mit Dpr ist α,β-Diaminpropionsäure gemeint. Mit Agl ist α-Aminoglycin gemeint und in Agl(Me) ist die Amino-Seitenkettengruppe methyliert. Mit Cbm ist Carbamoyl gemeint und mit MeCbm ist Methylcarbamoyl oder -CONHCH&sub3; gemeint. Mit Niedrigalkyl ist C&sub1;&submin;&sub5;, bevorzugt C&sub1;&submin;&sub3;, und am meisten bevorzugt C&sub1; oder C&sub2;, d. h. Methyl (Me) oder Ethyl (Et) gemeint.
- Obgleich die bevorzugten D-Isomere zur Einführung in die Position 6 dieser GnRH-Antagonisten speziell offenbart sind, ist zu verstehen, daß als Folge der intensiven Forschung auf diesem Gebiet über die letzten zwei Jahrzehnte es viele bekannte äquivalente D-Isomere gibt. Es ist bekannt, daß Leu&sup7; durch Phe&sup7; substituiert sein kann, um GnRH-Antagonisten mit äquivalenten Eigenschaften bereitzustellen.
- Ein bevorzugter Unterstamm der GnRH-Antagonisten weist die Formel auf:
- X-D-Nal-(A)D-Phe-Xaa&sub3;-Ser-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Leu-Xaa&sub8;-Pro-Xaa&sub1;&sub0; wobei:
- X eine Acyl-Gruppe von 7 Kohlenstoffatomen oder weniger oder Q ist,
- wobei Q
- ist,
- wobei R H oder Methyl oder Ethyl ist,
- Xaa&sub3; D-Gln, Gln oder D-Dpr(Q) ist;
- Xaa&sub5; Aph(Ac), Aph(Q), Amf(Q) oder Aph(atz) ist, und
- Xaa&sub6; D-Aph(Ac), D-Amf(Q), D-Aph(Q) oder D-Aph(atz) ist.
- Ein zusätzlicher Stamm von GnRH-Antagonisten, der die erfindungsgemäßen Merkmale erfüllt, und zusätzliche Substitutionen in den Positionen 5 und 6 einschließt, weist die Formel auf:
- X-D-Nal-(A)D-Phe-Xaa&sub3;-Ser-Xaa&sub3;-Xaa&sub6;-Leu-Xaa&sub8;-Pro-Xaa&sub1;&sub0;
- wobei:
- X For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz oder Q ist,
- wobei Q
- ist, und
- R H oder ein Niedrigalkyl ist,
- A 4Cl, 4F, 4Br, 4NO&sub2;, 4CH&sub3;, 4OCH&sub3;, 3,4Cl&sub2; oder CαMe4Cl ist,
- Xaa&sub3; D-Gln, Gln, D-Asn, Asn oder D-Dpr(Q) ist,
- Xaa&sub5; Aph(Q&sub1;) oder Amf(Q&sub1;) ist, wobei Q&sub2; Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, Q oder
- ist;
- Xaa&sub6; D-Aph(Q&sub2;), D-Amf(Q&sub2;), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci oder D-Pal ist, wobei Q&sub2; For oder Q&sub1; ist,
- Xaa&sub8; Lys(ipr), Arg, Har, Har(Et&sub2;) oder Arg(Et&sub2;) ist; und
- Xaa&sub1;&sub0; D-Ala-NH&sub2;, NHCH&sub2;CH&sub3;, Gly-NH&sub2;, AzaGly-NH&sub2;, Ala-NH&sub2;, Agl-NH&sub2;, D-Agl-NH&sub2;, Agl(Me)-NH&sub2; oder D-Agl(Me)-NH&sub2; ist,
- vorausgesetzt, daß die α-Aminogruppe von Xaa&sub5; methyliert sein kann.
- Mit Hor ist das L-Isomer von Hydroorotsäure gemeint. Mit Imz ist L-2-Imidazolidon-4-carbonsäure gemeint. Sowohl Hör als auch Imz können als L- oder D-Isomere oder als D/L-Mischung verwendet werden.
- Ein bevorzugter Unterstamm solcher GnRH-Antagonisten weist die Formel auf:
- Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Xaa&sub3;-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-Xaa&sub1;&sub0;, wobei Xaa&sub3; D-Gln, Gln oder D-Dpr(Q) ist,
- wobei Q
- ist, und R H oder Methyl ist, und
- Xaa&sub1;&sub0; D-Ala-NH&sub2; oder ein Äquivalent ist.
- Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch klassische Peptid- Lösungssynthese synthetisiert werden und eine solche Synthese ist für große Produktmengen bevorzugt. Um geringere Mengen zu erhalten, z. B. weniger als 1 kg, kann es bevorzugt sein, sie unter Verwendung eines Festphasenverfahrens herzustellen. Ein chlormethyliertes Harz oder hydroxymethyliertes Harz kann verwendet werden, jedoch ist es bevorzugt, ein Methylbenzydrylamin (MBHA)-Harz, ein Benzydriylamin (BHA)-Harz oder ein anderes im Stand der Technik bekanntes Harz, das direkt ein C-terminales Amid nach der Spaltung bereitstellt, einzusetzen. Sollten äquivalente Peptide mit einem substituierten Amid am C-Terminus gewünscht sein, werden sie bevorzugt unter Verwendung eines N-Alkylaminomethylharzes, wie in dem US-Patent Nr. 4 569 967, herausgegeben am 11. Februat 1986, offenbart, synthetisiert. Festphasen, Kettenverlängerungssynthese wird im allgemeinen auf eine solche Art und Weise durchgeführt, daß einzelne Aminosäuren schrittweise zu der Kette gegeben werden, z. B. auf eine Art und Weise, die im Detail im US- Patent Nr. 5 296 468 beschrieben ist. Seitenkettenschutzgruppen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, werden bevorzugt als Teil einer Aminosäure, die eine besonders reaktive oder labile Seitenkette aufweist, eingesetzt, wenn sie an eine Kette gebunden wird, die an das Harz gebaut wird. Eine solche Synthese stellt ein voll geschütztes Zwischenpeptidoharz bereit.
- Ein Beispiel eines chemischen Zwischenproduktes, das verwendet werden kann, um einen GnRH-Antagonisten mit einem gewünschten Carbamoyl-enthaltenden Rest an der 3-Position zu synthetisieren, ist dargestellt durch die Formel: X¹-D-Nal-D-4ClPhe-Xaa&sub3;(X³ oder X&sup5;)-Ser(X²)-Aph(X³)-D-Aph(X³)- Leu-ILys(X&sup4;)-Pro-X&sup6;, wobei X¹ eine α-Amino-Schutzgruppe eines Typs ist, die im Stand der Technik als nützlich bekannt ist, bei der schrittweisen Synthese von Polypeptiden und wenn X in der gewünschten Peptid- Zusammensetzung eine bestimmte Acyl-Gruppe ist, wobei diese Gruppe als Schutzgruppe verwendet werden kann. Unter den Klassen von α-Amino- Schutzgruppen, die von X¹ eingeschlossen sind, sind (1) Schutzgruppen vom Acyl-Typ, wie Formyl(For), Trifluoracetyl, Phthaolyl, p-Toluolsulfonyl(Tos), Benzoyl(Bz), Benzolsulfonyl, Dithiasuccinoyl(Dts), o-Nitrophenylsulfenyl(Nps), Tritylsulfeny, o-Nitrophenoxyacetyl, Acrylyl(Acr), Chloracetyl, Acetyl(Ac) und γ-Chlorbutyryl; (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethan-Typ, wie Benzyloxycarbonyl(Z), Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc) und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl(ClZ), p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (3) aliphatische Urethan-Schutzgruppen, wie Tertbutyloxycarbonyl(Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl; (4) Schutzgruppen vom Cycloalkylurethan-Typ, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; (5) Schutzgruppen bom Thiourethan-Typ, wie Phenylthiocarbonyl, (6) Schutzgruppen vom Alkyl-Typ, wie Allyl(Aly), Triphenylmethyl(trityl) und Benzyl(Bzl); (7) Trialkylsilan-Gruppen, wie Trimethylsilan. Die bevorzugt α-Amino-Schutzgruppe ist BOG.
- X² ist eine Schutzgruppe für die Hydroxyl-Seitenkette von Ser, z. B. ist Ac, Bz, Trityl, 2,6-Dichlorbenzyl oder Benzylether(Bzl) und Bzl bevorzugt.
- X³ ist eine Schutzgruppe für eine Seitenketten-Aminogruppe von Dpr oder dgl., die nicht entfernt wird, wenn die α-Amino-Schutzgruppe oder eine andere Amino-Schutzgruppe entfernt wird. Veranschaulichende Beispiele umfassen (1) basislabile Gruppen, wie Fmoc oder andere schwach saure stabile aromatische Schutzgruppen vom Urethan-Typ, (2) Thiol-labile Gruppen, wie Dithiasuccinoyl(Dts), die durch Thiolyse entfernt oder gespalten werden können, (3) Hydrazin-labile Gruppen, wie Phthaloyl(Pht), das durch Hydrazinolyse gespalten ist, (4) nukleophile labile Gruppen, wie o-Nitrophenylsulfenyl (Nps) und dgl., die durch Thioacetamid oder durch schwache Säuren oder ihre Salze gespalten werden, (5) photolabile Gruppen, die Photolyse gespalten werden; und (6) Gruppen, die durch Reduktion selektiv entfernbar sind, wie Dts. Fmoc ist bei einer Boc SPPS-Strategie bevorzugt.
- X&sup4; ist eine säurelabile Schutzgruppe für eine primäre oder sekundäre Amino-Seitenkettengruppe, wie Z oder 2ClZ.
- X&sup5; ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe von der Amido-Gruppe von Gin, wie Xanthenyl (xan). Jedoch wird bevorzugt Gin oder Asn ohne Seitenkettenschutz in der Gegenwart von Hydroxybenzotriazol (HOBt) gebunden.
- X&sup6; kann sein D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- oder D-Agl(Me)-NH-[Harzträger] oder N(Et)-[Harzträger], X&sup6; kann außerdem ein Amit entweder von Gly oder D-Ala oder ein Niedrigalkyl-substituiertes Amid, das direkt an Pro oder AzaGly-NH&sub2; gebunden ist, sein.
- Das Kriterium zur Auswahl der Seitenkettenschutzgruppen X² bis X&sup5; ist, daß die Schutzgruppe im allgemeinen gegenüber dem Reagens bei jedem Syntheseschritt stabil ist, unter Bedingungen, die ausgewählt werden, zur Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe (bevorzugt Boc). Diese Schutzgruppen sollten im allgemeinen nicht unter den Bedingungen des Verbindens abgespalten werden, aber sollten entfernbar sein, nach dem Ende der Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz unter Bedingungen, die die Peptidkette nicht ändern. Die Schutzgruppen, die anfangs eingesetzt werden bei Aminosäuren in der 3-Position und außerdem bei Resten in der 5. und 6- Position werden bevorzugt entfernt und selektive Reaktionen werden vor der Spaltung des Endpeptids von dem Harz durchgeführt, wie hiernach erklärt wird.
- Wenn die X&sup6;-Gruppe D-Ala-NH-[Harzträger] ist, verbindet eine Amid- Bindung D-Ala an ein BHA-Harz oder an ein MBHA-Harz, dies ist gleichermaßen der Fall, wenn Agl oder D-Agl am C-Terminus verwendet wird. Wenn X&sup6; N(Et)-[Harzträger] ist, verbindet eine Amid-Bindung Pro an ein N-Alkylaminomethylharz (NAAM).
- Wenn der N-Terminus z. B. zu acetylieren ist, ist es möglich, Acetyl als X¹-Schutzgruppe für die α-Amino-Gruppe von β-D-Nal in der Position 1 einzusetzen durch Zugeben desselben zu der Aminosäure bevor sie an die Peptidkette gebunden wird, jedoch wird bevorzugt eine Reaktion mit dem Peptid-Zwischenprodukt auf dem Harz durchgeführt. Nach dem Deblockieren der α-Amino-Gruppe und während die gewünschten Seitenkettengruppen geschützt bleiben, wird die Acetylierung bevorzugt durchgeführt durch Reagieren mit Essigsäureanhydrid, alternativ wird die Reaktion mit Essigsäure durchgeführt in der Gegenwart von Diisopropyl oder Dicyclohexylcarbodiimid (Die oder DCC) oder durch eine andere geeignete Acylierungsreaktion, die im Stand der Technik bekannt ist. Ein ähnliches Verfahren wird durchgeführt, wenn eine Carbamoyl- oder substituierte Carbamoyl-Gruppe am Endterminus gewünscht wird. Wenn die von der Schutzgruppe befreiten Seitenketten Amino- Gruppen modifiziert werden, wenn der Rest ein Teil der Peptidkette ist, kann die Reaktion durchgeführt werden unter Verwendung eines geeigneten Isocyanats in der Gegenwart einer geeigneten Base, z. B. N,N-Diisopropylethylamin (DIEA), obgleich die Verwendung einer solchen Base wahlweise ist. Wenn eine unsubstituierte Carbamoyl-Gruppe im Endprodukt gewünscht wird, kann die von der Schutzgruppe befreite Amino-Seitenkette mit Benzylisocyanat, Trimethylsilylisocyanat oder tert-Butylisocyanat, wobei letztere bevorzugt ist, reagiert werden. Unter Verwendung einer solchen Strategie wird die t-Butyl-Komponente während der Entfernung der Schutzgruppe entfernt, wobei Carbamoyl als Teil einer Harnstoff-Gruppe zurückbleibt.
- Die Erfindung stellt außerdem ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines GnRH-Antagonisten bereit, das z. B. die Formel aufweist: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(MeCbm)-Ser-4Aph(Ac)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala- NH&sub2;, wobei das Verfahren umfaßt (a) Bilden eines Zwischenpeptids mit der Formel: Boc-Ser(X²)-4Aph(X³)-D-4Aph(X³)-Leu-ILys(X&sup4;)-Pro-X&sup6;, wobei X² Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für eine Hydroxyl-Gruppe von Ser ist, X³ eine basenlabile, Hydrazin-labile oder andere geeignete labile Schutzgruppe für eine Amino-Gruppe ist, X&sup4; eine säurelabile Schutzgruppe für eine Amino- Seitenkette ist, X&sup6; ein D-Ala-NH-[Harzträger] ist, (b) Entfernen von X³ von 4Aph und D-4Aph und Reagieren der von der Schutzgruppe befreiten primären Amino-Gruppen mit Essigsäureanhydrid, (c) Beenden der Kettenverlängerung, um das Zwischenprodukt X¹-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(X³)-Ser(X²)-3Aph(Ac)-D- 4Aph(Ac)-Leu-ILys(X&sup4;)-Pro-X&sup6;, wobei X¹ eine α-Amino-Schutzgruppe ist, (d) Entfernen von dem Rest X³ der 3-Position, um die Seitenkette der primären Amino-Gruppe dieses Aminosäure-Restes des Zwischenpeptids zu entfernen, (e) Reagieren dieser von der Schutzgruppe befreiten primären Amino-Gruppe der Seitenkette mit Methylisocyanat; (f) Acylieren des N-Terminus und (g) Abspalten jeder verbliebenen Schutzgruppe und/oder Abspalten vom Harzträger, der in X&sup6; eingeschlossen ist.
- Die Reinigung des Endpeptids kann durch Ionenaustauscherchromatographie, Trennungschromatographie oder unter Verwendung von HPLC, wie im Stand der Technik bekannt ist, siehe J. Rivier, et al., J. Chromatography, 288, 303-328 (1984) und C. Miller und J. Rivier, Biopolymers (Peptide Science), 40, 265-317 (1996) bewirkt werden.
- Die erfindungsgemäßen GnRH-Antagonisten werden bei Mengen von weniger als 100 ug/kg Körpergewicht als wirksam angesehen, wenn sie subkutan ungefähr am Mittag des Proestrus subkutan verabreicht werden, um die Ovulation in weiblichen Ratten zu unterdrücken. Zur längeren Unterdrückung der Ovulation ist es notwendig, Dosierungsmengen im Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 2,5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht zu verwenden. Die Antagonisten halten die Spermatogenese auch wirksam an, wenn sie an männliche Säuger auf einer regulären Basis verabreicht werden und können folglich als Verhütungsmittel verwendet werden. Da diese Verbindungen die Testosteron-Gehalte verringern und folglich Libido (eine ungewünschte Konsequanz eines normal sexuell aktiven Mannes) bedeuten, kann es wünschenswert sein, Testosteron-Dosierungen ersatzweise zusammen mit dem GnRH- Antagonisten zu verabreichen, um Azoospermia oder Haarwachstum zu erreichen, während die Libido beibehalten wird. Diese Antagonisten können außerdem verwendet werden, um die Herstellung von Gonadotropinen und Sexsteroiden zu regulieren und für andere langzeitige oder kurzzeitige Indikationen, wie hier zuvor angezeigt ist, und sie können bei Veterinäranwendungen als Verhütungsmittel für Haustieres eingesetzt werden.
- Die erfindungsgemäß bereitgestellten Peptide sind besonders löslich bei physiologischen pHs und können als verhältnismäßig konzentrierte Lösungen zur Verabreichung, insbesondere zur subkutanen Injektion, hergestellt werden. Diese Peptide werden vom Körper gut toleriert und tendieren nicht dazu, ein Gel zu bilden, wenn sie subkutan in wirksamen Konzentrationen verabreicht werden. Im allgemeinen können pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Peptide einschließen, und ein geeigneter pharmazeutisch annehmbarer Träger iv, ip, subkutan oder dgl. in Mengen von zwischen ungefähr 0,001 mg bis ungefähr 2,5 mg/kg Körper pro Tag verabreicht werden, wobei 0,5 mg/kg/Tag im allgemeinen ausreicht.
- Die in geeigneter Weise geschützten D- oder L-Hydroorotyl-enthaltenden, Carbamoyl-enthaltenden und/oder D- oder L-Imidazolidon-carbonylenthaltenden Aminosäuren können synthetisiert werden und anschließend bei einer Peptid-Synthese zur Kettenverlängerung eingesetzt werden. Eine gleichermaßen gültige Synthese wird bewirkt durch anfängliches Einführen eines geeigneten geschützten 4Aph-, 4Amf- oder Dpr-Restes an der gewünschten Position in dem Peptid-Zwischenprodukt und dies kann ein Laborverfahren der Wahl sein, bei dem nur kleine Mengen anfangs gewünscht sind. Sie wird vollendet durch anschließendes Entfernen der Schutzgruppen des bestimmten Restes (entweder sofort oder an die Synthese anschließend) und anschließendes Reagieren der von der Schutzgruppe befreiten Seitenketten- Aminogruppe mit dem gewünschten Reagens.
- Die Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele weiter beschrieben.
- Es wird festgestellt, daß das Peptid mit der Formel: Ac-D-2Nal-D- 4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nie)-D-Lys(Nie)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; (Antid) sehr gute biologische Eigenschaften als GnRH-Antagonist entfaltet, sowie das Peptid, das jetzt als Acylin bezeichnet wird und sich von Antid nur in der 5- und 6-Position unterscheidet. Es wurde jetzt festgestellt, daß bei Erzeugung bestimmter Substitutionen an der 3-Position dieses Decapaptids oder anderer GnRH-Antagonisten mit bekannter Potenz ein GnRH-Antagonist erhalten werden kann, der weniger teuer herzustellen ist und/oder der eine bessere Bioaktivität in vivo über eine Zeitspanne entfaltet.
- Das folgende Decapeptid [D-Dpr(MeCbm)³]-Acylin oder alternativ [Ac-D- 2Nal¹, D-4Cpa², D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(Ac)&sub5;, D-4Aph(Ac)&sup6;, ILys&sup8;, D-ala¹&sup0;]-GnRH (Peptid Nr. 1) wird durch Festphasensynthese synthetisiert. Dieses Peptid hat die folgende Formel:
- Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-4Aph(Acetyl)-D- 4Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2;.
- Ungefähr 9,3 g (0,54 mmol/g) MBHA-Harz (Bachern) wurden anfangs verwendet und Boc-geschütztes D-Ala wurde an das Harz über einen Zeitraum von 8 Stunden in Dimethylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon (NMP)/CH&sub2;Cl&sub2; unter Verwendung von ungefähr 10 mmol Boc-Derivat und Diisopropylcarbodiimid (DIC) und wasserfreiem 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) als Aktivierungs/Verbindungsreagenzien gebunden. Der D-Ala-Rest ist mit dem MBHA-Rest durch eine Amid-Bindung verbunden.
- Nach dem Verbinden jedes Aminosäurerestes wurde gewaschen, deblockiert und anschließend die nächste Aminosäure gebunden, gemäß dem folgenden manuellen Syntheseplan für ungefähr 0,5 bis 1 g Ausgangsharz:
- Der obige Plan wird verwendet zum Binden jeder Aminosäure des erfindungsgemäßen Peptids nachdem die erste Aminosäure angehängt worden ist. Nα-Boc-Schutz wurde für jede Aminosäure verwendet, die über die Synthese hinweg angehängt wurde. NαBoc-β-D-2Nal wurde gemäß einem im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt, z. B. wie im Detail im US- patent Nr. 4 234 571, herausgegeben am 18. November 1980 beschrieben; es ist außerdem im Handel erhältlich von SyntheTech Oregon USA. Die primären Seitenketten-Aminogruppen von 4Aph an der 5-Position und von D-4Aph an der 6-Position wurden durch Fmoc geschützt. Benzylether (Bzl) wurde als Seitenkettenschutzgruppe für die Hydroxyl-Gruppe von Ser verwendet, jedoch kann Ser ohne Seitenkettenschutz gebunden werden. Nα-Boc-Lys(ipr,Z) wurde am Rest der 8-Position verwendet.
- Nach der Zugabe von Ser am Rest der 4-Position als Nα-Boc-Ser(Bzl) lag das folgende Zwischenprodukt vor: Boc-Ser(Bzl)-4Aph(Fmoc)-D-4Aph(Fmoc)- Leu-Lys(ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA-Harzträger]. Die Fmoc-Schutzgruppen wurden von beiden Resten entfernt durch aufeinanderfolgende Behandlungen mit 25% Piperidin in DMF (10 ml) jeweils ungefähr 15 Minuten lang. Nachdem bevorzugt das Peptidoharz mit DMF gewaschen wurde, wurden die neu befreiten Amino-Gruppen mit einem großen Überschuß Essigsäureanhydrid bei Raumtemperatur 30 Minuten behandelt oder bis zur Beendigung, wie unter Verwendung eines Ninhydrin-Testes festgestellt, um beide Seitenketten zu acetylieren. Das Peptidoharz wurde anschließend standardgewaschen mit MeOH und DCM.
- Nach der Vollendung der Acetylierung der 4Aph und D-4ApH-Rest- Seitenketten wurde NαBoc, Nβ-Fmoc-geschütztes D-Dpr an die Kette als Rest in der 3-Position gebunden. Nach dem Binden des Restes wurde der Boc-Schutz entfernt und die beiden letzten Reste wurden anschließend hinzugefügt, um die Kette abzuschließen. Nach dem Deblockieren der α-Amino-Gruppe am N- Terminus unter Verwendung Trifluoressigsäure (TFA) wurde die Acetylierung unter Verwendung eines großen Überschusses an Essigsäureanhydrid in Dichlormethan (DCM) oder DMF über 30 Minuten hinweg erreicht. Durch den Beginn mit einer geeigneten großen Menge des Harzes können Teile des Peptidoharz-Zwischenproduktes zu diesem Zeitpunkt entfernt werden, um in drei hiernach beschriebenen parallelen Synthesen verwendet zu werden.
- Auf die Acetylierung des N-Terminus folgend, werden ungefähr 500 mg Peptidoharz mit 25% Piperidin behandelt, um selektiv die D-Dpr Seitengruppe von der Schutzgruppe zu befreien. Das zum Teil von der Schutzgruppe befreite Peptidoharz wird anschließend mit Methylisocyanat in der Gegenwart von 2,7 mmol DIEA, einer geeigneten Base, in 10 ml DMF 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt, um den Methylcarbamoyl-substituierten Rest zu bilden.
- Das Peptidoharz wird getrocknet und anschließend werden die Spaltung des Peptids von dem Harz und die Entfernung der Schutzgruppe der Ser- und Lys-Seitenketteen bei ungefähr 0ºC mit 15 ml HF und Anisol (0,5 ml) als Radikalauffänger ungefähr 1,5 Stunden durchgeführt. Nach der HF-Entfernung unter Vakuum wird das Harz zweimal mit 100 ml Ethylether gewaschen. Das gespaltene Peptid wird mit 0,2% TFA in 25% CH&sub3;CN/H&sub2;O extrahiert, das Verfahren wird wiederholt, wobei jedesmal 100 ml verwendet werden. Die Extrakte werden zusammengeführt und lyophilisiert und sie liefern ungefähr 160 mg des rohen Peptidpulvers.
- Die Reinigung des Peptids wird anschließend bewirkt durch präparative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrter Phase (RP-HPLC), wie im Stand der Technik bekannt und insbesondere beschrieben in J. Rivier, et al., J. Chromatography, 288, 303-328 (1984). Die erste präparative RP-HPLC- Trennung verwendet einen Gradienten-TEAP (Triethylammoniumphosphat)- Puffersystem und eine Endtrennung wird unter Verwendung eines 0,1%igen TFA (Trifluoressigsäure)-Gradienten durchgeführt, wie im Detail in dem J. Chromatography-Artikel beschrieben.
- Das Peptid (ungefähr 51 mg) wird als im wesentlichen homogen bewertet unter Verwendung von Kapillarzon-Elektrophorese (CZE) und die Reinheit wird auf ungefähr 100% geschätzt. Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Peptids ist mit der Formel der erstellten Struktur konsistent. Das durch flüssige sekundäre Ionen-Massenspektrometrie (LSIMS) bestimmte Molekulargewicht wird auf 1527,8 Da gemessen, das mit der erwarteten Masse von 1527,8 Da dieses Peptids übereinstimmt.
- Die Hydrophilie wurde untersucht durch Messen der Retentionszeit unter Verwendung von RP-HPLC mit einem Gradienten von 40% Puffer B bis 70% Puffer B über 30 Minuten, mit Puffer A, der TEAP, pH 7,0 ist und Puffer B, der 70% CH&sub3;CN ist und 30% Puffer A bei pH 7,0. Das Peptid Nr. 1 ist hydrophiler als Acylin, wobei es ungefähr 1,8 Minuten vor Acylin eluiert. Seine Löslichkeit in wäßrigen Puffern bei eimem pH von ungefähr 5 bis ungefähr 7 und seine Beständigkeit in vivo gegenüber Gelbildung, zusammen mit seiner langandauernden Biopotenz, zirkulierende LH-Werte zu unterdrücken, wie hiernach beschrieben wird, macht es dazu, daß es sich besonders eignet für die Verabreichung durch subkutane Injektion im Vergleich zu anderen Verbindungen mit vergleichsweise vergleichbarer biologischer Wirksamkeit, die kurzzeitig wirken.
- Das Peptid wird hiernach als Peptid Nr. 1 bezeichnet und wird in vivo untersucht, um zu bestimmen, wie wirksam es die Absonderung von LH in Ratten unterdrückt. Die Messung der zirkulierenden LH-Werte in kastrierten männlichen Sprague-Dawley-Ratten, die subkutan mit dem Peptid behandelt wurden, wurden durchgeführt wie in C. Rivier et al. Biol. Reproduc., 1983, 29, 374-378 berichtet wird. Die Peptide wurden zunächst bei einer Konzentration von 1,0 oder 10 mg/ml in Bakterienwachstums-hemmenden Wasser gelöst und anschließend in 0,04 M Phosphatpuffer, der 0,1% BSA enthält, verdünnt. Anschließende Verdünnungen wurden mit Phosphatpuffer durchgeführt. Die Peptide wurden sk injiziert und Blutproben (300 ul) wurden unter Metotan-Anästhesie gesammelt. Die Sera (50 ul) wurden auf LH- Werte doppelt untersucht unter Verwendung von Reagenzien, die durch das National Pituitary and Hormone Distribution Program der NIDDK bereitgestellt wurden. Die Untersuchung zeigt, daß eine Dosis von 50 ug Peptid pro Ratte, in den ersten 3 Tagen die LH-Sekretion auf Werte unterdrückt, die weniger als 50% der Kontrollwerte betragen, wobei die Werte ungefähr die gleichen wie die LH-Werte sind, die Ratten aufweisen, die auf gleiche Weise mit einer Dosis von 50 ug Acylin injiziert wurden. 96 Stunden nach der Injektion betrugen die LH-Werte ungefähr 75% derer der Acylin- injizierten Ratten. Die Untersuchung der Ratten zeigt, daß das Peptid sehr gut toleriert wurde, wobei keine signifikante Gelbildung zum Injektionszeitpunkt nachweisbar war.
- Die Erfahrung, die von der Untersuchung einer großen Zahl von GnRH- Antagonisten gewonnen wurde, zeigt, daß ein Peptid, das eine solch lang wirkende Unterdrückung von LH entfaltet vollständig die Ovulation bei einer Dosis von 2,5 ug unterdrücken würde, wenn es in vivo in reifen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten untersucht wird.
- Ein Teil des Peptidoharz-Zwischenproduktes, das in Beispiel 1 synthetisiert wurde, wurde verwendet, um [D-Dpr(Cbm)³]-Acylin zu bilden. Nach der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe von der Seitenkette des D-Dpr- Restes, wie in Beispiel 1, wurde das Zwischenprodukt mit t-Butylisocyanat ungefähr 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die Spaltung des Harzes und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, was zu der Entfernung von t-Butyl führt, wobei die Carbamoyl-Gruppe, die an der Amino-Seitenkette des D-Dpr- Restes substituiert ist, zurückbleibt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D- Dpr(Carbamoyl)-Ser-4Aph(Acetyl)-D-4Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D- Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 2) wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Es wird als im wesentlichen homogen beurteilt und seine Reinheit wird auf größer als 98% geschätzt. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1513,7 Da, was in Übereinstimmung mit der berechneten Masse von 1513,7 Da steht. Den HPLC- Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als das Peptid Nr. 1 ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Rattentest, wie in Beispiel 1, zeigt, daß bei einer Dosis von 50 ug das Peptid bioaktiv ist, wobei es ungefähr genauso wirksam in der LH-Unterdrückung ist wie das Peptid Nr. 1.
- Ein Teil des Peptidoharz-Zwischenproduktes, das in der in Beispiel 1 gezeigten Synthese hergestellt wird, wird hier zur Bildung von [D-Dpr(EtCbm)³]-Acylin verwendet. Nach der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe von Seitenkette des D-Dpr-Restes, wie in Beispiel 1, wurde das Zwischenprodukt mit Ethylisocyanat ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Gegenwart von DIEA behandelt, um eine Ethylharnstoff-Gruppe mit der Amino- Seitenkette des D-Dpr-Restes zu bilden. Die Spaltung des Harzes und die Entfernung der Schutzgruppe gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D- Dpr(Ethylcarbamoyl)-Ser-4Aph(Acetyl)-D-4Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro- D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Es wurde als im wesentlichen homogen angesehen und seine Reinheit wurde auf größer als 98% geschätzt. MS-Analyse zeigt eine Masse von 1541,4 Da, was in Übereinstimmung mit der berechneten Masse von 1541,8 Da steht. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid ungefähr so hydrophil ist wie Acylin.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Rattenrest, wie in Beispiel 1, zeigt, daß bei einer Dosierung von 50 ug das Peptid bioaktiv ist, wobei es ungefähr genauso wirksam in der LH-Unterdrückung ist wie das Peptid Nr. 2.
- Ein weiterer Teil des Peptidoharz-Zwischenproduktes, das in Bei¬ spiel 1 hergestellt wurde, wird verwendet, um das Decapeptid [D-Dpr(iprCbm)³]-Acylin zu bilden. Nach der Entfernung der Fmoc- Schutzgruppe von der Seitenkette des D-Dpr-Restes, wie in Beispiel 1, wurde das Zwischenprodukt mit Isopropylisocyanat ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Gegenwart von DIEA behandelt, um eine Isopropylharnstoff-Gruppe mit der Aminoseitenkette des D-Dpr-Restes zu bilden. Die Spaltung von dem Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Isopropylcarbamoyl)-Ser-4Aph(Acetyl)-D-4Aph(Acetyl)- Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Es wurde als im wesentlichen homogen angesehen und seine Reinheit wurde auf größer als 95% geschätzt. Die MS-Analyse zeigte eine Masse von 1555,5 Da, was in Übereinstimmung mit der berechneten Masse von 1555,8 Da steht.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Rattentest, wie in Beispiel 1, zeigt, daß bei einer Dosierung von 50 ug das Peptid bioaktiv ist, wobei es zwei Tag so wirksam ist, wie Acylin. Nach 3 Tagen ist es weniger wirksam als Acylin bei der LH-Unterdrückung.
- Die Synthese, die in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde allgemein verwendet, um ein Decapeptid-Zwischenprodukt zu bilden, wobei D-Dpr-, 4Aph- und D-4Aph-Reste alle durch Fmoc geschützt blieben. Nach der Acetylierung des N-Terminus und dem Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen von den drei Seitenketten, wie in Beispiel 1, wurde das Zwischenprodukt mit Methylisocyanat ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur in der Gegenwart von DIEA behandelt, um Methylharnstoff-Gruppen mit dem drei Amino-Seitenketten zu bilden. Die Spaltung von dem Harz und das Entfernen der Schutzgruppen, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser- 4Aph(Methylcarbamoyl)-D-4Aph(Methylcarbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala- NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Es wurde als im wesentlichen homogen und hydrophiler als Acylin angesehen.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-Assay, wie in Beispiel 1, zeigt, daß bei einer Dosierung von 50 ug das Peptid bioaktiv ist und ungefähr so wirksam wie Acylin bei der LH-Unterdrückung ist.
- Eine Analog des Peptids Cetrorelix mit der Formel Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D- Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde unter Verwendung der Synthese, wie im allgemeinen in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert. Anstatt des Verbindens von Nα-Boc-D-1Aph und 4Aph in der 6- und 5-Position, wurde NαBoc-D-Cit in der 6-Position und NαBoc-Tyr(2BrZ) in der 5-Position gebunden. NαBoc-Arg(Tos) wurde anstatt von NαBoc-Lys(ipr,Z) gebunden. Alternativ wurden Nα-Boc-D-Orn(Fmoc) in der 6-Position gebunden und die Kettenverlängerung wurde vorübergehend angehalten, gefolgt von der Zugabe von Boc-Tyr(2BrZ) in der 5-Position, unter Erhalt des folgenden Peptid-Zwischenproduktes:
- Boc-Tyr(2BrZ)-D-Orn(Fmoc)-Leu-Arg(Tos-Pro-D-Ala-NH-[MBHA-Harzträger]. Die Amino-Seitenketten des Orn-Restes wurden anschließend durch Entfernen des Fmoc-Schutzes von der Schutzgruppe befreit, wie in Beispiel 1, und das Zwischenprodukt wurde mit überschüssigem t-Butylisocyanat in DMF ungefähr 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt, um mit der Seitenkette des Orn- Restes zu reagieren. Die Vervollständigung der Synthese des Decapeptid- Zwischenproduktes wurde anschließend wie in Beispiel 1 durchgeführt, gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette und der Reaktion mit Methylisocyanat.
- Das Peptidoharz wurde anschließend einer Standartwaschung unterworfen und die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 3) wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten.
- Das Peptid wurde hydrophiler als Acylin und mit einer längeren Dauer der in vivo LH-Unterdrückung als Cetrorelix angesehen.
- Die Synthese wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde wiederholt, wobei NαBoc-D-Hci für NαBoc-D-Cit und ILys&sup8; für Arg&sup8; ersetzt wurde, um ein Analog des Decapeptids Antarelix zu synthetisieren. Nach der Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette, wurde die Umsetzung mit Methylisocyanat durchgeführt. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-β-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-Tyr-D- Hci-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten.
- Dieses Peptid besaß die gleiche Fähigkeit die in vivo LH-Sekretion zu unterdrücken wie das Peptid Nr. 3.
- Ein Analog des Peptids Antid mit der Formel Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D- Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-Lys(Nicotinoyl)-D-Lys(Nicotinoyl)-Leu-Lys(ipr)- Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde unter Verwendung der Synthese synthetisiert, die in Beispiel 1 von US-Patent Nr. 5 169 935 beschrieben ist, wobei NαBoc-C- Dpr(Fmoc) für D-3Pal ersetzt wurde. Nach der Beendigung der Synthese des Decapeptid-Zwischenproduktes wurde die Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette und die Umsetzung mit Methylisocyanat wie in Beispiel 1 durchgeführt.
- Das Peptidoharz wurde anschließend standardgemäß gewaschen und daraufhin wurde die Spaltung des Harzes und die Entfernung der Schutzgruppen, gefolgt von der Reinigung wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser- Lys(Nic)-D-Lys(Nie)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 4) wurde bei RP-HPLC-Reinigung erhalten. Das Peptid entfaltet eine längere Unterdrückung der LH-Sekretion in vivo als Antid.
- Ein Analog des Peptids Azalin B mit der Formel Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D- Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-4Aph(atz)-D-4Aph(atz)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; wird unter Verwendung der Synthese synthetisiert, wie sie in Beispiel VIII des US-Patentes Nr. 5 269 468 beschrieben ist. Anstatt des Bindens von NαBoc-D- 3Pal an der 3-Position wird NαBoc-D-Dpr(Fmoc) gebunden. Nach der Beendigung der Synthese des Decapeptid-Zwischenprodukts wurde die Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette und die Umsetzung mit Methylisocyanat wie in Beispiel durchgeführt.
- Das Peptid wurde anschließend standardgemäß gewaschen und die Spaltung vom Harz, das Entfernen der Schutzgruppe und die darauffolgende Reinigung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-4Aph(atz)-D-4Aph(atz)-Leu-ILys- Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 5) wurde bei RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin und entfaltet eine längere Unterdrückung der LH-Sekretion in vivo als Azalin B.
- Ein Analog des Peptids Antid [D-Dpr(Methylcarbamoyl)³, 4Aph(Gab)atz)&sup5;, D-4Aph(Gab)(atz)&sup6;]-Antid wurde unter Verwendung der Synthese, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, synthetisiert. Nach dem Binden von NαBoc-D-4Aph(Fmoc) und NαBoc-4Aph(Fmoc) in der 6- und 5-Position wurde die Kettenverlängerung zeitweilig angehalten und die Reaktion mit der seitengeschützten γ-Aminobutteräsure (Gab) durchgeführt, gefolgt von dem Einbauen der Triazol-Modifikationen, wie es in Beispiel 1 des US-Patents Nr. 5 506 207 beschrieben ist. Auf die Beendigung der Synthese des Decapeptid-Zwischenproduktes folgend wurde die Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette und die Umsetzung mit Methylisocyanat wie in Beispiel 1 durchgeführt.
- Das Peptidoharz wurde anschließend standardgemäß gewaschen und die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen gefolgt von der Reinigung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-4Aph(Gab)(atz)-D- 4Aph(Gab)(atz)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 5A) wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Antid und enfaltet eine längere Unterdrückung der LH-Sekretion in vivo als Acylin.
- Ein weiteres Analog des Peptids Antid [D-Dpr(Methylcarbamoyl)³, 4Aph(β-Ala)(atz)&sup5;, D-4Aph(β-Ala)(atz)&sup6;]-Antid wurde unter Verwendung der in Beispiel 5A beschriebenen Synthese durchgeführt. Anstatt der Umsetzung der Seitenketten-Aminogruppen von D-4Aph und 4Aph in der 6- und 5-Position mit Gab wurde die Anfangsreaktion mit NαFomc-β-Ala durchgeführt. Der Rest der Synthese war gleich. Auf die Beendigung der Synthese des Decapeptid- Zwischenproduktes folgend wurde die Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr- Seitenkette und die Reaktion mit Methylisocyanat wie in Beispiel 1 durchgeführt.
- Das Peptidoharz wurde anschließend standardgemäß gewaschen und die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-4Aph(β-Ala)(atz)-D-4Aph(β- Ala)(atz)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 5B) wurde bei der RP-HPLC- Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Antid und entfaltet eine längere Unterdrückung der LH-Sekretion in vivo als Antid.
- Ein weiteres Analog des Peptids Antid [D-Dpr(Methylcarbamoyl)³, 4Aph(For)&sup5;, D-4Aph(For)&sup6;]-Antid wurde unter Verwendung der Synthese, die allgemein im Beispiel 1 beschrieben ist, durchgeführt. Anstatt der Umsetzung der Seitenketten-Aminogruppen von D-4Aph und 4Aph in der 6- und 5-Position mit Essigsäureanhydrid wurde die Reaktion mit einer Mischung aus Ameisensäure und Essigsäureanhydrid durchgeführt. Nach Beendigung der Synthese des Decapeptid-Zwischenproduktes wurde die Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette und die Reaktion mit Methylisocyanat wie in Beispiel 1 durchgeführt.
- Das Peptidoharz wurde anschließend standardgemäß gewaschen und die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-4Aph(For)-D-4Aph(For)-Leu-ILys- Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 5C) wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Das Peptid entfaltet eine längere Unterdrückung der LH-Sekretion in vivo als Antid.
- Das Analog [D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin wurde wie allgemein in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert. D-4Aph an der 6-Position wurde vor der Zugabe zu der NαBoc-4Aph(Fmoc)-Kette acetyliert. Auf die Entfernung der Schutzgruppe der 4Aph-Seitenkette folgend wurde die Reaktion mit Hydroorotsäure (C&sub4;N&sub2;H&sub5;(O)&sub2;COOH) in der Gegenwart von DIC und HOBt in DMF ungefähr 8 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Beendigung der Synthese, die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen gefolgt von der Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(MeCbm)-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 99% geschätzt wurde, die MS-Analyse zeigte eine Masse von 1625,5 Da, die sich gut mit der erwarteten Masse von 1625,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Das Untersuchen dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug 2 Tage im wesentlichen so aktiv die LH weiter unterdrückt wie Acylin und nach 3 Tagen zeigt es eine LH-Unterdrückung auf Werte, die unter denen von Acylin liegen.
- Das Analog [D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Aph(Hor)&sup6;]-Acylin wurde wie allgemein in Beispiel 5D dargelegt, synthetisiert. Die Reste an der 6- Position D-4Aph und der 5-Position 4Aph wurden gleichzeitig umgesetzt. Auf die Entfernung der Schutzgruppen der beiden 4Aph-Seitenketten folgend, wurde die Reaktion mit Hydroorotsäure durchgeführt und die Beendigung der Synthese, die Spaltung vom Harz, die Entfernung der Schutzgruppen und die Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 5D durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Hor)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und wurde als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 95% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigte eine Masse von 1735,5 Da, die sich gut mit der erwarteten Masse von 1735,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosierung von mindestens 50 ug nach 1, 2 und 3 Tagen im wesentlichen so aktiv die LH-Werte unterdrückt wie Acylin und wird als langwirkend angesehen.
- Das Analog [D-Dbu(MeCbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin wird allgemein wie in Beispiel 5D dargelegt, synthetisiert, wobei NαBoc-D-Dbu(Fmoc) durch NαBoc-D-Dpr(Fmoc) ersetzt wurde. Die Beendigung der Synthese, die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen gefolgt von der Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dbu(MeCbm)-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Acetyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Die Verbindung ist hinsichtlich der Unterdrückung der LH-Sekretion bioaktiv.
- Das Analog [D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cmb)&sup6;]-Acylin wurde wie im allgemeinen in Beispiel 5D dargelegt, synthetisiert, wobei NαBoc-D- 4Amf(Fmoc) durch NαBoc-D-4Aph(Fmoc) am Rest der 6-Position ersetzt wurde und anschließend das Umsetzen seiner von der Schutzgruppe befreiten Seitenkette mit t-Butylisocyanat vor der Zugabe von NαBoc-4Aph(Fmoc). Die Beendigung der Synthese, die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(MeCbm)-Ser- 4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Die Verbindung ist hinsichtlich der Unterdrückung der LH-Sekretion bioaktiv.
- Die Synthese, die in Beispiel 1 dargelegt ist, wurde wiederholt, um das Peptid [D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(Cbm)&sup5;, D-4Aph(Cbm)&sup6;]-Antid zu bilden. Anstatt des Reagierens der Seitenketten-Aminogruppen von 4Aph und D-4Aph mit Essigsäureanhydrid wurden beide mit t-Butylisocyanat reagiert, wobei die Boc-Entfernung anschließend die weitere Verlängerung der Peptidkette erlaubt. Auf die Acetylierung des N-Terminus und der anschließenden Entfernung der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette folgend wurde die Reaktion mit Methylisocyanat durchgeführt. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt und führen zu der Entfernung der t-Butyl-Komponenten. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(Methylcarbamoyl)- Ser-4Aph(Carbamoyl)-D-4Aph(Carbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 98% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigte eine Masse von 1529,9 Da, die sich gut mit der erwarteten Masse von 1529,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß bei einer Dosis von 50 ug es im wesentlichen so lange wirkt wie Acylin.
- Eine Synthese, wie sie im allgemeinen in Beispiel 5G dargelegt ist, wurde durchgeführt, um das Peptid [D-Dpr(Cbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]- Antid zu bilden. Die Seitenketten-Aminogruppe von D-4Amf wurde mit t-Butylisocyanat umgesetzt. Nach der Boc-Entfernung wurde NαBoc-4Aph(Fmoc) zu der Peptidkette gegeben. Nach der Fmoc-Entfernung wurde die Umsetzung mit Hydroorotsäure durchgeführt. Auf die Acetylierung des N-Terminus und dem anschließenden Entfernen der Schutzgruppe der D-Dpr-Seitenkette folgend wurde die Reaktion mit t-Butylisocyanat durchgeführt. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen, gefolgt von der Reinigung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D- Dpr(Carbamoyl)-Ser-4Aph(L-Hydroorotyl)-D-4Amf (Carbamoyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist bei der Unterdrückung der LH-Sekretion bioaktiv.
- Das Peptid-Analog [D-Gln³]-Acylin wurde unter Verwendung der allgemein in Beispiel 1 dargelegten Synthese synthetisiert. Anstatt des Bindens von NαBoc-D-Dpr(Fmoc) an der 3-Position wurde in Nα-Boc-D-Gln verwendet. Wahlweise wurden NαBoc-D-Gln(Xan) verwendet, jedoch wurde bevorzugt D-Gin ohne Seitenkettenschutz gebunden. Auf die Synthese des Decapeptid-Zwischenproduktes folgend wurde das Peptidoharz standardgemäß gewaschen, anschließend wurden die Spaltung des Harzes und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Aph(Ac)-D-4Aph(Ac)- Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 7) wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Es wurde als im wesentlichen homogen angesehen und seine Reinheit wurde auf größer als 99% geschätzt. Die LSIMS-Analyse zeigte eine gemessene Masse von 1512,9 Da, was in Übereinstimmung mit der berechneten Masse von 1512,7 Da dieses Peptids steht. Bei der Untersuchung auf Unterdrückung der LH-Sekretion in vivo, wie in Beispiel 1, entfaltet das Peptid über 3 Tage ungefähr die gleiche Bioaktivität wie Acylin.
- Das Analog [D-Gin³, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin wurde wie allgemein in den Beispielen 5D und 7 dargelegt synthetisiert. Das D-4Aph an der 6-Position wurde vor der Zugabe der Kette von NαBoc-4Aph(Fmoc) acetyliert. Auf die Entfernung der Schutzgruppe der 4Aph-Seitenkette folgend wurde eine Reaktion mit Hydroorotsäure wie in Beispiel 5D durchgeführt. Auf die Beendigung der Synthese und Reinigung folgend wurde das Peptid Ac-D-2Nal-D- 4Cpa-D-Gln-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D- Ala-NH&sub2; bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 95% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1610,9 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1610,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Das Untersuchen dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten- Unterdrückungstest zeigt, daß es 1, 2 und 3 Tage bei einer Dosis von 50 ug im wesentlichen so aktiv die LH-Werte unterdrückt wie Acylin und nach ungefähr 96 Stunden zeigt es eine Unterdrückung von LH auf Werte, die gut unter von Acylin sind. Es wird als sehr lang wirkend angesehen.
- Die Synthese wie sie in Beispiel 7 dargelegt ist, wurde wiederholt, um ein Peptid zu bilden, wobei D-Gln(Me)³ mit D-Gln³ ersetzt wurde. Eine einfache Substitution von NαBoc-D-Gln(Me) durch NαBoc-D-Gln kann verwendet werden. Alternativ wird auf die Zugabe von Boc-D-Glu(OFm) und die Entfernung der Fluorenylmethylester-Seitenkettenschutzgruppe folgend eine Reaktion mit NH&sub2;CH&sub3;·HCl in Gegenwart von DIEA und BOP (Benzotriazoyl-N- oxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat) durchgeführt, um N-Methylamid zu bilden. Die Spaltung vom Harz and die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln(Methyl)-Ser-4Aph(L- Hydroorotyl)-D-4Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 98% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1624,8 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1624,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug im wesentlichen so lange wirkt wie Acylin; es ist 3 Tage gleichpotent und bis zum Tag 4 etwas weniger wirksam.
- Die Synthese, die in Beispiel 7A dargelegt ist, wurde wiederholt, wobei NαBoc-D-4Amf(Fmoc) durch NαBoc-D-4Aph(Fmoc) ersetzt wurde und anschließend seine von der Schutzgruppe befreite Seitenkette mit t-Butylisocyanat vor der Zugabe von NαBoc-4Aph(Fmoc) umgesetzt wurde. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Aph(L-Hydroorotyl)-D-4Amf(Carbamoyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 98% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1625,8 Da, was sich gut mit der erwarteten Massen von 1625,8 Da bergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Das Untersuchen dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug 2 bis 3 Tage im wesentlichen so wirksam wie Acylin ist.
- Die Synthese von Beispiel 7C wurde im allgemeinen verfolgt, um [N-MeCbm-D-2Nal¹, D-Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Antid herzustellen, jedoch wurde der Fmoc-Schutz von 4Aph nicht entfernt bis der N-Terminus modifiziert worden ist. Auf das Entfernen der Schutzgruppe des N-Terminus folgend, wurde die α-Amino-Gruppe mit Methylisocyanat umgesetzt. Dann wurde der Fmoc-Schutz entfernt und 4Aph mit L-Hydroorotsäure wie in Beispiel 7A umgesetzt. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid N-Methylcarbamoyl-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Aph(L- Hydroorotyl)-D-4Amf(Carbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 99% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigte eine Masse von 1640,8 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1640,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug für 2 bis 3 Tage im wesentlichen so wirksam ist wie Acylin.
- Die Synthese, die in Beispiel 7C dargelegt ist, wurde wiederholt, wobei Methylisocyanat durch t-Butylisocyanat bei der Durchführung der Reaktion mit der von der Schutzgruppe befreiten Seitenkette von D-4Amf durchgeführt wurde. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe gefolgt von der Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Aph(L- Hydroorotyl)-D-4Amf(Methylcarbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 99% geschätzt wurde. Die MS- Analyse zeigt eine Masse von 1639,7 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1639,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung des Peptids in dem Standard in vivo-LH-Unterdrückungstest zeigt, daß es für 2 bis 3 Tage bei einer Dosis von 50 ug im wesentlichen so wirksam ist wie Acylin.
- Die Synthese, die in Beispiel 7C dargelegt ist, wurde wiederholt, wobei Nα-Boc-4-Amf(Fmoc) für NαBoc-4Aph(Fmoc) ersetzt wurde, um das Analog [D-Gln³, 4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;-Antid zu bilden. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D- 2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Amf(L-Hydroorotyl)-D-4Amf(Carbamoyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Propyl-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 98% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1639,7 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1639,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Das Untersuchen dieses Peptids im den Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug so wirksam bleibt und nach 4 Tagen etwas besser ist als Acylin.
- Die Synthese, die in Beispiel 7D dargelegt ist, wurde wiederholt, wobei D-Hydroorotsäure durch L-Hydroorotsäure in der Reaktion mit der von Schutzgruppe befreiten Seitenkette von 4Aph ersetzt wurde, um das Analog [N-MeCbm-D-2Nal¹, D-Gin³, 4Aph(D-Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Antid zu bilden. Sollte ein alternatives Protokoll verwendet werden, bei dem das Peptidoharz die Hydroorotyl-Gruppe enthalten würde, wenn die die Reaktion mit einem Isocyanat stattfindet, wird die Base, z. B. DIEA nicht zugegeben und nur 3 Äquivalente des bestimmten Isocyanats werden eingesetzt. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid N-Methylcarbamoyl-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Aph(D-Hydroorotyl)-D- 4Amf(Carbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC- Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 98% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigte eine Masse von 1640,7 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1640,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standart in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug kurzwirkend ist, fast so wirksam wie Acylin für einen Tag und anschließend verhältnismäßig schnell seine Wirksamkeit verliert.
- Die Synthese, die in Beispiel 7D dargelegt ist, wurde wiederholt, wobei L-Imz durch L-Hydroorotsäure in der Reaktion mit der von der Schutzgruppe befreiten Seitenkette von 4Aph ersetzt wurde, um das Analog [N-MeCbm-D-2Nal¹, D-Gln³, 4Aph(Imz)&sup5;, D-4-Amf(Cbm)&sup6;]-Antid zu bilden. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppen, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid N-Methylcarbamoyl-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Aph(Imz)-D-4Amf(Carbamoyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin und ist 2 bis 3 Tage bei der LH-Unterdrückung im wesentlichen so wirksam wie Acylin.
- Die Synthese, die in Beispiel 7F dargelegt ist, wurde wiederholt, wobei Methylisocyanat durch t-Butylisocyanat bei der Durchführung der Reaktion mit von der Schutzgruppe befreiten Seitenkette von D-4Amf durchgeführt wurde, um das Analog [D-Gln³, 4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(MeCbm)&sup6;]- Antid zu bilden. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln-Ser-4Amf(L-Hydroorotyl)-D- 4Amf(Methylcarbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 98% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1653,7 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1653,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Das Untersuchen dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug für 3 Tage im wesentlichen so wirksam ist wie Acylin und bis zum Tag 4 wirksam bleibt.
- Die Synthese, die in Beispiel 7A dargelegt ist, wurde wiederholt, wobei Nα-Boc-4Amf (Fmoc) durch NαBoc-4Aph(Fmoc) ersetzt wurde, um das Analog [D-Gln³, 4Amf(Hor)&sup5;]-Acylin zu bilden. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Gln- Ser-4Amf(L-Hydroorotyl)-D-4Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf größer als 99% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1624,8 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1624,8 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug fast so wirksam ist wie Acylin, sowohl nach 3 als auch nach 4 Tagen.
- Das Analog [D-Asn³, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin wurde wie allgemein in Beispiel 7A dargelegt, synthetisiert, außer daß NαBoc-D-Asn anstatt von Nα- Boc-D-Gln verwendet wurde. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Asn-Ser-4Aph(Hor)- D-Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC- Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf ungefähr 99% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigte eine Masse von 1596,9 Da, was sich gut mit der erwarteten Masse von 1596,7 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug 2 Tage im wesentlichen so aktiv die LH-Werte unterdrückt wie Acylin und nach 3 Tagen zeigt es eine LH-Unterdrückung auf Werte unter denen von Acylin.
- Das Analog [D-Asn³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin wurde wie allgemein in Beispiel 7K dargelegt, synthetisiert, außer daß D-4Amf als Rest der 6-Position verwendet wurde. Nach dem Entfernen der Schutzgruppe von D-4Amf wurde es mit t-Butylisocyanat umgesetzt vor der Entfernung von Boc, um die Kette zu verlängern. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Asn-Ser- 4Aph(Hor)-D-Amf(Cbm)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Das Peptid ist bei der Unterdrückung der Sekretion von LH bioaktiv.
- Das Peptid [Gln³]-Acylin wurde synthetisiert durch Wiederholen der in Beispiel 7 dargelegten Synthese, wobei NαBoc-Gln an der 3-Position anstatt von NαBoc-D-Gln gebunden wurden. Das Peptid Ac-D-(2Nal-D-4Cpa-Gln-Ser- 4Aph(Ac)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH&sub2; (Peptid Nr. 8) wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Es wurde als im wesentlichen homogen angesehen und seine Reinheit wurde auf größer als 99% geschätzt. Die LSIMS-Analyse zeigt eine gemessene Masse von 1512,7 Da, was in Übereinstimmung mit der berechneten Masse von 1512,7 Da dieses Peptids steht. Das Peptid entfaltet ungefähr über den gleichen Zeitraum Bioaktivität wie Acylin, wenn es in vivo auf die Unterdrückung der LH-Sekretion, wie in Beispiel 1, untersucht wurde, wobei es über 4 Tage ungefähr gleich zu Acylin ist. Es wurde als langwirkend betrachtet.
- Das Analog [Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin wurde wie in Beispiel 7A dargelegt, synthetisiert, wobei ein NαBoc-Gln durch NαBoc-D-Gln ersetzt wurde. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Gln-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Acetyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten und als im wesentlichen homogen angesehen, wobei seine Reinheit auf ungefähr 99% geschätzt wurde. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1610,7 Da, was sich gut mit der berechneten Masse von 1610,87 Da vergleichen läßt. Den HPLC-Ergebnissen ist zu entnehmen, daß dieses Peptid hydrophiler als Acylin ist.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Ratten-LH- Unterdrückungstest zeigt, daß es bei einer Dosis von 50 ug über 4 Tage im wesentlichen so aktiv die LH-Werte unterdrückt wie Acylin in der Unterdrückung. Es wird als langwirkend angesehen.
- Die in Beispiel 7A dargelegte Synthese wurde wiederholt um ein Peptid zu bilden, wobei Gln(Me)³ durch D-Gln³ ersetzt wurde. Eine einfache Ersetzung von NαBoc-D-GlnMe) durch NαBoc-D-Gln wurde durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Gln(Methyl)-Ser-4Aph(L-Hydroorotyl)-D-4Aph(Acetyl)- Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin. Bei einer Dosis von 50 ug wirkt es im wesentlichen so lange wie Acylin.
- Die in Beispiel 8A dargelegte Synthese wurde wiederholt, wobei NαBoc- D-4Amf(Fmoc) durch NαBoc-D-4Aph(Fmoc) ersetzt wurde und seine von der Schutzgruppe befreite Seitenkette mit t-Butylisocyanat anschließend umgesetzt wurde. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Gln-Ser-4Aph(L-Hydroorotyl)-D- 4Amf(Carbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC- Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin. Es wird im wesentlichen homogen angesehen und seine Reinheit wird auf größer als 99% geschätzt. Die MS-Analyse zeigt eine Masse von 1625,6 Da, was in Übereinstimmung mit der berechneten Masse von 1625,8 Da steht.
- Die Untersuchung dieses Peptids in dem Standard in vivo-Rattentest, wie in Beispiel 1, zeigt, daß bei einer Dosis von 50 ug das Peptid bioaktiv ist, wobei es 24 Stunden ungefähr so wirksam ist wie Acylin. Nach 2 Tagen ist es etwas weniger wirksam als Acylin bei der LH-Unterdrückung und seine Wirksamkeit sinkt danach schnell.
- Die in Beispiel 8C dargelegte Synthese wurde wiederholt, wobei Methylisocyanat durch t-Butylisocyanat bei der Durchführung der Reaktion mit der von der Schutzgruppe befreiten Seitenkette von D-4Amf ersetzt wurde. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden anschließend wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Gln-Ser-4Aph(L-Hydroorotyl)-D- 4Amf(Methylcarbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP- HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin. Bei einer Dosis von 50 ug ist es 2 bis 3 Tage im wesentlichen so wirksam wie Acylin.
- Die in Beispiel 8C dargelegte Synthese wurde wiederholt, wobei NαBoc-4Amf(Fmoc) durch NαBoc-4Aph(Fmoc) ersetzt wurde, um das Peptid [Gin, 4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Antid zu bilden. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Gln-Ser- 4Amf(L-Hydroorotyl)-D-4Amf(Carbamoyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin. Bei einer Dosis von 50 ug ist es über 4 Tage ungefähr so wirksam wie Acylin.
- Die in Beispiel 8E dargelegte Synthese wurde wiederholt, wobei Methylisocyanat durch t-Butylisocyanat ersetzt wurde bei der Durchführung der Reaktion mit der von der Schutzgruppe befreiten Kette von D-4Amf. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Gln-Ser-4Amf(L-Hydroorotyl)-D-4Amf(Methylcarbamoyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin. Bei einer Dosis von 50 ug ist es 3 Tage im wesentlichen so wirksam wie Acylin.
- Die in Beispiel 8A dargelegte Synthese wurde wiederholt, wobei ein NαBoc-4Amf(Fmoc) durch NαBoc-4Aph(Fmoc) ersetzt wurde, um das Analog [Gln³, 4Amf(Hor)&sup5;]-Acylin zu bilden. Die Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe, gefolgt von der Reinigung wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Gln-Ser-4Amf(L- Hydroorotyl)-D-4Aph(Acetyl)-Leu-Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin. Bei einer Dosis von 50 ug ist es über 3 Tage ungefähr so wirksam wie Acylin.
- Die in Beispiel 7A dargelegte Synthese wurde wiederholt, um ein Peptid zu bilden, woebei Asn³ durch D-Gln³ ersetzt wurde. Eine einfache Substitution von NαBoc-Asn durch NαBoc-D-Gln wurde verwendet. Das Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Asn-Ser-4Aph(L-Hydroorotyl)-D-4Aph(Acetyl)-Leu- Lys(Isopropyl)-Pro-D-Ala-NH&sub2; wurde bei der RP-HPLC-Reinigung erhalten. Dieses Peptid ist hydrophiler als Acylin. Bei einer Dosis von 50 ug wirkt es im wesentlichen so lange wie Acylin.
- Unter den in den Beispielen 1 bis 8 allgemein dargelegten Verfahren wurden die folgenden GnRH-Antagonisten-Peptide außerdem hergestellt:
- [Acr-D-2Nal¹, 4FD-Phe², D-Dpr(MeCbm)³]-Acylin
- [Bz-D-2Nal¹, 4NO&sub2;D-Phe², D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [For-D-2Nal¹, 4OCH&sub3;D-Phe², D-Dpr(MeCbm)³, 4Amf(Hor)&sup5;]-Acylin
- [Bz-D-2Nal¹, 4BrD-Phe², D-Dpr(MeCbm)&sup5;, D-4Aph(Imz)&sup6;]-Acylin
- [Pn-D-2Nal¹, 4CH&sub3;D-Phe², D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(MeCbm)&sup5;]-Acylin
- [By-D-2Nal¹, 3,4Cl&sub2;D-Phe², D-Dpr(MeCbm)³, 4Aph(Cbm)&sup5;]-Acylin
- [Vl-D-2Nal¹, 4NO&sub2;D-Phe², D-Gln³, D-4Aph(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [Vac-D-2Nal¹, CαMe&sub4;ClD-Phe², D-Gln&sub3;, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [Pn-D-2Nal¹, D-Gln³, 3Aph(Imz)&sup5;, D-3Amf(Hor)&sup6;, Agl¹&sup0;]-Antid
- [Acr-D-2Nal¹ D-Gln&sup5;, 4Ahp(Hor)&sup5;, Arg&sup8;, D-Agl(Me)¹&sup0;]-Acylin
- [MeCbm-D-2Nal¹, D-Gin³, 4Aph(Cbm)&sup5;, Agl(Me)¹&sup0;]-Acylin
- [Cbm-D-2Nal¹, D-Dpr(MeCbro)³, 4Amf(MeCbm)&sup5;, D-Agl¹&sup0;]-Acylin
- [EtCbm-D-2Nal¹, D-Dpr(MeCbm)³, 4Amf(iprCbm)&sup5;, Pro&sup9;NHCH&sub2;CH&sub3;]- Acylin
- [Acr-D-2Nal¹, D-Gln³, 4Aph(Imz)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;, Ala¹&sup0;]-Antid
- [Cbm-D-2Nal¹, D-Dpr(Cbm)³, 4Aph(MeCbm)&sup5;, Arg(Et&sub2;)&sup8;]-Acylin
- [D-Dpr(Cbm)³, 4Ahp(Hor)&sup5;, D-4Ahp(Imz)&sup6;, D-Agl¹&sup0;]-Antid
- [Ac-D-1Nal¹, D-Gln³, 3Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(Hor)&sup6;, Arg&sup8;]-Antid
- [PrCbm-D-2Nal¹, D-Gln³, D-3Aph(EtCbm)&sup6;, Pro&sup9;NHCH&sub2;CH&sub3;]-Acylin
- [D-Dpr(MeCbm)³, 4Amf(Hor)&sup5;, AzaGly¹&sup0;]-Antid
- [D-Dpr(Cbm)³, 4Amf(Hor)&sup5;, D-Cit&sup6;, Har&sup8;]-Acylin
- [D-Dpr(EtCbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Aph(D-Imz)&sup6;, Gly¹&sup0;]-Antid
- [D-Dpr(Cbm)³, D-Hci&sup6;, Agl(Me)¹&sup0;]-Antid
- [D-Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-2Pal&sup6;, Har&sup8;, Ala¹&sup0;]-Antid
- [D-Dpr(Cbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Aph(For)&sup6;, D-Agl(Me)¹&sup0;]-Antid
- [D-Dpr(EtCbm)³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Aph(atz)&sup6;, Har(Et&sub2;)&sup8;]-Antid
- [D-Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Aph(iprCbm)&sup6;, D-Agl¹&sup0;]-Antid
- [For-D-1Nal¹, D-Dpr(EtCbm)³, 4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(atz)&sup6;]-Antid
- Diese Peptide sind bei der Hemmung der LH-Sekretion biopotent.
- Unter Verwendung der in den Beispielen 1 bis 8 und dem US-Patent Nr. 5 491 217 allgemein dargelegten Verfahren wurden außerdem die folgenden GnRH-Antagonisten-Peptide hergestellt.
- [D-Dpr(MeCbm)³, NαMe4Aph(Ac)&sup5;]-Acylin
- [D-Dpr(Cbm)³, NαMe4Aph(Ac)&sup5;]-Acylin
- [D-Dpr(EtCbm)³, NαMe4Aph(Ac)&sup5;]-Acylin
- [D-Dpr(iPrCbm)³, NαMe4Aph(Ac)&sup5;]-Acylin
- [D-Dpr(MeCbm)³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [D-Dpr(MeCbm)³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-Aph(Hor)&sup6;]-Acylin
- [D-Dbu(MeCbm)³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [D-Dpr(MeCbm)³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [Dpr(MeCbm)³, NαMe4Aph(Cbm)&sup5;, D-4Aph(Cbm)6]-Acylin
- [Dpr(Cbm)³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [D-Gln³, NαMe4Aph(Ac)&sup5;]-Acylin
- [D-Gln³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [D-Gln³(Me), NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [D-Gln³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [NαMeCbm¹, D-Gln³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [D-Gln³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(MeCbm)&sup6;]-Acylin
- [D-Gln³, NαMe4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [NαMeCbm¹, D-Gln³, NαMe4Aph(D-Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [NαMeCbmD-Gln³, NαMe4Aph(Imz)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [D-Gln³, NαMe4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(MeCbm)&sup6;]-Acylin
- [D-Gln³, NαMe4Amf(Hor)&sup5;]-Acylin
- [D-Asn³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [D-Asn³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [Gln³, NαMe4Aph(Ac)&sup5;]-Acylin
- [Gln³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [Gln³(Me), NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [Gln³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [Gln³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;, D-4Amf(MeCbm)&sup6;]-Acylin
- [Gln³, NαMe4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;]-Acylin
- [Gln³, NαMe4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(MeCbm)&sup6;]-Acylin
- [Gln³, NαMe4Amf(Hor)&sup5;]-Acylin
- [Asn³, NαMe4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- Diese Peptide sind bei der Hemmung der LH-Sekretion biopotent und entfalten sehr gute Löslichkeit bei physiologischem pH.
- Unter Verwendung der in den Beispielen 1 bis 8 allgemein dargelegten Verfahren wurden die folgenden GnRH-Antagonisten-Peptide außerdem hergestellt:
- [For-D-2Nal¹, 4CH&sub3;D-Phe², Gln³, 4Amf(Hor)5]-Acylin
- [Bz-D-2Nal¹, 4BrD-Phe², Gln³, D-4Aph(Imz)&sup6;]-Acylin
- [Acr-D-2Nal¹, Gin³, 4Ahp(Hor)&sup5;, Arg&sup8;, D-Agl(Me)10]-Acylin
- [For-D-2Nal¹, 4NO&sub2;D-Phe², Gln³, D-4Aph (Cbm)&sup6;]-Acylin
- [Bz-D-2Nal¹, CαMe4ClD-Phe², Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;]-Acylin
- [Pn-D-1Nal¹, Gln³, 3Aph(Imz)&sup5;, D-3Amf(Hor)&sup6;, Agl¹&sup0;]-Antid
- [MeCbm-D-2Nal¹ Gln&sup5;, 4Aph(Cbm)&sup5;, Agl(Me)¹&sup0;]-Acylin
- [PrCbm-D-2Nal¹, Gln&sup5;, D-4Aph(EtCbm)&sup6;, Pro&sup9;NHCH&sub2;CH&sub3;]-Acylin
- [Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Aph(iprCbm)&sup6;, D-Agl¹&sup0;]-Antid
- [Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-3Pal&sup6;, Har&sup8;, Ala¹&sup0;]-Antid
- [Ac-D-1Nal¹, Gln³, 4Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(Hor)&sup6;, Arg&sup8;]-Antid
- [Gln³, 3Amf(Hor)&sup5;, D-Cit&sup6;, Har&sup8;]-Acylin
- [Gln³, 4Aph(Hor)&sup5;, D-4Aph(atz)&sup6;, Har(Et&sub2;)&sup8;]-Antid
- [For-D-1Nal¹, Gln³, 3Amf(Hor)&sup5;, D-4Amf(atz)&sup6;]-Antid
- [Acr-D-2Nal¹, Gln³, 4Aph(Imz)&sup5;, D-4Amf(Cbm)&sup6;, Ala¹&sup0;]-Antid
- Diese Biopeptide sind bei der Hemmung der LH-Sekretion biopotent.
- Die vorgenannten Verbindungen, die untersucht wurden, entfalteten vom Standpunkt der LH-Unterdrückung biologische Potenz, die sich allgemein mit der des bekannten GnRH-Antagonisten-Peptid vergleichen laßt, wobei jedes davon ein Analog ist. Als Ergebnis ausführlicher Untersuchungen auf diesem Gebiet über ein Jahrzehnt wird in diesem weit akzeptierten Test Beweis für die Biopotenz solcher Verbindungen geliefert, die Gonadotropin-Sekretion zu unterdrücken und folglich antiovulatorische und antigonodale Wirkung aufzuweisen. Auf Basis der besseren Löslichkeit, der Beständigkeit gegen die Gelbildung in vivo, die über einen langen Zeitraum dauernde Bioaktivität und anderer Eigenschaften werden die Verbindungen als allgemein nützlich zur Unterdrückung der Sekretion von Gonadotropinen und zur Hemmung der Absonderung von Steroiden durch die Gonaden, z. B. als antiovulatorische Mittel, angesehen.
- Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden häufig in Form von pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Salzen, wie Säureadditionssalzen oder Metallkomplexen, z. B. mit Zink, Barium, Calcium, Magnesium, Aluminium oder dgl. (die als Additionssalze zum Zweck dieser Anwendung betrachtet werden) oder Kombinationen von zwei davon verabreicht. Beispiel solcher Additionssalze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Oxalat, Fumarat, Gluconat, Tannat, Pamoat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Alginat, Malat, Ascorbat, Tartrat und dgl.; Acetat und Pamoat, das Salz der Pamoinsäure, können bevorzugt sein. Wenn der aktive Bestandteil in Tablettenform verabreicht wird, kann die Tablette einen pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Verdünner enthalten, der ein Bindemittel, wie Tragacanth, Maisstärke oder Gelatine umfaßt, ein Aufschlußmittel, wie Algininsaure und ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat. Wenn die Verabreichung in flüssiger Form gewünscht ist, können Süßstoffe und/oder Geschmacksstoffe als Teil des pharmazeutisch annehmbaren Verdünners verwendet werden, und intravenöse Verabreichung in isotoner Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferten Lösungen oder dgl. können bewirkt werden.
- Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten im allgemeinen eine wirksame Menge des Peptids in Verbindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner. Allgemein liegt die Dosis bei ungefähr 10 bis ungefähr 2,5 mg des Peptids pro kg Körpergewicht des Wirtes, wenn es intravenös gegeben wird. Die Beschaffenheit dieser Verbindungen kann die wirksame orale Verabreichung erlauben, jedoch können die oralen Dosierungen höher sein. Insgesamt wird die Behandlung von Subjekten mit diesen Peptiden im allgemeinen auf die gleiche Art und Weise durchgeführt, wie diese klinische Behandlung unter Verwendung anderer Antagonisten von GnRH, wobei ein geeigneter Träger verwendet wird, in dem die Verbindung löslich ist und eine Dosis verabreicht wird, die ausreicht, um die LH- und FSH-Werte in dem Patienten zu unterdrücken.
- Es kann außerdem wünschenswert sein, das GnRH-Analog über einen längeren Zeitraum abzugeben, z. B. über einen Zeitraum von einer Woche bis zu einem Jahr bei einer einzelnen Verabreichung, und langsame Freisetzungs-, Depot- oder Implantat-Dosierungsformen können eingesetzt werden.
- Diese Verbindungen können an Säuger intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, perkutan, intranasal, intrapulmonär, intrarektal oder intravaginal allgemein verabreicht werden, um die Sekretion von Gonadotropinen zu unterdrücken, z. B. um die Fertilitätshemmung zu erreichen und/oder zu kontrollieren und außerdem in Anwendungen, die nach einer umkehrbaren Unterdrückung der gonadalen Aktivität suchen, wie das Mangement vorzeitiger Pubertät oder während der Bestrahlung oder Chemotherapie. Sie werden außerdem zur Behandlung von Steroid-abhängigen Tumoren verwendet. Die wirksamen Dosierungen hängen von der Verabreichungsform und der speziellen Art des Säugers, der behandelt wird, ab. Ein Beispiel einer typischen Dosierungsform ist eine Bakterien-wachstumshemmende Wasserlösung bei einem pH von ungefähr 6, enthaltend das Peptid, wobei die Lösung parenteral verabreicht wird, um eine wirksame Dosis im Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 2,5 mg/kg Körper pro Tag bereitzustellen. Diese Verbindungen werden als in vivo gut toleriert angesehen und widerstehen der Gelbildung, folglich werden sie als besonder gut geeignet zur Verabreichung durch subkutane Injektion in einer Bakterien-wachstumshemmenden Wasserlösung bei geeigneten Konzentrationen, über ungefähr 0,75 mg/ml und sogar über ungefähr 1,0 mg/ml angesehen, ohne daß die Gefahr der Gelbildung zum Injektionszeitpunkt besteht.
- Diese GnRH-Antagonisten-Peptide sind außerdem diagnostisch nützlich, sowohl in vivo als auch in vitr. Diese Peptide können in vivo injiziert werden, gefolgt von der Untersuchung des Blutstromes eines Patienten, um das Ausmaß der Verringerung der hormonalen Sekretion, z. B. LH-Sekretion zu bestimmen. Die in vitro-Assays können durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob bestimmte Tumorzellen empfindlich auf GnRH reagieren. In solchen Assays werden Tumorzellkulturen mit den GnRH-Antagonisten-Peptiden behandelt und anschließend die Sekretionen von Hormonen und die Zellproliferation verfolgt.
- Obgleich die Erfindung hinsichtlich seiner bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist zu berücksichtigen, daß Änderungen und Modifikationen, die für den Fachmann offensichtlich sind, durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, der durch die Ansprüche dargelegt ist, abzuweichen. Z. B. kann alternativ bei der Synthese ein Isocyanat mit der Aminoseitenkette umgesetzt werden vor der Bindung der α- Amino-geschützten Aminosäure in die Peptidkette und nicht das Modifizieren desselben während es ein Teil der Kette ist. Wohingegen der N-Terminus nicht substituiert sein kann oder andere äquivalente Acylierungs-Gruppen verwendet werden können, ist entweder Acetyl oder substituiertes oder unsubstituiertes Carbamoyl bevorzugt. Anstatt von 4Aph(Ac) kann die AmioPhe-Gruppe mit alternativen Acylierungsmitteln behandelt werden, wie sie dem US-Patent Nr. 5 506 207 offenbart sind, wie Ameisensäure, β-Ala(atz) und gamma-Aminobuttersäure(atz), was wie in den Beispielen angedeutet gleichermaßen zu GnRH-Antagonisten führt, die über einen langen Zeitraum eine Wirkung entfalten, folglich werden diese als Äquivalente zu jeweils D- und L-4Aph(Ac) angesehen. Anstatt von Aph oder D-Aph, können Ahp(Aminohomophenylalanin) oder D-Ahp jeweils an der 5- und 6-Position verwendet werden. Sowohl Lys(Bu) als auch Lys(Et&sub2;) werden als Äquivalente von ILys angesehen, sowie auch Arg, Arg(Et&sub2;), Har und Har(Et&sub2;), jedoch ist ILys am meisten bevorzugt. Andere hydrophobe Aminosäure-Reste können an der 1-Position und an der 6-Position eingesetzt werden (wie zuvor erwähnt wurde) bevorzugt in der D-Isomerform und werden als Äquivalente zu den spezifizierten angesehen. Anstatt von D-Ala-NH&sub2; am C-Terminus können als ein Äquivalent D-Ala-ol oder Ala-ol verwendet werden. Darüber hinaus können die Antagonisten in der Form ihrer pharmazeutisch oder Veterinär annehmbaren nicht-toxischen Salze, wie zuvor angedeutet, sein, die als Äquivalente betrachtet werden.
Claims (13)
1. Lineares GnRH-Antagonistenpeptid mit der Formel:
X-D-Nal-(A)D-Phe-Xaa&sub3;-Ser-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Leu-Xaa&sub8;-Pro-Xaa&sub1;&sub0;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei:
X eine Acylgruppe von 7 Kohlenstoffatomen oder weniger oder Q,
wobei
ist,
wobei R H oder ein Niedrigalkyl (C&sub1;-C&sub5;) ist, darstellt;
A 4Cl, 4F, 4Br, 4NO&sub2;, 4CH&sub3;, 4OCH&sub3;, 3,4Cl&sub2; oder CαMe&sub4;Cl ist;
Xaa&sub3; D-Gin, Gin, D-Asn, Asn oder D-Dpr(Diamin-Propionsäure)(Q) ist;
Xaa&sub5; Tyr, Aph(Aminophenylalanin)(Q&sub1;), Amf(Aminomethylphenylalanin)(Q&sub1;) oder
Lys(Nic) ist, wobei Q&sub1; Q, For, Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, β-Ala(3-amino-
1,2,4-triazol), Gab(3-amino-1,2,4-triazol),
ist;
Xaa&sub6; D-Aph(Q&sub2;), D-Amf(Q&sub2;), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci oder D-Pal ist,
wobei Q&sub2; unabhängig eines der Mitglieder aus Q&sub1; ist;
Xaa&sub8; Lys(ipr), Arg, Har, Har(Et&sub2;) oder Arg(Et&sub2;) ist; und
Xaa&sub1;&sub0; D-Ala-NH&sub2;, NHCH&sub2;CH&sub3;, Gly-NH&sub2;, AzaGly-NH&sub2;, Ala-NH&sub2;, Agl-NH&sub2;,
D-Agl-NH&sub2;, Agl(Me)-NH&sub2; oder D-Agl(Me)-NH&sub2; ist;
vorausgesetzt, daß die α-Aminogruppe von Xaa&sub5; methyliert werden kann
und daß Phe&sup7; für Leu&sup7; substituiert sein kann.
2. GnRH-Antagonistenpeptid nach Anspruch 1, wobei:
X Formyl, Acetyl, Acrylyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Vinylacetyl,
Benzoyl oder Q ist;
Xaa&sub5; APn(Q&sub1;) oder Amf(Q&sub1;) ist, wobei Q&sub1; Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, Q
oder
ist;
Xaa&sub6; D-Aph(Q&sub2;), D-Amf(Q&sub2;), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci oder D-Pal ist,
wobei Q&sub2; For, Ac, 3-Amino-1,2,4-triazol, Q oder
ist; wobei Q, A, Xaa&sub3;, Xaa&sub8; und Xaa&sub1;&sub0; wie in Anspruch 1 definiert
sind.
3. GnRH-Antagonistenpeptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
X-D-Nal-D-Xaa&sub3;-Ser-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Leu-Lys(ipr)-Pro-D-Ala-NH&sub2;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei:
X eine Acylgruppe mit 7 Kohlenstoffatomen oder weniger oder Q ist,
wobei Q
ist,
wobei R H oder Methyl oder Ethyl ist;
Xaa&sub3; D-Gin, Gin oder D-Dpr(Q) ist;
Xaa&sub5; Aph(Ac), Aph(Q), Amf(Q) oder Aph(atz) ist; und
Xaa&sub6; D-Aph(Ac), D-Amf(Q), D-Aph(Q) oder D-Aph(atz) ist.
4. GnRH-Antagonist nach Anspruch 1 oder 2, wobei X Ac ist, Xaa&sub5;
4Aph(Q&sub1;) oder 4Amf(Q&sub1;) ist, Xaa&sub6; D-4Aph(Q&sub2;) oder D-4Amp(Q&sub2;) ist, Xaa&sub8;
Lys(ipr) ist und Xaa&sub1;&sub0; D-Ala-NH&sub2; ist.
5. GnRH-Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Xaa&sub5;
4Aph(Ac) ist und Xaa&sub6; D-4Aph(Ac) ist oder Xaa&sub5; 4Aph(atz) und Xaa&sub6;
D-4Aph(atz) ist.
6. GnRH-Antagonist nach Anspruch 1 oder 2, wobei Xaa&sub5; Tyr ist und
Xaa&sub6; D-Cit ist, oder Xaa&sub5; Lys(Nic) ist und Xaa&sub6; D-Lys(Nic) ist, oder Xaa&sub5;
Tyr ist und Xaa&sub6; D-Hci ist.
7. GnRH-Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Xaa&sub3;
D-Gin ist.
8. GnRH-Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Xaa&sub3;
Gin ist.
9. GnRH-Antagonist nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Xaa&sub3;
D-Dpr(Q) ist und R H, Me oder Et ist.
10. GnRH-Antagonist nach Anspruch 1 mit den folgenden Formeln:
Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(MeCbm)-Ser-4Aph(Ac)-D-4Aph(Ac)-Leu-Lys(ipr)-Pro-D-
Ala-NH&sub2;; Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-Dpr(MeCbm)-Ser-4Aph(Cbm)-D-4Aph(Cbm)-Leu-
Lys(ipr)-Pro-D-Ala-NH&sub2; und Ac-D-2Nal-D-4Cpa-Xaa&sub3;-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-
Leu-Lys(ipr)-Pro-D-Ala-NH&sub2;, wobei Xaa&sub3; D-Gin oder Gln ist.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung der Absonderung von
Gonadotropinen bei Säugern umfassend als aktiven Bestandteil eine wirksame
Menge eines GnRH-Antagonisten nach einem der vorstehenden Ansprüche in
Verbindung mit einem nicht-toxischen Verdünnungsmittel.
12. Verwendung eines GnRH-Antagonisten nach einem der
vorhergehenden Ansprüche bei der Herstellung einer Präparation zur Verwendung bei
der in vivo oder in vitro Diagnose eines Zustands, bei dem GnRH eine
überschüssige hormonale Sekretion oder Tumorwachstum verursacht, wobei bei der
Diagnose der GnRH-Antagonist verabreicht wird und die hormonale Sekretion
oder die Tumorzellanhäufung verfolgt wird.
13. Verwendung einer pharmazeutischen Verbindung nach Anspruch 11
zur Herstellung einer Substanz oder Zusammensetzung zur Verwendung bei der
Hemmung der Sekretion von Gonadotropinen bei Säugern durch Verabreichung
einer wirksamen Menge davon, die eine wesentliche Verringerung der LH- und
FSH-Werte bewirkt.
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