DE69117123T2

DE69117123T2 - Menschliches MK Gen und Protein-Sequenz

Info

Publication number: DE69117123T2
Application number: DE69117123T
Authority: DE
Inventors: Peter Bohlen; Imre Kovesdi
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1990-08-20
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2011-06-01
Also published as: NZ239357A; JPH06217778A; ATE134219T1; AU8258591A; DK0476233T3; PT98694A; EP0476233A1; DE69117123D1; GR3019059T3; CA2049370A1; US5210026A; EP0476233B1; AU636789B2; KR920004570A; ES2085928T3

Description

Diese Erfindung betrifft eine neue DNA-Sequenz für ein Protein, das eine beträchtliche Homologie mit dem menschlichen Heparin-bindenden neurotrophischen Faktor (HBNF) aufweist. Die betreffenden Sequenzen zeigen auch ein hohes Maß an Homologie mit einem früher beschriebenen Mäuse- Protein, das als MK1 bezeichnet wurde. Die Homologie von MK mit diesen bekannten Proteinen legt eine ähnliche Nützlichkeit bei der Induktion von Nervenzellenwachstum und -differenzierung sowie Nervenzellen- Aufrechterhaltung und -Reparatur nahe. Darüber hinaus weist das Auftreten des MK-Gens in Teratokarzinom-Zellen und bei der Embryonenentwicklung eine breitere Nützlichkeit als Differenzierungs-induzierender Faktor sowie als Gewebe-Aufrechterhaltungs- oder -Reparatur-Faktor hin.
Das Protein der vorliegenden Erfindung wird normalerweise im menschlichen Gehirn erzeugt, aber offensichtlich entwicklungsmäßig zu einem anderen Zeitpunkt als HBNF. Das menschliche MK-Protein zeigt eine ungefähr 85%-ige Homologie mit der veröffentlichten Maus-MK-Sequenz. Die Existenz eines derartigen Proteins beim Menschen ist zuvor nicht erkannt worden, obwohl es jetzt offensichtlich ist, daß MK ein Mitglied einer hoch konservierten Genfamilie ist, die in einer Anzahl von verschiedenen Arten vorhanden ist.
Das Gen, das für das menschliche MK-Protein kodiert, ist aus einer cDNA-Bibliothek isoliert worden, die von RNA aus menschlichem Neugeborenen-Hirnstamm erhalten wurde. Das Gen ist sequenziert und kloniert worden; es hat eine Sequenz mit 366 Nukleotiden, die ein Protein mit 121 Aminosäuren vorhersagt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Kadomatsu et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 151: 1312-1318, 1988) isolierten und sequenzierten cDNA aus Mauszellen, die sie als MK1 bezeichneten. Es wurde berichtet, daß die entsprechende mRNA in den frühen Stadien, aber nicht in den späteren Stadien, der Maus-Embryonenentwicklung reichlich vorhanden war. Es wurde vorgeschlagen, daß das MK1-Protein mit der Steuerung der Zelldifferenzierung verbunden ist, insbesondere als DNA-bindendes Protein, das die Genexpression steuert. Es wurde keine Verwandtschaft zu irgendwelchen anderen bekannten Proteinsequenzen gefunden. Ein anschließender Artikel (Tomomura et al., J. Biol. Chem. 265: 10765-10770, 1990) berichtete von der Expression des MK-Gens in frühen Stadien der Embryonalkarzinom-Zelldifferenzierung und stellte auch das Auftreten von drei unterschiedlichen Klassen von cDNA-Klonen fest, die als MK1, MK2 und MK3 bezeichnet wurden. Kadomatsu et al. (J. Cell. Biol. 110: 607-616, 1990) schlugen vor, daß MK eine fundamentale Rolle bei der Differenzierung einer Vielfalt von Zellen spielen könnte und daß es bei der Erzeugung von Epithelgeweben und bei der Umformung von Mesoderm beteiligt sein könnte.
Es wurde nun gefunden, daß die Maus-MK1-Sequenz ein hohes Maß an Homologie mit der Gruppe von Proteinen aufweist, die als Heparin-bindende neurotrophische Faktoren (HBNFs) bekannt sind; die Nukleotidsequenz, die für die letztgenannten Proteine kodiert, ist in der mitanhängigen und zur gleichen Zeit eingereichten Serial No. 07/568,574 der Amelderin offenbart. Die HBNF-Proteine wurden ursprünglich in der EP 325 076 als HBBMS offenbart. Es wurde jetzt unerwarteterweise entdeckt, daß ein Gen, das der Maus-MK-Sequenz entspricht, auch im menschlichen Gehirn vorgefunden wird. Die vorliegende Erfindung stellt die gesamte Sequenz des Gens, das für das menschliche Protein kodiert, sowie die vorhergesagte Aminosäuresequenz des reifen Proteins, Klonierungs- und Expressionsvektoren und Wirtszellen bereit, die in der Lage sind, das Gen zu exprimieren und reines MK-Protein zu erzeugen. In Anbetracht der starken Homologie zwischen den MK-Proteinen und HBMF ist es wahrscheinlich, daß diese eine Familie von Genen und Proteinen bilden, die für die Entwicklung von Bedeutung sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 (siehe auch Sequenzliste 1). Nukleotid- und Aminosäuresequenz des menschlichen MK-Gens. Fettgedruckte Aminosäuren stellen die vorhergesagte Protein-Präsequenz dar, der Pfeil stellt den vorhergesagten N-Terminus des reifen Proteins dar, und die zwei Peptidsequenzen, die den Primern 1 und 2 entsprechen, welche zum Amplifizieren der genomischen Maus-DNA-Sonde verwendet wurden, sind unterstrichen. Die zwei Polyadenylierungs-Sequenzen in der Nähe des 3'-Endes des Gens sind unterstrichen.
Figur 2 zeigt einen Vergleich der Region des reifen Proteins von menschlichem HBNF (siehe auch Sequenzliste 3) und der MK-Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenz Identische Aminosäuren sind in fetten Buchstaben angegeben. Identitäten in den beiden Nukleotidsequenzen sind durch Sterne (*) angegeben.
Figur 3 zeigt eine Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem und Maus-MK (siehe auch Sequenzliste 2). Unterschiede in den zwei Nukleotidsequenzen sind durch Sterne (*) angegeben. Unterschiede in den Aminosäuren sind in fetten Buchstaben angegeben. Aminosäuren, die für die Erstellung des Mausgenom-PCR-Primers verwendet wurden, sind unterstrichen.
Figur 4. Bakterielle Expression von menschlichen rekombinanten HBNF- und MK-Proteinen. Zell-Lysate stammen aus Bakterienkulturen, die die Expressionsplasmide pETHH8 oder pETMH2 enthalten. Bahnen 1 und 2, Lysate aus nicht-induzierten und IPTG-induzierten Kulturen, die pETMH2 enthalten. Bahn 3, gereinigtes rekombinantes MK-Protein. Bahnen 4 und 5, nichtinduzierte und induzierte Kulturen, die pETHH8 enthalten. Bahn 6, gereinigtes rekombinantes HBNF-Protein. Protein-Standards sind von BRL.
Figur 5. Neuritenauswuchs-Assays von gereinigten rekombinanten HBNF- und MK-Proteinen. Gereinigte Proteine werden an 18 Tage alten fetalen Rattenneuronen bei den angegebenen Konzentrationen getestet. (A) Nervenzellen ohne zugesetztes Protein. (B) Von Rinderhirn abstammtes HBNF- Protein (160 ng/ml). (C) Gereinigtes rekombinantes menschliches HBNF- Protein (150 ng/ml). (D) Gereinigtes rekombinantes menschliches MK-Protein (150 ng/ml).
Figur 6 zeigt (a) die Expression des HBNF-Gens während der Ratten- Embryogenese. Aus jedem Gewebe wurden insgesamt 20 µg RNA pro Bahn aufgetragen und mit einer ³²P-markierten menschlichen HBNF-cDNA-Sonde hybridisiert. Gewebe, die bei der RNA-Isolierung verwendet wurden, waren Gesamt-Embryo, geeignet für E8 und E10, Köpfe für E12 und E14, Gesamt-Hirn für E16, E18, E20, P2 und erwachsene Tiere; (b) Expression des MK-Gens während der Ratten-Embryogenese. Der gleiche Northern-Blot wie in (a), mit einer ³²P-markierten menschlichen MK-cDNA-Sonde hybridisiert.
Figur 7. Genexpression von HBNF und MK im Gehirn von erwachsenen Ratten. RNA, die aus verschiedenen Himregionen 2 Monate alter Ratten extrahiert worden war, wurde einer Northern-Analyse unterzogen (10 µg/Bahn RNA; Bahn 1 - Gesamthirn, 2 - Kortex, 3 - Hippocampus, 4 - Cerebellum, 5 - Nucleus caudatus, 6 - Mittelhirn + Hypothalamus, 7 - Hirnstamm). Der resultierende Blot wurde anschließend mit Sonden für HBNF, MK und β-Actin hybridisiert.
Figur 8. Retinoesäure-induzierte Expression von HBNF- und MK-Genen in NT2/D1-Zellen. NT2/D1-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von RS behandelt, 9 Tage kultiviert, und die RNA wurde extrahiert. (A) Bei jeder RS-Konzentration wurden 10 µg RNA in einer Northern-Analyse verwendet. Der resultierende Blot wurde anschließend mit HBNF-, MK- und β-Actin-Sonden hybridisiert. (B) Hybridisierungssignale, die (A) bei HBNF (schwarz) und MK (gestrichelt) erhalten wurden, wurden durch Densitometrie gemessen und auf die β-Actin-Signale normiert.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die DNA-Sequenz, die für menschliches MK kodiert, wird durch Isolieren einer Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Kombination und Durchmustern einer cDNA-Bibliothek, die von einem menschlichen Neugeborenen-Hirnstamm abstammt, kloniert. Die menschliche HBNF-Sequenz wird als Ausgangspunkt für die Erstellung von Oligonukleotiden für eine PCR-Amplifikationsreaktion verwendet; diese Sequenz ist in Figur 2 dargestellt. Spezielle oligonukleotide werden für die Regionen entworfen, die zwischen HBNF und der veröffentlichten Maus-MK1-DNA-Sequenz am meisten konserviert sind. Diese Oligonukleotide werden als Primer in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) an genomischer Maus-DNA verwendet. Das erwartete Produkt mit 150 Basenpaaren wird in einem geeigneten Vektor kloniert, und die Sequenz wird bestimmt. Dieser Klon wird als Sonde für die Durchmusterung einer Menschenhirn-cDNA-Bibliothek verwendet, um das äquivalente menschliche MK-Gen zu identifizieren. Ein einziger Klon wird isoliert, subkloniert und sequenziert. Die Sequenz eines dieser Klone ist in Figur 1 dargestellt und trägt 790 Nukleotiden der geschätzten 1100 Nukleotide der reifen menschlichen MK-mRNA Rechnung. Die Nukleotidsequenz wird anschließend in zusätzlichen MK-Klonen mit kürzerer Länge bestätigt, bei denen man fand, daß sie verschiedene überlappende Fragmente des Original-Klons enthielten. Die Sequenz der MK-cDNA schließt zwei Polyadenylierungs-Signale und einen Poly A-Schwanz ein (Figur 1). Der iolierte Original-Klon weist ein offenes Leseraster mit einer Kodierungsregion auf, die am Nukleotid 22 beginnt und ein Protein mit 143 Resten definiert. Die N-terminale Sequenz ist hoch hydrophob und weist die Eigenschaften eines Signalpeptids auf (Von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99- 105, 1985). Auf der Grundlage der von Von Heijne (ebenda; Nucl. Acid Res. 14: 4683-4690, 1986) angegebenen Kriterien für Signalpeptid-Strukturen und Vergleichen mit Maus-MK- und menschlichen HBNF-Sequenzen wird angenommen, daß die Signalpeptid-Abspaltung zwischen den Aminosäureresten 22 (Ala) und 23 (Lys) stattfinden, was so zu einem reifen MK-Polypeptid mit einer Länge von 121 Resten Anlaß gibt.
Wie in Figur 3 dargestellt, zeigt ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz von menschlichem MK mit der Sequenz von Maus-MK-Protein einen Unterschied von lediglich ungefähr 15% an. Die meisten dieser Änderungen sind konservativ. Die Homologie zwischen MK und HBNF, die in Figur 2 dargestellt ist, zeigt eine Homologie von 50% an, die auf 63% ansteigt, wenn konservierte [richtig wohl: konservative] Aminosäureänderungen eingeschlossen werden. Zehn Cysteine, die in beiden Proteinen anwesend sind, liegen genau an den gleichen Positionen vor, was ähnliche Strukturen nahelegt.
Um eine Quelle des reifen MK-Proteins bereitzustellen, die frei von kontaminierenden eukaryontischen Proteinen ist, werden die oben isolierten cDNA-Klone als Matrizen für eine PCR-Amplifikation mit Primern verwendet, die so gestaltet sind, daß sie ein Methionin-Codon unmittelbar am 5' des N-terminalen Lysinrests der reifen Proteine anordnen. Das amplifizierte Produkt wird in eine modifizierte Form des Expressionsvektors pET-3a (Studier et al., 1990) kloniert, und das resultierende Plasmid pETMH2 wird in den E. coli-Stamm BL21 LysS transformiert. Proteinextrakte von IPTG- induzierten, pETMH2-haltigen Bakterien prägen eine Haupt-Proteinbande aus, die zu ungefähr 16,5 kDa wandert (Figur 4, Bahn 2). Eine nicht-induzierte Kultur (Bahn 1, pETMH2-haltige Bakterien) enthält viel geringere Mengen des Proteins, wie aus den SDS-PAGE-Bandenintensitäten beurteilt wird. Rekombinantes MK-Protein wird mittels Heparin-Affinitätschromatographie aus IPTG-induzierten Bakterienkulturen gereinigt (Figur 4, Bahn 3), und seine N-terminale Sequenz und Aminosäuren-Zusammensetzung werden bestätigt.
Die Homologie zwischen der menschlichen MK-DNA und der veröffentlichten Maus-MK-DNA und die abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen ein geringeres Maß an Konservierung als ein ähnlicher evolutionärer Vergleich von HBNF (Figur 3). Unter Verwendung eines mutmaßlichen N-Terminus aus dem reifen MK-Protein, der aus der Homologie mit HBNF abgeleitet ist, wird eine 86%-ige Aminosäure-Identität, einschließlich einer Deletion von drei Aminosäuren in der Maus-Sequenz, beobachtet. Sowohl HBNF als auch MK werden im Gehirn exprimiert, aber die zeitliche und räumliche Steuerung sind unterschiedlich. Eine vorläufige in-situ-Hybridisierung zeigte individuelle Expressionsmuster für die zwei Informationen für die Proteine. Die Northern-Hybridisierungsanalyse der Maus-RNA aus den überprüften Geweben von erwachsenen Tiere zeigte, daß nur das Gehirn eine HBNF-Information mit 1650 Nukleotiden exprimierte (Figur 6). Dies ist mit früheren Untersuchungen über die Expressionseigenschaften des HBNF- Proteins konsistent, die dessen Anwesenheit im Gehirn zeigen (EP 326 075, Rauvala, EMBÖ J. 8: 2933-2941, 1989). Kürzlich wurde HBNF-Protein auch aus Rinder-Uterus isoliert (Milner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 165: 1096-1103, 1989). Diese ersten Experimente zeigten, daß MK in keinem überprüften Gewebe von erwachsenen Tieren exprlmiert wird (Figur 6). Jedoch zeigten anschließende Experimente, daß MK-mRNA in zwei Regionen des Gehirns von erwachsenen Tieren, dem Nucleus caudatus und dem Hirnstamm, nachweisbar ist (Figur 7). Auf der Grundlage der signifikant längeren Einwirkungszeiten, die benötigt werden, um diese Banden der RNA von erwachsenen Tieren zu sehen, verglichen mit äquivalenten Mengen an embryonaler RNA, scheint es, daß MK-RNA beim erwachsenen Tier zu einem minimalem Ausmaß exprimiert wird.
Die zeitliche Expression beider Gene wird durch Northern-Blot- Analyse mit Gesamt-Ratten-RNA aus verschiedenen Entwicklungsstadien ausgewertet. Die Hybridisierung mit einer HBNF-Sonde zeigt eine allmähliche Zunahme der Information während der Entwicklung, wobei die höchste Konzentration im Gehirn von erwachsenen Tieren auftritt (Figur 6a). Die Hybridisierung des gleichen Blots mit einer MK-Sonde zeigt, daß nur 12, 14 und 16 Tage alte embryonale Gewebe die Information enthielten. Die häufigste Auftreten der MK-Information scheint im embryonalen Stadium des Tages 12 vorzuliegen (Figur 6b). Diese Ergebnisse stimmen im allgemeinen mit den in-situ-Hybridisierungsuntersuchungen von Kadomatsu (oben) überein. Jedoch waren wir im Gegensatz zu den Befunden von Kadomatsu nicht in der Lage, eine MK-mRNA-Expression in Nierengewebe nachzuweisen. Untersuchungen über HBNF-Protein in Rattenhirnen legen nahe, daß die höchste Konzentration in jungen Tieren am Tag 7 nach der Geburt auftritt. Diese Konzentration gibt einen zehnfachen Unterschied im Vergleich zu 56 Tage alten Tieren wieder (Rauvala, oben).
Man kann die Differenzierung der menschlichen Embryonalkarzinom(EC)- Zellinie NT2/D1 mit Konzentrationen von Retinoesäure (RS) induzieren, die von 0,01 bis 10 µM variieren, wobei der Prozentsatz an differenzierenden EC-Zellen im Bereich von 50% bei 0,01 µM RS (Simeone et al., Nature 346: 763-766, 1990) bis zu mehr als 99% bei 1 und 10 µM RS (Andrews, Dev. Biol. 103: 285-293, 1984) liegt. Die Expression von MK und HBNF während der Differenzierung von NT2/D1 wird bei Konzentrationen im Bereich von 0,01 bis 10 µM untersucht. Nach neuntägiger Einwirkung von RS wurde Gesamt-RNA aus Zellen extrahiert und durch Northern-Analyse auf die Genexpression überprüft. Die Expression beider Gene folgte einem ähnlichen Muster (Figur 8). Die Niveaus der mRNA-Expression blieben bei 0,1 bis 0,5 µM RS auf einem konstanten Hintergrundniveau, stiegen zwischen 0,1 und 0,5 µM RS schnell an und behielten dieses Niveau bei Konzentrationen bis zu und einschließlich 10 µM RS bei. Als RNA-Hybridisierungssignale auf eine Kontroll-β-Actin-Sonde normiert wurden, wurden die maximalen Zunahmen zu 6-fach bei HBNF und 11-fach bei MK berechnet (Figur 8). Diese Ergebnisse sind mit denjenigen vergleichbar, die bei MK während einer Retinoesäure- Induktion der Maus-EC-Zellinie HM-1 (Kadomatsu et al., oben) beobachtet wurden. In dieser Zellinie wurde die MK-Genexpression 8- bis 10-fach über den Hintergrund hinaus induziert.
Rekombinante HBNF- und MK-Proteine werden auf die Fähigkeit getestet, einen Neuritenauswuchs von 18 Tage alten fetalen Rattenhirn- Neuronen zu stimulieren. Die beiden von Bakterien abstammenden Proteine zeigten eine den Neuritenauswuchs fördernde Wirkung, die derjenigen von nativem Rinder-HBNF ähnlich ist (Figur 5). Das rekombinante MK-Protein wird auch auf seine mitogene Wirkung bei Aorta-Endothelzellen und NIH 3T3- Fibroblasten vom erwachsenen Rind getestet. Das MK-Protein zeigt bei diesen Zellen keine mitogene Wirkung. Jedoch ist von Tomomura (Biochem. Biophys. Res. Comm. 171: 603, 609, 1990) berichtet worden, daß ein konditioniertes Medium von mit MK transfizierten L-Zellen von [richtig vermutlich: für] PC12-Zellen mitogen ist.
Die Befunde der vorliegenden Erfindung zeigen demgemäß, daß HBNF und MK Mitglieder einer hoch konservierten Genfamihe sind. Weiter geben die Genexpressions-Daten zu verstehen, daß diese Gene bei der Proliferation, Aufrechterhaltung und/oder Entwicklungsdifferenzierung von Gewebe und insbesondere Nervengewebe eine Wirkung aufweisen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Klonierung und Expression des MK-Gens in einem T7-RNA-Polymerase-Expressionssystem. Jedoch sollte, obwohl dieses T7-Expressionssystem ziemlich wirkungsvoll ist, verstanden werden, daß dies nicht das einzige Hilfsmittel ist, durch das MK rekombinant erzeugt werden kann. Die Erzeugung von MK kann durch Einbau des MK-Gens in irgendeinen geeigneten Expressionsvektor und anschließende Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit dem Vektor erreicht werden; alternativ kann die Transformation der Wirtszellen ohne die Verwendung eines Vektors direkt durch nackte DNA erreicht werden. Die Erzeugung von MK sowohl durch eukaryontische Zellen als auch durch prokaryontische Zellen wird in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Beispiele für geeignete eukaryontische Zellen schließen Säugerzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen und Insektenzellen ein. Ähnlich schließen geeignete prokaryontische Wirte zusätzlich zu E. coli Bacillus subtilis ein.
Andere geeignete Expressionsvektoren können ebenfalls verwendet werden und werden auf der Grundlage der Wahl der Wirtszelle ausgewählt. Zum Beispiel sind zahlreiche Vektoren wohlbekannt, die zur Verwendung bei der Transformation von Bakterienzellen geeignet sind. Beispielsweise sind Plasmide und Bakteriophagen, wie zum Beispiel der λ-Phage, die am häufigsten verwendeten Vektoren für Bakterien-Wirte und insbesondere für E. coli. Sowohl in Säuger- als auch in Insektenzellen werden häufig Virus- Vektoren verwendet, um eine Expression von exogener DNA zu erhalten. Insbesondere Säugerzellen werden häufig mit SV40 oder Polyoma-Virus transformiert; und Insektenzellen in Kultur können mit Baculovirus- Expressionsvektoren transformiert werden. Hefe-Vektorsysteme schließen Hefe-Centromerplasmide, Hefe-Episomenplasmide und Hefe- Integrationsplasmide ein.
Man versteht auch, daß die Umsetzung der Erfindung in die Praxis nicht auf die Verwendung der genauen Sequenz des MK-Gens beschränkt ist, wie sie in Figur 1 definiert ist. Modifikationen der Sequenz, wie Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, die stumme Änderungen im resultierenden Proteinmolekül erzeugen, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Beispielsweise werden Änderungen in der Gensequenz, die die Produktion einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einer gegebenen Stelle zur Folge haben, in Betracht gezogen; demgemäß kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, leicht durch ein Codon substituiert werden, das für einen anderen hydrophoben Rest, wie beispielsweise Glycin, kodiert, oder dieser kann durch einen hydrophoberen Rest, wie Valin, Leucin oder Isoleucin, substituiert werden. Ähnlich kann man von Änderungen, die den Ersatz eines negativ geladenen Restes durch einen anderen, wie den von Glutaminsäure durch Asparaginsäure, oder eines positiv geladenen Restes durch einen anderen, wie den von Arginin durch Lysin, zur Folge haben, ebenfalls erwarten, daß sie ein biologisch äquivalentes Produkt erzeugen. Nukleotidänderungen, die die Änderung von N-terminalen oder C-terminalen Teilen des Proteinmoleküls zur Folge haben, ändern häufig die Proteinaktivität nicht, da diese Regionen gewöhnlich nicht an der biologischen Aktivität beteiligt sind. Es kann auch wünschenswert sein, eines oder mehrere der in der Sequenz vorhandenen Cysteine zu entfernen, da die Anwesenheit von Cysteinen die unerwünschte Bildung von Multimeren zur Folge haben kann, wenn das Protein rekombinant erzeugt wird, wodurch die Reinigungs- und Kristallisationsverfahren kompliziert werden. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen liegt gut innerhalb der Routinefähigkeiten auf diesem Gebiet der Technik, wie es auch bei der Bestimmung der Beibehaltung der biologischen Aktivität der kodierten Produkte der Fall ist. Deshalb wird verstanden, daß, wenn der Ausdruck "MK-DNA-Sequenz" oder "MK-Gen" in der Beschreibung oder den Ansprüchen verwendet wird, alle derartigen Modifikationen und Variationen umfaßt werden, die die Erzeugung eines biologisch äquivalenten MK-Proteins zur Folge haben. Insbesondere werden in der Erfindung diejenigen DNA- Sequenzen in Betracht gezogen, die die Sequenz der Figur 1 so hinreichend duplizieren, daß sie die Hybridisierung mit derselben unter hochstringenten Standard-Southern-Hybridisierungsbedingungen gestatten, wie denjenigen, die bei Maniatis et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben werden. Das MK- Protein ist zum HBNF-Protein stark homolog und stimuliert wie HBNF die Induktion des Neuritenauswuchses. MK wird demgemäß als ein neurotrophisches Mittel vorgeschlagen. Als solches sind die MK-Proteine sowohl in vivo als auch in vitro beim Wachstum, der Aufrechterhaltung und der Reparatur von Nervenzellen des peripheren und zentralen Nervensystems nützlich. Ein Beispiel für eine in-vitro-Anwendung ist die Aufrechterhaltung von embryonalen Gehirnimplantaten, die derzeit zur Verwendung bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit vorgeschlagen werden.
In Anbetracht der offensichtlichen Rolle bei der Differenzierung wird das MK-Protein auch als genereller Gewebe-Differenzierungs-, -Aufrechtserhaltungs- und -Reparaturfaktor vorgeschlagen. Insbesondere kann MK bei der Behandlung von Tumorzellen nützlich sein, um die Rückkehr zu einem differenzierten Phänotyp zu induzieren.
Die in-vivo-Verabreichung von MK wird durch die Entdeckung der Gensequenz signifikant vereinfacht, insbesondere bei der Behandlung von zentralen oder peripheren Nervensystem-Verletzungen. Die Identifizierung des Gens und seiner Sequenz gestatten die Konstruktion von transgenen Zellen, wie Fibroblasten, Monocyten oder Makophagen, die gentechnologisch so verändert werden können, daß sie die Expression des MK-Gens gestatten und als Implantat für die Behandlung neurodegenerativer Störungen, die periphere Nervenreparatur nach einem chirurgischen Eingriff oder irgendwelche Zustände, bei denen eine Verstärkung des Nervenzellenwachstums und/oder der Nervenzellenreparatur wünschenswert wären, verwendet werden können.
Darüber hinaus ist die therapeutische Verwendung von MK nicht auf die Behandlung von Menschen allein beschränkt. In der Tat kann in Anbetracht der konservierten Natur dieses Proteins unter entfernt verwandten Arten die Verabreichung von MK in irgendeiner Form auch bei einer veterinärmedizinischen Anwendung von Nutzen sein. Therapeutische Zusammensetzungen umfassen MK in einer Menge, die wirksam ist, die gewünschte biologische Aktivität zu induzieren, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Träger. Alternativ umfaßt die Zusammensetzung eine pharmazeutisch annehmbare Aggregation von kompatiblen transgenen Zellen, die MK in vitro exprimieren können, als Implantat für Reparaturen des peripheren und zentralen Nervensystems oder für eine Differenzierungsbehandlung.

BEISPIEL

KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES MK-GENS

Die veröffentlichte Maus-MK-Protein-Aminosäuresequenz wurde verwendet, um spezielle Oligonukleotide zu schaffen, die als Primer bei einer Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden sollten. Genomische Maus- DNA wurde aus C57 Black/6J-Mäusen isoliert, wie von Maniatis et al., oben, beschrieben.
Für die Aminosäuresequenz: CNWKKEFG (Figur 1) wird ein Sinn-Primer hergestellt, der an einer HindIII-Restriktionsstelle beginnt und die DNA- Sequenz: 5'GGAATTCGGTCTCCTGGCACTGGGCAGT-3' enthält.
Die PCR-Reaktion wird unter Verwendung der Taq-Polymerase (USB Corp.) an der komplementären DNA-Matrize mittels einer sorgfältigen Hybridisierung bei 50ºC, 2-minütigen Verlängerung bei 72ºC und 1-minütigen Denaturierung bei 94ºC über 30 Zyklen durchgeführt.
Das Maus-MK-PCR-Produkt mit 150 Basenpaaren wird in einen Blue Scribe (+)-Vektor (Stratagene) kloniert und als Sonde bei der Durchmusterung einer Neugeborenen-Hirnstamm- und -Basalganglien-λ gt 11- cDNA-Bibliothek verwendet (Kamholz, PNAS USA 83: 4962-54966, 1986). Ein einziger mutmaßlich die MK-Sequenz enthaltender Klon wird isoliert und in die EcoRI-Stelle von Blue Scribe (+) subkloniert und durch das Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., PNAS USA 74: 5463-5467, 1988) sequenziert. Die Sequenz des MK-Gens sowie die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in Figur 1 dargestellt. Der Vergleich mit der Maus-MK-Sequenz zeigt einen Unterschied von 41 Nukleotiden, einschließlich der Deletion von drei Codons in der Maussequenz.

EXPRESSION VON REKOMBINANTEM MENSCHLICHEM MK

Der oben angegebene isolierte Klon, der als pMKHC2 bezeichnet wird, wird als Matrize für die PCR-Amplifikation mit Primern verwendet, die so erstellt sind, daß sie ein Methionin-Codon und eine Nde I- Restriktionsstelle unmittelbar 5' zum N-terminalen Lysin anordnen. Das gereinigte PCR-Produkt wird in ein Derivat des Expressionsvektors pET-3a kloniert, der durch die Deletion des Sall/PvuII-Fragments mit 1400 Bp und Insertion eines f1-Replikations-Startpunkts in die EcoRI-Stelle modifiziert ist. Nach Sequenzierung des Inserts, um die genaue übereinstimmung der PCR-Amplifikation zu bestätigen, wird das Plasmid (als pETMH2 bezeichnet; früher auch als pETMKHC2 bezeichnet) in den Stamm BL21 LysS transformiert und, wie beschrieben (Studier et al., oben), zur Proteinerzeugung mit IPTG induziert. Pellets aus 1 ml Kultur werden in 100 µl SDS-Puffer (Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970) resuspendiert, und 2,5 µl werden auf einem 15-Acrylamid-SDS-PAGE-Gel laufen gelassen. Das Gel wird mit Coomassie-Blau angefärbt. Rekombinantes MK wird aus einem Bakterienextrakt auf Heparin-Sepharose CL-6B-Harz (Pharmacia) in 10 mM Tris, pH 7,0, gereinigt und bei 1 - 1,13 M NaCl eluiert. Eine weitere Reinigung wird auf Mono S-Säulen (Pharmacia) in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, mit einer von 0 bis 1 M NaCl zunehmenden Salzkonzentration erreicht. Das gereinigte Protein wird bei 0,6 M NaCl eluiert.

NEURITENAUSWUCHS-ASSAYS

Gehirne von 18 Tage alten fetalen Ratten werden unter sterilen Bedingungen entfernt und unter Verwendung einer sterilen 5 ml-Spritze in DMEM, das 10% FCS enthält, zu einzelnen Zellen dispergiert. Die Zellsuspension wird auf 5 x 10&sup5; Zellen/ml eingestellt und auf Gewebekultur-Schalen plattiert, die 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 50 µg/ml poly-L-Lysin vorbeschichtet werden (Rauvala und Pihlaskan, J. Biol. Chem. 262: 16625-16635, 1987). Die Kulturen werden 24 Stunden bei 37ºC in 10% CO&sub2; inkubiert, wonach das Medium zu DMEM, das 1 mg/ml BSA enthält, ausgetauscht wird und HBNF- oder MK-Proteine bei den angegebenen Konzentrationen zugesetzt werden. Nach einer weiteren eintägigen Inkubation wird die Neuritenauswuchs-Aktivität durch visuelle Überprüfung von Zellen auf im Vergleich zu Kontrollen vergrößerte Auswuchsentwicklungen überprüft. Wie in Figur 5b gezeigt, ist gereinigtes rekombinantes MK in der Lage, den Neuritenauswuchs zu im wesentlichen dem gleichen Ausmaß wie rekombinantes HBNF und von Rinderhirn abstammendes HBNF zu stimulieren.

WACHSTUM UND RETINOESÄURE-INDUKTION DER MENSCHLICHEN NT2/D1-ZELLEN

Die menschliche Embryonalkarzinom-Zellinie NT2/D1 wird wie früher beschrieben (Andrews, Dev. Biol. 103: 285-293, 1984) kultiviert. Für die Retinoesäure-Induktion werden die Zellen kultiviert und mit einer Dichte von 5 x 10&sup5; Zellen pro 100 mm Schale in DMEM-Medium resuspendiert, das 10% Rinderkälberserum enthält, und in DMEM-Medium resuspendiert, das 10% Rinderkälberserum (Hyclone Laboratories, Inc.) enthält. Variierende Konzentrationen von all-trans-Retinoesäure in Dimethylsulfoxid (10 µl) werden zugesetzt, und die Zellen werden 9 Tage inkubiert. Frisches Medium und RS werden an den Tagen 4 und 8 zugesetzt. Die Platten werden einmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, und die RNA wird wie oben beschrieben extrahiert. Figur 8 zeigt eine graphische Darstellung der Konzentrationen sowohl von HBNF als auch von MK, die als Antwort auf variierende Größen der Retinoesäure-Konzentration erzeugt wurden. Da vorgeschlagen worden ist, daß mit RS induzierte NT2/D1-Zellen ein Modellsystem für Untersuchungen der neuronalen Differenzierung bereitstellen (Lee und Andrews, J. Neurosci. 6: 514-521, 1986), zeigt die Steigerung der Induktion von HBNF- und von MK-Genen in diesem System eine mögliche Rolle bei der neuronalen Zellentwicklung an.

HINTERLEGUNG DER BIOLOGISCHEN MATERIALIEN

Der E. coli-Stamm M 1061, der pMKHC2 beherbergt, und der E. coli- Stamm BL2T LysS, der pETMH2 beherbegt, sind bei den Culture Collections der American Cyanamid Company, Lederle Laboratories, Pearl River, New York, und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68384 am 13. August 1990 bzw. der Hinterlegungsnummer 68401 am 17. September 1990 hinterlegt worden.
Sequenz-ID-Nr.: 1
Sequenz-Typ: Nukleinsäure und Aminosäure
Sequenz-Länge: 799 Basenpaare, 143 Aminosäuren
Strangart: Einzelstrang
Topologie: Linear
Ursprünglicher Quellenorganismus: Mensch
Eigenschaften: Menschliches MK-Gen und Proteinsequenz
Sequenz-ID-Nr.: 2
Sequenz-Typ: Nukleinsäure und Aminosäure
Sequenz-Länge: 354 Basenpaare, 118 Aminosäuren
Strangart: Einzelstrang
Topologie: Linear
Ursprünglicher Quellenorganismus: Maus
Eigenschaften: Maus-MK-Gen und Proteinsequenz
Sequenz-ID-Nr.: 3
Sequenz-Typ: Nukleinsäure und Aminosäure
Sequenz-Länge: 411 Basenpaare, 136 Aminosäuren
Strangart: Einzelstrang
Topologie: Linear
Ursprünglicher Quellenorganismus: Mensch
Eigenschaften: menschliches HBNF-Gen und Proteinsequenz

Claims

1. Gereinigte und isolierte DNA mit der in Figur 1 dargestellten MK-Sequenz, die für ein menschliches MK- Protein kodiert, oder ein Teil derselben, der für ein biologisch aktives MK-Protein kodiert.

2. DNA, die mit der in Figur 1 dargestellten MK-Sequenz unter hochstringenten Standard-Bedingungen hybridisierbar ist.

3. Verfahren zur Herstellung von reinem menschlichem MK- Protein oder einem Teil desselben, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit der DNA nach Anspruch 1 und das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der DNA durch die Wirtszelle gestatten.

4. Expressionsvektor, der die DNA nach Anspruch 1 umfaßt.

5. Transgene Zelle, die die DNA nach Anspruch 1 umfaßt.

6. Zelle nach Anspruch 5, die bei der American Type Culture Collection als ATCC 68384 hinterlegt ist.

7. Gereinigtes, isoliertes MK-Protein mit einer in Figur 1 dargestellten Sequenz und Homologe oder Fragmente desselben, die die biologische MK-Aktivität beibehalten.

8. Therapeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge des MK-Proteins nach Anspruch 7 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

9. Verfahren zür Beibehaltung oder Förderung des Wachstums von Nervenzellen in vitro, umfassend das Kultivieren der Zellen in Anwesenheit einer wirksamen Menge des Proteins nach Anspruch 7.

10. Verfahren zur Induzierung einer Differenzierung von undifferenzierten Zellen, umfassend das Versetzen der Zellen mit einer wirksamen Menge des Proteins nach Anspruch 7.

11. Verwendung der Zellen nach Anspruch 5 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Wiederherstellung oder Behandlung von beschdigten Nervenzellen in vivo, welche eine wirksame Menge an kompatiblen transgenen Zellen umfaßt, die ein MK-Protein exprimieren können.