DE69118056T2

DE69118056T2 - Anticoagulatorische Zusammensetzung aus LACI und sulfatierten Polysacchariden

Info

Publication number: DE69118056T2
Application number: DE69118056T
Authority: DE
Inventors: Tze-Chein Wun
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1990-08-27
Filing date: 1991-08-26
Publication date: 1996-10-24
Anticipated expiration: 2011-08-27
Also published as: PT98779B; ES2085462T3; EP0473564A1; EP0473564B1; IE913004A1; DK0473564T3; JPH0733336B2; GR3020312T3; ATE135585T1; CA2049873A1; JPH04257524A; CA2049873C; PT98779A; DE69118056D1

Description

Diese Erfindung betrifft eine antikoagulatorische Kombination von LACI und sulfatisierten Polysacchariden und insbesondere eine Kombination von LACI und Heparin oder ähnlichen derartigen antikoagulatorischen sulfatisierten Polysacchariden, die eine synergistische Antikoagulationswirkung im Vollplasma ausüben.
Die Blutgerinnung kann über den intrinsischen oder den extrinsischen Weg aktiviert werden. Der intrinsische Weg beginnt mit der Kontaktphase, welche die Wechselwirkung von Faktor XII, Kallikrein, Kininogen mit hohem Molekulargewicht, einer fremden Oberfläche und Faktor XI involviert. Das Produkt dieser Reaktion, Faktor XIa, führt Faktor IX in Faktor IXa über, welcher in der Folge Faktor X in Anwesenheit von aktiviertem Faktor VIII, Phospholipid und Calcium zu Faktor Xa hydrolisiert. Alternativ beginnt der extrinsische Weg, wenn Plasma-Faktor VII/VIIa an Gewebsfaktor (TF; Thromboplastin) bindet, um einen Komplex zu bilden, welcher die Faktoren IX und X proteolytisch aktiviert. Sobald Faktor Xa über den intrinsischen oder extrinsischen Weg gebildet wird, kann er Faktor Va, Phospholipid und Calcium binden, um den Prothrombinase-Komplex zu bilden, welcher Prothrombin in Thrombin überführt. Schließlich bewirkt Thrombin die Bildung des Fibringerinnsels.
Bei klinischen Zuständen wurde Heparin in großem Umfang als Antikoagulans verwendet. Die Antikoagulationswirkung von Heparin ist großteils eine direkte Folge seiner katalytischen Wirkung auf die Inhibierung von Thrombin durch Antithrombin 111, und in einem geringeren Ausmaß seiner katalytischen Wirkung auf die Inhibierung anderer Koagulations-Proteasen durch Antithrombin 111, einschließlich der Faktoren XIIa, XIa, IXa, Xa und Kallikrein (1-4). In Abwesenheit von Heparin inhibiert Antithrombin III Faktor VIIa (5-8) nicht. Es wurde berichtet, daß Faktor VIIa in Anwesenheit von Heparin gegen eine Inhibition resistent war (6), oder zu 50% durch Antithrombin III in 11 min (7), 75-90 min (8) oder 6 Stunden (5) inhibiert wurde. Somit ist die Geschwindigkeit der Faktor VIIa-Inhibition durch Antithrombin III so langsam, daß Antithrombin III wahrscheinlich kein physiologischer Regulator des TF/Faktor VII-Weges in Anwesenheit oder Abwesenheit von Heparin ist (9). zusätzlich zur Antithrombin III-abhängigen Inhibierung von Proteasen des intrinsischen Weges kann Heparin auch eine Antikoagulationswirkung ausüben, indem es Faktor Xa und Prothrombin aus dem Prothrombinase-Komplex auf Antithrombin III-unabhängige Weise verdrängt (10, 11).
In den letzten paar Jahren hat sich Beweismaterial dafür angesammelt, daß bei der Regulierung des extrinsischen Weges vor allem ein vom Plasma abstammendes Protein, genannt Lipoproteinassoziierter Koagulations-Inhibitor (lipoprotein-associated coagulation inhibitor, LACI) (12) eine Rolle spielt. Dieses Protein wurde als Inhibitor des extrinsischen Weges (extrinsic pathway inhibitor, EPI) (13), oder Gewebsfaktor-Inhibitor (tissue factor inhibitor, TFI) (14) bezeichnet. Der Inhibitor kann mit Faktor Xa direkt einen Komplex bilden und inhibiert die TF-Aktivität durch Bildung eines inerten TF/Faktor VIIa/Faktor Xa/Ca²&spplus;/Inhibitor-Komplexes (12). Nach der Reinigung eines offensichtlich verwandten Inhibitors aus einem Hep G2-Hepatom (14), wurde die für das Protein codierende cDNA in der Folge kloniert (15). Kürzlich erzeugte die Expression von rekombinantem Protein eine große Menge an Protein für eine Verwendung in vitro und in vivo.
Die Isolierung von LACI aus den konditionierten Medien von Hep G2-Zellen, SK-Hep-1-Zellen und Chang-Leberzellen ist auch in der Europäischen Patentanmeldung EP 300988, veröffentlicht am 25. Jänner 1989, geoffenbart, und die Klonierung der für das LACI-Protein kodierenden cDNA ist ebenfalls in der Europäischen Patentanmeldung EP 318451, veröffentlicht am 31. Mai 1989, geoffenbart.
Die in Klammern angeführten Zahlen sind Hinweise auf nachstehend angeführte Literaturstellen.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue antikoagulatorische Kombination von Lipoprotein-assoziiertem Koagulations- Inhibitor (LACI) und sulfatisierten Polysacchariden. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß diese Kombination eine synergistische Antikoagulationswirkung in Vollplasma ausübt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bewirken LACI und Heparin eine stark verbesserte Antikoagulation im Vergleich zu entweder LACI oder Heparin alleine. Es wurde festgestellt, daß auch viele verwandte sulfatisierte Polysaccharide mit bekannter Antikoagulationsaktivität die LACI- abhängige Inhibierung von TF-induzierter Gerinnung verbessern. Auf das Gewicht bezogen, haben die relativen Wirksamkeiten dieser Verbindungen die folgende Reihenfolge: Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=5100) > unfraktioniertes Heparin > Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=3700) > Pentosanpolysulfat > Dermatansulfat > Dextransulfat > Heparansulfat.
Infolge des uniken Mechanismus und der Fähigkeit von LACI bei der Inhibierung von TF-induzierter Koagulation wurde LACI bisher als potentielles therapeutisches Protein zur Behandlung/Prävention thrombotischer Erkrankungen beschrieben. Die synergistische Verwendung von Heparin und LACI in Kombination, wie hierin zur therapeutischen Anwendung beschrieben, ist somit aus folgenden Gründen sehr attraktiv: erstens ist Heparin in großem Umfang erhältlich und kann die Menge an für die Behandlung benötigtem LACI durch Potenzierung der LACI-Funktion verringern; zweitens inhibieren Heparin und LACI in Kombination sowohl den intrinsischen als auch den extrinsischen Koagulationsweg; und drittens kann die Kombination bei klinischen Zuständen, bei welchen Heparin alleine nicht ausreicht, z. B. disseminierter intravaskulärer Koagulation, bei welcher TF in großen Mengen erzeugt werden kann, wirksam sein.
Die zur Inhibierung der Koagulation verwendeten Dosierungen von LACI und sulfatisierten Polysacchariden sind vorzugsweise kleine, aber wirksame Mengen zur Erzeugung eines synergistischen Antikoagulationsergebnisses. Die Verwendung von etwa 0,1 bis etwa 4 Einheiten Heparin pro ml Plasma in Kombination mit etwa 0,1 µg bis etwa 5 µg LACI pro ml Plasma ist für die synergistische Antikoagulationsaktivität bevorzugt. Zur Erzeugung einer synergistischen Antikoagulationswirkung können auch andere sulfatisierte Polysaccharide in verschiedenen Mengen und Proportionen mit LACI verwendet werden. Die Verwendung der folgenden Mengen dieser und anderer sulfatierter Polysaccharide mit etwa 0,1 bis etwa 5 µg LACI sind für eine synergistische Antikoagulationsaktivität jeweils bevorzugt:
0,2-2 µg/ml Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=5.100),
1-10 µ/ml Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=3.700),
4,5-45 µg/ml Pentosanpolysulfat,
34-340 µg/ml Dermatansulfat,
50-500 µg/ml Dextransulfat (mittleres Mr=6.000-8000), und
100-1.000 µg/ml Heparansulfat.
Wie hierin verwendet, ist LACI so definiert, daß er den Lipoprotein-assoziierten Koagulationsinhibitor, wie von Wun et al., J.Biol. Chem. 263, 6001-6004 (1988) beschrieben, bedeutet. LACI kann aus verschiedenen bekannten Quellen, z. B. den konditionierten Medien gezüchteter Leberzellen, wie Hep G2-Zellen, SK-Hepatom-Zellen und Chang-Leberzellen, isoliert werden, oder er kann mittels rekombinanter DNA-Verfahren erzeugt werden. Obwohl spezifische Methoden für die Isolierung oder Erzeugung von LACI hierin beschrieben sind, ist es verständlich, daß die Erfindung nicht auf irgendeine besondere LACI-Quelle eingeschränkt ist.
Wie hierin verwendet, ist eine Heparin-Einheit so definiert, daß sie eine U.S.P.(United States Pharmacopoeia)-Einheit bedeutet. Die USP-Heparineinheit ist jene Menge, die 1 h lang die Gerinnung von 1,0 ml citriertem Schafplasma nach Zugabe von 0,2 ml einer 1 : 1000-CaCl&sub2;-Lösung verhindert. Heparin wird allgemein durch Isolieren aus Säuger-Geweben, welche Mastzellen enthalten, wie Leber und Lunge, erhalten. Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck "Heparin" auch die pharmazeutisch akzeptablen wasserlöslichen Salze davon, z. B. das Natriumsalz, inkludieren. Geeignete Bespiele für im Handel erhältliche Heparin-Natriumprodukte sind Lipo-Hepin® (Riker Laboratories), Liquaemin®- Natrium (Organon) und Panheprin® (Abbott Laboratories).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Obgleich die Beschreibung mit Patentansprüchen schließt, welche den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung bildend angesehen wird, besonders herausstreichen und genau beanspruchen, nimmt man an, daß die Erfindung aus den folgenden bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen, die graphische Darstellungen sind, besser verständlich ist, worin
Fig. 1 die Wirkung von Heparin auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) eines normalen Plasmas und dasselbe Plasma ohne endogenen LACI zeigt. Ein gefrorenes Plasma wurde aufgetaut und ohne Vorbehandlung verwendet, oder nach einer Immunadsorption mit anti-LACI-Ig Sepharose 4B zur Entfernung des endogenen LACI, verwendet. Die Plasmas wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Heparin ergänzt, und die APTT wurde, wie nachstehend in METHODEN beschrieben, bestimmt. Originalplasma -o-; LACI-freies Plasma, - -. Die Extrapolationen über 0,6 Einheiten Heparin/ml Plasma hinaus beruhten auf Ergebnissen, daß beide Plasmen mehr als 1 h lang bei 0,8 Einheiten Heparin/ml Plasma ungeronnen blieben.
Fig. 2 zeigt die Wirkung von Heparin auf die Prothrombinzeit (PT) von normalem Plasma und von LACI-freiem Plasma bei ver- - schiedenen Gewebsfaktor- ( TF ) -Konzentrationen. Die verwendeten Plasmas waren entweder unbehandelt (-o-) oder von endogenem LACI-Antigen durch Immunadsorption, wie nachstehend in METHODEN beschrieben, befreit (- -). TF-Reagens wurde 1 : 1000 (Tafel A), 1 : 100 (Tafel B) oder 1 : 10 (Tafel C) für die Bestimmung von PT verdünnt. Die strichlierten Linien in den Tafeln A und B wurden aufgrund der Ergebnisse, daß die Plasmen mehr als 1 h lang bei 0,5 (Tafel A) bzw. 2 (Tafel B) Einheiten Heparin/ml Plasma ungeronnen blieben, extrapoliert.
Fig. 3 zeigt die Wirkung von exogen zugesetztem LACI auf die PT eines Plasmas, das durch verschiedene Konzentrationen von TF zur Gerinnung angeregt wurde. Tafel A: TF-Reagens wurde 1 : 10.000 (- -) 1 : 1000 (-o-) und 1 : 100 (-·-) zur Bestimmung der PT verdünnt. Tafel B: TF-Reagens wurde in einer 1 : 10-Verdünnung verwendet.
Fig. 4 zeigt einen Test der Synergie zwischen Heparin und LACI zur Verlängerung der PT eines LACI-freien Plasmas. (A) Wirkung von LACI, Heparin und einer Kombination von LACI und Heparin auf die PT eines LACI-freien Plasmas. Ein LACI-freies Plasma wurde mit LACI (-x-), Heparin (- -) oder einer Kombination von LACI und Heparin (- -) ergänzt, und ihre PTs wurden, wie nachstehend in METHODEN beschrieben, unter Verwendung von 90 µl einer 1 : 100 Verdünnung des TF-Reagens bestimmt.

(B) Isobolaranalyse der LACI/Heparin-Wechselwirkung

Konzentrationen von LACI alleine, von Heparin alleine und von LACI/Heparin in Kombination, die dieselben PTs ergaben (isoeffektive Gerinnungszeiten von 80, 100, 120, 140, 160, 180 und 200 s) wurden aus den Kurven in Tafel (A) bestimmt. und sind die Konzentrationen von LACI und Heparin separat, die auch isoeffektiv mit der LACI/Heparin-Kombination in Konzentrationen von bzw. , sind. Die Werte von da/Da + db/Db zeigen, ob die beiden Agentien in Wechselwirkung stehen. Ein Wert von =1 deutet null-Wechselwirkung an; ein Wert von > 1 zeigt Antagonismus an; und ein Wert von < 1 zeigt Synergie.
Fig. 5 zeigt die Wirkung von LACI, Heparin und der Kombination von LACI und Heparin auf die PT eines Plasmas, das von endogenem LACI befreit war. Plasma wurde durch Immunadsorption auf einer anti-LACI-Ig-Sepharose 4B-Säule von endogenem LACI befreit. Die PT wurde, wie nachstehend in METHODEN beschrieben, bestimmt, wobei 90 µl einer 1 : 100-Verdünnung des TF-Reagens verwendet wurden. LACI-freies Plasma wurde mit verschiedenen Mengen von LACI (-x-), Heparin (- -) und LACI in Kombination mit 0,5 (-·-), 1,0 (- -) bzw. 2,0 (- -) Einheiten Heparin pro ml Plasma ergänzt. Es sind Gleichungen und Korrelationskoeffizienten aus der linearen Regressionsanalyse gezeigt.
Fig. 6 zeigt die Wirkung von sulfatierten Polysacchariden auf die PT von normalem Plasma. Die PT wurde, wie nachstehend in METHODEN beschrieben, bestimmt, wobei 90 µl einer 1 : 100-Verdünnung des TF-Reagens, 10 µl sulfatisierter Polysaccharide, 100 µl eines gepoolten Plasmas und 100 µl von 25 mM CaCl&sub2; verwendet wurden. Die verwendeten sulfatisierten Polysaccharide sind LMWH5100 (low molecular weight heparin, mittleres Mr=5100); UFH (unfraktioniertes Heparin); LMWH3700 (low molecular weight heparin, mittleres Mr=3700); PPS (Pentosanpolysulfat), DS (Dermatansulfat); DXS (Dextransulfat, mittleres Mr=6000-8000); und HS (Heparansulfat).
Fig. 7 zeigt die Wirkung von sulfatierten Polysacchariden, LACI und der Kombination aus sulfatierten Polysacchariden/LACI auf die PT eines gepoolten Plasmas. Die PT wurde, wie nachstehend in METHODEN beschrieben, unter Verwendung von 90 µl einer 1 : 100 Verdünnung des TF-Reagnes, 10 µl eines sulfatierten Polysaccharids, LACI, oder einer Kombination der beiden bei den angegebenen Konzentrationen, 100 µl eines gepoolten Plasmas und 100 µl von 25 mM CaCl&sub2;, bestimmt. Die verwendeten Verbindungen sind dieselben wie die in Fig. 6. LACI alleine (-x-); sulfatiertes Polysaccharid alleine (- -); eine Kombination von LACI und sulfatiertem Polysaccharid (- -).
Die neue antikoagulatorische Kombination von LACI und Sulfat-Polysacchariden wird hierin weiters im Detail durch eine Kombination von rekombinantem LACI (rLACI), in Mäuse-C127-Zellen exprimiert, und Heparin und verwandten sulfatierten Polysacchariden veranschaulicht.
Der hierin verwendete LACI ist ein bekannter, von Plasma stammender Inhibitor, der die Gewebsfaktor (TF)/Faktor VII- induzierte Koagulation auf Faktor Xa-abhängige Weise inhibiert. Die Rollen des endogenen Plasma-LACI und des exogen zugesetzten LACI und des Heparins bei der Regulierung der Koagulation, initiiert durch den intrinsischen und den extrinsischen Weg, wurden getestet, indem ein aktivierter partieller Thromboplastinzeit-(APTT)-Test und ein modifizierter Prothrombinzeit- (PT)-Test verwendet wurden. Solche Tests sind auf dem Gebiet der Hämatologie zur Messung der Wirkung von Heparin auf die Blutgerinnungszeiten herkömmlich. Vgl. z. B. U.S. Patent 3,486,981. Das LACI-freie Plasma und das Normalplasma haben identische APTTs und ähnliche Verlängerungen der APTT als Reaktion auf Heparin; und beide sind bei ähnlichen Heparin-Konzentrationen vollkommen antikoaguliert (willkürlich definiert als Gerinnungszeiten von mehr als 1 h). Diese Ergebnisse zeigen an, daß Heparin ein sehr wirksames Antikoagulans ist, wenn die Koagulation durch den intrinsischen Weg initiiert wird, und daß endogenes LACI bei der Regulierung dieses Weges nicht wesentlich involviert ist. Die PT von Normalplasma ist nur geringfügig länger als die von LACI-freiem Plasma, wenn Heparin nicht vorhanden ist, was nahelegt, daß endogener Plasma-LACI eine sehr begrenzte Kapazität zur Inhibierung der TF-induzierten Gerinnung hat. In Gegenwart von Heparin sind jedoch die PTs von LACI- freiem Plasma und die PT von Normalplasma sehr unterschiedlich. Eine Verlängerung der PT trat bei zunehmenden Konzentrationen von Heparin in LACI-freiem Plasma nur mäßig und linear auf; dagegen zeigte Normalplasma ein größeres Ausmaß an PT-Verlängerung als Reaktion auf das Heparin, und das Plasma wurde bei einer bestimmten Schwellenkonzentration von Heparin vollkommen antikoaguliert. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß LACI als Co-Faktor für Heparin dient, und dies verbessert die Inhibierung der TF-induzierten Gerinnung sehr. LACI-freies Plasma wurde mit gereinigtem, rekombinantem LACI, Heparin, oder einer Kombination von beidem ergänzt, und ihre Auswirkungen auf die TF-induzierte Gerinnungszeit wurde getestet. Man fand unerwarteterweise, daß LACI und Heparin in Kombination eine stark verbesserte Antikoagulation im Vergleich zu LACI oder Heparin alleine bewirkte. Es zeigte sich auch, daß viele sulfatierte Polysaccharide die LACI-abhängige Inhibierung von TF-induzierter Gerinnung verbessern. Die Wirkungsbereiche dieser Verbindungen sind: Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=5.100) bei 0,2-2 µg/ml; unfraktioniertes Heparin bei 0,1-4 Einheiten/ml; Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=3.700) bei 1-10 µg/ml, Pentosanpolysulfat bei 4,5-45 µg/ml; Dermatansulfat bei 34-340 µg/ml, Dextransulfat bei 50-500 µg/ml; und Heparansulfat bei 100-1000 µg/ml. Aufgrund der folgenden Ergebnisse schließt man darauf, daß LACI ein Co-Faktor für Heparin in der TF-induzierten Gerinnung ist und daß LACI und sulfatierte Polysaccharide eine synergistische Antikoagulationswirkung in Vollplasma ausüben.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, obwohl verständlicherweise die Erfindung nicht auf diese speziellen Beispiele oder darin beschriebenen Details eingeschränkt ist.

BEISPIELE

MATERIALIEN

Kaninchenhirn-Thromboplastin (Gewebsfaktor, TF) wurde von Ortho Diagnostic erhalten. Dade's aktiviertes Cephaloplastin- Reagens für die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT), gekauft von American Scientific Product. Unfraktioniertes Heparin (UFH, Lot 038078) wurde von Elkin-Sinn Inc. erhalten. Heparine mit niedrigem Molekulargewicht (LMWH) mit einem mittleren Molekulargewicht von 5100 und 3700 stammten von Calbiochem. Pentosanpolysulfat (PS, Nr. P8275), Dermatansulfat aus der Rindermucosa (DS, Nr. C2413) und Heparansulfat aus Rindermucosa (HS, Nr. H7641) stammten von Sigma. Dextransulfat (DXS, mittleres Mr=7.000-8.000) wurde von ICN Biochemicals geliefert. Humanplasma wurde von American Red Cross (St. Louis) zur Verfügung gestellt. Vier Einheiten von Plasma wurden gepoolt und in aliquoten Teilen bis zu ihrer Verwendung bei -80ºC gefroren gelagert. Faktor Xa aus Rind und Spectrozyme Xa wurden von American Diagnostica erhalten.

METHODEN

Expression und Reinigung von rLACI

rLACI wurde in Mäuse-C127-Zellen unter Verwendung eines Rinder-Papillomavirusvektors exprimiert, und die rLACI- produzierende Zellinie wurde in einer Zellfabrik zur Ernte von konditioniertem Medium wie folgt gezüchtet:
Der Rinder-Papillomavirusvektor pMON1123, der aus dem gesamten, in das pBR322-Derivat von pML2 klonierten Rinder- Papillomavirusgenom, besteht, wurde zur Expression von LACI verwendet. Dieser Vektor benützt den Mäuse-Metallothionin-I- Promotor und die SV40-Late-poly-A-Additionsstelle, um die Expression von durch DNA-Fragmente kodierten Proteinen, die in eine unike BamHI-Stelle inseriert sind, zu lenken. Die Verwendung von rekombinanten DNA-Prozessen unter Ausnützung einer Papillomavirus-DNA als Vektor für die Replikation und Expression von exogenen Genen in eukaryontischen Zellen ist herkömmliche Praxis, wie aus dem U.S. Patent 4,419,446 ersichtlich. Zur Expression von LACI cDNA wurde pMON1123 mit BamHI verdaut, und die 5V-überhängenden Enden wurden mit Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und Desoxynucleotiden (dNTPs) aufgefüllt. Auf ähnliche Weise wurde die LACI-cDNA als EcoRI-Fragment isoliert, und die Enden wurden durch Klenow- Auffüllung stumpf gemacht. Das LACI-Fragment wurde in pMON1123 ligiert, um das Plasmid pMON1456 zu ergeben. Mäuse-C127-Zellen wurden gezüchtet und mit pMON1456 und pSVneo mittels des Verfahrens, wie früher von Ramabhadran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6701 (1984) beschrieben, co-transfektiert. Nach Selektion mit G418 Antibiotikum (Geneticin) wurden resistente Kolonien ausgewählt und Platten mit 24 Vertiefungen damit inokuliert. Konditionierte Medien aus jeder Vertiefung wurden auf die Expression von rekombinantem LACI (rLACI) mittels einer Enzym-verbundenen Immnunosorbens-Untersuchung (ELISA) untersucht. Ein Klon, 1455-15, der etwa 1 bis 2 µg LACI/10&sup6; Zellen/24 h exprimierte, wurde zur Isolation von rLACI vermehrt.
Die rLACI-produzierende Zellinie 1455-15 wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum, gezüchtet. Die Zellen wurden in 150 cm²-Kolben bis zur Konfluenz gezüchtet. Jeder Kolben wurde dann trypsiniert und zur Beimpfung einer 850 cm²-Roller-Flasche verwendet. Nach Erreichung einer Konfluenz wurden die Zellen aus jeder Roller-Flasche verwendet, um eine Zellfabrik mit 10 Kammern (6000 cm²; GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.) zu beimpfen. Bei Erreichung der Konfluenz wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in einem serumfreien Medium, bestehend aus Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, ergänzt mit 0,2 µg/ml Menadion, 2,5 mmol/l Natriumbutyrat und 50 E/ml Aprotinin, inkubiert. Das serumfreie konditionierte Medium wurde alle 2 Tage gesammelt und durch frisches Medium ersetzt.
Das serumfreie konditionierte Medium wurde auf 50 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, eingestellt, durch ein 0,2 µ-Filter filtriert, und 30-fach konzentriert, wobei ein Amicon YM30-Konzentrator mit radialer Kartusche verwendet wurde. Das Konzentrat wurde einer Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen. Proteine, die zwischen 23- 90%- Ammoniumsulfatsättigung ausfällten wurden gesammelt und gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, enthaltend 20 mM Na&sub2;SO&sub4;, dialysiert. Triton® X-100-Detergens wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,05% zugesetzt, und die Lösung wurde durch einstündige Zentrifugation bei 40.000 · g geklärt. Der Überstand wurde auf einer Anhydrotrypsin-Sepharose® 4B-Säule (12 ml Gel, hergestellt gemäß dem in Lit. 17 beschriebenen Verfahren), chromatographiert, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 20 mM Na&sub2;SO&sub4;, 0,05% Triton® X-100 (Puffer A), äquilibriert. Die Säule wurde mit 80 ml von Puffer A und 80 ml desselben Puffers ohne Triton® X-100 gewaschen. Das gebundene Protein wurde mit 1,5 M NaSCN in drei Säulen-Volumen eluiert. Das eluierte Protein wurde konzentriert und gegen eine Lösung enthaltend 0,15 M NaCl und 20 mM Na&sub2;SO&sub4; dialysiert. Die Gewinnung von LACI betrug etwa 60%. Die frisch hergestellte Anhydrotrypsin-Sepharose 4B-Säule hatte eine Kapazität von etwa 0,6 mg LACI/ml Gel. Nach wiederholter Verwendung nahm die Kapazität auf etwa 0,2 mg/ml Gel ab. Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) des eluierten Proteins zeigte eine Hauptbande von Mr 38.000 entsprechend LACI mit Spuren von hochmolekulargewichtigen Verunreinigungen. Die Verunreinigungen wurden durch Adsorption mit Phenyl-Sepahrose 4B entfernt.

Charakterisierung von gereinigtem rLACI

Das isolierte Protein ist im wesentlichen reiner LACI anhand der folgenden Kriterien: (a) SDS-PAGE zeigt im wesentlichen eine einzige Bande; (b) Aminosäureanalyse und Protein-Sequenzierung passen zur Zusammensetzung und Sequenz, die aus der cDNA-Sequenz von LACI abgeleitet ist; und (c) die Stöchiometrie der Inhibierung von Faktor Xa in einem Versuch mit amidolytischem Substrat beträgt etwa 1 : 1 (siehe unten).
Die Konzentration von LACI wurde mittels Aminosäureanalyse quantitativ bestimmt. Die Konzentration an aktiven Zentren des Faktor Xa wurde durch Titrieren mit p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoat gemäß Chase und Shaw (16) gemessen. Die amidolytische Aktivität von Faktor Xa und die anti-Faktor Xa-Aktivität von LACI wurden wie folgt bestimmt:
Zehn µl Rinderfaktor Xa (0,084 pmol aktives Molekül) wurden mit 10 µl TBB-Puffer (Tris-gepufferte Kochsalzlösung enthaltend 5 mg/ml Rinderserumalbumin und 2,5 mg/ml Rinder-Gammaglobulin) oder 10 µl richtig verdünntem LACI in TBB-Puffer in einer Einweg-Küvette 5 min bei Raumtemperatur gemischt. Nach Zugabe von 0,22 ml eines Untersuchungspuffers (0,1 M Tris/HCl, pH 8,4, 0,5% Triton® X-100) und 10 µl Spectrozyme Xa (12,5 mM) wurde die Extinktionsveränderungsrate bei 405 nm bei 37ºC gemessen. Die Kontrolle ergab eine Extinktionsveränderung von 0,0233 pro min pro 0,1 pmol aktivem Faktor Xa bei 405 nm. In der LACI enthaltenden Reaktionsmischung wurde die anti-Xa-Aktivität aufgrund der Abnahme der Faktor Xa-Aktivität im Vergleich zu jener der Kontrolle berechnet. Unter Verwendung der oben beschriebenen Untersuchungen zeigte sich, daß 2,6 ng von gereinigtem LACI (aufgrund der Aminosäureanalyse; äquivalent mit 0,068 pmol unter der Annahme Mr=38.000) 0,066 pmol von aktivem Faktor Xa inhibiert. So scheint die Stöchiometrie der Wechselwirkung zwischen LACI und Faktor Xa 1 : 1 zu sein.

Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT)

Dade's aktiviertes Cephaloplastin-Reagens wurde verwendet, um die APTT von Plasma unter Verwendung eines Fibrometer- Gerinnsel-Zeitmessungsinstruments zu bestimmen. 90 µ l Plasma wurden mit 10 l sulfatiertem Polysaccharid oder Kontrollpuffer und 100 µl aktiviertem Cephaloplastin-Reagens genau 2 min lang bei 37ºC gemischt. Eine Calciumlösung (100 µl von 25 mM CaCl&sub2;) wurde zur Mischung zugegeben, und die Zeit bis zur Gerinnung wurde aufgezeichnet. Der Versuch wurde bis zu 1 h lang beobachtet. Aus praktischen Gründen wird das Plasma willkürlich als "vollkommen antikoaguliert" bezeichnet, wenn die Gerinnung nicht in 1 h auftritt.

Prothrombin-Zeit (PT)

Kaninchenhirnthromboplastin (TF, Ortho Diagnostic) wurde 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000 oder 1 : 10.000 in einer Kochsalzlösung enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin zur Bestimmung der PT verdünnt. 100 µl Plasma wurden mit 10 µl Kontrollpuffer, LACI- Lösung oder sulfatierter Polysaccharidlösung und 90 µl eines verdünnten TF in der Vertiefung des Fibrometers 2 min lang bei 37ºC gemischt. 100 µl von 25 mM CaCl&sub2; wurden zugegeben, und die Zeit bis zur Gerinnung wurde bestimmt. Die Konzentrationen der sulfatierten Polysaccharide und von LACI beziehen sich auf die Mengen dieser Verbindungen pro ml unverdünnten Plasmas (nicht die Konzentration der endgültigen Mischung). Die hier berichteten PTs sind der Durchschnitt von 2-8 Bestimmungen, je nach der Länge der Gerinnungszeit. Wenn die Gerinnungszeit kurz (< 100 s) war, sind die Variationen zwischen den Bestimmungen gering und wurden 2-3 Versuche durchgeführt und für jeden Datenpunkt ein Durchschnitt ermittelt. Wenn die Gerinnungszeit lang (> 100 s) war und die Variationen infolge der Verwendung von verdünntem TF oder hoher Konzentrationen von LACI und sulfatierten Polysacchariden größer waren, wurden 4-8 Bestimmungen durchgeführt und für jeden Datenpunkt ein Durchschnitt ermittelt. Der Versuch wurde bis zu 1 h lang beobachtet. Das Plasma wird als "vollkommen antikoaguliert" bezeichnet, wenn die Gerinnung nicht in 1 h auftritt.

Antiserum, anti-LACI-Ig und anti-LACI-Ig-Sepharose 4B

Zwei weiße Neuseeland-Kaninchen wurden jeweils durch intradermale Injektion mit einem Homogenat enthaltend 1 ml komplettes Freundsches Adjuvans und 1 ml gereinigten LACI (200 µg LACI-Protein) immunisiert. Einen Monat später erhielt jedes der Kaninchen einen Booster mit einem Homogenat enthaltend 1 ml unvollständiges Freundsches Adjuvans und 1 ml des gereinigten LACI (100 µg LACI-Protein). Danach wurde jede Woche Antiserum genommen. Booster-Injektionen wurden monatlich durchgeführt, bis die Kaninchen nach 3 Monaten ausgeblutet wurden. Anti-LACI-Ig wurde aus dem Antiserum durch Chromatographie auf einer Protein A-Sepharose 4B-Säule isoliert. Das isolierte anti-LACI-Ig wurde mit Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose 4B mit einer Konzentration von 10 mg Ig/ml Gel mittels der von Pharmacia empfohlenen Vorgangsweise gekoppelt.

Präparation von LACI-freiem Plasma

Gepooltes gefrorenes Plasma (100 ml) wurde aufgetaut und fünf mal durch eine anti-LACI-Ig-Sepharose 4B-Säule (3 ml Gel enthaltend -15 mg gebundenes Ig) geleitet, um das endogene LACI- Antigen zu entfernen. Das Immuno-adsorbierte Plasma war im wesentlichen frei von endogenem LACI, da eine Immununtersuchung (Empfindlichkeit von -1 ng/ml) kein LACI-Antigen nachwies.

ERGEBNISSE

Wirkung von Heparin auf die intrinsische Koagulation

In der APTT-Untersuchung sind die Kontaktphasenproteine aktiviert, was zur Einleitung der intrinsischen Koagulationskaskade führt. Fig. 1 zeigt die Wirkung von Heparin auf die APTT von Normalplasma und dasselbe Plasma ohne endogenen LACI. Eine mäßige Verlängerung der Gerinnungszeit (bis zum 5-fachen) wurde bei Heparinkonzentration von 0 bis 0,6 Einheiten/ml Plasma beobachtet. Bei 0,8 Einheiten Heparin/ml blieb das Plasma mehr als 1 h lang ungeronnen (willkürlich als "vollständig antikoaguliert" bezeichnet). Es gab keinen wesentlichen Unterschied in der APTT bei Normalplasma und dem LACI-freien Plasma, was nahelegt, daß endogener Plasma-LACI keine wesentliche Rolle bei der Regulierung der intrinsischen Koagulation in Anwesenheit oder Abwesenheit von Heparin spielt.

Die Rolle von endogenem Plasma-LACI bei der Regulierung der extrinsischen Koagulation

Normalplasmen wurden mit anti-LACI-Ig oder normalem Kaninchen-Ig vorinkubiert, und ihre PTs wurden gemessen, um die Rolle von endogenem Plasma-LACI bei der Regulierung der extrinsischen Koagulation zu bestimmen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren die PTs für das mit anti-LACI-Ig behandelte Plasma kürzer als für jene mit normalem Ig. Der Unterschied zwischen dem mit Antikörper behandelten Plasma und der Kontrolle war gering bei 1 : 10, 1 : 100 und 1 : 1000 Verdünnungen von TF. Ein mäßiger Unterschied in den PTs wurde bei einer 1 : 10.000 Verdünnung von TF beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn unbehandeltes Plasma und Plasma, das durch Immunoadsorption mit anti- LACI-Ig-Sepharose 4B von endogenem LACI befreit worden war, verwendet wurden. Diese Ergebnisse deuten an, daß die Kapazität und/oder die Fähigkeit des endogenen LACI zur Inhibierung von TF-induzierter Koagulation unter diesen Bedingungen eher gering ist.

Wirkung von Heparin auf die extrinsiche Koagulation

Die Wirkung von Heparin auf die PTs von Normalplasma und von gleichem Plasma, das frei von endogenem LACI war, wurde unter Verwendung verschiedener TF-Konzentrationen gemessen. Fig. 2(A) zeigt die Ergebnisse bei Verwendung einer 1 : 1000-Verdünnung von TF (PT=77 s für die Kontrolle ohne Heparin). Im LACI-freien Plasma (A) verlängerten steigende Konzentrationen von Heparin (0-0,6 Einheiten/ml Plasma) die PT progressiv in im wesentlichen linearer Weise. Im endogenen LACI-enthaltenden Plasma (o) war die Heparin-Reaktion sigmoidal. Bei 0,1-0,2 Einheiten Heparin/ml Plasma war die PT gleich oder geringfügig länger als jene in LACI-freiem Plasma. Bei 0,3 und 0,4 Einheiten Heparin/ml Plasma waren die PTs 1,5- und 2,6-mal länger als jene im LACI-freien Plasma. Bei 0,5 Einheiten Heparin/ml Plasma wurde das Plasma "vollständig antikoaguliert".
Fig. 2(B) zeigt das Ergebnis bei einer 1 : 100 Verdünnung von TF (PT=41 s für die Kontrolle ohne Heparin). In LACI-freiem Plasma (A) stieg die PT mit zunehmender Heparinkonzentration auch linear an, doch war eine etwa 6-mal höhere Konzentration von Heparin notwendig, um dieselben PTs wie jene in Fig. 2(A) zu erreichen. In Plasma, das endogenen LACI (o) enthielt, war die Heparin-Reaktion auch sigmoidal, doch trat die Schwellenkonzentration von Heparin, die notwendig ist, um einen "vollständig antikoagulierten" Zustand zu erreichen, bei einer Konzentration von mehr als 1,5 Einheiten Heparin/ml Plasma auf.
Fig. 2(C) zeigt einen ähnlichen Test unter Verwendung einer 1 : 10-Verdünnung von TF (PT=24 s für die Kontrolle ohne Heparin). Im LACI-freien Plasma ( ) waren die Heparin-induzierten Verlängerungen der PT viel geringer als jene in Fig. 2(A) und (B). Im LACI-enthaltenden Plasma blieb die PT bis zu 4 Einheiten Heparin/ml Plasma kürzer als 500 s.
Die obigen Ergebnisse deuten insgesamt an, daß mehrere Mechanismen an der Regulierung der extrinsischen Koagulation beteiligt sein können. Erstens kann Heparin die durch TF- induzierte Gerinnung in Abwesenheit von endogenem LACI mäßig verlängern; zweitens hat endogener Plasma-LACI eine schwache antikoagulierende Wirkung gegen eine durch TF induzierte Gerinnung in Abwesenheit von Heparin; und drittens verbessert über einer bestimmten Schwellenkonzentration Heparin die Inhibierung der mit TF induzierten Gerinnung in Anwesenheit von Plasma-LACI ganz wesentlich, was nahelegt, daß LACI bei der Inhibierungsreaktion als Co-Faktor für Heparin dient.

Wirkung von exogen zugesetztem LACI auf die PT von Normalplasma

Die oben beschriebenen Tests sind auf Plasma beschränkt, das endogenen LACI enthält oder frei von diesem ist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß endogener Plasma-LACI eine wichtige Rolle bei der Inhibierung von durch TF induzierter Gerinnung spielen kann, wenn die Menge an TF gering ist, daß er aber nicht ausreicht, wenn die Menge an TF groß ist. Um den Bereich der Kontrolle auf Bedingungen auszudehnen, in welchen endogener LACI nicht ausreichen würde, wurde exogener LACI Normalplasma zugesetzt, um seine Wirkung auf die PT zu untersuchen. Fig. 3(A) zeigt, daß bei Verwendung eines weiten Bereichs konstanter Konzentrationen von TF (1 : 10.000, 1 : 1000 und 1 : 100-Verdünnungen von TF), die PTs in linearer Beziehung zur Konzentration des dem Plasma zugesetzten exogenen LACI stehen. Die Konzentration von LACI, die zur Verlängerung der PT nötig ist, nimmt mit steigenden Konzentrationen von verwendetem TF zu, und dies zeigt sich im Gefälle der PT-LACI-Konzentrations-Reaktionskurven. Bei einer höheren Konzentration von verwendetem TF (1 : 10-Verdünnung von TF) ist die PT-LACI-Konzentrations-Reaktionskurve nicht linear, wie in Fig. 3(B) gezeigt.

Synergistische Antikoagulationswirkung von LACI und Heparin

Die obigen Tests zeigen, daß der separate Zusatz von Heparin oder LACI zu Plasma eine Dosis-abhängige Inhibierung der durch TF induzierten Gerinnung erzeugt (Fig. 2 und 3). Außerdem scheint Heparin die Inhibierung von durch TF induzierter Gerinnung durch endogenen LACI (Fig. 2) zu potenzieren. Um das Ausmaß der Potenzierung quantitativ zu bestimmen, wurde ein LACI-freies Plasma mit Heparin, gereinigtem LACI oder einer Kombination aus beidem ergänzt, um ihre antikoagulatorischen Wirkungen zu vergleichen. Fig. 4(A) zeigt das Verhältnis der PT zu den Konzentrationen von exogen zugesetztem Heparin und LACI.
Die Verlängerung der PT mit steigenden Konzentrationen von Heparin ( ) oder LACI (x) alleine sind linear. Wenn Heparin und LACI gleichzeitig im Plasma anwesend sind ( ), variiert die Gesamtwirkung auf die Gerinnungszeit mit der Konzentration der verwendeten Verbindungen. Bei geringen Konzentrationen (z. B. < 0,2 Einheiten Heparin/ml plus < 1 µg LACI/ml) weicht die Gerinnungszeit von jener, die für die einzelnen Komponenten erwartet wird, nicht wesentlich ab. Bei höheren Konzentrationen (mehr als 0,3 Einheiten Heparin/ml plus 1,5 µg LACI/ml) weicht die Gerinnungszeit von jener, die von den einzelnen Komponenten erwartet wird, zunehmend ab, und die Potenzierungswirkung wird augenscheinlich. Beispielsweise hat 0,5 Einheiten Heparin/ml plus 2,5 µg LACI/ml eine PT von -1.000 s, während 1 Einheit Heparin/ml oder 5 µg LACI/ml PTs von weniger als 200 s haben.
Pharmakologisch können Arzneistoffwechselwirkungen durch das Isobol-Verfahren (isoeffektive Kurve) unter Verwendung des Wechselwirkungs-Index als Kriterium zur Unterscheidung von Null- Wechselwirkung, Synergie oder Antagonismus (18) analysiert werden. Der Arzneistoffwechselwirkungs-Index ist als /Da + /Db definiert, worin und Konzentrationen von A bzw. B in der Kombination sind und Da und Db die Konzentrationen von A und B separat sind, die mit der Kombination isoeffektiv sind. Der Wert des Wechselwirkungsindex zeigt die Art der Wechselwirkung an: ein Wert von =1 deutet auf Null-Wechselwirkung hin; ein Wert von < 1 zeigt Synergie an; und ein Wert von > 1 zeigt einen Antagonismus an. Aufgrund der Daten der Fig. 4(A) können isoeffektive Konzentrationen der Verbindungen (d. h. LACI, Heparin separat und ihre Kombinationen, die dieselben Gerinnungszeiten ergeben) für die Berechnung der wechselwirkungs-Indices erhalten werden. Fig. 4(B) zeigt den Wechselwirkungs-Index als Funktion der Gerinnungszeit. Das Resultat zeigt deutlich eine zunehmende Synergie oder Potenzierung (Wechselwirkungs-Index < 1) mit zunehmender Gerinnungszeit aufgrund der kombinierten Verwendung einer steigenden Konzentration von LACI und Heparin.

Heparin verbessert die Inhibierung von mit TF induzierter Gerinnung durch LACI

Um die relative Wirksamkeit von LACI in Abwesenheit und Anwesenheit von Heparin zu beurteilen, wurde ein LACI-freies Plasma mit verschiedenen Konzentrationen von LACI und Heparin ergänzt und deren PTs bestimmt. Fig. 5 zeigt die PT als Funktion der Konzentration von LACI in Abwesenheit von Heparin (x), in Anwesenheit von 0,5 (·), 1,0 ( ) bzw. 2,0 ( ) Einheiten Heparin/ml Plasma. Wenn man annimmt, daß die Neigung auch die Wirksamkeit zeigt, dann nimmt die relative Wirksamkeit von LACI 3,4-, 8,5- und 75-fach in Anwesenheit von 0,5, 1,0 bzw. 2,0 Einheiten Heparin/ml Plasma gegenüber der in Abwesenheit von exogen zugesetztem Heparin zu.

Wirkung sulfatierter Polysaccharide und ihrer Kombination mit LACI auf die PT von Plasma

Angesichts der Fähigkeit von Heparin, die TF-induzierte Gerinnung auf LACI-abhängige und unabhängige Weise zu inhibieren, wurden auch andere sulfatierte Polysaccharide auf ihre Antikoagulationswirkung getestet. Fig. 6 zeigt die Wirkung verschiedener sulfatierter Polysaccharide auf die PT von Normalplasma. Alle getesteten Verbindungen zeigten die Fähigkeit, die Gerinnungszeit zu verlängern, doch wurde diese Wirkung bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen beobachtet. Auf das Gewicht bezogen, haben die relativen Wirksamkeiten dieser Verbindungen die folgenden Reihenfolge: Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=5100) > unfraktioniertes Heparin > Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (mittleres Mr=3700) > Pentosanpolysulfat > Dermatansulfat > Dextransulfat > Heparansulfat. Um zu untersuchen, ob diese Verbindungen auch die LACI- abhängige antikoagulatorische Aktivität potenzierten, wurden Tests ähnlich jenen, die in Fig. 4(A) beschrieben sind, durchgeführt. Die Fig. 7(A)-(F) zeigen die Wirkung von LACI, sulfatierten Polysacchariden und ihren Kombinationen auf die PT von Normalplasma. Alle getesteten Verbindungen potenzierten die Inhibierung von TF-induzierter Gerinnung durch LACI, doch bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen. Die Konzentrationen der sulfatierten Polysaccharide, die die antikoagulatorische Wirkung von LACI potenzierten, lagen in einem ähnlichen Bereich wie jene, die in Fig. 6 verwendet wurden, und die relativen Wirksamkeiten haben, auf das Gewicht bezogen, dieselbe Reihenfolge wie oben. Tabelle 1 Wirkung von anti-LACI-Ig auf die Prothrombin-Zeit eines Normalplasmas TF-Verdünnung Prothrombin-Zeit Plasma + Normal-Kaninchen-Ig Plasma + anti-LACI-Ig a. Prothrombin-Zeit wurde wie in METHODEN beschrieben untersucht. Die Werte sind der Durchschnitt von zwei Bestimmungen. b. TF wurde in eine Kochsalzlösung enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin seriell verdünnt. c. Ein Normalplasma (1,95 ml) wurde mit 0,5 ml Normal-Kaninchen-Ig (1,6 mg/ml) gemischt und vor der Untersuchung 3 h lang bei 4º inkubiert. d. Dasselbe wie in c., außer das anti-LACI-Ig anstelle von Normal-Kaninchen-Ig verwendet wurde.
Die antikoagulatorische Kombination von LACI und sulfatiertem Polysaccharid zur Inhibierung sowohl des intrinsischen als auch des extrinsischen Koagulationsweges durch geeignete Verabreichung an einen warmblütigen Säuger, der einer solchen Behandlung bedarf, wie beispielsweise für disseminierte intravaskuläre Koagulation benötigt sein kann, verwendet werden. Die Menge der Kombination, die normalerweise verabreicht würde, hängt in erster Linie von den körperlichen Merkmalen des Säugers und der Schwere der Erkrankung ab. Die Menge muß eine wirksame Menge sein, das heißt, eine Menge, die medizinisch für die Inhibierung der Koagulation günstig ist, die aber keine toxischen Wirkungen hat, die die Vorteile, die mit deren Verwendung verbunden sind, überwiegen. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist oral oder parenteral. Die Verabreichung der Kombination in Lösung mit herkömmlichen Verdünnungsmitteln und Trägern, beispielsweise Kochsalzlösung, dient der Veranschaulichung. Andere geeignete Formulierungen der aktiven Kombination in pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln oder Trägern in therapeutischer Dosierung können durch Zuhilfenahme allgemeiner Texte auf dem Gebiet der Pharmazie, wie z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Hrsgb. Arthur Osol, 16. Auflage, 1980, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, hergestellt werden.
Verschiedene andere Beispiele werden für den Fachmann nach Lesen der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein, ohne vom Umfang der Erfindung abzugehen. Es ist beabsichtigt, daß alle solchen anderen Beispiele im Umfang der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sind.

Literaturstellen

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Claims

1. Zusammensetzung umfassend einen Lipoprotein-assoziierten Koagulationsinhibitor und ein antikoagulatorisches sulfatisiertes Polysaccharid in Anteilen, die bei exogener Verabreichung an einen warmblütigen Säuger eine synergistische Antikoagulationswirkung schaffen.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das sulfatisierte Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heparin, Pentosanpolysulfat, Dermatansulfat, Dextransulfat und Heparansulfat.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Lipoproteinassoziierte Koagulationsinhibitor und Heparin in Anteilen von 0,1 bis 4 Einheiten Heparin mit 0,1 µg bis 5 µg Lipoproteinassoziiertem Koagulationsinhibitor vorliegen.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als Medikament bei einem warmblütigen Säuger.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Hemmung von Blutkoagulation bei einem warmblütigen Säuger.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Verfahren die Verabreichung von 0,1 bis 4 Einheiten Heparin und 0,1 µg bis 5 µg LACI pro ml behandeltem Plasma umfaßt.

7. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Inhibition der Blutkoagulation bei einem warmblütigen Säuger geeignet ist.