DE69033961T2

DE69033961T2 - Zellinien, die einen biologisch aktiven faktor-ix exprimieren

Info

Publication number: DE69033961T2
Application number: DE69033961T
Authority: DE
Inventors: Sophie Jallat; Pierre Meulien; Andrea Pavirani; Frederic Perraud
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1989-08-09
Filing date: 1990-08-09
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2010-08-10
Also published as: JPH04501209A; US5814716A; CA2039153A1; ATE217905T1; EP0437599A1; FR2650838A1; DE69033961D1; EP0437599B1; WO1991002056A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue immortalisierte Zellinien, die von transgenen Tieren, aber nicht Menschen, gewonnen wurden und einen biologisch aktiven Faktor IX exprimieren, sowie ein neues Verfahren zur Erzeugung des Faktors IX aus den erfindungsgemäßen Zellinien.
Der menschliche Faktor IX ist ein Protein mit 415 Aminosäuren (reife Form), welches natürlich im Blut vorhanden ist und in der Reaktionsabfolge zum Einsatz kommt, die zur Koagulation des Blutes führt. Der Faktor IX wird im wesentlichen in der Leber synthetisiert, ursprünglich in Form eines Vorläufers, der sodann zumindest vier Post-Translationsmodifikationen unterzogen wird: (i) einer γ-Carboxylierung, die sich auf 12 Glutaminsäure-Reste erstreckt, (ii) einer Glycosylierung, (iii) einer β-Hydroxylierung des Asparginsäure-Restes in der Position 64 sowie (iv) der Freisetzung des Signalpeptides durch proteolytische Spaltung, gefolgt von jener des Propeptids. Der auf diese Weise verarbeitete Faktor IX wird in das Blut sekretiert. Wenn ein Koagulationsereignis des Blutes stattfindet, wird die zirkulierende Form des Faktors IX mit einer einzigen Kette (zymogene Form) in Anwesenheit des aktivierten Faktors Xl gespalten, um die aktivierte Form des Faktors IX mit Doppelkette (Faktor IXa) zu ergeben, der nun an einem Komplex teilnimmmt, der auch einen Faktor Villa, Phospholipide, die von der Membran der Blutplättchen abstammen, und Calcium umfaßt.
Der erbliche Mangel des menschlichen Faktors IX ist die Ursache für eine schwere Krankheit, die Hämophilie des Typs B, an der eines von dreißigtausend männlichen Subjekten leidet. Derzeit werden die Patienten durch Infusion von konzentrierten Faktor IX-Präparaten behandelt, die von menschlichem Plasma abstammen. Die Patienten werden somit aufgrund des möglichen Vorhandenseins von nicht feststellbaren pathogenen Stoffen im Blut der Spender nicht unerheblichen Infektionsgefahren ausgesetzt. Um diesen großen Nachteil zu vermeiden, werden seit langem Untersuchungen durchgeführt, um den Faktor IX durch die Techniken der rekombinanten DNA zu erzeugen. Es wurden verschiedene Expressionssysteme vorgeschlagen, insbesondere Systeme, die Wirtszellen von Säugetieren einsetzen. Dennoch wurde rasch festgestellt, daß der Faktor IX, der auf diese Weise erzeugt wurde, nicht richtig entwickelt war und daß seine Aktivität weit unter jener des von dem Blutplasma abstammenden Faktors IX lag.
Parallel dazu wurde auch die Expression des menschlichen Faktors IX in transgenen Tieren erhalten. Choo et al., Nucl. Acids Res. (1987) 15: 871 berichtet von der Expression dieses Proteins in transgenen Mäusen, in die vorher die komplementäre DNA (cDNA) eingeführt wurde, welche für den Faktor IX codiert, der unter die Kontrolle des induzierbaren Promotors des Metallthionein-Gens des Schafes gestellt ist. Ausgehend von diesem Promotor wird ein signifikantes Transkriptionsniveau nur in Anwesenheit von Zink induziert. Obwohl der auf diese Weise erzeugte Faktor IX biologisch aktiv ist, kann das Experiment von Choo et al., obwohl es wissenschaftlich interessant ist, somit aus offensichtlichen Gründen der Wirksamkeit und der Ethik keine industrielle Anwendung finden.
Weiter beschreibt die europäischen Patentanmeldung 0 298 807 ein Verfahren zur Herstellung von stabilen Zellinien für die Erzeugung von bestimmten Proteinen, insbesondere des α-Antitrypsins, durch Herstellung eines Vektors, der eine onkogene Sequenz und eine komplementäre DNA-Sequenz des betreffenden Proteins umfaßt.
Schließlich beschreibt das Dokument EP-A-316 558 das Klonieren der cDNA des für den menschlichen Faktor IX codierenden Gens zu Diagnosezwecken und zur Erzeugung des Faktors IX auf rekombinantem Weg. In diesem Zusammenhang schlagen die Autoren verschiedene Expressionssysteme vor, die bei Bakterien oder Säuger-Zellen einzusetzen sind.
Es wurde nun gefunden, daß immortalisierte Zellinien, die von der Leber von transgenen Tieren abstammen und in ihrem Genom ein oder mehrere DNA-Fragmente, die eine Sequenz des genomischen oder Minigen-Typs aufweisen, die für den menschlichen Faktor IX codiert, und ein zweites exogenes DNA-Fragment, das eine für ein Onkogen codierende Region umfaßt, integriert aufweisen, wenn sie kultiviert werden, einen Faktor IX erzeugen können, dessen Aktivität ähnlich jener des Faktors IX ist, der im menschlichen Blutplasma vorhanden ist.
Folglich schlägt die Erfindung eine trans-immortalisierte Zellinie hepatischen Ursprungs vor, die in der Lage ist, einen Faktor IX menschlichen Ursprungs zu exprimieren, dessen Aktivität ähnlich jener des Faktors IX ist, der im menschlichen Plasma vorhanden ist, und in ihrem Genom ein exogenes DNA- Fragment, das eine Region des genomischen oder Minigen-Typs umfaßt, die für den menschlichen Faktor IX codiert, wobei diese Sequenz unter die Kontrolle einer spezifischen Promotorregion der Leber gestellt ist, und ein zweites exogenes DNA-Fragment integriert aufweist, das eine Region umfaßt, die für ein Onkogen codiert, wobei die codierende Region unter die Kontrolle einer geeigneten Promotorregion gestellt ist.
Unter "Faktor IX menschlichen Ursprungs" ist jedes Protein zu verstehen, das die beiden folgenden Merkmale aufweist:
- Das Protein ist aus dem menschlichen Faktor IX, dessen Aminosäuresequenz in Anson et al., EMBO J. (1984) 3: 1053, angegeben ist, und allen Analoga desselben ausgewählt, die Modifikationen in der Aminosäuresequenz aufweisen. Diese Modifikationen können Deletionen, Insertionen oder ein Ersatz von Aminosäuren durch andere sein. Unter "Analoga des menschlichen Faktors IX" ist auch jedes Protein zu verstehen, das dieselbe Aminosäuresequenz wie der menschliche Faktor IX besitzt, das jedoch unterschiedliche Post-Translations-Modifikationen aufweist.
- Das Protein besitzt eine Koagulations-Aktivität, wie durch den Koagulations-Test mit Kaolin (einmalige Dosierung) nachgewiesen wurde, der von Austen & Rhymes, (1975) A laboratory manual of blood coagulation, Blackwell Scientific Ed.; beschrieben wurde; diese Aktivität wird im folgenden Textverlauf "Faktor IX"-Aktivität genannt. Als Beispiel wird nachfolgend eine detaillierte Beschreibung einer besonderen Ausführungsform dieses Tests angeführt.
100 ul eines Plasmas ohne Faktor IX (Stago) und 100 ul einer Cephalin-Kaolin-Lösung [25 mg Kaolin (Merck; Referenz 1906); 100 ul Cephalin (Stago) für ein Endvolumen von 10 ml in einem Puffer Owren & Koller (5,5 g/l, von 5,5-Diethylbarbitursäure, 3,69 g/l Natriumacetat, NaCl 0,63%, pH-Wert 7,3) werden zu 100 ul einer Aliquote einer zu testenden Probe hinzugefügt. Falls erforderlich, kann diese Probe vorher in einem Imidazol-Puffer (1,75 g/l; pH-Wert 7,4) verdünnt werden. Dieses Präparat wird 180 Sekunden lang bei 37ºC inkubiert, sodann werden 100 ul 0,025M CaCl&sub2; hinzugefügt. Die Latenzzeit vor der Bildung eines Gerinnsels (Koagulationszeit) wird automatisch gemessen (Behring Fibrintimer 10). Die "Faktor IX"-Aktivität wird in der Folge als Funktion eines geeichten Bereichs bestimmt, der folgendermaßen hergestellt wird: ein Kontrollplasma, das den Faktor IX enthält (Kontrollplasma N FVIII- FIX von Stago, dessen Aktivität durch die Lieferfirma angegeben wird; 1E = 5 ug des Faktors IX) wird zu 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 und 1/160 in einem Imidazol-Puffer verdünnt. Die Koagulationszeit wird für jede der Verdünnungen gemessen, und die Eichungskurve wird erstellt (Einheit "Faktor IX" als Funktion der Koagulationszeit auf einer logarithmischen Skala). Wenn die oben beschriebene Vorgehensweise durchgeführt wird, wird angenommen, daß eine getestete Probe keine "Faktor IX"-Aktivität aufweist, wenn die gemessene Aktivität geringer als 250 ng/ml ist.
Wenn dieser Test mit dem Plasma eines transgenen Tieres durchgeführt wird, das den menschlichen Faktor IX exprimiert, muß eine doppelte Probenreihe verwendet werden; die erste Reihe, die Plasma, wie es entnommen wurde, umfaßt; und die zweite Reihe, die Plasma umfaßt, das mit neutralisierenden Anti-Human-Faktor IX-Antikörpern behandelt wurde, mit der Maßgabe, daß diese Antikörper keine Kreuzreaktion mit dem Faktor IX der betreffenden Tiere aufweisen. Dies ermöglicht es, durch Bewertung des Unterschiedes der parallel erhaltenen Resultate die Faktor IX-Aktivität festzustellen, die speziell auf den menschlichen Faktor IX zurückgeht. Schließlich wird, falls erforderlich, das Plasma der transgenen Tiere stärker mit einem Imidazol-Puffer verdünnt.
Unter "Faktor IX menschlichen Ursprungs, der eine Aktivität ähnlich jener des im menschlichen Plasma vorhandenen Faktors IX aufweist", ist ein Faktor IX menschlichen Ursprungs zu verstehen, der durch eine gegebene Probe repräsentiert wird, deren Faktor IX-Aktivität, gemessen in ug/ml unter Einsatz des vorstehend beschriebenen Tests von Austen & Rhymes, gleich mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 80% oder noch besser mindestens 90% der Gesamtmenge des Faktors IX in der Probe ist, gemessen in ug/ml durch einen ELISA-Test. Ein spezielles ELISA-Kit für den Faktor IX ist im Handel bei Diagnostica Stago, Asnieres, Frankreich, erhältlich. Unter Berücksichtigung der Definition des vorliegenden Absatzes weist der im menschlichen Plasma vorhandene Faktor IX eine Faktor IX-Aktivität von ungefähr 100% auf. Ganz allgemein wird ein Faktor IX, der dem oben erwähnten Aktivitätskriterium entspricht, mit dem Ausdruck "biologisch aktiver Faktor IX" bezeichnet.
Unter "spezifische Promotorregion der Leber" ist ein Säugetierpromotor oder ein Teil desselben zu verstehen, der in der Lage ist, die Transkription einer codierenden Sequenz in einer begrenzten Anzahl von Säugetierzelltypen (nicht in allen Typen) zu initiieren, insbesondere in einer hepatischen Zelle oder einer Zelle hepatischen Ursprungs. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein spezifischer Promotor der Leber ein Promotor, der in der Lage ist, die Transkription einer codierenden Sequenz im wesentlichen in einer hepatischen Zelle oder einer Zelle hepatischen Ursprungs zu initiieren; beispielsweise der Promotor des Gens des α-Antitrypsins oder des Faktors IX und die Teile derselben, die ausreichen, um die Expression dieser codierenden Region zu induzieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird dieser letztgenannte Promotor besonders bevorzugt, obwohl bisher angenommen wurde, daß die durch den Promotor des Gens des Faktors IX gesteuerte Expression geringer als die durch den Promotor des α-Antitrypsin-Gens gesteuerte Expression ist.
Ganz allgemein kann eine erfindungsgemäße Zellinie durch ein Verfahren der Transimmortalisierung in vivo gewonnen werden. Sie kann somit aus einer Kultur von hepatischen Tumorzellen ausgewählt werden, die einem transgenen Tier oder einem Tier entnommen wurden, bei dem ein hepatischer Tumor, der von einem transgenen Tier abstammt, fortgepflanzt wurde.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter "transgenem Tier" ein nicht menschliches transgenes Tier zu versehen, das in seinem Genom ein Fragment exogener DNA umfaßt, das eine für einen Faktor IX menschlichen Ursprungs codierende Region oder eine für ein Onkogen codierende Region umfaßt, und das in der Lage ist, die entsprechenden Proteine zu exprimieren. Dieses transgene Tier kann vollständig transgen (alle seine Zellen besitzen das exogene DNA-Fragment) oder auch ein Mosaik sein (das exogene DNA-Fragment befindet sich in einem gewissen Prozentsatz der Zellen, aber nicht in allen). Dieses transgene Tier ist vorzugsweise ein nicht menschliches Säugetier, insbesondere ein kleines Nagetier und auf besonders bevorzugte Weise eine Maus.
Unter Berücksichtigung des vorher gesagten muß ein transgenes Tier, aus dem eine Zellinie abgeleitet werden kann, doppelt transgen sein: für den Faktor IX und für ein Onkogen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform wird ein solches Tier durch Entwicklung eines Eis erhalten, in das sowohl (i) ein erstes exogenes DNA-Fragment, das eine für den Faktor IX codierende Region enthält, die unter die Kontrolle einer für die Leber spezifischen Promotorregion gestellt ist, als auch (ii) ein zweites DNA-Fragment injiziert wurde, das eine für ein Onkogen codierende Region (eine onkogene Sequenz) enthält, die unter die Kontrolle einer geeigneten Promotorregion gestellt ist, beispielsweise eines für die Leber spezifischen Promotors. Das erste und das zweite DNA-Fragment können als zwei unterschiedliche DNA-Moleküle oder auch als eine einzige DNA-Einheit eingespritzt werden.
Gemäß einer zweiten alternativen Ausführungsform kann ein für den Faktor IX transgenes Tier, das in der Lage ist, hepatische Tumorzellen zu entwickeln, aus denen erfindungsgemäße Zellinien hergestellt werden können, folgendermaßen erhalten werden: in Eier wird ein DNA-Fragment, das eine onkogene Region umfaßt, injiziert, um ein erstes für ein Onkogen transgenes Tier zu erhalten. Parallel dazu wird ein DNA-Fragment injiziert, das eine für den Faktor IX codierende Region umfaßt, um ein zweites transgenes Tier zu erhalten. Sodann werden das erste und das zweite transgene Tier gekreuzt, um einen für das Onkogen und den Faktor IX doppelt transgenen Nachkommen zu erhalten.
Folglich betrifft die Erfindung auch:
ein transgenes Tier, dessen Blutplasma einen Faktor IX menschlichen Ursprungs enthält, dessen Aktivität ähnlich jener des Faktors IX ist, der im menschlichen Blut-Plasma vorhanden ist, in dessen Genom ein erstes exogenes DNA-Fragment, das eine für einen Faktor IX menschlichen Ursprungs codierende Region des genomischen oder Minigen-Typs umfaßt, integriert ist; wobei diese Region unter die Kontrolle einer für die Leber spezifischen Promotorregion gestellt ist, und das ferner in der Lage ist, einen hepatischen Tumor zu entwickeln, da in sein Genom ein zweites exogenes DNA-Fragment integriert ist, das eine für ein Onkogen codierende Region umfaßt, die unter die Kontrolle einer geeigneten Promotorregion gestellt ist, beispielsweise einer eukaryontischen Promotorregion oder einer Promotorregion viralen Ursprungs. Vorzugsweise handelt es sich um eine für die Leber spezifische Promotorregion.
Ganz allgemein umfaßt das zweite DNA-Fragment eine für ein Onkogen codierende Region, die in der Lage ist, einen hepatischen Tumor bei dem betreffenden Tier zu induzieren. Beispielsweise kann dies das T-Antigen des Virus SV40 oder das durch das c-myc-Gen der Maus codierte Antigen sein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann ein DNA-Fragment, das eine für den menschlichen Faktor IX codierende Region umfaßt, in Form eines Expressionsblocks konstruiert sein, genauer indem diese Region unter die Kontrolle einer Promotorregion in 5' der codierenden Region gestellt wird, die ein für die Leber spezifischer Promotor oder zumindest ein Teil desselben sein kann, der ausreicht, um die Expression des Faktors IX in einer hepatischen Zelle zu ermöglichen. Außer einer Promotorregion und einer codierenden Region kann der Expressionsblock auch Endelemente zur Termination der Transkription umfassen.
Die Sequenz der für den Faktor IX codierenden Region ist:
- vom genomischen Typ; beispielsweise handelt es sich im Falle des menschlichen Faktors IX insbesondere um die in Anson et al. (oben) beschriebene Sequenz, die 8 Exons (Exons A bis H) und 7 Introns (Introns 1 bis 7) umfaßt, oder um eine Sequenz, die der oben beschriebenen Sequenz entspricht, bei der die Größe von mindestens einem Intron durch Einführung einer Deletion verringert wurde;
- vom "gemischten" Typ (auch Minigen genannt); beispielsweise handelt es sich im Falle des menschlichen Faktors IX um die in Anson et al. (oben) beschriebene Sequenz, bei der mindestens eines der 7 Introns fehlt und mindestens eines der 7 Introns konserviert ist. Vorzugsweise wird nur das erste Intron oder ein Teil des ersten Introns konserviert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Sequenz des genomischen Typs ausgewählt.
Das exogene DNA-Fragment kann ferner eine Amplifikationsregion, wie beispielsweise eine für die Adenosin-Desaminase (ADA) codierende Region, umfassen, die eine progressive Resistenz gegen manche Antibiotika verleiht. Die Amplifikationsregion und die für den Faktor IX codierende Region müssen unter die Kontrolle einer gemeinsamen Promotorregion gestellt sein. Durch Auswahl auf Basis der Resistenz gegen starke Antibiotika-Dosen kann man auf diese Weise eine für den Faktor IX hyperproduktive Zellinie erhalten werden.
Dieses exogene DNA-Fragment wird anfänglich als ein in einen Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, insertiertes Fragment konstruiert. Dennoch muß es für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung in lineare Form gebracht werden und von den anderen Plasmidelementen getrennt werden.
Weiter schlägt die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zellinie vor, bei dem
- man die Tumorleber (oder Tumor bildende Leber) eines erfindungsgemäßen transgenen Tiers oder die Tumorleber eines Tiers entnimmt, bei dem die hepatischen Tumorzellen, die von einem erfindungsgemäßen transgenen Tier abgeleitet wurden, fortgepflanzt wurden, und
- man durch Kultivierung der Zellen dieser Leber die Zellinie selektiert.
Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Faktors IX menschlichen Ursprungs mit einer Aktivität ähnlich jener des Faktors IX, der im menschlichen Plasma vorhanden ist, bei dem eine erfindungsgemäße Zellinie kultiviert und anschließend der Faktor IX in dem Kulturmedium geerntet wird.
Die Erfindung ist nachstehend erläutert und bezieht sich auf die folgenden Figuren:
Fig. 1 stellt schematisch die Struktur des für den menschlichen Faktor IX codierenden Gens dar; angegeben sind: die Position der Exons (von A bis H), die Anordnung der Sequenzen, die von den Oligonukleotiden erkannt werden, die verwendet werden, um die Genombibliothek zu durchzumustern (von [1] bis [6]), und die DNA-Stücke, die in die drei lambda-Vektoren λTG1951, λTG1958 und λTG1952 kloniert werden.
Fig. 2 stellt schematisch die Struktur des Plasmids pTG3960 dar, indem angegeben wird, von welchen Plasmiden seine Fragmente stammen und ausgehend von welchem lambda-Vektor die letztgenannten konstruiert wurden. Die Exons des Faktors IX sind durch die Buchstaben A bis H angegeben.
Fig. 3 stellt schematisch die Struktur des Plasmids pTG3954 dar, indem angegeben wird, von welchen Vektoren seine verschiedenen Fragmente abstammen. Die Exons des Faktors IX sind durch die Buchstaben A bis H angegeben.
Fig. 4 stellt schematisch die Struktur des Plasmids pTG3962 dar, indem angegeben wird, von welchen Plasmiden seine verschiedenen Fragmente abstammen. Die Exons des Faktors IX sind durch die Buchstaben A bis H (offene Rechtecke) angegeben, das erste nicht codierende Exon des des α- Antitrypsin-Gens durch die Zahl 1 und der Teil des Exons c-myc durch die Zahl 2 (schwarze Rechtecke).
Fig. 5 stellt die Elektrophorese-Analyse der RNA dar, die aus den verschiedenen Geweben einer Linie von transgenen Mäusen, die den menschlichen Faktor IX exprimiert ("C" für Kontrollmaus und "T" für Test), präpariert wurde.
Fig. 6 stellt die Elektrophorese-Analyse der Boten-RNA aus der Leber von transgenen Mäusen dar, die den menschlichen Faktor IX exprimieren; (1) und (2) Maus der Linie TMTG3960-1, "C" Kontrollmaus; (3) Maus der Linie TMTG3962-18; (4) Maus der Linie TMTG3954-9; und (5) und (6) Maus der Linie TMTG3954-58.
Fig. 7 stellt die Analyse durch Western-Blot des menschlichen rekombinanten Faktors IX dar, der aus dem Plasma der transgenen Mäuse gewonnen wurde; (1) und (2) Maus der Linie TMTG3954-58; "C" Kontrollmaus; (3), (4), (5) und (6) Maus der Linie TMTG3960-1, "S" Faktor IX Stago und (7) und (8) Maus der Linie TMTG3954-9.
Die Fig. 8a und 8b stellen schematisch die Konstruktion des Plasmids pTG4912 dar.

BEISPIEL 1: Herstellung von Vektoren, die ein DNA-Fragment tragen, das eine für den menschlichen Faktor IX codierende Region umfaßt

A. Klonieren einer für den menschlichen Faktor IX codierenden Region

Eine genomische DNA-Bibliothek, die von einer Linie lymphoblastoider menschlicher Zellen GM1202A (4XY) abstammt, wird in dem Bakteriophagen λEMBL3 hergestellt (Pavirani A et al., Bio/Technology (1987) 5: 389), sodann mit Hilfe der folgenden synthetischen Oligonukleotid-Sonden (21-, 22- und 25- mer) durchmustert:
Diese entsprechen verschiedenen Regionen des Faktors IX-Gens, wie in Fig. 1 angegeben.
Drei unabhängige λ-Klone werden mit Hilfe von Sonden nach Southern-Blot identifiziert:
λTG1951, λTG1958 und λTG1952 (Fig. 1). Das Insert λTG1951 umfaßt die 5 kB der Promotorregion und die Region, welche die vier ersten Exons des Gens abdeckt. Das Insert λTG1952 umfaßt 2,3 kB des Introns 6, das Intron 7, die Exons G und H und die 10 kB der Sequenz, die stromaufwärts an das Polyadenylierungssignals angrenzt. Das Insert λTG1958 erstreckt sich vom Exon B bis zu 0,47 kB stromabwärts vom Exon F (es überdeckt das Insert λTG1951 auf 7 kB). Als Schlußfolgerung decken die drei oben beschriebenen Inserts zu dritt einen großen Teil des Gens ab, insbesondere die acht Exons und die angrenzenden Regionen 5' (5 kB) und 3' (10 kB); nur eine Region des Introns 6 (6,7 kB) befindet sich nicht darin.

8. Konstruktion eines Plasmids, das eine DNA-Sequenz des genomischen Typs umfaßt, die für den menschlichen Faktor IX codiert und unter die Kontrolle des Promotors des Gens des menschlichen Faktors IX (pTG3960, Fig. 2) gestellt ist

Das Fragment SalI von 15 kB des Klons λTG1958 wird in die Restriktionsstelle SalI des Vektors ppolyIII-I*, der in Lathe et al., Gene (1987) 57: 193 beschrieben ist, subkloniert, um das Plasmid pTG3911 zu ergeben.
Ein synthetischer Linker, Träger von einzelnen Restriktionsstellen (Sfil, EcoRI, KpnI, BamHI, XhoI und NotI), wird zwischen die beiden EcoRI-Stellen des Cosmids pCV001 [Choo et al., Gene (1986) 46: 277] eingeführt, welche bei der Insertion zerstört werden, um das Plasmid pTG3909 zu erzeugen. Die Fragmente BamHI-EcoRI (4,3 kB) und EcoRI-EcoRI (1,8 kB), die aus dem Klon XTG1952 isoliert wurden, werden zwischen die BamHI-EcoRI-Stellen von pTG3909 kloniert, um pTG3914 zu ergeben. Die Orientierung des EcoRI-EcoRI-Fragments wird durch enzymatische Verdauung überprüft. Das Fragment von 6,2 kB (die beiden vorhergehenden Fragmente plus ein Vektorfragment EcoRI-AatII), das den 3'-Teil des Gens des Faktors IX (entsprechend den Exons G und H) trägt, wird durch Verdauung mit BamHI und AatII aus dem Cosmid herausgenommen. Sodann wird dieses Fragment zwischen die gleichen Stellen von pTG3911 kloniert, um das Plasmid pTG3921 zu ergeben.
Das Insert SalI-SalI von XTG1951 wird in die SalI-Stelle des Plasmids pAT153 subkloniert [Twigg A. J. und Sherrat D., Nature (1980) 283: 216], um das Plasmid pTG3927 zu ergeben. Der zentrale Teil des Introns 1 wird durch Verdauung mit Pvull, gefolgt von einer Ligation, beseitigt, um das Plasmid pTG3952 zu ergeben. Dieses Plasmid besitzt nicht mehr die beiden Fragmente Pvull (3,65 kB und 1,13 kB), die im Intron 1 enthalten sind, behält aber das Fragment Pvull (4,38 kB), das die Exons B und C trägt. Das Insert SalI-SalI von pTG3952 wird wieder in den Vektor ppolyIII-I* eingefügt, um das Plasmid pTG3956 zu ergeben, das über einzelne Stellen in 5' verfügt. Das Fragment XhoI-SnaBI von pTG3956 wird zwischen die XhoI-SnaBI-Stellen von pTG3921 eingeführt, um das Plasmid pTG3960 (Fig. 2) zu ergeben, das umfaßt:
- 5 kB der Promotorsequenz des Gens des Faktors IX,
- 22 kB des für den Faktor IX codierenden Fragments (das Intron 1 ist um diese beiden Fragmente Pvull gekürzt, und das Intron 6 um 7,1 kB wegen der zusätzlichen Deletion eines Fragments von 0,46 kB aufgrund der Verwendung der BamHI-Stelle, die sich am meisten stromabwärts von dem Intron befindet),
- einige Hundert Basenpaare der genomischen Sequenzen 3' stromabwärts des Polyadenylierungssignals.
Alle Konstruktionen werden mittels Passage in dem Stammes E. coli 5K hergestellt, mit Ausnahme des letzten Klonierungsschrittes, der den Stamm E. coli BJ verwendet.

C. Aufbau eines Plasmids, das eine Sequenz vom "gemischten" Typ umfaßt, die für den menschlichen Faktor IX codiert und unter die Kontrolle des Promotors des Gens des menschlichen Faktors IX (pTG3954, Fig. 3) gestellt ist

Das Fragment von 6,2 kB, das das 3'-Ende des Gens des Faktors IX umfaßt, wird durch Verdauung mit ClaI und AatII aus dem Cosmid pTG3914 herausgenommen. Sodann wird es zwischen die Stellen ClaI und AatII des Vektors pAT153 kloniert, um das Plasmid pTG3924 zu erzeugen. Diese Konstruktion wird in den Stamm E. coli GM 33 (dam) eingeführt. Die genomischen Sequenzen, die zwischen den Stellen Bchl und BglII liegen, werden beseitigt und durch ein BchI-BglII-Fragment (2,34 kB) ersetzt, das von dem Phagen λTG1951 abstammt und das 5'-Ende des Exons B und den 3'-Teil des Introns 1 umfaßt, um das Plasmid pTG3926 zu ergeben. Dieses Klonieren erfolgt in dem Stamm E. coli 5K. Es verbleiben 0,6 kB genomische Sequenzen, die von dem Intron 6 abstammen, zwischen den Stellen BamHI und BglII, die bei dem letzten Klonierungsschritt beseitigt werden. Das Plasmid pTG3926 wird in den Stamm E. coli GM 33 (dam) transferiert, um den Teil der komplementären DNA zwischen den Exons B und H rekonstruieren zu können, indem das Fragment Bchl (1,4 kB) integriert wird, das aus dem Plasmid pTG397 isoliert wurde, welches in der europäischen Patentanmeldung EP-A-162 782 beschrieben ist (dieses Plasmid umfaßt die komplementäre DNA des menschlichen Faktors IX), um das Plasmid pTG3951 zu ergeben.
Der Promotorteil, das Exon A und der Rest des Introns 1 werden aus dem Plasmid pTG3910 (pTG3910 stammt von der Klonieren des Fragments SalI von XTG1951 in den Vektor ppolyIII-I* ab) in Form eines XhoI-BglII-Fragments isoliert. Dieses Fragment wird zwischen die gleichen Stellen in pTG3951 integriert, um das Plasmid pTG3954 (Fig. 3) zu ergeben, das somit ein Minigen des Faktors IX trägt, welches den Teil von 5 kB des Promotors, das Exon A, das erste vollständige Intron, die Exons B bis H in Form einer komplementären DNA und einige Hundert Basenpaare des 3'-Teils umfaßt, der stromabwärts des Polyadenylierungssignals angrenzt.

D. Konstruktion eines Plasmids, das eine DNA-Sequenz des genomischen Typs umfaßt, die für den menschlichen Faktor IX codiert und unter die Kontrolle des Promotors des α-Antitrypsin-Gens (pTG3962, Fig. 4) gestellt ist

Ein KpnI-KpnI-Fragment, das die Promotorregion, das erste nicht codierende Exon und den 5'- Teil des Introns 1 des α-Antitrypsin-Gens umfaßt, dessen Sequenz durch Long G. L. et al., Biochemistry (1984) 23: 4828 gegeben ist, wird in den Vektor pUC18 [Yanisch-Perron C. et al., Gene (1985) 33: 103] insertiert. Insbesondere umfaßt der 5'-Teil des Introns 1 eine Donor-Spleißstelle.
Sodann wird ein funktionelles Hybridintron erzeugt, indem in die Xbal-Stelle des Polylinkers von pUC18 ein DNA-Linker eingeführt wird, dessen Sequenz auf jener des 3'-Endes des ersten Introns des Maus-c-myc-Gens basiert. Dieses synthetische Fragment weist als Sequenz auf:
Dieses synthetische Fragment umfaßt von 5' zu 3' eine Xbal-Stelle, eine Akzeptor-Spleißstelle (*), die das korrekte Spleißen des Transkripts ermöglicht (der Schnitt erfolgt zwischen G und C), eine Klonierungsstelle an den glatten Enden (HpaI), um die Fusion mit dem DNA-Fragment zu ermöglichen, das für den Faktor IX auf dem Niveau der Exonregionen codiert, und schließlich eine Xbal-Stelle. Die Orientierung dieses Fragments wird durch Sequenzierung überprüft. Am Ende der Konstruktion wird das Plasmid pTG3925 erhalten.
Parallel dazu wird ein HindIII-Fragment (4 kB) von XTG1951, das den 5'-Teil der Promotorregion des Gens des Faktors IX, das Exon A und ungefähr 600 Bp des Introns 1 trägt, in den Vektor M13TG130 subkloniert [Kieny M. P. et al., Gene (1983) 26: 91)]. Sodann wird eine SmaI-Stelle (glatte Enden) durch gesteuerte Mutagenese unter Verwendung des Oligonukleotides 5'GCATAACCCGGGCTAGCAG 3' erzeugt. Diese Stelle wird zwei Nukleotide stromaufwärts des ATG-Initiators der Transkription erzeugt. Das auf diese Weise modifizierte HindIII-Insert wird wieder in den Vektor ppolyIII-I* integriert, was das Plasmid pTG3913 ergibt.
Der Promotorteil und der Anfang der codierenden Region des α-Antitrypsin-Gens, die mit Akzeptorspleißstellen versehen ist, werden in Form eines EcoRI-HpaI-Fragments aus dem Vektor pTG3925 isoliert. Dieses Fragment wird zwischen die EcoRI- und SmaI-Stellen des Plasmids pTG3913 integriert, um das Plasmid pTG3953 zu erzeugen. Diese Insertion zerstört die Klonierungsstellen HpaI und SmaI und erfolgt in einer Exonzone. Der ATG-Initiator wird von der für den Faktor IX (Exon A) codierenden Region geliefert. Die Sequenzierung der Fusionszone (zwischen der synthetischen Sequenz, die Maus-c-myc entspricht, und dem Exon A) gibt an, daß ein Nukleotid beim Klonieren verloren wurde:
Der 5'-Teil der für den Faktor IX codierenden Region, die das gekürzte Intron 1 des Gens des Faktors IX trägt, wird wiederhergestellt, um dieselbe Strategie wie vorher für die Zusammenfügung der vollständigen codierenden Region anzuwenden. Zu diesem Zweck wird das EcoRV-SalI-Fragment, das aus dem Plasmid pTG3952 isoliert wurde, zwischen die gleichen Stellen von pTG3953 kloniert, um das Plasmid pTG3957 zu ergeben.
Schließlich wird das XhoI-SnaBI-Fragment (9,9 kB) von pTG3957 zwischen die gleichen Stellen von pTG3921 transferiert, um das Plasmid pTG3962 zu ergeben(Fig. 4). Dieser letzte Klonierungsschritt erfolgt mittels Passage in dem Stamm E. coli BJ, während die vorhergehenden mittels Passage in dem Stamm E. coli 5K erfolgt sind.
In pTG3962 (Fig. 4) ist das erste nicht codierende Exon des α-Antitrypsin-Gens konserviert.

BEISPIEL 2: Einfach-transgene Mäuse, die den menschlichen Faktor IX exprimieren

A. Erhalt der transgenen Mäuse

PTG3954 wird von SalI und Sfil verdaut, während pTG3960 und pTG3962 nur von Sfil verdaut werden, um in jedem Fall ein DNA-Fragment zu erhalten, das einen Expressionsblock des Faktors IX umfaßt, der von den Plasmid-DNA-Fragmenten, die von pBR322 abstammen, abgetrennt wird. Jedes auf diese Weise freigesetzte Fragment wird auf einem Saccharosegradienten gereinigt und in den männlichen Pronukleus eines fertilisierten Eis von hybriden Mäusen der ersten Generation injiziert, welche aus der Kreuzung einer weiblichen Maus C57/B16 mit einer männlichen SJL gemäß der dem Fachmann bekannten Technik abstammen. Jedes Ei wird sodann wieder in den Uterus einer Maus implantiert, damit die Trächtigkeit fortgesetzt wird.
Die DNA der Gewebe des Schwanzes der Neugeborenen wird isoliert, um die Integration des exogenen DNA-Fragments in das Genom des Tiers durch Dot-Blot-Analyse zu überprüfen, indem eine geeignete Sonde verwendet wird (BamHI-BamHI-Fragment des Plasmids pTG397, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung EP-A-162 782), die mit dem Isotop 32P markiert ist. Den beim Hybridisierungstest positiven Mäusen wird Blut abgenommen, und das Expressionsniveau des Faktors IX wird in dem Serum durch die ELISA-Methode bestimmt, indem das Dosierungskit Diagnostica Stago (Asserachrom IX: Ag; Ref. 0410) verwendet wird. Der Test ist für den menschlichen Faktor IX spezifisch und zeigt wenig oder keine Kreuzreaktion mit dem Faktor IX von Mäusen. Die Ergebnisse sind nachstehend festgehalten. Tabelle 1
Die Tabelle 1 zeigt, daß die höchste Expression mit den DNA-Fragmenten erzielt wird, die von pTG3954 und pTG3960 abstammen und den Promotor des Gens des menschlichen Faktors IX umfassen. Darüber hinaus ist es, um ein gutes Expressionsniveau zu erzielen, nicht erforderlich, über die Gesamtheit der Introns zu verfügen (pTG3954).

B. Analyse der mRNA, die dem menschlichen Faktor IX entspricht und von den transgenen Mäusen abstammt

Die Gesamt-RNA mehrerer Gewebe (Niere, Milz, Darm und Leber) wird ausgehend von transgenen Mäusen der Linie TMTG3960-1 hergestellt (Promotor und codierende genomische Sequenz des Faktors IX). Diese RNAs werden durch Elektrophorese auf 1%-igem Agarose-Formaldehyd-Gel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer menschlichen radioaktiven Sonde, die mit dem Isotop ³²P markiert ist, hybridisiert (900 Bp der nicht translatierten 3' Sequenz des Gens des Faktors IX, in ppolyIII-I* kloniert). Fig. 5 zeigt, daß die Boten-RNA des menschlichen Faktors IX (ungefähr 3 kB) nur in den hepatischen Geweben der transgenen Mäuse der Linie TMTG3960-1 nachgewiesen wird, während kein radioaktives Signal für die RNAs nachgewiesen wird, die aus anderen Geweben als der Leber isoliert wurden, auch nicht in der Leber eines Kontrolltiers. Transgene Mäuse, die den menschlichen Faktor IX spezifisch auf dem Niveau der Leber exprimieren, wurden somit erhalten.
Andererseits ist, wenn die Boten-RNAs, die von der Leber aller Linien von transgenen Mäusen abstammen, mit derselben Sonde analysiert werden, die Stärke des Signals global mit dem Expressionsniveau vergleichbar (Fig. 6).

C. Analyse des menschlichen Faktors IX durch Western-Blot

Den transgenen Mäusen, die von den Linien TMTG3960-1, TMTG3954-9 und TMTG3954-58 abstammen, wurde Plasma entnommen. Eine Fraktion wird durch Barium gefällt und nach der Wiederauflösung durch Wester-Blot analysiert. Fig. 7 zeigt, daß der menschliche Faktor IX, der von einer transgenen Maus abstammt, eine Molekulargewicht ähnlich jenem des Faktors IX des menschlichen Plasmas aufweist, was anzeigt, daß das erhaltene Produkt glycosyliert ist (ein wenig oder nicht glycosylierter Faktor IX hätte ein geringeres Molekulargewicht).

D. Koagulations-Aktivität des menschlichen Faktors IX, der im Plasma von transgenen Mäusen vorhanden ist

Durch ELISA-Test wird die Konzentration des menschlichen Faktors IX im Plasma von Mäusen verschiedener Linien bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Die verschiedenen Mäuse werden durch die Nummer der Linie (beispielsweise TMTG3960-1), gefolgt von der Generation (beispielsweise I für die Generation F1), gefolgt von einer speziellen Nummer identifiziert. Es ist anzumerken, daß die Konzentration an menschlichem Faktor IX, die bei den Mäusen der ersten Generation der Linie TMTG3960-1 quantitativ bestimmt wurde, größer als jene ist, die bei der Stamm- Maus bestimmt wurde (siehe Tabelle 1), da diese letztgenannte vom Mosaiktyp ist. Bei denselben Entnahmen wird die Aktivität des menschlichen Faktors IX durch einen Koagulationstest durch die Technik der einmaligen Dosierung nach Austen und Rhymes bestimmt, wie vorher berichtet. Die Aktivität wird in E/ml mit Bezug auf eine menschliche Plasmaprobe bestimmt, die als Vergleich herangezogen wurde (Stago 1 E/ml). Das Mäuseplasma weist einen starken Hintergrund auf (von ungefähr 1 E/ml). Die Präinkubation der Plasmaproben der transgenen Mäuse mit einem spezifischen polyklonalen Anti- Human-Faktor IX-Antikörper neutralisiert diesen und verringert das Aktivitätsniveau auf jenes des Faktors IX der Maus. Der Unterschied zwischen dem in Abwesenheit von Antikörper erhaltenen Wert und jenem in Anwesenheit von Antikörper entspricht der Aktivität, die ausschließlich auf den menschlichen Faktor IX zurückzuführen ist. Diese Aktivität wird in ug/ml (1 E/ml = 5 ug/ml des Faktors IX im normalen menschlichen Plasma, das als Bezug herangezogen wird) mitgeteilt. Die Resultate sind in nachstehender Tabelle 2 angeführt. TABELLE 2
Die Tabelle 2 zeigt, daß im Plasma von transgenen Mäusen der menschliche Faktor IX biologisch aktiv ist, da die Koagulations-Aktivität (gemessen in ug/ml) der Menge an Faktor IX entspricht, die durch den ELISA-Test gemessen wurde, und zwar bei allen Linien.

E. Fällungstest mit Bariumcitrat

Die Qualität des menschlichen Faktors IX, der im Plasma einer transgenen Maus vorhanden ist, wird auch durch den Fällungstest mit Bariumsalz verifiziert [Bajaj S. P. et al., J. Biol. Chem. (1981) 256: 253]. Die γ-carboxylierten Proteine adsorbieren an und fallen gemeinsam mit dem Bariumcitrat (unlösliches Salz) aus, während die Proteine, die dies nicht sind, in Lösung verbleiben. Die Menge des menschlichen Faktors IX (ges) im Plasma der transgenen Mäuse wird vor der Behandlung bestimmt. Nach der Behandlung des Plasmas mit Bariumcitrat wird die adsorbierte (ads) und somit γ-carboxylierte Fraktion wieder gelöst und durch den ELISA-Test quantitativ bestimmt. Die Mengen werden bezüglich des Volumens der Probe mitgeteilt und somit in ng angegeben. Das Verhältnis Ads/ges, ausgedrückt in Prozent (%), quantifiziert den Anteil des γ-carboxylierten menschlichen Faktors IX. TABELLE 3
Die Tabelle 3 zeigt, daß der Hauptteil des menschlichen Faktors IX, der im Plasma der Mäuse vorhanden ist, γ-carboxyliert ist, da er in der unlöslichen Fraktion nachgewiesen wird. Durch Vergleich mit dem im menschlichen Plasma vorhandenen Faktor IX wird gemäß den Experimenten eine Fällungsrate von 80 bis 100% erhalten.

F. Reinigung und Charakterisierung des Faktors IX, der aus den Linien TMTG3960-1 und TMTG3954-9 gewonnen wird

Der menschliche Faktor IX, der von Mäusen erhalten wird, die von den Linien TMTG3960-1 und TMTG3954-9 abstammen, wird durch Immunaffinitäts-Chromatographie gereinigt. Die eluierte Fraktion wird durch Umkehrphasen-HPLC geleitet, um das Produkt zu entsalzen, und die N-terminale Sequenz wird durch Edman-Abbau bestimmt. Die in jedem Fall erhaltenen Resultate zeigen an, daß der menschliche Faktor IX, der im Blut der transgenen Mäuse vorhanden ist, gut der reifen Form entspricht. Es ist keine Spur des Vorläufers des menschlichen Faktors IX zu entdecken. Der menschliche Faktor IX der transgenen Mäuse ist somit homogen und korrekt verarbeitet.

BEISPIEL 3: Trans-immortalisierte Zellinien, die den menschlichen Faktor IX exprimieren

A. Einfach-transgene Mäuse, die ein Onkogen exprimieren

Die transgene Mauslinie TMTG2984, die das Onkogen c-myc exprimiert, wird erzeugt, indem man das NotI-NotI-Fragment des Plasmids pTG2984 verwendet, das in der Patentanmeldung EP-A 0 298 807 beschrieben ist.
Die transgene Mauslinie TMTG4912, welche die T-und t-Tumorantigene von SV40 exprimiert, wird erzeugt, indem man das SalI-EcoRI-Fragment des Plasmids pTG4912 verwendet, das nachstehend beschrieben ist.
Das Plasmid pTG4912 leitet sich von dem Plasmid pTG171, das in dem Patent EP 0140762 beschrieben ist, und vom Plasmid pML2 ab. Das Plasmid pML2 stammt von einem Plasmid "pJYM like" ab, das in dem Artikel von Lusky M. et al. [Nature 293, (1981), Seiten 79-81 j beschrieben ist, bei dem die Giftregion von pBR322, die deletiert ist, ein DNA-Fragment ist, das zwischen den Nukleotiden 1086 und 2457 einschließlich liegt. Das Insert BamHI von SV40 ist außerdem deletiert, und man erhält somit das Plasmid pML2.
Das Fragment 2553-2770 BamHI-BchI des Genoms von SV40 [Buchman et al. Tooze J. Hsg., DNA Tumor Viruses - Second Edition Revised, Seiten 799-841 (1981)] wird in den Vektor pML2 insertiert, der vorher mit BamHI verdaut wurde, um den Vektor pTGML2A&spplus; zu ergeben, der in Fig. 8 dargestellt ist.
Das BamHI-BamHI-Fragment des Plasmids pTG171, das die Gene trägt, die für die T- und t- Antigene und für das Tollwut-Gfycoprotein codieren, wird in den Vektor pTGML2A&spplus; insertiert, der vorher mit BamHI verdaut wurde, um das Plasmid pTG173 zu erzeugen, das in Fig. 8 dargestellt ist.
Das Plasmid pTG173 wird mit den Enzymen StuI, das zu einem glatten Schnitt führt, und SalI verdaut, das kohäsive 5'-Enden entstehen läßt. Die kleinen Fragmente StuI-StuI und StuI-SalI werden beseitigt. Das große SalI-StuI-Fragment, das die Regionen umfaßt, die für die T-und t-Antigene, das Ampicillin-Resistenzgen und den Replikationsstartpunkt codieren, wird isoliert und der Einwirkung der Klenow-Polymerase (Amersham) in Anwesenheit der 4 Nukleotidtriphosphate ATP, GTP, CTP und TTP unterzogen. Die Polymerase füllt die Stelle SalI mit den Nukleotiden auf, und man erhält auf diese Weise ein DNA-Fragment, das zwei glatte Enden aufweist.
Das vorstehend beschriebene Plasmid pTG3925 wird mit EcoRI, das kohäsive 5'-Enden entstehen läßt, und HpaI verdaut, das einen glatten Schnitt macht. Das EcoRI-HpaI-Fragment, das den Promotor, das erste nicht codierende Exon, einen Teil des ersten Introns, das die Donor-Spleißstelle des α-Antitrypsin-Gens und eine synthetische Akzeptor-Spleißstelle umfaßt, wird isoliert und der Einwirkung der Nuklease "Mung Bean" (Biolabs) unterzogen, welche die kohäsiven Enden der EcoRI-Stelle schneidet. Auf diese Weise wird ein Fragment erhalten, das zwei glatte Enden aufweist. Dieses Fragment wird in das Plasmid pTG173 insertiert, das mit StuI und SalI verdaut wurde, wie oben hergestellt, wodurch man das Plasmid pTG4912 erhält, das in Fig. 8 dargestellt ist.

B. Mehrfach-transgene Mäuse, die den menschlichen Faktor IX und mindestens ein Onkogen exprimieren

Doppelt transgene Mäuse werden durch Kreuzung der Mäuse der Linie TMTG3960-1 mit Mäusen der Linie TMTG2984 erzeugt. Der doppelt transgene Zustand wird durch Dot-Blot-Analyse mit geeigneten Sonden überprüft. Die Stamm-Mäuse der Linie TMTG3960-1 X TMTG2984 exprimieren sowohl das menschliche α-Antitrypsin als auch den menschlichen Faktor IX. Diese beiden Expressionscharaktere werden nach Mendel auf die Nachkommen übertragen. Drei dieser doppelt transgenen Mäuse entwickeln im Alter von 12 Monaten Lebertumore.
Um Mäuse zu erhalten, die Tumore in einem früheren Alter entwickeln, wird ein Männchen der Linie TMTG3960-1 X TMTG2984 mit Weibchen der Linie TMTG4912 gekreuzt. Eine der dreifach transgenen Mäuse, die durch diese Kreuzung erzeugt werden, exprimiert 1 mg/ml menschliches α- Antitrypsin und 40,3 ug/ml menschlichen Faktor IX. Diese wird im Alter von 6 Wochen geopfert, und ihre Leber (Leber Nr. 1), die bereits eine Hyperplasie aufweist, wird entnommen. Eine weitere dreifach transgene Maus, die 3 mg/ml menschliches α-Antitrypsin und 60 ug/ml menschlichen Faktor IX exprimiert, unterliegt demselben Schicksal im Alter von drei Monaten (Leber Nr. 2).

C. Auswahl von trans-immortalisierten Zellinien

Jede einzelne Leber wird folgendermaßen behandelt:
Das hepatische Tumorgewebe wird durch Behandlung mit Kollagenase dissoziiert, wie von Howard & Pesh, J. Bio. Chem. (1968) 105; 3105 beschrieben, mit Ausnahme des Perfusionsschrittes. Dann werden die Zellen in ein Williams'E-Medium (Gibco) gegeben, das mit 10 ng/ml Insulin, 300 ng/ml Hydrocortison, 10 ug/ml Transferrin, 25 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 2 mM Glutamin, 50 E/ml Streptomycin, 250 E/ml Penicillin und 5% dialysiertem fötalem Kalbsserum (FCS) ergänzt ist. Die Zugabe dieser verschiedenen Bestandteile ist für das Wachstum und die Aufrechterhaltung einer hepatocytischen Morphologie wesentlich. Die Kulturfläschchen Primaria (Falcon) werden für diese erste Kultur verwendet. Die Kultur wird bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre, die zu 10% mit CO&sub2; angereichert ist, durchgeführt.
Während dieser ersten Kultur werden die Zellen in angehäuftem Zustand kultiviert. Wenn eine 80 %-ige Konfluenz erreicht ist, werden sie in Anwesenheit von 0,05%-igem Trypsin abgelöst und mehrere Male durch aufeinanderfolgende Passagen in das oben beschriebene ergänzte Medium umgepflanzt. Bei den ersten Umpflanzungen werden die Zellen vorübergehend (ungefähr 10 min) in Kunststofffläschchen transferiert, an deren Wänden die Makrophagen sofort anhaften und auf diese Weise beseitigt werden können. Nach 5 Passagen wird das FCS durch 1 mg/ml Rinder-Serumalbumin (BSA) ersetzt. Nach 5 zusätzlichen Passagen werden Reinkulturen von Hepatocyten erhalten: TMhep39 und TMhep48, die aus der Leber 1 bzw. 2 selektiert wurden.
Die Menge des durch diese Zellinien erzeugten Faktors IX wird direkt im Kulturüberstand durch ELISA-Test gemessen. Bei TMhep39 beträgt die Produktivität ungefähr 0,15 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden; und für TMhep48 beträgt sie zwischen 0,29 und 0,55 ug/10&sup6; Zellen/24 Stunden. Wenn die Kulturen eine hohe Zelldichte aufweisen, erreicht die Produktion 0,3-0,4 ug/ml/24 Stunden bzw. ungefähr 0,7 ug/ml/24 Stunden.
Die "Faktor IX"-Aktivität des von den Zellinien TMhep39 und TMhep48 erzeugten Faktors IX wird durch den vorstehend beschriebenen Test von Austen & Rhymes gemessen. In beiden Fällen liegt sie nahe bei 100%.
Der im Kulturüberstand der beiden Zellinien vorhandene Faktor IX wird auf einer Immunaffinitätssäule gereinigt. Die Sequenzierung des N-terminalen Endes bestätigt, daß der auf diese Weise erzeugte Faktor IX gut der reifen Form entspricht. Ein Western-Blotting bestätigt ebenfalls, daß seine elektrophoretische Mobilität identisch mit jener des Faktors IX ist, der vom menschlichen Plasma abstammt.

D. Charakterisierung der Zellinien TMhep39 und TMhep48

Die Erzeugung von Albumin, das ein speziell von der Leber sekretiertes Protein ist, wird im Kulturmedium durch einen ELISA-Test nachgewiesen, indem man als ersten Antikörper ein Anti-Maus- Albumin-Kaninchenantiserum und als zweiten Antikörper einen Anti-Maus-Albumin-Kaninchenantikörper verwendet, der mit Peroxydase markiert ist. Bei den beiden Zellinien variiert der Spiegel des sekretierten Albumins zwischen 3 und 11 ug/ml/24 h.
In den Zellen der Linie TMhep39 wird das Vorhandensein von spezifischen Boten-RNAs der Leberzellen durch die "Spot-Blot"-Technik, die von Costanzi und Gillespie (1987) [in: Berger S. L., Kimmel A. R. Hsg. Guide to Molecular Cloning Techniques, 152, Orlando: Academic press, 582-587] beschrieben ist, ausgehend von der Gesamt-RNA nachgewiesen, die durch die Guanidiumhydrochlorid-Methode hergestellt wird, wie von Chirgwin et al., Biochemistry (1979) 18: 701-710 beschrieben. Die Suche nach den mRNAs, die für das Maus-Transferrin (1), das Maus-α-Antitrypsin (2), das Maus-Albumin (3), das Maus-β-Actin (4), das menschliche α-Antitrypsin (5), das Hamster-Vimentin (6), den menschlichen Faktor IX (7), das c-myc der Maus (8), das T-Antigen von SV40 (9), die Glutathion-S-Transferase (10), das Maus α-Fötoprotein (11) codieren, wird mit Hilfe von Sonden begonnen, deren Sequenzen folgende sind:
Die Sonde, die dem β-Actin entspricht, einem allgegenwärtigen Protein, wird als positive Kontrolle verwendet. Das Fehlen einer Hybridisierung wird korrekt beobachtet, wenn die Sonde 6 (negative Kontrolle) und die Sonde 11 (die einem Protein entspricht, das nur auf dem fötalen Niveau, d. h. auf undifferenziertem Niveau, exprimiert wird) verwendet werden. Eine positive Antwort wird für das Albumin, die α-Antitrypsine des Menschen und der Maus, die Glutathion-Transferase, den menschlichen Faktor IX, das Maus-c-myc, das T-Antigen von SC40 und das Transferrin beobachtet.
Die oben mitgeteilten Ergebnisse zeigen deutlich, daß die nach den aufeinanderfolgenden Umpflanzungen erhaltenen Zellinien einen stabilen und differenzierten Phänotyp konservieren.
Der Stamm E. coli BJ, der durch das Plasmid pTG3960 transformiert ist, wurde am 19. Juli 1989 bei der C. N. C. M. 25, rue du Dr. ROUX 75724 PARIS unter der Nummer I-893 hinterlegt.
Die Zellinie TMhep48 wurde am 9. August 1990 bei der C. N. C. M. 25, rue du Dr. ROUX 75724 PARIS unter der Nummer I-989 hinterlegt.

Claims

1. Trans-immortalisierte Zellinie hepatischen Ursprungs, die fähig ist, einen humanen Faktor IX zu exprimieren, dessen Aktivität ähnlich derjenigen des Faktors IX ist, der im menschlichen Blutplasma anwesend ist, welche in ihrem Genom ein Fragment exogener DNA integriert aufweist, das eine Region vom genomischen oder vom Minigen-Typ, welche für einen menschlichen Faktor IX kodiert, wobei die Region unter die Kontrolle einer für die Leber spezifischen Promotor-Region gestellt ist, und ein zweites Fragment exogener DNA umfaßt, das eine Region umfaßt, die für ein Onkogen kodiert, wobei die kodierende Region unter die Kontrolle einer geeigneten Promotor-Region gestellt ist.

2. Zellinie nach Anspruch 1, deren Region, die für den menschlichen Faktor IX kodiert, vom Minigen-Typ ist.

3. Zellinie nach Anspruch 1, deren Region, die für den menschlichen Faktor IX kodiert, vom genomischen Typ ist.

4. Zellinie nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, die in ihrem Genom ein Fragment exogener DNA integriert aufweist, das eine Region vom genomischen oder vom Minigen-Typ umfaßt, welche für den menschlichen Faktor IX kodiert, wobei die kodierende Region unter die Kontrolle einer Promotor-Region gestellt ist, die ausgewählt ist aus dem Promotor des Gens des Faktors IX, dem Promotor des α-Antitrypsin-Gens und Teilen derselben, die ausreichen, um die Expression der kodierenden Region zu induzieren.

5. Zellinie nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, die in ihrem Genom ein Fragment exogener DNA integriert aufweist, das eine Region vom genomischen oder vom Minigen-Typ umfaßt, die für den menschlichen Faktor IX kodiert, wobei die kodierende Region unter die Kontrolle des Promotors des Gens des Faktors IX oder eines Teils desselben, welcher ausreicht, um die Expression der kodierenden Region zu induzieren, gestellt ist.

6. Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite DNA- Fragment eine Region umfaßt, die für ein Onkogen kodiert, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Gen des Virus SV40, das für das T-Antigen kodiert, oder dem Gen C-myc der Maus besteht, und unter die Kontrolle einer für die Leber spezifischen Promotor-Region gestellt ist.

7. Zellinie nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Leber spezifische Promotor- Region der Promotor des Gens von α-1-Antitrypsin ist.

8. Zellinie nach Anspruch 3, ausgewählt aus TMhep48, hinterlegt am 9. August 1990 bei der CNCM unter der Nummer I-989, und TMhep39, die gemäß dem folgenden Verfahren aus dreifach transgenen Mäusen hervorgeht: doppelt transgene Mäuse werden erzeugt durch Kreuzen von Mäusen der Linie TMTG3960-1, erzeugt ausgehend von dem Plasmid pTG3960, hinterlegt am 19. Juli 1989 unter der Nummer 1-893 bei der CNCM, mit Mäusen der Linie TMTG2984, erzeugt ausgehend von dem Plasmid pTG2984, dann werden Mäuse der Linie TMTG3960-IxTMTG2984 mit Mäusen der Linie TMTG4912, erzeugt ausgehend vom Plasmid pTG4912, das in der Fig. 8b dargestellt ist, gekreuzt, dann entnimmt man die Tumorleber der dreifach transgenen Mäuse oder eines Tiers, in dem die Zellen der Tumorleber vermehrt worden sind, und man selektioniert mittels Kultivieren der Linie TMhep39.

9. Nicht-menschliches transgenes Tier, dessen Blutplasma einen menschlichen Faktor IX enthält, dessen Aktivität ähnlich ist derjenigen des Faktors IX, der in menschlichem Blutplasma vorhanden ist, welches in seinem Genom ein erstes Fragment exogener DNA, das eine Region vom genomischen oder vom Minigen-Typ umfaßt, die für einen menschlichen Faktor IX kodiert, wobei die kodierende Region unter die Kontrolle einer für die Leber spezifischen Promotor- Region gestellt ist, und ein zweites Fragment exogener DNA integriert aufweist, das eine Region umfaßt, die für ein Onkogen kodiert, wobei die kodierende Region unter die Kontrolle einer geeigneten Promotor-Region gestellt ist.

10. Nicht-menschliches transgenes Tier nach Anspruch 9, dessen Region, die für den menschlichen Faktor IX kodiert, vom Minigen-Typ ist.

11. Nicht-menschliches transgenes Tier nach Anspruch 9, dessen Region, die für den menschlichen Faktor IX kodiert, vom genomischen Typ ist.

12. Nicht-menschliches transgenes Tier nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, das in seinem Genom ein Fragment exogener DNA integriert aufweist, welches eine Region vom genomischen oder vom Minigen-Typ umfaßt, die für den menschlichen Faktor IX kodiert; wobei die kodierende Region unter die Kontrolle einer Promotor-Region gestellt ist, die ausgewählt ist aus dem Promotor des Gens des Faktors IX, dem Promotor des α-Antitrypsin-Gens und Teilen derselben, die ausreichen, um die Expression der kodierenden Region zu induzieren.

13. Nicht-menschliches transgenes Tier nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, das in seinem Genom ein Fragment exogener DNA integriert aufweist, das eine Region vom genomischen oder vom Minigen-Typ umfaßt, welche für den menschlichen Faktor IX kodiert; wobei die kodierende Region unter die Kontrolle des Promotors des Gens des Faktors IX oder eines Teils desselben, welcher ausreicht, um die Expression der kodierenden Region zu induzieren, gestellt ist.

14. Verfahren zur Herstellung einer Zellinie nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, in dem

- man die Tumorleber eines transgenen Tiers nach Anspruch 12 oder die Tumorleber eines Tiers, in dem die hepatischen Tumorzellen, die von einem transgenen Tier nach Anspruch 9 abstammen, vermehrt worden sind, entnimmt und

- man durch Kultivieren der Zellen der besagten Leber die Zellinie selektioniert.

15. Verfahren zur Herstellung eines Faktors IX menschlichen Ursprungs, der eine Aktivität aufweist, die derjenigen des Faktors IX ähnlich ist, der im menschlichen Plasma vorhanden ist, in welchem man eine Zellinie nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 kultiviert und anschließend den Faktor IX aus dem Kulturmedium gewinnt.