JPH06217778A - ヒトｍｋ遺伝子及び蛋白質の配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明はヒトＭＫ蛋白質のための新規ＤＮＡ
及びアミノ酸配列に関する。ＭＫ蛋白質の製造法におい
て有用な発現ベクタ−及び宿主細胞についても記載す
る。 【効果】 本発明における配列決定により神経細胞の成
長、維持及び修復に有用な細胞を構築することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はヒトヘパリン結合神経栄養因子
（ＨＢＮＦ）と実質的に相同な蛋白質のための新規ＤＮ
Ａ配列に関する。問題の配列は以前に記載されたＭＫ１
と表されるねずみ蛋白質とも高度の相同性を示す。これ
らの既知の蛋白質とのＭＫの相同性は、神経細胞成長及
び分化の誘導、ならびに神経細胞の維持及び修復におい
て類似の有用性かあることを示唆している。さらに奇形
がん腫細胞及び胚の発生においてＭＫ遺伝子が存在する
ことは分化誘導因子として、ならびに組織維持又は修復
因子としての広い有用性を示す。

【０００２】本発明の蛋白質は通常ヒトの脳で製造され
るが、明らかにＨＢＮＦとは発生的に異なる時期に製造
される。ヒトのＭＫ蛋白質は発表されているマウスＭＫ
配列と約８５％の相同性を示す。現在ＭＫは、多数の異
なる種に存在する保存性の高い遺伝子ファミリ−の一員
であることが明らかになったが、ヒトにおいてそのよう
な蛋白質の存在は以前認められていなかった。

【０００３】ヒトのＭＫ蛋白質をコ−ドする遺伝子はヒ
トの新生児脳幹ＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリから
単離される。遺伝子は配列を決定され、クロ−ニングさ
れている；これは３６６−ヌクレオチド配列であり、蛋
白質が１２１アミノ酸を有することを示している。

【０００４】

【発明の背景】Ｋａｄｏｍａｔｓｕ等（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５１：１３
１２−１３１８，１９８８）はマウス細胞からｃＤＮＡ
を単離し、配列を決定し、それをＭＫ１と呼んだ。対応
するｍＲＮＡはマウスの胚の発生の初期段階に存在する
が後期段階には存在しないと言われている。ＭＫ１蛋白
質は細胞の分化、特にＤＮＡ結合蛋白質調節遺伝子発現
の制御と関連していると示唆されている。他の既知の蛋
白質配列との関連性は見いだされていない。その後の文
献（Ｔｏｍｏｍｕｒａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）は胚性がん
腫細胞分化の初期段階におけるＭＫ遺伝子の発現を報告
しており、明確に異なる３種類のｃＤＮＡクロ−ンの存
在を示し、ＭＫ１，ＭＫ２及びＭＫ３と呼んだ。Ｋａｄ
ｏｍａｔｓｕ等（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：６
０７−６１６，１９９０）はＭＫが多種類の細胞の分化
において基本的な役割を演じること、及び上皮組織の生
成及び中胚葉の改造に含まれ得ることを示唆した。

【０００５】ここでマウスＭＫ１配列はヘパリン結合神
経栄養因子（ＨＢＮＦｓ）として知られる蛋白質の群に
おいて高度の相同性を有することが見いだされた；後者
の蛋白質をコードするヌクレオチド配列は出願人等の同
時係属、及び同時出願の出願番号０７／５６８，５７４
に開示されている。ＨＢＮＦ蛋白質はＥＰ ３２５０７
６で最初にＨＢＢＭＳとして開示された。ここで予期に
反してマウスＭＫ配列に対応する遺伝子がヒトの脳でも
見いだされた。本発明はヒトの蛋白質をコードする遺伝
子の全配列、ならびに成熟蛋白質の予想アミノ酸配列、
クローニング及び発現ベクター、及び遺伝子を発現し、
純粋なＭＫ蛋白質を製造することができる宿主細胞を提
供する。ＭＫ蛋白質及びＨＢＮＦの間の強い相同性を考
慮すると、これらは発生的な意味を持つ、遺伝子及び蛋
白質のファミリーを構成するようである。

【０００６】１連のポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の
分離、及びヒト新生児脳幹から誘導したｃＤＮＡライブ
ラリのスクリ−ニングにより、ヒトＭＫをコ−ドするＤ
ＮＡ配列をクロ−ニングする。ＰＣＲ増幅のためのオリ
ゴヌクレオチドの設計のための出発点としてヒトＨＢＮ
Ｆ配列を使用する；この配列を図２に示す。ＨＢＮＦ、
及び発表されたマウス ＭＫ１ ＤＮＡ配列間に最も保
存されている領域に特異的なヌクレオチドを設計する。
このオリゴヌクレオチドをマウスゲノムＤＮＡ上のポリ
メラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマ−として
使用する。予想された１５０の塩基対生成物を適したベ
クタ−にクロ−ニングし、配列を決定する。このクロ−
ンを、ヒトＭＫ同等遺伝子の同定のためのヒト脳ｃＤＮ
Ａライブラリのスクリ−ニングのプロ−ブとして使用す
る。単一のクロ−ンを単離し、サブクロ−ニングし、配
列を決定する。これらのクロ−ンのひとつの配列を図１
に示し、１１００と見積もられる成人ＭＫ ｍＲＮＡの
ヌクレオチドの７９０ヌクレオチドと説明する。続いて
ヌクレオチド配列をより短い別のＭＫクロ−ンで確認
し、最初のクロ−ンの異なる重複フラグメントを含むこ
とがわかる。ＭＫ ｃＤＮＡの配列は２個のポリアデニ
ル化シグナル、及び１個のポリＡ末端を含む（図１）。
最初の単離クロ−ンは読み取り枠を持ち、コ−ド領域は
ヌクレオチド２２で始まり１４３残基蛋白質を定義す
る。Ｎ−末端配列は非常に嫌水性で、シグナルペプチド
を特徴とする（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８５）。Ｖｏｎ
Ｈｅｉｊｎｅにより示されたシグナルペプチドの構造に
関する基準（同；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：
４６８３−４６９０，１９８６）、及びマウスＭＫとヒ
トＨＢＮＦ配列の比較を基にして、シグナルペプチドの
分裂はアミノ酸残基２２（Ａｌａ）及び２３（Ｌｙｓ）
の間で起こり、１２１残基の長さの成熟ＭＫポリペプチ
ドが生ずると仮定する。

【０００７】図３に示す通り、ヒトＭＫ誘導アミノ酸配
列、及びマウスＭＫ蛋白質配列を比較するとその相違は
わずか約１５％である。これらの変化のほとんどは保存
的である。図２に示されたＭＫとＨＢＮＦの間の相同性
は、保存されたアミノ酸変化が含まれると５０％の相同
性が６３％に増加することを示す。両蛋白質に存在する
システインは完全に並んでおり、類似構造を示唆してい
る。

【０００８】真核蛋白質に汚染されない成熟ＭＫ蛋白質
の供給源とするために、上記で単離したｃＤＮＡクロ−
ンをＰＣＲ増幅の鋳型として使用し、メチオニンコドン
を成熟蛋白質のＮ−末端リシン残基の５’に直接配置す
るようプライマ−を設計する。増幅生成物を発現ベクタ
−ｐＥＴ−３ａの修正型（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，１９９
０）にクロ−ニングし、得られたプラスミドｐＥＴＭＨ
２をＥ．ｃｏｌｉ株 ＢＬ２１ ＬｙｓＳに形質転換す
る。ＩＰＴＧ−誘導ｐＥＴＭＨ２を含む細菌の蛋白質抽
出物は約１６．５ｋＤａ移動した蛋白質主要バンドを示
す（図４，列２）。非誘導培養物（列１，ｐＥＴＭＨ２
−含有細菌）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドの強度により
判断して、ずっと少量の蛋白質を含む。組み替えＭＫ蛋
白質を、ＩＰＴＧ−誘導細菌培養物からヘパリンアフィ
ニティ−クロマトグラフィ−（図４，列３）により精製
し、そのＮ−末端配列及びアミノ酸組成を確認する。

【０００９】ヒト、及び発表されたマウスＭＫ ＤＮ
Ａ、ならびに誘導蛋白質配列の相同性は、ＨＢＮＦの類
似の進化的比較より保存性の程度が低い。ＨＢＮＦとの
相同性から推定した成熟ＭＫ蛋白質からの推定Ｎ−末端
を用いて、マウス配列中に３個のアミノ酸の欠失を含み
８６％のアミノ酸の同一性が観察される。ＨＢＮＦ及び
ＭＫは両方とも脳で発現するが、それらの時間的、及び
空間的調節は異なる。予備的に行ったｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリッド形成により、２つのメッセ−ジのための明確
に異なる発現のパタ−ンを示した。成体組織からのマウ
スＲＮＡのノザンハイブリッド形成分析は、脳が１６５
０−ヌクレオチドＨＢＮＦメッセ−ジを発現するだけで
あることを示す（図６）。これはＨＢＮＦ蛋白質が脳に
存在することを示したＨＢＮＦ蛋白質の発現の特徴に関
する以前の研究と一致する（ＥＰ３２６ ０７５，Ｒａ
ｕｖａｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ．８：２９３３−２９４１，
１９８９）。最近、ＨＢＮＦ蛋白質が牛の子宮からも単
離された（Ｍｉｌｎｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６５：１０９６−１１０
３，１９８９）。これらの最初に実験によるとＭＫは試
験したどの成体組織中でも発現しない（図６）。しかし
その後の実験によると、ＭＫ ｍＲＮＡが成体の脳の二
領域、尾状核、及び脳幹で検出できる（図７）。胚のＲ
ＮＡの場合と比較して成体のＲＮＡにおいてこれらのバ
ンドを検出するのに非常に長時間の暴露が必要であるこ
とに基づき、ＭＫ ＲＮＡの成体における発現は最小で
あると思われる。

【００１０】両遺伝子の時間的発現を、種々の発生段階
のラットＲＮＡ全体を用いて、ノザンブロット分析によ
り評価する。ＨＢＮＦプロ−ブとのハイブリッド形成に
より、発生中を通じてメッセ−ジの量が徐々に増加し、
成体の脳で最高量となることが示された（図６ａ）。同
一ブロットのＭＫプロ−ブとのハイブリッド形成によ
り、１２−，１４−及び１６−日令の胚組織のみがメッ
セ−ジを含むことが示された。１２日令段階の胚におい
て、最も多くのＭＫメッセ−ジが存在すると思われる
（図６ｂ）。一般にこれらの結果はＫａｄｏｍａｔｓｕ
（同上）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成研究と一致
する。しかしＫａｄｏｍａｔｓｕの発見に反して我々は
腎臓組織でＭＫ ｍＲＮＡ発現を検出することはできな
かった。ラットの脳におけるＨＢＮＦ蛋白質の研究によ
り出生後７日の子供に最高量が生ずることが示された。
この量は５６日令の動物と比較すると１０倍である（Ｒ
ａｕｖａｌａ，同上）。

【００１１】ヒトの胚性がん腫（ＥＣ）細胞系 ＮＴ２
／Ｄ１を、レチノイン酸（ＲＡ）濃度０．０１−１０μ
Ｍにて分化を誘導することができ、分化ＥＣ細胞の割合
は０．０１μＭのＲＡで５０％（Ｓｉｍｅｏｎｅ等，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４６：７６３−７６６，１９９０）か
ら、１及び１０μＭのＲＡで９９％以上（Ａｎｄｒｅｗ
ｓ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １０３：２８５−２９３，１
９８４）である。ＮＴ２／Ｄ１の分化の間のＭＫ及びＨ
ＢＮＦの発現を、０．０１−１０μＭの濃度で研究す
る。ＲＡへの暴露９日後、ＲＮＡ全体を細胞から抽出
し、ノザン分析により遺伝子発現に関して調べた。両遺
伝子の発現は類似パタ−ンに従った（図８）。ｍＲＮＡ
発現の程度は０．１−０．５μＭのＲＡ濃度の場合定常
基底量以内であり、０．１−０．５μＭのＲＡ濃度の間
に急速に増加し、１０μＭのＲＡ濃度まで及びこの濃度
でその量を維持した。ＲＮＡハイブリッド形成シグナル
を標準β−アクチンプロ−ブに規格化すると、最大増加
はＨＢＮＦの場合６倍、及びＭＫの場合１１倍と算出さ
れた（図８）。これらの結果は、マウスＥＣ細胞系、Ｈ
Ｍ−１のレチノイン酸誘導の間の観察結果に匹敵する
（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ等，同上）。この細胞系におい
て、ＭＫ遺伝子発現は上記基底量の８−１０倍と推定さ
れている。

【００１２】組み替えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質を、１８
日令胎児ラットの脳ニュ−ロンのニュ−ライト自然成長
を刺激する能力に関して分析する。細菌誘導蛋白質は両
方とも、本来の牛ＨＢＮＦと類似のニュ−ライト自然成
長促進活性を示した（図５）。組み替えＭＫ蛋白質も、
牛成体の大動脈内皮細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞
に対するマイトジェン活性につき分析する。ＭＫ蛋白質
はこれらの細胞に対してマイトジェン活性を示さない。
しかしＭＫ−トランスフェクション Ｌ 細胞からのな
らし培地はＰＣ１２細胞からマイトジェン性であること
がＴｏｍｏｍｕｒａにより報告されている（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｃｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７１：６
０３，６０９，１９９０）。

【００１３】このように本発明の発見は、ＨＢＮＦ及び
ＭＫが高度に保存された遺伝子ファミリ−の一員である
ことを示している。さらに遺伝子の発現のデ−タは、こ
れらの遺伝子が組織、特に神経組織の増殖、維持、及び
／又は発生的分化において機能していることを意味して
いる。

【００１４】以下の実施例ではＭＫ遺伝子のクロ−ニン
グとＴ７ ＲＮＡポリメラ−ゼ発現系における発現を説
明する。しかし、このＴ７発現系は非常に有効である
が、これが組み替えによりＭＫを製造する唯一の手段で
はないことを理解するべきである。ＭＫの製造はＭＫ遺
伝子を適した発現ベクタ−に挿入し、その後ベクタ−を
用いて適した宿主細胞を形質転換することにより行うこ
とができる；又はベクタ−を用いずに裸のＤＮＡにより
直接宿主細胞の形質転換を行うこともできる。本発明に
より真核細胞、又は原核細胞のいずれかによるＭＫの製
造を試みる。適した真核細胞の例には、哺乳類細胞、植
物細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞が含まれる。同様に、
適した原核細胞宿主としてはＥ．ｃｏｌｉの他に枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。

【００１５】他の適した発現ベクタ−も使用することが
でき、宿主細胞の選択に基づいて選ぶ。例えば細菌細胞
の形質転換に使用するのに適した多数のベクタ−が周知
である。例えばプラスミド、及びλ−ファ−ジなどのバ
クテリオファ−ジが細菌宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉに
最も良く使用されるベクタ−である。哺乳類及び昆虫細
胞の両方において、外因性ＤＮＡの発現を得るためにウ
ィルスベクタ−を使用することが多い。特に哺乳類細胞
は通常ＳＶ４０又はポリオ−マウィルスを用いて形質転
換され；培養昆虫細胞はバクロウィルス発現ベクタ−を
用いて形質転換することができる。酵母のベクタ−系に
は酵母セントロメアプラスミド、酵母エピソ−ムプラス
ミド、及び酵母組み込みプラスミドが含まれる。

【００１６】本発明の実行は図１で定義したＭＫ遺伝子
の正確な配列の使用に限られないことも理解しなければ
ならない。得られる蛋白質分子中に現れない変化を生ず
る、配列の欠失、挿入又は置換などの配列の修正も予期
している。例えばある部位における化学的に同等なアミ
ノ酸を製造する遺伝子配列の変化を予期する；このよう
にして嫌水性アミノ酸であるアラニンを示すコドンをグ
リシンなどの他の嫌水性残基をコ−ドするコドンと容易
に置換することができ、あるいはバリン、ロイシン、又
はイソロイシンなどのより嫌水性の強い残基と置換する
こともできる。同様にある負に帯電した残基から他への
置換を起こす変化、例えばアスパラギン酸からグルタミ
ン酸への変化、あるいはある正に帯電した残基から他へ
の置換を起こす変化、例えばリシンからアルギニンへの
変化も生物学的に同等な生成物を製造すると思われる。
蛋白質分子中のＮ−末端及びＣ−末端の割合を変えるヌ
クレオチドの変化は、通常これらの領域が生物活性に含
まれないので多くの場合蛋白質の活性を変化させない。
組み替えにより蛋白質を製造する場合、システインが存
在すると望ましくない多量体の形成が起こり、そのため
に精製及び結晶化過程が複雑になり得るので配列中に存
在する１個又はそれ以上のシステインを除去するのが望
ましい。提案される修正のそれぞれはコ−ドされた生成
物の生物活性の保持の決定と同様にこの分野における全
く日常的技術である。従って”ＭＫＤＮＡ配列”又は”
ＭＫ遺伝子”という言葉が明細書及び特許請求の範囲中
で使用される場合、それは生物学的に同等のＭＫ蛋白質
を製造するそのような修正及び変化のすべてを含むもの
とする。特に本発明は、図１の配列と十分に重複してお
り、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，１９８２）に記載されているような標準的高
緊縮サザンハイブリッド形成条件下でそれとハイブリッ
ド形成できるＤＮＡ配列を意図する。ＭＫ蛋白質はＨＢ
ＮＦ蛋白質と強い相同性を有し、ＨＢＮＦと同様にニュ
−ライト自然成長の誘導を刺激する。従ってＭＫを神経
栄養剤として提案する。そのままでＭＫ蛋白質は生体内
及び試験管内の両方において、末梢及び中枢神経系の神
経細胞の成長、維持、及び修復に有用である。試験管内
適用の例は、パ−キンソン氏病の治療における使用が現
在提出されている、胚脳移植の維持における利用であ
る。

【００１７】分化における明らかな役割を考慮して、Ｍ
Ｋ蛋白質を一般組織の分化、維持、及び修復因子として
も提案する。特にＭＫは分化表現型への逆行を起こす腫
瘍細胞の治療に有用であることができる。

【００１８】中枢又は末梢神経系の損傷の治療における
ＭＫの生体内投与は遺伝子配列の発見により非常に単純
になる。遺伝子及びその配列の同定により、繊維芽細
胞、単球、又はマクロファ−ジなどのトランスジェニッ
ク細胞の構築ができるようになり、これらをＭＫ遺伝子
の発現を許すように設計し、神経破壊異常、手術に続く
末梢神経の修復、又は神経細胞の成長、及び／又は修復
の強化が望まれる状態のための移植組織として使用する
ことができる。

【００１９】さらにＭＫの治療への利用はヒトのみに限
られてはいない。実際に関連性の薄い種の間でのこの蛋
白質の保存性を考慮すると、どのような形態におけるＭ
Ｋの投与も同様に獣医学的適用に有益である。治療配合
物は所望の生物活性を起こすのに有効な量のＭＫを製薬
上許容できる液体又は固体キャリヤ−と組み合わせて含
む。又は、配合物は試験管内でＭＫを発現できる適合性
トランスジェニック細胞の製薬上許容できる集合を、末
梢及び中枢神経系修復、又は分化治療のための移植組織
として含む。

【００２０】

【実施例】ＭＫ遺伝子のクロ−ニング及び配列決定 発表されたマウスＭＫ蛋白質アミノ酸配列を用いてポリ
メラ−ゼ連鎖反応におけるプライマ−として使用する特
異的オリゴヌクレオチドを製造した。Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、同上、に記載の通り、Ｃ５７ Ｂｌａｃｋ／６Ｊ
マイスからマウスゲノムＤＮＡを単離した。

【００２１】ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位から出発してアミ
ノ酸配列：ＣＮＷＫＫＥＦＧ（図１）に対して認識プラ
イマ−を作り、それはＤＮＡ配列：５’ＧＧＡＡＴＴＣ
ＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴ−３’を
含んだ。

【００２２】相補的ＤＮＡ上でＴａｇポリメラ−ゼを用
い、５０℃における１分間のアニ−リング、７２℃にお
ける２分間の伸張、及び９４℃における１分間の変性を
３０サイクル行ってＰＣＲ反応を行った（ＵＳＢ Ｃｏ
ｒｐ．）。

【００２３】１５０塩基対のマウスＭＫ ＰＣＲ生成物
をブル−スクライブ（＋）ベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）にクロ−ニングし、新生脳幹及び大脳基底核 λ
ｇｔ １１ ｃＤＮＡライブラリにおけるスクリ−ニン
グに使用する（Ｋａｍｈｏｌｚ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
３：４９６２−５４９６６，１９８６）。ＭＫ配列を含
むと推定される単一のクロ−ンを単離し、ブル−スクラ
イブ（＋）のＥｃｏＲＩ部位にサブクロ−ニングし、ジ
デオキシヌクレオチド連鎖停止法により配列決定する
（Ｓａｎｇｅｒ等 ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４：５４６３
−５４６７，１９８８）。ＭＫ遺伝子の配列、並びに予
測アミノ酸配列を図１に示す。マウスＭＫ配列と比較す
ると、マウス配列における３個のコドンの欠失を含めて
４１のヌクレオチドの相違がある。

【００２４】組み替えヒトＭＫの発現 ｐＭＫＨＣ２と呼ぶ上記の単離クロ−ンを、メチオニン
コドン及びＮｄｅ Ｉ制限部位をＮ−末端リシンの５’
に直接配置するよう設計したプライマ−を用いたＰＣＲ
増幅のための鋳型として使用する。精製ＰＣＲ生成物
を、１４００ｂｐＳａｌｌ／ＰｖｕＩＩフラグメントの
欠失、及びｆ１複製起点のＥｃｏＲＩ部位への挿入によ
り修正した発現ベクタ−ｐＥＴ−３ａの誘導体にクロ−
ニングする。ＰＣＲ増幅の正確性を確認するために挿入
物の配列を決定した後、プラスミド（ｐＥＴＭＨ２と名
付ける；以前ｐＥＴＭＫＨＣ２とも呼ばれた）を株 Ｂ
Ｌ２１ ｌｙｓＳに形質転換し、記載の通りＩＰＴＧを
用いて蛋白質製造を誘導する（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，同
上）。１ｍｌの培養物からの菌糸塊を１００μｌのＳＤ
Ｓ緩衝液中に再懸濁させ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２２７：６８０−６８５，１９７０）、２．５μｌ
を１５アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流す。
ゲルをク−マシ−ブル−を用いて染色する。組み替えＭ
ＫをｐＨ７．０のトリス１０ｍＭ中のヘパリン セファ
ロ−ス ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂上で細
菌抽出物から精製し、１−１．１３ＭのＮａＣｌにて溶
離する。さらに５０ｍＭのｐＨ６．８のリン酸ナトリウ
ム中のＭｏｎｏ Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上で
ＮａＣｌを用い、０−１Ｍまで塩濃度を増加させて精製
する。精製蛋白質は０．６Ｍ ＮａＣｌにて溶離する。

【００２５】ニュ−ライト自然成長分析 １８日令の胎児ラットから脳を無菌下で取り出し、無菌
の５ｍｌシリンジを用いて１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ
中に分散して単一細胞とする。細胞懸濁液を５ｘ１０⁵
細胞／ｍｌに調節し、室温で３０分間５０μｇ／ｍｌの
ポリ−Ｌ−リシンを予備被覆した組織培養皿にひろげる
（Ｒａｕｖａｌａ ａｎｄ Ｐｉｈｌａｓｋａｒｉ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６６２５−１６６
３５，１９８７）。培養物を１０％ＣＯ₂中、３７℃に
て２４時間インキュベ−トし、その後培地を１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを含むＤＭＥＭに変え、ＨＢＮＦ又はＭＫ蛋
白質を指示された濃度で加える。さらに１日インキュベ
−トした後、細胞の視覚試験により標準と比較した拡大
自然成長／プロセスに関してニュ−ライト自然成長活性
を決定する。図５Ｄに示す通り、精製組み替えＭＫは、
組み替えＨＢＮＦ及び牛の脳から誘導したＨＢＮＦと実
質的に同程度にニュ−ライト自然成長を刺激することが
できる。

【００２６】ヒトＮＴ２／Ｄ１細胞の成長とレチノイン酸誘導 ヒトの胚性がん腫細胞系ＮＴ２／Ｄ１を前記のようにし
て成育する（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０
３：２８５−２９３，１９８４）。レチノイン酸誘導の
ために細胞を成育し、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ培
地に１００ｍｍの皿当たり５ｘ１０⁵細胞の密度で再分
散する（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）。ジメチルスルホキシド（１０μｌ）中の種
々の濃度の全−トランスレチノイン酸を加え、細胞を９
日間インキュベ−トする。第４日及び８日目に新しい培
地及びＲＡを加える。皿をリン酸塩緩衝生理食塩水で１
度洗浄し、ＲＮＡを上記の通りに抽出する。図８はレチ
ノイン酸の濃度の変化量に対応する、製造ＨＢＮＦ及び
ＭＫの量をグラフで示したものである。ＲＡを用いて誘
導したＮＴ２／Ｄ１細胞はニュ−ロン分化の研究のモデ
ル系となることが示されているので（Ｌｅｅ 及び Ａ
ｎｄｒｅｗ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：５１４−５２
１，１９８６）、この系におけるＨＢＮＦ及びＭＫ遺伝
子の誘導の増加はニュ−ロン細胞発生における可能な役
割を示している。

【００２７】生物学的素材の貯蔵 ｐＭＫＨＣ２を含むＥ．ｃｏｌｉ株 Ｍ １０６１、及
びｐＥＴＭＨ２を含むＥ．ｃｏｌｉ株 ＢＬ２Ｔ Ｌｙ
ｓＳを、Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｙａｎａｍｉｄＣｏｍｐ
ａｎｙ，Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＰｅａｒｌＲｉｖｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋのカルチャ−
コレクション、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ
に、それぞれ１９９０年８月１３日受け入れ番号ＡＴＣ
Ｃ ６８３８４、及び１９９０年９月１７日受け入れ番
号６８４０１として貯蔵した。

【００２８】配列ＩＤ番号：１ 配列の種類：核酸、及びアミノ酸 配列の長さ：７９９塩基対 １４３アミノ酸 らせん：一重 トポロジ−：直線 供給生物：ヒト 特性：ヒトＭＫ遺伝子及び蛋白質配列

【００２９】

【表１】 配列ＩＤ番号：２ 配列の種類：核酸、及びアミノ酸 配列の長さ：３５４塩基対 １１８アミノ酸 らせん：一重 トポロジ−：直線 供給生物：マウス 特性：マウスＭＫ遺伝子及び蛋白質配列

【００３０】

【表２】 配列ＩＤ番号：３ 配列の種類：核酸、及びアミノ酸 配列の長さ：４１１塩基対 １３６アミノ酸 らせん：一重 トポロジ−：直線 供給生物：ヒト 特性：ヒトＨＢＮＦ遺伝子及び蛋白質配列

【００３１】

【表３】 本発明の主たる特徴及び態様は以下の通りである。

【００３２】１．精製及び単離されたヒトＭＫ蛋白質を
コードする遺伝子。

【００３３】２．第１項に記載の遺伝子において、生物
活性ＭＫ蛋白質をコ−ドする、図１に描いたＭＫ配列又
はその一部を有することを特徴とする遺伝子。

【００３４】３．第１項に記載の遺伝子において、標準
高緊縮条件下で図１に描いたＭＫ配列とハイブリッド形
成することができることを特徴とする遺伝子。

【００３５】４．実質的に純粋なＭＫ蛋白質の製造法に
おいて、第１項に記載の遺伝子を有する宿主細胞を形質
転換し、宿主細胞による遺伝子の発現を許す条件下で宿
主細胞を培養することから成ることを特徴とする方法。

【００３６】５．第１項に記載の遺伝子を含む発現ベク
タ−。

【００３７】６．第１項に記載の遺伝子を含む宿主細
胞。

【００３８】７．第６項に記載の細胞において、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎにＡＴＣＣ ６８３８４として貯蔵された細
胞。

【００３９】８．精製単離された図１に描いた配列を有
するＭＫ蛋白質、及びＭＫ生物活性を保持しているその
相同体又はフラグメント。

【００４０】９．有効量のＭＫ蛋白質を、製薬上許容で
きるキャリヤ−と組み合わせて含む治療配合物。

【００４１】１０．第９項に記載の配合物において、蛋
白質が図１に描いた配列を有する、又はＭＫ生物活性を
保持しているその相同体又はフラグメントであることを
特徴とする配合物。

【００４２】１１．試験管内の神経細胞の成長を保持、
又は促進する方法において、有効量の第８項に記載の蛋
白質の存在下で細胞を培養することから成ることを特徴
とする方法。

【００４３】１２．損傷神経細胞を生体内で修復又は治
療する方法において、そのような治療の必要な個人にＭ
Ｋ蛋白質を発現することができる適合性トランスジェニ
ック細胞を投与することから成ることを特徴とする方
法。

【００４４】１３．未分化細胞の分化を起こす方法にお
いて、有効量のＭＫ蛋白質を細胞に適用することを含む
方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１（配列表１も参照）。ヒトＭＫ遺伝子のヌ
クレオチド及びアミノ酸配列。太字のアミノ酸は予想蛋
白質配列を示し、矢印は成熟蛋白質の予想Ｎ−末端を示
し、マウスゲノムＤＮＡプロ−ブを増幅するために使用
したプライマ−１及び２に対応する２箇所のペプチド配
列に下線を引く。遺伝子の３’末端近辺の２カ所のポリ
アデニル化配列に下線を引く。

【図２】図２はヒトＨＢＮＦの成熟蛋白質領域（配列表
３も参照）、及びＭＫヌクレオチドの比較を示し、アミ
ノ酸配列を推定する。同一のアミノ酸を太字で示す。二
ヌクレオチド配列の一致を星（＊）で示す。

【図３】図３はヒト及びマウスＭＫのヌクレオチド配列
及び推定アミノ酸配列を示す（配列表２も参照）。二ヌ
クレオチド配列における相違を星（＊）で示す。アミノ
酸における相違を太字で示す。マウスゲノムＰＣＲプラ
イマ−設計に使用したアミノ酸に下線を引く。

【図４】図４はヒト組み替えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質の
細菌における発現。細胞溶解物は発現プラスミドｐＥＴ
ＨＨ８又はｐＥＴＭＨ２を含む培養細菌から得る。列１
及び２はｐＥＴＭＨ２を含む非誘導、及びＩＰＴＧ誘導
培養物。列３は精製組み替えＭＫ蛋白質。列４及び５は
ｐＥＴＨＨ８を含む非誘導、及び誘導培養物。列６は精
製組み替えＨＢＮＦ蛋白質。蛋白質標準はＢＲＬからの
ものである。

【図５】図５は精製組み替えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質の
ニュ−ライト自然成長分析。精製蛋白質は１８日令ラッ
ト胎児ニュ−ロン上で、示した濃度にて分析した。
（Ａ）蛋白質を加えない神経細胞。（Ｂ）牛の脳からの
ＨＢＮＦ蛋白質（１６０μｇ／ｍｌ）。（Ｃ）精製組み
替えヒトＨＢＮＦ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）。（Ｄ）
精製組み替えヒトＭＫ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）。

【図６】図６は（ａ）ラットの胚形成の間のＨＢＮＦ遺
伝子の発現を示す。各組織から１列当たり２０μｇの全
ＲＮＡを適用し、³²Ｐ−標識ヒトＨＢＮＦ ｃＤＮＡプ
ロ−ブとハイブリッド形成した。ＲＮＡの単離に使用し
た組織は、Ｅ８及びＥ１０の場合は胚プロパ−全体、Ｅ
１２及びＥ１４の場合は頭、Ｅ１６，Ｅ１８，Ｅ２０，
Ｐ２及び成体（Ａｄｕｌｔ）の場合は脳全体であった；
（ｂ）ラットの胚形成の間のＭＫ遺伝子の発現。（ａ）
と同様に³²Ｐ−標識ヒトＭＫ ｃＤＮＡプロ−ブとハイ
ブリッド形成した（ａ）と同様のノザンブロット。

【図７】図７は成体ラット脳におけるＨＢＮＦ及びＭＫ
の遺伝子発現。２月令のラットの脳の種々の領域から抽
出したＲＮＡに関してノザン分析を行った（１列当たり
１０μｇのＲＮＡ；列１−脳全体、２−皮質、３−海
馬、４−小脳、５−尾状核、６−中脳＋視床下部，７−
脳幹）。得られたブロットを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及
びβ−アクチンのプロ−ブとハイブリッド形成した。

【図８】図８はＮＴ２／Ｄ１細胞におけるＨＢＮＦ及び
ＭＫ遺伝子のレチノイン酸−誘導による発現。ＮＴ２／
Ｄ１細胞を種々の濃度のＲＡで処理し、９日成育し、Ｒ
ＮＡを抽出した。（Ａ）ノザン分析では各ＲＡ濃度につ
き１０μｇのＲＮＡを使用した。得られたブロットを連
続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンとハイブリッド
形成した。（Ｂ）（Ａ）ＨＢＮＦ（黒）、及びＭＫ（斜
線）で得たハイブリッドシグナルをデンシトメトリ−に
より測定し、β−アクチンのシグナルに対して規格化し
た。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年８月２７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＭＫ遣伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配
列。太字のアミノ酸は予想蛋白質配列を示し、矢印は成
熟蛋白質の予想Ｎ−末端を示し、マウスゲノムＤＮＡプ
ローブを増幅するために使用したプライマー１及び２に
対応する２箇所のペプチド配列に下線を引く。遣伝子の
３′末端近辺の２カ所のポリアデニル化配列に下線を引
く。

【図２】 ヒトＨＢＮＦ及びＭＫヌクレオチド配列とそれ
らの推定アミノ酸（一文字標記）配列の一部を示す。こ
の配列に

【図３】に示される配列が連続して、ヒトＨＢＮＦ及び
ＭＫ配列の全体を構成する。星印（＊）は両ヌクレオチ
ド配列の一致する部分を示す。

【図３】

【図２】の配列に連続するヒトＨＢＮＦ及びＭＫヌクレ
オチド配列とその推定アミノ酸配列の一部を示す。

【図４】 ヒトＭＫのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列
並びにマウスＭＫのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示
す。両ヌクレオチド配列の相違する部分を星印（＊）で
示す。

【図５】 ヒト組み換えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質の発現を
表わす、各培養細菌の細胞溶解物のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真で
ある。列１及び２はｐＥＴＭＨ２を含む非誘導、及びＩ
ＰＴＧ誘導培養物。列３は精製組み替えＭＫ蛋白質。列
４及び５はｐＥＴＭＨ８を含む非誘導、及び誘導培養
物。列６は精製組み替えＨＢＮＦ蛋白質。蛋白質標準は
ＢＲＬからのものである。

【図６】 組み換えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質刺激による脳
ニユーロンのニユーライト（神経細胞突起）の成長の様
子（生物の形態）を示す図面に代わる写真である。な
お、（Ａ）は蛋白質を加えない神経細胞であり、（Ｂ）
は牛の脳からのＨＢＮＦ蛋白質（１６０μｇ／ｍｌ）を
加えた神経細胞である。

【図７】 図６に準ずる写真である。なお、（Ｃ）は、精
製組み替えヒトＨＢＮＦ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）を
加えた神経細胞であり、（Ｄ）は精製組み替えヒトＭＫ
蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）を加えた神経細胞である。

【図８】 ラットの胚形成の間のＨＢＮＦ遺伝子の発現を
表わし（ａ）、そしてラットの胚形成の間のＭＫ遺伝子
の発現を表わす（ｂ）ための各ＲＮＡのゲル電気泳動
（ノーザンハイブリッド形成処理済み）の結果を示す図
面に代わる写真である。（ａ）は、各組織から１列当た
り２０μｇの全ＲＮＡを適用し、^３２Ｐ−標識ヒトＨＢ
ＮＦ ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成した。ＲＮ
Ａの単離に使用した組織は、Ｅ８及びＥ１０の場合は胚
プロパー全体、Ｅ１２及びＥ１４の場合は頭、Ｅ１６，
Ｅ１８，Ｅ２０，Ｐ２及び成体（Ａｄｕｌｔ）の場合は
脳全体であった；（ｂ）は、（ａ）と同様に^３２Ｐ−標
識ヒトＭＫ ｃＮＡプローブとハイブリッド形成した
（Ａ）と同様のノーザンブロット。

【図９】 成体ラット脳におけるＨＢＮＦ及びＭＫの遺伝
子を表わすゲル電気泳動（ノーザンハイブリッド形成処
理済み）の結果を示す図面に代わる写真である。２月令
のラットの脳の種々の領域から抽出したＲＮＡに関して
ノザン分析を行った（１列当たり１０μｇのＲＮＡ；列
１−脳全体、２−皮質、３−海馬、４−小脳、５−尾状
核、６−中脳＋視床下部，７−脳幹）。得られたブロッ
トを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンのプロー
ブとハイブリッド形成した。

【図１０】 上段の図は、ＮＴ２／Ｄ１細胞におけるＨＢ
ＮＦ及びＭＫ遺伝子のレチノイン酸誘導による発現を表
わすための各ＲＮＡのゲル電気泳動（ノーザンハイブリ
ッド形成処理済み）の結果を示す図面に代わる写真であ
る。ＮＴ２／Ｄ１細胞を種々の濃度のＲＡで処理し、９
日成育し、ＲＮＡを抽出した。ノーザン分析では各ＲＡ
濃度につき１０μｇのＲＮＡを使用した。得られたブロ
ットを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンとハイ
ブリッド形成した。下段の図は、上記のＨＢＮＦ
（黒）、及びＭＫ（斜線）で得たハイブリッドシグナル
をデンシトメトリーにより測定し、β−アクチンのシグ
ナルに対して規格化したグラフである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【図３】

【図１】

【図４】

【図６】

【図５】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 精製及び分離されたヒトＭＫ蛋白質をコ
   −ドする遺伝子。
2. 【請求項２】 実質的に純粋なＭＫ蛋白質の製造法にお
   いて、請求項１に記載の遺伝子を有する宿主細胞を形質
   転換し、宿主細胞による遺伝子の発現を許す条件下で宿
   主細胞を培養することから成ることを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の遺伝子を含む発現ベク
   タ−。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の遺伝子を含む宿主細
   胞。
5. 【請求項５】 精製単離された図１に描いた配列を有す
   るＭＫ蛋白質、及びＭＫ生物活性を保持しているその相
   同体又はフラグメント。
6. 【請求項６】 有効量のＭＫ蛋白質を、製薬上許容でき
   るキャリヤ−と組み合わせて含む治療配合物。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の配合物において、蛋白
   質が図１に描いた配列を有する、又はＭＫ生物活性を保
   持しているその相同体又はフラグメントであることを特
   徴とする配合物。
8. 【請求項８】 試験管内の神経細胞の成長を保持、又は
   促進する方法において、有効量の請求項５に記載の蛋白
   質の存在下で細胞を培養することから成ることを特徴と
   する方法。
9. 【請求項９】 損傷神経細胞を生体内で修復又は治療す
   る方法において、そのような治療の必要な個人にＭＫ蛋
   白質を発現することができる適合性トランスジェニック
   細胞を投与することから成ることを特徴とする方法。
10. 【請求項１０】 未分化細胞の分化を起こす方法におい
    て、有効量のＭＫ蛋白質を細胞に適用することを含む方
    法。